KR102189645B1 - 당근액 및 박테리오파지를 이용한 락토코커스 락티스 내 나이신의 대량 생산 방법 - Google Patents

당근액 및 박테리오파지를 이용한 락토코커스 락티스 내 나이신의 대량 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 당근액 및 박테리오파지를 이용한 락토코커스 락티스 내 나이신의 생산 방법에 관한 것으로, 저렴한 소재안 당근을 이용하고, 박테리오파지를 이용함으로써, 항균 활성이 있는 것으로 알려진 나이신을 락토코커스 락티스 내에서 경제적으로 대량 생산할 수 있다.

Description

당근액 및 박테리오파지를 이용한 락토코커스 락티스 내 나이신의 대량 생산 방법 {Method for mass production of nisin in Lactococcus lactis with carrot liquid and bacteriophage}
본 발명은 항균물질로 알려진 나이신의 생산방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 당근액 및 박테리오파지를 이용한 락토코커스 락티스 내 나이신의 대량 생산 방법에 관한 것이다.
유산균(Lactic acid bacteria)은 당류를 분해하여 젖산을 생성하는 세균으로 젖산균이라고도 한다. 유산균은 인간의 장내에서 해로운 물질을 억제할 뿐만 아니라 그 자체로서 면역력을 향상시키는데 기여하는 등 광범위한 효능이 있다. 또한, 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)는 항균 활성이 있는 나이신(nisin)을 생산하는 균주로 알려져 있다.
나이신(nisin)은 박테리오신의 일종으로 작은 펩타이드(peptide)인데, 미생물에 대한 정균(bacteriostatic) 효과와 살균(bactericidal) 효과가 있으며, 인간이 섭취할 경우 단백질 가수분해효소에 의해 분해되기 때문에 체내에 잔류하는 부작용이 없는 장점이 있다.
따라서, 나이신은 식품 보존제로 널리 쓰일 뿐 아니라, 약품 및 화장품 원료로도 이용되어 산업적으로 매우 효용가치가 있는 물질이다. 또한, 화학 보존제를 대체할 수 있는 효과가 있어, 화학물질에 대한 소비자의 불안감을 저감시킬 수 있는 장점도 있다.
대한민국 공개특허 제10-2007-0021132호(2007.02.22.공개)에는, 나이신 고생산 유산균 및 이의 선발방법이 개시되어 있다. 대한민국 등록특허 제10-1600569호(2016.02.29.등록)에는, 당근잼을 이용한 발효유의 제조방법이 개시되어 있다.
본 발명은 나이신의 생산 효율을 더욱 증진시켜 고농도로 나이신을 생산하는 방법을 제공하고자 한다. 즉, 본 발명은 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)로부터 생산되는 천연 항균물질인 나이신(nisin)을 더욱 효율적으로 생산할 수 있는 방법을 개발하여 제공하고자 한다.
본 발명은 당근 착즙액 또는 당근 추출액에 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)와 박테리오파지(Bacteriophage)를 접종하여 배양하는 것을 특징으로 하는 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법을 제공한다.
본 발명의 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법에 있어서, 상기 당근 착즙액 또는 당근 추출액은, 바람직하게 자몽씨 추출물(grapefruit seed extract)을 함유하는 것이 좋다. 이때, 더욱 바람직하게 상기 자몽씨 추출물(grapefruit seed extract)을 배양 중 간헐적으로 당근 착즙액 또는 당근 추출액에 첨가할 수 있다.
본 발명의 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법에 있어서, 상기 당근 착즙액 또는 당근 추출액은, 바람직하게 멸균처리된 것을 사용하는 것이 좋다.
본 발명의 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법에 있어서, 상기 배양은, 바람직하게 30℃ 온도에서 혐기 조건으로 12-15시간 배양하는 것이 좋다.
본 발명의 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법에 있어서, 상기 락토코커스 락티스는, 바람직하게 당근 착즙액 또는 당근 추출액 10 mL 당 1×109 CFU/mL) 접종하는 것이 좋다.
