KR102182656B1 - 카르복시메틸 덱스트란이 코팅된 초상자성 산화철 나노입자를 함유한 자성 아가로스 비드와 그 제조방법 - Google Patents

카르복시메틸 덱스트란이 코팅된 초상자성 산화철 나노입자를 함유한 자성 아가로스 비드와 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

카르복시메틸 덱스트란이 코팅된 초상자성 산화철 나노입자를 함유한 자성 아가로스 비드와 그 제조방법에 관한 것으로,
본 발명의 일 측면에서 제공되는 CMD-IONP 함유 자성 아가로스 비드 (CMD-IONP-MAB)는, 내부의 극미세 초상자성 산화철 나노입자(IONP)가 카르복시메틸 덱스트란으로 코팅되어 친수성이고, 입자 간 반발력이 생성되어 입자 간의 응집이 방지되므로, CMD-IONP가 CMD-IONP-MAB 내부에 균일하게 분포할 수 있어, 상기 CMD-IONP-MAB는 단백질의 분리와 정제 효율이 높은 효과가 있다.

Description

카르복시메틸 덱스트란이 코팅된 초상자성 산화철 나노입자를 함유한 자성 아가로스 비드와 그 제조방법{Magnetic agarose beads containing carboxymethyl dextran-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles and the preparation method thereof}
카르복시메틸 덱스트란이 코팅된 초상자성 산화철 나노입자를 함유한 자성 아가로스 비드와 그 제조방법에 관한 것이다.
단백질, 펩타이드, 핵산 등과 같은 바이오 분자의 분리와 정제에는 원심분리, 흡착 크로마토그래피, 침강법 등의 방법이 이용되고 있다. 자성 입자를 이용한 바이오 분자의 분리와 정제의 장점은 다른 방법에 비해 분리와 정제에 소요되는 시간이 짧고 분리 효율이 높다는 점이 있다. 자성 입자는 주로 금속이 이용되는데, Fe3O4, NiO, Co3O4 등과 같은 금속 산화물이나 FeCo, FePt, CoNi 등과 같은 합금이 이용된다.
자성 입자는 강자성(ferromagnetic) 또는 상자성(paramagnetic)의 특성을 나타내는데 단백질, 펩타이드, 핵산 등의 분리와 정제는 주로 상자성 입자들이 이용되며, 상자성 입자는 입경의 크기에 따라 극미세 초상자성 입자, 초상자성 입자 그리고 상자성 입자로 구분된다. 그 직경은 극미세 초상자성 입자가 50 nm 이하, 초상자성 입자가 70 내지 150 nm, 그리고 상자성 입자가 1000nm 이상이다.
금속 산화물 자성입자는 열분해법, 전기화학법, 초음파합성법, 공침법 등의 방법으로 제조될 수 있다. 이중 공침법은 다른 제조방법에 비해 낮은 비용, 높은 수율 그리고 위험한 용매와 고온이 불필요하다는 장점을 갖는다.
자성 입자의 분산력을 향상시키기 위해서는 자성 입자를 도핑(doping) 하는 것이 필요한데, 구연산(citric acid), 올레산(oleic acid) 와 같은 저분자 물질 또는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 폴리(비닐 알코올)과 같은 합성 고분자나 다당류(polysaccharides)와 같은 천연 고분자 물질이 도핑에 이용된다.
한편, 아가로스(agarose)는 아가로스 분자가 갖는 다공성에 의해 분리능이 우수하기 때문에 비드로 제조되어 흡착 크로마토그래피에 이용되어왔다. 또한, 아가로스는 낮은 독성, 우수한 생체적합성, 친수성, 생분해성과 같은 특성을 지니고 있을뿐만 아니라, 풍부한 하이드록시기를 가지고 있어 다양한 작용기로의 개질이 가능하다.
이에, 자성 입자를 아가로스 비드 내부에 함유시킨 자성 아가로스 비드는, 아가로스 비드가 가지고 있는 낮은 독성, 우수한 생체적합성 등의 장점과, 자성 입자가 가지고 있는 높은 분리 효율과 분리의 편의성 등의 장점을 동시에 나타낼 수 있다.
상자성 산화철 나노입자를 아가로스의 유화 젤 형성을 통해 아가로스 비드의 내부에 함유시킨 자성 아가로스 비드는, 도핑하지 않은 산화철 나노입자를 이용하는 경우, 산화철 나노입자가 입자의 내부에 불균일하게 응집된 형태로 존재한다. 비드 내에서 자성 나노입자의 응집이 최소화되고 입자가 균일하게 분포된 자성 아가로스 비드를 제조하려면, 비드 내에서 자성 나노입자가 입자 자체의 자성에 의해 응집되려는 경향을 최소화시켜야 한다.
