CN110662559A - 用于靶向并杀死ALPHA-V BETA-3(αvβ3)-阳性癌症干细胞(CSC)和治疗耐药癌症的组合物和方法 - Google Patents
用于靶向并杀死ALPHA-V BETA-3(αvβ3)-阳性癌症干细胞(CSC)和治疗耐药癌症的组合物和方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110662559A CN110662559A CN201880033739.9A CN201880033739A CN110662559A CN 110662559 A CN110662559 A CN 110662559A CN 201880033739 A CN201880033739 A CN 201880033739A CN 110662559 A CN110662559 A CN 110662559A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polypeptide
- cancer
- antibody
- tumor
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
- C07K16/2848—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily against integrin beta3-subunit-containing molecules, e.g. CD41, CD51, CD61
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
- A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
- A61K31/517—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. quinazoline, perimidine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70546—Integrin superfamily
- C07K14/70557—Integrin beta3-subunit-containing molecules, e.g. CD41, CD51, CD61
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
提供了用于治疗或减轻癌症的组合物和方法,通过靶向在癌症干细胞(CSC)细胞表面表达的ALPHA‑V BETA‑3多肽而杀死CSC,从而治疗由在其细胞表面上表达ALPHA‑V BETA‑3多肽的癌症细胞或肿瘤细胞,或者癌症干细胞导致或起始,或者由其维持的癌症。提供了用于靶向和杀死ALPHA‑V BETA‑3阳性癌症干细胞(CSC)和治疗耐药癌症的组合物和方法。在可选的实施方案中,本文中提供的组合物和方法使用抗体,所述抗体能够特异性地结合人ALPHA‑V BETA‑3,所述抗体也包括能够介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)通过巨噬细胞杀死癌症细胞的Fc部分;例如,使用针对ALPHA‑V BETA‑3的人源化抗体,其经修饰以包括工程化的。
Description
相关申请
该专利合作条约(PCT)国际申请要求于2017年3月31日提交的美国临时专利申请号62/479,768的优先权权益。前述申请通过引用,以其整体并为所有目地清楚地并入本文。
政府权利
该发明是在由国立卫生研究院(NIH)授予的批准号T32 OD017853;T32 HL086344;T32 HL098062-03;R-857GC;NCI R01CA045726的政府资助下做出的。政府具有本发明中的某些权利。
技术领域
本发明大体上涉及免疫学和肿瘤学。在可选择的实施方案中,提供了用于治疗或减轻癌症的组合物和方法,通过靶向在癌症干细胞(CSC)中细胞表面表达的αvβ3(avb3)多肽而杀死CSC,从而治疗减轻或减缓由在其细胞表面上表达αvβ3多肽的癌细胞或肿瘤细胞,或者癌症干细胞(CSC)引起或起始的,或者由其维持的癌症的发展。
背景技术
肿瘤相关巨噬细胞参与癌症生长和侵袭性的调控。M2巨噬细胞向微环境中分泌促肿瘤细胞因子以维持肿瘤的进展,而M1巨噬细胞触发炎性响应并抑制肿瘤生长。巨噬细胞由M1向M2的转换与肺癌的进展相关,而且癌症干细胞作为该重编程过程的驱动因子已被牵涉到其中。
发明内容
在可选择的实施方案中,提供了用于以下的方法:
-在有需要的个体中杀死表达αvβ3(avb3)多肽的癌细胞或癌症干细胞(CSC),或降低其数目,
-在有需要的个体中治疗、减轻或逆转或减缓表达αvβ3(avb3)多肽的癌症或肿瘤的发展,
-减轻或减缓由在其细胞表面上表达αvβ3多肽的癌细胞或肿瘤细胞,或者癌症干细胞(CSC)引起或起始的癌症的发展,或者由其维持的癌症的发展,
-增加能够在体内触发炎性响应并抑制肿瘤生长的巨噬细胞群,其中任选地所述能够触发炎性响应并抑制肿瘤生长的巨噬细胞群包括肿瘤相关巨噬细胞(TAM)或者M1巨噬细胞群,
-增强表达αvβ3(avb3)多肽的癌症或肿瘤对于治疗(任选地化学疗法,任选地用生长因子抑制剂治疗)效果的敏感性,
所述方法包括:
(a)向有需要的个体给予能够特异性地结合至在癌细胞或肿瘤细胞上,或在CSC上表达的αvβ3(avb3)整合素多肽的抗体或多肽,或者
(b)(i)提供能够特异性地结合至在癌细胞或肿瘤细胞上,或在CSC上表达的αvβ3(avb3)整合素多肽的抗体或多肽,
其中所述抗体或多肽具有能够结合巨噬细胞并起始抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)杀死所述抗体特异性结合的细胞的Fc结构域或同等结构域或部分,
(ii)向有需要的个体施用所述抗体或多肽,
从而导致:
在有需要的个体中杀死表达αvβ3(avb3)多肽的癌细胞或癌症干细胞(CSC),或降低其数目,
-在有需要的个体中治疗、减轻或逆转或减缓表达αvβ3(avb3)多肽的癌症或肿瘤的发展,
-减轻或减缓由在其细胞表面上表达αvβ3多肽的癌细胞或肿瘤细胞,或者癌症干细胞(CSC)引起或起始的,或者由其维持的癌症的发展,
-增加能够在体内触发炎性响应并抑制肿瘤生长的巨噬细胞群,其中任选地所述能够触发炎性响应并抑制肿瘤生长的巨噬细胞群包括肿瘤相关巨噬细胞(TAM)或者M1巨噬细胞群,
-增强表达αvβ3(avb3)多肽的癌症或肿瘤对于治疗效果的敏感性。
在可选择的实施方案中,提供了方法:其中所述抗体或多肽是人源化抗体,任选地是人源化鼠抗体;或者其中所述抗体或多肽是重组的或者工程化的抗体;或者其中所述的抗体是人抗体;或者其中所述的抗体是单克隆抗体,或者是多克隆抗体;或者,其中所述抗体是:单克隆抗体LM609(Chemicon Int.,Temecula,CA)(CVCL_KS89)(ATCC登录号为HB9537的鼠杂交瘤细胞)(参见例如美国专利号7,115,261);衍生自23C6克隆的单克隆抗体CBL544(MilliporeSigma,Burlington,MA);单克隆抗体ab7166(abcam,Cambridge,MA);或者,单克隆抗体ab78289(abcam,Cambridge,MA),或其任意的人源化形式,或包括LM609、CBL544、ab7166或ab78289的αvβ3-结合CDR的任意多肽。
在可选的实施方案中,提供了方法:其中所述巨噬细胞是人巨噬细胞,或者肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、M1巨噬细胞,或者肿瘤抑制性M2巨噬细胞。
在可选的实施方案中,提供了方法:其中所述癌症是上皮癌或者上皮肿瘤细胞;或者其中所述癌症是耐药癌症,并且任选地所述药物是生长因子抑制剂或激酶抑制剂,其中任选地所述生长因子抑制剂包括受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂,任选地为厄洛替尼。
在可选的实施方案中,提供了方法:其中所述抗体或多肽通过静脉、肌内或皮下向有需要的个体施用;或者其中所述抗体或多肽被配制为无菌药学组合物或制剂,或者被配制用于静脉、肌内或皮下施用;或者其中抗体或多肽的剂量是基于固定给药或者基于体重给药,或者每月大约100至1200mg的固定剂量,或者为大约0.3至10mg/kg的剂量。
在可选的实施方案中,提供了方法,进一步包括施用生长因子抑制剂,其中任选地所述生长因子抑制剂包括受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂、Src抑制剂、抗代谢物抑制剂、吉西他滨、GEMZARTM、有丝***毒剂、紫杉醇、他克唑、ABRAXANETM、厄洛替尼、TARCEVATM、拉帕替尼、TYKERBTM、西妥昔单抗(a cetuxamib)、ERBITUXTM,或者胰岛素生长因子抑制剂。
在可选的实施方案中,提供了以下物质在制备药物中的用途:能够特异性地结合至在癌细胞或肿瘤细胞上,或在CSC上表达的αvβ3(avb3)整合素多肽的抗体或多肽;或者能够特异性地结合至在癌细胞或肿瘤细胞上,或在CSC上表达的αvβ3(avb3)整合素多肽的抗体或多肽,其中所述抗体具有能够结合巨噬细胞并起始抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)杀死所述抗体特异性结合的所述细胞的Fc结构域或同等结构域或部分,所述药物用于:
-在有需要的个体中杀死表达αvβ3(avb3)多肽的癌细胞或癌症干细胞(CSC),或降低其数目,
-在有需要的个体中治疗、减轻或逆转或减缓表达αvβ3(avb3)多肽的癌症或肿瘤的发展,
-减轻或减缓由在其细胞表面上表达αvβ3多肽的癌细胞或肿瘤细胞,或者癌症干细胞(CSC)引起或起始的,或者由其维持的癌症的发展,
-增加能够在体内触发炎性响应并抑制肿瘤生长的巨噬细胞群,其中任选地所述能够触发炎性响应并抑制肿瘤生长的巨噬细胞群包括肿瘤相关巨噬细胞(TAM)或者M1巨噬细胞群,
-增强表达αvβ3(avb3)多肽的癌症或肿瘤对于治疗效果的敏感性。
在可选的实施方案中,提供了药学组合物或制剂,其用于在用于下述的方法中使用:
-在有需要的个体中杀死表达αvβ3(avb3)多肽的癌细胞或癌症干细胞(CSC),或降低其数目,
-在有需要的个体中治疗、减轻或逆转或减缓表达αvβ3(avb3)多肽的癌症或肿瘤的发展,
-减轻或减缓由在其细胞表面上表达αvβ3多肽的癌细胞或肿瘤细胞,或者癌症干细胞(CSC)引起或起始的,或者由其维持的癌症的发展,
-增加能够在体内触发炎性响应并抑制肿瘤生长的巨噬细胞群,其中任选地所述能够触发炎性响应并抑制肿瘤生长的所述巨噬细胞群包括肿瘤相关巨噬细胞(TAM)或者M1巨噬细胞群,
-增强表达αvβ3(avb3)多肽的癌症或肿瘤对于治疗效果的敏感性,
其中所述药学组合物或制剂包含:
能够特异性地与结合至在癌细胞或肿瘤细胞上,或在CSC上表达的αvβ3(avb3)整合素多肽的抗体或多肽;或者,能够特异性地结合至在癌细胞或肿瘤细胞上,或在CSC上表达的αvβ3(avb3)整合素多肽的抗体,其中所述抗体或多肽具有能够结合巨噬细胞并起始抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)杀死所述抗体或多肽特异性结合的所述细胞的Fc结构域或同等结构域或部分。
一个或多个示例性实施方案的详细内容在下文随附的附图和说明中阐明。根据说明书和附图,以及根据权利要求,本发明的其他特征、目标和优势将显而易见。本文中引用的所有出版物、专利、专利申请为了所有目的通过引用被清楚地并入本文。
附图说明
本文中列出的附图是本文中提供的实施方案的说明,并且不意味着限制由权利要求所涵盖的本发明的范围。
图1A-I示意性地通过图示阐明了涉及肺癌对于EGFR抑制剂的耐受性的获得性耐受途径的评估,其导致αvβ3上调和获得药物耐受的干细胞样命运:
图1A:通过图示阐明厄洛替尼耐受性异种移植模型的图解,即如何用载体或厄洛替尼处理荷载αvβ3-阴性的EGFR突变体人非小细胞肺癌(HCC827)皮下异种移植物的小鼠,并随着时间推移测量肿瘤生长;
图1B:图示数据,所述数据显示与对照(“Veh”或载体)相比,肿瘤如何在几个星期之后最终开始再生长,显示肿瘤体积作为处理天数的函数,用对照或者厄洛替尼处理HCC827(β3-)异种移植小鼠。
图1C:阐明了肿瘤组织针对β3被染色的图像;
图1D:通过图示阐明了流式细胞术研究的数据,其中自厄洛替尼耐受性组织分离的细胞针对αvβ3和ALDH1A1被染色;
图1E:通过图示阐明了流式细胞术的数据,其中自载体处理的小鼠(veh)和厄洛替尼处理的小鼠(ErlR)分离的肿瘤细胞针对αvβ3被染色;
图1F:通过图示阐明了用厄洛替尼或奥希替尼处理细胞72小时之后的细胞活力;
图1G:通过图示阐明了数据,所述数据显示在原发肿瘤仍然响应处理时,厄洛替尼增加CTC;其中在肺注射HCC827(β3-,GFP+,荧光素酶+)细胞8周之后,用厄洛替尼处理小鼠30天,接着分离CTC,并将CTC针对αvβ3染色,并且在处理之前(处理前,n=3)和处理之后(处理后,n=5)计数来自小鼠的αvβ3-阳性(β3+)和αvβ3-阴性(β3-)CTC。
图1H:阐明了图1G中的原发病变的图像。
图1I:通过图示阐明M2-TAM如何在厄洛替尼耐受性异种移植组织中增加;在处理50天之后,在载体处理(n=9)和厄洛替尼处理(n=9)之间比较肿瘤组织中M1的百分比(深灰色)和M2-TAM的百分比(浅灰色);
如下文实施例1中进一步详细讨论。
图2A-2E示意性地通过图示阐明了数据,所述数据显示LM609产生侵袭性较低的表型:
图2A通过图示阐明LM609抑制厄洛替尼耐受性的获得,其中用厄洛替尼或者厄洛替尼和LM609处理HCC827(β3-)异种移植小鼠;
图2B上图和下图通过图示和以图像阐明数据和组织染色图像,显示LM609消除β3-阳性细胞;其中用磺丁基-β-环糊精(Captisol)和PBS、磺丁基-β-环糊精和LM609、厄洛替尼和PBS,或者厄洛替尼和LM609处理HCC827(β3-)异种移植小鼠50天,并且针对整合素β3将肿瘤组织染色(下图),且定量组织中的β3-阳性区域(上图);
图2C-2E示意性地通过图示阐明了LM609减少由厄洛替尼诱导的CTC的数量:右肺注射HCC827(β3-,GFP+,荧光素酶+)细胞之后8周,用厄洛替尼或厄洛替尼和LM609的组合(厄洛替尼+LM609)处理小鼠4周,接着分离CTC,并且在处理之前和用厄洛替尼(厄洛替尼处理后,n=4)或厄洛替尼和LM609的组合(厄洛替尼+LM609处理后,n=5)处理之后通过生物发光法测量肿瘤体积(图2D),并且定量(图2C,上图);将CTC针对αvβ3染色,以定量αvβ3-阳性(β3+)和αvβ3-阴性(β3-)CTC(图2C,下图);显示了αvβ3-阳性CTC的一个实例(图2E);
如下文实施例1中进一步详细讨论。
图3A-3E通过图示阐明LM609通过巨噬细胞介导的ADCC消除αvβ3-阳性细胞:
图3A-3C:LM609在体外通过巨噬细胞介导的ADCC消除αvβ3-阳性细胞;用骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)或NK细胞实施对具有或不具有αvβ3整合素的癌细胞实施ADCC分析,所述癌细胞由IgG同种型或10μg/mL LM609和/或Fc阻断剂处理;
图3D-3E:LM609仅在具有巨噬细胞的小鼠中消除αvβ3-阳性肿瘤的生长。裸鼠经皮下注射异位表达β3的HCC827细胞,并用对照脂质体和PBS(图3D左图,对照)、对照脂质体和LM609(图3D左图,LM609)、氯膦酸盐脂质体和PBS(图3D右图,对照),或者氯膦酸盐脂质体和LM609(图3D右图,LM609)处理,监测肿瘤生长15天,并且在处理之后,定量肿瘤组织中F4/80的染色(图3E);
如下文实施例1中进一步详细讨论。
图4A-4C通过图示阐明厄洛替尼耐受性肿瘤细胞获得αvβ3整合素并对奥希替尼具有耐受性:
图4A图示数据,所述数据显示厄洛替尼处理的肿瘤获得耐受性,其中用载体(Veh)(n=1)或厄洛替尼(ErlR,n=1)处理PC9(β3-)皮下异种移植小鼠;
图4B图示数据,所述数据显示来自厄洛替尼耐受性组织的细胞是αvβ3-阳性的而来自载体处理的动物的细胞则不是;通过流式细胞术测量自载体处理的动物(Veh,左图)和厄洛替尼处理的动物(ErlR,右图)分离的细胞上的αvβ3水平;
图4C:厄洛替尼耐受性细胞是奥希替尼耐受性的。用厄洛替尼(左图)或者奥希替尼(右图)以所指示的剂量处理来自载体处理的动物(Veh)和厄洛替尼处理的动物(ErlR)的细胞,并且进行MTT分析以测量细胞活力;
如下文实施例1中进一步详细讨论。.