본 발명의 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법에 있어서, 상기 박테리오파지(Bacteriophage)는 바람직하게 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)를 접종한 후, 시간 차를 두고 당근 착즙액 또는 당근 추출액에 접종하는 것이 좋다. 이때, 상기 박테리오파지는 더욱 바람직하게 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)를 접종한 후, 시간 차를 두고 당근 착즙액 또는 당근 추출액에 반복적으로 접종하는 것이 좋다.
본 발명의 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법에 있어서, 상기 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법은, 바람직하게 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 배양 후, 락토코커스 락티스 균체를 파쇄하기 위해 고압파쇄를 수행하는 것이 좋다.
본 발명에 의할 경우, 저렴한 소재안 당근을 이용하고, 박테리오파지를 이용함으로써, 항균 활성이 있는 것으로 알려진 나이신을 락토코커스 락티스 내에서 경제적으로 대량 생산할 수 있다.
또한, 본 발명에 의할 경우, 최소의 열처리 및 저온 유통으로 안정성을 확보할 수 있는 항균 제품을 개발할 수 있으며, 화학 보존제에 대한 소비자의 불안감을 해소할 수 있어 고품질의 항균 신제품으로 사용 가능하다.
도 1은 당근을 이용하여 락토코커스 락티스로부터 나이신을 생산하는 본 발명의 과정을 나타내는 모식도이다.
도 2는 각각 당근, 오이, 사과, 상추를 이용하여 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)를 배양한 결과 그래프 (균체 성장 그래프)이다.
도 3은 본 발명의 락토코커스 락티스 배양시, 박테리오파지 접종 후 락토코커스 락티스 균수의 변화를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 배양에 따른 당근 배양액을 고압파쇄한 후, 지표균주에 대한 항균력을 측정한 결과이다 (도 4에서, a) control (당근배양액), b) 1회 처리, c) 3회 처리, d) 5회 처리 e) 1000배 희석).
도 5는 락토코커스 락티스가 파쇄된 당근 배양액을 사용하여 지표균주 중 'P2]' 균주 및 'P4]' 균주에 대해 시간별 (0h, 3h, 6h, 12h, 18h, 24h) /온도별 (23℃, 30℃, 37℃) 항균능을 확인한 결과이다.
본 발명은 당근 착즙액 또는 당근 추출액에 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)와 박테리오파지(Bacteriophage)를 접종하여 배양하는 것을 특징으로 하는 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법을 제공한다.
나이신(nisin)은 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 유산균으로부터 생산되는 박테리오신(bacteriocin)으로 천연의 항균성 단백질이다. 나이신은 섭취하여도 인체 내의 단백질 가수분해효소에 의해 분해되기 때문에 체내에 잔류하는 부작용이 없는 장점이 있으며, 식품 뿐만 아니라 약품 또는 화장품 원료로도 이용될 수 있어 효용가치가 매우 높다.
본 발명은 나이신 생산을 위한 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)의 배양에 있어서 배지로 당근액 (당근 착즙액 또는 당근 추출액)을 사용하였다. 당근은 각종 비타민과 무기물 등 영양분이 풍부하고, 다른 채소에 비하여 산미가 낮아 별도의 pH 조정이 필요없으며, 당도가 높기 때문에 천연 배지로서 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)를 발효시키기에 적합한 것으로 본 발명에서 확인되었다 (도 2).
한편, 본 발명에서는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)의 배양시, 박테리오파지(bacteriophage)를 함께 첨가하여 배양시키고 있는데, 이를 통해 나이신(nisin)을 고농도로 생산할 수 있었다.
박테리오신(bacteriocin)은 일반적으로 생장이 힘든 가혹한 환경에서 높은 농도로 생산될 수 있는데, 본 발명에서 사용하는 박테리오파지는 유산균의 생육을 저해하는 물질로서, 가혹한 환경을 유도하는 역할을 하기 때문에 박테리오신의 일종인 나이신의 생산량을 늘릴 수 있는 것이다. 또한, 박테리오파지는 유산균을 파쇄시키는 역할을 수행할 수 있기 때문에, 균체 내에 있는 나이신을 균체밖으로 자연스럽게 배출하는 효과도 발휘하게 된다.