상자성 나노입자가 아가로스 비드의 중심부 또는 비드 내부의 어느 한 부위에 응집된 형태로 존재하는 아가로스 비드를 이용하여 표적 단백질을 분리하는 경우, 표적 단백질이 흡착된 비드는 영구 자석에 의한 견인이 균일하지 않고, 단백질이 흡착된 비드의 손실이 발생한다. 따라서 단백질이 흡착된 비드의 손실을 최소화하기 위해서 외부에서 필요 이상의 자력을 가해야만 하거나 단백질의 수득률을 높이기 위해 비드 내에 자성 입자를 과량으로 함유시켜야 한다.
일반적으로, 자성입자의 응집을 억제하는 방법은 친수성 저분자 또는 고분자 형태의 물질 그리고 양친매성 물질을 자성입자의 표면에 코팅하는 것이지만, 단백질의 분리를 위해서는 상자성 자성입자의 표면 처리에 이용되는 물질이 표적 단백질의 특성을 변화시키지 않도록 높은 생체적합성을 가져야 하고, 자성 입자에 충분한 수분산성과 이온 반발력을 부여할 수 있어야 한다.
특허문헌 1(US 7,897,257 B2)은 상자성 산화철 입자의 표면을 소수성 모노머를 중합하여 표면 처리하고 이어서 친수성 물질로 친수화 처리한 후 에멀전 합성법으로 아가로스 비드의 중심부에 수 개의 상자성 산화철 입자들이 존재하도록 하는 자성 아가로스 비드 제조법을 개시하고 있다.
하지만, 상기 제조법은 제조 공정이 매우 복잡할 뿐만 아니라, 설사 중심부에만 구형의 산화철 입자가 존재하는 경우라고 할지라도, 최종 제조된 아가로스 비드가 영구 자석에 의해 견인되지 않았고, 특허의 재현성이 확보되지 않는 문제가 있다.
본 발명의 일 측면에서의 목적은 바이오 분자 분리용으로 사용할 때, 바이오 분자를 흡착한 후 영구 자석으로 견인시, 견인이 용이하고 비드 자체의 손상이 적어 바이오 분자 분리효율을 대폭 개선할 수 있는 자성 아가로스 비드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 측면에서의 목적은 상기 자성 아가로스 비드의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 일 측면에서의 목적은 상기 자성 아가로스 비드를 포함하는 바이오 분자 분리용 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명의 일 측면은 카르복시메틸 덱스트란(carboxymethyl dextran) 코팅층이 표면에 형성된 금속 산화물 나노입자를 포함하는 자성 아가로스 비드를 제공한다.
본 발명의 다른 일 측면은 금속 산화물 나노입자에 카르복시메틸 덱스트란을 처리하여 카르복시메틸 덱스트란 코팅층을 형성하는 단계;
상기 코팅층이 형성된 금속 산화물 나노입자와 아가로스를 포함하는 수상 용액을, 유기상 용액에 첨가하여 에멀젼을 형성시키는 단계; 및
아가로스의 젤화를 유도하는 단계; 를 포함하는 자성 아가로스 비드의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 상기 자성 아가로스 비드를 포함하는 바이오 분자 분리용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 측면에서 제공되는 CMD-IONP 함유 자성 아가로스 비드 (CMD-IONP-MAB)는, 내부의 극미세 초상자성 산화철 나노입자(IONP)가 카르복시메틸 덱스트란으로 코팅되어 친수성이고, 입자 간 반발력이 생성되어 입자 간의 응집이 방지되므로, CMD-IONP가 CMD-IONP-MAB 내부에 균일하게 분포할 수 있어, 상기 CMD-IONP-MAB는 단백질의 분리와 정제 효율이 높은 효과가 있다. 또한, 아가로스 고유의 작용기인 하이드록시기 이외에도 표면의 카르복시기가 존재할 수 있으므로 표면 개질에 유리하다.
도 1은 카르복시메틸 덱스트란으로 코팅된 산화철 나노입자 (CMD-IONP) 회합체의 입도 분포를 나타내는 도면이다.
도 2는 CMD-IONP의 X-선 회절 패턴을 나타내는 도면이다.
도 3은 고해상도 투과전자현미경으로 관찰된 CMD-IONP의 이미지를 나타내는 도면이다.
도 4는 광학 현미경 관찰된 CMD-IONP 함유 자성 아가로스 비드 (CMD-IONP-MAB) 이미지를 나타내는 도면이며, 축척 막대는 50 마이크로미터이다.