图5A-5B图示数据,所述数据显示LM609抑制αvβ3整合素的配体结合但不抑制细胞活力;
图5A图示数据,所述数据显示LM609抑制αvβ3整合素的配体结合,其中将M21细胞(αvβ3+)接种于含有指定剂量的LM609的胶原蛋白或玻连蛋白(αvβ3配体)上,并且测量黏附细胞数目;
图5B图示数据,所述数据显示LM609不影响细胞活力,用指定剂量的LM609处理成对的αvβ3-阳性(β3+)和αvβ3-阴性(β3-)细胞,并且进行MTT分析以测量细胞活力。
图6图示数据,所述数据显示癌症疗法在上皮癌细胞中富集β3整合素:进行qPCR以检测整合素α和β亚基响应72小时内增加的过氧化氢(H2O2)剂量的mRNA表达,用相对于载体对照的倍数来表示。
在不同的附图中相同的参考标记指示相同的元素。
将详细地参考各种示例性实施方式,其实例在随附的附图中阐明。提供下文的详细描述,以使读者更好地理解本文中所提供的方面和实施方式的某些详细内容,并且不应当被理解为对本发明的范围的限制。
具体实施方案
在可选的实施方式中,提供了用于治疗或减轻癌症的组合物和方法,其通过靶向在癌症干细胞(CSC)的细胞表面上表达的αvβ3(avb3)多肽而杀死CSC,从而治疗、减轻或减缓由在其细胞表面上表达αvβ3多肽的癌细胞或肿瘤细胞,或者癌症干细胞(CSC)引起或起始的,或者由其维持的癌症的发展。在可选的实施方式中,提供了用于靶向并杀死αvβ3-阳性癌症干细胞(CSC)和治疗耐药癌症的组合物和方法。在可选的实施方案中,本文所提供的组合物和方法使用能够特异性结合至人类αvβ3的抗体或多肽,所述抗体或多肽还包括能够通过巨噬细胞介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)杀死癌细胞或肿瘤细胞的Fc部分;例如,使用针对αvβ3的人源化抗体,所述抗体经修饰以包括特异性结合至人巨噬细胞的工程化的Fc部分。在可选的实施方案中,施用抗αvβ3抗体能够消灭或减少高度侵袭性的、αvβ3-阳性耐药癌症,其招募结合至所述抗体或多肽(其也结合至αvβ3)肿瘤相关巨噬细胞,以及所述巨噬细胞因而通过ADCC杀死癌症。在可选的实施方案中,使用抗体,例如诸如抗αvβ3抗体LM609的人源化抗体,以在体内靶向αvβ3多肽,从而结合αvβ3-阳性癌细胞,例如CSC,并且还通过结合至巨噬细胞而通过ADCC杀死表达αvβ3多肽的CSC。
虽然本发明不受限于任何特定的作用机制,但在可选的实施方案中,诸如LM609(Chemicon Int.,Temecula,CA)、源自23C6克隆的CBL544(MilliporeSigma,Burlington,MA)、ab7166(abcam,Cambridge,MA),和单克隆抗体ab78289(abcam,Cambridge,MA),以及其人源化形式的抗αvβ3抗体被用于在有需要的个体中通过经由巨噬细胞介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)来靶向耐药癌症细胞而延长癌症药物敏感性。
如本文中所提供的组合物和方法被用于靶向和杀死癌症干细胞(CSC),所述癌症干细胞(CSC)能够代表肿瘤群体中最具有侵袭性和耐药性的细胞。如本文所提供的组合物和方法被用于靶向整合素αvβ3,其是一种多肽,在各种上皮癌中识别CSC群体,并且对改良药物耐受性是必要和充分的。
在EGFR突变体肺腺癌异种移植模型中,抗αvβ3整合素抗体LM609延长了对厄洛替尼的敏感性。本文中描述的研究表明,用EGFR抑制剂厄洛替尼治疗荷载肺肿瘤的小鼠,虽然最初抑制肿瘤生长,但最终导致肿瘤相关的αvβ3表达,导致如由循环肿瘤细胞(CTC)增加所测定的肿瘤发展。此外,厄洛替尼处理的小鼠相对于未处理的肿瘤显示肿瘤相关巨噬细胞(TAM)显著累积。全身性递送靶向αvβ3的单克隆抗体LM609,破坏原发肿瘤中的药物耐受性CSC并且消除CTC。这种抗肿瘤效果是巨噬细胞依赖的,因为去除巨噬细胞的小鼠不能响应该抗体。在体外,LM609与巨噬细胞组合而不是与NK细胞组合凭借抗体依赖性细胞的细胞毒作用(ADCC)而破坏CSC。这些发现证明,厄洛替尼虽然最初控制肿瘤生长,但最终导致干细胞性、药物耐受性、肿瘤进展,以及TAM累积。证据表明LM609通过靶向αvβ3能够指导TAM破坏原发肿瘤中药物耐受性最强的细胞,从而控制肿瘤进展。
我们最近报道,在药物耐受过程中整合素αvβ3表达在肺腺癌细胞上被诱导并且是对于将这些肿瘤重编程为干细胞样状态是必要和充分的。考虑到癌症干细胞在将M1巨噬细胞向M2巨噬细胞转换(巨噬细胞从M1向M2转换已与肺癌进展相关)中所发挥的作用,我们询问αvβ3在肺腺癌细胞上表达是否就是该巨噬细胞转化的原因。αvβ3阳性肿瘤中M1/M2巨噬细胞的比例相对于缺乏αvβ3的肿瘤显著降低。我们接着用靶向这一受体的单克隆抗体(LM609)处理荷载αvβ3-阳性肿瘤的小鼠,以评估其改变这些肿瘤中的巨噬细胞表型的能力。LM609能够通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)选择性地消除αvβ3-阳性癌症干细胞,从而显著地增强这些肿瘤对治疗效果的敏感性。这些发现表明,表达αvβ3的癌症干细胞富集促肿瘤M2肿瘤相关巨噬细胞(TAM)。通过ADCC消除αvβ3-阳性癌症干细胞有利于延长肿瘤对治疗的敏感性。
药学组合物和制剂
在可选的实施方式中,提供了例如包括抗αvβ3(avb3)抗体的药学组合物和制剂,以及用于以下途的方法:在有需要的个体中杀死表达αvβ3(avb3)多肽的癌细胞或癌症干细胞(CSC),或降低其数目,在有需要的个体中治疗、减轻或逆转或减缓表达αvβ3(avb3)多肽的癌症或肿瘤的发展,减轻或减缓由在其细胞表面上表达αvβ3多肽的癌细胞或肿瘤细胞,或者癌症干细胞(CSC)引起或起始的,或者由其维持的癌症的发展,在体内操作TAM,或者增强表达αvβ3(avb3)多肽的癌症或肿瘤对于治疗效果的敏感性。
在可选的实施方案中,本文中提供的组合物,以及用于实践本文中提供的方法的组合物,与药学上可接受的载剂一起配制。在可选的实施方案中,用于实践本文中提供的方法的药物组合物可以非经肠给药、局部(topically)给药、口服给药,或者通过局部给药(local administration),诸如通过喷雾给药或者经皮给药。所述药学组合物可以以任何方式配制,并且能够根据病况或疾病以及疾病的程度、每个病人的综合身体状况、由此导致的优选施用方法等,以多种单位剂型给药。配制技术和给药的详细内容详细描述于科学文献和专利文献中,参见例如最新版的《雷明顿制药科学(Remington's PharmaceuticalSciences)》(Maack Publishing Co.,Easton PA)(《雷氏》(“Remington’s”))。
如本文中提供的治疗剂,例如包括抗αvβ3(avb3)抗体和用于实践如本文中所提供的方法的抗体,能够单独给药或者作为药学制剂(组合物)的组分给药,或者在用例如生长因子抑制剂的另外一种活性剂给药的同时、之前和/或之后给药,其中任选地所述生长因子抑制包括受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂、Src抑制剂、抗代谢物抑制剂、吉西他滨、GEMZARTM、有丝***毒剂、紫杉醇、他克唑、ABRAXANETM、厄洛替尼、TARCEVATM、拉帕替尼、TYKERBTM、西妥昔单抗(cetuxamib)、ERBITUXTM,或者胰岛素生长因子抑制剂。
药学组合物和制剂例如包括抗αvβ3(avb3)抗体可以被配制用于以任何方便的方式施用用于在人类医药或兽医中使用。润湿剂、乳化剂和润滑剂,诸如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁,以及着色剂、缓释剂、包衣剂、甜味剂、芳香剂和香味剂、防腐剂和抗氧化剂也能够存在于组合物中。
本文中提供的以及用于实施本文中提供的方法的组合物制剂包括适用于经口/经鼻给药、局部给药、非经肠胃给药、直肠给药,和/或***内给药的那些。所述制剂可以便利地以单位剂型提供,并且通过药学领域熟知的任何方法制备。可与载剂材料组合以产生单剂型的活性成分的量根据治疗的宿主、给药的特定模式而改变。可与载剂材料组合以产生单剂型的活性成分的量通常是产生治疗效果的化合物的量。
本文中提供的组合物,以及用于实践本文中提供的方法的组合物,可以根据药物制造领域中已知的任何方法制备。这样的药物可以包含甜味剂、芳香剂、着色剂和防腐剂。制剂能够与适于制造的无毒的药学上可接受的赋形剂混合。制剂可以包括一种或多种稀释剂、乳化剂、防腐剂、缓冲剂、赋形剂等,并且可以以诸如液剂、散剂、乳剂、冻干散剂、喷雾剂、乳膏剂、洗剂、控释制剂、片剂、凝胶剂、贴剂、植入剂等形式提供。
用于口服给药的药学制剂能够使用本领域中熟知的药学上可接受的载体以恰当的和合适的剂量配制。这样的载体使得药物被配制为适于患者吸收的片剂、凝胶片、丸剂、散剂、糖衣丸、胶囊剂、液体、锭剂、凝胶剂、糖浆剂、浆剂、混悬剂等单位剂型。用于口服使用的药学制剂能够被配制为固态赋形剂,任选地研磨所得到的混合物,并且如果需要,在添加合适的额外的化合物之后,加工颗粒混合物,以获得片剂或糖衣芯(dragee core)。合适的固体赋形剂是碳水化合物或者蛋白质填充剂,包括例如糖(包括乳糖、蔗糖、甘露醇,或者山梨糖醇);来自玉米、小麦、水稻、马铃薯,或其他植物的淀粉;纤维素诸如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素,或者羧甲基纤维素钠;和包括***胶和黄芪胶的树胶;和蛋白质,例如明胶和胶原。可以添加崩解剂或者增溶剂,诸如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或其盐,诸如海藻酸钠。
糖衣芯被提供有合适的包衣(诸如浓缩的糖溶液),其也可以含有***胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆(Carbopol)胶、聚乙二醇,和/或二氧化钛、漆溶液(lacquersolution),以及合适的有机溶剂或溶剂混合物。染料或色素可以添加到片剂或糖衣包衣中用于产品鉴定或者用于表征活性化合物的数量(即剂量)。本文中提供的药学制剂和用于实践本发明提供的方法的药学制剂也能够使用例如由明胶制造的推入配合胶囊(push-fitcapsules),以及由明胶和诸如甘油或者山梨糖醇的包衣制造的密封软胶囊而口服利用。推入配合胶囊能够含有与填充剂或者黏合剂(诸如乳糖或淀粉)、润滑剂(诸如滑石粉或硬脂酸镁),和任选的稳定剂混合的活性剂。在软胶囊中,活性剂能够被溶解或悬浮在含有或不含有稳定剂的合适的液体中,诸如脂肪油、液体石蜡、或者液体聚乙二醇。
水混悬剂能够含有与适于制造水混悬剂的赋形剂掺合的活性剂(例如抗αvβ3(avb3)抗体)。这样的赋形剂包括助悬剂,诸如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄芪胶和***树胶;以及分散剂或者润湿剂,诸如天然形成的磷脂(例如,卵磷脂)、含有脂肪酸的烯化氧缩合产物(例如,聚氧乙烯硬脂酸酯)、含有长链脂肪醇的环氧乙烷缩合产物(例如,十七氧乙烯基鲸腊醇(heptadecaethyleneoxycetanol))、含有源自脂肪酸和己糖醇的偏酯的环氧乙烷缩合产物(例如,聚氧乙烯山梨醇单油酸酯),或者含有源自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的环氧乙烷缩合产物(例如,聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯)。水混悬剂也能够含有一种或多种防腐剂,诸如对羟基苯甲酸乙酯或者对羟基苯甲酸正丙酯;一种或多种着色剂;一种或多种芳香剂,和一种或多种甜味剂,诸如蔗糖、阿斯巴甜、或者糖精。能够调节制剂的渗透压。
