KR102176937B1 - A Composition for Preventing or Treating Metabolic Disorders Comprising Viperin Inhibitors as Active Ingredients - Google Patents

Abstract

The present invention relates to a composition for preventing or treating metabolic diseases and a method for screening the same. The present invention causes a rapid decrease of body fat by remarkably increasing heat production and metabolic activity in fat tissues, thereby being able to be usefully used as an efficient therapeutic composition for various metabolic syndromes including obesity.

Description

바이페린 억제제를 유효성분으로 포함하는 대사질환의 예방 또는 치료용 조성물{A Composition for Preventing or Treating Metabolic Disorders Comprising Viperin Inhibitors as Active Ingredients}A composition for preventing or treating metabolic diseases comprising a viperin inhibitor as an active ingredient {A Composition for Preventing or Treating Metabolic Disorders Comprising Viperin Inhibitors as Active Ingredients}

본 발명은 바이페린 억제제를 유효성분으로 포함하는 비만, 당뇨, 이상지방혈증, 지방간 및 인슐린 저항성 증후군을 비롯한 대사질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for preventing or treating metabolic diseases, including obesity, diabetes, dyslipidemia, fatty liver and insulin resistance syndrome, comprising a biperine inhibitor as an active ingredient.

많은 인터페론(IFN)-유도 단백질은 바이러스 감염에 대응한 방어에서 역할을 하며, 이들 단백질이 유도되는 메카니즘은 잘 연구되어 있다. 최근, RNA 시퀀싱이나 프로테오믹스와 같은 고속대량분석(high-throughput analysis) 기술의 발달로 인해 다양한 조직의 유전자 또는 단백질 발현 프로파일의 생성이 가능해졌다. 놀랍게도, Mx 단백질(MX 다이나민-유사 GTPases), GBP (구아닐레이트-결합 단백질), ISG15(15kDa의 IFN-자극 유전자 산물), ISG20(20kDa의 IFN-자극 엑소뉴클레아제), IFIT(반복된 트라트리코펩타이드를 가지는 IFN-유도 단백질), IFITM(IFN-유도 막관통 단백질), BST2(골수기질세포 항원 2) 및 바이페린(바이러스-억제 단백질)를 포함하는 대부분의 IFN-유도 단백질들은 특정 조직에서 어떠한 자극 없이도 발현되어, 이들 조직에서 새로운 기능을 하고 있을 것이라는 점을 시사한다.Many interferon (IFN)-inducing proteins play a role in defense against viral infection, and the mechanisms by which these proteins are derived are well studied. Recently, due to the development of high-throughput analysis techniques such as RNA sequencing and proteomics, it has become possible to generate gene or protein expression profiles of various tissues. Surprisingly, Mx proteins (MX dyinamine-like GTPases), GBP (guanylate-binding protein), ISG15 (15 kDa IFN-stimulating gene product), ISG20 (20 kDa IFN-stimulating exonuclease), IFIT (repeated Most IFN-inducing proteins, including IFN-derived protein with tratricopeptide), IFITM (IFN-derived transmembrane protein), BST2 (myeloid stromal cell antigen 2), and biperine (viral-suppressing protein) It is expressed without any stimulus in the tissues, suggesting that these tissues will have new functions.

바이페린(RSAD2, cig5 또는 vig1)은 항바이러스 활성을 가지고, 신호경로 또는 Th2 세포 발달을 매개하며, 세포 대사를 조절하는, IFN-유도 다중기능 단백질이다. 바이페린이 다양한 세포에서 기능을 하는 메카니즘은 잘 알려져있다. 바이페린은 ER(endoplasmic reticulum)에서 골지체로의 가용성 단백질의 수송을 차단하며, 미토콘드리아의 지방산 β-산화를 억제하여 ATP 생성을 감소시키고 세포 지방생성을 증가시킨다.Biperine (RSAD2, cig5 or vig1) is an IFN-derived multifunctional protein that has antiviral activity, mediates signaling pathways or Th2 cell development, and regulates cellular metabolism. The mechanism by which biperine functions in various cells is well known. Biperine blocks the transport of soluble proteins from the ER (endoplasmic reticulum) to the Golgi apparatus, and inhibits the fatty acid β-oxidation of mitochondria, thereby reducing ATP production and increasing cellular adipogenesis.

지방 조직은 에너지 균형과 항상성을 조절하는 중추적 대사기관이다. 지방 조직에는 백색 지방조직(WAT)과 갈색 지방조직(BAT)의 2가지 주요 형태가 있다. WAT는 지방을 저장하는 기능을 하며, BAT는 주로 열생성을 위해 지방을 태우는 역할을 한다. BAT은 다중 미토콘드리아 및 다방성 지질방울(lipid droplet)을 가지는데, 이는 미토콘드리아 UCP1(uncoupling protein 1)의 유도를 통해 열 생성에 중요한 역할을 한다. WAT은 갈색화(browning) 과정을 통해서도 열 생성에 기여한다. 열생성의 활성화는 에너지 소모를 증가시키고 비만, 인슐린 저항성 2형 당뇨와 같은 대사 질환을 개선시킨다. 열생성의 유도에는 지방산 β-산화가 필요하다. UCP1-결핍 마우스에서처럼, 지방산 β-산화가 결핍된 마우스에서는 지방 과다가 나타나면서 저온 스트레스에 민감해져, 지방산 β-산화가 열생성 및 지방조직 분화에 관여한다고 예상할 수 있다. 그러나, 지방산 β-산화-매개 열생성과 지방세포의 분화가 어떠한 기작에 의해 조절되는지는 알려져 있지 않다.Adipose tissue is the central metabolic organ that regulates energy balance and homeostasis. There are two main types of adipose tissue: white adipose tissue (WAT) and brown adipose tissue (BAT). WAT serves to store fat, and BAT serves to burn fat primarily for heat production. BAT has multiple mitochondria and multiple lipid droplets, which play an important role in heat generation through the induction of mitochondrial uncoupling protein 1 (UCP1). WAT also contributes to heat generation through the browning process. The activation of heat production increases energy expenditure and improves metabolic diseases such as obesity and insulin resistant type 2 diabetes. Fatty acid β-oxidation is required to induce thermogeneration. As in the UCP1-deficient mice, fatty acid β-oxidation deficient mice are sensitive to cold stress due to the appearance of excess fat, and it can be expected that fatty acid β-oxidation is involved in thermogeneration and adipose tissue differentiation. However, it is not known which mechanism regulates fatty acid β-oxidation-mediated heat production and adipocyte differentiation.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.Throughout this specification, a number of papers and patent documents are referenced and citations are indicated. The disclosure contents of the cited papers and patent documents are incorporated by reference in this specification as a whole, and the level of the technical field to which the present invention belongs and the contents of the present invention are more clearly described.

비특허문헌 1. J Interferon Cytokine Res. 2011 Jan; 31(1): 131-135. Non-Patent Document 1. J Interferon Cytokine Res. 2011 Jan; 31(1): 131-135.

본 발명자들은 생체 내 지방 대사를 효율적으로 조절함으로써 비만, 당뇨, 이상지방혈증, 지방간 및 인슐린 저항성 증후군을 포함하는 다양한 대사질환에 대한 우수한 치료 활성을 가지는 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 인터페론(IFN)-유도 단백질인 바이페린을 억제하는 물질을 개체에 투여할 경우 개체의 간, 심장, 지방 등의 조직에서 열 생성률, 산소 소모율 및 CO₂ 생성률이 증가하고, 열생성 및 지방산 β-산화와 관련된 유전자의 발현이 증가하며, 이를 통해 궁극적으로 체내 지방량이 현저히 감소됨을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors have tried to develop a composition having excellent therapeutic activity for various metabolic diseases including obesity, diabetes, dyslipidemia, fatty liver and insulin resistance syndrome by efficiently controlling fat metabolism in vivo. As a result, when a substance that inhibits biperin, an interferon (IFN)-inducing protein, is administered to an individual, the rate of heat generation, oxygen consumption, and CO ₂ generation in tissues such as liver, heart, and fat of the individual increase, and heat generation and By finding that the expression of genes related to fatty acid β-oxidation is increased, and ultimately, the amount of fat in the body is significantly decreased, the present invention has been completed.

따라서 본 발명의 목적은 대사질환(metabolic disorder)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating metabolic disorders.

본 발명의 다른 목적은 대사질환(metabolic disorder)의 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a method for screening a composition for preventing or treating metabolic disorders.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.Other objects and advantages of the present invention will become more apparent by the following detailed description, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 바이페린(viperin) 억제제를 유효성분으로 포함하는 비만, 당뇨, 이상지방혈증(dyslipidemia), 지방간 및 인슐린 저항성 증후군(insulin resistance syndrome)으로 구성된 군으로부터 선택되는 대사질환(metabolic disorder)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.According to an aspect of the present invention, the present invention is selected from the group consisting of obesity, diabetes, dyslipidemia, fatty liver, and insulin resistance syndrome comprising a viperin inhibitor as an active ingredient. It provides a pharmaceutical composition for preventing or treating metabolic disorders.

본 발명자들은 생체 내 지방 대사를 효율적으로 조절함으로써 비만, 당뇨, 이상지방혈증, 지방간 및 인슐린 저항성 증후군을 포함하는 다양한 대사질환에 대한 우수한 치료 활성을 가지는 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 인터페론(IFN)-유도 단백질인 바이페린을 억제하는 물질을 개체에 투여할 경우 개체의 간, 심장, 지방 등의 조직에서 열 생성률, 산소 소모율 및 CO₂ 생성률이 증가하고, 열생성 및 지방산 β-산화와 관련된 유전자의 발현이 증가하며, 이를 통해 궁극적으로 체내 지방량이 현저히 감소됨을 발견하였다. The present inventors have tried to develop a composition having excellent therapeutic activity for various metabolic diseases including obesity, diabetes, dyslipidemia, fatty liver and insulin resistance syndrome by efficiently controlling fat metabolism in vivo. As a result, when a substance that inhibits biperin, an interferon (IFN)-inducing protein, is administered to an individual, the rate of heat generation, oxygen consumption, and CO ₂ generation in tissues such as liver, heart, and fat of the individual increase, and heat generation and It was found that the expression of genes related to fatty acid β-oxidation was increased, and ultimately, fat mass in the body was significantly reduced.

본 명세서에서 용어“억제제”는 바이페린의 활성 또는 발현의 저하를 야기시키는 물질을 의미하며, 이에 의해 바이페린의 활성 또는 발현이 탐지 불가능해지거나 무의미한 수준으로 존재하게 되는 경우 뿐 아니라, 바이페린에 의한 지방산 β-산화와 열생성의 억제가 유의하게 저하될 수 있을 정도로 바이페린의 활성 또는 발현을 저하시키는 물질을 의미한다. In the present specification, the term “inhibitor” refers to a substance that causes a decrease in the activity or expression of biperin, whereby the activity or expression of biperin becomes undetectable or exists at an insignificant level, as well as It refers to a substance that lowers the activity or expression of biperin to such an extent that the inhibition of fatty acid β-oxidation and heat generation by the fatty acid can be significantly reduced.

바이페린의 억제제는 예를 들어 당업계에 이미 그 서열 및 구조가 공지된 단백질인 바이페린의 발현을 유전자 수준에서 억제하는 shRNA, siRNA, miRNA, 리보자임(ribozyme), PNA(peptide nucleic acids) 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드와, 단백질 수준에서 억제하는 항체 또는 앱타머 뿐 아니라, 바이페린의 활성을 억제하는 화합물, 펩타이드 및 천연물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.Inhibitors of biperin are, for example, shRNA, siRNA, miRNA, ribozyme, peptide nucleic acids (PNA) that inhibit the expression of biperin, a protein whose sequence and structure are already known in the art, at the gene level. Antisense oligonucleotides and antibodies or aptamers that inhibit at the protein level, as well as compounds, peptides, and natural products that inhibit the activity of biperine, but are not limited thereto.

본 명세서에서 용어“shRNA(small hairpin RNA)”는 in vivo 상에서 스템-루프(stem-loop) 구조를 이루는 단일 가닥으로 50-70개로 구성된 뉴클레오타이드로서, RNA 간섭을 통해 타겟 유전자의 발현을 억제하기 위한 타이트한 헤어핀 구조를 만드는 RNA 서열을 의미한다. 통상적으로 5-10개의 뉴클레오타이드의 루프 부위 양쪽으로 상보적으로 19-29개의 뉴클레오타이드의 긴 RNA가 염기쌍을 이루어 이중가닥의 스템을 형성하며, 언제나 발현되도록 하기 위하여 U6 프로모터를 포함하는 벡터를 통해 세포 내로 형질도입되며 대개 딸세포로 전달되어 타겟 유전자의 발현억제가 유전되도록 한다. As used herein, the term “shRNA (small hairpin RNA)” is a single strand consisting of 50-70 nucleotides constituting a stem-loop structure in vivo, and is used to inhibit the expression of a target gene through RNA interference. It refers to an RNA sequence that creates a tight hairpin structure. Typically, long RNAs of 19-29 nucleotides complementary to both sides of the loop portion of 5-10 nucleotides form a double-stranded stem by base pairing, and in order to be expressed at any time, into the cell through a vector containing the U6 promoter. It is transduced and is usually delivered to daughter cells, allowing the expression of the target gene to be inherited.

본 명세서에서 용어“siRNA”는 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 타겟 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 가장 바람직하게는 20 내지 70 염기이고, 타겟 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt)말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3 말단 돌출한 구조와 5 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하다. As used herein, the term “siRNA” refers to a short double-stranded RNA capable of inducing RNAi (RNA interference) through cleavage of a specific mRNA. It is composed of a sense RNA strand having a sequence homologous to the mRNA of the target gene and an antisense RNA strand having a sequence complementary thereto. The total length is 10 to 100 bases, preferably 15 to 80 bases, most preferably 20 to 70 bases, and if the expression of the target gene can be suppressed by the RNAi effect, the blunt end or cohesive Both ends are possible. The structure of the adhesive end can be a structure that protrudes at the 3 end and a structure which protrudes at the 5 end.

본 명세서에서 용어 “miRNA(microRNA)”는 세포내에서 발현되지 않는 올리고뉴클레오타이드로서 짧은 스템-루프 구조를 가지면서 타겟 유전자의 mRNA와 상보적인 결합을 통하여 타겟 유전자 발현을 억제하는 단일 가닥 RNA분자를 의미한다.As used herein, the term “miRNA (microRNA)” refers to a single-stranded RNA molecule that suppresses the expression of a target gene through complementary binding to the mRNA of the target gene while having a short stem-loop structure as an oligonucleotide that is not expressed in cells. do.

본 명세서에서 용어“리보자임(ribozyme)”은 RNA의 일종으로 특정한 RNA의 염기 서열을 인식하여 자체적으로 이를 절단하는 효소와 같은 기능을 가진 RNA 분자를 의미한다. 리보자임은 타겟 mRNA 가닥의 상보적인 염기서열로 특이성을 가지고 결합하는 영역과 타겟 RNA를 절단하는 영역으로 구성된다.In the present specification, the term "ribozyme" refers to an RNA molecule that has the same function as an enzyme that recognizes the base sequence of a specific RNA and cuts it by itself as a kind of RNA. Ribozyme is composed of a region that binds with specificity with a complementary nucleotide sequence of a target mRNA strand and a region that cleaves the target RNA.

본 명세서에서 용어“PNA(Peptide nucleic acid)”는 핵산과 단백질의 성질을 모두 가지면서 DNA 또는 RNA와 상보적으로 결합이 가능한 분자를 의미한다. PNA는 자연계에서는 발견되지 않고 인공적으로 화학적인 방법으로 합성되며, 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization)를 통해 이중가닥을 형성하여 타겟 유전자의 발현을 조절한다. In the present specification, the term "PNA (Peptide nucleic acid)" refers to a molecule capable of complementarily binding to DNA or RNA while having both the properties of nucleic acid and protein. PNA is not found in nature and is artificially synthesized by chemical methods, and it forms double strands through hybridization with natural nucleic acids of complementary nucleotide sequences to regulate the expression of target genes.