도 5는 산성 용액 (pH 4.5)에서 시간 경과에 따른 CMD-IONP-MAB 내 Fe3O4 NP의 함량을 나타내는 도면이다.
도 6은 산화철 나노입자 (IONP) 회합체의 입도 분포를 나타내는 도면이다.
도 7은 IONP의 X-선 회절 패턴을 나타내는 도면이다.
도 8은 투과전자현미경으로 관찰된 IONP의 이미지를 나타내는 도면이다.
도 9는 광학 현미경 관찰된 IONP 함유 자성 아가로스 비드 (IONP-MAB)의 이미지를 나타내는 도면이며, 축척 막대는 50 마이크로미터이다.
도 10은 산성 용액 (pH 4.5)에서 시간 경과에 따른 IONP-MAB 내 Fe3O4 NP의 함량을 나타내는 도면이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
한편, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 실시 형태는 당해 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다. 나아가, 명세서 전체에서 어떤 구성요소를 "포함"한다는 것은 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명의 일 측면은 카르복시메틸 덱스트란(carboxymethyl dextran) 코팅층이 표면에 형성된 금속 산화물 나노입자를 포함하는 자성 아가로스 비드를 제공한다. 이때, 상기 금속 산화물 나노입자는 초상자성(superparamagnetic) 산화철 나노입자인 것이 바람직하다.
상기 금속 산화물 나노입자의 평균 직경은 1 내지 20 nm 범위일 수 있고, 2 내지 20 nm 범위일 수 있고, 3 내지 20 nm 범위일 수 있고, 4 내지 20 nm 범위일 수 있고, 5 내지 20 nm 범위일 수 있고, 1 내지 19 nm 범위일 수 있고, 1 내지 18 nm 범위일 수 있고, 1 내지 17 nm 범위일 수 있고, 1 내지 16 nm 범위일 수 있고, 1 내지 15 nm 범위일 수 있고, 2 내지 19 nm 범위일 수 있고, 3 내지 18 nm 범위일 수 있고, 4 내지 17 nm 범위일 수 있고, 4.5 내지 16 nm 범위일 수 있고, 5 내지 15 nm 범위일 수 있다.
또한, 상기 카르복시메틸 덱스트란 코팅층의 평균 두께는 0.1 내지 1.0 nm 범위일 수 있고, 0.2 내지 1.0 nm 범위일 수 있고, 0.3 내지 1.0 nm 범위일 수 있고, 0.4 내지 1.0 nm 범위일 수 있고, 0.5 내지 1.0 nm 범위일 수 있고, 0.1 내지 0.9 nm 범위일 수 있고, 0.1 내지 0.8 nm 범위일 수 있고, 0.1 내지 0.7 nm 범위일 수 있고, 0.1 내지 0.6 nm 범위일 수 있고, 0.1 내지 0.5 nm 범위일 수 있고, 0.2 내지 0.8 nm 범위일 수 있고, 0.3 내지 0.7 nm 범위일 수 있고, 0.4 내지 0.6 nm 범위일 수 있고, 0.5 nm 일 수 있다.
나아가, 상기 카르복시메틸 덱스트란 코팅층이 표면에 형성된 금속 산화물 나노입자는, 20 내지 210 nm의 평균 직경을 갖는 회합체 형태로 아가로스 비드 내부에 균일하게 분포된다. 상기 회합체의 평균 직경은 다른 측면에서 22 내지 210 nm 범위일 수 있고, 24 내지 210 nm 범위일 수 있고, 26 내지 210 nm 범위일 수 있고, 28 내지 210 nm 범위일 수 있고, 30 내지 210 nm 범위일 수 있고, 20 내지 208 nm 범위일 수 있고, 20 내지 206 nm 범위일 수 있고, 20 내지 204 nm 범위일 수 있고, 20 내지 202 nm 범위일 수 있고, 20 내지 200 nm 범위일 수 있고, 22 내지 208 nm 범위일 수 있고, 24 내지 206 nm 범위일 수 있고, 26 내지 204 nm 범위일 수 있고, 28 내지 202 nm 범위일 수 있고, 30 내지 200 nm 범위일 수 있다.
또한, 상기 아가로스 비드의 평균 직경은 20 내지 210 ㎛(마이크로미터) 범위일 수 있고, 20 내지 208 ㎛ 범위일 수 있고, 20 내지 206 ㎛ 범위일 수 있고, 20 내지 204 ㎛ 범위일 수 있고, 20 내지 202 ㎛ 범위일 수 있고, 20 내지 200 ㎛ 범위일 수 있다.