油基药物对于施用用于实践本文提供的方法的疏水性活性剂(例如,抗αvβ3(avb3)抗体或多肽)特别有益。能够通过将活性剂悬浮在植物油,诸如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油中,或者悬浮在矿物油诸如液态石蜡中,或者这些油的混合物中来配制油基混悬剂。参见例如美国专利5,716,928号,其描述了使用精油或者精油组分,用于增加口服给药的疏水性药学化合物的生物可利用度和降低其个体间和个体内的变异性(也参见美国专利5,858,401号)。所述油悬浮剂能含有增稠剂,诸如蜂蜡、固体石蜡,或者鲸蜡醇。可以添加甜味剂,诸如甘油、山梨糖醇,或蔗糖,以提供可口的口服制剂。通过添加抗氧化剂诸如抗坏血酸,能够保存这些制剂。作为注射用油载体的实例,参见Minto(1997)J.Pharmacol.Exp.Ther.281:93-102。本文中提供的药学制剂也能够以水包油乳剂形式存在。该油相可以是如上所述的植物油或者矿物油,或者是这些油的混合物。合适的乳化剂包括天然形成的树胶,诸如***树胶和黄芪胶;天然形成的磷脂,诸如大豆卵磷脂、源自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯,诸如山梨醇酐单油酸酯,和这些偏酯与环氧乙烷的浓缩产物,诸如聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯。所述乳剂也可以如在糖浆剂和酏剂制剂中一样含有甜味剂和芳香剂。这样的制剂也可以含有缓和剂、防腐剂,或者着色剂。
在实践本文中提供的实施方案时,所述药学化合物也可以通过鼻内、眼内和***内途径给药,包括栓剂、吹入剂、粉剂和气溶胶制型(对于类固醇吸入剂的实例,参见Rohatagi(1995)J.Clin.Pharmacol.35:1187-1193;Tjwa(1995)Ann.Allergy AsthmaImmunol.75:107-111)。栓剂制剂能够通过将药物与合适的无刺激性的赋形剂混合而制备,所述赋形剂在常温下呈固态但在体温下呈液态,且因此在机体中溶解以释放药物。这样的材料是可可油和聚乙二醇。
在实践本文中提供的实施方案时,药学化合物能够被配制为敷药棒、溶液、混悬液、乳剂、凝胶剂、乳膏剂、软膏剂、糊剂、果胶剂、涂剂、散剂和气溶胶,通过局部途径经皮递送。
在实践本文中提供的实施方案时,药学化合物也能够以微球体被递送,以在机体中缓慢释放。例如,微球体能够通过皮内注射在皮下释放缓慢的药物来给药;参见Rao(1995)J.Biomater Sci.Polym.Ed.7:623-645;作为生物可降解的可注射凝胶制剂,参见例如Gao(1995)Pharm.Res.12:857-863(1995);或者作为用于口服给药的微球体,参见例如Eyles(1997)J.Pharm.Pharmacol.49:669-674。
在实践本文中提供的实施方案时,药学化合物能够非经肠道给药,诸如通过静脉(IV)给药或者给药到体腔或器官的内腔。这些制剂可以包括溶解在药学上可接受的载体中的活性剂溶液。能够使用的可接受的载体和溶剂是水和等渗氯化钠林格氏溶液(Ringer'ssolution)。此外,无菌的非挥发油能够被用作溶剂或悬浮介质。为了这个目的,能够采用任何无味非挥发油包括合成的单甘酯或双甘酯。此外,脂肪酸诸如油酸同样地能够被用于制备注射剂。这些溶液是无菌的,并且一般不含有不期望的物质。这些制剂可以通过常规熟知的灭菌技术来灭菌。根据需要,该制剂可以含有药学上可接受的辅助物质,以接近生理条件,诸如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂,例如,乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中活性剂的浓度可以变化范围很大,并且可以参照所选择的特定给药模式和病人的需要,主要基于流体体积、粘性、体重等进行选择。对于静脉注射(IV)给药,制剂可以是无菌的可注射制剂,诸如无菌的可注射水混悬液或油混悬液。能够使用那些合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制该混悬液。无菌的可注射制剂也可以是混悬液,其溶于无毒的对于非肠道是可接受的稀释剂或溶剂(诸如1,3-丁二醇溶液)中。可以通过推注或连续灌注(例如,大体上不间断地向血管中导入具体的一段时间)给药。
本文中提供的药学化合物和制剂,以及用于实践本文中提供的方法的药学化合物和制剂可以是冻干的。也提供了包括本文中提供的组合物的稳定冻干制剂,其能够通过将包括本文中提供的药物和膨胀剂(例如甘露醇、海藻糖、棉籽糖和蔗糖,或其混合物)的溶液冻干而制备。制备稳定冻干制剂的方法可以包括将大约2.5mg/mL蛋白质、大约15mg/mL蔗糖、大约19mg/mL NaCl和具有大于5.5但小于6.5的pH值的柠檬酸钠缓冲液的溶液冻干。参见例如美国专利申请号20040028670。
本文中提供的组合物和制剂,以及用于实践本文中提供的方法的组合物和制剂可以通过使用脂质体递送。通过使用脂质体,特别是当脂质体表面携带对靶标细胞特异的配体,或者以其他方式优先定向特定器官时,人们可以集中于在体内将活性剂递送到靶标细胞中。例如参见美国专利号6,063,400;6,007,839;Al-Muhammed(1996)J.Microencapsul.13:293-306;Chonn(1995)Curr.Opin.Biotechnol.6:698-708;Ostro(1989)Am.J.Hosp.Pharm.46:1576-1587。
本文中提供的以及用于实践本文中提供的方法的制剂可以为了预防性和/或治疗性的处理而施用。在治疗性的应用中,组合物以足以治愈、减缓,或部分抑制病况、感染或疾病及其并发症的临床表现的量(“治疗有效量”)被施用给已经罹患所述病况、感染或疾病的个体。例如,在可选的实施方案中,本文中提供的药学组合物以足以达到下列目的的量被施用:在有需要的个体中杀死表达αvβ3(avb3)多肽的癌细胞或癌症干细胞(CSC),或降低其数目;在有需要的个体中治疗、减轻或逆转或减缓表达αvβ3(avb3)多肽的癌症或肿瘤的发展;和/或减轻或减缓由在其细胞表面上表达αvβ3多肽的癌细胞或肿瘤细胞,或者癌症干细胞(CSC)引起或起始的,或者由其维持的癌症的发展。足以达到该目的的药学组合物的量被定义为“治疗有效量”。有效实现这一用途的给药方案和量,即“给药方案”取决于各种因素,包括疾病或病况的阶段,疾病或病况的严重程度,病人的综合健康状况,病人的身体状况、年龄等。在计算病人的给药方案时,还要考虑给药方式。
给药方案也要考虑本领域中熟知的药代动力学参数,例如,活性剂的吸收率,生物有效性,新陈代谢,清除等(例如参见Hidalgo-Aragones(1996)J.SteroidBiochem.Mol.Biol.58:611-617;Groning(1996)Pharmazie51:337-341;Fotherby(1996)Contraception 54:59-69;Johnson(1995)J.Pharm.Sci.84:1144-1146;Rohatagi(1995)Pharmazie 50:610-613;Brophy(1983)Eur.J.Clin.Pharmacol.24:103-108;前述最新版的《雷氏》)。现有技术允许临床医生针对每个单独的病患、活性制剂和所治疗的疾病或病况确定给药方案。针对用作药物的类似组合物所提供的用药指南能够被用于指导确定给药方案,即被施用于实践本文提供的方法的给药方案和剂量水平是正确且合适的。
根据病患所需要和所耐受的剂量和频率,可以给予制剂的单次给药或者多次给药。所述制剂应该提供足够量的活性制剂以有效地治疗、预防,或减轻如本文中描述的病况、疾病或症状。例如,本文中提供的或者用于实践本文中提供的方法的组合物的一种用于口服给药的示例性药学制剂可以以每天每公斤体重大约0.1至0.5至大约20、50、100,或1000,或者更多ug的日总量。在可选的实施方案中,使用每天每个病患每公斤体重大约1mg至大约4mg的剂量。与口服给药相比,给药至血液、至体腔,或至器官内腔可以使用较低的剂量。在局部给药或口服给药,或者以散剂、喷雾剂或吸入剂给药时可以使用实质上更高的剂量。用于制备可经肠给药或者可非经肠给药的制剂的实际方法是本领域技术人员所知悉的或者对本领域技术人员而言是显然的,并且在诸如上文所述的《雷氏》这样的出版物中有更详细的描述。
本文中提供的方法能够进一步包括与其他药物或药品(例如,用于治疗癌症、感染性休克、感染、发烧、疼痛和相关的症状或病况的组合物)共给药。例如,本文中提供的方法和/或组合物和制剂能够与下列物质共配制和/或共给药:抗生素(例如,抗菌或抑菌的肽或蛋白质),尤其对革兰氏阴性细菌有效的那些抗生素,流体,细胞因子,免疫调节剂,抗炎性剂,补体激活剂,诸如包括胶原蛋白样结构域或者纤维蛋白原样结构域的肽或蛋白质(例如,纤维胶凝蛋白),碳水化合物结合结构域等,和其组合物。
纳米颗粒和脂质体
也提供包括化合物(例如,抗αvβ3(avb3)抗体)的纳米颗粒和脂质体膜,用于实践本文中提供的方法。在可选的实施方案中,也提供靶向肿瘤(癌症)干细胞和功能失调干细胞的纳米颗粒和脂质体膜。在一方面,用于实践本文中的方法的组合物特异性地靶向癌细胞或者癌症干细胞。
在可选的实施方案中,也提供了包括(除了包括用于实践本文提供的方法的化合物以外)分子的纳米颗粒和脂质体膜,所述分子例如,选择性靶向异常生长的、患病的、感染的、功能失调的,和/或癌症(肿瘤)细胞受体的肽或者抗体。在可选的实施方案中,也提供了使用IL-11受体和/或GRP78受体以靶向在细胞上(例如在肿瘤细胞上,例如在***癌细胞上,或者卵巢癌细胞上)的受体的纳米颗粒和脂质体膜。例如,参见美国专利公开号20060239968。
也提供了纳米细胞,以允许依序地递送具有不同作用模式或者不同药代动力学的两种不同的治疗剂,其中至少一种包括用于实践本文提供的方法的组合物。通过在含有第二制剂的脂囊泡内用第一制剂封装纳米芯而形成纳米细胞;例如,参见Sengupta等的美国专利公开号20050266067。在外层脂质空间中的制剂首先被释放并可在纳米芯中的制剂被释放之前发挥功效。纳米细胞递送***可以被配在任何药学组合物中以递送给病患。
在一个实施方案中,在纳米细胞的外层脂囊泡中包含乙酰转移酶基因,转录本(信使)和/或蛋白质表达或蛋白质活性的抑制剂或清除剂,并且将本文中提供的抗血管生成剂负载到纳米芯上。这种布置允许活性剂首先被释放,并且在肿瘤的血液供应被本文中提供的组合物切断之前被递送到肿瘤。
还提供了包含用于实践本文中提供的实施方案(例如,用于经皮吸收)的化合物的多层脂质体,例如,如在Park等的美国专利公开号20070082042中的描述。能够使用包括角鲨烷、甾醇类、神经酰胺、中性脂或油、脂肪酸和卵磷脂的油相组分的混合物制备多层脂质体,形成大约200至5000nm粒径,以包裹本文中提供的组合物。
用于实践本文中提供的实施方式的多层脂质体可以进一步包括抗菌剂、抗氧化剂、稳定剂、增稠剂等以改善稳定性。可以例如以0.01%至20%的量,使用合成的抗菌剂和天然抗菌剂。可以使用抗氧化剂,例如,BHT、赤山梨酸酯(erysorbate)、生育酚、虾青素、蔬菜类黄酮和其衍生物,或者植物来源的抗氧化物质。能够使用稳定剂(例如,多元醇和糖类)以稳定脂质体的结构。示例性的多元醇包括丁二醇、聚乙二醇、丙二醇、二丙二醇和乙基卡必醇;糖类的实例是海藻糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇和壳聚糖,或者单糖或寡糖,或者高分子量淀粉。能够使用增稠剂(例如,天然增稠剂或丙烯酰胺,或者合成的聚合物增稠剂)以改善所构建脂质体在水中的分散稳定性。示例性的增稠剂包括天然聚合物,诸如金合欢树胶,黄原胶,吉兰糖胶,槐豆胶和淀粉,纤维素衍生物诸如羟乙基纤维素、羟丙基纤维素和羧甲基纤维素,合成的聚合物诸如聚丙烯酸、聚丙烯酰胺,或聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇,和其共聚物或者交联材料。
能够使用任何方法制造脂质体,例如,如在Park等的美国专利公开号20070042031中描述的方法,包括通过封装治疗性产品而制造脂质体的方法,其包括在第一容器中提供水溶液;在第二容器中提供有机脂溶液,其中所述水溶液和所述有机脂溶液中的一种包括治疗性产品;在第一混合区域中将所述水溶液与所有机脂溶液混合,以产生脂质体溶液,其中所述有机脂溶液与所述水溶液混合,以大体上瞬时产生封装了治疗性产品的脂质体;并接着立即将所述脂质体溶液与缓冲溶液混合,以产生稀释的脂质体溶液。
也提供了包含用于实践本文中提供的实施方案的化合物(例如,抗-αvβ3(avb3)抗体)的纳米颗粒,以将组合物作为含有药品的纳米颗粒递送(例如,第二纳米颗粒),如美国专利公开号20070077286中的描述。在一个实施方案中,也提供了包含本文中提供的脂溶性药品或脂增溶的水溶性药品的纳米颗粒,以与二价或三价金属盐作用。
