KR102198497B1 - 파킨슨 질환 동물 모델 및 이를 이용한 스크리닝 방법 - Google Patents
파킨슨 질환 동물 모델 및 이를 이용한 스크리닝 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102198497B1 KR102198497B1 KR1020180135355A KR20180135355A KR102198497B1 KR 102198497 B1 KR102198497 B1 KR 102198497B1 KR 1020180135355 A KR1020180135355 A KR 1020180135355A KR 20180135355 A KR20180135355 A KR 20180135355A KR 102198497 B1 KR102198497 B1 KR 102198497B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- parkinson
- disease
- mouse
- animal model
- gene
- Prior art date
Links
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 title claims abstract description 67
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title description 16
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title description 5
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 100
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 claims abstract description 50
- 238000010171 animal model Methods 0.000 claims abstract description 37
- 108090000185 alpha-Synuclein Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 101150014177 Aimp2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 8
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims abstract description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 31
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 30
- 230000003902 lesion Effects 0.000 claims description 26
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 23
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 21
- 210000004558 lewy body Anatomy 0.000 claims description 21
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 20
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 17
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 15
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 claims description 13
- 230000030833 cell death Effects 0.000 claims description 12
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 claims description 11
- 102000006441 Dopamine Plasma Membrane Transport Proteins Human genes 0.000 claims description 9
- 108010044266 Dopamine Plasma Membrane Transport Proteins Proteins 0.000 claims description 9
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 claims description 8
- 235000014510 cooky Nutrition 0.000 claims description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 6
- 238000010825 rotarod performance test Methods 0.000 claims description 5
- 208000012661 Dyskinesia Diseases 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 102000003802 alpha-Synuclein Human genes 0.000 description 22
- 102100022417 Aminoacyl tRNA synthase complex-interacting multifunctional protein 2 Human genes 0.000 description 21
- 101000755758 Homo sapiens Aminoacyl tRNA synthase complex-interacting multifunctional protein 2 Proteins 0.000 description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 21
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 7
- PLRACCBDVIHHLZ-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine Chemical compound C1N(C)CCC(C=2C=CC=CC=2)=C1 PLRACCBDVIHHLZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101001135571 Mus musculus Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 2 Proteins 0.000 description 6
- 108091000117 Tyrosine 3-Monooxygenase Proteins 0.000 description 6
- 102000048218 Tyrosine 3-monooxygenases Human genes 0.000 description 6
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 6
- DIVDFFZHCJEHGG-UHFFFAOYSA-N oxidopamine Chemical compound NCCC1=CC(O)=C(O)C=C1O DIVDFFZHCJEHGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- 208000016285 Movement disease Diseases 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 230000003376 axonal effect Effects 0.000 description 3
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 210000001577 neostriatum Anatomy 0.000 description 3
- 230000016273 neuron death Effects 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 210000003523 substantia nigra Anatomy 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 3
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 241001573498 Compacta Species 0.000 description 2
- 108010020246 Leucine-Rich Repeat Serine-Threonine Protein Kinase-2 Proteins 0.000 description 2
- 102000009784 Leucine-Rich Repeat Serine-Threonine Protein Kinase-2 Human genes 0.000 description 2
- 208000019430 Motor disease Diseases 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 101000800132 Mus musculus Thyroglobulin Proteins 0.000 description 2
- 206010052904 Musculoskeletal stiffness Diseases 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 2
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 210000001259 mesencephalon Anatomy 0.000 description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 2
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 2
- 230000007436 olfactory function Effects 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 3,3'-diaminobenzidine Chemical compound C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 Antibody Proteins 0.000 description 1
- 208000019901 Anxiety disease Diseases 0.000 description 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010048610 Cardiotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 1
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 1
- 108091027757 Deoxyribozyme Proteins 0.000 description 1
- 206010012335 Dependence Diseases 0.000 description 1
- 108700003861 Dominant Genes Proteins 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 208000018522 Gastrointestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000619542 Homo sapiens E3 ubiquitin-protein ligase parkin Proteins 0.000 description 1
- 101000605835 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase PINK1, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N L-DOPA Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N L-Dopa Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 206010061296 Motor dysfunction Diseases 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 108090000119 Nucleotidyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 102000003832 Nucleotidyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 208000012898 Olfaction disease Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 1
- 102000007659 Protein Deglycase DJ-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010032428 Protein Deglycase DJ-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 208000025535 REM sleep behavior disease Diseases 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 102000052708 Recessive Genes Human genes 0.000 description 1
- 108700005079 Recessive Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 102100038376 Serine/threonine-protein kinase PINK1, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 108010057517 Strep-avidin conjugated horseradish peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 206010044565 Tremor Diseases 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 229960000106 biosimilars Drugs 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000259 cardiotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007681 cardiovascular toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 235000019219 chocolate Nutrition 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000036461 convulsion Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000006739 dopaminergic cell death Effects 0.000 description 1
- 210000005064 dopaminergic neuron Anatomy 0.000 description 1
- 239000002019 doping agent Substances 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000005861 gene abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000003208 gene overexpression Methods 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 229910021389 graphene Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000005787 mitochondrial ATP synthesis coupled electron transport Effects 0.000 description 1
- 230000004065 mitochondrial dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008450 motivation Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000956 olfactory bulb Anatomy 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 102000045222 parkin Human genes 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 102200036626 rs104893877 Human genes 0.000 description 1
- 201000000980 schizophrenia Diseases 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000008786 sensory perception of smell Effects 0.000 description 1
- 230000007958 sleep Effects 0.000 description 1
- 208000019116 sleep disease Diseases 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229940124598 therapeutic candidate Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011820 transgenic animal model Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
- G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
- A01K2267/0318—Animal model for neurodegenerative disease, e.g. non- Alzheimer's
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본원은, AIMP2 유전자와 α-시뉴클레인 유전자를 도파민 세포에서 함께 발현하도록 형질전환된 파킨슨 질환 동물 모델, 및 이를 이용한 파킨슨 질환 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
Description
본원은, AIMP2 유전자와 α-시뉴클레인 유전자를 도파민 세포에서 함께 발현하도록 형질전환된 파킨슨 질환 동물 모델, 및 이를 이용한 파킨슨 질환 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
평균 수명이 증가하여 고령화 사회로 진입함에 따라, 노화에 따라 발병하는 퇴행성 질환이 커다란 의료 및 사회적 문제로 대두되고 있다. 이러한 퇴행성 질환 중에서도 특히 퇴행성 운동장애 뇌질환인 파킨슨 질환 환자의 수가 급격하게 증가하는 추세에 있다.