본 발명의 일 측면에서 제공되는 CMD-IONP 함유 자성 아가로스 비드 (CMD-IONP-MAB)는, 내부의 극미세 초상자성 산화철 나노입자(IONP)가 카르복시메틸 덱스트란으로 코팅되어 친수성이고, 입자 간 반발력이 생성되어 입자 간의 응집이 방지되므로, CMD-IONP가 CMD-IONP-MAB 내부에 균일하게 분포할 수 있어, 상기 CMD-IONP-MAB는 단백질의 분리와 정제 효율이 높은 효과가 있다. 또한, 아가로스 고유의 작용기인 하이드록시기 이외에도 표면의 카르복시기가 존재할 수 있으므로 표면 개질에 유리하다.
특히, 상기 자성 아가로스 비드 (CMD-IONP-MAB)를 바이오 분자 분리용으로 사용할 때, 바이오 분자를 흡착한 후 영구 자석으로 견인시, 비드 자체의 견인이 용이하고, 견인시 비드 자체의 손상이 적어 바이오 분자 분리효율을 대폭 개선할 수 있다.
본 발명의 다른 일 측면은 금속 산화물 나노입자에 카르복시메틸 덱스트란을 처리하여 카르복시메틸 덱스트란 코팅층을 형성하는 단계(단계 1);
상기 코팅층이 형성된 금속 산화물 나노입자와 아가로스를 포함하는 수상 용액을, 유기상 용액에 첨가하여 에멀젼을 형성시키는 단계(단계 2); 및
아가로스의 젤화를 유도하는 단계(단계3); 를 포함하는 자성 아가로스 비드의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 다른 일 측면에서 제공하는 자성 아가로스 비드의 제조방법을 단계별로 상세히 설명한다.
단계 1: 금속 산화물 나노입자에 카르복시메틸 덱스트란을 처리하여 카르복시메틸 덱스트란 코팅층을 형성하는 단계이다.
이때, 상기 금속 산화물 나노입자는 일 측면에서 Fe2 +, Fe3 + 이온을 1:2 몰(mol) 비율로 함유한 수용액을 질소 분위기에서 암모니아수 또는 수산화나트륨용액과 같은 염기성 물질을 가하여 산화철을 공침시켜 준비할 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 금속 산화물 나노입자는 극미세 초상자성 산화철 나노입자일 수 있으며, 평균 직경은 일 측면에서 5 내지 15 nm 범위일 수 있다. 상기 카르복시메틸 덱스트란은 시판되는 제품을 구매하여 사용할 수도 있고 직접 공지된 방법을 통해 제조하여 사용할 수도 있다. 상기 카르복시메틸 덱스트란의 중량평균 분자량(Mw)은 10,000 내지 15,000 g/mol 범위일 수 있고, 11,000 내지 15,000 g/mol 범위일 수 있고, 12,000 내지 15,000 g/mol 범위일 수 있고, 13,000 내지 15,000 g/mol 범위일 수 있고, 13,500 내지 15,000 g/mol 범위일 수 있고, 10,000 내지 14,000 g/mol 범위일 수 있고, 10,000 내지 13,800 g/mol 범위일 수 있고, 11,500 내지 14,000 g/mol 범위일 수 있고, 13,500 내지 13,800 g/mol 범위일 수 있고, 13,700 g/mol일 수 있다. 금속 산화물 나노입자에 카르복시메틸 덱스트란을 가하여 코팅층을 형성할 때, 금속 산화물 나노입자 100 중량부에 대해 카르복시메틸 덱스트란은 1 내지 4 중량부 범위, 2 내지 4 중량부 범위, 2.5 내지 4 중량부 범위, 1 내지 3 중량부 범위, 1 내지 2.8 중량부 범위, 2 내지 3 중량부 범위, 2.5 내지 2.7 중량부 범위, 2.6 중량부 범위로 가할 수 있다.
상기 금속 산화물 나노입자에 카르복시메틸 덱스트란 코팅층을 형성하는 단계는 금속 산화물 나노입자와 카르복시메틸 덱스트란을 물(탈이온수, 증류수)에 첨가하고, 70℃ 내지 90℃ 온도로 가열한 후, 암모늄 하이드록사이드 용액을 첨가하고 교반하여 코팅층을 형성할 수 있다.
단계 2: 상기 코팅층이 형성된 금속 산화물 나노입자와 아가로스를 포함하는 수상 용액을, 유기상 용액에 첨가하여 에멀젼을 형성시키는 단계이다.