脂质体
用于实践本文中提供的实施方案的组合物(例如,抗-αvβ3(avb3)抗体)和制剂可以通过使用脂质体递送。通过使用脂质体,特别是当脂质体表面携带对靶细胞特异性的配体,或以其他方式优选地定向到特定器官或细胞(例如癌症干细胞)时,人们能够集中于在体内将活性制剂递送到靶细胞。参见例如美国专利号6,063,400;6,007,839;Al-Muhammed(1996)J.Microencapsul.13:293-306;Chonn(1995)Curr.Opin.Biotechnol.6:698-708;Ostro(1989)Am.J.Hosp.Pharm.46:1576-1587。例如,在一个实施方案中,通过使用具有刚性脂类的脂质体递送用于实践本文中提供的实施方案的组合物和制剂,所述刚性脂类具有头部基团和疏水性尾部,例如,如使用聚乙二醇交联脂类,其具有与所述脂质的至少一部分相配对的侧链,如例如在美国专利公开号20080089928中所描述。在另一个实施方案中,通过使用包括脂质混合物的两性脂质体递送用于实施本文中提供的实施方案的组合物和制剂,例如,包括阳离子两性化合物、阴离子两性化合物,和/或中性两性化合物的混合物,如例如在美国专利公开号20080088046或20080031937中所描述。在另一个实施方案中,通过使用脂质体递送用于实践本文中提供的实施方案的组合物和制剂,所述脂质体包括通过硫醚基团与脂质体相结合的聚二醇部分和也通过硫醚基团与脂质体相结合的抗体,如例如美国专利申请公开号20080014255中的描述。在另一个实施方案中,通过使用脂质体递送用于实践本文中提供的实施方案的组合物和制剂,所述脂质体包括甘油酯、甘油-磷脂、甘油膦酰脂(glycerophosphinolipids)、甘油磷酸酯(glycerolphosphonolipids)、硫脂、鞘脂、磷脂、异戊烯醇脂、类固醇、硬脂、甾醇,和/或含有碳水化合物的脂,如例如在美国专利申请公开号20070148220中所描述。
抗体和抗原结合多肽作为药学组合物
在可选的实施方案中,也提供了包括下列物质的组合物和方法:抗体或其活性片段,或者能够特异性结合至在癌细胞或肿瘤细胞上或在CSC上表达的αvβ3(avb3)整合素多肽的αvβ3-结合多肽(例如,包括能够特异性结合至αvβ3的CDR),其中所述抗体或多肽具有能够结合巨噬细胞并起始抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)杀死与抗体(例如抗-αvβ3(avb3)抗体)特异性结合的细胞的Fc结构域或同等的结构域或部分。在可选的实施方案中,提供组合物以施用这些抗体和多肽。
在可选的方面,用于实践本文中提供的实施方案的抗体或多肽能够包括由一种免疫球蛋白基因或多种免疫球蛋白基因来源的,仿效其的,或者大体上由其编码的肽或多肽,或其片段,其能够特异性地结合抗原或者抗原表位,参见例如Fundamental Immunology,Third Edition,W.E.Paul,ed.,Raven Press,N.Y.(1993);Wilson(1994)J.Immunol.Methods 175:267-273;Yarmush(1992)J.Biochem.Biophys.Methods 25:85-97。在可选的方面,用于实践本文中提供的实施方案的抗体或多肽包括抗原结合部分,即保持与抗原结合的能力的“抗原结合位点”(例如,片段,子序列,互补决定区(CDR)),其包括(i)Fab片段,由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段;(ii)F(ab')2片段,包括在铰链区由二硫键交联的两个Fab片段的双价片段;(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段;(iv)由抗体的单条臂的VL和VH结构域组成的Fv片段,(v)dAb片段(Ward et al.,(1989)Nature 341:544-546),其由VH结构域组成;和(vi)分离的互补决定区。单链抗体也通过引用被包括在术语“抗体”中。
在可选的实施方案中,方法包括使用能够特异性地结合αvβ3(avb3)整合素多肽的任意多肽,包括包含如下物质的αvβ3-结合CDR的多肽:单克隆抗体LM609(Chemicon Int.,Temecula,CA)(CVCL_KS89)(ATCC登录号为HB9537的鼠杂交瘤细胞)(参见例如美国专利号7,115,261);衍生自23C6克隆的单克隆抗体CBL544(MilliporeSigma,Burlington,MA);单克隆抗体ab7166(abcam,Cambridge,MA);或者,单克隆抗体ab78289(abcam,Cambridge,MA),其能够由本领域技术人员容易地确定。
可选的实施方案能够使用“人源化的”抗体,包括非人类(例如,鼠)的抗体,其为包含来源于非人类免疫球蛋白的最小序列(例如,抗原结合片段)的嵌合抗体。在可选的实施方案中,人源化的抗体是人类免疫球蛋白,其中来自受体(例如,人抗体序列)的高度可变区(HVR)的残基被由来自非人类物种(供体抗体),诸如具有所希望的特异性、亲和性和兼容性的小鼠、大鼠、兔或者非人灵长类的高度可变区(HVR)的残基所取代。在可选的实施方案中,人类免疫球蛋白的构架区(FR)残基被相应的非人类残基所取代,以改善抗原结合亲和性。
在可选的实施方案中,人源化的抗体可包含在受体抗体或供体抗体中不存在的残基。进行这些修饰可能是为了改善抗体的亲和性或功能活性。在可选的实施方案中,人源化抗体能够包含大体上所有的至少一个可变结构域,且通常两个可变结构域,其中所有的或大体上所有的高度可变区域对应于非人类免疫球蛋白中的那些,并且所有的或大体上所有的Ab构架区域是具有人类免疫球蛋白序列的那些。
在可选的实施方案中,用于实践本文中提供的实施方案的人源化抗体可包含免疫球球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分,通常是属于人类免疫球蛋白或者衍生于人类免疫球蛋白。
然而,在可选的实施方案中,完整的人抗体也能够被用于实践本文中提供的实施方案,包括包含氨基酸序列对应于由人类产生的抗体的氨基酸序列的人抗体。人抗体的这个定义特异地排除了包括非人抗原结合残基的人源化抗体。
在可选的实施方案中,方法包括使用能够特异性地结合αvβ3(avb3)整合素多肽的人源化抗体,包括以下的人源化形式:结合αvβ3的单克隆抗体LM609(Chemicon Int.,Temecula,CA)(CVCL_KS89)(ATCC登录号为HB9537的鼠杂交瘤细胞)(参见例如美国专利号7,115,261);衍生自23C6克隆的单克隆抗体CBL544(MilliporeSigma,Burlington,MA);单克隆抗体ab7166(abcam,Cambridge,MA);或者,单克隆抗体ab78289(abcam,Cambridge,MA),其中各种人源化的形式能够由本领域技术人员容易地确定。
在可选的实施方案中,用于实施本文中提供的实施方案的抗体包括“亲和性成熟的”抗体,例如,在一个或多个高变区中包括一种或多种改变的抗体,所述改变导致抗体对抗原(例如,组氨酸甲基化和/或乙酰转移酶)的亲和性与不具有这些改变的母本抗体相比有所改善。在可选的实施方式中,用于实践本文中提供的实施方案的抗体是成熟的抗体,对靶标抗原例如,组氨酸甲基化和/或乙酰转移酶具有纳摩尔级或者甚至皮摩尔级的亲和性。可以通过本领域中已知的流程制备亲和性成熟的抗体。
在可选的实施方案中,用于实践本文中提供的方法的抗体是:单克隆抗体LM609(Chemicon Int.,Temecula,CA)(CVCL_KS89)(ATCC登录号为HB9537的鼠杂交瘤细胞)(参见例如美国专利号7,115,261);衍生自23C6克隆的单克隆抗体CBL544(MilliporeSigma,Burlington,MA);单克隆抗体ab7166(abcam,Cambridge,MA);或者,单克隆抗体ab78289(abcam,Cambridge,MA),和其人源化的形式。单克隆抗体LM609描述于例如Cheresh etal.,J Biol Chem.1987;262(36):17703-11和美国专利号(USPN)5,753,230和USPN 6,590,079中。LM609是对整合素αvβ3特异的鼠单克隆抗体,参见例如Cheresh,D.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:6471-6475(1987)和Cheresh et al,J.Biol.Chem.262:17703-17711(1987)。LM609是针对M21细胞黏附受体生产的并且能与M21细胞黏附受体反应,所述M21细胞黏附受体现在被称为整合素αvβ3。LM609抑制M21细胞与αvβ3配体诸如玻连蛋白、纤维蛋白原和血管性血友病因子结合(前述的Cheresh和Spiro的文章),并且也是αvβ3介导的病状的抑制剂,所述病状诸如肿瘤诱导的血管生成(Brooks et al.Cell 79:1157-1164(1994))、在皮肤创口中的肉芽组织发展(Clark et al.,Am.J.Pathology,148:1407-1421(1996))和诸如在术后再狭窄过程中发生的平滑肌细胞迁移(Choi et al.,J.Vascular Surg.,19:125-134(1994);Jones et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.93:2482-2487(1996))。
试剂盒和说明书
还提供了试剂盒,其包括用于实践本文中提供的方法和用途的组合物(例如,抗体),任选地还包括其用途的说明书。在可选的实施方案中,还提供了包括如本文中所述能够特异性地结合αvβ3的单克隆抗体或多肽的试剂盒。
通过引用下述的实施例,将进一步描述本发明。但是,应该理解,本文中提供的示例性实施方案或者本发明不受限于这些实施例。
实施例
实施例1:免疫靶向耐药肺癌
本文中呈现的这一实施例和数据阐明了如本文所提供的组合物和方法用于治疗癌症的有效性。本文中提供的是用于***的组合物和方法,所述肿瘤已经变得适应疗效,并且已经变得具有高度的侵袭性和入侵性。这一实施例描述了通过利用在获得性耐药性过程中出现的两个现象以阻止这一进程的一种方法。第一,由RTK抑制剂厄洛替尼处理的EGFR突变体肺肿瘤中获得整合素αvβ3表达,而且这一标记在循环肿瘤细胞上高度富集。第二,厄洛替尼处理的肿瘤显示累积M2肿瘤相关巨噬细胞,证明了肿瘤如何能够操控免疫***以支持其自身的增殖和转移。由于这些事件各自驱动一种侵袭性更强的耐药肿瘤表型,因而他们共同存在创造了一个独一无二的契机。我们证明,全身递送αvβ3单克隆抗体LM609不仅破坏在原发肿瘤中的耐药细胞,而且消除循环肿瘤细胞。从机制上来说,肿瘤细胞杀死是由于抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)发生的,对于ADCC而言,巨噬细胞是体外和体内的效应细胞。虽然厄洛替尼最初能够限制肿瘤的生长,但这一疗法通过富集表达αvβ3/ALDH1A1的细胞并招募肿瘤相关巨噬细胞最终造成侵袭性更强的肿瘤。通过靶向αvβ3,本文中提供的组合物和方法,包括LM609的示范性应用,利用肿瘤对免疫***的操控作用以破坏最耐药的细胞并阻止肿瘤进程。
我们团队之前报道,已经使用厄洛替尼而进展的肺腺癌患者显示整合素αvβ3表达显著降低,荷载αvβ3-阴性肺肿瘤的小鼠在他们对厄洛替尼变得耐受时获得αvβ3表达(2),而且与来自同一病患的原发性肿瘤相比,转移性病灶上高度富集αvβ3(3)。实际上,我们确定,整合素αvβ3不仅是诱导厄洛替尼耐受性,而且是诱导侵袭性干细胞样表型的充分必要条件(2-4)。因此,在治疗上靶向αvβ3不仅能够降低肿瘤进程,而且可能也消除群体中最耐药的细胞。
在分子水平,我们鉴定了αvβ3在这一过程中不依赖于其作为粘附受体功能的作用(5)。因此,使用竞争整合素-配体结合的RGD环肽或类似的整合素拮抗剂阻断αvβ3的常规整合素功能的策略不影响其驱动干细胞性和耐药性的能力(2)。相反,我们报道了,扰乱由αvβ3驱动的TANK-结合激酶1(TBK1)/NF-κB信号通路能够逆转这些侵袭性肿瘤细胞的表型(2)。因为,这个方法仅切断了一条下游通路,我们考虑了直接靶向和破坏表达整合素αvβ3的肿瘤细胞的可选方法。