파킨슨 질환 (Parkinson's disease)은 팔, 다리 또는 전신의 근육이 경련 또는 경직되며 중심을 잡지 못하는 퇴행성 신경질환이다. 이와 같은 증상은 뇌신경세포의 문제로 신경전달물질인 도파민 분비에 이상이 생기면서, 뇌의 특정 신경세포가 점차 파괴되어 발생한다. 파킨슨 질환의 전형적인 증상은 경련, 근육 경직 및 동작이 느려지는 증상 등을 포함하는 운동장애, 및 후각장애, 수면장애, 우울증, 불안장애, 인지 장애, 조현증상과 같은 비운동장애이다. 이와 같은 파킨슨 질환의 치료 내지 예방 효과를 가지는 약물의 탐색을 위한 전임상 단계에서 파킨슨 질환 동물 모델이 사용되고 있다.
이러한 전임상 실험을 위한 파킨슨 질환 동물 모델로서 미토콘드리아 독소 MPTP 모델 및 6-하이드록시도파민 (6-OHDA) 주입 모델 등이 개발된 바 있다. MPTP는 미토콘드리아의 전자 전달 연쇄계의 Complex I 저해제로서, MPTP 모델은 인간을 포함한 다양한 동물 시스템에서 도파민 신경세포의 사멸 및 파킨슨 관련 병변을 유도한다. 6-OHDA는 선조체로 주입시 도파민 운송체를 통해 도파민 신경세포의 축색 말단으로 선택적으로 흡수되고, 도파민 세포의 축색에서 6-OHDA는 산화스트레스를 통해 축색 말단의 즉각적인 기능 이상 및 운동 장애를 유발하며, 역행성의 도파민 신경세포 사멸을 유도한다. MPTP 모델과 6-OHDA 주입 모델은 도파민 신경세포의 급성의 수 일에 걸친 사멸에 따른 운동 장애를 연구하는 데에는 적합한 모델이지만, 실제 파킨슨 질환의 진행적인 병변 및 상위의 병리 원인을 연구하기에는 적합하지 않다는 한계가 있다. 또한, MPTP와 6-OHDA 주입 모델에서 도파민 세포의 사멸은 수 일 내에 유도되지만, 파킨슨 질환의 중요 병변인 루이소체 응집체가 발현되지 않는다. 즉 루이소체를 타겟하는 치료 후보 물질을 검증하기에는 적합하지 않았다. 무엇보다 치명적인 MPTP 모델의 단점은 같은 양의 독소를 주입하더라도 동물의 병변 발현이 일정하지 않고 독성 때문에 많은 수의 동물이 주로 심장 독성으로 치사하는 것이다. 결국 이들 모델들은 신약 후보물질의 전임상 검증에 이용될 수는 있으나 좋은 모델로서의 가치가 떨어지며 신뢰할 만한 실험 결과를 기대하기 어렵다는 한계가 있다.
한편, 파킨슨 질환을 유발하는 것으로 알려진 대표적인 파킨슨 우성 유전자로는 α-시뉴클레인 (α-synuclein)과 LRRK2가 있으며, 열성 유전자로는 파킨 (parkin), PINK1 및 DJ-1 등이 있다. 이들 파킨슨 유전자들은 가족성 유전 파킨슨 질환에서 발견되었지만 대부분을 차지하는 산발성 파킨슨 질환 환자와 거의 유사한 병변을 보이며, 이러한 유전자들을 활용하여 파킨슨 유전자 변형 마우스 모델이 개발된 바 있다.
그러나 우성 파킨슨 유전자 모델인 α-시뉴클레인 과발현 형질 전환 마우스의 경우 다양한 프로모터를 활용한 모델 개발에도 불구하고 도파민 신경세포의 사멸이 나타나지 않았으며, 루이체 병변의 발현도 일관되지 않았다. 이에 열성 파킨슨 유전자들의 결손 마우스들도 개발되었지만, 미토콘드리아의 기능이상 외에 파킨슨 환자의 도파민 세포 사멸 및 루이체 병변을 발현하지 않았다. 우성 파킨슨 유전자 모델인 LRRK2 과발현 형질 전환 마우스의 경우 L-DOPA에 반응하는 행동 이상 및 축색 병변이 보고된 바 있으나, 역시 도파민 신경세포의 사멸 및 루이체 병변은 나타나지 않았다.