본 명세서에서 용어 “안티센스 올리고뉴클레오타이드”는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열로서 타겟 mRNA 내의 상보적 서열에 결합하여 이의 단백질로의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해하는 핵산 분자를 의미한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5(3):343-55, 1995). 올리고뉴클레오타이드 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당숄포네이 등으로 변형될 수 있다. As used herein, the term “antisense oligonucleotide” is a nucleotide sequence that is complementary to the sequence of a specific mRNA and binds to the complementary sequence in the target mRNA and translates it into a protein, translocation into the cytoplasm, maturation, or any other It refers to a nucleic acid molecule that inhibits essential activity for an overall biological function. Antisense oligonucleotides can be modified at the site of one or more bases, sugars or backbones to enhance efficacy (De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol. , 5(3):343-55, 1995). . The oligonucleotide skeleton may be modified with phosphorothioate, phosphotriester, methyl phosphonate, short-chain alkyl, cycloalkyl, short-chain heteroatomic, heterocyclic sugar scholphone, and the like.

본 발명에 따르면, 본 발명의 바이페린 억제제는 바이페린의 활성을 단백질 수준에서 저해하는 바이페린 특이적 항체일 수 있다. 바이페린을 특이적으로 인식하는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다.According to the present invention, the biperin inhibitor of the present invention may be a biperin-specific antibody that inhibits the activity of biperin at the protein level. Antibodies that specifically recognize biperin are polyclonal or monoclonal antibodies, preferably monoclonal antibodies.

본 발명의 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519 (1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,567호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; 및 Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984에 상세하게 기재되어 있다. Antibodies of the present invention are conventionally practiced in the art, for example, a fusion method (Kohler and Milstein, European Journal of Immunology , 6:511-519 (1976)), a recombinant DNA method (US Pat. No. 4,816,567). ) Or phage antibody library method (Clackson et al, Nature , 352:624-628 (1991) and Marks et al, J. Mol. Biol. , 222:58, 1-597 (1991)). . General procedures for antibody production are described in Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; And Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques , CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984.

본 발명은 항체 대신 바이페린에 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용하여 이의 활성을 억제할 수도 있다. 본 명세서에서 용어“앱타머”는 특정 표적물질에 높은 친화력과 특이성으로 결합하는 단일 줄기의(single-stranded) 핵산(RNA 또는 DNA) 분자 또는 펩타이드 분자를 의미한다. 앱타머의 일반적인 내용은 Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):426-30(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):14272-7(1998)에 상세하게 개시되어 있다.The present invention may inhibit its activity by using an aptamer that specifically binds to biperin instead of an antibody. In the present specification, the term "aptamer" refers to a single-stranded nucleic acid (RNA or DNA) molecule or a peptide molecule that binds to a specific target material with high affinity and specificity. The general description of aptamers is Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):426-30(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):14272-7(1998).

본 명세서에서 용어“대사질환”은 신진대사 이상을 원인으로 발생하는 각종 심혈관 질환과 제2형 당뇨병의 위험 요인들이 서로 군집을 이루는 현상을 한 가지 질환군으로 개념화시킨 것으로 인슐린 저항성 및 이와 관련된 복잡하고 다양한 여러 대사이상과 임상 양상을 모두 포괄하는 개념이다. In this specification, the term “metabolic disease” refers to a phenomenon in which risk factors for various cardiovascular diseases and type 2 diabetes, which occur due to metabolic abnormalities, cluster together as one disease group. Insulin resistance and related complex It is a concept that encompasses various metabolic abnormalities and clinical manifestations.

본 명세서에서 용어“비만(obesity)”은 장기간에 걸쳐 에너지 섭취량이 에너지 소비량을 초과하여 잉여 에너지가 지방으로 저장됨으로써 체내에 지방조직이 과다해지는 상태를 의미한다. 통상 체질량지수(Body mass index: 체중(kg)/[신장(m)]²)가 25 이상이면 임성적으로 비만으로 정의된다. As used herein, the term "obesity" refers to a state in which the amount of energy intake exceeds the amount of energy expenditure over a long period of time and excess energy is stored as fat, resulting in excess fat tissue in the body. Usually, if the body mass index (body mass index: weight (kg)/[height (m)] ² ) is 25 or more, it is defined as fertility obesity.

본 명세서에서 용어“당뇨”은 포도당-비관용(intolerance)을 초래하는 인슐린의 상대적 또는 절대적 부족으로 특징되는 만성질환을 의미한다. 본 발명의 조성물로 치료 또는 예방되는 당뇨는 모든 종류의 당뇨병을 포함하며, 예를 들어, 제1형 당뇨, 제2형 당뇨 및 유전성 당뇨를 포함한다. 제1형 당뇨는 인슐린 의존성 당뇨병으로서, β-세포의 파괴에 의해 주로 초래된다. 제2형 당뇨는 인슐린 비의존성 당뇨병으로서, 식사 후 불충분한 인슐린 분비에 의해 초래되거나 또는 인슐린 내성에 의해 초래된다.As used herein, the term “diabetes” refers to a chronic disease characterized by a relative or absolute lack of insulin causing glucose-intolerance. Diabetes treated or prevented by the composition of the present invention includes all types of diabetes, and includes, for example, type 1 diabetes, type 2 diabetes, and inherited diabetes. Type 1 diabetes is insulin dependent diabetes, which is mainly caused by the destruction of β-cells. Type 2 diabetes is insulin-independent diabetes, which is caused by insufficient insulin secretion after a meal or by insulin resistance.

본 명세서에서 용어“이상지방혈증(dyslipidemia)”은 혈액 내의 지방농도 수치가 정상범위 밖에 있는 병적 상태(pathologic condition)를 의미하며, 예를 들어 고콜레스테롤혈증, 고중성지방혈증, 저-HDL-콜레스테롤혈증 및 고-LDL-콜레스테롤혈증 외에도 지단백의 대사이상을 원인으로 하는 비정상적 지질상태를 모두 포함한다.As used herein, the term “dyslipidemia” refers to a pathologic condition in which the level of fat concentration in the blood is outside the normal range, for example, hypercholesterolemia, hypertriglyceridemia, low-HDL-cholesterol In addition to hyperemia and hyper-LDL-cholesterolemia, it includes all abnormal lipid states caused by abnormal metabolism of lipoproteins.

본 명세서에서 용어“지방간”은 간의 지방대사 장애로 지방이 간세포에 과도한 양으로 축적된 상태를 말하며, 이는 협심증, 심근경색, 뇌졸중, 동맥경화, 지방간 및 췌장염 등과 같은 다양한 질병의 원인이 된다.In the present specification, the term "fatty liver" refers to a state in which fat is accumulated in excessive amounts in hepatocytes due to a disorder of fat metabolism of the liver, which causes various diseases such as angina pectoris, myocardial infarction, stroke, arteriosclerosis, fatty liver and pancreatitis.

본 명세서에서 용어“인슐린 저항성”은 혈당을 낮추는 인슐린의 기능이 떨어져 세포가 포도당을 효과적으로 연소하지 못하는 상태를 의미한다. 인슐린 저항성이 높을 경우, 인체는 너무 많은 인슐린을 만들어 내고 이로 인해 고혈압이나 이상지방혈증은 물론 심장병, 당뇨병 등까지 초래할 수 있다. 특히 제2형 당뇨병에서는 근육과 지방조직에서 인슐린의 증가를 알아채지 못하여, 인슐린의 작용이 일어나지 않는다. 용어 “인슐린 저항성 증후군”은 상기 인슐린 저항성에 의하여 유발된 질환을 총칭하는 개념으로 인슐린 작용에 대한 세포의 저항성, 고인슐린혈증 및 초저밀도지단백(very low density lipoprotein, VLDL)과 중성지방의 증가, 고밀도지단백(high density lipoprotein, HDL)의 감소 및 고혈압 등을 특징으로 하는 질환을 의미하며, 심혈관질환과 제2형 당뇨병의 위험인자로 인식되고 있는 개념이다(Reaven GM, Diabetes, 37: 1595-607, (1988)). In the present specification, the term "insulin resistance" refers to a state in which the function of insulin to lower blood sugar decreases so that cells cannot effectively burn glucose. If insulin resistance is high, the human body makes too much insulin, which can lead to high blood pressure or dyslipidemia, as well as heart disease and diabetes. In particular, type 2 diabetes does not notice an increase in insulin in muscle and adipose tissue, so the action of insulin does not occur. The term “insulin resistance syndrome” is a generic term for diseases caused by the insulin resistance, and the resistance of cells to insulin action, hyperinsulinemia, and very low density lipoprotein (VLDL) and triglycerides increase, high density. It refers to a disease characterized by a decrease in high density lipoprotein (HDL) and high blood pressure, and is a concept recognized as a risk factor for cardiovascular disease and type 2 diabetes (Reaven GM, Diabetes, 37: 1595-607, (1988)).

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물로 예방 또는 치료되는 이상지방혈증은 고지혈증이다.According to a specific embodiment of the present invention, the dyslipidemia prevented or treated with the composition of the present invention is hyperlipidemia.

본 명세서에서 사용되는 용어“고지혈증”은 중성지방과 콜레스테롤 등의 지방대사가 제대로 이루어지지 않아 혈액 중에 높은 지질농도가 유지되어 유발되는 질환을 의미한다. 보다 구체적으로 고지혈증이란 혈액내의 중성지방, LDL 콜레테롤, 인지질 및 유리 지방산 등의 지질 성분이 증가된 상태로 발생빈도가 높은 고콜레스테롤혈증 또는 고중성지방혈증을 포함한다.The term "hyperlipidemia" as used herein refers to a disease caused by the maintenance of high lipid concentration in the blood due to inadequate metabolism of fats such as triglycerides and cholesterol. More specifically, hyperlipidemia includes hypercholesterolemia or hypertriglyceridemia with a high incidence of lipid components such as triglycerides, LDL cholesterol, phospholipids and free fatty acids in the blood.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물로 예방 또는 치료되는 지방간은 비알콜성 지방간이다.According to a specific embodiment of the present invention, the fatty liver prevented or treated with the composition of the present invention is non-alcoholic fatty liver.

본 명세서에서 용어“비알콜성 지방간(Non-alcoholic fatty liver, NAFL)”은 알콜의 흡수와 무관하게 간세포에 과도한 양의 지방이 축적되는 질환을 의미하고, 여기에는 단순지방간(steatosis)과 비알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)이 포함된다. 단순 지방간은 임상적으로 예후가 양호한 편이나, 염증 혹은 섬유화를 동반하는 NASH는 진행성 간질환으로 간경변 또는 간암을 유발하는 전구질환으로 인지되고 있다. 비만과 인슐린저항성은 대표적인 비알콜성 지방간질환의 위험인자이다. 간섬유증 진행의 위험인자로는 가령, 비만(BMI>30), 혈중 간기능지표 비율(AST/ALT >1) 및 당뇨를 들 수 있고, 특히 C형 간염 보균자가 비알콜지방간일 경우 간암까지 진행될 수 있다. 비알콜성 지방간 환자의 69-100%는 비만환자이고, 비만환자의 20-40%는 비알콜성 지방간을 동반하며, 특히 유럽, 미국, 아시아의 비만아동의 10~77%가 비알콜성 지방간 병변을 보이는데, 이는 비알콜성 간질환의 가장 중요한 위험인자가 비만이기 때문이다.As used herein, the term “Non-alcoholic fatty liver (NAFL)” refers to a disease in which excessive amounts of fat are accumulated in hepatocytes irrespective of alcohol absorption, and includes simple fatty liver (steatosis) and non-alcoholic These include non-alcoholic steatohepatitis (NASH). Simple fatty liver has a good clinical prognosis, but NASH with inflammation or fibrosis is recognized as a progressive liver disease and a precursor disease that causes cirrhosis or liver cancer. Obesity and insulin resistance are typical risk factors for non-alcoholic fatty liver disease. Risk factors for progression of hepatic fibrosis include obesity (BMI>30), blood liver function indicator ratio (AST/ALT>1), and diabetes.Especially, if the hepatitis C carrier is non-alcoholic fatty liver, it may progress to liver cancer. I can. 69-100% of patients with non-alcoholic fatty liver are obese, 20-40% of obese patients have non-alcoholic fatty liver, especially 10-77% of obese children in Europe, the United States, and Asia Lesions are shown, because obesity is the most important risk factor for non-alcoholic liver disease.

본 명세서에서 용어“예방”은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸릴 가능성이 있는 대상체에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다. In the present specification, the term “prevention” refers to suppressing the occurrence of a disease or disease in a subject that has not been diagnosed as having a disease or disease, but is likely to have such disease or disease.

본 명세서에서 용어“치료”는 (a) 질환, 질병 또는 증상의 발전의 억제; (b) 질환, 질병 또는 증상의 경감; 또는 (c) 질환, 질병 또는 증상을 제거하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물을 대상체에 투여하면 바이페린의 활성 또는 발현을 억제함으로써 열생성 및 지방 소모를 유도하여, 과도한 지방의 축적으로 인한 대사질환 증상의 발전을 억제하거나, 이를 제거하거나 또는 경감시키는 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 그 자체로 이들 질환 치료의 조성물이 될 수도 있고, 혹은 다른 약리성분과 함께 투여되어 상기 질환에 대한 치료 보조제로 적용될 수도 있다. 이에, 본 명세서에서 용어“치료”또는“치료제”는“치료 보조”또는“치료 보조제”의 의미를 포함한다. As used herein, the term “treatment” refers to (a) inhibition of the development of a disease, disease or condition; (b) alleviation of the disease, disease or condition; Or (c) to eliminate the disease, disease or condition. When the composition of the present invention is administered to a subject, it inhibits the activity or expression of biperin, thereby inducing heat generation and fat consumption, thereby inhibiting the development of metabolic disease symptoms due to excessive fat accumulation, eliminating or alleviating it. do. Accordingly, the composition of the present invention may itself be a composition for treatment of these diseases, or may be administered together with other pharmacological components and applied as a therapeutic adjuvant for the disease. Accordingly, the term “treatment” or “therapeutic agent” in this specification includes the meaning of “treatment aid” or “treatment aid”.

본 명세서에서 용어“투여”또는“투여하다”는 본 발명의 조성물의 치료적 유효량을 대상체에 직접적으로 투여함으로써 대상체의 체내에서 동일한 양이 형성되도록 하는 것을 말한다.In the present specification, the term “administration” or “administer” refers to the formation of the same amount in the body of the subject by directly administering a therapeutically effective amount of the composition of the present invention to the subject.

본 발명에서 용어“치료적 유효량”은 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하고자 하는 개체에게 조성물 내의 약리성분이 치료적 또는 예방적 효과를 제공하기에 충분한 정도로 함유된 조성물의 함량을 의미하며, 이에“예방적 유효량”을 포함하는 의미이다. In the present invention, the term "therapeutically effective amount" refers to the amount of the composition contained in a sufficient degree to provide a therapeutic or prophylactic effect to the individual who intends to administer the pharmaceutical composition of the present invention. It is meant to include “prophylactically effective amount”.

본 명세서에서 용어“대상체”는 제한없이 인간, 마우스, 래트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 비비 또는 붉은털 원숭이를 포함한다. 구체적으로는, 본 발명의 대상체는 인간이다. As used herein, the term “subject” includes, without limitation, human, mouse, rat, guinea pig, dog, cat, horse, cow, pig, monkey, chimpanzee, baboon or rhesus monkey. Specifically, the subject of the present invention is a human.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 Ucp1, Pgc1α, Cidea, Pparα, Pparβ/δ, Cpt1, 아디포넥틴, Fabp4 및 C/ebpα로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현을 증가시킨다.According to a specific embodiment of the present invention, the composition of the present invention increases the expression of one or more genes selected from the group consisting of Ucp1 , Pgc1α , Cidea, Pparα, Pparβ/δ , Cpt1 , adiponectin, Fabp4 and C/ebpα .