다만, 박테리오파지를 첨가하여 배양할 경우, 유산균의 생육이 억제될 수 있고, 이는 나이신의 전체 생산량 감소로 이어질 수 있는데, 본 발명의 실험에 의할 경우 도 3에서 보는 바와 같이 일정 농도 이하로는 유산균의 균체량이 저하되지 않는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 균체량의 저감에 따른 나이신의 생산량 저감은 본 발명에서 그리 큰 우려사항은 아닌 것으로 판단되었다.
본 발명의 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법에 있어서, 당근 착즙액 또는 당근 추출액은, 바람직하게 멸균처리된 것을 사용하는 것이 좋다. 멸균처리를 함으로써, 당근 추출액이 다른 균에 의해 사용되는 것을 막을 수 있고, 배양액에 다른 균에 의해 오염되는 것을 방지할 수 있기 때문이다.
본 발명의 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법에 있어서, 상기 배양은, 바람직하게 30℃ 온도에서 혐기 조건으로 12-15시간 발효시키는 것이 좋다. 락토코커스 락티스는 혐기성 균으로 30℃ 내외에서 생육이 활발하기 때문이다.
본 발명의 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법에 있어서, 상기 락토코커스 락티스는, 바람직하게 당근 착즙액 또는 당근 추출액 10 mL 당 1×109 CFU/mL) 접종하는 것이 좋다.
본 발명의 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법에 있어서, 상기 박테리오파지(Bacteriophage)는 바람직하게 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)를 접종한 후, 시간 차를 두고 당근 착즙액 또는 당근 추출액에 접종하는 것이 좋다. 동시에 접종하는 경우 락토코커스 락티스의 생육이 현저히 저해될 수 있기 때문이다. 더욱 바람직하게는 대수기(exponential phase) 또는 정지기 (stationay phase)에 접종하는 것이 좋다. 또한, 시간 차를 두고 당근 착즙액 또는 당근 추출액에 박테리오파지(Bacteriophage)를 반복적으로 접종하는 것이 더욱 좋다.
본 발명의 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법에 있어서, 상기 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법은, 바람직하게 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 배양 후, 락토코커스 락티스 균체를 파쇄하기 위해 고압파쇄를 수행하는 것이 좋다. 나이신은 단백질로서, 고온처리시 활성이 소실될 수 있는데, 고압을 이용하여 균체를 파쇄할 경우, 나이신이 열에 의해 활성이 소실되는 것을 방지할 수 있다. 고압파쇄 처리는 세포 파쇄 방법 중 하나로 세포 발효액을 고압 하에서 파쇄 하는 방법으로써, 다른 파쇄 방법에 비해 신속하고 간단한 방법이다. 이를 통해 세포 내 생성물인 나이신을 외부로 방출시킴으로써, 활성을 유지하고 있는 나이신을 고농도로 추출 가능한 것이다.
한편, 본 발명의 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법에 있어서, 상기 당근 착즙액 또는 당근 추출액은, 바람직하게 자몽씨 추출물(grapefruit seed extract)을 함유하고 있을 수 있다. 자몽씨 추출물(Grapefruit seed extract)은 항균활성능이 있는 것으로 최근 주목받고 있으며, 상업적으로 쉽게 이용이 가능한 물질이다. 자몽씨 추출물에는 자몽씨앗, 펄프, 그리고 흰 막이 포함되며 상업적으로 화장품제조와 식품 보조제로 주로 쓰이는데, 자몽 씨 추출물이 천연항균제로 알려져 있기 때문이다. 이렇듯 자몽씨 추출물은 안전하고 자연적이며, 효과적인 보존제로서 그 가치가 있다. 또한, 상기 자몽씨 추출물(grapefruit seed extract)은 본 발명에서 더욱 바람직하게 배양 중 간헐적으로 당근 착즙액 또는 당근 추출액에 추가할 수 있다.