이때, 상기 유기상 용액은 사이클로 헥산, 톨루엔과 같은 유기용매를 사용할 수 있다. 또한, 상기 아가로스는 시판되는 제품을 구매하여 사용할 수도 있고 직접 공지된 방법을 통해 제조하여 사용할 수도 있다. 상기 아가로스의 중량평균 분자량은 100,000 내지 140,000 g/mol 범위일 수 있고, 110,000 내지 140,000 g/mol 범위일 수 있고, 120,000 내지 140,000 g/mol 범위일 수 있고, 100,000 내지 130,000 g/mol 범위일 수 있고, 100,000 내지 120,000 g/mol 범위일 수 있고, 110,000 내지 130,000 g/mol 범위일 수 있고, 115,000 내지 125,000 g/mol 범위일 수 있고, 120,000 g/mol 범위일 수 있다. 상기 에멀젼 형성은 50 내지 90℃에서 수행될 수 있고, 60 내지 90℃에서 수행될 수 있고, 70 내지 90℃에서 수행될 수 있고, 50 내지 80℃에서 수행될 수 있고, 50 내지 70℃에서 수행될 수 있고, 60 내지 80℃에서 수행될 수 있고, 70℃에서 수행될 수 있다.
단계 3: 아가로스의 젤화를 유도하는 단계이다. 상기 아가로스의 젤화는 상기 에멀젼을 형성시킬때의 온도를 냉각시킴으로써 수행될 수 있다.
일 측면에서, 상기 아가로스의 젤화는 15 내지 30℃에서 수행될 수 있고, 17 내지 30℃에서 수행될 수 있고, 19 내지 30℃에서 수행될 수 있고, 20 내지 30℃에서 수행될 수 있고, 15 내지 28℃에서 수행될 수 있고, 15 내지 26℃에서 수행될 수 있고, 15 내지 24℃에서 수행될 수 있고, 15 내지 23℃에서 수행될 수 있고, 17 내지 28℃에서 수행될 수 있고, 19 내지 25℃에서 수행될 수 있고, 20 내지 23℃에서 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 상기 자성 아가로스 비드를 포함하는 바이오 분자 분리용 키트를 제공한다.
이때, 상기 바이오 분자는 단백질, 펩타이드 및 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 생체에서 얻을 수 있는 분자라면 제한 없이 사용할 수 있다.
본 발명의 일 측면에서 제공되는 CMD-IONP 함유 자성 아가로스 비드 (CMD-IONP-MAB)는, 내부의 극미세 초상자성 산화철 나노입자(IONP)가 카르복시메틸 덱스트란으로 코팅되어 친수성이고, 입자 간 반발력이 생성되어 입자 간의 응집이 방지되므로, CMD-IONP가 CMD-IONP-MAB 내부에 균일하게 분포할 수 있어, 상기 CMD-IONP-MAB는 단백질의 분리와 정제 효율이 높은 효과가 있으며, 이는 후술하는 실시예, 실험예에 의해 직접적으로 뒷받침된다.
이하, 본 발명을 후술하는 실시예와 실험예를 통해 상세히 설명한다.
단, 후술하는 실시예와 실험예는 본 발명을 일부 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 카르복시메틸 덱스트란이 코팅된 초상자성 산화철 나노입자를 함유한 자성 아가로스 비드 ( CMD - IONP - MAB ) 제조
극미세 초상자성 산화철 나노입자는 Fe2 +, Fe3 + 이온을 1:2 몰(mol) 비율로 함유한 수용액을 질소 분위기에서 암모니아수 또는 수산화나트륨용액과 같은 염기성 물질을 가하여 산화철을 공침시켜 준비하였다. 이때, 반응 온도는 80℃이었고, 교반 속도는 800 내지 1200 rpm 이었다.
이로써 준비된 극미세 초상자성 산화철 나노입자의 평균직경은 5 내지 15 nm 이었다.
상기 준비한 극미세 초상자성 산화철 나노입자 3.8g과 카르복시메틸 덱스트란(CMD) 0.1g을 탈이온수에 가하고, 강한 교반 하에서 용액을 섭씨 80℃로 가열한다. 가열된 용액에 6 mL의 35%(v/v) 암모늄 하이드록사이드 용액을 시린지 펌프로 10분 동안 가하고, 3시간 동안 교반시킨다. 용액의 온도를 실온(약 20~23℃)까지 냉각시킨 후, 반응 플라스크 바닥에 가라앉은 CMD 코팅층이 형성된 짙은 검은색의 극미세 초상자성 산화철 나노입자를 자석을 이용해 분리하고, 분리된 산화철 입자를 탈이온수로 pH가 중성이 될 때까지 여러 번 수세한다. 수세한 산화철 입자를 동결건조한다. 상기 코팅층이 형성된 극미세 초상자성 산화철 나노입자를 CMD-IONP라 명명한다.