최근 개발된 PFF (Preformed fibril: α-시뉴클레인 응집체) 주입 모델의 경우 3~6개월에 걸쳐 루이소체의 발현/전파 및 도파민 세포의 사멸 (약 50%) 그리고 운동이상이 나타나는 것으로 보고된 바 있다. 이 모델은 실제로 최근 각광 받고 있는 GLP 효능제 또는 c-Abl 저해제, 그리고 그래핀 나노파티클의 전임상 치료 효과 (주로 응집체 및 도파민 세포 사멸에 대한 치료 효과)를 검증하는데 이용되었다. 그러나, 이 PFF 모델의 경우 병변 발현에 6 개월 내지 1 년에 걸친 오랜 시간이 소요될 뿐 아니라, 도파민 세포 사멸의 정도가 충분하지 않아 실제 임상 파킨슨 환자의 경우와는 차이가 있다는 문제가 있다. 그리고 재조합 단백질인 PFF를 주입하기 때문에 PFF 제작상의 품질 관리에 따라 일관된 병변 유도가 힘들고, PFF 정제가 불완전할 경우 엔도톡신 (endotoxin) 오염으로 인한 인위적인 염증 병변이 혼재될 수 있다는 단점이 있다.
즉, 도파민 세포 특이적인 독소 및 다양한 파킨슨 유전자를 활용한 다양한 동물 모델, 그리고 최근의 PFF 주입 동물 모델의 개발에도 불구하고 기존 마우스 모델들은 인간의 파킨슨 질환과는 거리가 있거나, 도파민 세포 사멸, 루이체 병변 및 운동 이상과 같은 주요 질환 병변을 발현하지 않거나, 혹은 그러한 병변이 너무 늦게 발현된다는 문제점이 여전히 존재하였다.
본원에서는, 파킨슨 질환의 인자로 알려진 AIMP2와 α-시뉴클레인을 도파민 세포에 특이적으로 함께 발현시킬 수 있는 Tet-OFF 형질전환 동물 모델을 구축하고 주요 질환 관련 병변 분석을 수행함으로써 전임상 시험용 파킨슨 모델로서의 적합성을 시험하고자 하였다.
AIMP2와 α-시뉴클레인은 파킨슨 환자의 루이소체에서 동시에 발현되는 질환 단백질로서 임상 연계성을 가지고 있는 인자지만, 각각을 단독으로 발현시킬 경우 α-시뉴클레인은 병변 발현이 미약하며, AIMP2는 세포 독성만을 유발할 뿐 루이소체 발현에 대해서는 검증된 바 없었다. 이에 본원에서는 AIMP2과 α-시뉴클레인을 복합 발현시키는 전략을 통해 기존 파킨슨 동물 모델의 한계를 극복하고 인간 파킨슨 질환의 주요 병변을 단기간에 발현하는 혁신적인 동물 모델을 제공하고자 하였다.
또한, 그러한 동물 모델을 파킨슨 질환 치료 후보 화합물 및 항체 제제등과 같은 바이오시밀라의 전임상 효능 검증의 플랫폼으로 활용함으로써 단기간에 적은 비용으로 질환 치료 약물 개발이 가능한 동물 모델을 제공하고자 하였다.
그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본원의 제 1 측면은, AIMP2 유전자와 α-시뉴클레인 유전자를 도파민 세포에서 함께 발현하도록 형질전환된 파킨슨 질환 동물 모델에 관한 것이다.
본원의 제 2 측면은, 제 1 측면에 따른 파킨슨 질환 동물 모델에 시험 물질을 처리하는 단계; 및 상기 시험 물질 처리 후 상기 형질전환 동물에서 파킨슨 질환의 경감 또는 치료 정도를 평가하는 단계;를 포함하는 파킨슨 질환 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
상술한 과제 해결 수단은 단지 예시적인 것으로서, 본원발명을 제한하려는 의도로 해석되지 않아야 한다. 상술한 예시적인 구현예 외에도, 도면 및 발명의 상세한 설명에 기재된 추가적인 구현예 및 실시예가 존재할 수 있다.
본원발명에 따른 파킨슨 질환 동물 모델은, 종래의 파킨슨 질환 동물 모델에서 구현할 수 없었던 파킨슨 질환 환자의 주요 증상인 운동 이상 (서동) 및 비운동 이상 (후각 이상), 도파민 세포의 약 70% 이상 사멸 및 루이소체 병변 등을 3 개월이라는 짧은 기간 내에 완전히 발현시킬 수 있다.
이러한 동물 모델을 이용하여 파킨슨 질환의 원인을 보다 정확하게 규명할 수 있을 것이고, 파킨슨 질환의 진단을 위한 각종 바이오마커를 발굴하는 데 필요한 중요한 정보를 제공할 것이며, 더 나아가 치료를 위한 타겟을 발굴하고 관련 약물의 스크리닝 연구 내지는 신약 개발에도 유용하게 활용될 수 있을 것으로 예상된다.
또한, 본원발명에 따라 구축된 동물 모델은 흑질을 중심으로 한 신경세포간 기능 및 구조적 연결망 분석에 활용할 수도 있으며 이를 통하여 파킨슨 질환과 관련된 운동 기능 및 비운동 기능 장애에 대한 원인과 치료전략 개발 연구에 지속적으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본원의 일 실시예에 따라 제조된 파킨슨 질환 마우스 모델 제조 도식도 (도 1a), 지노타이핑 PCR 결과 (도 1b) 및 파킨슨 질환 동물 마우스 내에서의 유전자 발현 도식도 (도 1c)이다.
도 2는 본원의 일 실시예에 따라 제조된 파킨슨 질환 마우스 모델의 폴 테스트 (도 2a), 로타로드 테스트 (도 2b) 및 히든 쿠키 테스트 (도 2c)의 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3은 본원의 일 실시예에 따라 제조된 파킨슨 질환 마우스 모델에서의 도파민 신경세포 사멸을 확인한 이미지이다.
도 4는 본원의 일 실시예에 따라 제조된 파킨슨 질환 마우스 모델의 중뇌 흑질 절편에서 루이 응집체의 형성을 확인한 이미지이다 (도 4a 및 4b).