본 명세서에서 용어“발현의 증가”는 상기 나열된 유전자의 발현 정량값이 본 발명의 바이페린 억제제를 투여하지 않은 대조군에 비하여 측정 가능할 정도로 증가한 경우를 의미하며, 구체적으로는 대조군에 비해 발현량이 110% 이상인 경우를 의미하고, 보다 구체적으로는 120% 이상인 경우를 의미하며, 가장 구체적으로는 130% 이상인 경우를 의미한다.In the present specification, the term “increased expression” refers to a case where the quantified value of the expression of the genes listed above is measurably increased compared to the control group to which the biperin inhibitor of the present invention is not administered, and specifically, the expression level is 110% compared to the control It means the case of the above, more specifically, the case of 120% or more, and most specifically, the case of 130% or more.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 아드레날린 신호 경로 활성화제를 추가적인 유효성분으로 포함한다. According to a specific embodiment of the present invention, the composition of the present invention comprises an adrenaline signaling pathway activator as an additional active ingredient.

후술하는 실시예에서 보는 바와 같이, 본 발명의 바이페린 억제제는 아드레날린 신호 경로를 경유하여 지방산 β-산화와 지방조직에서의 열생성 및 이에 따른 지방량의 감소를 유도하며, 바이페린을 억제하는 동시에 아드레날린 신호 경로를 활성화시킬 경우 이러한 지방 감소 효과는 더욱 증가하였다. 따라서 아드레날린 신호 경로 활성화제는 대사질환의 예방 또는 치료를 위해 병용 투여되는 보조적 유효성분으로서 이용될 수 있다. As shown in the examples to be described later, the biperine inhibitor of the present invention induces fatty acid β-oxidation, heat production in adipose tissue, and thus a decrease in fat mass via an adrenergic signaling pathway, and inhibits biperin and at the same time adrenaline. When the signaling pathway was activated, this fat reduction effect was further increased. Therefore, the adrenaline signaling pathway activator can be used as an auxiliary active ingredient that is administered in combination for the prevention or treatment of metabolic diseases.

구체적으로는, 상기 아드레날린 신호 경로 활성화제는 β3-아드레날린 수용체(ADRB3) 아고니스트이며, 보다 구체적으로는 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:Specifically, the adrenergic signaling pathway activator is a β3-adrenergic receptor (ADRB3) agonist, and more specifically, a compound represented by the following formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof:

화학식 1Formula 1

상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 CL-316243 (5-[(2R)-2-[[(2R)-2-(3-클로로페닐)-2-하이드록시에틸]아미노]프로필]-1,3-벤조디옥솔-2,2-디카복실산)이다.The compound represented by Formula 1 is CL-316243 (5-[(2R)-2-[[(2R)-2-(3-chlorophenyl)-2-hydroxyethyl]amino]propyl]-1,3 -Benzodioxole-2,2-dicarboxylic acid).

본 명세서에서 용어“약제학적으로 허용되는 염”은 약학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다. 적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 트리플루로초산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등을 들 수 있다. 적합한 염기로부터 유도된 염은 나트륨 등의 알칼리 금속, 마그네슘 등의 알칼리 토금속, 및 암모늄 등을 포함할 수 있다. 구체적으로는, 본 발명에서 사용되는 약제학적으로 허용되는 염은 나트륨염이다.In the present specification, the term “pharmaceutically acceptable salt” includes salts derived from pharmaceutically acceptable inorganic acids, organic acids, or bases. Examples of suitable acids are hydrochloric acid, bromic acid, sulfuric acid, nitric acid, perchloric acid, fumaric acid, maleic acid, phosphoric acid, glycolic acid, lactic acid, salicylic acid, succinic acid, toluene-p-sulfonic acid, tartaric acid, acetic acid, trifluroacetic acid, citric acid, methane And sulfonic acid, formic acid, benzoic acid, malonic acid, naphthalene-2-sulfonic acid, and benzenesulfonic acid. Salts derived from suitable bases may include alkali metals such as sodium, alkaline earth metals such as magnesium, and ammonium and the like. Specifically, the pharmaceutically acceptable salt used in the present invention is a sodium salt.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.When the composition of the present invention is prepared as a pharmaceutical composition, the pharmaceutical composition of the present invention includes a pharmaceutically acceptable carrier.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical composition of the present invention are commonly used at the time of formulation, and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, gum acacia, calcium phosphate, alginate, gelatin, Calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, etc. It does not become. The pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, and the like in addition to the above components. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 구체적으로는 경구, 정맥, 피하 또는 복강 투여될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and specifically, may be administered orally, intravenously, subcutaneously or intraperitoneally.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다.A suitable dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is formulated in various ways depending on factors such as formulation method, mode of administration, age, weight, sex, pathological condition, food, administration time, route of administration, excretion rate, and response sensitivity. Can be. The preferred dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is in the range of 0.001-100 mg/kg on an adult basis.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention is prepared in unit dosage form by formulating using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily carried out by a person having ordinary knowledge in the art. Or it can be made by incorporating it into a multi-dose container. At this time, the formulation may be in the form of a solution, suspension, syrup, or emulsion in an oil or aqueous medium, or in the form of an extract, powder, powder, granule, tablet or capsule, and may additionally include a dispersant or a stabilizer.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 비만, 당뇨, 이상지방혈증(dyslipidemia), 지방간 및 인슐린 저항성 증후군(insulin resistance syndrome)으로 구성된 군으로부터 선택되는 대사질환(metabolic disorder)의 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다:According to another aspect of the present invention, the present invention relates to a metabolic disorder selected from the group consisting of obesity, diabetes, dyslipidemia, fatty liver and insulin resistance syndrome, comprising the following steps: It provides a method for screening a composition for prophylaxis or treatment:

(a) 바이페린(viperin)을 포함하는 생물학적 시료에 후보물질을 접촉시키는 단계; (a) contacting a candidate substance with a biological sample containing viperin;

(b) 상기 시료 내 바이페린의 활성 또는 발현량을 측정하는 단계, (b) measuring the activity or expression level of biperine in the sample,

상기 바이페린의 활성 또는 발현량이 감소한 경우, 상기 후보물질은 대사질환의 예방 또는 치료용 조성물로 판정한다. When the activity or expression level of the biperine decreases, the candidate substance is determined as a composition for preventing or treating metabolic diseases.

본 발명에서 지시하는“대사질환”의 의미에 대해서는 이미 상술하였으므로 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.Since the meaning of “metabolic disease” indicated in the present invention has already been described above, description thereof will be omitted to avoid excessive redundancy.

본 발명에서 용어“생물학적 시료”는 인간을 포함한 포유동물로부터 얻어지는, 바이페린을 발현하는 세포를 포함하고 있는 모든 시료로서, 조직, 기관, 세포 또는 세포 배양액을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로는, 본 발명에서 이용되는 생물학적 시료는 간 조직, 심장 조직, 지방 조직, 이들로부터 유래한 세포 및 세포 배양액으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함한다. In the present invention, the term "biological sample" is any sample containing cells expressing biperin obtained from mammals including humans, and includes, but is not limited to, tissues, organs, cells, or cell culture. Specifically, the biological sample used in the present invention includes any one or more selected from the group consisting of liver tissue, heart tissue, adipose tissue, cells derived therefrom, and cell culture fluid.

본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 “시험물질”은 바이페린을 발현하는 세포를 포함하는 시료에 첨가되어 바이페린의 활성 또는 발현량에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시험물질은 화합물, 뉴클레오타이드, 펩타이드 및 천연 추출물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 시험물질을 처리한 생물학적 시료에서 바이페린의 발현량 또는 활성을 측정하는 단계는 당업계에 공지된 다양한 발현량 및 활성 측정방법에 의해 수행될 수 있다. 측정 결과, 바이페린의 발현량 또는 활성이 감소한 경우 상기 시험물질은 대사질환의 예방 또는 치료용 조성물로 판정될 수 있다.The term “test substance” used while referring to the screening method of the present invention is an unknown used in screening to examine whether it is added to a sample containing biperin-expressing cells and affects the activity or expression level of biperin. Means the substance of. The test substances include, but are not limited to, compounds, nucleotides, peptides, and natural extracts. The step of measuring the expression level or activity of biperin in a biological sample treated with the test substance may be performed by various methods for measuring expression level and activity known in the art. As a result of the measurement, when the expression level or activity of biperine is decreased, the test substance may be determined as a composition for preventing or treating metabolic diseases.

본 명세서에서 용어“발현의 감소”는 대상체 내에서 바이페린에 의한 열생성 및 지방분해의 억제활성이 유의하게 저해되어 대사질환 증상의 개선 및 회복에 이를 정도로 바이페린의 발현량이 감소하는 것을 의미한다. 구체적으로는 대조군에 비하여 활성 또는 발현량이 20% 이상 감소한 상태, 보다 구체적으로는 30% 이상 감소한 상태, 더욱 구체적으로는 40% 이상 감소한 상태를 의미할 수 있다.In the present specification, the term "reduction in expression" means that the amount of expression of biperin decreases to the extent that the inhibition of heat production and lipolysis by biperine is significantly inhibited in the subject, leading to improvement and recovery of metabolic disease symptoms. . Specifically, it may mean a state in which the activity or expression level is reduced by 20% or more, more specifically, by 30% or more, and, more specifically, by 40% or more compared to the control group.

본 명세서에서 용어“활성의 감소”란 대조군에 비하여 바이페린 단백질의 생체내 고유한 기능이 측정 가능할 정도로 유의하게 감소하는 것을 말하며, 구체적으로는 대사질환 증상의 개선 및 회복에 이를 정도로 바이페린의 활성이 감소하는 것을 말한다. 활성(activity)의 감소는 단순한 기능(function)의 감소 뿐 아니라 안정성(stability)의 감소로 기인한 궁극적인 활성 저해를 포함한다.In the present specification, the term “reduction in activity” refers to a significant decrease in the intrinsic function of biperine protein in vivo compared to the control group, and specifically, the activity of biperin to the extent that it leads to improvement and recovery of metabolic disease symptoms. It says that it decreases. Reduction in activity includes not only a simple decrease in function, but also the ultimate inhibition of activity due to a decrease in stability.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:

(a) 본 발명은 대사질환(metabolic disorder)의 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 스크리닝 방법을 제공한다.(a) The present invention provides a composition for preventing or treating metabolic disorders and a screening method thereof.

(b) 본 발명은 지방 조직에서의 열생성과 대사활성을 현저히 증가시켜 체내 지방의 급격한 감소를 야기함으로써, 비만을 비롯한 다양한 대사증후군의 효율적인 치료 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.(b) The present invention can be usefully used as an effective therapeutic composition for various metabolic syndromes, including obesity, by remarkably increasing heat production and metabolic activity in adipose tissue, thereby causing a rapid decrease in body fat.