이하, 본 발명의 내용에 대해 하기 실시예 및 실험예에서 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[실험예 1: 여러 채소를 이용한 락토코커스 락티스의 생육능 비교]
본 실험에서는 여러 채소 (당근, 오이, 상추 또는 사과)의 착즙액을 배지로 하여 락토코커스 락티스의 생육능을 비교하고자 하였다. 대조군으로는 유산균 배양을 위해 많이 사용되는 MRS 배지를 사용하였다.
당근, 오이, 상추 또는 사과를 수세하여 박피하는 과정을 거친 후 효율적인 착즙을 위하여 2~4 cm로 썰어서 착즙기를 이용하여 주스를 추출하였다. 추출된 주스는 고압멸균기를 이용하여 완전한 제균 처리를 거쳐 유산균만을 선택적으로 발효시킬 수 있도록 하였다. 제균처리를 한 주스에 락토코커스 락티스 균주의 접종을 완료한 후, 30℃에서 12시간 배양하였다.
배양 결과, 도 2의 a) 및 b)에서 보는 바와 같이, 당근을 사용하는 경우가 오이, 상추 또는 사과를 사용하는 경우에 비해 균체 (락토코커스 락티스)의 생장이 우수한 것으로 확인되었다. 또한, 당근은 유산균 발효에 많이 사용되는 MRS 배지보다도 동등 또는 그 이상의 우수한 생육능을 나타냈다.
[실시예 1: 본 발명의 나이신 생산 공정의 확립]
상기에서 우수한 배지 소재로 선택된 당근을 이용하여 하기와 같이 본 발명을 실시하였다. 당근은 수세하여 박피하는 과정을 거친 후 효율적인 착즙을 위하여 2~4 cm로 썰어서 착즙기를 이용하여 당근 주스를 추출하였다. 추출된 주스는 고압멸균기를 이용하여 완전한 제균 처리를 거쳐 유산균만을 선택적으로 발효시킬 수 있도록 하였다.
제균처리를 한 당근 주스에 락토코커스 락티스 균주의 접종을 완료한 후, 30℃에서 12시간 배양하였다. 이때, 락토코커스 락티스를 호스트 (host)로 하는 박테리오파지(103 PFU/mL)를 락토코커스 락티스 접종과 동시에 당근주스에 접종하여 함께 배양하였다. 박테리오신의 일종인 나이신은 힘든 환경이 주어졌을 때 농도가 높게 생산될 수 있기 때문에, 배양 동안에 함께 박테리오파지를 첨가해 주어 배양시킨 것이다. 접종 후, 12시간 동안 배양하고, 나이신의 보존과 발효를 중지하기 위해 냉장보관을 하였다.
도 3은 본 발명의 락토코커스 락티스 배양시, 박테리오파지 접종 후, 시간의 경과에 따른 유산균 수의 변화를 나타낸 것이다.
[실험예 2: 상기 실시예 1에서 배양 완료 후, 수득한 당근 배양액의 병원성 균주에 대한 항균능 측정]
본 실험에서는 상기 실시예 1의 배양을 통해 수득한 당근 배양액의 항균능을 측정하고자 하였다. 우선, 당근 배양액 중 락토코커스 락티스의 파쇄를 위해, 고압파쇄를 실시하였는데, 고압파쇄는 1회 처리 시 압력 세기 20,000 psi으로 진행하였으며, 1회 처리 후 5분간 열을 식히는 단계를 거치면서 총 3회 진행하였다.
락토코커스 락티스가 파쇄된 당근 배양액의 항균능 측정은 spot-on-lawn과 paper disc 방법을 사용하였다. 지표균주가 함유된 TSB 연한천배지(0.65% 한천 첨가)를 TSB 한천배지에 중층하여 건조시킨 후, 고압파쇄 처리까지 완료되어 락토코커스 락티스가 파쇄된 당근 배양액을 spot-on-lawn의 경우 10 uL 떨어뜨리고, disc는 80 uL 흡수시켜 12시간 후 나이신에 의한 저해환을 확인하였다.