도 2는 본원의 일 실시예에 따라 제조된 파킨슨 질환 마우스 모델의 폴 테스트 (도 2a), 로타로드 테스트 (도 2b) 및 히든 쿠키 테스트 (도 2c)의 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3은 본원의 일 실시예에 따라 제조된 파킨슨 질환 마우스 모델에서의 도파민 신경세포 사멸을 확인한 이미지이다.
도 4는 본원의 일 실시예에 따라 제조된 파킨슨 질환 마우스 모델의 중뇌 흑질 절편에서 루이 응집체의 형성을 확인한 이미지이다 (도 4a 및 4b).
아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~ 를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B" 의 기재는, "A, B, 또는, A 및 B" 를 의미한다.
본원 명세서 전체에서, "형질전환 동물"이란 외부에서 도입된 유전자가 동물의 염색체 상에 삽입됨으로써 그 형질의 일부가 변화된 동물을 의미하며, 동물의 종류는 자연계의 포유류라면 제한 없이 생산 가능하다.
본원 명세서 전체에서, "유전자"는 단백질 코딩 또는 전사시에 또는 다른 유전자 발현의 조절시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미한다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 서열 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다.
본원 명세서 전체에서, "유전자 발현"이란 용어는 일반적으로 전사체 그리고 나아가 생물학적 활성이 있는 폴리펩티드가 DNA 서열로부터 생성되고 세포에서 생물학적 활성을 나타내는 세포 과정을 의미한다. 그런 의미로, 유전자 발현은 전사 및 해독 과정을 포함할 뿐만 아니라, 유전자 또는 유전자 산물의 생물학적 활성에 영향을 끼칠 수 있는 전사후 및 해독후 과정을 포함한다. 상기 과정들은 RNA 합성, 가공 및 수송뿐만 아니라, 폴리펩티드 합성, 수송 및 폴리펩티드의 해독후 변형을 포함하지만, 이들에 국한되는 것은 아니다. 본원에서는 유전자 발현의 태양으로 mRNA 발현 및 단백질 발현의 경우를 모두 포함한다.
본원 명세서 전체에서, "프라이머"는 상보성 RNA 또는 DNA 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고 예를 들어 PCR에서 발생하는 뉴클레오티딜트랜스퍼라제의 작용에 의해 모노뉴클레오티드로부터 폴리뉴클레오티드의 단계적 합성을 위한 출발점으로 기능하는 올리고뉴클레오티드 서열을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, "치료" 또는 “경감”이란 시험물질 또는 후보물질의 투여로 파킨슨 질환의 증세를 치료, 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
이하, 본원의 파킨슨 질환 동물 모델 및 이를 이용한 스크리닝 방법에 대하여 구현예 및 실시예와 도면을 참조하여 구체적으로 설명하도록 한다. 그러나, 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되는 것은 아니다.
본원의 제 1 측면은, AIMP2 유전자와 α-시뉴클레인 유전자를 도파민 세포에서 함께 발현하도록 형질전환된 파킨슨 질환 동물 모델에 관한 것이다.
본원발명에 따른 형질전환된 동물은 특히 도파민 세포에서 AIMP2 유전자와 α-시뉴클레인 유전자를 함께 발현하거나 내지는 함께 과발현될 수 있다. 이러한 발현은 mRNA 수준에서만이 아니라 단백질 수준 모두에서 높은 양상을 나타내는 것일 수 있다.
본원발명에 따라 형질전환 동물의 도파민 세포에서 AIMP2 유전자와 α-시뉴클레인 유전자가 발현되는 경우 (즉 정상대조군과 대비하여 형질전환에 의해 AIMP2 및 α-시뉴클레인의 mRNA 및/또는 단백질 발현 수준이 증가하는 경우), 예컨대 도파민 세포 사멸, 루이체 병변, 운동 이상 (서동) 및 후각 이상 (후각 손실 내지 후각 기능 저하) 등의 증상을 나타낼 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 파킨슨 질환 동물 모델은, 야생형 동물과 비교하여 도파민 세포 사멸, 루이체 병변, 운동 이상 및 후각 이상으로부터 선택되는 1 종 이상의 파킨슨 질환 증상을 나타내는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원발명의 형질전환 동물은, AIMP2 유전자와 α-시뉴클레인 유전자가 도파민-특이적 프로모터에 동작가능하게 연결된 유전자를 유전체 내에 가질 수 있다. 상기 도파민-특이적 프로모터는 당업계에 알려진 것 중에서 바람직하게 선택될 수 있으며, 예를 들어 DAT (dopamine transporter) 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 여기서 “동작가능하게 연결된”은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 파킨슨 질환 동물 모델은 AIMP2 유전자와 α-시뉴클레인 유전자가 DAT (dopamine transporter) 프로모터에 의해 도파민 세포-특이적으로 발현이 유도되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 파킨슨 질환 동물 모델은 AIMP2 유전자와 α-시뉴클레인 유전자가 과발현되는 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 동물은 설치류일 수 있으며, 예를 들어 마우스일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 제 2 측면은, 본원 발명의 파킨슨 질환 동물 모델에 시험 물질을 처리하는 단계; 및 상기 시험 물질 처리 후 상기 동물 모델에서 파킨슨 질환의 경감 또는 치료 정도를 평가하는 단계;를 포함하는 파킨슨 질환 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본원발명의 스크리닝 방법에 의해 분석될 수 있는 파킨슨 질환 치료용 시험 물질 (또는 후보 화합물)은 단일 화합물, 화합물들의 혼합물(예컨대, 천연 추출물 또는 세포 또는 조직 배양물), 또는 바이오의약품(예컨대, 단백질, 항체, 펩타이드, DNA, RNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, RNAi, 앱타머, RNAzyme 및 DNAzyme)일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 시험 물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있으며 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