상기 사용한 카르복시메틸 덱스트란(CMD)은 Sigma-Aldrich 사에서 구입한 것이며, 중량 평균 분자량은 13,700 g/mol 이었다. 또한, 상기 형성된 코팅층의 평균 두께는 약 0.5 nm 이었다.
다음으로, CMD-IONP가 내부에 균일하게 함유된 자성 아가로스 비드는 유화액적젤 형성법을 통해 제조하였다.
유화액적젤 형성법은, 수상으로 1.2 g의 아가로스와 0.3 g의 CMD-IONP를 탈이온수에 용해시킨 아가로스 용액을, 유기상으로 사이클로 헥산 또는 톨루엔 유기용매를 사용하였다. 이때, 아가로스는 Sigma-Aldrich 사의 제품을 사용하였고, 중량평균 분자량은 120,000 g/mol 이었다.
유기상의 온도를 70℃로 맞추고 교반하며, 상기 수상을 가하여 에멀전을 형성시킨 후 실온(약 20 내지 23℃)으로 냉각시켜 아가로스를 젤화시켜, CMD-IONP가 내부에 균일하게 함유된 자성 아가로스 비드를 제조했다. 이때, 교반 속도는 800-1200 rpm이었다.
생성된 자성 아가로스 비드(CMD-IONP-MAB) 들은 자석에 의해 분리되었고, 분리된 비드들은 50%(v/v) 에탄올/물로 세정된 후, 20%(v/v) 에탄올/물에 분산되었고, 사용 전까지 4℃에서 보관되었다.
상기 과정을 통해,
본 발명의 일 측면에서 제공하는, 카르복시메틸 덱스트란이 코팅된 초상자성 산화철 나노입자를 함유한 자성 아가로스 비드를 제조하였으며, 이를 CMD-IONP-MAB라 명명한다.
< 비교예 1> 코팅층이 없는 초상자성 산화철 나노입자( IONP ) 제조
극미세 초상자성 산화철 나노입자는 Fe2 +, Fe3 + 이온을 1:2 몰 비율로 함유한 수용액을 질소 분위기에서 암모니아수 또는 수산화나트륨용액과 같은 염기성 물질을 가하여 산화철을 공침시켜 준비하였다. 이때, 반응 온도는 80℃이었고, 교반 속도는 800 내지 1200 rpm 이었다.
즉, 실시예 1에서 극미세 초상자성 산화철 나노입자를 준비하는 과정을 동일하게 수행하여 IONP를 제조하였다.
< 비교예 2> 코팅층이 없는 초상자성 산화철 나노입자를 함유한 자성 아가로스 비드 ( IONP - MAB ) 제조
실시예 1에서 카르복시메틸 덱스트란(CMD) 코팅층을 형성하는 단계만 수행하지 않고, 나머지 단계를 동일하게 수행하여 IONP-MAB를 제조하였다.
< 실험예 1> CMD - IONP의 입도 분석
상기 실시예 1의 중간 과정에서 제조한 CMD-IONP 들을 탈이온수에 현탁시킨 액 1mL을 일회용 큐벳에 가하고, 직경 크기 분석기 (Zetasizer Nano ZS, Malvern instruments Ltd., Worcestershire, UK)를 이용하여 25℃에서 입자들의 크기와 크기 분포를 측정하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1은 카르복시메틸 덱스트란으로 코팅된 산화철 나노입자 (CMD-IONP)의 입도 분포를 나타내는 도면이다.
도 1에 나타난 바와 같이,
상기 실시예 1의 중간 과정에서 제조한 CMD-IONP는 약 30 내지 200 nm의 직경 범위를 갖는 구형의 회합체로 존재하는 것으로 나타났다.
< 실험예 2> CMD - IONP의 XRD 분석
상기 실시예 1의 중간 과정에서 제조한 CMD-IONP를 진공 하에 건조시킨 후, 한국화학연구원 (이하, KRICT)의 Cu Kα 방사선(radiation)을 사용하는 X-선 파우더 회절측정기 (D8 ADVANCE, Bruker AXS GmbH, Kalsruhe, Germany)를 이용하여 X-선 회절 패턴을 분석하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2는 CMD-IONP의 X-선 회절 패턴을 나타내는 도면이다.
도 2에 나타난 바와 같이,
상기 실시예 1의 중간 과정에서 제조한 CMD-IONP가 나타내는 피크들은, Fe3O4 결정이 갖는 피크 값과 일치하므로, 이로부터 CMD 코팅이 극미세 초상자성 산화철 나노입자의 경정성에 영향을 주지 않음을 알 수 있다.