除了功能阻断性质以外,特定的抗体能够标记肿瘤细胞以通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)进行消除。这个过程在抗体与肿瘤细胞抗原结合时被触发,并且同时由免疫效应细胞上的FcγR识别(6)。考虑到其他研究组也报道了肿瘤相关巨噬细胞(TAM)在厄洛替尼耐受性肿瘤中累积(2,7,8),本文中提供的了一种策略,其利用αvβ3表达增强且巨噬细胞富集的这一状态作为切入点,以消除表达αvβ3的侵袭性肿瘤细胞。
结果和讨论
在小鼠和人类中的前期研究表明肺癌对于EGFR抑制剂的耐受性导致αvβ3上调和耐药性干细胞样命运的获得(2)。为了评估获得性耐受性的这一通路,我们用载体或厄洛替尼处理荷载αvβ3阴性EGFR突变体人非小细胞肺癌(HCC827)皮下异种移植物的小鼠,并且测量肿瘤随着时间的生长(图1A)。虽然厄洛替尼在若干天内造成了预期的肿瘤生长抑制效果,但肿瘤在若干星期之后最终开始再生长(图1B)。如先前在厄洛替尼耐受性病患中所观察到(2),与载体组相比,整合素αvβ3的表达在厄洛替尼耐受性肿瘤中被富集,并且表达αvβ3的细胞呈现干细胞标记物乙醛脱氢酶1A1(ALDH1A1)阳性(图1B-D)。自厄洛替尼耐受性肿瘤建立的细胞系HCC827-ErlR在体外保留了厄洛替尼耐受性,并且对于第三代EGFR抑制剂奥希替尼也具有耐受性(图1E-F)。更重要的是,我们能够使用αvβ3阴性EGFR-突变体PC9异种移植物确认这些结果。
如果αvβ3整合素与一系列癌症的肿瘤进展和转移相关联(3,9),那么我们推断厄洛替尼诱导的αvβ3表达可能有利于增加肿瘤的侵袭性。为了评估这个可能性,我们检查了荷载HCC827原位肿瘤的动物在用厄洛替尼进行全身治疗期间循环肿瘤细胞(CTC)的数目(图1A)。虽然肺中的肿瘤生长抑制作用在初始厄洛替尼处理之后30天仍维持,但我们检测到CTC的数目在厄洛替尼处理组中急剧增加(图1G-H),表明肿瘤细胞向循环的传播增强发生在原发肿瘤团获得耐药性之前。更重要的是,在厄洛替尼治疗之后检测到的绝大部分CTC是αvβ3阳性的(图1G-H)。这些发现表明,虽然厄洛替尼最初控制原发肿瘤生长,但其具有将细胞转变为具有溢出到循环***并在其中存活的能力的αvβ3/ALDH1A1阳性状态的能力,表明需要靶向这群在可检测到疾病进展之前出现的干细胞样的耐药肿瘤细胞。
肿瘤相关巨噬细胞(TAM),特别是M2-型(10),分泌生长因子、促肿瘤发生细胞因子,和免疫抑制酶类,以通过诱导血管生成、转移和免疫抑制促进肿瘤进展(11-14)。因此,在肿瘤组织中观察到富集的TAM与各种类型的癌症,包括肺腺癌中的不良预后有关(7)。如在EGFR抑制剂耐受性肺腺癌病患肿瘤中观察到的(7,8),我们在厄洛替尼耐受性肿瘤中发现,比那些来自用载体对照处理的小鼠的肿瘤中更多数量的TAMs(CD11b-阳性,Ly-6G-阴性),特别是M2型(TAM群体中CD206-阳性或CD206-和MHCll-双阴性)(图1I)。
上述的发现表明,厄洛替尼耐受性肿瘤环境对于利用巨噬细胞渗透靶向表达αvβ3的肿瘤细胞的治疗方法可以是非常合适的。作为达成这一点的策略,我们在临床前模型中使用我们之前开发和表征的抗人αvβ3抗体(LM609)作为抗肿瘤/抗血管生成剂(15)。实际上,LM609的人源化且亲和性成熟的形式,伊瑞西珠,在具有实体瘤的有些患者中也显示临床活性(16-19),虽然αvβ3表达的异质性可能可以解释在其他患者中缺乏疗效的原因。由于伊瑞西珠被报道在体外介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC),我们认为LM609是促使TAM靶向在体内获得针对厄洛替尼耐受性期间出现的、表达αvβ3的富集肿瘤细胞群的独特机会。
虽然厄洛替尼单独富集αvβ3并且导致肿瘤再生长和CTC出现,但厄洛替尼和LM609组合维持厄洛替尼敏感性(图2A)。LM609不仅确实消除了αvβ3阳性肿瘤细胞(图2B),其还阻止了αvβ3阳性CTC的增加(图2C-E),表明LM609在治疗过程中既阻止厄洛替尼耐受性,也阻止αvβ3阳性循环肿瘤细胞内渗入血管并存活。虽然整合素αvβ3作为细胞基质黏附分子起作用(15),单独用LM609处理不影响αvβ3阳性或αvβ3阴性细胞的活力。这一发现与其他研究是一致的,所述其他研究表明αvβ3整合素在肿瘤细胞中的作用不依赖于其作为黏附分子的功能,而是诱导不依赖贴壁的生长(2,3)。相反,我们发现LM609通过ADCC增加αvβ3阳性细胞死亡,而且我们确定这一过程是由巨噬细胞而不是由NK细胞介导的(图3A和3B)。
实际上,封闭巨噬细胞上的Fcγ受体减少了LM609在体外的效果(图3C)。虽然LM609在体内抑制αvβ3阳性肿瘤的生长,但用氯膦酸盐脂质体去除巨噬细胞消除这一效果(图3D)。综上,这些研究表明,巨噬细胞介导的ADCC是LM609在体外和体内的活性的主要机制。
我们的研究阐明了厄洛替尼治疗如何通过富集αvβ3表达而改变肿瘤,并且显示了肿瘤如何能够操控宿主免疫***以支持耐药表型。虽然这些适应可能在用厄洛替尼治疗的过程中促进肿瘤进展,但他们也提供了利用这一情节的独特机会。实际上,抗αvβ3抗体刺激巨噬细胞选择性地破坏原发肿瘤中表达αvβ3/ALDH1A1的耐药性肿瘤细胞,以及CTC,合起来推迟获得性耐受的发生(图2A)。因为LM609仅识别人整合素αvβ3,我们的异种移植模型允许我们将其在ADCC中的作用与对于需要这种整合素进行血管生成的肿瘤相关内皮细胞的任何影响区分开(20,21)。考虑到血管生成有助于肿瘤生长,而且由于LM609和伊瑞西珠相比于小鼠巨噬细胞Fcγ受体是对人具有较高亲和性的IgG1抗体(22),我们的临床前评估可能低估了这一治疗策略对于人厄洛替尼耐受性肿瘤的功效。此外,如果不仅厄洛替尼而且其他癌症疗法也增加上皮癌细胞中β3整合素表达(图6),那么抗αvβ3抗体治疗能够与各种疗法一起使用。总之,本文中提供了抗αvβ3抗体与EGFR抑制剂和/或其他癌症药物的组合,作为用于基于标准治疗进展的上皮癌病患的独特治疗方法。
方法
细胞系和试剂
肺腺癌细胞(培养在RPMI中的HCC827)从ATCC获得。黑色素瘤细胞系,M21,是D.L.Morton博士(加利福尼亚大学,洛杉矶,美国)的馈赠。肺腺癌细胞系PC9是JoanMassague博士(斯隆-凯特琳研究所,美国)的馈赠。细胞系鉴定由ATCC使用短串联重复DNA图谱进行。收到以后,将各细胞系扩增、作为低传代的保藏物保藏,并且用常规方法检测支原体。对于异位表达和基因敲除,如先前描述使用慢病毒***用载体对照(GFP标记)、整合素β3,或荧光素酶转染细胞(1)。如下描述通过流式细胞术检测αvβ3整合素水平。
磺丁基-β-环糊精从CydexTM(NC0604701)获得,并以6%在水中稀释。厄洛替尼从SellekChemTM(S1023)获得,并且对于体外实验用DMSO稀释或者对于体内实验用磺丁基-β-环糊精稀释。LM609如先前描述在该实验室中制备(2)。通过如下描述的黏附分析确认活性。对照和氯膦酸盐脂质体溶液从ClodronateLiposome.com获得。
黏附分析
将M21(αvβ3+)细胞接种在含有和不含有LM609的玻连蛋白包被或胶原蛋白包被的平板上。用结晶紫对贴壁细胞进行染色,并且使用酶标仪定量每孔的可见光吸光度(600nm)。
厄洛替尼耐受性肺腺癌异种移植模型
如先前描述使用厄洛替尼耐受性肺腺癌异种移植模型(3)。简言之,将HCC827(100μl RPMI中5×106肿瘤细胞)细胞皮下注射到雌性nu/nu小鼠(8-10周龄)的右侧。用卡尺每周两次测量肿瘤(肿瘤体积(mm3)=长度x宽度x宽度/2)。将具有250-700mm3肿瘤体积的动物随机分配到由磺丁基-β-环糊精(口服,每周6次)和PBS(腹腔注射,每周两次)、磺丁基-β-环糊精和LM609(腹腔注射,10mg/kg,每周两次)、厄洛替尼(口服,6.25mg/kg,每周6次)和PBS,或者厄洛替尼和LM609处理的组。磺丁基环-β-糊精组的小鼠由于肿瘤尺寸巨大而在第15天被处死。埃罗替尼组在第50天被处死。将肿瘤组织分为三份进行速冻,在OCT化合物(VWR,25608-930)或者10%***固定液(Fisher Scientific,23-313095)中冷冻用于进一步的分析。
TAM定量
如先前描述从肿瘤组织中分离TAM(4)。将速冻肿瘤组织解冻、切碎,并在37℃在含有胶原酶IV(Sigma,C5138,0.5mg/mL)、透明质酸酶(Sigma,H2654,0.1mg/mL)、中性蛋白酶II(Roche,04942078001,0.6U/mL)和DNA酶IV(Millipore,260913-10MU,5U/mL)的HBSS中解离15分钟。通过70μm细胞过滤器过滤细胞悬液,并且用PBS清洗。单一的细胞悬液(106细胞/100μL溶于PBS配置的5%BSA)与小鼠BD FcBlockTM(BD Biosciences,553142,1:50)在4℃孵育10分钟,并且与荧光标记的抗体,CD11b(eBioscience,17-0112-81,1:100),Ly-6G(eBioscience,25-5931,1:100),CD206(BioRad,MCA2235PET),和MHCll(BD Biosciences,562928)在4℃孵育一小时。在BD LSRFortessaTM上进行流式细胞术,并且使用流式细胞术分析程序FlowJoTM(Treestar)计算肿瘤组织中TAMs(CD11b阳性,Ly-6G阴性)、M1(TAM中CD206阴性,MHCll阳性)和M2(TAM中的非M1群体)的比例。
免疫组织化学分析
根据VECTASTAIN Elite ABC HRP试剂盒(Vector Laboratories,PK-6100)的制造商推荐,在未染色的FFPE载玻片上进行免疫组化染色。使用抗-整合素β3抗体(CellSignaling,13166,1:200)和生物素标记的羊抗兔抗体(Vector Laboratories,BA-1000,1:200)。染色的组织在NanoZoomer Slide Scanning SystemTM(Hamamatsu)上成像,并且用ImageJ(NIH)计算肿瘤组织中β3阳性区域部分(5)。
原位肺腺癌模型和CTC分离
将荧光素酶和GFP阳性的HCC827细胞(50μl PBS中5×106细胞)注射到雌性nu/nu小鼠(8-10周龄)的右肺。使用IVIS SpectrumTM(PerkinElmer)每四周监测肿瘤的生长。注射后8周,将小鼠随机分为三组,处理前、厄洛替尼(口服,6.25mg/kg,每周6次)处理,和厄洛替尼和LM609(腹腔注射,10mg/kg,每周两次)组合。在第8周将处理前组的小鼠处死以进行CTC分析。用厄洛替尼和或LM609处理处理组小鼠四周,然后处死。在EDTA管中收集全血(每只小鼠0.5mL),并且根据制造商的实验方案,使用LymphoprepTM(STEMCELL Technologies,85415)和SepMateTM(STEMCELL Technologies,07801)分离包括CTC的PBMC。用PBS清洗所分离的细胞,将其接种在多聚赖氨酸(Sigma,P1399)包被的8孔小室平板上,用4%PFA(VWR,AA43368-9M)固定,并且用DAPI(Life Technologies,D1306,1μg/mL溶于PBS配制的1%BSA)、LM609(5μg/mL溶于PBS配制的1%BSA),和荧光标记的第二抗体(Thermo,A21235,1:500)染色。使用Nikon Eclipse C2TM共聚焦显微镜(Nikon)分析细胞。CTC被定义为DAPI和GFP双阳性的细胞。计数每只小鼠中αvβ3阳性和αvβ3阴性CTC的数目。处死小鼠之后,还使用OV100TM荧光成像***(Olympus)测量肺中肿瘤团的体积。
建立厄洛替尼诱导的αvβ3阳性细胞系
如先前描述建立厄洛替尼耐受性HCC827(HCC827-R)细胞和(PC9-R)细胞(3)。通过MTT分析确定对EGFR抑制剂(厄洛替尼和AZD9291)的耐受性(图1B)。
MTT分析