파킨슨 질환 동물 모델에 시험물질을 처리하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 동물에 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 국소 투여 또는 경피 투여 등의 방법이 포함될 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 파킨슨 질환의 경감 또는 치료 정도를 평가하는 단계는, 상기 파킨슨 질환 동물 모델에서 시험 물질 처리 전후의 도파민 세포 사멸, 루이체 병변, 운동 이상 및 후각 이상으로부터 선택되는 1 종 이상의 증상의 변화 여부를 확인하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 파킨슨 질환의 경감 또는 치료 정도를 평가하는 단계는, 대조군으로서 기존의 파킨슨 질환 치료제를 처리한 경우 또는 시험 물질로 처리하지 않은 경우와 비교하는 단계를 추가로 포함하여 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 파킨슨 질환의 경감 또는 치료 정도를 평가하는 단계는, 폴 테스트 (Pole test), 로타로드 테스트 (Rotarod test) 및 히든 쿠키 테스트 (Hidden cookie test)로부터 선택되는 하나 이상을 수행하여 평가하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본원발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
[
실시예
]
실험예
1. 마우스의 폴 테스트 (Pole test)
평가대상 마우스를 최소한 20 분 동안 폴 (Pole: 운동 테스트 기둥) 에서 순응하게 하였다. (마우스들이 처음 폴 위에 올라갔을 때 두려움이 생겨 아래로 내려오지 않으려는 성향이 있기에 반드시 순응 단계를 진행해야 한다.) 폴은 직경 10 mm, 높이 58 cm의 금속 기둥으로 만들어졌고 기둥은 붕대 거즈로 싸여 있는 것을 사용하였다.
순응된 마우스를 폴의 꼭대기에 놓고, 폴 위쪽 끝에서 아래쪽 끝에 도달하는 데 걸린 총 시간을 기록하였다. 각 마우스를 6 회의 세션으로 평가하고 총 시간 및 평균을 기록하였다.
실험예
2.
로타로드
테스트 (
Rotarod
test)
로타로드 기기를 30 초 정도 프리 런 (Pre-run) 설정을 하였다. (평가 대상 마우스 자세 안정화) 프리 런이 끝나면 RPM을 서서히 올려가며 (최대 40 rpm) 기록을 진행하였다. 마우스가 아래로 내려오면 해당 시간과 rpm을 기록하였다. 프리 세션 2 회를 진행한 후 본 실험을 위한 6 회 세션을 진행하였다.
실험예
3.
히든
쿠키 테스트 (Hidden cookie test)
우선적으로 평가 대상 마우스에게 실험에 사용할 새로운 먹이 (쿠키, 초콜릿 등)을 하루간 경험하게 하여 익숙하게 만든 뒤, 하루 정도 단식을 진행시켰다. (식수는 그대로 진행) 다음날 실험에 사용할 새로운 먹이를 깔짚 속에 숨긴 테스트 케이지를 준비하였다. 테스트 케이지는 이전에 사용한 적이 없는 새 것으로 준비하며 깨끗한 상태로 준비하였다. 실험 대상 마우스를 실험 케이지에 넣는 순간부터 먹이를 발견하는 시점까지 시간을 기록하였으며, 총 6 회 세션으로 실험을 반복하였다. 모든 행동실험은 동영상으로 기록하여 데이터를 보관하였다.
실험예
4. 관류 (perfusion) 및 뇌조직 면역 염색
동물을 수면 마취시키고 마우스 수술 플랫폼에 고정 시켜 개심을 진행하고, PBS 및 4% 파라포름알데히드 (wt/vol)로 관류 시켰다. 마우스의 뇌를 추출하여 4% 파라포름알데히드 (wt/vol)로 후고정시키고, 30% 수크로오스 (wt/vol)에서 동결보존 시켰다. 이후 면역염색 진행을 위하여 고정된 뇌를 40 μm 두께로 코로날 섹션 (coronal section)을 진행하고, 흑질 (substantia nigra)을 포함한 섹션을 주된 분석에 사용하였다. 도파민 세포를 분석하기 위해 티로신 수산화효소 (tyrosine hydroxylase, TH) 또는 pS129-α-시뉴클레인 항체 (1:1000 희석액 이용)를 이용하여 뇌 절편들을 인큐베이션하였다. 이후 시각화를 위해서 순차적으로 비오틴화 고트 항-래빗 IgG (biotinylated goat anti-rabbit IgG)와 스트렙타비딘-컨쥬게이트화 홀스래디쉬 퍼옥사이드 (streptavidin-conjugated horseradish peroxidase, HRP)에 인큐베이션시켰다. 이후 3,3-디아미노벤지딘 (3,3-Diaminobenzidine)에 노출시켜 각 뇌 절편에 TH의 염색 정도를 확인하였다. 염색이 완료된 후 TH 염색 샘플은 Stereo Investigator의 Optical Fractionator 프로브를 이용하여 실질적인 도파민 세포의 수를 계수하였다. pS129-α-시뉴클레인 염색의 경우 확대 이미지를 얻어 병변 진행 정도를 확인하였다.
실시예
1.
AIMP2
/α-
시뉴클레인을
도파민 세포 특이적으로 발현하는 신규 파킨슨 마우스 모델 구축
AIMP2와 α-시뉴클레인의 도파민 세포 특이적인 발현을 유도하기 위해, Jackson Laboratory로부터 세 종류의 마우스 라인들 (DAT- PF -tTA 드라이버 마우스-Slc6atm4.1(tTA)Xz/J; TetO - AIMP2 리스판더 마우스-Tg(tetO-AIMP2)630Tmd/J; 및 TetO-α-시뉴클레인 리스판더 마우스-Tg(tetO-SNCA*A53T)E2Cai/J)를 구매하였다.