< 실험예 3> CMD - IONP의 TEM 분석
상기 실시예 1의 중간 과정에서 제조한 CMD-IONP를 탈이온수에 현탁시키고, 이 액의 액적을 탄소 코팅된 구리 그리드에 가하고 실온에서 건조한 후, KRICT의 전계 방사형 (Field-Emission) TEM (FE-TEM) (FEI TALOS F200X, FEI Company, Hillsboro, OR, USA)을 이용하여 가속전압 200kV에서 CMD-IONP를 일반 분해능 및 고 분해능 조건으로 관찰하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3은 고해상도 투과전자현미경으로 관찰된 CMD-IONP의 이미지를 나타내는 도면이다.
도 3에 나타난 바와 같이,
CMD-IONP 단일 입자의 크기는 5 내지 15 nm이고, CMD-IONP 회합체의 크기는 30 nm이다. CMD-IONP 회합체는 구형의 CMD-IONP가 회합된 형태이다. CMD-IONP의 고해상도 투과전자현미경 이미지로부터 Fe3O4의 잘 발달된 결정 격자 패턴이 확인된다.
< 실험예 4> CMD - IONP - MAB의 광학 현미경 관찰
상기 실시예 1에서 제조한 CMD-IONP-MAB를 광학 현미경 (Leica DMI3000 B, Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)를 이용하여 관찰하였다. 그 결과를 도 4와 하기 표 1에 나타내었다.
도 4는 광학 현미경 관찰된 CMD-IONP 함유 자성 아가로스 비드 (CMD-IONP-MAB) 이미지를 나타내는 도면이며, 축척 막대는 50 마이크로미터이다. 하기 표 1에서 단위는 마이크로미터이다.
시료 비드 수 비드 직경 분포 평균
직경		 표준
편차		 최대값 최소값
CMD-IONP-MAB 80개 20-50 28개 70.3 38.5 201.2 20.7
50-100 37개
100-200 14개
200초과 1개
도 4에 나타난 바와 같이,
CMD-IONP-MAB 내부에 CMD-IONP가 매우 균일하게 분포되어 있다.
< 실험예 5> CMD - IONP - MAB의 안정성 시험
상기 실시예 1에서 제조한 CMD-IONP-MAB 3g이 담긴 바이알에, 1 mL의 0.1 M 초산완충액(acetate buffer, pH 4.5)를 가한 후, 진탕배양기(shaking incubator) 를 이용하여 바이알을 25℃에서 100 rpm으로 진탕(shaking) 하면서, 시간 경과에 따라 상등액을 취하였다. 취한 상등액에는 CMD-IONP-MAB가 존재한다. 채취한 시료에 함유된 Fe 이온의 함량을 철 분석 키트(iron assay kit) (C) (BioVision Inc., Milpitas, CA, USA)를 이용하여 분석하였다. Fe 이온의 측정 및 분석은 다음과 같은 과정에 의해 실시되었다. 각 시료 50 μL를 96-웰 플레이트의 각 웰에 가하고, 시료가 가해진 웰에, 키트 내 구비되어 있던 분석완충액(assay buffer) 50 μL와 Fe 환원(reducer) 용액 5 μL을 차례로 가한 후, 실온에서 30분간 인큐베이션(incubation) 하였다. 키트 내 구비되어 있던 100 μL의 Fe 프로브(probe) 용액를 각 웰에 가하고 실온에서 60분간 빛을 차단하고 인큐베이션(incubation) 하였다. 그 후, 마이크로플레이트 리더(microplate reader) (Hidex sense 425-301, Hidex Oy. Turku, Finland) 를 이용하여 593 nm 파장에서 시료의 흡광도를 측정하고 미리 작성한 검량선을 이용하여 Fe 이온의 함량을 산출하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5는 산성 용액 (pH 4.5)에서 시간 경과에 따른 CMD-IONP-MAB 내 Fe3O4 NP의 함량을 나타내는 도면이다.
도 5에 나타난 바와 같이,
CMD-IONP-MAB 내부에 Fe3O4 NP가 진탕 과정에서 유출되지 않고, CMD-IONP-MAB 내부에 안정하게 존재함을 알 수 있다.
이로부터, 카르복시메틸 덱스트란(CMD)이 시험 용액에서 Fe3O4의 유출의 문제를 일으키지 않음이 뒷받침된다.
< 실험예 6> IONP의 입도 분석
비교예 1에서 제조한 코팅층이 없는 초상자성 산화철 나노입자(IONP)를 대상으로, 상기 실험예 1과 동일한 과정을 수행하여 입도를 분석하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6은 산화철 나노입자 (IONP)의 입도 분포를 나타내는 도면이다.
