KR102182656B1 - Magnetic agarose beads containing carboxymethyl dextran-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles and the preparation method thereof - Google Patents
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Abstract
카르복시메틸 덱스트란이 코팅된 초상자성 산화철 나노입자를 함유한 자성 아가로스 비드와 그 제조방법에 관한 것으로,
본 발명의 일 측면에서 제공되는 CMD-IONP 함유 자성 아가로스 비드 (CMD-IONP-MAB)는, 내부의 극미세 초상자성 산화철 나노입자(IONP)가 카르복시메틸 덱스트란으로 코팅되어 친수성이고, 입자 간 반발력이 생성되어 입자 간의 응집이 방지되므로, CMD-IONP가 CMD-IONP-MAB 내부에 균일하게 분포할 수 있어, 상기 CMD-IONP-MAB는 단백질의 분리와 정제 효율이 높은 효과가 있다.It relates to a magnetic agarose bead containing superparamagnetic iron oxide nanoparticles coated with carboxymethyl dextran and a method of manufacturing the same,
CMD-IONP-containing magnetic agarose beads (CMD-IONP-MAB) provided in one aspect of the present invention is hydrophilic because the inner ultrafine superparamagnetic iron oxide nanoparticles (IONP) are coated with carboxymethyl dextran, Since the repulsive force is generated to prevent aggregation between particles, CMD-IONP can be evenly distributed inside CMD-IONP-MAB, so that the CMD-IONP-MAB has a high efficiency of protein separation and purification.
Description
카르복시메틸 덱스트란이 코팅된 초상자성 산화철 나노입자를 함유한 자성 아가로스 비드와 그 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a magnetic agarose bead containing superparamagnetic iron oxide nanoparticles coated with carboxymethyl dextran and a method of manufacturing the same.
단백질, 펩타이드, 핵산 등과 같은 바이오 분자의 분리와 정제에는 원심분리, 흡착 크로마토그래피, 침강법 등의 방법이 이용되고 있다. 자성 입자를 이용한 바이오 분자의 분리와 정제의 장점은 다른 방법에 비해 분리와 정제에 소요되는 시간이 짧고 분리 효율이 높다는 점이 있다. 자성 입자는 주로 금속이 이용되는데, Fe3O4, NiO, Co3O4 등과 같은 금속 산화물이나 FeCo, FePt, CoNi 등과 같은 합금이 이용된다.Methods such as centrifugation, adsorption chromatography, and sedimentation are used to separate and purify biomolecules such as proteins, peptides, and nucleic acids. The advantage of separating and purifying biomolecules using magnetic particles is that the time required for separating and purifying is shorter and higher separation efficiency than other methods. The magnetic particles are mainly metal, and metal oxides such as Fe 3 O 4 , NiO, Co 3 O 4 , or alloys such as FeCo, FePt, and CoNi are used.
자성 입자는 강자성(ferromagnetic) 또는 상자성(paramagnetic)의 특성을 나타내는데 단백질, 펩타이드, 핵산 등의 분리와 정제는 주로 상자성 입자들이 이용되며, 상자성 입자는 입경의 크기에 따라 극미세 초상자성 입자, 초상자성 입자 그리고 상자성 입자로 구분된다. 그 직경은 극미세 초상자성 입자가 50 nm 이하, 초상자성 입자가 70 내지 150 nm, 그리고 상자성 입자가 1000nm 이상이다.Magnetic particles exhibit ferromagnetic or paramagnetic properties. Paramagnetic particles are mainly used to separate and purify proteins, peptides, and nucleic acids, and paramagnetic particles are ultra-fine superparamagnetic particles and superparamagnetic particles depending on the size of the particle size. It is divided into particles and paramagnetic particles. Its diameter is 50 nm or less for ultrafine superparamagnetic particles, 70 to 150 nm for superparamagnetic particles, and 1000 nm or more for paramagnetic particles.
금속 산화물 자성입자는 열분해법, 전기화학법, 초음파합성법, 공침법 등의 방법으로 제조될 수 있다. 이중 공침법은 다른 제조방법에 비해 낮은 비용, 높은 수율 그리고 위험한 용매와 고온이 불필요하다는 장점을 갖는다.The metal oxide magnetic particles may be prepared by a method such as a pyrolysis method, an electrochemical method, an ultrasonic synthesis method, and a coprecipitation method. The double coprecipitation method has advantages of low cost, high yield, and no need for dangerous solvents and high temperatures compared to other manufacturing methods.
자성 입자의 분산력을 향상시키기 위해서는 자성 입자를 도핑(doping) 하는 것이 필요한데, 구연산(citric acid), 올레산(oleic acid) 와 같은 저분자 물질 또는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 폴리(비닐 알코올)과 같은 합성 고분자나 다당류(polysaccharides)와 같은 천연 고분자 물질이 도핑에 이용된다. In order to improve the dispersibility of magnetic particles, it is necessary to doping the magnetic particles.Low molecular weight materials such as citric acid and oleic acid, or synthesis such as polyethylene glycol and poly(vinyl alcohol) Natural polymer substances such as polymers and polysaccharides are used for doping.
한편, 아가로스(agarose)는 아가로스 분자가 갖는 다공성에 의해 분리능이 우수하기 때문에 비드로 제조되어 흡착 크로마토그래피에 이용되어왔다. 또한, 아가로스는 낮은 독성, 우수한 생체적합성, 친수성, 생분해성과 같은 특성을 지니고 있을뿐만 아니라, 풍부한 하이드록시기를 가지고 있어 다양한 작용기로의 개질이 가능하다. On the other hand, agarose has excellent resolution due to the porosity of agarose molecules, so it has been prepared as beads and used in adsorption chromatography. In addition, agarose not only has characteristics such as low toxicity, excellent biocompatibility, hydrophilicity, and biodegradability, but also has abundant hydroxy groups, so that it can be modified with various functional groups.
이에, 자성 입자를 아가로스 비드 내부에 함유시킨 자성 아가로스 비드는, 아가로스 비드가 가지고 있는 낮은 독성, 우수한 생체적합성 등의 장점과, 자성 입자가 가지고 있는 높은 분리 효율과 분리의 편의성 등의 장점을 동시에 나타낼 수 있다.Accordingly, magnetic agarose beads containing magnetic particles inside the agarose beads have advantages such as low toxicity and excellent biocompatibility of the agarose beads, as well as the high separation efficiency and convenience of separation that magnetic particles have. Can be expressed simultaneously.
상자성 산화철 나노입자를 아가로스의 유화 젤 형성을 통해 아가로스 비드의 내부에 함유시킨 자성 아가로스 비드는, 도핑하지 않은 산화철 나노입자를 이용하는 경우, 산화철 나노입자가 입자의 내부에 불균일하게 응집된 형태로 존재한다. 비드 내에서 자성 나노입자의 응집이 최소화되고 입자가 균일하게 분포된 자성 아가로스 비드를 제조하려면, 비드 내에서 자성 나노입자가 입자 자체의 자성에 의해 응집되려는 경향을 최소화시켜야 한다.Magnetic agarose beads containing paramagnetic iron oxide nanoparticles inside the agarose beads through the formation of an emulsified gel of agarose are in the form of unevenly agglomerated iron oxide nanoparticles inside the particles when undoped iron oxide nanoparticles are used. Exists as In order to minimize agglomeration of magnetic nanoparticles in the bead and to prepare magnetic agarose beads in which particles are uniformly distributed, the tendency of magnetic nanoparticles to be agglomerated by the magnetism of the particles itself must be minimized.
상자성 나노입자가 아가로스 비드의 중심부 또는 비드 내부의 어느 한 부위에 응집된 형태로 존재하는 아가로스 비드를 이용하여 표적 단백질을 분리하는 경우, 표적 단백질이 흡착된 비드는 영구 자석에 의한 견인이 균일하지 않고, 단백질이 흡착된 비드의 손실이 발생한다. 따라서 단백질이 흡착된 비드의 손실을 최소화하기 위해서 외부에서 필요 이상의 자력을 가해야만 하거나 단백질의 수득률을 높이기 위해 비드 내에 자성 입자를 과량으로 함유시켜야 한다.When the target protein is separated using an agarose bead in which the paramagnetic nanoparticles are aggregated in the center of the agarose bead or at any one part inside the bead, the bead with the target protein adsorbed is uniformly traction by a permanent magnet. Without doing so, loss of the beads on which the protein is adsorbed occurs. Therefore, in order to minimize the loss of the beads to which the protein is adsorbed, magnetic force more than necessary must be applied from the outside, or magnetic particles must be contained in an excessive amount in the beads to increase the yield of the protein.
일반적으로, 자성입자의 응집을 억제하는 방법은 친수성 저분자 또는 고분자 형태의 물질 그리고 양친매성 물질을 자성입자의 표면에 코팅하는 것이지만, 단백질의 분리를 위해서는 상자성 자성입자의 표면 처리에 이용되는 물질이 표적 단백질의 특성을 변화시키지 않도록 높은 생체적합성을 가져야 하고, 자성 입자에 충분한 수분산성과 이온 반발력을 부여할 수 있어야 한다. In general, the method of inhibiting the aggregation of magnetic particles is to coat a hydrophilic low-molecular or high-molecular type material and an amphiphilic material on the surface of the magnetic particles, but for the separation of proteins, the material used for surface treatment of the paramagnetic magnetic particles is the target. It must have high biocompatibility so as not to change the properties of the protein, and must be able to impart sufficient water dispersibility and ionic repulsion to magnetic particles.
특허문헌 1(US 7,897,257 B2)은 상자성 산화철 입자의 표면을 소수성 모노머를 중합하여 표면 처리하고 이어서 친수성 물질로 친수화 처리한 후 에멀전 합성법으로 아가로스 비드의 중심부에 수 개의 상자성 산화철 입자들이 존재하도록 하는 자성 아가로스 비드 제조법을 개시하고 있다.Patent Document 1 (US 7,897,257 B2) describes the surface treatment of paramagnetic iron oxide particles by polymerizing a hydrophobic monomer, followed by hydrophilic treatment with a hydrophilic material, and an emulsion synthesis method in which several paramagnetic iron oxide particles exist in the center of the agarose beads. A method for producing magnetic agarose beads is disclosed.
하지만, 상기 제조법은 제조 공정이 매우 복잡할 뿐만 아니라, 설사 중심부에만 구형의 산화철 입자가 존재하는 경우라고 할지라도, 최종 제조된 아가로스 비드가 영구 자석에 의해 견인되지 않았고, 특허의 재현성이 확보되지 않는 문제가 있다.However, the manufacturing method is not only very complicated in the manufacturing process, and even if spherical iron oxide particles exist only in the center, the final manufactured agarose beads were not pulled by a permanent magnet, and the reproducibility of the patent was not secured. There is no problem.
본 발명의 일 측면에서의 목적은 바이오 분자 분리용으로 사용할 때, 바이오 분자를 흡착한 후 영구 자석으로 견인시, 견인이 용이하고 비드 자체의 손상이 적어 바이오 분자 분리효율을 대폭 개선할 수 있는 자성 아가로스 비드를 제공하는 것이다.In one aspect of the present invention, when used for separating biomolecules, when pulling with a permanent magnet after adsorbing biomolecules, magnetic properties that can easily traction and reduce damage to the bead itself can significantly improve biomolecule separation efficiency. It is to provide agarose beads.
본 발명의 다른 일 측면에서의 목적은 상기 자성 아가로스 비드의 제조방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method of manufacturing the magnetic agarose beads.
본 발명의 또 다른 일 측면에서의 목적은 상기 자성 아가로스 비드를 포함하는 바이오 분자 분리용 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a kit for separating a biomolecule comprising the magnetic agarose beads.
상기 목적을 달성하기 위하여,To achieve the above object,
본 발명의 일 측면은 카르복시메틸 덱스트란(carboxymethyl dextran) 코팅층이 표면에 형성된 금속 산화물 나노입자를 포함하는 자성 아가로스 비드를 제공한다.One aspect of the present invention provides a magnetic agarose bead including metal oxide nanoparticles having a carboxymethyl dextran coating layer formed on the surface thereof.
본 발명의 다른 일 측면은 금속 산화물 나노입자에 카르복시메틸 덱스트란을 처리하여 카르복시메틸 덱스트란 코팅층을 형성하는 단계;Another aspect of the present invention is a step of forming a carboxymethyl dextran coating layer by treating the metal oxide nanoparticles with carboxymethyl dextran;
상기 코팅층이 형성된 금속 산화물 나노입자와 아가로스를 포함하는 수상 용액을, 유기상 용액에 첨가하여 에멀젼을 형성시키는 단계; 및Forming an emulsion by adding an aqueous phase solution containing the metal oxide nanoparticles and agarose on which the coating layer is formed to an organic phase solution; And
아가로스의 젤화를 유도하는 단계; 를 포함하는 자성 아가로스 비드의 제조방법을 제공한다.Inducing gelation of agarose; It provides a method of manufacturing a magnetic agarose beads comprising a.
본 발명의 또 다른 일 측면은 상기 자성 아가로스 비드를 포함하는 바이오 분자 분리용 키트를 제공한다.Another aspect of the present invention provides a kit for separating a biomolecule comprising the magnetic agarose beads.
본 발명의 일 측면에서 제공되는 CMD-IONP 함유 자성 아가로스 비드 (CMD-IONP-MAB)는, 내부의 극미세 초상자성 산화철 나노입자(IONP)가 카르복시메틸 덱스트란으로 코팅되어 친수성이고, 입자 간 반발력이 생성되어 입자 간의 응집이 방지되므로, CMD-IONP가 CMD-IONP-MAB 내부에 균일하게 분포할 수 있어, 상기 CMD-IONP-MAB는 단백질의 분리와 정제 효율이 높은 효과가 있다. 또한, 아가로스 고유의 작용기인 하이드록시기 이외에도 표면의 카르복시기가 존재할 수 있으므로 표면 개질에 유리하다.CMD-IONP-containing magnetic agarose beads (CMD-IONP-MAB) provided in one aspect of the present invention is hydrophilic because the inner ultrafine superparamagnetic iron oxide nanoparticles (IONP) are coated with carboxymethyl dextran, Since the repulsive force is generated to prevent aggregation between particles, CMD-IONP can be evenly distributed inside CMD-IONP-MAB, so that the CMD-IONP-MAB has a high efficiency of protein separation and purification. In addition, since a carboxyl group on the surface may exist in addition to the hydroxyl group, which is a unique functional group of agarose, it is advantageous for surface modification.
도 1은 카르복시메틸 덱스트란으로 코팅된 산화철 나노입자 (CMD-IONP) 회합체의 입도 분포를 나타내는 도면이다.
도 2는 CMD-IONP의 X-선 회절 패턴을 나타내는 도면이다.
도 3은 고해상도 투과전자현미경으로 관찰된 CMD-IONP의 이미지를 나타내는 도면이다.
도 4는 광학 현미경 관찰된 CMD-IONP 함유 자성 아가로스 비드 (CMD-IONP-MAB) 이미지를 나타내는 도면이며, 축척 막대는 50 마이크로미터이다.
도 5는 산성 용액 (pH 4.5)에서 시간 경과에 따른 CMD-IONP-MAB 내 Fe3O4 NP의 함량을 나타내는 도면이다.
도 6은 산화철 나노입자 (IONP) 회합체의 입도 분포를 나타내는 도면이다.
도 7은 IONP의 X-선 회절 패턴을 나타내는 도면이다.
도 8은 투과전자현미경으로 관찰된 IONP의 이미지를 나타내는 도면이다.
도 9는 광학 현미경 관찰된 IONP 함유 자성 아가로스 비드 (IONP-MAB)의 이미지를 나타내는 도면이며, 축척 막대는 50 마이크로미터이다.
도 10은 산성 용액 (pH 4.5)에서 시간 경과에 따른 IONP-MAB 내 Fe3O4 NP의 함량을 나타내는 도면이다.1 is a view showing the particle size distribution of an iron oxide nanoparticle (CMD-IONP) aggregate coated with carboxymethyl dextran.
2 is a diagram showing an X-ray diffraction pattern of CMD-IONP.
3 is a diagram showing an image of CMD-IONP observed with a high-resolution transmission electron microscope.
4 is a diagram showing an image of CMD-IONP-containing magnetic agarose beads (CMD-IONP-MAB) observed under an optical microscope, and a scale bar is 50 micrometers.
5 is a diagram showing the content of Fe 3 O 4 NP in CMD-IONP-MAB over time in an acidic solution (pH 4.5).
6 is a diagram showing a particle size distribution of an iron oxide nanoparticle (IONP) aggregate.
7 is a diagram showing an X-ray diffraction pattern of IONP.
8 is a diagram showing an image of IONP observed with a transmission electron microscope.
9 is a diagram showing an image of IONP-containing magnetic agarose beads (IONP-MAB) observed with an optical microscope, and a scale bar is 50 micrometers.
10 is a diagram showing the content of Fe 3 O 4 NP in IONP-MAB over time in an acidic solution (pH 4.5).
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
한편, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 실시 형태는 당해 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다. 나아가, 명세서 전체에서 어떤 구성요소를 "포함"한다는 것은 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.Meanwhile, the embodiments of the present invention may be modified into various other forms, and the scope of the present invention is not limited to the embodiments described below. In addition, embodiments of the present invention are provided in order to more completely explain the present invention to those having average knowledge in the art. Furthermore, "including" certain elements throughout the specification means that other elements may be further included rather than excluding other elements unless specifically stated to the contrary.
본 발명의 일 측면은 카르복시메틸 덱스트란(carboxymethyl dextran) 코팅층이 표면에 형성된 금속 산화물 나노입자를 포함하는 자성 아가로스 비드를 제공한다. 이때, 상기 금속 산화물 나노입자는 초상자성(superparamagnetic) 산화철 나노입자인 것이 바람직하다.One aspect of the present invention provides a magnetic agarose bead including metal oxide nanoparticles having a carboxymethyl dextran coating layer formed on the surface thereof. In this case, the metal oxide nanoparticles are preferably superparamagnetic iron oxide nanoparticles.
상기 금속 산화물 나노입자의 평균 직경은 1 내지 20 nm 범위일 수 있고, 2 내지 20 nm 범위일 수 있고, 3 내지 20 nm 범위일 수 있고, 4 내지 20 nm 범위일 수 있고, 5 내지 20 nm 범위일 수 있고, 1 내지 19 nm 범위일 수 있고, 1 내지 18 nm 범위일 수 있고, 1 내지 17 nm 범위일 수 있고, 1 내지 16 nm 범위일 수 있고, 1 내지 15 nm 범위일 수 있고, 2 내지 19 nm 범위일 수 있고, 3 내지 18 nm 범위일 수 있고, 4 내지 17 nm 범위일 수 있고, 4.5 내지 16 nm 범위일 수 있고, 5 내지 15 nm 범위일 수 있다.The average diameter of the metal oxide nanoparticles may range from 1 to 20 nm, may range from 2 to 20 nm, may range from 3 to 20 nm, may range from 4 to 20 nm, and range from 5 to 20 nm May be, may range from 1 to 19 nm, may range from 1 to 18 nm, may range from 1 to 17 nm, may range from 1 to 16 nm, may range from 1 to 15 nm, and 2 It may range from to 19 nm, may range from 3 to 18 nm, may range from 4 to 17 nm, may range from 4.5 to 16 nm, and may range from 5 to 15 nm.
또한, 상기 카르복시메틸 덱스트란 코팅층의 평균 두께는 0.1 내지 1.0 nm 범위일 수 있고, 0.2 내지 1.0 nm 범위일 수 있고, 0.3 내지 1.0 nm 범위일 수 있고, 0.4 내지 1.0 nm 범위일 수 있고, 0.5 내지 1.0 nm 범위일 수 있고, 0.1 내지 0.9 nm 범위일 수 있고, 0.1 내지 0.8 nm 범위일 수 있고, 0.1 내지 0.7 nm 범위일 수 있고, 0.1 내지 0.6 nm 범위일 수 있고, 0.1 내지 0.5 nm 범위일 수 있고, 0.2 내지 0.8 nm 범위일 수 있고, 0.3 내지 0.7 nm 범위일 수 있고, 0.4 내지 0.6 nm 범위일 수 있고, 0.5 nm 일 수 있다.In addition, the average thickness of the carboxymethyl dextran coating layer may be in the range of 0.1 to 1.0 nm, may be in the range of 0.2 to 1.0 nm, may be in the range of 0.3 to 1.0 nm, may be in the range of 0.4 to 1.0 nm, and may be in the range of 0.5 to May be in the range of 1.0 nm, may be in the range of 0.1 to 0.9 nm, may be in the range of 0.1 to 0.8 nm, may be in the range of 0.1 to 0.7 nm, may be in the range of 0.1 to 0.6 nm, and may be in the range of 0.1 to 0.5 nm And, it may be in the range of 0.2 to 0.8 nm, may be in the range of 0.3 to 0.7 nm, may be in the range of 0.4 to 0.6 nm, and may be 0.5 nm.
나아가, 상기 카르복시메틸 덱스트란 코팅층이 표면에 형성된 금속 산화물 나노입자는, 20 내지 210 nm의 평균 직경을 갖는 회합체 형태로 아가로스 비드 내부에 균일하게 분포된다. 상기 회합체의 평균 직경은 다른 측면에서 22 내지 210 nm 범위일 수 있고, 24 내지 210 nm 범위일 수 있고, 26 내지 210 nm 범위일 수 있고, 28 내지 210 nm 범위일 수 있고, 30 내지 210 nm 범위일 수 있고, 20 내지 208 nm 범위일 수 있고, 20 내지 206 nm 범위일 수 있고, 20 내지 204 nm 범위일 수 있고, 20 내지 202 nm 범위일 수 있고, 20 내지 200 nm 범위일 수 있고, 22 내지 208 nm 범위일 수 있고, 24 내지 206 nm 범위일 수 있고, 26 내지 204 nm 범위일 수 있고, 28 내지 202 nm 범위일 수 있고, 30 내지 200 nm 범위일 수 있다.Further, the metal oxide nanoparticles having the carboxymethyl dextran coating layer formed on the surface thereof are uniformly distributed inside the agarose beads in the form of an aggregate having an average diameter of 20 to 210 nm. The average diameter of the aggregate may range from 22 to 210 nm, may range from 24 to 210 nm, may range from 26 to 210 nm, may range from 28 to 210 nm, and may range from 30 to 210 nm. May range, may range from 20 to 208 nm, may range from 20 to 206 nm, may range from 20 to 204 nm, may range from 20 to 202 nm, may range from 20 to 200 nm, It may range from 22 to 208 nm, may range from 24 to 206 nm, may range from 26 to 204 nm, may range from 28 to 202 nm, and may range from 30 to 200 nm.
또한, 상기 아가로스 비드의 평균 직경은 20 내지 210 ㎛(마이크로미터) 범위일 수 있고, 20 내지 208 ㎛ 범위일 수 있고, 20 내지 206 ㎛ 범위일 수 있고, 20 내지 204 ㎛ 범위일 수 있고, 20 내지 202 ㎛ 범위일 수 있고, 20 내지 200 ㎛ 범위일 수 있다.In addition, the average diameter of the agarose beads may be in the range of 20 to 210 μm (micrometer), may be in the range of 20 to 208 μm, may be in the range of 20 to 206 μm, and may be in the range of 20 to 204 μm, It may be in the range of 20 to 202 μm, and may be in the range of 20 to 200 μm.
본 발명의 일 측면에서 제공되는 CMD-IONP 함유 자성 아가로스 비드 (CMD-IONP-MAB)는, 내부의 극미세 초상자성 산화철 나노입자(IONP)가 카르복시메틸 덱스트란으로 코팅되어 친수성이고, 입자 간 반발력이 생성되어 입자 간의 응집이 방지되므로, CMD-IONP가 CMD-IONP-MAB 내부에 균일하게 분포할 수 있어, 상기 CMD-IONP-MAB는 단백질의 분리와 정제 효율이 높은 효과가 있다. 또한, 아가로스 고유의 작용기인 하이드록시기 이외에도 표면의 카르복시기가 존재할 수 있으므로 표면 개질에 유리하다.CMD-IONP-containing magnetic agarose beads (CMD-IONP-MAB) provided in one aspect of the present invention is hydrophilic because the inner ultrafine superparamagnetic iron oxide nanoparticles (IONP) are coated with carboxymethyl dextran, Since the repulsive force is generated to prevent aggregation between particles, CMD-IONP can be evenly distributed inside CMD-IONP-MAB, so that the CMD-IONP-MAB has a high efficiency of protein separation and purification. In addition, since a carboxyl group on the surface may exist in addition to the hydroxyl group, which is a unique functional group of agarose, it is advantageous for surface modification.
특히, 상기 자성 아가로스 비드 (CMD-IONP-MAB)를 바이오 분자 분리용으로 사용할 때, 바이오 분자를 흡착한 후 영구 자석으로 견인시, 비드 자체의 견인이 용이하고, 견인시 비드 자체의 손상이 적어 바이오 분자 분리효율을 대폭 개선할 수 있다.In particular, when the magnetic agarose beads (CMD-IONP-MAB) are used for biomolecule separation, the bead itself is easily traction when pulled with a permanent magnet after adsorbing the biomolecules, and the bead itself is damaged during traction. As it is small, the separation efficiency of biomolecules can be significantly improved.
본 발명의 다른 일 측면은 금속 산화물 나노입자에 카르복시메틸 덱스트란을 처리하여 카르복시메틸 덱스트란 코팅층을 형성하는 단계(단계 1);Another aspect of the present invention is a step of forming a carboxymethyl dextran coating layer by treating a metal oxide nanoparticle with carboxymethyl dextran (step 1);
상기 코팅층이 형성된 금속 산화물 나노입자와 아가로스를 포함하는 수상 용액을, 유기상 용액에 첨가하여 에멀젼을 형성시키는 단계(단계 2); 및Forming an emulsion by adding an aqueous phase solution containing the metal oxide nanoparticles and agarose on which the coating layer is formed to the organic phase solution (step 2); And
아가로스의 젤화를 유도하는 단계(단계3); 를 포함하는 자성 아가로스 비드의 제조방법을 제공한다.Inducing gelation of agarose (step 3); It provides a method of manufacturing a magnetic agarose beads comprising a.
이하, 본 발명의 다른 일 측면에서 제공하는 자성 아가로스 비드의 제조방법을 단계별로 상세히 설명한다.Hereinafter, a method of manufacturing a magnetic agarose bead provided in another aspect of the present invention will be described in detail step by step.
단계 1: 금속 산화물 나노입자에 카르복시메틸 덱스트란을 처리하여 카르복시메틸 덱스트란 코팅층을 형성하는 단계이다.Step 1: This is a step of forming a carboxymethyl dextran coating layer by treating a metal oxide nanoparticle with carboxymethyl dextran.
이때, 상기 금속 산화물 나노입자는 일 측면에서 Fe2 +, Fe3 + 이온을 1:2 몰(mol) 비율로 함유한 수용액을 질소 분위기에서 암모니아수 또는 수산화나트륨용액과 같은 염기성 물질을 가하여 산화철을 공침시켜 준비할 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 금속 산화물 나노입자는 극미세 초상자성 산화철 나노입자일 수 있으며, 평균 직경은 일 측면에서 5 내지 15 nm 범위일 수 있다. 상기 카르복시메틸 덱스트란은 시판되는 제품을 구매하여 사용할 수도 있고 직접 공지된 방법을 통해 제조하여 사용할 수도 있다. 상기 카르복시메틸 덱스트란의 중량평균 분자량(Mw)은 10,000 내지 15,000 g/mol 범위일 수 있고, 11,000 내지 15,000 g/mol 범위일 수 있고, 12,000 내지 15,000 g/mol 범위일 수 있고, 13,000 내지 15,000 g/mol 범위일 수 있고, 13,500 내지 15,000 g/mol 범위일 수 있고, 10,000 내지 14,000 g/mol 범위일 수 있고, 10,000 내지 13,800 g/mol 범위일 수 있고, 11,500 내지 14,000 g/mol 범위일 수 있고, 13,500 내지 13,800 g/mol 범위일 수 있고, 13,700 g/mol일 수 있다. 금속 산화물 나노입자에 카르복시메틸 덱스트란을 가하여 코팅층을 형성할 때, 금속 산화물 나노입자 100 중량부에 대해 카르복시메틸 덱스트란은 1 내지 4 중량부 범위, 2 내지 4 중량부 범위, 2.5 내지 4 중량부 범위, 1 내지 3 중량부 범위, 1 내지 2.8 중량부 범위, 2 내지 3 중량부 범위, 2.5 내지 2.7 중량부 범위, 2.6 중량부 범위로 가할 수 있다.At this time, the metal oxide nanoparticles co-precipitate iron oxide by adding a basic substance such as aqueous ammonia or sodium hydroxide solution in a nitrogen atmosphere with an aqueous solution containing Fe 2 + and Fe 3 + ions in a ratio of 1:2 mol (mol). It can be prepared, but is not particularly limited thereto. The metal oxide nanoparticles may be ultra-fine superparamagnetic iron oxide nanoparticles, and the average diameter may range from 5 to 15 nm in one aspect. The carboxymethyl dextran may be used by purchasing a commercially available product, or may be directly prepared and used through a known method. The weight average molecular weight (Mw) of the carboxymethyl dextran may range from 10,000 to 15,000 g/mol, from 11,000 to 15,000 g/mol, from 12,000 to 15,000 g/mol, from 13,000 to 15,000 g /mol, may range from 13,500 to 15,000 g/mol, may range from 10,000 to 14,000 g/mol, may range from 10,000 to 13,800 g/mol, may range from 11,500 to 14,000 g/mol, and , May range from 13,500 to 13,800 g/mol, and may be 13,700 g/mol. When forming a coating layer by adding carboxymethyl dextran to metal oxide nanoparticles, carboxymethyl dextran is in the range of 1 to 4 parts by weight, 2 to 4 parts by weight, 2.5 to 4 parts by weight per 100 parts by weight of the metal oxide nanoparticles It can be added in a range, 1 to 3 parts by weight, 1 to 2.8 parts by weight, 2 to 3 parts by weight, 2.5 to 2.7 parts by weight, and 2.6 parts by weight.
상기 금속 산화물 나노입자에 카르복시메틸 덱스트란 코팅층을 형성하는 단계는 금속 산화물 나노입자와 카르복시메틸 덱스트란을 물(탈이온수, 증류수)에 첨가하고, 70℃ 내지 90℃ 온도로 가열한 후, 암모늄 하이드록사이드 용액을 첨가하고 교반하여 코팅층을 형성할 수 있다.In the step of forming the carboxymethyl dextran coating layer on the metal oxide nanoparticles, the metal oxide nanoparticles and carboxymethyl dextran are added to water (deionized water, distilled water), heated to a temperature of 70°C to 90°C, and then ammonium hydroxide. A coating layer can be formed by adding and stirring the rockside solution.
단계 2: 상기 코팅층이 형성된 금속 산화물 나노입자와 아가로스를 포함하는 수상 용액을, 유기상 용액에 첨가하여 에멀젼을 형성시키는 단계이다.Step 2: This is a step of forming an emulsion by adding an aqueous phase solution containing the metal oxide nanoparticles on which the coating layer is formed and agarose to the organic phase solution.
이때, 상기 유기상 용액은 사이클로 헥산, 톨루엔과 같은 유기용매를 사용할 수 있다. 또한, 상기 아가로스는 시판되는 제품을 구매하여 사용할 수도 있고 직접 공지된 방법을 통해 제조하여 사용할 수도 있다. 상기 아가로스의 중량평균 분자량은 100,000 내지 140,000 g/mol 범위일 수 있고, 110,000 내지 140,000 g/mol 범위일 수 있고, 120,000 내지 140,000 g/mol 범위일 수 있고, 100,000 내지 130,000 g/mol 범위일 수 있고, 100,000 내지 120,000 g/mol 범위일 수 있고, 110,000 내지 130,000 g/mol 범위일 수 있고, 115,000 내지 125,000 g/mol 범위일 수 있고, 120,000 g/mol 범위일 수 있다. 상기 에멀젼 형성은 50 내지 90℃에서 수행될 수 있고, 60 내지 90℃에서 수행될 수 있고, 70 내지 90℃에서 수행될 수 있고, 50 내지 80℃에서 수행될 수 있고, 50 내지 70℃에서 수행될 수 있고, 60 내지 80℃에서 수행될 수 있고, 70℃에서 수행될 수 있다.At this time, the organic phase solution may use an organic solvent such as cyclohexane or toluene. In addition, the agarose may be used by purchasing a commercially available product, or may be directly prepared and used through a known method. The weight average molecular weight of the agarose may range from 100,000 to 140,000 g/mol, may range from 110,000 to 140,000 g/mol, may range from 120,000 to 140,000 g/mol, and may range from 100,000 to 130,000 g/mol And, it may range from 100,000 to 120,000 g/mol, may range from 110,000 to 130,000 g/mol, may range from 115,000 to 125,000 g/mol, and may range from 120,000 g/mol. The emulsion formation may be performed at 50 to 90°C, may be performed at 60 to 90°C, may be performed at 70 to 90°C, may be performed at 50 to 80°C, and may be performed at 50 to 70°C Can be, can be carried out at 60 to 80 ℃, it can be carried out at 70 ℃.
단계 3: 아가로스의 젤화를 유도하는 단계이다. 상기 아가로스의 젤화는 상기 에멀젼을 형성시킬때의 온도를 냉각시킴으로써 수행될 수 있다.Step 3: This is the step of inducing gelation of agarose. The gelation of the agarose may be performed by cooling the temperature at the time of forming the emulsion.
일 측면에서, 상기 아가로스의 젤화는 15 내지 30℃에서 수행될 수 있고, 17 내지 30℃에서 수행될 수 있고, 19 내지 30℃에서 수행될 수 있고, 20 내지 30℃에서 수행될 수 있고, 15 내지 28℃에서 수행될 수 있고, 15 내지 26℃에서 수행될 수 있고, 15 내지 24℃에서 수행될 수 있고, 15 내지 23℃에서 수행될 수 있고, 17 내지 28℃에서 수행될 수 있고, 19 내지 25℃에서 수행될 수 있고, 20 내지 23℃에서 수행될 수 있다.In one aspect, the gelation of the agarose may be performed at 15 to 30°C, may be performed at 17 to 30°C, may be performed at 19 to 30°C, and may be performed at 20 to 30°C, It can be carried out at 15 to 28 ℃, it can be carried out at 15 to 26 ℃, it can be carried out at 15 to 24 ℃, it can be carried out at 15 to 23 ℃, it can be carried out at 17 to 28 ℃, It can be carried out at 19 to 25 ℃, it can be carried out at 20 to 23 ℃.
본 발명의 또 다른 일 측면은 상기 자성 아가로스 비드를 포함하는 바이오 분자 분리용 키트를 제공한다.Another aspect of the present invention provides a kit for separating a biomolecule comprising the magnetic agarose beads.
이때, 상기 바이오 분자는 단백질, 펩타이드 및 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 생체에서 얻을 수 있는 분자라면 제한 없이 사용할 수 있다.In this case, the biomolecule may be one or more selected from the group consisting of proteins, peptides, and nucleic acids, but any molecule that can be obtained in vivo may be used without limitation.
본 발명의 일 측면에서 제공되는 CMD-IONP 함유 자성 아가로스 비드 (CMD-IONP-MAB)는, 내부의 극미세 초상자성 산화철 나노입자(IONP)가 카르복시메틸 덱스트란으로 코팅되어 친수성이고, 입자 간 반발력이 생성되어 입자 간의 응집이 방지되므로, CMD-IONP가 CMD-IONP-MAB 내부에 균일하게 분포할 수 있어, 상기 CMD-IONP-MAB는 단백질의 분리와 정제 효율이 높은 효과가 있으며, 이는 후술하는 실시예, 실험예에 의해 직접적으로 뒷받침된다.CMD-IONP-containing magnetic agarose beads (CMD-IONP-MAB) provided in one aspect of the present invention is hydrophilic because the inner ultrafine superparamagnetic iron oxide nanoparticles (IONP) are coated with carboxymethyl dextran, Since repulsive force is generated to prevent aggregation between particles, CMD-IONP can be evenly distributed inside CMD-IONP-MAB, so that the CMD-IONP-MAB has a high efficiency of protein separation and purification, which will be described later. It is directly supported by Examples, Experimental Examples.
이하, 본 발명을 후술하는 실시예와 실험예를 통해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail through Examples and Experimental Examples to be described later.
단, 후술하는 실시예와 실험예는 본 발명을 일부 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.However, the examples and experimental examples to be described later are merely illustrative of the present invention, and the present invention is not limited thereto.
<< 실시예Example 1> 1> 카르복시메틸Carboxymethyl 덱스트란이 코팅된 Dextran coated 초상자성Superparamagnetic 산화철 나노입자를 함유한 자성 Magnetism containing iron oxide nanoparticles 아가로스Agarose 비드Bead (( CMDCMD -- IONPIONP -- MABMAB ) 제조) Produce
극미세 초상자성 산화철 나노입자는 Fe2 +, Fe3 + 이온을 1:2 몰(mol) 비율로 함유한 수용액을 질소 분위기에서 암모니아수 또는 수산화나트륨용액과 같은 염기성 물질을 가하여 산화철을 공침시켜 준비하였다. 이때, 반응 온도는 80℃이었고, 교반 속도는 800 내지 1200 rpm 이었다.The ultra-fine superparamagnetic iron oxide nanoparticles were prepared by co-precipitation of iron oxide by adding a basic substance such as aqueous ammonia or sodium hydroxide solution in a nitrogen atmosphere with an aqueous solution containing Fe 2 + and Fe 3 + ions in a 1:2 mol (mol) ratio. . At this time, the reaction temperature was 80° C., and the stirring speed was 800 to 1200 rpm.
이로써 준비된 극미세 초상자성 산화철 나노입자의 평균직경은 5 내지 15 nm 이었다.The average diameter of the ultrafine superparamagnetic iron oxide nanoparticles thus prepared was 5 to 15 nm.
상기 준비한 극미세 초상자성 산화철 나노입자 3.8g과 카르복시메틸 덱스트란(CMD) 0.1g을 탈이온수에 가하고, 강한 교반 하에서 용액을 섭씨 80℃로 가열한다. 가열된 용액에 6 mL의 35%(v/v) 암모늄 하이드록사이드 용액을 시린지 펌프로 10분 동안 가하고, 3시간 동안 교반시킨다. 용액의 온도를 실온(약 20~23℃)까지 냉각시킨 후, 반응 플라스크 바닥에 가라앉은 CMD 코팅층이 형성된 짙은 검은색의 극미세 초상자성 산화철 나노입자를 자석을 이용해 분리하고, 분리된 산화철 입자를 탈이온수로 pH가 중성이 될 때까지 여러 번 수세한다. 수세한 산화철 입자를 동결건조한다. 상기 코팅층이 형성된 극미세 초상자성 산화철 나노입자를 CMD-IONP라 명명한다.3.8 g of the prepared ultrafine superparamagnetic iron oxide nanoparticles and 0.1 g of carboxymethyl dextran (CMD) were added to deionized water, and the solution was heated to 80°C under strong stirring. 6 mL of 35% (v/v) ammonium hydroxide solution was added to the heated solution for 10 minutes by a syringe pump, and stirred for 3 hours. After cooling the solution to room temperature (about 20~23℃), the dark black ultrafine superparamagnetic iron oxide nanoparticles with the CMD coating layer settled on the bottom of the reaction flask were separated using a magnet, and the separated iron oxide particles were separated. Wash several times with deionized water until the pH is neutral. The washed iron oxide particles are freeze-dried. The ultrafine superparamagnetic iron oxide nanoparticles on which the coating layer is formed are called CMD-IONP.
상기 사용한 카르복시메틸 덱스트란(CMD)은 Sigma-Aldrich 사에서 구입한 것이며, 중량 평균 분자량은 13,700 g/mol 이었다. 또한, 상기 형성된 코팅층의 평균 두께는 약 0.5 nm 이었다.The used carboxymethyl dextran (CMD) was purchased from Sigma-Aldrich, and the weight average molecular weight was 13,700 g/mol. In addition, the average thickness of the formed coating layer was about 0.5 nm.
다음으로, CMD-IONP가 내부에 균일하게 함유된 자성 아가로스 비드는 유화액적젤 형성법을 통해 제조하였다.Next, magnetic agarose beads containing CMD-IONP uniformly therein were prepared through an emulsion droplet gel formation method.
유화액적젤 형성법은, 수상으로 1.2 g의 아가로스와 0.3 g의 CMD-IONP를 탈이온수에 용해시킨 아가로스 용액을, 유기상으로 사이클로 헥산 또는 톨루엔 유기용매를 사용하였다. 이때, 아가로스는 Sigma-Aldrich 사의 제품을 사용하였고, 중량평균 분자량은 120,000 g/mol 이었다.In the emulsion droplet gel formation method, an agarose solution obtained by dissolving 1.2 g of agarose and 0.3 g of CMD-IONP in deionized water as an aqueous phase, and a cyclohexane or toluene organic solvent as an organic phase were used. At this time, agarose was used by Sigma-Aldrich, and the weight average molecular weight was 120,000 g/mol.
유기상의 온도를 70℃로 맞추고 교반하며, 상기 수상을 가하여 에멀전을 형성시킨 후 실온(약 20 내지 23℃)으로 냉각시켜 아가로스를 젤화시켜, CMD-IONP가 내부에 균일하게 함유된 자성 아가로스 비드를 제조했다. 이때, 교반 속도는 800-1200 rpm이었다.Adjust the temperature of the organic phase to 70°C and stir, and after adding the aqueous phase to form an emulsion, the agarose is gelled by cooling to room temperature (about 20 to 23°C), and CMD-IONP is uniformly contained in the magnetic agarose. Beads were prepared. At this time, the stirring speed was 800-1200 rpm.
생성된 자성 아가로스 비드(CMD-IONP-MAB) 들은 자석에 의해 분리되었고, 분리된 비드들은 50%(v/v) 에탄올/물로 세정된 후, 20%(v/v) 에탄올/물에 분산되었고, 사용 전까지 4℃에서 보관되었다.The generated magnetic agarose beads (CMD-IONP-MAB) were separated by a magnet, and the separated beads were washed with 50% (v/v) ethanol/water, and then dispersed in 20% (v/v) ethanol/water. And stored at 4°C until use.
상기 과정을 통해,Through the above process,
본 발명의 일 측면에서 제공하는, 카르복시메틸 덱스트란이 코팅된 초상자성 산화철 나노입자를 함유한 자성 아가로스 비드를 제조하였으며, 이를 CMD-IONP-MAB라 명명한다.Magnetic agarose beads containing superparamagnetic iron oxide nanoparticles coated with carboxymethyl dextran, provided in one aspect of the present invention, were prepared, and are referred to as CMD-IONP-MAB.
<< 비교예Comparative example 1> 코팅층이 없는 1> No coating layer 초상자성Superparamagnetic 산화철 나노입자( Iron oxide nanoparticles ( IONPIONP ) 제조) Produce
극미세 초상자성 산화철 나노입자는 Fe2 +, Fe3 + 이온을 1:2 몰 비율로 함유한 수용액을 질소 분위기에서 암모니아수 또는 수산화나트륨용액과 같은 염기성 물질을 가하여 산화철을 공침시켜 준비하였다. 이때, 반응 온도는 80℃이었고, 교반 속도는 800 내지 1200 rpm 이었다.The ultra-fine superparamagnetic iron oxide nanoparticles were prepared by co-precipitation of iron oxide by adding a basic substance such as aqueous ammonia or sodium hydroxide solution in a nitrogen atmosphere in an aqueous solution containing Fe 2 + and Fe 3 + ions in a 1:2 molar ratio. At this time, the reaction temperature was 80° C., and the stirring speed was 800 to 1200 rpm.
즉, 실시예 1에서 극미세 초상자성 산화철 나노입자를 준비하는 과정을 동일하게 수행하여 IONP를 제조하였다.That is, the process of preparing the ultrafine superparamagnetic iron oxide nanoparticles in Example 1 was performed in the same manner to prepare IONP.
<< 비교예Comparative example 2> 코팅층이 없는 2> No coating layer 초상자성Superparamagnetic 산화철 나노입자를 함유한 자성 Magnetism containing iron oxide nanoparticles 아가로스Agarose 비드Bead (( IONPIONP -- MABMAB ) 제조) Produce
실시예 1에서 카르복시메틸 덱스트란(CMD) 코팅층을 형성하는 단계만 수행하지 않고, 나머지 단계를 동일하게 수행하여 IONP-MAB를 제조하였다.In Example 1, only the step of forming the carboxymethyl dextran (CMD) coating layer was not performed, and the remaining steps were performed in the same manner to prepare IONP-MAB.
<< 실험예Experimental example 1> 1> CMDCMD -- IONP의IONP 입도 분석 Particle size analysis
상기 실시예 1의 중간 과정에서 제조한 CMD-IONP 들을 탈이온수에 현탁시킨 액 1mL을 일회용 큐벳에 가하고, 직경 크기 분석기 (Zetasizer Nano ZS, Malvern instruments Ltd., Worcestershire, UK)를 이용하여 25℃에서 입자들의 크기와 크기 분포를 측정하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.1 mL of a solution in which the CMD-IONPs prepared in the intermediate process of Example 1 were suspended in deionized water was added to a disposable cuvette, and a diameter size analyzer (Zetasizer Nano ZS, Malvern instruments Ltd., Worcestershire, UK) was used at 25° C. The size and size distribution of the particles were measured. The results are shown in FIG. 1.
도 1은 카르복시메틸 덱스트란으로 코팅된 산화철 나노입자 (CMD-IONP)의 입도 분포를 나타내는 도면이다.1 is a view showing the particle size distribution of iron oxide nanoparticles (CMD-IONP) coated with carboxymethyl dextran.
도 1에 나타난 바와 같이,As shown in Figure 1,
상기 실시예 1의 중간 과정에서 제조한 CMD-IONP는 약 30 내지 200 nm의 직경 범위를 갖는 구형의 회합체로 존재하는 것으로 나타났다.CMD-IONP prepared in the intermediate process of Example 1 was found to exist as a spherical aggregate having a diameter range of about 30 to 200 nm.
<< 실험예Experimental example 2> 2> CMDCMD -- IONP의IONP XRDXRD 분석 analysis
상기 실시예 1의 중간 과정에서 제조한 CMD-IONP를 진공 하에 건조시킨 후, 한국화학연구원 (이하, KRICT)의 Cu Kα 방사선(radiation)을 사용하는 X-선 파우더 회절측정기 (D8 ADVANCE, Bruker AXS GmbH, Kalsruhe, Germany)를 이용하여 X-선 회절 패턴을 분석하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.After drying the CMD-IONP prepared in the intermediate process of Example 1 under vacuum, an X-ray powder diffractometer (D8 ADVANCE, Bruker AXS) using Cu Kα radiation of the Korea Research Institute of Chemical Technology (hereinafter, KRICT) GmbH, Kalsruhe, Germany) was used to analyze the X-ray diffraction pattern. The results are shown in FIG. 2.
도 2는 CMD-IONP의 X-선 회절 패턴을 나타내는 도면이다.2 is a diagram showing an X-ray diffraction pattern of CMD-IONP.
도 2에 나타난 바와 같이,As shown in Figure 2,
상기 실시예 1의 중간 과정에서 제조한 CMD-IONP가 나타내는 피크들은, Fe3O4 결정이 갖는 피크 값과 일치하므로, 이로부터 CMD 코팅이 극미세 초상자성 산화철 나노입자의 경정성에 영향을 주지 않음을 알 수 있다.The peaks represented by CMD-IONP prepared in the intermediate process of Example 1 coincide with the peak values of the Fe 3 O 4 crystal, so that the CMD coating does not affect the hardness of the ultra-fine superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Can be seen.
<< 실험예Experimental example 3> 3> CMDCMD -- IONP의IONP TEMTEM 분석 analysis
상기 실시예 1의 중간 과정에서 제조한 CMD-IONP를 탈이온수에 현탁시키고, 이 액의 액적을 탄소 코팅된 구리 그리드에 가하고 실온에서 건조한 후, KRICT의 전계 방사형 (Field-Emission) TEM (FE-TEM) (FEI TALOS F200X, FEI Company, Hillsboro, OR, USA)을 이용하여 가속전압 200kV에서 CMD-IONP를 일반 분해능 및 고 분해능 조건으로 관찰하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.CMD-IONP prepared in the intermediate process of Example 1 was suspended in deionized water, and a droplet of this liquid was added to a carbon-coated copper grid, dried at room temperature, and then KRICT's Field-Emission TEM (FE- TEM) (FEI TALOS F200X, FEI Company, Hillsboro, OR, USA) was used to observe CMD-IONP under normal and high resolution conditions at an acceleration voltage of 200 kV. The results are shown in FIG. 3.
도 3은 고해상도 투과전자현미경으로 관찰된 CMD-IONP의 이미지를 나타내는 도면이다.3 is a diagram showing an image of CMD-IONP observed with a high-resolution transmission electron microscope.
도 3에 나타난 바와 같이,As shown in Figure 3,
CMD-IONP 단일 입자의 크기는 5 내지 15 nm이고, CMD-IONP 회합체의 크기는 30 nm이다. CMD-IONP 회합체는 구형의 CMD-IONP가 회합된 형태이다. CMD-IONP의 고해상도 투과전자현미경 이미지로부터 Fe3O4의 잘 발달된 결정 격자 패턴이 확인된다.The size of CMD-IONP single particles is 5 to 15 nm, and the size of CMD-IONP aggregate is 30 nm. The CMD-IONP association is a form in which the spherical CMD-IONP is associated. The well-developed crystal lattice pattern of Fe 3 O 4 was confirmed from the high-resolution transmission electron microscope image of CMD-IONP.
<< 실험예Experimental example 4> 4> CMDCMD -- IONPIONP -- MAB의MAB's 광학 현미경 관찰 Optical microscope observation
상기 실시예 1에서 제조한 CMD-IONP-MAB를 광학 현미경 (Leica DMI3000 B, Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)를 이용하여 관찰하였다. 그 결과를 도 4와 하기 표 1에 나타내었다.The CMD-IONP-MAB prepared in Example 1 was observed using an optical microscope (Leica DMI3000 B, Leica Microsystems, Wetzlar, Germany). The results are shown in Figure 4 and Table 1 below.
도 4는 광학 현미경 관찰된 CMD-IONP 함유 자성 아가로스 비드 (CMD-IONP-MAB) 이미지를 나타내는 도면이며, 축척 막대는 50 마이크로미터이다. 하기 표 1에서 단위는 마이크로미터이다.4 is a diagram showing an image of CMD-IONP-containing magnetic agarose beads (CMD-IONP-MAB) observed under an optical microscope, and a scale bar is 50 micrometers. In Table 1 below, the unit is micrometer.
직경Average
diameter
편차Standard
Deviation
도 4에 나타난 바와 같이,As shown in Figure 4,
CMD-IONP-MAB 내부에 CMD-IONP가 매우 균일하게 분포되어 있다.CMD-IONP is very evenly distributed inside CMD-IONP-MAB.
<< 실험예Experimental example 5> 5> CMDCMD -- IONPIONP -- MAB의MAB's 안정성 시험 Stability test
상기 실시예 1에서 제조한 CMD-IONP-MAB 3g이 담긴 바이알에, 1 mL의 0.1 M 초산완충액(acetate buffer, pH 4.5)를 가한 후, 진탕배양기(shaking incubator) 를 이용하여 바이알을 25℃에서 100 rpm으로 진탕(shaking) 하면서, 시간 경과에 따라 상등액을 취하였다. 취한 상등액에는 CMD-IONP-MAB가 존재한다. 채취한 시료에 함유된 Fe 이온의 함량을 철 분석 키트(iron assay kit) (C) (BioVision Inc., Milpitas, CA, USA)를 이용하여 분석하였다. Fe 이온의 측정 및 분석은 다음과 같은 과정에 의해 실시되었다. 각 시료 50 μL를 96-웰 플레이트의 각 웰에 가하고, 시료가 가해진 웰에, 키트 내 구비되어 있던 분석완충액(assay buffer) 50 μL와 Fe 환원(reducer) 용액 5 μL을 차례로 가한 후, 실온에서 30분간 인큐베이션(incubation) 하였다. 키트 내 구비되어 있던 100 μL의 Fe 프로브(probe) 용액를 각 웰에 가하고 실온에서 60분간 빛을 차단하고 인큐베이션(incubation) 하였다. 그 후, 마이크로플레이트 리더(microplate reader) (Hidex sense 425-301, Hidex Oy. Turku, Finland) 를 이용하여 593 nm 파장에서 시료의 흡광도를 측정하고 미리 작성한 검량선을 이용하여 Fe 이온의 함량을 산출하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.To the vial containing 3 g of CMD-IONP-MAB prepared in Example 1, 1 mL of 0.1 M acetic acid buffer (pH 4.5) was added, and then the vial was placed at 25°C using a shaking incubator. While shaking at 100 rpm, the supernatant was taken over time. CMD-IONP-MAB is present in the supernatant taken. The content of Fe ions contained in the collected sample was analyzed using an iron assay kit (C) (BioVision Inc., Milpitas, CA, USA). Measurement and analysis of Fe ions were carried out by the following procedure. 50 μL of each sample was added to each well of a 96-well plate, 50 μL of assay buffer and 5 μL of Fe reduction solution were sequentially added to the wells to which the sample was added, and then at room temperature. Incubated for 30 minutes (incubation). 100 μL of Fe probe solution provided in the kit was added to each well, and the light was blocked at room temperature for 60 minutes, followed by incubation. Thereafter, the absorbance of the sample was measured at a wavelength of 593 nm using a microplate reader (Hidex sense 425-301, Hidex Oy. Turku, Finland), and the content of Fe ions was calculated using a calibration curve prepared in advance. . The results are shown in FIG. 5.
도 5는 산성 용액 (pH 4.5)에서 시간 경과에 따른 CMD-IONP-MAB 내 Fe3O4 NP의 함량을 나타내는 도면이다.5 is a diagram showing the content of Fe 3 O 4 NP in CMD-IONP-MAB over time in an acidic solution (pH 4.5).
도 5에 나타난 바와 같이,As shown in Figure 5,
CMD-IONP-MAB 내부에 Fe3O4 NP가 진탕 과정에서 유출되지 않고, CMD-IONP-MAB 내부에 안정하게 존재함을 알 수 있다.It can be seen that the Fe 3 O 4 NP inside the CMD-IONP-MAB does not leak out during the shaking process, and stably exists inside the CMD-IONP-MAB.
이로부터, 카르복시메틸 덱스트란(CMD)이 시험 용액에서 Fe3O4의 유출의 문제를 일으키지 않음이 뒷받침된다.From this, it is supported that carboxymethyl dextran (CMD) does not cause the problem of outflow of Fe 3 O 4 in the test solution.
<< 실험예Experimental example 6> 6> IONP의IONP 입도 분석 Particle size analysis
비교예 1에서 제조한 코팅층이 없는 초상자성 산화철 나노입자(IONP)를 대상으로, 상기 실험예 1과 동일한 과정을 수행하여 입도를 분석하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.For the superparamagnetic iron oxide nanoparticles (IONP) without a coating layer prepared in Comparative Example 1, the particle size was analyzed by performing the same procedure as in Experimental Example 1. The results are shown in FIG. 6.
도 6은 산화철 나노입자 (IONP)의 입도 분포를 나타내는 도면이다.6 is a diagram showing the particle size distribution of iron oxide nanoparticles (IONP).
<< 실험예Experimental example 7> 7> IONP의IONP XRDXRD 분석 analysis
비교예 1에서 제조한 코팅층이 없는 초상자성 산화철 나노입자(IONP)를 대상으로, 상기 실험예 2와 동일한 과정을 수행하여 XRD 분석을 실시하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.For the superparamagnetic iron oxide nanoparticles (IONP) without a coating layer prepared in Comparative Example 1, XRD analysis was performed by performing the same procedure as in Experimental Example 2. The results are shown in FIG. 7.
도 7은 IONP의 X-선 회절 패턴을 나타내는 도면이다.7 is a diagram showing an X-ray diffraction pattern of IONP.
<< 실험예Experimental example 8> 8> IONP의IONP TEMTEM 분석 analysis
비교예 1에서 제조한 코팅층이 없는 초상자성 산화철 나노입자(IONP)를 대상으로, 상기 실험예 3과 동일한 과정을 수행하여 TEM 분석을 실시하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.For the superparamagnetic iron oxide nanoparticles (IONP) without a coating layer prepared in Comparative Example 1, TEM analysis was performed by performing the same procedure as in Experimental Example 3. The results are shown in FIG. 8.
도 8은 투과전자현미경으로 관찰된 IONP의 이미지를 나타내는 도면이다.8 is a diagram showing an image of IONP observed with a transmission electron microscope.
<< 실험예Experimental example 9> 9> IONPIONP -- MAB의MAB's 광학 현미경 관찰 Optical microscope observation
비교예 2에서 제조한 코팅층이 없는 초상자성 산화철 나노입자를 함유한 자성 아가로스 비드(IONP-MAB)를 대상으로, 상기 실험예 4와 동일한 과정을 수행하여 광학 현미경 관찰을 실시하였다. 그 결과를 도 9와 하기 표 2에 나타내었다.The magnetic agarose beads (IONP-MAB) containing superparamagnetic iron oxide nanoparticles without a coating layer prepared in Comparative Example 2 were subjected to the same procedure as in Experimental Example 4 to observe an optical microscope. The results are shown in Fig. 9 and Table 2 below.
도 9는 광학 현미경 관찰된 IONP 함유 자성 아가로스 비드 (IONP-MAB)의 이미지를 나타내는 도면이며, 축척 막대는 50 마이크로미터이다. 하기 표 2의 단위는 마이크로미터이다.9 is a diagram showing an image of IONP-containing magnetic agarose beads (IONP-MAB) observed with an optical microscope, and a scale bar is 50 micrometers. The units in Table 2 below are micrometers.
직경Average
diameter
편차Standard
Deviation
도 9에 나타난 바와 같이,As shown in Figure 9,
IONP-MAB 내부에 IONP가 서로 응집되어 불균일하게 분포되어 있다.Inside IONP-MAB, IONP is aggregated and distributed unevenly.
<< 실험예Experimental example 10> 10> IONPIONP -- MAB의MAB's 안정성 시험 Stability test
비교예 2에서 제조한 코팅층이 없는 초상자성 산화철 나노입자를 함유한 자성 아가로스 비드(IONP-MAB)를 대상으로, 상기 실험예 5와 동일한 과정을 수행하여 안정성을 평가하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.For the magnetic agarose beads (IONP-MAB) containing superparamagnetic iron oxide nanoparticles without a coating layer prepared in Comparative Example 2, stability was evaluated by performing the same procedure as in Experimental Example 5. The results are shown in FIG. 10.
도 10은 산성 용액 (pH 4.5)에서 시간 경과에 따른 IONP-MAB 내 Fe3O4 NP의 함량을 나타내는 도면이다.10 is a diagram showing the content of Fe 3 O 4 NP in IONP-MAB over time in an acidic solution (pH 4.5).
이상, 본 발명을 바람직한 실시예, 실험예를 통해 상세히 설명하였으나, 본 발명의 범위는 특정 실시예에 한정되는 것은 아니며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 해석되어야 할 것이다. 또한, 이 기술분야에서 통상의 지식을 습득한 자라면, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않으면서도 많은 수정과 변형이 가능함을 이해하여야 할 것이다.As described above, the present invention has been described in detail through preferred embodiments and experimental examples, but the scope of the present invention is not limited to specific embodiments and should be interpreted by the appended claims. In addition, those who have acquired ordinary knowledge in this technical field should understand that many modifications and variations can be made without departing from the scope of the present invention.
Claims (12)
상기 카르복시메틸 덱스트란 코팅층의 평균 두께는 0.1 내지 1.0 nm이고,
상기 카르복시메틸 덱스트란 코팅층이 표면에 형성된 금속 산화물 나노입자는, 20 내지 210 nm의 평균 직경을 갖는 회합체 형태로 아가로스 비드 내부에 균일하게 분포되는 것을 특징으로 하는 자성 아가로스 비드.
It is a magnetic agarose bead containing metal oxide nanoparticles having a carboxymethyl dextran coating layer formed on the surface thereof,
The average thickness of the carboxymethyl dextran coating layer is 0.1 to 1.0 nm,
Magnetic agarose beads, characterized in that the metal oxide nanoparticles having the carboxymethyl dextran coating layer formed on the surface are uniformly distributed inside the agarose beads in the form of an aggregate having an average diameter of 20 to 210 nm.
상기 금속 산화물 나노입자는 초상자성(superparamagnetic) 산화철 나노입자인 것을 특징으로 하는 자성 아가로스 비드.
The method of claim 1,
The metal oxide nanoparticles are magnetic agarose beads, characterized in that the superparamagnetic iron oxide nanoparticles.
상기 아가로스 비드의 평균 직경은 20 내지 210 ㎛인 것을 특징으로 하는 자성 아가로스 비드.
The method of claim 1,
Magnetic agarose beads, characterized in that the average diameter of the agarose beads is 20 to 210 ㎛.
상기 코팅층이 형성된 금속 산화물 나노입자와 아가로스를 포함하는 수상 용액을, 유기상 용액에 첨가하여 에멀젼을 형성시키는 단계; 및
아가로스의 젤화를 유도하는 단계; 를 포함하는 제1항의 자성 아가로스 비드의 제조방법.
Treating the metal oxide nanoparticles with carboxymethyl dextran to form a carboxymethyl dextran coating layer;
Forming an emulsion by adding an aqueous phase solution containing the metal oxide nanoparticles and agarose on which the coating layer is formed to an organic phase solution; And
Inducing gelation of agarose; The method of manufacturing the magnetic agarose beads of claim 1 comprising a.
상기 카르복시메틸 덱스트란의 중량평균 분자량은 10,000 내지 15,000 g/mol인 것을 특징으로 하는 자성 아가로스 비드의 제조방법.
The method of claim 7,
The method for producing magnetic agarose beads, characterized in that the weight average molecular weight of the carboxymethyl dextran is 10,000 to 15,000 g/mol.
상기 아가로스의 중량평균 분자량은 100,000 내지 140,000 g/mol인 것을 특징으로 하는 자성 아가로스 비드의 제조방법.
The method of claim 7,
The method for producing magnetic agarose beads, characterized in that the weight average molecular weight of the agarose is 100,000 to 140,000 g/mol.
상기 에멀젼 형성은 50 내지 90℃에서 이루어지고,
상기 아가로스의 젤화는 15 내지 30℃에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 자성 아가로스 비드의 제조방법.
The method of claim 7,
The emulsion is formed at 50 to 90°C,
The method of producing a magnetic agarose beads, characterized in that the gelation of the agarose is performed at 15 to 30°C.
A kit for separating biomolecules comprising the magnetic agarose beads of claim 1.
상기 바이오 분자는 단백질, 펩타이드 및 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 바이오 분자 분리용 키트.The method of claim 11,
The biomolecule is a kit for separating biomolecules, characterized in that at least one selected from the group consisting of proteins, peptides and nucleic acids.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020180170397A KR102182656B1 (en) | 2018-12-27 | 2018-12-27 | Magnetic agarose beads containing carboxymethyl dextran-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles and the preparation method thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180170397A KR102182656B1 (en) | 2018-12-27 | 2018-12-27 | Magnetic agarose beads containing carboxymethyl dextran-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles and the preparation method thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20200081580A KR20200081580A (en) | 2020-07-08 |
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ID=71599980
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| KR1020180170397A KR102182656B1 (en) | 2018-12-27 | 2018-12-27 | Magnetic agarose beads containing carboxymethyl dextran-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles and the preparation method thereof |
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| KR (1) | KR102182656B1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20220093995A (en) * | 2020-12-28 | 2022-07-05 | 한국화학연구원 | Magnetic agarose bead (MAB) grafted with metal ion-complex for affinity-based separation of macromolecules and its preparation method thereof |
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|---|---|---|---|---|
| JP2011505237A (en) * | 2007-12-03 | 2011-02-24 | ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． | System and method for manufacturing beads |
| JP2016536003A (en) * | 2013-09-09 | 2016-11-24 | ラボ − オン − ア − ビード エービー | Production of magnetic particles |
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2018
- 2018-12-27 KR KR1020180170397A patent/KR102182656B1/en active IP Right Grant
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|---|---|
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