将细胞接种在96孔板中,并且在适当的处理之后,将细胞在37℃于MTT溶液(Sigma,M2128,0.5mg/mL溶于生长培养基)中孵育两小时。然后,去除MTT溶液,并且用DMSO溶解每孔中的蓝色结晶沉淀物。使用酶标仪定量每孔在560nm处的可见光吸光度。
分离骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)
通过用RPMI冲洗安乐致死小鼠的大腿骨,从8-10周龄的雌性C57BL/6小鼠中无菌收集BMDM,通过70μm细胞过滤器过滤,并且在血红细胞裂解缓冲液Hybri-MaxTM(Sigma,R7757)中孵育。
NK细胞分离
通过使用含有2%FBS和1mM EDTA的PBS研碎安乐致死小鼠的脾脏,从8-10周龄的雌性C57BL/6小鼠中无菌收集脾细胞,通过40μm过滤器过滤,并且在血红细胞裂解缓冲液Hybri-MaxTM(Sigma,R7757)中孵育。使用NK细胞分离试剂盒IITM(NK Cell Isolation KitIITM)(Miltenyi,130-096-892)从脾细胞中分离NK细胞。
ADCC分析
将用CFSE细胞***追踪试剂盒TM(CFSE Cell Division Tracker KitTM)(BioLegend,423801)或者CellTraceTM远红细胞增殖试剂盒TM(CellTraceTM Far Red CellProliferation KitTM)(ThermoFisher,C34564)染色的靶细胞与BMDM或NK细胞在存在或不存在同型IgG或LM609情况下于37℃共培养五小时。孵育后,将细胞用PI(Sigma,P4864,1:1000)染色,并且在BD LSRFortessaTM上进行流式细胞术分析。如先前描述计算死亡的靶细胞(PI阳性)相对于总的靶细胞群(CFSE阳性或远红阳性)的比例(6)。
巨噬细胞缺失的肺腺癌异种移植模型
将HCC827-β3(100μl RPMI中的5×106肿瘤细胞)细胞经皮下注射到雌性nu/nu小鼠(8-10周龄)的右侧。每周两次用卡尺测量肿瘤。具有30-110mm3肿瘤体积的动物被随机分为用对照脂质体(腹腔注射,200μL,每周两次)和PBS(腹腔注射,每周两次,n=5)、对照脂质体(腹腔注射,200μL,每周两次)和LM609(腹腔注射,10mg/kg,每周两次,n=6)、氯膦酸盐脂质体(腹腔注射,200μL,每周两次)和PBS(腹腔注射,每周两次,n=5),或者氯膦酸盐脂质体(腹腔注射,200μL,每周两次)和LM609(腹腔注射,10mg/kg,每周两次,n=6)处理的组。处理15天之后,将肿瘤组织进行固定并冻存于OTC化合物中。
免疫荧光
在未染色的OCT载玻片上进行免疫荧光染色。将载玻片用溶于PBS的0.1%TritonX-100(Bio-Rad,1610407)进行渗透化1分钟,用溶于PBS的10%NGS(JacksonImmunoResearch,005-000-121)封闭两小时,并与DAPI(Life Technologies,D1306,1μg/mL溶于PBS配制的1%BSA)和抗小鼠F4/80抗体(eBioscience,14-4801,由OneWorldLab将其与德州红(TexasRed)荧光素缀合)在室温下孵育两小时。使用NikonEclipseC2TM共聚焦显微镜(Nikon)获得共聚焦显微图片。使用ImageJTM(NIH)计算肿瘤组织中F4/80阳性的区域部分(5)。
αvβ3整合素流式细胞学分析
用溶于PBS的1%BSA在室温下清洗封闭细胞沉淀30分钟,并且用LM609(5μg/mL溶于PBS配制的1%BSA)和荧光标记的第二抗体(Thermo,A21235,1:500)染色。染色之后,将细胞与PI进行孵育(Sigma,P4864,1:1000),并且在BD LSRFortessaTM上进行流式细胞学分析。使用流式细胞学分析程序FlowJoTM(Treestar)分析αvβ3整合素的水平。
基因表达
使用RNeasyTMRNA纯化试剂盒(Qiagen)收集总RNA,使用MultiScribeTM反转录酶通过随机引物(Thermo)合成cDNA,并且在LightCyclerTM上用SYBR绿色探针(Roche)进行反转录PCR。使用2-ddCT法计算相对于参考基因的表达量。
研究许可
所有的研究都是按照S05018协议开展的,并且得到UCSD机构动物护理和使用委员会的批准。所有的研究符合NIH指南中针对实验动物护理和使用所提出的指导意见。
统计分析
进行学生t检验、曼-惠特尼U检验,或者ANOVA以比较独立样本组。进行卡普兰一梅尔估计量(Kaplan-Meier estimator)以测量无耐受性生存期。使用Excel(Microsoft)和SPSS(IBM Analytics)进行统计学分析。
图解
图1.厄洛替尼耐受性影响原发性肿瘤、CTC和间质。
图1A:厄洛替尼耐药性异种移植模型的示意图。
图1B-D:厄洛替尼耐受性组织显示表达αvβ3/ALDH1A1的细胞增多。用载体(Veh,n=5)或厄洛替尼(ErlR,n=9)处理HCC827(β3-)异种移植小鼠。测量肿瘤的生长(图1B)。针对β3对肿瘤组织进行染色(图1C)。比例尺,10μm。针对αvβ3和ALDH1A1对从厄洛替尼耐受性组织中分离的细胞进行染色用于流式细胞术分析(图1D)。图中呈现了两只小鼠。
图1E-F:厄洛替尼耐受性αvβ3阳性细胞对第三代EGFR抑制剂奥希替尼具有耐受性。针对αvβ3对从载体处理的小鼠(veh)和厄洛替尼处理的小鼠(ErlR)中分离的肿瘤细胞进行染色用于流式细胞术分析(图1E)。图片是三次实验的代表性结果。用厄洛替尼或奥希替尼处理细胞72小时,并且测量细胞的活力(图1F)。
图1G-H:厄洛替尼在原发肿瘤对处理仍有响应时增加CTC。在肺注射HCC827(β3-,GFP+,荧光素酶+)细胞之后8周,用厄洛替尼处理小鼠30天,然后进行CTC分离。针对αvβ3对CTC进行染色。计数处理之前(处理前,n=3)和处理之后(处理后,n=5)来自小鼠的αvβ3阳性(β3+)和αvβ3阴性(β3-)CTC(图1G)。可视化原发团块(图1H)。GFP,肿瘤组织;比例尺,5mm。
图1I:图示在厄洛替尼耐受性异种移植组织中M2-TAM如何增加的数据;在处理之后50天在载体(n=9)处理和厄洛替尼(n=9)处理之间比较M1(黑灰)和M2-TAM(淡灰)的百分比。使用双尾学生t检验确定统计显著性(与对照相比*P<0.05)。误差棒显示标准误差。
图2.LM609产生侵袭性较低的表型.
图2A:LM609抑制厄洛替尼耐受性的获得。用厄洛替尼(厄洛替尼,n=9)或者厄洛替尼和LM609(厄洛替尼+LM609,n=10)处理HCC827(β3-)异种移植小鼠。每周两次测量肿瘤生长。使用卡普兰-梅尔估计量(Kaplan-Meier estimator)分析无进展生存期。
图2B:LM609消除β3阳性细胞。用磺丁基-β-环糊精和PBS(对照,n=5)、磺丁基-β-环糊精和LM609(LM609,n=5)、厄洛替尼和PBS(厄洛替尼,n=9),或者厄洛替尼和LM609(Erl+LM609,n=10)处理HCC827(β3-)异种移植小鼠50天。针对整合素β3对肿瘤组织进行染色,并且定量组织中的β3阳性区域(每组n=9个视野)(上图)。图片(下图)是代表性结果。比例尺,10μm。使用双尾学生t检验确定统计显著性(*P<0.05)。误差棒显示标准差。
图2C-E:LM609降低由厄洛替尼诱导的CTC的数目。在右肺注射HCC827(β3-,GFP+,荧光素酶+)细胞之后8周,用厄洛替尼或厄洛替尼与LM609的组合(厄洛替尼+LM609)处理小鼠四周,然后分离CTC。在处理之前(处理前,n=14),和用厄洛替尼(厄洛替尼处理后,n=4)或厄洛替尼与LM609的组合(Erl+LM609处理后,n=5)处理之后,使用IVIS光谱通过生物荧光测量肿瘤体积并定量(图2C)。图片是代表性结果(图2D)。针对αvβ3对CTC进行染色以定量αvβ3阳性(β3+)和αvβ3阴性(β3-)CTC(图2E)。显示了αvβ3阳性CTC的一个实例(右下图)。使用双尾学生t检验确定统计显著性(与处理前相比*P<0.05)。误差棒显示标准误差(上图)和标准差(下图)。比例尺:5mm(上图);比例尺,10μm(下图);蓝色,DAPI;绿色,GFP;红色,αvβ3。
图3.LM609通过巨噬细胞介导的ADCC消除αvβ3阳性细胞
图3A-C:LM609在体外通过巨噬细胞介导的ADCC消除αvβ3阳性细胞。对含有或不含有αvβ3整合素且由同型IgG,或者LM60910μg/mL,或者Fc阻断剂处理的癌细胞进行骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)或者NK细胞的ADCC分析。使用碘化丙啶通过流式细胞术定量癌细胞的细胞死亡百分比。效应细胞和靶细胞的比例是5:1。使用双尾学生t检验确定统计显著性(与同型IgG对照相比*P<0.05)。误差棒显示标准误差。空载体,EV;β3质粒,β3;Veh,分离自载体处理的组织的细胞;ErlR,分离自厄洛替尼耐药性组织的细胞。
图3D-E:LM609仅在具有巨噬细胞的小鼠中消除αvβ3阳性肿瘤生长。用异位表达β3的HCC827细胞经皮下注射裸鼠,并且用对照脂质体和PBS(图3D左图,对照,n=5)、对照脂质体和LM609(图3D左图,LM609,n=6)、氯膦酸盐脂质体和PBS(右图,对照,n=5),或者氯膦酸盐脂质体和LM609(图3D右图,LM609,n=6)处理。检测肿瘤体积15天,并且在处理之后,定量肿瘤组织中的F4/80染色(图3D右图,每组n=10个视野)。使用双尾学生t检验确定统计显著性(与对照相比*P<0.05)。误差棒显示标准误差。
图4:厄洛替尼耐受性肿瘤细胞获得αvβ3整合素并且对奥希替尼耐受。
图4A:厄洛替尼处理的肿瘤获得耐受性。用载体(Veh)(n=1)或者厄洛替尼(ErlR,n=1)处理PC9(β3-)皮下异种移植小鼠。每周测量肿瘤生长。
图4B:来自厄洛替尼耐受性组织的细胞是αvβ3阳性的,而来自载体处理的动物的细胞不是。通过流式细胞术测量从载体处理的动物(Veh)和厄洛替尼处理的动物(ErlR)分离的细胞上的αvβ3水平。蓝色:第二对照;红色:由LM609染色。
图4C:厄洛替尼耐受性细胞对奥希替尼具有耐受性。用厄洛替尼或者奥希替尼以指定的剂量处理来自载体处理的动物(Veh)和厄洛替尼处理的动物(ErlR)的细胞,并且进行MTT分析测量细胞活力。
使用双尾学生t检验确定统计显著性(与对照相比*P<0.05)。误差棒显示标准差。
图5:LM609抑制αvβ3整合素的配体结合而不是细胞活力。
图5A:LM609抑制整合素αvβ3的配体结合。将M21细胞(αvβ3+)接种在含有指定剂量LM609的胶原蛋白或玻连蛋白(αvβ3配体)上。测量粘附细胞数目。
图5B:LM609不影响细胞活力。用指定剂量的LM609处理αvβ3阳性(β3+)和αvβ3-阴性细胞对,并且进行MTT分析以测量细胞活力。
使用双尾学生t检验确定统计显著性。误差棒显示标准差。EV,空载体;β3,β3质粒;Veh,分离自载体组的细胞(对厄洛替尼敏感);ErlR,分离自厄洛替尼耐受性组织的细胞。
图6:图示数据,显示癌症疗法在上皮癌细胞中富集β3整合素:进行qPCR以检测整合素α和β亚基响应增加剂量的过氧化氢72小时的mRNA表达,表示为相对于载体对照的倍数。误差棒显示标准差。与对照相比*P<0.05。
参考文献
1.Holohan et al.,Cancer drug resistance:an evolving paradigm.Nat RevCancer.2013;13(10):714-26.
2.Seguin et al.,An integrin beta(3)-KRAS-RalB complex drives tumourstemness and resistance to EGFR inhibition.Nat Cell Biol.2014;16(5):457-68.
3.Desgrosellier et al.,An integrin alpha(v)beta(3)-c-Src oncogenicunit promotes anchorage-independence and tumor progression.Nat Med.2009;15(10):1163-9.