< 실험예 7> IONP의 XRD 분석
비교예 1에서 제조한 코팅층이 없는 초상자성 산화철 나노입자(IONP)를 대상으로, 상기 실험예 2와 동일한 과정을 수행하여 XRD 분석을 실시하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7은 IONP의 X-선 회절 패턴을 나타내는 도면이다.
< 실험예 8> IONP의 TEM 분석
비교예 1에서 제조한 코팅층이 없는 초상자성 산화철 나노입자(IONP)를 대상으로, 상기 실험예 3과 동일한 과정을 수행하여 TEM 분석을 실시하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8은 투과전자현미경으로 관찰된 IONP의 이미지를 나타내는 도면이다.
< 실험예 9> IONP - MAB의 광학 현미경 관찰
비교예 2에서 제조한 코팅층이 없는 초상자성 산화철 나노입자를 함유한 자성 아가로스 비드(IONP-MAB)를 대상으로, 상기 실험예 4와 동일한 과정을 수행하여 광학 현미경 관찰을 실시하였다. 그 결과를 도 9와 하기 표 2에 나타내었다.
도 9는 광학 현미경 관찰된 IONP 함유 자성 아가로스 비드 (IONP-MAB)의 이미지를 나타내는 도면이며, 축척 막대는 50 마이크로미터이다. 하기 표 2의 단위는 마이크로미터이다.
시료 비드 수 비드 직경 분포 평균
직경		 표준
편차		 최대값 최소값
IONP-MAB 64개 20-50 4개 108.4 52.2 265.3 27.7
50-100 32개
100-200 24개
200초과 4개
도 9에 나타난 바와 같이,
IONP-MAB 내부에 IONP가 서로 응집되어 불균일하게 분포되어 있다.
< 실험예 10> IONP - MAB의 안정성 시험
비교예 2에서 제조한 코팅층이 없는 초상자성 산화철 나노입자를 함유한 자성 아가로스 비드(IONP-MAB)를 대상으로, 상기 실험예 5와 동일한 과정을 수행하여 안정성을 평가하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10은 산성 용액 (pH 4.5)에서 시간 경과에 따른 IONP-MAB 내 Fe3O4 NP의 함량을 나타내는 도면이다.
이상, 본 발명을 바람직한 실시예, 실험예를 통해 상세히 설명하였으나, 본 발명의 범위는 특정 실시예에 한정되는 것은 아니며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 해석되어야 할 것이다. 또한, 이 기술분야에서 통상의 지식을 습득한 자라면, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않으면서도 많은 수정과 변형이 가능함을 이해하여야 할 것이다.

Claims (12)

  1. 카르복시메틸 덱스트란(carboxymethyl dextran) 코팅층이 표면에 형성된 금속 산화물 나노입자를 포함하는 자성 아가로스 비드이며,
    상기 카르복시메틸 덱스트란 코팅층의 평균 두께는 0.1 내지 1.0 nm이고,
    상기 카르복시메틸 덱스트란 코팅층이 표면에 형성된 금속 산화물 나노입자는, 20 내지 210 nm의 평균 직경을 갖는 회합체 형태로 아가로스 비드 내부에 균일하게 분포되는 것을 특징으로 하는 자성 아가로스 비드.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 금속 산화물 나노입자는 초상자성(superparamagnetic) 산화철 나노입자인 것을 특징으로 하는 자성 아가로스 비드.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 아가로스 비드의 평균 직경은 20 내지 210 ㎛인 것을 특징으로 하는 자성 아가로스 비드.
  7. 금속 산화물 나노입자에 카르복시메틸 덱스트란을 처리하여 카르복시메틸 덱스트란 코팅층을 형성하는 단계;
    상기 코팅층이 형성된 금속 산화물 나노입자와 아가로스를 포함하는 수상 용액을, 유기상 용액에 첨가하여 에멀젼을 형성시키는 단계; 및
    아가로스의 젤화를 유도하는 단계; 를 포함하는 제1항의 자성 아가로스 비드의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 카르복시메틸 덱스트란의 중량평균 분자량은 10,000 내지 15,000 g/mol인 것을 특징으로 하는 자성 아가로스 비드의 제조방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 아가로스의 중량평균 분자량은 100,000 내지 140,000 g/mol인 것을 특징으로 하는 자성 아가로스 비드의 제조방법.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 에멀젼 형성은 50 내지 90℃에서 이루어지고,
    상기 아가로스의 젤화는 15 내지 30℃에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 자성 아가로스 비드의 제조방법.
  11. 제1항의 자성 아가로스 비드를 포함하는 바이오 분자 분리용 키트.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 바이오 분자는 단백질, 펩타이드 및 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 바이오 분자 분리용 키트.
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