우선 TetO - AIMP2 마우스와 TetO -α- 시뉴클레인 마우스를 교배하여 두 유전자형을 모두 가진 이중 Tg를 만들고, 도파민 세포 특이적으로 tTA (tetracycline regulated transcription activator)를 발현하는 DAT-PF-tTA 마우스와 교배하여 최종적으로 세 종류의 유전자형을 모두 가진 삼중 Tg 마우스를 확보한 후, 삼중 Tg 마우스 꼬리로부터 추출한 DNA를 지노타이핑 (genotyping) PCR하여 분석하였다 (도 1a 및 1b). PCR에 사용된 프라이머 세트, 구체적인 PCR 조건 및 각 유전자형별 PCR 산물의 크기는 아래의 표 1 내지 3에 나타나 있다.
| 프라이머 이름 | 서열 |
| TetP-AIMP2-F | AAGCATTCTGCCTTCCTAGTGG |
| TetP-AIMP2-R | TTACATCCAAGTCTGCATCTGGT |
| TetP-A53T-SNCA-F | TACTGCTCCATTTTGCGTGA |
| TetP-A53T-SNCA-R | TCCAGAATTCCTTCCTGTGG |
| DAT-PF-tTA-common-F | AGAAGAAGGAAACAGACTTCCTC |
| DAT-PF-tTA-WT-R | TGATGAGGGTGGAGTTGGTC |
| DAT-PF-tTA-mutant-R | GCTTGTTCTTCACGTGCCAGT |
| PCR 사용 시약 | PCR 사이클 조건 |
| 2X 마스터 믹스 10 ㎕ (동행 제품) DNA 1 ㎕ 프라이머 믹스 (F+R) 1 ㎕ Invitrogen 물 8 ㎕ 총 20 ㎕ |
94 ℃ 2 분 ↓ 94 ℃ 20 초 65 ℃ 15 초 72 ℃ 1 초 (30 사이클 반복) ↓ 72 ℃ 5 분 4 ℃ 홀딩 |
| PCR 산물 크기 |
| TetP-AIMP2: 300 bp |
| TetP-A53T-SNCA: 574 bp |
| DAT-PF-tTA-WT: 184 bp |
| DAT-PF-tTA-Mutant: 232 bp |
DAT- PF -tTA 유전자형은 DAT (dopamine transporter) 프로모터로부터 발현 유도된 tTA가 하류 (downstream)의 TetO 프로모터를 활성화시킴으로써 tTA 발현을 증폭시키게 된다. 이렇게 도파민 세포 특이적으로 증폭 발현된 tTA는 TetO - AIMP2와 TetO -α- 시뉴클레인의 TetO 프로모터에 결합하여 AIMP2와 α-시뉴클레인의 동시 발현을 유도하게 된다 (도 1c). 결과적으로, 본 실시예에 따라 제조된 신규 파킨슨 마우스 모델인 삼중 Tg 마우스는 도파민 세포 특이적으로 파킨슨 질환 인자인 AIMP2와 α-시뉴클레인을 발현하게 된다.
실시예
2. 신규 파킨슨 동물 모델의 현저한 운동/
비운동
이상의 유도
인간 파킨슨 환자는 특징적인 운동 장애 (서동, 휴지기 떨림 및 강직 등) 및 비운동 증상 (후각 장애, REM 수면 행동 장애 및 위장관 장애 등)을 나타낸다. 이에, Tet-OFF 시스템으로 확립한 신규 삼중 Tg 모델 (3 개월령)이 파킨슨 질환 관련 운동 및 비운동 증상을 보이는지 행동 실험을 통해 확인하였다. 대조군으로서 야생형 (WT) 마우스와 AIMP2 단독 또는 α-시뉴클레인을 단독으로 발현하는 마우스들을 포함시켰다. 마우스의 서동 (운동이 느려짐)을 측정하는 폴 테스트에 의하면 AIMP2 단독 발현 마우스와 AIMP2와 α-시뉴클레인을 함께 발현하는 마우스 모델에서 폴 테스트를 수행하는 시간이 현저히 증가함을 확인하였다. 두 그룹 간에서는 AIMP2와 α-시뉴클레인을 동시 발현할 경우 유의성있게 서동 증상이 악화되었다 (도 2a). 추가적으로 운동 조율 능력을 측정하는 로타로드 테스트를 수행한 결과, 마찬가지로 AIMP2와 α-시뉴클레인을 동시 발현하는 모델이 가장 운동 조율 능력이 떨어짐을 확인하였다 (도 2b). 결론적으로 도파민 세포 특이적인 AIMP2와 α-시뉴클레인의 복합 발현 전략이 각각을 단독으로 발현시키는 것 보다 파킨슨 관련 운동 장애 증상을 유도하는데 현저히 효과적임이 확인되었다.
DAT- PF -tTA 드라이버 마우스의 경우 후각망울에서의 tTA 발현을 유발하기 때문에 후각 기능상의 장애를 유발하는지를 히든 쿠키 테스트 (buried food finding)를 통해 확인하였다. 후각 테스트의 경우 다른 대조군에 대해서 AIMP2와 α-시뉴클레인을 함께 발현하는 마우스 모델만이 현저한 후각 기능 소실의 표현형을 보였다 (도 2c).