도 1은 지방 조직에서 바이페린의 내재적 발현이 대사 및 열생성을 조절함을 보여주는 그림이다. 도 1a는 SPF 및 GF 마우스의 다양한 조직에서의 바이페린 발현을 보여준다. 도 1b는 WT 및 바이페린 KO 마우스의 지방 조직인 eWAT, iWAT 및 BAT의 육안 형태를 나타낸다. WT 및 바이페린 KO 마우스에 15주령부터 30주령까지 RC 또는 HFD를 먹이고(15 주간 섭식) 체중(n=4-7)(도 1c), 신체 조성(n=4-7)(도 1d), 지방 조직의 바이페린 발현(n=3)(도 1e), 지방 조직과 간에서의 대표적인 H&E-염색 이미지(스케일바: 200μm)(도 1f); 혈청 대사체(HDLC, TG, TCHO 및 GLU), AST 및 ALT(n = 4-7)(도 1g); 복강 글루코스 내성(n = 7-8)(도 1h); 및 열생성율(n = 4-7; 간접 열량측정)(도 1i)을 조사한 결과를 각각 나타낸다. 데이터는 생물학적으로 독립적인 시료들의 평균±표준오차로 나타냈다. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 vs. WT.
도 2는 바이페린 결핍이 지방조직에서의 열생성-관련 유전자 및 단백질의 발현을 촉진시킴을 보여주는 그림이다. RC 또는 HFD를 15주간 먹인 WT 및 바이페린 KO 마우스에서 지방 조직을 분리하였다. 도 2a는 지방 조직에서 열생성 및 지방산 β-산화 관련 유전자의 상대적인 mRNA 수준을 보여준다(n=6). 도 2b는 BAT에서 바이페린 및 UCP1의 단백질 발현을 나타낸다(n=3). 도 2c는 지방 조직에서 UCP1에 대한 면역조직화학 염색결과를 보여준다(스케일바:200μm). 도 2d는 지방 조직의 면역형광 염색 결과를 나타낸다. DAPI, 핵(파란색); 바이페린(녹색); MFN-1, 미토콘드리아 마커(붉은색). 화살표는 미토콘드리아에 위치한 바이페린을 가리킨다(스케일바:50 μm). 데이터는 생물학적으로 독립적인 시료들의 평균±표준오차로 나타냈다. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001 vs. WT.
도 3은 바이페린 결핍이 열생성을 촉진하고 저온 내성을 가져옴을 보여주는 그림이다. 도 3a는 7일간의 저온 노출기간 동안 21주령 WT 및 바이페린 KO 마우스의 직장 온도를 보여준다(n=4-7). 만성적인 저온에 노출시킨 WT 및 바이페린 KO 마우스에서의 지방조직의 총중량(n=4-7)(도 3b), 지방조직에서 열생성 및 지방산 β-산화 관련 유전자의 상대적인 mRNA 수준(n=4-7)(도 3c), BAT에서 바이페린 및 UCP1의 단백질 발현(n=3)(도 3d) 및 지방 조직에서 UCP1에 대한 면역조직화학 염색 결과(스케일바: 200μm)(도 3e)를 각각 나타내었다.
도 4는 ADRB3 아고니스트가 바이페린 KO 마우스에서 열발생 표현형을 촉진함으로 보여주는 그림이다. WT 및 바이페린 KO 마우스에 CL-316243 및 ADRB3 아고니스트를 복강(1mg/kg 체중/일)으로 3일간 투여하였다. CL-처리 마우스에 대해서, 도 4a는 열생성률(n = 6; 간접 열량측정), 도 4b는 복강 글루코스 내성(n = 6), 도 4c는 지방 조직의 총중량(n = 6), 도 4d는 지방 조직에서의 열생성- 및 지방산 β-산화-관련 유전자의 상대적인 mRNA 수준(n = 6), 도 4e는 iWAT에서의 바이페린과 UCP1의 단백질 발현 수준(n = 3), 그리고 도 4f는 지방 조직의 UCP1에 대한 면역조직화학 염색 결과(스케일바: 200μm)를 각각 나타낸다. 데이터는 생물학적으로 독립적인 시료들의 평균±표준오차로 나타냈다. *P<0.05; **P<0.001 vs. WT.
도 5는 바이페린이 지방세포-자율적으로 지방산 β 산화-매개 열생성을 조절함을 보여주는 그림이다. SVF를 BAT로부터 분리한 뒤 성숙한 갈색 지방세포로 분화시켰다. 도 5a는 분화하는 동안 갈색 지방세포에서의 지방생성-, 열생성- 및 지방산 β-산화-관련 유전자의 상대적인 mRNA 수준을 나타낸다. 도 5b 및 5c는 CL-처리된 갈색 지방세포(도 5b) 및 ETO(에토목실; 좌측)- 또는 RAN(라노라진; 우측)-처리된 갈색 지방세포(도 5c)에서의 열생성-관련 유전자의 상대적인 mRNA 수준을 각각 보여준다. 도 5d는 CL 처리(상단) 또는 ETO 처리(하단) 후 WT 및 바이페린 KO 갈색 지방세포에서의 OCR 및 미토콘드리아 파라미터(기저 호흡, ATP 생성, 양이온 누출 및 최대 호흡)를 보여준다. 데이터는 2개의 독립적인 실험값에 대한 평균±표준오차로 나타냈다. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001 vs. WT.
도 6은 15주령부터 30주령까지 RC 또는 HFD를 먹인(15주간 섭식) 중간 연령 WT 및 바이페린 KO 마우스의 표현형을 보여주는 그림이다. 각각 기관 무게(n=4-7)(도 6a), 지방 조직(eWAT, iWAT 및 BAT)과 간 조직 단면의 H&E 염색을 통해 관찰한 지방세포와 간 지질방울 크기(n=4-7)(도 6b), 산소 소모율(VO₂), 이산화탄소 생성율(VCO₂), 음식 섭취율, 활동성 및 호흡 교환비(RER)(n=4-7;간접 열량측정)(도 6c)를 보여준다. 데이터는 생물학적으로 독립적인 시료들의 평균±표준오차로 나타냈다 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001vs.
도 7는 RC 또는 HFD를 6주령에서 21주령까지 먹인(15주간 섭식) 어린 WT 및 바이페린 KO 마우스의 표현형을 보여주는 그림으로, 체중(n=3-6)(도 7a), 신체 조성(n=3-6)(도 7b), 혈청 대사체(HDLC, TG, TCHO 및 GLU)(n=3-6)(도 7c), 기관 무게(n=3-6)(도 7d), 지방 조직과 간에서의 대표적인 H&E-염색 이미지(스케일바: 200μm)(도 7e), VO₂, VCO₂, 음식 섭취율, 활동성 및 호흡 교환비(n=3-6)(도 7f)를 각각 보여준다. 데이터는 생물학적으로 독립적인 시료들의 평균±표준오차로 나타냈다. *P<0.05, **P<0.01 and ***P<0.001 vs. WT
도 8은 RC 또는 HFD를 단기간 동안 먹인 중간 연령 WT 및 바이페린 KO 마우스의 표현형을 보여주는 그림이다. WT 및 바이페린 KO 마우스에 RC 또는 HFD를 16주령에서 20주령까지 먹였다(4주간 섭식). 도 8a는 체중변화를(n=5-7), 도 8b는 신체 조성을(n=5-7), 도 8c는 혈청 대사체(HDLC, TG, TCHO 및 GLU)를(n=5-7), 도 8d는 기관 무게를(n=5-7), 도 8e는 VO₂, VCO₂, 음식 섭취율, 활동성 및 호흡 교환비(n=5-7)(도 8e)를 각각 나타낸다. 데이터는 생물학적으로 독립적인 시료들의 평균±표준오차로 나타냈다.
도 9는 RC 또는 HFD를 장기간 동안 먹인 어린 마우스의 지방조직에서 열생성-관련 유전자의 발현을 보여주는 그림이다. WT 및 바이페린 KO 마우스에 RC 또는 HFD를 6주령에서 21주령까지 먹였다(15주간 섭식). RC(도 9a) 또는 HFD(도 9b)를 먹인 마우스의 지방조직에서 열생성- 및 지방산 β-산화 관련 유전자의 상대적인 mRNA 수준을 각각 타나낸다(n=3-4). 데이터는 생물학적으로 독립적인 시료들의 평균±표준오차로 나타냈다. *P<0.05,**P<0.01, ***P<0.001 vs. WT.
도 10은 RC 또는 HFD를 단기간 동안 먹인 중간 연령 마우스의 지방조직에서 열생성-관련 유전자의 발현을 보여주는 그림이다. WT 및 바이페린 KO 마우스에 RC 또는 HFD를 16주령에서 20주령까지 먹였다(4주간 섭식). RC(도 10a) 또는 HFD(도 10b)를 먹인 마우스의 지방조직에서 열생성- 및 지방산 β-산화 관련 유전자의 상대적인 mRNA 수준을 각각 타나낸다(n=3-4). 데이터는 생물학적으로 독립적인 시료들의 평균±표준오차로 나타냈다. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs. WT.
도 11은 RC 또는 HFD를 장기간 먹인 중간 연령 마우스의 지방조직에서 사이토카인 발현을 관찰한 결과이다. WT 및 바이페린 KO 마우스를 RC 또는 HFD를 15주령에서 30주령까지 먹였다(15주간 섭식). 도 11a는 지방조직에서 바이페린에 대한 면역조직화학 염색 결과를 나타내며(스케일바:200μm), 도 11b는 지방조직의 면역형광 염색 결과를 보여준다. DAPI, 핵(blue); 바이페린(파란색); F4/80, 대식세포 마커(붉은색). 화살표는 대식세포에 위치한 바이페린을 가리킨다. 닫힌 화살표 머리는 바이페린을, 열린 화살표 머리는 대식세포를 각각 나타낸다. 도 11c 및 d는 RC를 먹인 마우스(도 11c)와 HFD를 먹인 마우스(도 11d)의 지방조직에서 사이토카인의 상대적인 mRNA 수준을 각각 나타낸다(n=3-4). 데이터는 생물학적으로 독립적인 시료들의 평균±표준오차로 나타냈다. *P<0.05 vs. WT.
도 12은 CL 처리 후 WT 및 바이페린 KO 마우스의 대사 표현형을 보여주는 그림이다. 21주령의 WT 및 바이페린 KO 마우스에 β3-아드레날린 수용체(ADRB3)-아고니스트인 CL-316243을 3일간 복강투여(1mg/kg 체중/일)하고 VO₂, VCO₂, 음식 섭취율, 활동성 및 호흡 교환비(n=6, 간접 열량측정)를 측정하였다. 데이터는 생물학적으로 독립적인 시료들의 평균±표준오차로 나타냈다. *P<0.05 vs. WT
도 13은 저온 노출 또는 CL를 처리한 뒤 HFD를 먹인 WT 및 바이페린 KO 마우스의 열발생 표현형을 보여주는 그림이다. WT 및 바이페린 KO 마우스에 HFD를 6주령부터 21주령까지 먹였다(15주간 섭식). 7일간 저온 노출된 21주령 마우스의 직장 온도를(n=4-5)(도 13a), BAT(n=3)에서 바이페린 및 UCP1의 발현을(도 13b), 지방조직에서 UCP1에 대한 면역조직화학 염색 결과를(도 13c) 각각 나타내었다. HFD을 먹인 21주령 WT 및 바이페린 KO 마우스에 CL-316243을 3일간 복강투여(1mg/kg 체중/일)한 뒤, 글루코스 내성을 측정하고(도 13d), iWAT과 BAT에서의 바이페린 및 UCP1 단백질의 발현을 각각 측정하며(n=3)(도 13e 및 도 13f)(n=3), 지방조직에서의 UCP1에 대한 면역조직화학 염색을 수행하였다(도 13g)(스케일바:200μm). 데이터는 생물학적으로 독립적인 시료들의 평균±표준오차로 나타냈다. *P<0.05 및 **P<0.01 vs. WT.
도 14는 HFD 섭식 및/또는 저온 노출 후 WT 마우스의 갈색 지방조직에서의 바이페린 발현수준을 비교한 결과를 보여준다. WT 마우스에 RC 또는 HFD를 15주간 먹이거나 또는 저온상태에 7일간 노출시킨 후 BAT에서의 단백질 발현을 측정하였다(n=3). 데이터는 생물학적으로 독립적인 시료들의 평균±표준오차로 나타냈다.
도 15은 갈색 지방세포에서 바이페린의 세포 자율기능(Cell-autonomous function)을 보여주는 그림이다. BAT으로부터 SVF를 분리하여 성숙 갈색 지방세포로 분화시켰다. 도 15a는 분화하는 동안 갈색 지방세포에서 지방생성 및 열생성-관련 유전자의 상대적인 RNA 수준을 나타낸다. 도 15b는 분리된 SVF 및 SVF-분화된 갈색 지방세포에서 사이토카인의 상대적 mRNA 수준을 나타낸다. 데이터는 2개의 독립적인 실험값에 대한 평균±표준오차로 나타냈다. *P<0.05, **P<0.01 및 ***P<0.001 vs. WT.
도 16은 백색 지방세포에서 바이페린의 세포 자율기능(Cell-autonomous function)을 보여주는 그림이다. eWAT으로부터 SVF를 분리하여 성숙 백식 지방세포로 분화시켰다. 도 16a는 분화하는 동안 백색 지방세포에서 지방생성 및 열생성-관련 유전자의 상대적인 mRNA 수준을 나타낸다. 도 16b는 ETO(에토목실)- 또는 RAN(라노라진)을 처리한 백색 지방세포에서의 바이페린 및 UCP1의 상대적인 mRNA 수준을 나타낸다. 데이터는 2개의 독립적인 실험값에 대한 평균±표준오차로 나타냈다. *P<0.05, **P<0.01 및 ***P<0.001 vs. WT1 is a diagram showing that the intrinsic expression of biperin in adipose tissue regulates metabolism and heat production. 1A shows biperine expression in various tissues of SPF and GF mice. 1B shows the macroscopic morphology of eWAT, iWAT and BAT, which are adipose tissues of WT and biperin KO mice. WT and biperine KO mice were fed RC or HFD from 15 weeks of age to 30 weeks of age (15 weeks of feeding) and body weight (n=4-7) (Figure 1c), body composition (n=4-7) (Figure 1d), Biperin expression in adipose tissue (n=3) (Fig. 1E), representative H&E-stained images in adipose tissue and liver (scale bar: 200 μm) (Fig. 1F); Serum metabolites (HDLC, TG, TCHO and GLU), AST and ALT (n = 4-7) (FIG. 1G ); Peritoneal glucose tolerance (n = 7-8) (Fig. 1H); And the results of examining the heat generation rate (n = 4-7; indirect calorimetry) (Fig. 1i), respectively. Data are expressed as the mean±standard error of biologically independent samples. *P <0.05; **P <0.01; ***P <0.001 vs. WT.
2 is a diagram showing that biperine deficiency promotes the expression of thermogenic-related genes and proteins in adipose tissue. Adipose tissue was isolated from WT and biperine KO mice fed RC or HFD for 15 weeks. 2A shows the relative mRNA levels of genes related to thermogeneration and fatty acid β-oxidation in adipose tissue (n=6). Figure 2b shows the protein expression of biperin and UCP1 in BAT (n=3). 2C shows the results of immunohistochemical staining for UCP1 in adipose tissue (scale bar: 200 μm). 2D shows the results of immunofluorescence staining of adipose tissue. DAPI, nucleus (blue); Biperine (green); MFN-1, mitochondrial marker (red). Arrows point to biperine located in the mitochondria (scale bar: 50 μm). Data are expressed as the mean±standard error of biologically independent samples. *P<0.05;**P<0.01;***P<0.001 vs. WT.
3 is a diagram showing that biperine deficiency promotes heat generation and results in low temperature tolerance. Figure 3a shows the rectal temperature of 21-week-old WT and biperine KO mice during a 7-day cold exposure period (n=4-7). Total weight of adipose tissue in WT and biperine KO mice exposed to chronic low temperature (n=4-7) (Fig.3b), relative mRNA levels of genes related to thermogenic and fatty acid β-oxidation in adipose tissue (n=4 -7) (Fig. 3c), protein expression of biperin and UCP1 in BAT (n = 3) (Fig. 3d) and immunohistochemical staining results for UCP1 in adipose tissue (scale bar: 200 μm) (Fig. 3e), respectively. Indicated.
4 is a diagram showing that the ADRB3 agonist promotes the thermogenic phenotype in biperine KO mice. CL-316243 and ADRB3 agonist were administered intraperitoneally (1 mg/kg body weight/day) to WT and biperine KO mice for 3 days. For CL-treated mice, Figure 4a is the rate of heat production (n = 6; indirect calorimetry), Figure 4b is peritoneal glucose tolerance (n = 6), Figure 4c is the total weight of adipose tissue (n = 6), Figure 4d is Relative mRNA levels of thermogenic- and fatty acid β-oxidation-related genes in adipose tissue (n = 6), Figure 4e is the protein expression levels of biperine and UCP1 in iWAT (n = 3), and Figure 4f is fat The results of immunohistochemical staining for the tissue UCP1 (scale bar: 200 μm) are shown, respectively. Data are expressed as the mean±standard error of biologically independent samples. *P<0.05;**P<0.001 vs. WT.
5 is a diagram showing that biperin regulates fat cell-autonomous fatty acid β oxidation-mediated heat production. SVF was isolated from BAT and then differentiated into mature brown adipocytes. 5A shows the relative mRNA levels of adipogenesis-, thermogenic- and fatty acid β-oxidation-related genes in brown adipocytes during differentiation. 5B and 5C show thermogenic-related genes in CL-treated brown adipocytes (FIG. 5B) and ETO (ethomoxil; left)- or RAN (ranorazine; right)-treated brown adipocytes (FIG. 5C). Shows the relative mRNA levels of each. Figure 5d shows OCR and mitochondrial parameters (basal respiration, ATP production, cation leakage and maximal respiration) in WT and biperine KO brown adipocytes after CL treatment (top) or ETO treatment (bottom). Data are expressed as the mean±standard error for two independent experimental values. *P<0.05;**P<0.01;***P<0.001 vs. WT.
Figure 6 is a picture showing the phenotype of middle-aged WT and biperine KO mice fed with RC or HFD from 15 weeks to 30 weeks of age (15 weeks of feeding). Each organ weight ( n = 4-7) (Fig.6a), adipose tissue (eWAT, iWAT, and BAT) and the size of adipose cells and liver lipid droplets ( n = 4-7) observed through H&E staining of sections of liver tissue ( 6b), oxygen consumption rate (VO ₂ ), carbon dioxide production rate (VCO ₂ ), food intake rate, activity and respiratory exchange rate (RER) ( n = 4-7; indirect calorimetry) (FIG. 6c ). Data are expressed as the mean ± standard error of biologically independent samples * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001vs.
Figure 7 is a picture showing the phenotype of young WT and biperine KO mice fed RC or HFD from 6 weeks to 21 weeks of age (15 weeks of feeding), body weight ( n = 3-6) (Figure 7a), body composition ( n =3-6) (Figure 7b), serum metabolites (HDLC, TG, TCHO and GLU) ( n =3-6) (Figure 7c), organ weight ( n =3-6) (Figure 7d), adipose tissue Representative H&E-staining images in the liver and (scale bar: 200 μm) (Fig. 7e), VO ₂ , VCO ₂ , food intake rate, activity and respiratory exchange ratio ( n = 3-6) (Fig. 7f) are shown, respectively. Data are expressed as the mean±standard error of biologically independent samples. * P <0.05, ** P <0.01 and *** P <0.001 vs. WT
FIG. 8 is a diagram showing the phenotype of middle-aged WT and biperine KO mice fed RC or HFD for a short period of time. WT and biperine KO mice were fed either RC or HFD from 16 to 20 weeks of age (4 weeks of feeding). Figure 8a shows the body weight change ( n =5-7), Figure 8b shows the body composition ( n =5-7), Figure 8c shows the serum metabolites (HDLC, TG, TCHO and GLU) ( n =5-7) , Figure 8d shows organ weight ( n =5-7), Figure 8e shows VO ₂ , VCO ₂ , food intake rate, activity and respiratory exchange ratio ( n =5-7) (Figure 8e), respectively. Data are expressed as the mean±standard error of biologically independent samples.
9 is a diagram showing the expression of thermogenic-related genes in adipose tissue of young mice fed with RC or HFD for a long period of time. WT and biperine KO mice were fed either RC or HFD from 6 to 21 weeks of age (15 weeks of feeding). Relative mRNA levels of thermogenic- and fatty acid β-oxidation-related genes in adipose tissue of mice fed with RC (Fig. 9a) or HFD (Fig. 9b) are shown, respectively ( n = 3-4). Data are expressed as the mean±standard error of biologically independent samples. * P <0.05,** P <0.01, *** P <0.001 vs. WT.
10 is a diagram showing the expression of thermogenic-related genes in adipose tissue of middle-aged mice fed with RC or HFD for a short period of time. WT and biperine KO mice were fed either RC or HFD from 16 to 20 weeks of age (4 weeks of feeding). Relative mRNA levels of thermogenic- and fatty acid β-oxidation-related genes in adipose tissue of mice fed with RC (Fig. 10a) or HFD (Fig. 10b) are shown, respectively ( n = 3-4). Data are expressed as the mean±standard error of biologically independent samples. * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001 vs. WT.
Figure 11 This is the result of observing cytokine expression in adipose tissue of middle-aged mice fed with RC or HFD for a long time. WT and biperine KO mice were fed either RC or HFD from 15 to 30 weeks of age (15 weeks of feeding). Figure 11a It shows the results of immunohistochemical staining for biperin in adipose tissue (scale bar: 200 μm), and FIG. 11B shows the results of immunofluorescence staining for adipose tissue. DAPI, nucleus (blue); Biperine (blue); F4/80, macrophage marker (red). Arrows point to biperine located in macrophages. Closed arrow heads represent biperine and open arrow heads represent macrophages. Figures 11c and d show the relative mRNA levels of cytokines in adipose tissues of mice fed with RC (Figure 11c) and mice fed with HFD (Figure 11d), respectively ( n = 3-4). Data are expressed as the mean±standard error of biologically independent samples. * P <0.05 vs. WT.
12 is It is a figure showing the metabolic phenotype of WT and biperine KO mice after CL treatment. Intraperitoneal administration of β3-adrenergic receptor (ADRB3)-agonist CL-316243 to 21-week-old WT and biperine KO mice for 3 days (1 mg/kg body weight/day) and VO ₂ , VCO ₂ , food intake rate, activity and respiration The exchange ratio ( n = 6, indirect calorimetry) was measured. Data are expressed as the mean±standard error of biologically independent samples. * P <0.05 vs. WT
13 is The figure shows the thermogenic phenotype of WT and biperine KO mice fed HFD after cold exposure or CL treatment. WT and biperine KO mice were fed with HFD from 6 to 21 weeks of age (15 weeks of feeding). Rectal temperature of 21-week-old mice exposed to low temperature for 7 days ( n = 4-5) (Fig. 13a), expression of biperine and UCP1 in BAT ( n = 3) (Fig. 13b), immunity to UCP1 in adipose tissue The histochemical staining results (Fig. 13c) are shown respectively. After intraperitoneal administration of CL-316243 to 21-week-old WT and biperine KO mice fed HFD for 3 days (1 mg/kg body weight/day), glucose tolerance was measured (Fig. 13D), and biperine and UCP1 in iWAT and BAT Each protein expression was measured ( n = 3) (Figs. 13e and 13f) ( n = 3), and immunohistochemical staining for UCP1 in adipose tissue was performed (Fig. 13g) (scale bar: 200 μm). Data are expressed as the mean±standard error of biologically independent samples. * P <0.05 and ** P <0.01 vs. WT.
14 shows the results of comparing the expression level of biperin in brown adipose tissue of WT mice after HFD feeding and/or cold exposure. WT mice were fed with RC or HFD for 15 weeks or exposed to cold conditions for 7 days, and then protein expression in BAT was measured ( n = 3). Data are expressed as the mean±standard error of biologically independent samples.
15 is a diagram showing the cell-autonomous function of biperin in brown adipocytes. SVF was isolated from BAT and differentiated into mature brown adipocytes. 15A shows the relative RNA levels of adipogenesis and thermogenic-related genes in brown adipocytes during differentiation. 15B shows the relative mRNA levels of cytokines in isolated SVF and SVF-differentiated brown adipocytes. Data are expressed as the mean±standard error for two independent experimental values. * P <0.05, ** P <0.01 and *** P <0.001 vs. WT.
16 is a diagram showing the cell-autonomous function of biperin in white adipocytes. SVF was isolated from eWAT and differentiated into mature white phagocyte adipocytes. 16A shows the relative mRNA levels of adipogenesis and thermogenic-related genes in white adipocytes during differentiation. Figure 16b shows the relative mRNA levels of biperin and UCP1 in white adipocytes treated with ETO (ethomoxil)- or RAN (ranorazine). Data are expressed as the mean±standard error for two independent experimental values. * P <0.05, ** P <0.01 and *** P <0.001 vs. WT