4.Desgrosellier et al.,Integrin alphavbeta3 drives slug activationand stemness in the pregnant and neoplastic mammary gland.Dev Cell.2014;30(3):295-308.
5.Smith JW,and Cheresh DA.Integrin(alpha v beta 3)-ligandinteraction.Identification of a heterodimeric RGD binding site on thevitronectin receptor.J Biol Chem.1990;265(4):2168-72.
6.Carter P.Improving the efficacy of antibody-based cancertherapies.Nat Rev Cancer.2001;1(2):118-29.
7.Chung et al.,Tumor-associated macrophages correlate with responseto epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors in advancednon-small cell lung cancer.Int J Cancer.2012;131(3):E227-35.
8.Zhang et al.,M2-polarized macrophages contribute to the decreasedsensitivity of EGFR-TKIs treatment in patients with advanced lungadenocarcinoma.Med Oncol.2014;31(8):127.
9.Knowles et al.,Integrin alphavbeta3 and fibronectin upregulate Slugin cancer cells to promote clot invasion and metastasis.Cancer Res.2013;73(20):6175-84.
10.Biswas SK,and Mantovani A.Macrophage plasticity and interactionwith lymphocyte subsets:cancer as a paradigm.Nat Immunol.2010;11(10):889-96.
11.Riabov et al.,Role of tumor associated macrophages in tumorangiogenesis and lymphangiogenesis.Front Physiol.2014;5(75.
12.Trikha et al.,E2f3 in tumor macrophages promotes lungmetastasis.Oncogene.2016;35(28):3636-46.
13.Noy R,and Pollard JW.Tumor-associated macrophages:from mechanismsto therapy.Immunity.2014;41(1):49-61.
14.Kaneda et al.,PI3Kgamma is a molecular switch that controls immunesuppression.Nature.2016;539(7629):437-42.
15.Cheresh DA.Human endothelial cells synthesize and express an Arg-Gly-Asp-directed adhesion receptor involved in attachment to fibrinogen andvon Willebrand factor.Proc Natl Acad Sci U S A.1987;84(18):6471-5.
16.Delbaldo et al.,.Phase I and pharmacokinetic study of etaracizumab(Abegrin),a humanized monoclonal antibody against alphavbeta3 integrinreceptor,in patients with advanced solid tumors.Invest New Drugs.2008;26(1):35-43.
17.McNeel et al.,Phase I trial of a monoclonal antibody specific foralphavbeta3 integrin(MEDI-522)in patients with advanced malignancies,including an assessment of effect on tumor perfusion.Clin Cancer Res.2005;11(21):7851-60.
18.Hersey et al.,Arandomized phase 2study of etaracizumab,amonoclonal antibody against integrin alpha(v)beta(3),+or-dacarbazine inpatients with stage IV metastatic melanoma.Cancer.2010;116(6):1526-34.
19.Mulgrew et al.,Direct targeting of alphavbeta3 integrin on tumorcells with a monoclonal antibody,Abegrin.Mol Cancer Ther.2006;5(12):3122-9.
20.Brooks et al.,Requirement of vascular integrin alpha v beta 3forangiogenesis.Science.1994;264(5158):569-71.
21.Brooks et al.,Integrin alpha v beta 3antagonists promote tumorregression by inducing apoptosis of angiogenic blood vessels.Cell.1994;79(7):1157-64.
22.Guilliams et al.,The function of Fcgamma receptors in dendriticcells and macrophages.Nat Rev Immunol.2014;14(2):94-108.
补充参考文献
1.SeguinL,KatoS,FranovicA,CamargoMF,LesperanceJ,ElliottKC,Yebra M,MielgoA,LowyAM,Husain H,et al.An integrin beta3-KRAS-RalB complex drivestumour stemness and resistance to EGFR inhibition.Nat Cell Biol.2014;16(5):457-68.
2.Cheresh DA,and Spiro RC.Biosynthetic and functional properties ofan Arg-Gly-Asp-directed receptor involvedinhumanmelanomacellattachmenttovitronectin,fibrinogen,andvonWill ebrandfactor.JBiol Chem.1987;262(36):17703-11.
3.SeguinL,KatoS,FranovicA,CamargoMF,LesperanceJ,ElliottKC,Yebra M,MielgoA,LowyAM,Husain H,et al.An integrin beta(3)-KRAS-RalB complex drivestumour stemness and resistance to EGFR inhibition.Nat Cell Biol.2014;16(5):457-68.
4.KanedaMM,MesserKS,RalainirinaN,LiH,LeemCJ,GorjestaniS,WooG,NguyenAV,Figueiredo CC,Foubert P,et al.PI3Kgamma is a molecular switch thatcontrols immune suppression.Nature.2016;539(7629):437-42.
5.Shu JQ,G.;Mohammad,I.A Semi-Automatic Image Analysis Tool forBiomarker Detection in ImmunohistochemistryAnalysis.SeventhInternationalConferenceonImageand Graphics.2013:937-42.
6.Bracher M,Gould HJ,Sutton BJ,Dombrowicz D,and Karagiannis SN.Three-colour flow cytometric methodtomeasureantibody-dependenttumourcellkillingbycytotoxicityandphag ocytosis.JImmunol Methods.2007;323(2):160-71.
描述了许多示例性实施方案。但是,应该理解可以在不背离本发明的精神和范围的情况下进行各种变型。因此,其他实施方案在下述权利要求的范围内。
Claims (16)
1.一种方法,用于:
-在有需要的个体中杀死表达αvβ3(avb3)多肽的癌细胞或癌症干细胞(CSC),或降低其数目,
-在有需要的个体中治疗、减轻或逆转或减缓表达αvβ3(avb3)多肽的癌症或肿瘤的发展,
-减轻或减缓由在其细胞表面上表达αvβ3多肽的癌细胞或肿瘤细胞,或者癌症干细胞(CSC)引起或起始的,或者由其维持的癌症的发展,
-增加能够在体内触发炎性响应并抑制肿瘤生长的巨噬细胞群,其中任选地所述能够触发炎性响应并抑制肿瘤生长的巨噬细胞群包括肿瘤相关巨噬细胞(TAM)或者M1巨噬细胞群,
-增强表达αvβ3(avb3)多肽的癌症或肿瘤对于治疗(任选地化学疗法,任选地用生长因子抑制剂治疗)效果的敏感性,
所述方法包括:
(a)向有需要的个体给予能够特异性地结合至在癌细胞或肿瘤细胞上,或在CSC上表达的αvβ3(avb3)整合素多肽的抗体或多肽,或者
(b)(i)提供能够特异性地结合至在癌细胞或肿瘤细胞上,或在CSC上表达的αvβ3(avb3)整合素多肽的抗体或多肽,
其中所述抗体或多肽具有能够结合巨噬细胞并起始抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)杀死所述抗体特异性结合的所述细胞的Fc结构域或同等结构域或部分,
(ii)向有需要的个体施用所述抗体或多肽,
从而导致:
在有需要的个体中杀死表达αvβ3(avb3)多肽的癌细胞或癌症干细胞(CSC),或降低其数目,
-在有需要的个体中治疗、减轻或逆转或减缓表达αvβ3(avb3)多肽的癌症或肿瘤的发展,
-减轻或减缓由在其细胞表面上表达αvβ3多肽的癌细胞或肿瘤细胞,或者癌症干细胞(CSC)引起或起始的,或者由其维持的癌症的发展,
-增加能够在体内触发炎性响应并抑制肿瘤生长的巨噬细胞群,其中任选地能够触发炎性响应并抑制肿瘤生长的所述巨噬细胞群包括肿瘤相关巨噬细胞(TAM)或者M1巨噬细胞群,
-增强表达αvβ3(avb3)多肽的癌症或肿瘤对于治疗效果的敏感性。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述抗体或多肽是人源化抗体或者包括人源化抗体,任选地人源化鼠抗体。
3.根据权利要求1所述的方法,其中所述抗体或多肽是重组的或者工程化的抗体或多肽。
4.根据权利要求1所述的方法,其中所述抗体是人抗体或人多肽。
5.根据权利要求1所述的方法,其中所述抗体是单克隆抗体,或是多克隆抗体。
6.根据权利要求5所述的方法,其中所述抗体或多肽是:单克隆抗体LM609(ChemiconInt.,Temecula,CA)(CVCL_KS89)(ATCC登录号为HB9537的鼠杂交瘤细胞)(参见例如美国专利号7,115,261);衍生自23C6克隆的单克隆抗体CBL544(MilliporeSigma,Burlington,MA);单克隆抗体ab7166(abcam,Cambridge,MA);或者,单克隆抗体ab78289(abcam,Cambridge,MA),或其任意的人源化形式,或包含LM609、CBL544、ab7166或ab78289的αvβ3-结合CDR的任意多肽。
7.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中所述巨噬细胞是人巨噬细胞,或者肿瘤相关巨噬细胞(TAM)。
8.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中所述癌症是上皮癌或上皮肿瘤细胞。
9.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中所述癌症是耐药癌症,并且任选地所述药物是生长因子抑制剂或激酶抑制剂,其中任选地所述生长因子抑制剂包括受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂,任选地厄洛替尼。
10.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中所述抗体或多肽静脉、肌内或皮下施用给有需要的个体。
11.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中所述抗体或多肽被配制为无菌药学组合物或制剂,或者被配制用于静脉、肌内或皮下施用。
12.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中抗体或多肽的剂量是基于固定给药或者基于体重给药,或者每月大约100至1200mg的固定剂量,或者为大约0.3至10mg/kg的剂量。
13.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其进一步包括施用生长因子抑制剂,其中任选地所述生长因子抑制剂包括受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂、Src抑制剂、抗代谢物抑制剂、吉西他滨、GEMZARTM、有丝***毒剂、紫杉醇、他克唑、ABRAXANETM、厄洛替尼、TARCEVATM、拉帕替尼、TYKERBTM、西妥昔单抗、ERBITUXTM,或者胰岛素生长因子抑制剂。
14.以下物质在制备药物中的用途:能够特异性地结合至在癌细胞或肿瘤细胞上,或在CSC上表达的αvβ3(avb3)整合素多肽的抗体或多肽;或者能够特异性地结合至在癌细胞或肿瘤细胞上,或在CSC上表达的αvβ3(avb3)整合素多肽的抗体或多肽,其中所述抗体或多肽具有能够结合巨噬细胞并起始抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)杀死所述抗体或多肽特异性结合的所述细胞的Fc结构域或同等结构域或部分,所述药物用于:
-在有需要的个体中杀死表达αvβ3(avb3)多肽的癌细胞或癌症干细胞(CSC),或降低其数目,
-在有需要的个体中治疗、减轻或逆转或减缓表达αvβ3(avb3)多肽的癌症或肿瘤的发展,
-减轻或减缓由在其细胞表面上表达αvβ3多肽的癌细胞或肿瘤细胞,或者癌症干细胞(CSC)引起或起始的,或者由其维持的癌症的发展,
-增加能够在体内触发炎性响应并抑制肿瘤生长的巨噬细胞群,其中任选地能够触发炎性响应并抑制肿瘤生长的所述巨噬细胞群包括肿瘤相关巨噬细胞(TAM)或者M1巨噬细胞群,
-增强表达αvβ3(avb3)多肽的癌症或肿瘤对于治疗效果的敏感性。
15.药学组合物或制剂用于在用于以下的方法中使用:
-在有需要的个体中杀死表达αvβ3(avb3)多肽的癌细胞或癌症干细胞(CSC),或降低其数目,
-在有需要的个体中治疗、减轻或逆转或减缓表达αvβ3(avb3)多肽的癌症或肿瘤的发展,
-减轻或减缓由在其细胞表面上表达αvβ3多肽的癌细胞或肿瘤细胞,或者癌症干细胞(CSC)引起或起始的,或者由其维持的癌症的发展,
-增加能够在体内触发炎性响应并抑制肿瘤生长的巨噬细胞群,其中任选地能够触发炎性响应并抑制肿瘤生长的所述巨噬细胞群包括肿瘤相关巨噬细胞(TAM)或者M1巨噬细胞群,
-增强表达αvβ3(avb3)多肽的癌症或肿瘤对于治疗效果的敏感性,
其中所述药学组合物或制剂包括:
能够特异性地结合至在癌细胞或肿瘤细胞上,或在CSC上表达的αvβ3(avb3)整合素多肽的抗体或多肽;或者,能够特异性地结合至在癌细胞或肿瘤细胞上,或在CSC上表达的αvβ3(avb3)整合素多肽的抗体或多肽,其中所述抗体或多肽具有能够结合巨噬细胞并起始抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)杀死所述抗体或多肽特异性结合的所述细胞的Fc结构域或同等结构域或部分。
16.包括根据权利要求15所述的药学组合物或制剂的试剂盒。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201762479768P | 2017-03-31 | 2017-03-31 | |
US62/479768 | 2017-03-31 | ||
PCT/US2018/025470 WO2018183894A1 (en) | 2017-03-31 | 2018-03-30 | Compositions and methods for targeting and killing alpha-v beta-3-positive cancer stem cells (cscs) and treating drug resistant cancers |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110662559A true CN110662559A (zh) | 2020-01-07 |
Family
ID=63676868
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201880033739.9A Pending CN110662559A (zh) | 2017-03-31 | 2018-03-30 | 用于靶向并杀死ALPHA-V BETA-3(αvβ3)-阳性癌症干细胞(CSC)和治疗耐药癌症的组合物和方法 |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20200109205A1 (zh) |
EP (2) | EP4353318A2 (zh) |
JP (2) | JP2020512978A (zh) |
KR (1) | KR102630070B1 (zh) |
CN (1) | CN110662559A (zh) |
AU (1) | AU2018243670A1 (zh) |
BR (1) | BR112019020451A2 (zh) |
CA (1) | CA3058458A1 (zh) |
EA (1) | EA201992326A1 (zh) |
IL (1) | IL269746A (zh) |
MX (1) | MX2019011717A (zh) |
WO (1) | WO2018183894A1 (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115960160A (zh) * | 2021-10-12 | 2023-04-14 | 南京大学 | 活细胞膜整合素αvβ3聚糖的原位糖链延长方法 |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2021015336A1 (ko) * | 2019-07-24 | 2021-01-28 | 가톨릭대학교 산학협력단 | αVβ3 인테그린 표적 단일 도메인 항체 |
AU2020324391A1 (en) * | 2019-08-02 | 2022-01-20 | The Regents Of The University Of California | Compositions and methods for targeting and killing alpha-v beta-3 -positive cancer stem cells (CSCS) and treating drug resistant and metastatic cancers |
CN115485301A (zh) * | 2020-04-23 | 2022-12-16 | 阿尔法贝塔控股有限责任公司 | 治疗癌症的组合物和方法 |
CN112626118B (zh) * | 2020-11-12 | 2023-06-23 | 清华-伯克利深圳学院筹备办公室 | 细胞株及其应用 |
WO2023056326A1 (en) * | 2021-09-30 | 2023-04-06 | Alpha Beta Holdings, Llc | Compositions and methods for treating cancer |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1226172A (zh) * | 1996-05-31 | 1999-08-18 | 斯克里普斯研究学院 | 用于抑制血管发生的方法和组合物 |