실시예
3. 신규 파킨슨 동물 모델의 도파민 세포 사멸 및
루이소체
발현 확인
AIMP2와 α-시뉴클레인을 도파민 세포에서 함께 발현하는 신규 파킨슨 마우스 모델이 실제로 파킨슨 환자의 주요 병변 특징인 도파민 신경세포 사멸 및 루이소체의 형성을 촉진하는지 확인하기 위해 면역 조직 염색을 수행하였다. 중뇌 흑질 부위의 도파민 세포를 TH (tyrosine hydroxylase) 특이적 항체로 염색하여 확인한 결과, 야생형 마우스와 비교하여 본 실시예에 따른 마우스 모델 (3 개월령)의 경우 도파민 세포가 거의 남아있지 않을 정도로 세포가 소실된 것이 관찰되었다 (도 3). 게다가, 도 3에 따르면 실제 운동 회로를 형성하는 SNpc (substantia nigra pars compacta) 지역의 도파민 세포 소실이 중독/동기부여를 조절하는 회로를 형성 하는 VTA (ventral tagmental area)의 도파민 세포 소실보다 더 선택적으로 나타난다는 사실을 확인할 수 있는데, 이는 실제 파킨슨 환자에서 나타나는 현상과 유사한 것이다.
루이체는 통상적으로 인산화 형태의 α-시뉴클레인 (pS129-α-시뉴클레인)을 표지하는 특이 항체를 이용해 검출한다. 야생형 마우스와 삼중 Tg에서 pS129-α-시뉴클레인 항체로 면역 조직 염색을 수행한 결과, VTA (ventral tagmental area) 지역과 SNpc (substantia nigra pars compacta) 지역의 아직 살아있는 도파민 세포에서 강한 염색이 나타남을 확인하였다 (도 4a). 확대하여 관찰한 결과 SNpc 지역의 도파민 세포에서는 실제 파킨슨 환자에서 관찰되는 루이소체와 아주 유사한 형태의 응집체도 관찰되었다. 도파민 신경세포의 축삭 (axon)이 있는 선조체 (STR, striatum)의 면역 조직 염색의 경우 특징적인 pS129-α-시뉴클레인으로 표지되는 루이 신경돌기 (Lewy neurite) 형태의 응집체를 삼중 Tg에서만 관찰할 수 있었다 (도 4b).
위의 결과는 AIMP2와 α-시뉴클레인의 동시 발현이 파킨슨 질환의 진단 마커이기도 한 루이소체 형성을 재현한다는 점에서 큰 의의가 있다. 또한 현재의 파킨슨 치료 전략이 루이소체를 억제하는 방향으로 진행되고 있으므로, 본원발명에 의한 신규 마우스 모델이 적절한 전임상 모델로서 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (11)
- AIMP2 유전자와 α-시뉴클레인 유전자가 도파민 세포에서 함께 과발현하도록 형질전환된, 파킨슨 질환 마우스 동물 모델로서,
상기 동물 모델은 AIMP2 유전자를 과발현하는 TetO-AIMP2 마우스 및 α-시뉴클레인 유전자를 과발현하는 TetO-α-시뉴클레인 마우스를 교배하여 이중 형질전환 마우스를 수득하는 단계; 및
상기 이중 형질전환 마우스에 DAT-PF-tTA 마우스와 교배하여 삼중 형질전환 마우스를 수득하는 단계;로 제조되며,
상기 동물 모델은 야생형 동물 모델과 비교하여 도파민 세포 사멸, 루이체 병변, 운동 이상 및 후각 이상의 파킨슨 질환 증상이 나타나고,
상기 AIMP2 유전자와 α-시뉴클레인 유전자는 DAT (dopamine transporter) 프로모터에 의해 도파민 세포-특이적으로 발현이 유도되는 것인, 파킨슨 질환 마우스 동물 모델. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- (1) 제 1 항에 따른 파킨슨 질환 마우스 동물 모델에 시험 물질을 처리하는 단계; 및
(2) 상기 시험 물질 처리 후 상기 동물 모델에서파킨슨 질환의 경감 또는 치료 정도를 평가하는 단계;를 포함하는, 파킨슨 질환 치료제의 스크리닝 방법으로서,
상기 평가하는 단계는 대조군으로서 기존의 파킨슨 질환 치료제를 처리한 경우 또는 시험 물질로 처리하지 않은 경우와 비교하여,
상기 파킨슨 질환 마우스 동물 모델에서 시험 물질 처리 전후의 도파민 세포 사멸, 루이체 병변, 운동 이상 및 후각 이상의 증상 변화 여부를 확인하여, 증상의 변화 여부를 확인하는 것인, 파킨슨 질환 치료제의 스크리닝 방법. - 삭제
- 삭제
- 제 7 항에 있어서, 상기 파킨슨 질환의 경감 또는 치료 정도를 평가하는 단계는, 폴 테스트 (Pole test), 로타로드 테스트 (Rotarod test) 및 히든 쿠키 테스트 (Hidden cookie test)로부터 선택되는 하나 이상을 수행하여 평가하는 것인, 파킨슨 질환 치료제의 스크리닝 방법.
- (1) AIMP2 유전자를 과발현하는 TetO-AIMP2 마우스 및 α-시뉴클레인 유전자를 과발현하는 TetO-α-시뉴클레인 마우스를 교배하여 이중 형질전환 마우스를 수득하는 단계; 및
(2) 상기 이중 형질전환 마우스에 DAT-PF-tTA 마우스와 교배하여 삼중 형질전환 마우스를 수득하는 단계;를 포함하는, 파킨슨 질환 동물 모델 제조 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180135355A KR102198497B1 (ko) | 2018-11-06 | 2018-11-06 | 파킨슨 질환 동물 모델 및 이를 이용한 스크리닝 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180135355A KR102198497B1 (ko) | 2018-11-06 | 2018-11-06 | 파킨슨 질환 동물 모델 및 이를 이용한 스크리닝 방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20200052142A KR20200052142A (ko) | 2020-05-14 |
| KR102198497B1 true KR102198497B1 (ko) | 2021-01-06 |
Family
ID=70737001
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020180135355A KR102198497B1 (ko) | 2018-11-06 | 2018-11-06 | 파킨슨 질환 동물 모델 및 이를 이용한 스크리닝 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102198497B1 (ko) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115517225B (zh) * | 2022-09-21 | 2023-10-27 | 北京脑重大疾病研究院 | 一种帕金森病动物模型的构建方法及构建得到的动物模型 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003199460A (ja) | 2002-01-08 | 2003-07-15 | Mikio Shoji | パーキンソン病モデルトランスジェニックマウス |
| WO2005041649A1 (ja) | 2003-10-30 | 2005-05-12 | Taisho Pharmaceutical Co., Ltd. | トランスジェニック非ヒト哺乳動物 |
| KR101433049B1 (ko) | 2013-07-19 | 2014-10-14 | 충남대학교산학협력단 | 세포복제 기술을 이용한 파킨슨병 개 동물모델 및 이의 제조방법 |
| KR101888785B1 (ko) * | 2017-02-24 | 2018-08-14 | 성균관대학교산학협력단 | 퇴행성 뇌질환 치료제 스크리닝 방법 및 이를 위한 키트 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20170045042A (ko) * | 2015-10-16 | 2017-04-26 | 충남대학교산학협력단 | 돌연변이 park2 유전자 및 이를 이용하여 파킨슨병을 진단하는 방법 |
-
2018
- 2018-11-06 KR KR1020180135355A patent/KR102198497B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003199460A (ja) | 2002-01-08 | 2003-07-15 | Mikio Shoji | パーキンソン病モデルトランスジェニックマウス |
| WO2005041649A1 (ja) | 2003-10-30 | 2005-05-12 | Taisho Pharmaceutical Co., Ltd. | トランスジェニック非ヒト哺乳動物 |
| KR101433049B1 (ko) | 2013-07-19 | 2014-10-14 | 충남대학교산학협력단 | 세포복제 기술을 이용한 파킨슨병 개 동물모델 및 이의 제조방법 |
| KR101888785B1 (ko) * | 2017-02-24 | 2018-08-14 | 성균관대학교산학협력단 | 퇴행성 뇌질환 치료제 스크리닝 방법 및 이를 위한 키트 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| J Neurosci, Vol. 35, No. 3, pp 890-905(2015.01.21. 온라인 공개)* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20200052142A (ko) | 2020-05-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Feng et al. | Deficient neurogenesis in forebrain-specific presenilin-1 knockout mice is associated with reduced clearance of hippocampal memory traces | |
| Melotte et al. | The N‐myc downstream regulated gene (NDRG) family: diverse functions, multiple applications | |
| Chesselet et al. | A progressive mouse model of Parkinson's disease: the Thy1-aSyn (“Line 61”) mice | |
| Kim et al. | Axon regeneration in young adult mice lacking Nogo-A/B | |
| Suzuki et al. | Collapsin response mediator protein‐2 accelerates axon regeneration of nerve‐injured motor neurons of rat | |
| Gautier et al. | AAV2/9-mediated silencing of PMP22 prevents the development of pathological features in a rat model of Charcot-Marie-Tooth disease 1 A | |
| Oshio et al. | Impaired pain sensation in mice lacking Aquaporin-1 water channels | |
| Yutsudo et al. | fosB-null mice display impaired adult hippocampal neurogenesis and spontaneous epilepsy with depressive behavior | |
| JP2010531638A5 (ko) | ||
| JPWO2003041496A1 (ja) | トランスジェニック動物 | |
| JP2013081480A (ja) | 標的化された細胞死 | |
| Miszczuk et al. | Traumatic brain injury increases the expression of Nos1, Aβ clearance, and epileptogenesis in APP/PS1 mouse model of Alzheimer’s disease | |
| Nishimura et al. | Global gene expression analysis following spinal cord injury in non-human primates | |
| Burbano et al. | Antisense oligonucleotide therapy for KCNT1 encephalopathy | |
| Yuan et al. | Gliogenesis in lampreys shares gene regulatory interactions with oligodendrocyte development in jawed vertebrates | |
| Turner et al. | Connective tissue growth factor is a novel prodepressant | |
| Kim et al. | CRMP2 mediates GSK3β actions in the striatum on regulating neuronal structure and mania-like behavior | |
| KR102198497B1 (ko) | 파킨슨 질환 동물 모델 및 이를 이용한 스크리닝 방법 | |
| JP2013503645A (ja) | 神経細胞の誘導除去のための方法およびシステム | |
| Bai et al. | Different mechanisms regulate expression of zebrafish myelin protein zero (P0) in myelinating oligodendrocytes and its induction following axonal injury | |
| Mathews et al. | Oligodendrocyte differentiation | |
| Liu et al. | Deletion of Calsyntenin-3, an atypical cadherin, suppresses inhibitory synapses but increases excitatory parallel-fiber synapses in cerebellum | |
| Modarresi et al. | A novel knockout mouse model of the noncoding antisense Brain-Derived Neurotrophic Factor (Bdnf) gene displays increased endogenous Bdnf protein and improved memory function following exercise | |
| WO2015053402A1 (ja) | 脊髄小脳変性症を予防又は治療するための薬剤 | |
| KR20240032021A (ko) | 신경 재프로그래밍을 위한 방법 및 조성물 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| X091 | Application refused [patent] | ||
| AMND | Amendment | ||
| X701 | Decision to grant (after re-examination) | ||
| GRNT | Written decision to grant |