도 4는 본 발명의 배양에 따른 당근 배양액을 고압파쇄한 후, 지표균주에 대한 항균력을 측정한 결과이다 (도 4에서, a) control (당근배양액), b) 1회 처리, c) 3회 처리, d) 5회 처리 e) 1000배 희석).
한편, 상기에서 수득한 락토코커스 락티스가 파쇄된 당근 배양액을 사용하여 지표균주 중 P2] 균주 및 P4] 균주에 대해 시간별/온도별 항균능을 확인하였는데, 23~30℃에서 12~24시간 배양 시 P2] 균주에 대하여 최대 1000배의 항균능을 확인할 수 있었다.
도 5는 락토코커스 락티스가 파쇄된 당근 배양액을 사용하여 지표균주 중 'P2]' 균주 및 'P4]' 균주에 대해 시간별 (0h, 3h, 6h, 12h, 18h, 24h) 및 온도별 (23℃, 30℃, 37℃) 항균능의 유지에 대해 확인한 결과이다.
[실시예 2: 당근 주스에 천연항균물질인 자몽씨추출액을 500 ppm 첨가하여 락토코커스 락티스의 배양]
제균 처리를 한 당근주스에 자몽씨 추출물 500 ppm을 첨가한 후, 락토코커스 락티스 균주를 접종하였다. 첨가 후, 30℃에서 배양이 12시간 정도 진행되면 나이신의 보존과 락토코커스 락티스의 발효를 중지하기 위해 냉장보관하였다. 한편, 별도 실시예 2-1에서는 상기 배양시, 실시예 1과 같은 방법으로 박테리오파지를 함께 접종하였다.
[실시예 3: 당근 주스에 천연항균물질인 자몽씨추출액을 100 ppm 첨가하여 배양]
제균 처리를 한 당근 주스에 자몽씨 추출물을 100 ppm을 첨가한 후, 락토코커스 락티스 균주를 접종하였다. 이후, 30℃에서 배양을 진행하고 배양이 진행되는 3시간, 5시간, 8시간 마다 100 ppm을 추가 접종하였다. 이후, 배양이 12-15시간 정도 진행되면 나이신의 보존과 락토코커스 락티스의 발효를 중단하기 위해 냉장 보관하였다. 한편, 별도 실시예 3-1에서는 상기 배양시, 실시예 1과 같은 방법으로 박테리오파지를 함께 접종하였다.

Claims (9)

  1. 당근 착즙액에 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)와 박테리오파지(Bacteriophage)를 접종하여 배양한 후, 수득된 당근 배양액을 고압파쇄하여 락토코커스 락티스 균체를 파쇄하여 나이신을 방출하며,
    상기 박테리오파지는 락토코커스 락티스를 호스트로 하는 박테리오파지인 것을 특징으로 하는 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 당근 착즙액은,
    자몽씨 추출물(grapefruit seed extract)을 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법은,
    자몽씨 추출물(grapefruit seed extract)을 배양 중 간헐적으로 당근 착즙액에 추가하는 것을 특징으로 하는 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 당근 착즙액은,
    멸균처리된 것을 특징으로 하는 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 배양은,
    30℃ 온도에서 혐기 조건으로 12-15시간 배양하는 것을 특징으로 하는 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 락토코커스 락티스는,
    당근 착즙액 10 mL 당 1×109 CFU/mL 접종하는 것을 특징으로 하는 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 박테리오파지(Bacteriophage)는
    락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)를 접종한 후, 시간 차를 두고 당근 착즙액에 접종하는 것을 특징으로 하는 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 박테리오파지는,
    락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)를 접종한 후, 시간 차를 두고 당근 착즙액에 반복적으로 접종하는 것을 특징으로 하는 락토코커스 락티스 내 나이신(nisin)의 생산방법.
  9. 삭제
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