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for describing the present invention in more detail, and it will be apparent to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples according to the gist of the present invention. .

실시예Example

실험방법Experiment method

동물 실험 Animal testing

모든 동물실험은 연세대학교 의과대학의 동물실험윤리위원회의 승인 하에 그 가이드라인을 준수하면서 수행하였다. 마우스는 SPF (pathogen-free) 격리장치에서 22℃의 12시간 광조건/12시간 암조건에서 유지하고, 물과 먹이를 자유롭게 먹도록 하였다.All animal experiments were conducted under the approval of the Animal Experimental Ethics Committee of Yonsei University College of Medicine, while complying with the guidelines. Mice were maintained in a pathogen-free (SPF) isolation device at 22° C. for 12 hours in light/12 hours in the dark, and were allowed to freely eat water and food.

동물식이 Animal diet

본 발명에서는 야생형(WT) 및 바이페린(Rsad2) 녹아웃(KO) C57BL/6 수컷 마우스를 종래에 보고된 바와 같이 이용하였다(1). WT 및 바이페린 KO 마우스를 함께 배양하면서 일반식이(RC) 또는 고지방 식이(HFD)(60% of the 총 칼로리의 60%가 지방, 20%가 탄수화물, 20%가 단백질)(D12492; Research Diets)를 15주령에서 30주령까지(15 주간 섭식) 또는 6주령에서 21주령까지(15 주간 섭식) 먹였다.In the present invention, wild-type (WT) and biperin (Rsad2) knockout (KO) C57BL/6 male mice were used as previously reported (1). Normal diet (RC) or high fat diet (HFD) (60% of the total calories are 60% fat, 20% carbohydrates, 20% protein) while incubating WT and biperine KO mice together (D12492; Research Diets) Were fed from 15 to 30 weeks of age (15 weeks of feeding) or 6 to 21 of weeks (15 weeks of feeding).

조직 분리 Tissue separation

간, 심장, 중뇌, eWAT, iWAT 및 BAT를 RC 또는 HFD를 먹인 WT 및 바이페린 KO 마우스로부터 적출하였다. GF(germ-free) C57BL/6 마우스의 조직은 Charles D. Surh 박사(POSTECH)로부터 제공받았다. Liver, heart, midbrain, eWAT, iWAT and BAT were excised from WT and biperine KO mice fed RC or HFD. The tissues of germ-free (GF) C57BL/6 mice were provided by Dr. Charles D. Surh (POSTECH).

신체 조성 및 혈액화학분석 Body composition and blood chemistry analysis

지방 및 제지방체중 값은 1H 자기공명분광계(Bruker)를 이용하여 측정하였다. 혈청은 모든 마우스로부터 채집하였다. 고밀도 지단백질 콜레스테롤(HDLC), 중성지방(TG), 총 콜레스테롤(TCHO), 글루코스(GLU), AST, 및 ALT 농도는 Roche cobas c111 분석기를 이용하여 측정하였다. Fat and lean body weight values were measured using a 1H magnetic resonance spectroscopy (Bruker). Serum was collected from all mice. High-density lipoprotein cholesterol (HDLC), triglyceride (TG), total cholesterol (TCHO), glucose (GLU), AST, and ALT concentrations were measured using a Roche cobas c111 analyzer.

글루코스 내성 시험Glucose tolerance test

마우스를 16시간 동안 굶기고 글루코스(1g/kg 체중)를 복강투여한 뒤 혈중 글루코스 수준을 0, 15, 30, 45, 60 및 120분에 당측정기(glucometer, Allmedicus)를 이용하여 측정하였다. The mice were starved for 16 hours and glucose (1 g/kg body weight) was intraperitoneally administered, and then the blood glucose level was measured using a glucose meter (glucometer, Allmedicus) at 0, 15, 30, 45, 60 and 120 minutes.

간접적 열량 측정 Indirect calorie measurement

대사 능력(에너지 흡수 및 에너지 소비)을 간접적 열량계산 시스템(Phenomaster; TSE Systems)을 이용하여 측정하였다. 실험 전에, 마우스를 2일 간 대사 챔버(metabolic chamber)에 적응시켰다. 이후 산소 소모율(VO₂; mL/kg/h), 이산화탄소 생성률(VCO₂;mL/kg/h), 열 생성율(에너지 소비; kcal/kg/h), 음식 섭취율(kcal/kg/h), 호흡 교환비(RER; VCO₂/VO₂) 및 활동성을 3일간 측정하였다. 열 생성 및 RER은 가스 교환 데이터로부터 계산하였다. 활동성은 적외선 빔을 이용하여 지정된 측정 기간 동안의 빔 깨짐 횟수를 측정함으로써 평가하였다. 대사 데이터는 제지방 체중에 대해 정규화하였다. 모든 마우스는 22℃의 12시간 광조건/12시간 암조건에서 유지하였다.Metabolic capacity (energy absorption and energy consumption) was measured using an indirect calorimetric system (Phenomaster; TSE Systems). Prior to the experiment, mice were acclimated to the metabolic chamber for 2 days. Afterwards, oxygen consumption rate (VO ₂ ; mL/kg/h), carbon dioxide generation rate (VCO ₂ ; mL/kg/h), heat generation rate (energy consumption; kcal/kg/h), food intake rate (kcal/kg/h), The respiratory exchange ratio (RER; VCO ₂ /VO ₂ ) and activity were measured for 3 days. Heat generation and RER were calculated from gas exchange data. Activity was evaluated by measuring the number of beam breaks during a specified measurement period using an infrared beam. Metabolic data was normalized to lean body weight. All mice were maintained at 22° C. under 12 hours light condition/12 hours dark condition.

체온 및 저온 노출 Body temperature and low temperature exposure

열중립 적응을 위해, 20주령 WT 및 바이페린 KO 수컷 마우스(케이지당 한 마리)를 동물 인큐베이터(Dae Han Bio Link)에 넣고 30℃에서 12시간 광조건/12시간 암조건으로 2-3일간 RC 또는 HFD를 먹였다(2, 3). 저온 노출을 위해 인큐베이터를 4℃까지 감온하고 마우스를 넣은 뒤 7일간 자유롭게 물과 먹이를 먹도록 하였다. 저온노출 동안 상이한 시간간격으로 심부체온(core body temperature)을 측정하였다. 또한, HFD를 먹인 21주령 WT 및 바이페린 KO 마우스에 ADRB3 아고니스트인 CL-316243(Sigma-Aldrich)을 1mg/kg 체중/일로 3일간 복강 투여하였다.For heat-neutral adaptation, 20-week-old WT and biperin KO male mice (one per cage) were placed in an animal incubator (Dae Han Bio Link) for 2-3 days at 30°C under light conditions for 12 hours/12 hours in dark conditions. HFD was fed (2, 3). For low-temperature exposure, the incubator was cooled to 4°C, and mice were placed in the incubator to freely eat water and food for 7 days. Core body temperature was measured at different time intervals during low temperature exposure. In addition, the ADRB3 agonist CL-316243 (Sigma-Aldrich) was administered intraperitoneally to 21-week-old WT and biperine KO mice fed HFD at 1 mg/kg body weight/day for 3 days.

조직학적 분석 Histological analysis

지방 조직을 채집하고 PBS에 용해된 4%(wt/vol) 파라포름알데히드로 고정한 뒤 파라핀에 포매하였다. 파라핀-포매된 조직 단면을 자일렌으로 탈파라핀화하고 100%, 95% 및 70%(vol/vol) 에탄올로 재수화하였다. 이들 샘플을 H&E(hematoxylin and eosin) 염색, 면역조직화학 및 면역형광 분석에 사용하였다. 압력 용기(Dako Denmark) 내 타겟 회수용액에서 항원을 회수하였다. 내인성 퍼옥시다제 활성을 3% H₂O₂(vol/vol)로 블로킹하고 무혈청의 바로 사용 가능한(ready-to-use) 단백질 블로킹 용액(Dako Denmark)에서 단백질을 블로킹하였다. 면역형광을 위해 샘플을 s were then treated with 바이페린 특이적 1차 항체(MaP.VIP), MFN-1 특이적 1차 항체(Santa Cruz Biotechnology) 및 UCP1(uncoupling protein 1) 특이적 1차 항체(Abcam)와, Alexa Fluor 488- 또는 555-접합 2차(Invitrogen)로 처리하였다. 이미지는 공초점 현미경(LSM 700; Carl Zeiss)으로 캡쳐하였다.Adipose tissue was collected, fixed with 4% (wt/vol) paraformaldehyde dissolved in PBS, and embedded in paraffin. Paraffin-embedded tissue sections were deparaffinized with xylene and rehydrated with 100%, 95% and 70% (vol/vol) ethanol. These samples were used for H&E (hematoxylin and eosin) staining, immunohistochemistry and immunofluorescence analysis. The antigen was recovered from the target recovery solution in a pressure vessel (Dako Denmark). Endogenous peroxidase activity was blocked with 3% H ₂ O ₂ (vol/vol) and proteins were blocked in a serum-free ready-to-use protein blocking solution (Dako Denmark). For immunofluorescence, samples were then treated with biperine-specific primary antibody (MaP.VIP), MFN-1 specific primary antibody (Santa Cruz Biotechnology) and UCP1 (uncoupling protein 1) specific primary antibody ( Abcam) and Alexa Fluor 488- or 555-conjugated secondary (Invitrogen). Images were captured with a confocal microscope (LSM 700; Carl Zeiss).

정량적 이미지 분석 Quantitative image analysis

대표적 이미지들을 광학 현미경(Olympus BX43)으로 캡쳐하였다. 지방세포의 크기 및 간의 지질방울을 Toup view 3.7.으로 분석하였다. 정량화를 위해, 각 샘플에 대해 5개 필드(field)를 임의로 선정하고, 200×배율의 광학 필드에서 지방세포의 직경 및 간의 지질방울을 측정하였다. 측정된 수의 지방세포 및 간의 지질방울로부터 평균 직경을 계산하였다.Representative images were captured with an optical microscope (Olympus BX43). The size of adipocytes and lipid droplets in the liver were analyzed with Toup view 3.7. For quantification, 5 fields were randomly selected for each sample, and the diameter of adipocytes and lipid droplets in the liver were measured in an optical field of 200× magnification. The average diameter was calculated from the measured number of adipocytes and liver lipid droplets.

면역블롯 분석. Immunoblot analysis.

WT 및 바이페린 KO 마우스에서 채집한 지방 조직을 프로테아제 억제제(Complete Mini; F. Hoffmann-La Roche) 및 포스파타제 억제제(PhosSTOP; F. Hoffmann-La Roche)와 함께 1×RIPA 완충액에서 균질화하였다 1× RIPA buffer with 프로테아제 억제제 (Complete Mini; F. Hoffmann-La Roche) and 포스파타제 억제제 (PhosSTOP;F. Hoffmann-La Roche). 모든 샘플을 6,000×g로 20분간 4℃에서 원심분리하고 상층액을 수집하였다. 단백질 농도는 비시초닌산 어세이(Thermo Fisher Scientific)를 통해 측정하였다. 단백질을 10% SDS/PAGE 겔을 통해 분리하고 PVDF 막으로 옮겼다. 블롯을 PBS에 용해된 5% 탈지유 및 0.05% Tween에서 1시간 동안 블로킹하고 1차 항체와 함께 배양한 뒤 probed with 항-Ig 호스래디쉬-접합 2차 항체로 표지한 다음 강화 화학발광 시약(Thermo Fisher Scientific)과 함께 배양하였다. GRP94(Abcam, Cambridge, UK) 또는 α-튜블린을 로딩 대조군으로 사용하였다.Adipose tissues collected from WT and biperine KO mice were homogenized in 1×RIPA buffer with a protease inhibitor (Complete Mini; F. Hoffmann-La Roche) and a phosphatase inhibitor (PhosSTOP; F. Hoffmann-La Roche). 1× RIPA buffer with protease inhibitor (Complete Mini; F. Hoffmann-La Roche) and phosphatase inhibitor (PhosSTOP; F. Hoffmann-La Roche). All samples were centrifuged at 6,000×g for 20 minutes at 4° C. and the supernatant was collected. Protein concentration was measured by visichonic acid assay (Thermo Fisher Scientific). Proteins were separated through a 10% SDS/PAGE gel and transferred to a PVDF membrane. Block the blot in 5% skim milk and 0.05% Tween dissolved in PBS for 1 hour, incubate with the primary antibody, and label with an anti-Ig horseradish-conjugated secondary antibody probed with an enhanced chemiluminescence reagent (Thermo Fisher Scientific). GRP94 (Abcam, Cambridge, UK) or α-tubulin was used as a loading control.

RNA 추출, cDNA 제작 및 정량적 실시간 PCR. RNA extraction, cDNA production and quantitative real-time PCR.

Qiagen RNeasy Mini Kit을 이용하여 세포 또는 지방 조직으로부터 총 RNA를 분리하였다. cDNA 합성은 RNA 1μg을 가지고 Prime Script First-Strand cDNA 합성 키트(TaKaRa Bio)를 이용하여 제조자의 지시에 따라 수행하였다. cDNA는 SYBR Green PCR Kit(Applied Biosystems)을 이용하여 qRT-PCR로 정량화하였다. 반응을 95℃에서 10분간 수행한 뒤 95℃에서 30초, 55℃에서 1분, 72℃에서 30초의 3단계 PCR 프로그램을 50사이클 반복하였다. PCR에 사용된 프라이머는 표 1에 나열하였다. CPT1는 CPT1A, CPT1B 및 CPT1C의 3개의 이성질체를 가지는데, 본 발명에서는 Cpt1b에 대한 프라이머를 사용하였다. PCR은 각 시료에 대해 3회 반복하였다. 정량화는 Ct(2^-ΔΔCt) 비교 방법으로 수행하였다. 각 샘플의 Ct 값은 β-액틴 유전자에 대해 정규화하였다. 2개의 독립적 실험을 통계적으로 분석하여 P 값을 각 도면에 표시하였다.Total RNA was isolated from cells or adipose tissue using the Qiagen RNeasy Mini Kit. cDNA synthesis was performed according to the manufacturer's instructions using Prime Script First-Strand cDNA synthesis kit (TaKaRa Bio) with 1 μg of RNA. cDNA was quantified by qRT-PCR using the SYBR Green PCR Kit (Applied Biosystems). The reaction was carried out at 95° C. for 10 minutes, followed by 50 cycles of a 3-step PCR program of 30 seconds at 95° C., 1 minute at 55° C., and 30 seconds at 72° C. Primers used in PCR are listed in Table 1. CPT1 has three isomers of CPT1A, CPT1B and CPT1C. In the present invention, primers for Cpt1b were used. PCR was repeated 3 times for each sample. Quantification was performed by Ct(2 ^-ΔΔCt ) comparison method. The Ct value of each sample was normalized to the β-actin gene. Two independent experiments were statistically analyzed and the P values were shown in each figure.

정량적 실시간 PCR에 사용된 마우스 특이적 프라이머 서열 Mouse specific primer sequence used for quantitative real-time PCR 유전자gene 정"??*tablet"??* 역방향Reverse ViperinViperin GTGAATACTTGGGCAAGCTGTGAATACTTGGGCAAGCT CAAATACTCCCCATAGTCCCAAATACTCCCCATAGTCC Ucp1Ucp1 GGCCTCTACGACTCAGTCCAGGCCTCTACGACTCAGTCCA TAAGCCGGCTGAGATCTTGTTAAGCCGGCTGAGATCTTGT Pgc1αPgc1α CCCTGCCATTGTTAAGACCCCCTGCCATTGTTAAGACC TGCTGCTGTTCCTGTTTTCTGCTGCTGTTCCTGTTTTC Prdm16Prdm16 CAGCACGGTGAAGCCATTCCAGCACGGTGAAGCCATTC GCGTGCATCCGCTTGTGGCGTGCATCCGCTTGTG CideaCidea TGCTCTTCTGTATCGCCCAGTTGCTCTTCTGTATCGCCCAGT GCCGTGTTAAGGAATCTGCTGGCCGTGTTAAGGAATCTGCTG PparγPparγ GTGCCAGTTTCGATCCGTAGAGTGCCAGTTTCGATCCGTAGA GGCCAGCATCGTGTAGATGAGGCCAGCATCGTGTAGATGA PparαPparα TCGGCGAACTATTCGGCTGTCGGCGAACTATTCGGCTG GCACTTGTGAAAACGGCAGTGCACTTGTGAAAACGGCAGT Pparβ/δPparβ/δ TTGAGCCCAAGTTCGAGTTTGTTGAGCCCAAGTTCGAGTTTG CGGTCTCCACACAGAATGATGCGGTCTCCACACAGAATGATG Cpt1bCpt1b TCTATGAGGGCTCGCGTCTATGAGGGCTCGCG CGTCAGGGTTGTAGCACGTCAGGGTTGTAGCA IL-6IL-6 CCTCTGGTCTTCTGGAGTACCCCTCTGGTCTTCTGGAGTACC ACTCCTTCTGTGACTCCAGCACTCCTTCTGTGACTCCAGC IL-10IL-10 ATAACTGCACCCACTTCCCAATAACTGCACCCACTTCCCA GGGCATCACTTCTACCAGGTGGGCATCACTTCTACCAGGT IL-13IL-13 GCAGCATGGTATGGAGTGTGGCAGCATGGTATGGAGTGTG TGGCGAAACAGTTGCTTTGTTGGCGAAACAGTTGCTTTGT IL-1βIL-1β GTGGCTGTGGAGAAGCTGTGGTGGCTGTGGAGAAGCTGTG GAAGGTCCACGGGAAAGACACGAAGGTCCACGGGAAAGACAC TNF-αTNF-α ATGAGCACAGAAAGCATGATGAGCACAGAAAGCATG AGTAGACAGAAGAGCGTGGTAGTAGACAGAAGAGCGTGGT TGF-βTGF-β CCTGCAAGACCATCGACATGCCTGCAAGACCATCGACATG TGTTGTACAAAGCGAGCACCTGTTGTACAAAGCGAGCACC C/ebpαC/ebpα CAAAGCCAAGAAGTCGGTGGACAACAAAGCCAAGAAGTCGGTGGACAA TCATTGTGACTGGTCAACTCCAGCTCATTGTGACTGGTCAACTCCAGC 아디포넥틴Adiponectin CCGGGACTCTACTACTTCTCTTCCGGGACTCTACTACTTCTCTT TTCCTGATACTGGTCGTAGGTTTCCTGATACTGGTCGTAGGT Fabp4Fabp4 ACACCGAGATTTCCTTCAAACTGACACCGAGATTTCCTTCAAACTG CCATCTAGGGTTATGATGCTCTTCCCATCTAGGGTTATGATGCTCTTC β-액틴β-actin GCTCCGGCATGTGCAAGCTCCGGCATGTGCAA AGGATCTTCATGAGGTAGTAGGATCTTCATGAGGTAGT

SVF 분리 및 지방세포로의 분화. SVF isolation and differentiation into adipocytes.

RC를 먹인 3주령 내지 6주령 수컷 마우스로부터 갈색 및 백색 지방 간질혈관분획(stromal vascular fraction, SVF)을 종래에 보고된 방법을 조금 변형하여 수득하였다(4). 요약하면, 지방 조직을 잘게 다진 뒤 1형 콜라게나아제(Worthington Biochemical) 1mg/mL를 포함하는 HBSS(Hanks’balanced salt solution)용액에서 37℃에서 50분 간 분해하였다. 조직 부유액을 45μm 세포 스트래이너로 여과하고 470×g로 15분간 원심분리하였다. 펠렛을 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 지방세포 배양 배지에 재부유하고 플레이팅하였다. 컨플루언스에 도달하면, 500μM 3-이소부틸-1-메틸잔틴(IBMX), 0.5μM 덱사메타손, 20nM 인슐린, 125μM 인도메타신 및 1nM T3(이상 Sigma-Aldrich)를 이용하여 1차 갈색 지방세포의 분화를 자극하였다. 백색 지방 전구세포는 500μM IBMX, 1μM 덱사메타손 및 10μg/mL 인슐린이 보충된 표준 배양액에서 배양하였다. 세포는 자극 6일째에 완전히 분화하여 1nM T3 및 20nM 인슐린이 보충된 보존 배지로 옮겼다. 완전 분화된 지방세포에 100nM CL-316243, 50μM 에토목실(etomoxir) 또는 50μg/mL 라노라진(ranolazine) (이상 Sigma-Aldrich)을 24시간 동안 처리하였다. 세포는 5% CO₂의 가습 인큐베이터에서 37℃로 배양하였으며, 배양액은 2일에 한 번씩 교체하였다.Brown and white adipose stromal vascular fraction (SVF) from 3 to 6 week old male mice fed with RC was obtained by slightly modifying the previously reported method (4). In summary, after the adipose tissue was finely chopped, it was digested for 50 minutes at 37°C in a HBSS (Hanks' balanced salt solution) solution containing 1 mg/mL of type 1 collagenase (Worthington Biochemical). The tissue suspension was filtered through a 45 μm cell strainer and centrifuged at 470×g for 15 minutes. The pellet was resuspended in adipocyte culture medium supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin and plated. Upon reaching confluence, use 500 μM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), 0.5 μM dexamethasone, 20 nM insulin, 125 μM indomethacin, and 1 nM T3 (above Sigma-Aldrich) of primary brown adipocytes. Differentiation was stimulated. White adipocytes were cultured in a standard culture medium supplemented with 500 μM IBMX, 1 μM dexamethasone and 10 μg/mL insulin. Cells were completely differentiated on day 6 of stimulation and transferred to a preservation medium supplemented with 1 nM T3 and 20 nM insulin. Completely differentiated adipocytes were treated with 100 nM CL-316243, 50 μM etomoxir or 50 μg/mL ranolazine (above Sigma-Aldrich) for 24 hours. Cells were cultured at 37° C. in a humidified incubator of 5% CO ₂ , and the culture solution was replaced every 2 days.

1차 갈색 지방세포의 세포 호흡 분석. Cell respiration analysis of primary brown adipocytes.

1차 갈색 지방세포의 세포 OCR은 Seahorse XF96 세포외 유동 분석기 (Seahorse Bioscience)를 이용하여 측정하였다. 분화된 지방세포를 10,000세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 지방세포에 100nM CL-316243 또는 50μM 에토목실을 24시간 동안 처리하였다. 기준선 세포 OCR은 비처리 세포에서 측정하였다. 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체의 억제제인 올리고마이신(complex V 억제제) 1μM, 카르보닐사이아나이드-4-(트리플루오로메톡시)페닐하이드라존[(FCCP;미토콘드리아 언커플러(uncoupler)] 1μM 및 로테논/안티마이신 A(complex I/Ⅲ 억제제) 0.5μM를 순차적으로 처리하였다. 기저 호흡, ATP 생성, 양이온 누출 및 최대 호흡을 포함하는 미토콘드리아 파라미터는 억제제 첨가 전후로 OCR로부터 계산하였다. 기저 호흡은 기준선 세포 OCR에서 비미토콘드리아 호흡을 뺌으로써 도출하였다. ATP 생성은 기준선 세포 OCR에서 올리고마이신 rate를 뺌으로써 측정하였으며, 양이온 누출은 올리고마이신 rate에서 비미토콘드리아성 호흡을 뺌으로써 도출하였다. 최대 호흡은 FCCP rate에서 비미토콘드리아성 호흡을 뺌으로써 계산하였다. 비미토콘드리아성 호흡은 로테논/안티마이신 A의 첨가 후 측정하였다.Cellular OCR of primary brown adipocytes was measured using a Seahorse XF96 extracellular flow analyzer (Seahorse Bioscience). Differentiated adipocytes were plated at a density of 10,000 cells/well. Adipocytes were treated with 100 nM CL-316243 or 50 μM etomoxil for 24 hours. Baseline cell OCR was measured in untreated cells. 1 μM of oligomycin (complex V inhibitor), an inhibitor of mitochondrial respiratory chain complex, 1 μM of carbonylcyanide-4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone [(FCCP; mitochondrial uncoupler] and rotenone/anti 0.5 μM of mycin A (complex I/III inhibitor) was sequentially treated Mitochondrial parameters including basal respiration, ATP production, cation leakage and maximal respiration were calculated from the OCR before and after inhibitor addition. Basal respiration was ratio in baseline cell OCR. ATP production was determined by subtracting the mitochondrial respiration, ATP production was measured by subtracting the oligomycin rate from the baseline cell OCR, and the cation leakage was derived by subtracting the non-mitochondrial respiration from the oligomycin rate. It was calculated by subtracting respiration Non-mitochondrial respiration was measured after addition of rotenone/antimycin A.

통계적 분석. Statistical analysis.

데이터는 평균±표준오차로 나타냈었다. 통계적 유의성은 비대응 양측분포 Student t-검정을 이용하여 결정하였다. P < 0.05인 경우 통계적 유의성을 가지는 것으로 간주하였다.Data were expressed as mean±standard error. Statistical significance was determined using a non-corresponding two - tailed Student t- test. If P <0.05, it was considered to have statistical significance.

실험결과Experiment result

바이페린의 내재적 발현이 지방대사 및 열생성을 조절한다.Intrinsic expression of biperine regulates fat metabolism and heat production.

본 발명자들은 IFN-유도 단백질인 바이페린의 내재적 발현이 특정 조직에서 새로운 기능을 제공할 것이라 가정하였다. 이런 관점에서, SPF 마우스 및 GF 마우스의 다양한 조직에서 바이페린 발현을 스크리닝하였다(도 1a). 바이페린은 간, 심장, 부고환 WAT(eWAT), 서혜 WAT(iWAT) 및 BAT에서 발현되었으나, 뇌에서는 발현되지 않았다. WT 및 바이페린 KO 마우스의 조직 크기 비교 결과 바이페린 KO 마우스에 비해 WT 마우스가 eWAT 및 iWAT의 크기가 더 컸다(도 1b). 이러한 결과는 지방 조직에서 바이페린의 내재적 발현은 대사조절 기능과 관련되어있을 수 있음을 시사한다. The present inventors hypothesized that the intrinsic expression of biperin, an IFN-inducing protein, would provide a new function in certain tissues. In this regard, biperin expression was screened in various tissues of SPF mice and GF mice (Fig. 1A). Biperine was expressed in liver, heart, epididymis WAT (eWAT), inguinal WAT (iWAT) and BAT, but not in brain. As a result of comparing the tissue size of WT and biperin KO mice, WT mice had larger eWAT and iWAT sizes than biperin KO mice (FIG. 1B). These results suggest that the intrinsic expression of biperin in adipose tissue may be related to metabolic regulatory functions.

이러한 가설을 시험하기 위해, WT 및 바이페린 KO 마우스에 RC 또는 HFD를 15주령에서 30주령까지 먹였다(15주간 섭식;장기간). 놀랍게도, RC를 먹인 WT 및 바이페린 KO 마우스 간에는 체중이 조금 차이가 있었으나, HFD를 먹인 마우스 간에는 그렇지 않았다(도 1c). 그러나, 신체조성 분석 결과 지방 질량은 RC 또는 HFD를 먹인 바이페린 KO 마우스에서 감소되었다(도 1d). 지방 조직의 무게를 제외하고, WT 및 바이페린 KO 마우스 간에 비장, 신장 및 고환과 같은 다른 조직의 무게는 큰 차이가 없었다(도 6 a). 이는 바이페린이 조직-특이적으로 효과를 나타냄을 시사한다. 바이페린 발현은 HFD를 먹인 WT 마우스의 지방 조직에서 증가하였다(도 1e). 따라서, 바이페린 결핍은 지방세포의 크기를 감소시키며, HFD를 먹인 마우스에 측적된 간의 지질방울 크기의 감소를 가져왔다(도 1f 및 도 6b). 바이페린 결핍은 또한 혈청의 총 콜레스테롤, AST(aspartate aminotransferase) 및 ALT(alanine aminotransferase)를 감소시켜 HFD-유도 글루코스 내성을 개선시켰다(도 1g 및 1h). To test this hypothesis, WT and biperine KO mice were fed either RC or HFD from 15 to 30 weeks of age (15 weeks of feeding; long term). Surprisingly, there was a slight difference in body weight between WT and biperin KO mice fed with RC, but not between mice fed with HFD (FIG. 1C ). However, as a result of body composition analysis, fat mass was decreased in biperin KO mice fed with RC or HFD (Fig. 1D). Excluding the weight of adipose tissue, there was no significant difference in the weight of other tissues such as spleen, kidney and testis between WT and biperin KO mice (Fig. 6A). This suggests that biperine exerts tissue-specific effects. Biperine expression was increased in adipose tissue of WT mice fed HFD (Fig. 1E). Thus, biperine deficiency reduced the size of adipocytes and resulted in a decrease in the size of lipid droplets in the liver measured in mice fed HFD (FIGS. 1F and 6B ). Biperine deficiency also improved HFD-induced glucose tolerance by reducing serum total cholesterol, aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) (FIGS. 1G and 1H ).

본 발명자들은 간접 열량측정을 통해 WT 및 바이페린 KO 마우스의 대사 표현형을 분석한 결과(도 1I 및 도 6c), 바이페린 결핍이 열 생성률, 산소 소모율 및 이산화탄소 생성률을 유의하게 증가시킴을 확인하였다. 지방조직의 지방산 β-산화가 열생성에 필요하므로, 이러한 발견은 지방조직에서의 열생성에 바이페린이 관여함을 시사한다. 나아가, 바이페린 KO 마우스에서 먹이 섭식율이 높은 것은 이들 동물에서의 지방 감소 표현형이 활발한 열생성에서 기인한다는 점을 보여준다.The present inventors analyzed the metabolic phenotype of WT and biperine KO mice through indirect calorimetry (FIGS. 1I and 6C), and it was confirmed that biperine deficiency significantly increased the rate of heat generation, oxygen consumption, and carbon dioxide production. Since fatty acid β-oxidation in adipose tissue is required for heat production, these findings suggest that biperine is involved in heat production in adipose tissue. Furthermore, the high food intake rate in biperine KO mice shows that the fat loss phenotype in these animals is due to active thermogeneration.

본 발명자들은 상이한 연령과 기간 동안 RC 또는 HFD를 먹인 WT 및 바이페린 KO 마우스의 표현형을 비교하였다. 마우스에 RC 또는 HFD를 6주령에서 21주령까지(15주간 섭식)(도 7) 또는 16주령에서 20주령까지(4주간 섭식; 단기간)(도 8) 먹였다. HFD를 단기간 먹인 마우스를 제외한 모든 마우스에서 표현형을 반복적으로 비교하였으며(도 7 및 도 8), 그 결과 바이페린-매개 표현형은 마우스의 연령보다는 섭식 기간에 좌우된다는 사실을 발견하였다.We compared the phenotypes of WT and biperine KO mice fed RC or HFD for different ages and periods. Mice were fed with RC or HFD from 6 weeks of age to 21 weeks of age (15 weeks of feeding) (FIG. 7) or from 16 weeks of age to 20 weeks of age (4 weeks of feeding; short period) (FIG. 8). The phenotypes were repeatedly compared in all mice except the mice fed with HFD for a short period of time (Figs. 7 and 8), and as a result, it was found that the biperine-mediated phenotype depends on the feeding period rather than the age of the mice.

바이페린 결핍은 지방 조직에서의 열발생 유전자 발현을 촉진시킨다. Biperine deficiency promotes thermogenic gene expression in adipose tissue.

바이페린 발현이 지방산 β-산화 매개된 열생성에 관련되었는지를 조사하기 위해, Ucp1, Pgc1α 및 Cidea와 같은 열생성 관련 유전자와 Pparα, Pparβ/δ 및 Cpt1와 같은 지방산 β-산화 관련 유전자의 발현 수준을 지방 조직에서 측정하였다(도 2a, 도 9 및 도 10). 이들 유전자의 발현 수준은 지방조직, 특히 RC를 먹인 바이페린 KO 마우스의 eWAT 및 iWAT에서 유의하게 증가하였다(도 2a, 도 9a 및 도 10a). 이들 유전자는 HFD를 장기간 먹인 바이페린 KO 마우스의 iWAT 및 BAT에서도 유의하게 증가하였지만, HFD를 단기간 먹인 경우에는 그렇지 않았다(도 2a, 도 9b 및 도 10b). UCP1 단백질 발현은 RC 또는 HFD를 먹인 바이페린 KO 마우스의 지방 조직에서 증가하였다(도 2b 및 2c). 바이페린 발현은 HFD를 먹인 WT 마우스의 지방조직에서도 증가하였다(도 2b 및 도 11a). 나아가, 바이페린은 RC 또는 HFD를 먹인 WT 마우스의 BAT에서 미토콘드리아로 이동하였다(도 2d). 이러한 데이터는 바이페린이 지방조직의 열생성을 저해하며, 이는 지방세포의 미토콘드리아에서 지방산 β-산화를 억제함으로써 이루어짐을 시사한다. 대식세포와 호산구 등의 면역세포에서 분비되는 IL-10 및 IL-13 등의 사이토카인은 지방조직의 열생성을 조절한다고 보고되었다(5-7). 본 발명자들은 최근 바이페린 결핍이 완전 분화된 골수유래 대식세포의 전염증성 및 항염증성 사이토카인의 발현을 촉진함을 밝혔다(8). 그러나, RC를 먹인 마우스 BAT의 대식세포에서 바이페린은 검출되지 않았다. HFD를 먹인 마우스의 BAT에서 소수의 바이페린-발현 대식세포가 관찰되었으나, HFD를 먹인 후 BAT로 침투하는 대식세포의 수는 증가하였다(도 11b). RC를 먹인 마우스의 BAT을 제외하고, RC 또는 HFD를 먹인 WT 및 바이페린 KO 마우스 간에 지방 조직에서의 사이토카인 유전자의 발현 수준은 거의 차이나지 않았다(도 11c 및 11d).To investigate whether biperine expression is involved in fatty acid β-oxidation-mediated thermogeneration , the expression levels of thermogenic genes such as Ucp1 , Pgc1α and Cidea and fatty acid β-oxidation related genes such as Pparα, Pparβ/δ and Cpt1. Was measured in adipose tissue (FIGS. 2A, 9 and 10 ). The expression levels of these genes were significantly increased in adipose tissue, particularly eWAT and iWAT of biperin KO mice fed RC (FIGS. 2A, 9A and 10A ). These genes were also significantly increased in iWAT and BAT of biperine KO mice fed with HFD for a long period of time, but not when fed with HFD for a short period of time (FIGS. 2A, 9B and 10B ). UCP1 protein expression was increased in adipose tissue of biperin KO mice fed with RC or HFD (FIGS. 2B and 2C ). Biperine expression was also increased in the adipose tissue of WT mice fed HFD (FIGS. 2B and 11A ). Furthermore, biperine migrated from the BAT of WT mice fed RC or HFD to the mitochondria (Fig. 2D). These data suggest that biperin inhibits the heat production of adipose tissue, which is achieved by inhibiting fatty acid β-oxidation in the mitochondria of adipocytes. It has been reported that cytokines such as IL-10 and IL-13, which are secreted by immune cells such as macrophages and eosinophils, regulate the heat production of adipose tissue (5-7). The present inventors have recently found that biperine deficiency promotes the expression of pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in fully differentiated bone marrow-derived macrophages (8). However, no biperine was detected in macrophages of mouse BAT fed RC. A small number of biperin-expressing macrophages were observed in the BAT of mice fed with HFD, but the number of macrophages infiltrating into the BAT after feeding HFD increased (FIG. 11B). Except for the BAT of the mice fed with RC, there was little difference in the expression level of the cytokine gene in the adipose tissue between WT and biperine KO mice fed with RC or HFD (FIGS. 11C and 11D ).

바이페린 결핍은 열생성을 촉진하고 저온 내성을 부여한다. Biperine deficiency promotes thermogeneration and imparts low temperature tolerance.

지방 조직의 열생성 조절에서 바이페린이 필수적임을 확인하기 위하여, RC를 먹인 WT 및 바이페린 KO 마우스를 7일간 4℃에서 유지하고 상이한 시간 간격으로 심부 체온을 측정하였다. 7일간의 저온 노출 동안 바이페린 KO 마우스의 체온이 WT 마우스에 비하여 높았으며(도 3a), 이를 통해 바이페린 결핍이 저온 내성을 증진시킴을 알 수 있었다. 저온에 노출된 바이페린 KO 마우스의 지방조직 질량은 감소하였는데(도 3b), 이를 통해 저온 노출 기간 동안 바이페린 KO 마우스에서 열생성이 WT 마우스에서보다 활발함을 알 수 있었다. 저온에 노출된 바이페린 KO 마우스의 지방조직에서 열생성 및 지방산 β-산화 관련 유전자 발현이 크게 증가되어 있었다(도 3c). 저온 노출 후 WT 마우스의 BAT에서 바이페린 단백질 발현이 증가하였으나(도 3d), BAT과 지방세포에서의 UCP1 단백질 발현은 바이페린 KO 마우스에서 WT 마우스보다 훨씬 높았다(도 3d 및 3e). 이들 데이터는 바이페린 발현 증가가 저온 환경에서의 열생성을 억제하고 저온 내성을 저해함을 말해준다. 따라서, 바이페린이 지방조직에서의 저온-유도 열생성의 조절에 필수적임을 알 수 있다.In order to confirm that biperin is essential in the regulation of thermogenic adipose tissue, RC-fed WT and biperin KO mice were maintained at 4°C for 7 days and core body temperature was measured at different time intervals. During 7 days of low-temperature exposure, the body temperature of biperin KO mice was higher than that of WT mice (FIG. 3A), and through this, it was found that biperin deficiency enhances low-temperature resistance. The adipose tissue mass of biperin KO mice exposed to low temperature was decreased (FIG. 3B), and through this, it was found that heat generation in biperin KO mice during low temperature exposure is more active than in WT mice. In the adipose tissue of biperine KO mice exposed to low temperature, the expression of genes related to heat production and fatty acid β-oxidation was significantly increased (FIG. 3C ). After cold exposure, the expression of biperin protein was increased in BAT of WT mice (Fig. 3D), but UCP1 protein expression in BAT and adipocytes was much higher in biperin KO mice than in WT mice (Figs. 3D and 3E). These data suggest that increased biperine expression inhibits thermogeneration in cold environments and inhibits cold tolerance. Thus, it can be seen that biperine is essential for the regulation of cold-induced heat production in adipose tissue.

바이페린 결핍은 아드레날린 신호경로를 통해 저온-유도 열생성을 촉진한다. Biperine deficiency promotes cold-induced heat generation through the adrenaline signaling pathway.

다음으로, 바이페린 KO 마우스 지방조직에서의 저온-유도 열생성 표현형이 아드레날린 신호경로에 의해 매개되는지 여부를 조사하기 위하여, 마우스를 ADRB3 아고니스트인 CL-316243로 3일간 자극하였다. 간접 열량측정 결과 CL-처리 바이페린 KO 마우스에서 열 생성률, 산소 소모율 및 CO₂ 생성률이 유의하게 증가함을 확인하였다(도 4b 및 도 12). 그러나, CL-처리 WT 및 바이페린 KO 마우스 간 음식 섭취량에는 차이가 없었다(도 12). 이러한 결과는 바이페린이 음식 섭취와 무관하게 지방조직에서의 열생성을 조절함을 말해준다. 글루코스 내성이 개선되었으며, CL-처리 바이페린 KO 마우스에서 지방 조직의 질량이 감소하여(도 4c), CL-처리 바이페린 KO 마우스에서의 열생성이 매우 활발함을 알 수 있었다. CL-처리 바이페린 KO 마우스의 지방조직에서 열생성 및 지방산 β-산화 관련 유전자의 발현 수준도 크게 증가하였다(도 4d). 바이페린 단백질 발현이 CL-처리 바이페린 WT 마우스의 iWAT에서 증가하였다(도 4e). 저온에 노출된 마우스와 마찬가지로, 지방 조직의 UCP1 단백질의 발현 증가는 CL-처리 바이페린 KO 마우스에서 CL-처리 바이페린 WT 마우스에 비해 더 두드러졌다(도 4e 및 4f). 이러한 결과를 통해 바이페린 KO 마우스의 저온환경으로 유도된 표현형이 아드레날린 신호 경로에 의해 유도됨을 알 수 있었다.Next, in order to investigate whether the cold-induced thermogenic phenotype in adipose tissue of biperine KO mice was mediated by the adrenaline signaling pathway, the mice were stimulated for 3 days with CL-316243, an ADRB3 agonist. As a result of indirect calorimetry, it was confirmed that the heat production rate, oxygen consumption rate, and CO ₂ production rate were significantly increased in CL-treated biperine KO mice (FIGS. 4B and 12 ). However, there was no difference in food intake between CL-treated WT and biperine KO mice (Fig. 12). These results suggest that biperine regulates heat production in adipose tissue regardless of food intake. Glucose tolerance was improved, and the mass of adipose tissue was decreased in CL-treated biperin KO mice (FIG. 4C), indicating that heat generation in CL-treated biperine KO mice was very active. The expression levels of genes related to heat production and fatty acid β-oxidation were also significantly increased in adipose tissue of CL-treated biperine KO mice (FIG. 4D). Biperine protein expression was increased in iWAT of CL-treated biperine WT mice (FIG. 4E ). As with the mice exposed to low temperature, the increased expression of UCP1 protein in adipose tissue was more pronounced in CL-treated biperin KO mice compared to CL-treated biperin WT mice (Figs. 4E and 4F). Through these results, it was found that the phenotype induced in the low temperature environment of biperine KO mice was induced by the adrenaline signaling pathway.

HFD-유도된 바이페린 발현은 저온-유도 열생성 표현형을 강화한다. HFD-induced biperine expression enhances the cold-induced thermogenic phenotype.

바이페린 발현이 HFD 섭식 또는 저온 노출 후 WT 마우스의 지방 조직을 증가시켰기 때문에, HFD를 먹인 WT 및 바이페린 KO 마우스의 저온 노출 또는 CL 처리 후의 열발생 표현형을 관찰하였다. 마우스에 HFD를 먹이고 7일 동안 4℃ 환경에 둔 뒤 상이한 시간간격으로 심부 체온을 측정하였다. 저온 노출 후 RC를 먹인 마우스에서의 결과와 유사하게, 7일간의 저온 노출 기간 동안 HFD를 먹인 바이페린 KO 마우스의 체온이 WT 마우스에 비해 더 높았다(도 13a). HFD를 먹인 WT 마우스의 BAT에서 저온 노출 후 바이페린 발현은 크게 증가하였다(도 13b 및 도 14). 저온 노출 시 BAT과 지방세포에서의 UCP1 발현 증가는 HFD를 먹인 WT 마우스에서보다 HFD를 먹인 바이페린 KO 마우스에서 더 두드러졌다(도 13b 및 13c). 이는 HFD 및 저온으로 유도된 바이페린 발현으로 이의 열생성 억제활성이 더 증진되고 WT 및 바이페린 KO 마우스의 열발생 표현형을 더 강화시킴을 보여준다. 본 발명자들은 또한 HFD를 먹인 바이페린 KO 마우스의 지방조직에서의 저온-유도 열생성 표현형이 아드레날린 신호 경로로 매개되는지 여부를 조사하였다. HFD를 먹인 마우스를 ADRB3 아고니스트인 CL-316243로 3일간 자극하였다. HFD-유도 글루코스 내성이 개선되어, HFD를 먹인 CL-처리 바이페린 KO 마우스에서의 열생성이 매우 활발함을 알 수 있었다(도 13d). 바이페린 단백질 발현은 HFD를 먹인 CL-처리 WT 마우스의 iWAT 및 BAT에서 증가하였다(도 13e 및 13f). 지방 조직에서 UCP1 발현의 증가는 HFD를 먹인 CL-처리 바이페린 KO 마우스에서 WT 마우스에 비해 더 두드러졌다(도 13e-13g). 이러한 결과는 HFD를 먹인 바이페린 KO 마우스의 저온-유도된 표현형이 아드레날린 신호 경로를 통해 매개된다는 사실을 보여준다. 이를 종합하면, 바이페린은 지방 조직의 열생성을 조절하는 데 필수적이며, 그 기능은 HFD 섭식 및/또는 저온 조건에서 보다 강화됨을 알 수 있다.Since biperine expression increased the adipose tissue of WT mice after HFD feeding or cold exposure, the thermogenic phenotype after cold exposure or CL treatment of WT and biperine KO mice fed HFD was observed. The mice were fed with HFD and placed in an environment of 4° C. for 7 days, and then the core body temperature was measured at different time intervals. Similar to the results in mice fed RC after cold exposure, the body temperature of biperin KO mice fed HFD during the 7-day cold exposure period was higher than that of WT mice (FIG. 13A ). After low temperature exposure in BAT of WT mice fed with HFD, the expression of biperin was significantly increased (FIGS. 13B and 14 ). The increase in UCP1 expression in BAT and adipocytes upon cold exposure was more pronounced in biperine KO mice fed HFD than in WT mice fed HFD (FIGS. 13B and 13C ). This shows that HFD and low temperature-induced biperine expression further enhances its thermogenic inhibitory activity and further enhances the thermogenic phenotype of WT and biperine KO mice. The present inventors also investigated whether the cold-induced thermogenic phenotype in adipose tissue of biperine KO mice fed with HFD is mediated by the adrenaline signaling pathway. Mice fed with HFD were stimulated for 3 days with CL-316243, an ADRB3 agonist. HFD-induced glucose tolerance was improved, and it was found that heat generation in CL-treated biperin KO mice fed HFD was very active (FIG. 13D). Biperine protein expression was increased in iWAT and BAT of CL-treated WT mice fed HFD (FIGS. 13E and 13F ). The increase in UCP1 expression in adipose tissue was more pronounced in CL-treated biperin KO mice fed HFD compared to WT mice (FIGS. 13E-13G ). These results show that the cold-induced phenotype of biperine KO mice fed HFD is mediated through the adrenaline signaling pathway. Taken together, it can be seen that biperine is essential for regulating the heat production of adipose tissue, and its function is more enhanced in HFD feeding and/or low temperature conditions.

바이페린은 지방세포-자율적으로 지방산 β-산화 매개된 열생성을 조절한다 Biperine regulates fatty acid β-oxidation-mediated thermoproduction in an adipocyte-autonomous manner

지방조직에서 바이페린의 세포-자율적인 기능을 시험하기 위해, BAT 또는 eWAT로부터 SVF를 분리하고 성숙한 갈색 또는 백색 지방세포로 분화시켰다(도 5, 도 15 및 도 16). 바이페린 결핍은 성숙한 갈색 지방세포(도 5a 및 도 15a)와 백색 지방세포(도 16a)에서 아디포넥틴, Fabp4 및 C/ebpα와 같은 지방생성-관련 유전자의 발현을 증진시킨다. 이를 통해 지방산 β-산화의 증가가 지방세포에서의 지방생성과 열생성을 모두 촉진함을 알 수 있다.To test the cell-autonomous function of biperin in adipose tissue, SVF was isolated from BAT or eWAT and differentiated into mature brown or white adipocytes (FIGS. 5, 15 and 16). Biperine deficiency enhances the expression of adipogenesis-related genes such as adiponectin, Fabp4 and C/ebpα in mature brown adipocytes (FIGS. 5A and 15A) and white adipocytes (FIG. 16A ). Through this, it can be seen that the increase in fatty acid β-oxidation promotes both adipogenesis and heat production in adipocytes.

지방조직의 면역세포에서 분비된 사이토카인이 지방세포의 열발생 표현형에 영향을 미칠 가능성을 차단하기 위해, WT 및 바이페린 KO 마우스의 BAT에서 분리한 SVF와 SVF로부터 분화된 갈색 지방세포의 사이토카인 발현량을 측정하였다(도 15b). SVF는 지방전구세포 뿐 아니라 면역세포도 포함하므로, 사이토카인은 배양액 내 면역세포로부터 유래할 수도 있다. WT 및 바이페린 KO 마우스의 SVF 또는 지방세포간 사이토카인 발현량에 거의 차이가 없었으며, 이를 통해 바이페린이 지방세포-자율적으로 열생성을 조절함을 알 수 있다. CL의 처리에 따른 열생성-관련 유전자 발현의 증가는 바이페린 KO 갈색 지방세포에서 크게 두드러졌는데, 이는 바이페린 발현이 CL 처리에 따라 WT 갈색 지방세포에서 증가했기 때문이다(도 5b). 이는 바이페린이 BAT에서 열발생 활성을 억제함을 보여준다.In order to block the possibility that the cytokine secreted from the immune cells of adipose tissue affects the thermogenic phenotype of adipocytes, the cytokines of brown adipocytes differentiated from SVF and SVF isolated from BAT of WT and biperine KO mice The expression level was measured (FIG. 15B). Since SVF includes not only adipocytes but also immune cells, cytokines may also be derived from immune cells in culture. There was almost no difference in the amount of cytokine expression between SVF or adipocytes in WT and biperine KO mice, and through this, it can be seen that biperin regulates the adipocyte-autonomous heat production. The increase in thermogenic-related gene expression according to the treatment of CL was remarkable in biperin KO brown adipocytes, because biperin expression increased in WT brown adipocytes according to CL treatment (FIG. 5B ). This shows that biperine inhibits thermogenic activity in BAT.

마지막으로, 바이페린이 지방조직의 열생성을 조절하는 메카니즘을 밝히기 위해, 지방산 β-산화의 억제제인 에토목실 또는 라노라진을 처리한 지방세포의 열생성-관련 유전자의 발현을 측정하였다(도 5c 및 도 16b). 그 결과, 바이페린 KO 지방세포의 열생성-관련 유전자의 발현은 억제제 처리 후에만 유의하게 감소하였다. 이를 통해 바이페린 결핍이 지방세포의 지방산 β-산화를 촉진함으로써 열생성을 증가시킴을 알 수 있었다 .Finally, in order to clarify the mechanism by which biperin regulates the thermogenicity of adipose tissue, expression of thermogenic-related genes in adipocytes treated with etomoxil or ranorazine, an inhibitor of fatty acid β-oxidation, was measured (Fig. 5c). And Fig. 16b). As a result, the expression of thermogenic-related genes in biperine KO adipocytes was significantly decreased only after inhibitor treatment. Through this, it was found that biperine deficiency increases thermogenicity by promoting fatty acid β-oxidation in adipocytes.

세포외 유입에 대한 분석을 통해 바이페린 KO 갈색 지방세포에서 산소 소모율(OCR)이 증가함을 확인하였다. 미토콘드리아 호흡 사슬 억제제의 첨가 전후에 기저 호흡, ATP 생성, 양이온 누출 및 최대 호흡을 포함하는 미토콘드리아 파라미터를 OCR로부터 계산하였다. 열생성의 핵심 요소인 양이온 누출(연합해지호흡; uncoupled respiration)과 다른 파라미터들은 바이페린 KO 갈색 지방세포에서 증가하였다. 나아가, CL 처리에 따른 양이온 누출 증가는 바이페린 KO 갈색 지방세포에서 더 두드러졌다(도 5d). 반면, 양이온 누출은 바이페린 KO 갈색 지방세포에서는 에토목실 처리 후에만 감소하였다(도 5d). 이러한 데이터를 통해 바이페린 발현이 지방산 β-산화를 억제하여 지방생성 및 지방세포의 열생성을 저해함을 알 수 있다.Through the analysis of extracellular influx, it was confirmed that the oxygen consumption rate (OCR) was increased in biperine KO brown adipocytes. Mitochondrial parameters including basal respiration, ATP production, cation leakage and maximal respiration before and after the addition of the mitochondrial respiratory chain inhibitor were calculated from OCR. Cation leakage (uncoupled respiration) and other parameters, a key factor in thermogeneration, were increased in biperine KO brown adipocytes. Furthermore, the increase in cation leakage according to CL treatment was more pronounced in biperine KO brown adipocytes (FIG. 5D). On the other hand, the leakage of cations decreased only after treatment with etomoxil in biperine KO brown adipocytes (FIG. 5D). From these data, it can be seen that biperine expression inhibits fatty acid β-oxidation, thereby inhibiting adipogenesis and heat production of adipocytes.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As described above, specific parts of the present invention have been described in detail, and it is obvious that these specific techniques are only preferred embodiments and are not intended to limit the scope of the present invention to those of ordinary skill in the art. Accordingly, it will be said that the substantial scope of the present invention is defined by the appended claims and their equivalents.

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Prdm16 F primer <400> 7 cagcacggtg aagccattc 19 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prdm16 R primer <400> 8 gcgtgcatcc gcttgtg 17 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cidea F primer <400> 9 tgctcttctg tatcgcccag t 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cidea R primer <400> 10 gccgtgttaa ggaatctgct g 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ppar gamma F primer <400> 11 gtgccagttt cgatccgtag a 21 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ppar gamma R primer <400> 12 ggccagcatc gtgtagatga 20 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ppar alpha F primer <400> 13 tcggcgaact attcggctg 19 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ppar alpha R primer <400> 14 gcacttgtga aaacggcagt 20 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ppar beta/delta F primer <400> 15 ttgagcccaa gttcgagttt g 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ppar beta/delta R primer <400> 16 cggtctccac acagaatgat g 21 <210> 17 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cpt1b F primer <400> 17 tctatgaggg ctcgcg 16 <210> 18 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cpt1b R primer <400> 18 cgtcagggtt gtagca 16 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 F primer <400> 19 cctctggtct tctggagtac c 21 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 R primer <400> 20 actccttctg tgactccagc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-10 F primer <400> 21 ataactgcac ccacttccca 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-10 R primer <400> 22 gggcatcact tctaccaggt 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-13 F primer <400> 23 gcagcatggt atggagtgtg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-13 R primer <400> 24 tggcgaaaca gttgctttgt 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1 beta F primer <400> 25 gtggctgtgg agaagctgtg 20 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1 beta R primer <400> 26 gaaggtccac gggaaagaca c 21 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha F primer <400> 27 atgagcacag aaagcatg 18 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha R primer <400> 28 agtagacaga agagcgtggt 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-beta F primer <400> 29 cctgcaagac catcgacatg 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-beta R primer <400> 30 tgttgtacaa agcgagcacc 20 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C/ebp alpha F primer <400> 31 caaagccaag aagtcggtgg acaa 24 <210> 32 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C/ebp alpha R primer <400> 32 tcattgtgac tggtcaactc cagc 24 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adiponectin F primer <400> 33 ccgggactct actacttctc tt 22 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adiponectin R primer <400> 34 ttcctgatac tggtcgtagg t 21 <210> 35 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fabp4 F primer <400> 35 acaccgagat ttccttcaaa ctg 23 <210> 36 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fabp4 R primer <400> 36 ccatctaggg ttatgatgct cttc 24 <210> 37 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin F primer <400> 37 gctccggcat gtgcaa 16 <210> 38 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin R primer <400> 38 aggatcttca tgaggtagt 19 <110> Industry-Academic Cooperation Foundation Yonsei University SNU R&DB Foundation <120> A Composition for Preventing or Treating Metabolic Disorders Comprising Viperin Inhibitors as Active Ingredients <130> HPC-8909 <160> 38 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Viperin F primer <400> 1 gtgaatactt gggcaagct 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Viperin R primer <400> 2 caaatactcc ccatagtcc 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ucp1 F primer <400> 3 ggcctctacg actcagtcca 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ucp1 R primer <400> 4 taagccggct gagatcttgt 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pgc1 alpha F primer <400> 5 ccctgccatt gttaagacc 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pgc1 alpha R primer <400> 6 tgctgctgtt cctgttttc 19 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prdm16 F primer <400> 7 cagcacggtg aagccattc 19 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prdm16 R primer <400> 8 gcgtgcatcc gcttgtg 17 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cidea F primer <400> 9 tgctcttctg tatcgcccag t 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cidea R primer <400> 10 gccgtgttaa ggaatctgct g 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ppar gamma F primer <400> 11 gtgccagttt cgatccgtag a 21 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ppar gamma R primer <400> 12 ggccagcatc gtgtagatga 20 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ppar alpha F primer <400> 13 tcggcgaact attcggctg 19 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ppar alpha R primer <400> 14 gcacttgtga aaacggcagt 20 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ppar beta/delta F primer <400> 15 ttgagcccaa gttcgagttt g 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ppar beta/delta R primer <400> 16 cggtctccac acagaatgat g 21 <210> 17 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cpt1b F primer <400> 17 tctatgaggg ctcgcg 16 <210> 18 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cpt1b R primer <400> 18 cgtcagggtt gtagca 16 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 F primer <400> 19 cctctggtct tctggagtac c 21 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 R primer <400> 20 actccttctg tgactccagc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-10 F primer <400> 21 ataactgcac ccacttccca 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-10 R primer <400> 22 gggcatcact tctaccaggt 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-13 F primer <400> 23 gcagcatggt atggagtgtg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-13 R primer <400> 24 tggcgaaaca gttgctttgt 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1 beta F primer <400> 25 gtggctgtgg agaagctgtg 20 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1 beta R primer <400> 26 gaaggtccac gggaaagaca c 21 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha F primer <400> 27 atgagcacag aaagcatg 18 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha R primer <400> 28 agtagacaga agagcgtggt 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-beta F primer <400> 29 cctgcaagac catcgacatg 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-beta R primer <400> 30 tgttgtacaa agcgagcacc 20 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C/ebp alpha F primer <400> 31 caaagccaag aagtcggtgg acaa 24 <210> 32 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C/ebp alpha R primer <400> 32 tcattgtgac tggtcaactc cagc 24 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adiponectin F primer <400> 33 ccgggactct actacttctc tt 22 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adiponectin R primer <400> 34 ttcctgatac tggtcgtagg t 21 <210> 35 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fabp4 F primer <400> 35 acaccgagat ttccttcaaa ctg 23 <210> 36 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fabp4 R primer <400> 36 ccatctaggg ttatgatgct cttc 24 <210> 37 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin F primer <400> 37 gctccggcat gtgcaa 16 <210> 38 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin R primer <400> 38 aggatcttca tgaggtagt 19

Claims (11)

(a) 바이페린(viperin) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 또는 바이페린 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드의 발현을 억제하는 핵산 분자; 및
(b) 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물:

.
(a) an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to viperin protein; Or a nucleic acid molecule that inhibits the expression of a nucleotide encoding a biperine protein; And
(b) a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of obesity comprising a compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient:

.
삭제delete 삭제delete 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 Ucp1, Pgc1α, Cidea, Pparα, Pparβ/δ, Cpt1, 아디포넥틴, Fabp4 및 C/ebpα로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
The composition of claim 1, wherein the composition increases the expression of one or more genes selected from the group consisting of Ucp1 , Pgc1α , Cidea, Pparα, Pparβ/δ , Cpt1 , adiponectin, Fabp4 and C/ebpα .
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