CN1346279A (zh) * | 1999-02-12 | 2002-04-24 | 斯克里普斯研究学院 | 联合应用抗血管生成和免疫治疗以***和转移的方法 |
WO2003075957A1 (en) * | 2002-03-04 | 2003-09-18 | Medimmune, Inc. | The prevention or treatment of cancer using integrin alphavbeta3 antagonists in combination with other agents |
CN101506238A (zh) * | 2005-06-30 | 2009-08-12 | 森托科尔公司 | 具有提高治疗活性的方法和成分 |
WO2013152313A1 (en) * | 2012-04-05 | 2013-10-10 | The Regents Of The University Of California | Compositions and methods for treating cancer and diseases and conditions responsive to growth factor inhibition |
WO2016100858A1 (en) * | 2014-12-18 | 2016-06-23 | The Regents Of The University Of California | Methods for inhibiting alpha-v beta-3 expression on cancer stem cells and inhibiting progression to a cancer stem cell phenotype |
CN106232625A (zh) * | 2013-10-01 | 2016-12-14 | 免疫医疗有限公司 | 治疗和诊断过表达α‑V‑β‑6的癌症的方法 |
Family Cites Families (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5753230A (en) | 1994-03-18 | 1998-05-19 | The Scripps Research Institute | Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis |
US5716928A (en) | 1995-06-07 | 1998-02-10 | Avmax, Inc. | Use of essential oils to increase bioavailability of oral pharmaceutical compounds |
US5858401A (en) | 1996-01-22 | 1999-01-12 | Sidmak Laboratories, Inc. | Pharmaceutical composition for cyclosporines |
US6007839A (en) | 1996-02-16 | 1999-12-28 | The Liposome Company, Inc. | Preparation of pharmaceutical compositions containing etherlipid-containing multiple lipid liposomes |
US6590079B2 (en) | 1997-01-30 | 2003-07-08 | Ixsys, Incorporated | Anti-αvβ3 recombinant human antibodies, nucleic acids encoding same |
US6630137B1 (en) | 1997-04-28 | 2003-10-07 | Eli Lilly And Company | Activated protein C formulations |
EP1005327A1 (en) | 1997-07-02 | 2000-06-07 | Sdg, Inc. | Targeted liposomal constructs for diagnostic and therapeutic uses |
AU766570B2 (en) | 1999-04-23 | 2003-10-16 | Mitsubishi Chemical Corporation | Antibody and polyalkylene glycol-bonded liposome |
US7671010B2 (en) | 2002-08-30 | 2010-03-02 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Compositions and methods of use of targeting peptides for diagnosis and therapy of human cancer |
US7858117B2 (en) | 2002-02-21 | 2010-12-28 | Novosom Ag | Amphoteric liposomes and their use |
EP1547581A1 (en) | 2003-12-23 | 2005-06-29 | Vectron Therapeutics AG | Liposomal vaccine for the treatment of human hematological malignancies |
EP1698329A4 (en) | 2003-12-24 | 2009-10-28 | Ltt Bio Pharma Co Ltd | PHARMACEUTICAL NANOTEILS, METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF AND PARENTERALLY APPLIED PRODUCT FROM NANOTEILES |
JP2007526322A (ja) | 2004-03-02 | 2007-09-13 | マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー | ナノセル薬物送達系 |
EP1773298A1 (en) | 2004-08-06 | 2007-04-18 | Biospectrum, Inc. | Multiple layered liposome and preparation method thereof |
JP2008510008A (ja) * | 2004-08-16 | 2008-04-03 | メディミューン,インコーポレーテッド | 抗体依存性細胞性細胞傷害活性が増強されたインテグリンアンタゴニスト |
US9005654B2 (en) | 2005-07-27 | 2015-04-14 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Systems and methods for manufacturing liposomes |
US20080088046A1 (en) | 2006-10-13 | 2008-04-17 | Steffen Panzner | Amphoteric liposomes, a method of formulating an amphoteric liposome and a method of loading an amphoteric liposome |
CA2629815C (en) * | 2005-11-14 | 2014-08-12 | University Of Southern California | Integrin-binding small molecules |
US20080089928A1 (en) | 2006-06-13 | 2008-04-17 | Stavroula Sofou | Liposome drug carriers with ph-sensitivity |
US20110319335A1 (en) * | 2010-06-23 | 2011-12-29 | Xiaodong Feng | Combined administration of integrin receptor antagonists for anti-angiogenic therapy |
WO2012167028A2 (en) * | 2011-06-02 | 2012-12-06 | The Regents Of The University Of California | Compositions and methods for treating cancer and diseases and conditions responsive to cell growth inhibition |
EP3070168A4 (en) * | 2013-11-11 | 2017-06-28 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule containing modified antibody variable region |
-
2018
- 2018-03-30 BR BR112019020451A patent/BR112019020451A2/pt unknown
- 2018-03-30 CN CN201880033739.9A patent/CN110662559A/zh active Pending
- 2018-03-30 EA EA201992326A patent/EA201992326A1/ru unknown
- 2018-03-30 KR KR1020197031332A patent/KR102630070B1/ko active IP Right Grant
- 2018-03-30 EP EP23203602.0A patent/EP4353318A2/en active Pending
- 2018-03-30 JP JP2019553167A patent/JP2020512978A/ja active Pending
- 2018-03-30 US US16/499,623 patent/US20200109205A1/en not_active Abandoned
- 2018-03-30 EP EP18774300.0A patent/EP3600422B1/en active Active
- 2018-03-30 CA CA3058458A patent/CA3058458A1/en active Pending
- 2018-03-30 WO PCT/US2018/025470 patent/WO2018183894A1/en active Application Filing
- 2018-03-30 AU AU2018243670A patent/AU2018243670A1/en active Pending
- 2018-03-30 MX MX2019011717A patent/MX2019011717A/es unknown
-
2019
- 2019-10-02 IL IL26974619A patent/IL269746A/en unknown
-
2021
- 2021-03-29 JP JP2021054730A patent/JP2021095423A/ja active Pending
-
2023
- 2023-10-04 US US18/480,778 patent/US20240067733A1/en active Pending
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1226172A (zh) * | 1996-05-31 | 1999-08-18 | 斯克里普斯研究学院 | 用于抑制血管发生的方法和组合物 |
CN1346279A (zh) * | 1999-02-12 | 2002-04-24 | 斯克里普斯研究学院 | 联合应用抗血管生成和免疫治疗以***和转移的方法 |
WO2003075957A1 (en) * | 2002-03-04 | 2003-09-18 | Medimmune, Inc. | The prevention or treatment of cancer using integrin alphavbeta3 antagonists in combination with other agents |
CN101506238A (zh) * | 2005-06-30 | 2009-08-12 | 森托科尔公司 | 具有提高治疗活性的方法和成分 |
WO2013152313A1 (en) * | 2012-04-05 | 2013-10-10 | The Regents Of The University Of California | Compositions and methods for treating cancer and diseases and conditions responsive to growth factor inhibition |
CN106232625A (zh) * | 2013-10-01 | 2016-12-14 | 免疫医疗有限公司 | 治疗和诊断过表达α‑V‑β‑6的癌症的方法 |
WO2016100858A1 (en) * | 2014-12-18 | 2016-06-23 | The Regents Of The University Of California | Methods for inhibiting alpha-v beta-3 expression on cancer stem cells and inhibiting progression to a cancer stem cell phenotype |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
CHRISTINE BÖGER等: "《Validation and comparison of anti-αvβ3 and anti-αvβ5 rabbit monoclonal versus murine monoclonal antibodies in four different tumor entities》", 《APPLIED IMMUNOHISTOCHEMISTRY & MOLECULAR MORPHOLOGY》 * |
JAY S DESGROSELLIER等: "《Integrin αvβ3 drives slug activation and stemness in the pregnant and neoplastic mammary gland》", 《DEVELOPMENTAL CELL》 * |
KATHY MULGREW等: "《Direct targeting of alphavbeta3 integrin on tumor cells with a monoclonal antibody, Abegrin》", 《MOLECULAR CANCER THERAPEUTICS》 * |
NAGARAJAN KANNAN等: "《Integrin β3 links therapy resistance and cancer stem cell properties》", 《NATURE CELL BIOLOGY》 * |
WEIBO CAI等: "《Anti-angiogenic cancer therapy based on integrin alphavbeta3 antagonism》", 《ANTI-CANCER AGENTS IN MEDICINAL CHEMISTRY》 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115960160A (zh) * | 2021-10-12 | 2023-04-14 | 南京大学 | 活细胞膜整合素αvβ3聚糖的原位糖链延长方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2018183894A1 (en) | 2018-10-04 |
US20240067733A1 (en) | 2024-02-29 |
IL269746A (en) | 2019-11-28 |
BR112019020451A2 (pt) | 2020-04-28 |
MX2019011717A (es) | 2019-12-16 |
EP3600422A1 (en) | 2020-02-05 |
EP3600422A4 (en) | 2021-01-13 |
JP2021095423A (ja) | 2021-06-24 |
EP4353318A2 (en) | 2024-04-17 |
KR20190133205A (ko) | 2019-12-02 |
US20200109205A1 (en) | 2020-04-09 |
KR102630070B1 (ko) | 2024-01-26 |
CA3058458A1 (en) | 2018-10-04 |
AU2018243670A1 (en) | 2019-10-31 |
EA201992326A1 (ru) | 2020-03-13 |
JP2020512978A (ja) | 2020-04-30 |
EP3600422B1 (en) | 2023-10-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20240067733A1 (en) | Compositions and methods for targeting and killing alpha-v beta-3-positive cancer stem cells (cscs) and treating drug resistant cancers | |
JP6706367B2 (ja) | 血管漏出症候群および癌を治療する方法 | |
CN101687039B (zh) | 工程化抗αν-整联蛋白杂合抗体 | |
ES2904880T3 (es) | Terapia combinada con inhibidores de Notch y de PD-1 o PD-L1 | |
JP2014132009A5 (zh) | ||
KR20150091165A (ko) | 항-cd38 항체 및 레날리도마이드를 포함하는 조성물 | |
US20140271644A1 (en) | Combination/adjuvant therapy for wt-1-positive disease | |
JP2012500180A5 (zh) | ||
KR20180095586A (ko) | 난소암 치료를 위한 hdac 억제제와 항-pd-l1 항체의 조합 | |
JP2020506945A (ja) | がんの治療のための方法、組成物及びキット | |
JP2003527441A (ja) | 細胞周期を阻止する薬剤及び抗体を含む医薬 | |
JP7352582B2 (ja) | Sumo活性化酵素阻害剤及び抗cd20抗体の投与 | |
JP6373252B2 (ja) | オーロラキナーゼ阻害薬を使用する癌の治療方法 | |
JP2022543780A (ja) | 抗ガレクチン9抗体と化学療法剤の組合せがん治療 | |
US20240043543A1 (en) | Anti-galectin-9 antibodies and therapeutic uses thereof | |
EP3815709A1 (en) | Pharmaceutical compositions and use thereof for relieving anticancer drug resistance and enhancing sensitivity of anticancer drug | |
JP2022522328A (ja) | Sumo活性化酵素阻害剤及びチェックポイント阻害剤の投与 | |
WO2014143835A1 (en) | Combination/adjuvant therapy for wt-1-positive disease | |
US20210060130A1 (en) | Pharmaceutical compositions and use thereof for relieving anticancer drug resistance and enhancing sensitivity of anticancer drug | |
US11298369B2 (en) | Composition and uses thereof | |
CN114144181A (zh) | 用于靶向和杀死α-vβ-3(αvβ3)阳性癌症干细胞(CSC)以及治疗耐药性和转移性癌症的组合物和方法 | |
JP6992984B2 (ja) | 腫瘍内静脈形成促進剤 | |
CA3237009A1 (en) | Lurbinectedin and atezolizumab combinations | |
JP2019526813A (ja) | Tirc7を基礎とする固形癌の診断及び治療 | |
JP2023542490A (ja) | Pd-1阻害剤を投与することによりがん疼痛を処置する方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |