KR102195221B1 - 포스파티딜이노시톨 3-키나아제 억제제 및 프로그램화 세포 사멸 단백질 1 억제제를 포함하는, 삼중음성 유방암의 방사선 병용 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

포스파티딜이노시톨 3-키나아제 억제제 및 프로그램화 세포 사멸 단백질 1 억제제를 포함하는, 삼중음성 유방암의 방사선 병용 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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한민국
장범섭
강미현
장원익
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Abstract

본 발명은 삼중음성 유방암의 치료를 위해, 방사능 치료와 병용하기 위한 약학적 조성물을 제공한다. 보다 구체적으로 상기 약학적 조성물은 PD-1 억제제 및 PI3Kγδ 억제제를 포함하며, 상기 PD-1 억제제 및 PI3Kγδ 억제제를 방사선 치료와 병용함으로써 각 치료제의 단독 요법에 비해 우수한 종양의 억제 및 면역 증진 효과를 가진다.

Description

포스파티딜이노시톨 3-키나아제 억제제 및 프로그램화 세포 사멸 단백질 1 억제제를 포함하는, 삼중음성 유방암의 방사선 병용 치료용 약학적 조성물 {Pharmaceutical composition for combination of radiotherapy for treating triple negative breast cancer comprising phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor and programmed cell death protein 1 inhibitor}
본 발명은 삼중음성 유방암에 대한 효과적인 병용 요법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 방사선 치료(radiotherapy)와 함께 투여되기 위한 포스파티딜이노시톨 3-키나아제(Phosphatidylinositol 3-kinase, 이하 "PI3K"라 한다) 억제제 및 프로그램화 세포 사멸 단백질 1(Programmed cell death protein-1, 이하 "PD-1"이라 한다) 억제제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
유방암은 임상적으로나 병리학적으로 매우 복잡하고 다양한 양상을 나타내는 암으로 알려져 있다. 최근 유방암 치료에 효과를 나타내는 다양한 표적 치료제가 개발되면서, 유방암도 점차 치료 표적의 발현 유무에 따라 분류하게 되었다.
현재까지 잘 알려진 유방암 치료의 표적은 호르몬 수용체와 HER2의 과발현이며, 이들 표적에 대한 치료를 통해 유방암의 예후를 향상시키는 효과를 가져왔다. 최근에는 유전자 발현 양상에 따라 유전자 차원에서 유방암을 평가하고 있다. DNA 미세 배열(microarray) 방법에 의해 유방암을 내강형 A군(에스트로겐 수용체 양성, HER2음성), 내강형 B군(에스트로겐 수용체 양성, HER2 양성), HER2 과발현 군(에스트로겐 수용체 음성, HER2 양성), 에스트로겐 수용체와 HER2 음성인 기저양(basal-like) 군과 정상형 군으로 분류하였다. 특히 기저양(basal-like) 유방암은 주로 호르몬 수용체가 없고 HER2/neu 발현이 되지 않는 군으로 나머지 군들에 비해 조기 재발이 많고, 예후가 불량하다고 알려져 있다. 그런데 이러한 유전자 발현 양상에 따른 분류 방법은 임상적으로 적용하기 어려워서, 현재는 면역조직화학염색을 통한 호르몬 수용체와 HER2의 발현 유무로 유방암을 구분하는 방법을 이용하고 있다.
삼중음성유방암은 면역조직화학염색에서 에스트로겐 수용체(ER), 프로게스테론 수용체(FR)와 HER2의 발현이 모두 음성인 유방암으로 전체 유방암의 10~15%를 차지한다. 삼중음성유방암은 기저양(basal-like) 유방암과 엄밀하게 일치하지는 않으나 매우 비슷한 임상 경과를 나타내기 때문에 실제 임상환경에서는 동일하게 여긴다. 삼중음성유방암은 비삼중음성유방암 환자에 비해 상대적으로 불량한 예후를 보인다고 알려져 있어, 이에 대한 치료제의 발굴이 필요한 실정이다.
유방암은 CD8+ 세포가 적고 종양 변이 부담이 적다는 점에서 면역비활성화 종양(immunologically "cold" tumor)으로 분류된다. 유방암 중 20%만이 PD-L1 양성 종양으로 알려져 있다. 그러나 삼중음성 유방암(Triple negative breast cancer, TNBC)의 종양 미세환경(tumor microenvironment)은 상대적으로 종양 침윤 림프구가 많고, PD-L1 발현이 높은 면역원성(immunogenic) 종양으로 일반적인 유방암과는 차이를 보인다. 이러한 삼중음성 유방암의 특징은 삼중음성 유방암이 면역체크포인트 억제제에 반응이 좋을 것임을 시사하나, 기존 임상 시험에서는 면역체크포인트 억제제 단독 요법에 의한 삼중음성 유방암 치료시 반응률이 불과 5 내지 19% 에 그침이 보고된 바 있다.
상기의 낮은 반응률은 면역 치료에 대한 적응 면역(adaptive resistance)에 의한 것으로 추측된다. 종양 미세환경에 존재하는 조절 T세포(regulatory T cells, Tregs 또는 Treg), 골수유래 면역억제세포 (myeloid-derived suppressor cells, MDSCs), 및/또는 M2 종양관련 대식세포(TAMs)는 면역치료에 대한 적응 면역에 중요한 역할을 수행하여 면역 치료의 효과를 떨어뜨리는 것으로 알려져 있다.
한편 최근 진행성 및 전이성 암에서 면역체크포인트 억제제 치료의 성공 사례가 보고되어, 방사선 치료(radiotherapy)를 면역체크포인트 억제제와 병합하는 방법이 주요 이슈로 대두되고 있으며, 많은 임상 시험이 진행 중이다.
특히 방사선 치료는 면역증진 효과를 가지는 것으로 예측되며, 상기 면역증진효과의 주요 기전은 고이동성 그룹 박스 1(high mobility group box 1, HMGB1)과 같은 위험-관련 분자 패턴(danger-associated molecular patterns, DAMPs)을 분비하는 면역활성 세포사멸 (immunogenic cell death)로 설명된다. 구체적으로, 면역활성 세포 사멸에 의해 분비된 DAMPs는 항원제시세포를 소집하고 활성화시켜 세포독성 T세포의 프라이밍 (priming)을 유도한다. 방사선 치료로 인한 친면역활성반응은 방사선이 조사된 종양을 in situ 백신 (in situ vaccine)으로 바꾸어 종양의 국소조절 및 원격 전이의 방지에 기여한다. 이는 또한 면역체크포인트 억제제에 대한 반응에 필요한 숙주의 면역 반응을 강화시키고, 면역 활성이 본래 좋지 않은 종양을 극복할 수 있도록 돕는 역할을 할 것으로 보인다.
한편, PI3K-AKT-mTOR 회로는 세포 생존, 생장 및 분화에 있어 중요한 기능을 하는 것으로 알려져 있다. PI3K family는 세 개의 클래스(class, I 내지 III)로 분류되며, Class I Pi3K는 이질이합체로 한 개의 촉매 소단위체(catalytic subunit, p110α, β, γ, δ)와 하나의 조절 소단위체(regulatory subunit, p85)로 구성된다. T세포 수용체에 의해 활성화되는 주요 동위체인 PI3Kδ는 주로 혈액암에서 치료의 표적이 되었으며, 조절 T세포를 조절하여 면역 억제 효과를 나타내는 것으로 보고된 바 있다.
먼저 PI3Kγ의 경우 p110γ의 과발현이 종양 발생을 야기하는 세포변형 기전의 하나로 알려져 있었으며, 최근 PI3Kγ가 종양미세환경 내 대식세포에 작용하여 항종양 면역 기능의 감소에 관여함이 보고되었다. 상기 항종양 면역 기능의 감소에는 PD-L1(Programmed death-ligand 1)과 같은 면역체크포인트의 발현이 증가하는 것을 포함한, 여러 면역 억제 사이토카인들의 분비 촉진이 관여하는 것으로 알려져 있다. 그러나 유방암에 대해 동물 모델 또는 환자를 대상으로 연구나 임상 시험이 진행된 경우는 현재까지 보고된 바 없다.
PI3Kδ 의 경우, p110δ를 비활성화시킨 마우스에서 조절 T세포의 기능이 억제되며 일부 다형핵 골수유래 면역억제 세포(polymorphonuclear MDSCs)를 억제하여 종양의 조절 및 생존률의 증가가 보고되었다.
본 발명자들은 면역 억제 세포들을 조절하여 숙주의 면역반응을 강화시키고, 적응 면역을 방지하기 위해서 면역체크포인트 억제제의 단독 요법보다 효과적인 복합치료(combination therapy)법을 연구한 결과, 삼중음성 유방암 동물 모델에서 PI3Kγδ 저해제와 PD-1 억제제를 방사선치료(Radiotherapy, RT)와 3중 병용투여 결과 항암 효과에 대한 시너지 효과를 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 삼중음성 유방암의 치료를 위해, 방사선 치료와 병용하기 위한 PI3K 억제제 및 PD-1 억제제를 포함하는, 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 PI3K 억제제를 투여하는 단계; PD-1 억제제를 투여하는 단계; 및 방사선 치료를 수행하는 단계를 포함하는, 삼중음성 유방암의 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은, PI3K 억제제 및 PD-1 억제제를 포함하는, 방사선 치료와 병용하기 위한, 삼중음성 유방암의 경감 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명이 제공하는 삼중음성 유방암의 경감 또는 치료용 약학적 조성물은, 방사선 치료와 병용되며, PI3K 억제제 및 PD-1 억제제를 포함한다.
본 명세서에서, "삼중음성 유방암"은 면역조직화학염색에서 에스트로겐 수용체(ER), 프로게스테론 수용체(FR)와 HER2의 발현이 모두 음성인 유방암으로, 기저양 유방암(basal-like breast cancer, BLBC)을 포함 또는 혼용하여 사용될 수 있다.
본 명세서에서, "PI3K 억제제"는 특별한 사정이 없는 한 Pi3Kγ 및/또는 PI3Kδ에 대한 억제제를 의미한다.
상기 PI3K 억제제는, PI3K γ 및/또는 PI3K δ에 대한 억제제라면 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들어, 상기 PI3K 억제제는 두벨리십(duvelisib), 테날리십(tenalisib), 및 아이델라리십(idelalisib)으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상, 둘 이상 또는 3종 모두일 수 있으나 이에 제한되지 아니한다.
본 발명이 제공하는 삼중음성 유방암의 경감 또는 치료용 약학적 조성물에 있어서, PI3K 억제제는 종양 내 적응 저항에 관여하는 면역 조절 T 세포(Tregs 또는 Treg) 및/또는 골수 유래 면역억제 세포 (MDSCs) 및/또는 M2 종양관련 대식세포(TAMs)를 억제할 수 있다. 따라서 PI3K 억제제를 포함함으로써, PD-1 억제제 단독 또는 방사서 치료 단독 또는 PD-1 억제제와 방사선 치료의 병용시보다 종양 환경에서의 적응 면역의 저항성(adaptive immune resistance)를 감소시켜 면역 치료의 효과를 증진시킬 수 있다.
본 발명이 제공하는 약학적 조성물에 있어서, 상기 PD-1 억제제는, 당업계에 알려져 있는 PD-1 억제제라면 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들어, 펨브로리주맵(pembrolizumab), 및 니볼루맙(nivolumab)으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상 또는 상기 2종의 조합 일 수 있다.
상기 PD-1 억제제는 면역원성 악성 종양, 예를 들어 삼중음성 유방암(TNBC)에 대한 면역 치료제로서 기능한다. 기존 삼중음성 유방암에 면역체크포인트 억제제를 단독 처리시 반응률이 낮았으나, 본 발명의 약학적 조성물을 방사선 치료와 병용하는 경우, PD-1 억제제 단독 처리시보다 종양 부피의 증가 속도가 현저히 낮아지는 장점이 있다.
일 예에서, PI3K 억제제, PD-1 억제제를 방사선 치료와 3중 병용 처치한 TBNC 동종이식 동물 모델에서의 종양부피는 무처리 대조군에 비해 0.16배, PD-1 억제제 단독 처리군에 비해 0.26배, PI3K 억제제 단독 처리군에 비해 0.22배, 방사선 단독 처리군에 비해 0.29배, PI3K 억제제와 방사선 병용 처리군에 비해 0.36배, 및/또는 PD-1 억제제와 방사선 치료의 병용시에 비해 0.61배로 나타나, 기존의 항암 치료 방법에 비해 월등히 우수한 종양 성장 억제 효과가 있음을 확인하였다.
본 발명이 제공하는 약학적 조성물에서, PD-1 억제제와 PI3K 억제제의 비율은 1:9 내지 9:1의 질량비 및/또는 부피비(PD-1 억제제 : PI3K 억제제, 이하 동일), 1:5 내지 5:1의 질량비 및/또는 부피비, 또는 2:5 내지 5:2의 질량비 및/또는 부피비로 혼합되어, 또는 순차적으로 투여 대상에게 투여될 수 있다. 일 예에서, 각 억제제의 농도는 투여 대상 개체에서 통상적으로 연구 및/또는 치료에 적용되어 허용되는 범위이며 약물의 치사량 범위 내에서 외삽될 수 있다.
또 다른 일 예에서, 본 발명이 제공하는 약학적 조성물 내 PD-1 억제제와 PI3K 억제제의 비율은 1:1 내지 10:1 의 질량비(PD-1 억제제 : PI3K 억제제, 이하 동일), 1:1 내지 5:1의 질량비, 또는 1:1 내지 5:2의 질량비로 혼합되어, 또는 순차적으로 투여 대상에게 투여될 수 있다.
본 발명이 제공하는 약학적 조성물 내 PD-1 억제제 및 PI3K 억제제의 함량은 전체 약학적 조성물 내 0.1 내지 10 중량%, 0.1 내지 5 중량%, 또는 0.1 내지 1 중량%일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명이 제공하는 약학적 조성물은 환자의 연령, 병기, 체중, 예후, 및/또는 기타 투약시 당업계에서 일반적으로 고려되는 사항을 고려하여 적절한 간격으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 1주일에 1회 내지 35회, 1주일에 1회 내지 21회, 1주일에 1회 내지 14회, 1주일에 1회 내지 7회, 1주일에 1회 내지 5회, 1주일에 1회 내지 3회, 2일마다 1회 내지 2회, 또는 이들의 조합으로 투여될 수 있다.
본 발명이 제공하는 약학적 조성물은 삼중음성 유방암의 치료를 위해 방사선 치료(Radiotherapy, RT)와 병용될 수 있다.
상기 방사선 치료는 당업계에 알려진 모든 방사선 치료 방법을 사용할 수 있으며, 일 예에서, 회당 방사선 용량에 있어, 면역 체계를 활성화 시킬 가능성이 높다고 알려진 방사선 치료 요법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 실제 연구나 진료를 위해 시행 가능한 방사선 치료 범위로써, 회당 강도 8 내지 12 Gy, 총 1 내지 5 회(Fx), 조사 간격은 1 내지 3일, 또는 2 내지 3일 간격으로 수행될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은, 방사선 치료와 병용되며, PI3K 억제제 및 PD-1 억제제를 동시에 포함함으로써 면역원성 종양의 면역 치료 효과를 높이는 효과가 있다. 구체적으로, 본 발명이 제공하는 삼중음성 유방암의 경감 또는 치료용 약학적 조성물이 처리된 종양 조직은, 하기 나열된 특징으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상, 둘 이상, 셋 이상 또는 하기의 특징 모두를 가질 수 있다:
(1) 종양 조직의 성장률 감소;
(2) 종양 조직 내 Treg 세포의 비율 감소;
(3) 종양 조직 내 MDSC 세포의 비율 감소;
(4) 종양 조직 내 CD8 양성 T 세포의 비율 증가; 및
(5) 종양 조직 내 M2 TAM 세포의 비율 감소 및/또는 M2 TAM 대비 M1 TAM의 비율 증가.
본 발명이 제공하는 삼중음성 유방암의 경감 또는 치료용 약학적 조성물은, 종양의 성장을 억제, 또는 종양의 성장률을 감소시킨다. 일 예에서, 본 발명이 제공하는 삼중음성 유방암의 경감 또는 치료용 약학적 조성물을 투여한 개체에서의 종양 크기(부피)는 무처리 대조군에 비해 0.25배 이하, 0.2배 이하 또는 0.18배 이하일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일 예에서, 본 발명이 제공하는 삼중음성 유방암의 경감 또는 치료용 약학적 조성물을 투여한 개체에서의 종양 크기는 방사선 치료 단독 처리군에 비해 0.5배 이하, 0.4배 이하, 또는 0.3배 이하일 수 있으며, PI3K 억제제 단독 처리군에 비해 0.5배 이하, 0.4배 이하, 0.3배 이하, 또는 0.25배 이하일 수 있고, PD-1 억제제 단독 처리군에 비해 0.5배 이하, 0.4배 이하 또는 0.3배 이하일 수 있으나, 상기 범위에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 일 예에서, 본 발명이 제공하는 삼중음성 유방암의 경감 또는 치료용 약학 조성물을 투여한 개체에서의 종양 크기는 방사선 치료와 PI3K 억제제 병용 처리군에 비해 0.8배 이하, 0.7배 이하, 0.6배 이하, 0.5배 이하, 또는 0.4배 이하일 수 있고, 방사선 치료와 PD-1 억제제 병용 처리군에 비해 0.8배 이하, 0.7배 이하 또는 0.65배 이하일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명이 제공하는 삼중음성 유방암의 경감 또는 치료용 약학적 조성물은, 종양 조직 내 Treg 세포의 비율을 감소시킨다.
Treg 세포는 면역 조절 T 세포로서 면역 치료시 적응 면역에 중요한 역할을 수행하며, 면역 치료의 효과를 떨어뜨리는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 발명이 제공하는 약학적 조성물이 Treg 세포의 비율을 감소시킴으로써, 적응 면역을 억제하고 면역 치료의 효과를 증진시킬 수 있다. 일 예에서, 본 발명의 약학적 조성물을 방사선 치료와 병용(3중 병용)한 종양 조직 내 Treg 세포 비율은 무처리 대조군 대비 60% 이하, 50% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 10 내지 60%, 10 내지 50%, 10 내지 40%, 10 내지 35%, 20 내지 60%, 20 내지 50%, 20 내지 40%, 또는 20 내지 35% 수준일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 실시예에서, PI3K 억제제 및 PD-1 억제제를 방사선 치료와 병용(3중 병용)한 경우, 무처리 대조군 대비 33.7% 수준, PD-1 억제제 및 방사선 치료의 병용시에 비해 37% 수준, PI3K 억제제 및 방사선 치료 병용시에 비해 약 59.4%수준의 Treg 세포 비율을 보였다.
본 발명이 제공하는 삼중음성 유방암의 경감 또는 치료용 약학적 조성물은, 종양 조직 내 MDSC 세포의 비율을 감소시킨다.
MDSC는 골수 유래 면역억제 세포로서 면역 치료시 적응 면역에 중요한 역할을 수행하며, 면역 치료의 효과를 떨어뜨리는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 발명이 제공하는 약학적 조성물이 MDSC 세포의 비율을 감소시킴으로써, 종양이 가진 적응 면역의 저항성을 억제하고 면역 치료의 효과를 증진시킬 수 있다. 일 예에서, 본 발명의 약학적 조성물을 방사선 치료와 병용(3중 병용)한 종양 조직 내 MDSC 비율은 무처리 대조군 대비 90% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 10 내지 90%, 10 내지 80%, 10 내지 75%, 20 내지 95%, 20 내지 80%, 20 내지 75%, 50 내지 90%, 50 내지 80%, 또는 50 내지 75% 수준일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 실시예에서, PI3K 억제제 및 PD-1 억제제를 방사선 치료와 병용(3중 병용)한 경우, 무처리 대조군 대비 73.4% 수준, PD-1 억제제 및 방사선 치료의 병용시에 비해 약 70.2% 수준, PI3K 억제제 및 방사선 치료 병용시에 비해 약 88.6%수준의 MDSC 세포 비율을 보였다.
본 발명이 제공하는 삼중음성 유방암의 경감 또는 치료용 약학적 조성물은, 종양 조직 내 CD8 양성 T 세포의 비율을 증가시킨다.
CD8 양성 T 세포는 킬러 T 세포(killer T cell), 또는 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell)로도 알려져 있으며, 종양 세포를 파괴할 수 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 발명이 제공하는 약학적 조성물이 종양 내 CD8 양성 T 세포의 비율을 증가시킴으로써, 삼중음성 유방암의 종양 성장이 억제될 수 있다. 일 예에서, 본 발명의 약학적 조성물을 방사선 치료와 병용(3중 병용)한 종양 조직 내 CD8 양성 T 세포 비율은 무처리 대조군 대비 2 내지 100배, 2 내지 50배, 2 내지 30배, 2 내지 20배, 5 내지 100배, 5 내지 50배, 5 내지 30배, 5 내지 20배, 10 내지 100배, 10 내지 50배, 10 내지 30배 또는 10 내지 20배 수준일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 실시예에서, PI3K 억제제 및 PD-1 억제제를 방사선 치료와 병용(3중 병용)한 경우, 무처리 대조군 대비 약 16.6배, PD-1 억제제 및 방사선 치료의 병용시에 비해 약 2.24배, PI3K 억제제 및 방사선 치료 병용시에 비해 약 2.42배의 CD8 양성 T 세포 비율을 보였다.
본 발명이 제공하는 삼중음성 유방암의 경감 또는 치료용 약학적 조성물은, 종양 조직 내 M2 TAM 세포의 비율을 감소시킨다.
M2 TAM 세포는 M2 종양 관련 대식세포로서, 항-염증성(anti-inflammatory) 반응과 조직의 리모델링에 관여하는 것으로 알려져 있다. 보다 구체적으로 M2 TAM은 암에 침투된 면역세포들 중 가장 핵심 구성 세포로, 암의 형성에 중요한 역할을 하며, 염증 환경을 조성하고 종양이 자라도록 유도하며, 암의 혈관 신생, 침투, 전이가 일어나도록 돕고 항암 면역력을 억제시키는 것으로 알려져 있어, 암 면역 치료의 표적이 된다. 따라서 본 발명이 제공하는 약학적 조성물이 종양 조직 내 M2 TAM의 비율을 감소시킴으로써 우수한 항암 효과를 가짐을 확인할 수 있다.
일 예에서, 본 발명의 약학적 조성물을 방사선 치료와 병용(3중 병용)한 종양 조직 내 M2 TAM 비율은, 무처리 대조군 대비 50% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 10 내지 50%, 10 내지 40%, 10 내지 35%, 20 내지 50%, 20 내지 40%, 20 내지 35%, 30 내지 50%, 30 내지 40%, 또는 30 내지 35%일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 실시예에서, 무처리 대조군에서의 M2 TAM 세포 비율은 4.68% 수준이었으나, PI3K 억제제, PD-1 억제제의 투여 및 방사선 치료를 병용 (3중 병용)한 마우스에서는 1.50% 수준으로 나타나, 방사선 치료 단독시의 M2 TAM 비율(5.22%) 또는, 가장 큰 감소폭을 보인 PI3K 억제제 투여시의 M2 TAM 비율(2.43%) 보다 더 낮은 수치의 M2 TAM 비율을 보여, 3종 병용시, 보다 항암 효과가 우수함을 확인하였다.
본 발명이 제공하는 삼중음성 유방암의 경감 또는 치료용 약학적 조성물은, 종양 조직 내 M2 TAM 세포 대비 M1 TAM 세포의 비율을 증가시킬 수 있다.
M2 TAM 세포는 상술한 바와 같이 암의 형성에 관여하며, M1 TAM 세포는 항암 활성에 관여 하는 것으로 알려져 있어, M1 TAM 세포의 비율이 높을수록 우수한 항암 활성을 가지는 것으로 예측할 수 있다.
일 예에서, 본 발명의 약학적 조성물을 방사선 치료와 병용(3중 병용)한 종양 조직 내 M1 TAM 비율은, 무처리 대조군 대비 1.1 내지 3배, 1.1 내지 2.5배, 1.1 내지 2배, 1.3 내지 3배, 1.3 내지 2.5배, 1.3 내지 2배, 1.5 내지 3배, 1.5 내지 2.5배, 또는 1.5 내지 2배일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 실시예에서, 무처리 대조군에서의 M1 TAM 세포 비율은 30.27% 수준이었으나, PI3K 억제제, PD-1 억제제의 투여 및 방사선 치료를 병용 (3중 병용)한 마우스에서는 53.92% 수준으로 나타나, 오히려 M1 TAM 비율이 감소한 것으로 나타난 PD-1 억제제 단독 투여(26.13% 수준) 및/또는 PI3K 억제제 및 방사선 치료의 2중 병용 (27.18% 수준)과 달리 M1 TAM에 의한 항암 활성이 3중 병용시 크게 증가함을 확인하였다. 또한 3중 병용시, 나머지 실험 그룹중 가장 큰 M1 TAM 비율의 증가폭을 보인 PI3K 억제제 단독 투여시보다(40.98%) 더 높은 수치의 M1 TAM비율을 보여, 3종 병용시 항암 효과가 현저히 상승함을 확인하였다.
본 발명이 제공하는 약학적 조성물은 삼중음성 유방암(TNBC)의 원발 부위 외의 부위에 발생한 전이 종양 및/또는 재발성 종양의 성장을 억제하는 것일 수 있다. 일 예에서, PI3K 억제제, 및 PD-1 억제제를 방사선 치료와 병용하는 경우 (3중 병용), 비장 조직 및/또는 종양 배수 림프절에서 상술한 종양 조직에서의 Treg, MDSC, 및/또는 CD8+ T cell의 비율 변화와 유사한 변화 패턴을 나타낼 수 있다.
일 실시예에서, 삼중 병용 치료된 마우스 모델의 비장 및 종양 배수 림프절에서 대조군에 비해 Treg 및 MDSC 비율이 감소하였으며, CD8+ T cell의 비율이 증가하여, 원발 부위가 아닌, 투여 대상이 되는 개체 내의 원발 부위 외 다른 부위에 대해서도 면역 치료 효과가 나타남을 확인하였다.
따라서 본 발명이 제공하는 약학적 조성물은 방사선 치료와 병용하여 삼중음성유방암(원발성 종양, Primary tumor) 및 이의 전이 종양 및/또는 재발성 종양에 대한 경감 및/또는 치료용으로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 상기 "전이 종양"은, 삼중음성 유방암이 발병 위치(원발 부위)로부터 거리상으로 분리되어 있는 다른 곳으로 옮겨져 발병한 종양을 의미하며, 상기 "재발성 종양"은 상기 원발성 종양과 동일한 위치 및/또는 거리상 분리되어 있는 위치에서 발병한, 상기 원발성 종양과 동일한 종류의 종양을 의미한다.
본 발명이 제공하는 약학적 조성물의 투여 방법은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 경구 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 경막내 주사, 피하 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 투여, 질 투여, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입 투여, 분무 투여, 피부 투여, 및 경피 투여로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상, 둘 이상, 또는 셋 이상의 투여 방법을 이용해 투여될 수 있다. 일 예에서, 상기 약학적 조성물은 주사 투여될 수 있다.
본 발명이 제공하는 약학적 조성물의 제형은 삼중음성 유방암의 치료를 위해 적절한 방법으로 선택하여 제조될 수 있으며, 예를 들어, 건조시럽제, 구강붕해정, 박칼정, 발포정, 산제, 설하정, 액제, 정제, 캡슐제, 츄어블정, 가글제, 관장액, 비강분무제, 연고, 크림, 로션, 점비제, 점안제, 점이제, 질 좌제, 패취제, 항문 좌제, 흡입제(에어로졸), 흡입제 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 아니하며, 투여 대상의 체중, 연령, 병기, 및/또는 예후를 고려하여 적절한 제형을 선택하여 사용될 수 있다.
본 발명이 제공하는 약학적 조성물은, 유효성분인 PI3K 억제제 및 PD-1 억제제 외에 약학적 유용성을 높이고 제제화를 용이하게 하며 제제의 안정화를 도모하고 외관을 좋게 하는 등의 목적으로 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 첨가제는 필요에 따라 부형제, 안정화제, 보존제, 완충제, 교미제, 현탁화제, 유화제, 방향제, 용해보조제, 착색제, 집중제, 또는 이들의 조합이 사용될 수 있다. 상기 첨가제는 본원의 약학적 조성물의 투여량에서 직접적인 약리작용을 나타내지 않고 안전하며, 본원 약학적 조성물의 치료 효과를 변하게 하거나 시험에 지장을 주지 않는 범위에서 자유롭게 선택되어 사용될 수 있다.
일 구현예에서 본 발명의 약학적 조성물이 주사제의 형태로 제공되는 경우, 상기 첨가제는, 용제, 용해 보조제, 완충제, 등장화제, 안정제, 항산화제, 무통화제, 및 현탁화제로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상, 둘 이상, 셋 이상, 또는 상기 전부의 첨가물을 모두 포함할 수 있다. 상기 첨가물의 함량 및/또는 종류는 본 발명의 목적 범위 내에서 통상의 기술자가 당업계에 공지된 범위 내에서 자유롭게 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예는, 삼중음성 유방암 환자에서의 삼중음성 유방암의 치료 방법으로서, PI3K 억제제를 상기 환자에게 투여하는 단계; PD-1 억제제를 상기 환자에게 투여하는 단계; 및 상기 환자에 대하여 방사선 치료를 수행하는 단계를 포함하는, 삼중 음성 유방암의 치료 방법에 관한 것이다. 상기 치료 방법은, 상기 투여하는 단계 및/또는 방사선 치료를 수행하는 단계 이전에, 삼중음성 유방암 환자 또는 삼중음성 유방암의 치료를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 PI3K 억제제, PD-1 억제제, 및 방사선 치료에 관한 내용은 상술한 바와 같다. 상기 PI3K 억제제, PD-1 억제제 및 방사선 치료의 3중 병용시, 각 처치의 단독 또는 2중 병용시에 비해 삼중음성 유방암 환경에서의 적응 면역의 저항성(adaptive immune resistance)을 감소시켜 면역 치료의 효과를 증진시키고, 항암 활성이 증가하는 효과가 있다.
상기 PI3K 억제제 및/또는 PD-1 억제제의 투여는 동시에 또는 시간 간격을 두고 투여될 수 있으며, 투여 방법 및/또는 용량은 상기 약학적 조성물에서의 투여 방법 및/또는 용량과 실질적으로 동일하며, 필요에 따라 삼중음성 유방암의 치료 목적 및/또는 약학적으로 허용되는 범위 내에서 자유롭게 투여 방법 및/또는 용량이 선택될 수 있다.
상기 방사선 치료는 상기 PD-1 억제제 및 PI3K 억제제의 투여와 동시에 또는 시간 간격을 두고 수행될 수 있으며, 일 예에서, 방사선 치료와 상기 억제제의 투여는 동일자 또는 이일자에 이루어질 수 있다.
본 발명이 제공하는 약학적 조성물은 방사선 치료와 병용하여 투여됨으로써 항암(항종양) 효과를 증진시키고, 면역원성 종양, 예를 들어 삼중음성 유방암의 면역 치료 또는 방사선치료 시 발생하는 종양의 적응 면역 저항성으로 인한 낮은 반응률을 개선할 수 있다.
도 1은 삼중음성유방암 동종 이식 마우스 모델에서 각 치료 방법에 따른 종양의 부피 변화를 나타낸 그래프이다.
도 2a 내지 2c는 비장 조직에 대한 FACS 분석 결과 및 FACS 결과로부터 분석된 조절 T세포(도 2a); 다핵구성 및 단핵구성 골수유래 면역억제 세포(PMN-MDSC, 도 2b); 및 CD8 양성 T 세포(도 2c)의 비율을 나타낸 그래프이다.
도 3a 내지 3c는 종양 배수 림프절에 대한 FACS 분석 결과 및 FACS 결과로부터 분석된 조절 T세포, 골수유래 면역억제 세포(PMN-MDSC, 도 3b), 및 CD8 양성 T 세포(도 3c)의 비율을 나타낸 그래프이다.
도 4a 내지 4c는 종양 미세 환경(종양 조직)에 대한 FACS 분석 결과 및 FACS 결과로부터 분석된 조절 T세포(도 4a), 골수유래 면역억제 세포(PMN-MDSC 및 M-MDSC, 도 4b), 및 CD8 양성 T 세포(도 4c)의 비율을 나타낸 그래프이다.
도 5는 종양 미세 환경(종양 조직)에 대한 FACS 분석 결과 및 이로부터 M1 또는 M2 TAMs 분석을 수행한 결과이다.
이하 본 발명의 내용을 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 세포의 배양 및 동종이식 마우스 모델의 제조
1-1. 유방암 세포주의 배양
삼중음성 유방암 세포주 (4T1-luc)는 10%(v/v) 소태아혈청(Fetal bovine serum, FBS) 및 1%(w/v) 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin-Streptomycin)이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, CORNING™) 배지에서, 세포 배양 플라스크를 이용해 37℃, 5% CO2 조건이 유지되는 항온 세포 배양기에서 배양하였다.
1-2. 동종이식 마우스 모델의 제조
상기 실시예 1-1에서 제조된 4T1-luc 삼중음성 유방암 세포 6 Х 105개를 BALB/c 암컷 연령표준 (8주) 마우스의 오른쪽 뒷다리에 주입하였다. 상기 각 암세포의 주입 이후 10일 째 되는 날 종양 부피가 40 mm3에 이르는 마우스를 선별하여, 이후 실험에 이용하였다.
실시예 2. 치료 방법에 따른 종양의 크기 변화 측정
상기 실시예 1-2의 방법으로 제조된 삼중음성 유방암(TNBC) 마우스 모델은 암세포 이식일로부터 10일 째부터 총 7군으로 배정하여 각 치료법을 수행하였으며, 각 군마다 7마리의 마우스 종양 평균 부피가 40 mm3가 되도록 7개 군으로 그룹화하여 이후 실험에 이용하였다.
상기 7군은 각각 대조군(무치료군), 방사선치료군, PI3Kγδ 억제제(duvelisib) 처리군, PI3Kγδ 억제제 및 방사선치료의 병용 치료군, PD-1 억제제 처리군, PD-1 억제제 및 방사선치료의 병용 치료군, 및 PI3Kγδ 억제제, PD-1 억제제 및 방사선 치료의 삼중 병용 치료군으로 구성되었다. 각 치료는 종양 이식 후 31일간 진행되었다.
방사선 치료는 전자선을 이용하였으며, 1주일간 2일 또는 3일에 한 번 (월요일, 수요일, 및 금요일) 총 24Gy를 3번에 나누어 조사하였다 (8 Gy x 3). PD-1 억제제는 10mg/kg의 용량으로, PI3Kγδ 억제제(duvelisib)는 4mg/kg의 용량으로 2일 또는 3일에 한 번 (월요일, 수요일, 금요일) 총 2주에 걸쳐 총 6회 주사 투여되었다. 방사선 치료와 약물 투여가 겹치는 날에는 방사선 치료 후 4시간 이후에 생쥐가 마취상태에서 회복된 것을 확인 후 약물을 투여하였다.
각 치료 수행일마다 종양의 크기를 버니어 캘리퍼스(Vernier Caliper)를 이용해 길이(length)와 너비(width)를 측정한 후 하기의 수학식 1의 방법으로 종양의 부피(volume, mm3)을 계산하였다.
[수학식 1]
Volume(mm3) = length(mm) x {width(mm)}2 x 0.5
도 1에 각 치료 방법에 따른 시간의 경과에 따른 종양 부피의 변화 그래프를 나타내었으며, 하기 표 1에 실험 종료일 기준 각 처리군에서의 최종 종양 부피의 평균값을 나타내었다.
분류 평균 종양 부피(mm3)
대조군(무처리) 1331.34
RT 720.72
PI3Kγδ 억제제 924.64
PI3Kγδ 억제제 + RT 570.51
PD-1 억제제 782.29
PD-1 억제제 + RT 336.88
PI3Kγδ 억제제 + PD-1 억제제 + RT 206.51
상기 표 1과 도 1에서 확인되는 바와 같이, PI3Kγδ 억제제, PD-1 억제제 및 RT 억제제의 3중 병용시에는 최종 종양 부피가 약 206mm3에 그쳐 이중 이중 병용 치료에 비해 월등한 종양 성장 억제 효과를 확인하였다. 보다 구체적으로, 이러한 최종 종양 부피는 대조군 대비 0.16배, 방사선 치료 단독 처리시에 비해 0.29배, PI3Kγδ 억제제 단독 처리시의 0.22배, PD-1 단독 처리된 그룹에 비해 0.26배, PI3Kγδ 억제제와 방사선 치료의 병용시에 비해 0.22배, 및 PD-1 억제제와 방사선 치료의 병용시에 비해 0.61배에 불과한 크기에 불과하여, 본 발명이 제공하는, 방사선 치료와 병용되는 PD-1 억제제 및 PI3Kγδ 억제제를 포함하는 약학적 조성물의 종양 성장 억제 효과가 매우 뛰어남을 확인하였다.
실시예 3. FACS를 이용한 면역 조절 효과의 확인
상기 실시예 2의 실험을 마친 후, 각 마우스로부터 종양과 비장, 종양 배수림프절(draining lymph node)을 각각 적출하였다. 종양 배수림프절은 종양을 심었던 뒷다리(hindlimb) 종아리 부위에 가장 가까운 inguinal lymph node를 적출하였다. 그리고 각 조직을 단일세포화(single cell isolation)하여 이후 유세포 분석법(flow cytometric analysis, FACS)를 이용해 면역 조절 효과를 확인하였다.
보다 구체적으로 종양 세포 주입 후 31일째에 각 마우스를 안락사 시킨 후 비장과 종양을 각각 적출하였다.
종양 조직은 절제된 후 멸균된 면도날을 사용하여 잘게 자르는 (fine chopping) 기계적 가공을 하고 DNase 0.1mg/ml, 콜라게나아제 1mg/ml를 각각 처리하여 36℃, 30 분간 반응하여 단일세포 현탁액을 얻었다.
비장 조직은 절제된 후 상기 종양 조직과 마찬가지의 방법으로 기계적 가공을 거친 후, Single cell suspension 방법(Thermofisher 사의 Standard Recommended Sample Preparation Procedures 참조)으로 적혈구를 용해하고 단일 세포 분리를 완료하였다.
종양 조직과 비장 조직으로부터 단일 세포 분리를 마친 후, 침윤 백혈구를 분석하기 위해, FACS 튜브당 1x106개의 세포를 CD3 항체, CD8b 항체, Ly6G 항체, CD11b 항체, CD25 항체, CD4 항체, Ly6G 항체, CD25 항체, Ly6C 항체, CD8a 항체, CD25 항체, CD127 항체, CD206 항체를 각각 이용해 FITC, PE, PerCP/Cy5.5, APC 형광으로 염색을 수행하였다.
각 세포 표면 마커의 염색은 얼음 위에서 30분간 반응하여 수행하였고, 세포 내 FOXP3 염색은 eBioscience 사의 매뉴얼에 따라 진행하였다.
각 염색을 모두 마친 샘플에 대해, BD Bioscience FACSCalibur machines을 이용하여, 종양 미세환경 및 비장에서의 조절 T 세포 (Tregs 또는 Treg), 골수유래 면역 억제 세포 (MDSCs), M1 또는 M2 종양관련 대식세포 (TAMs: M1 TAM 또는 M2 TAM), CD8+ 세포독성 T 세포의 분획을 각각 계산하였다. FACS 결과의 분석은 FlowJo software, version 10을 이용하였으며, 그 결과를 도 2a 내지 4c에 나타내었다. 구체적으로, 도 2a 내지 2c는 비장 조직에서의 FACS 분석 결과, 도 3a 내지 3c는 종양 배수 림프절에서의 FACS 분석 결과, 도 4a 내지 5는 종양 조직(종양 미세환경)에서의 FACS 분석 결과를 나타낸 것이다.
배수 림프절과 비장 내 면역 세포의 조성 변화는 치료가 적응 면역으로 이어져 다른 곳의 종양을 억제하기 위한 전제 조건이다. 도 2a 내지 도 4c에서 확인된 종양 배수 림프절(도 3a 내지 3b) 및 비장(도 2a 내지 2b) 내 면역세포들의 변화는, 본 발명이 제공하는 약학적 조성물과 방사선 치료의 병용이 단순한 원발 해부학적 위치의 종양미세환경에서 면역 증진 또는 그로 인한 면역 세포들의 항종양억제 역할을 넘어, 적응 면역을 발생시켜 원발 부위 외의 다른 해부학적 위치의 전이 또는 재발성 종양에 대해서도 종양 형성 억제 기능을 가질 수 있음을 확인하였다.
비장과 종양 배수 림프절 및 종양 조직 내 Treg, MDSC(PMN_MDSC) 및 CD8+ T 세포 비율을 하기 표 2 내지 4에 나타내었다.
구분 Treg 비율 (%)
비장 종양 배수 림프절 종양
대조군 6.46 5.43 12.62
RT 16.77 7.36 16.23
PI3Kγδ inhibitor 2.93 2.33 3.63
PI3Kγδ inhibitor+RT 3.64 2.61 7.15
PD-1 blockade 5.85 5.69 8.27
PD-1 blockade+RT 15.95 6.46 11.51
PI3Kγδ inhibitor+PD-1 blockade+RT 2.69 1.89 4.25
구분 PMN-MDSC 비율 (%)
비장 종양 배수 림프절 종양
대조군 58.70 3.63 26.55
RT 63.37 3.30 30.67
PI3Kγδ inhibitor 37.33 2.01 19.20
PI3Kγδ inhibitor+RT 36.75 2.77 21.98
PD-1 blockade 62.82 3.86 25.88
PD-1 blockade+RT 65.70 3.32 27.75
PI3Kγδ inhibitor+PD-1 blockade+RT 37.63 2.00 19.48
구분 CD8+ T 세포 비율 (%)
비장 종양 배수 림프절 종양
대조군 13.87 15.93 1.64
RT 25.37 22.87 10.10
PI3Kγδ inhibitor 14.00 19.20 4.85
PI3Kγδ inhibitor+RT 22.02 22.33 11.23
PD-1 blockade 20.62 16.15 3.33
PD-1 blockade+RT 23.40 25.90 12.13
PI3Kγδ inhibitor+PD-1 blockade+RT 25.75 28.60 27.17
도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이 방사선 치료와 PD-1 억제제 및 PI3K 억제제를 병용하는 경우, 방사선 또는 각 억제제의 단독 또는 이중 병용시에 비해 M1 TAM의 비율이 가장 높아졌으며, 대조군(무처리군) 대비 M1 TAM 비율이 약 1.8배 증가하였다. M2 TAM은 3중 병용시 대조군 대비 약 1/3 수준의 M2 TAM 비율을 보여, 방사선 치료 또는 각 억제제의 단독 또는 이중 병용시에 비해 현저히 낮은 M2 TAM 비율을 나타내었다 (표 5).
구분 M1 TAM 비율(%) M2 TAM 비율(%)
대조군 30.27 4.68
RT 35.72 5.22
PI3Kγδ inhibitor 40.98 2.43
PI3Kγδ inhibitor+RT 27.18 3.20
PD-1 blockade 26.13 4.49
PD-1 blockade+RT 31.27 6.75
PI3Kγδ inhibitor+PD-1 blockade+RT 53.92 1.50
M1 TAM은 M2 TAM과는 반대로 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)을 분비함으로써 종양미세환경내에서 종양을 억제한다. 따라서 상기 표 5 및 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이 M1 TAM이 큰 폭으로 증가하고 M2 TAM이 현저히 감소된 본원의 방사선 병용 치료용 PI3K 억제제 및 PD-1 억제제를 포함하는 약학적 조성물의 면역치료 효율이 우수함을 확인하였다.

Claims (8)

  1. 포스파티딜이노시톨 3-키나아제(Phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K) 델타 및 PI3K 감마로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 PI3K의 억제제; 및 프로그램화 세포 사멸 단백질 1(Programmed cell death protein-1, PD-1) 억제제를 포함하며,
    방사선 치료(Radiotherapy, RT)와 병용되는 것인,
    삼중음성 유방암의 경감 또는 치료용 약학적 면역 치료제 조성물로서,
    상기 PI3K의 억제제는 두벨리십, 테날리십 및 아이델라리십으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상이고,
    상기 PD-1 억제제는 펨브로리주맵 및 니볼루맙으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상이며,
    상기 삼중음성유방암은 전이 종양; 또는, 전이종양, 및 원발성 종양 및 재발성 종양으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 PI3K 억제제는 PI3K 델타 및 감마에 대한 억제제인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 PI3K 억제제와 PD-1 억제제는 9:1 내지 1:9의 중량비로 혼합된 것인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물이 방사선 치료와 함께 처리된 개체의 종양 부피는 무처리 대조군에서의 종양 부피의 0.25배 이하인 것인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은, 종양 조직 내 CD8 양성 T 세포의 비율을, 무처리 대조군 대비 2배 내지 100배 증가시키는 것인, 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물이 투여된 종양 조직은, 종양 조직 내 조절 T 세포(Treg)의 비율이 무처리 대조군에 비해 60% 이하 수준이고, 골수 유래 면역 억제세포(MDSC)의 비율이 무처리 대조군에 비해 90% 이하 수준인 것인, 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물이 투여된 종양 조직은 무처리 대조군 대비 M2 종양 관련 대식세포(M2 TAM)의 비율이 50% 이하이고, M1 종양 관련 대식세포(M1 TAM)의 비율이 무처리 대조군 대비 1.1 내지 3배인 것인, 조성물.
  8. 삭제
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