KR102152974B1 - A Composition for Enhancing Thermogenesis In Vivo Comprising Viperin Inhibitors as Active Ingredients - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to a composition for enhancing thermogenesis in vivo and to a composition for enhancing cold-tolerance. According to the present invention, various thermogenic hypofunctions such as metabolic syndrome are treated by increasing thermogenesis in vivo, and also the present invention can be usefully used as an efficient thermogenic enhancer capable of imparting resistance to a low-temperature exposure environment.

Description

바이페린 억제제를 유효성분으로 포함하는 생체 내 열생성 증진용 조성물{A Composition for Enhancing Thermogenesis In Vivo Comprising Viperin Inhibitors as Active Ingredients}A composition for enhancing thermogenesis in vivo containing a biperin inhibitor as an active ingredient {A Composition for Enhancing Thermogenesis In Vivo Comprising Viperin Inhibitors as Active Ingredients}

본 발명은 바이페린 억제제를 유효성분으로 포함하는 생체 내 열생성 증진 및 저온 내성 증진용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for enhancing heat production and low temperature resistance in a living body comprising a biperine inhibitor as an active ingredient.

포유류는 추위에 노출되면 열손실에 대응하여 체내 열생성을 증가시킴으로써 일정한 체온을 유지하고자 한다. 열손실이 열생성을 초과하는 경우 저체온증(hypothermia) 상태로 진입하면서 저온 노출 기간이 계속될 경우 사망에 이를 수 있다. 응급 처치를 통해 외부로부터 열공급을 하여 장기간의 저온 노출에 대응할 수 있으나, 개체의 열생성 자체를 증가시킬 수 있다면 저체온증 및 이로 인한 사망의 위험을 크게 낮출 수 있다.Mammals try to maintain a constant body temperature by increasing heat production in the body in response to heat loss when exposed to cold. If the heat loss exceeds heat production, it can lead to death if the period of low temperature exposure continues while entering a state of hypothermia. It is possible to cope with long-term low-temperature exposure by supplying heat from the outside through emergency treatment, but if the individual's heat generation itself can be increased, the risk of hypothermia and resulting death can be greatly reduced.

저온 상황 이외에도, 열생성 저하증(thermogenic hypofunction)으로 인한 에너지 불균형은 소모되지 못한 에너지로부터 변형되어 축적되는 지방으로 인해 비만을 비롯한 다양한 대사 증후군의 원인이 된다. 열생성 저하증은 또한 체중 감량을 위한 식이요법 후 신체가 부족한 영양섭취에 대응하여 열생성을 감소시키는 반사성(reflexive) 작용으로 발생하기도 한다. In addition to cold conditions, energy imbalances due to thermogenic hypofunction are responsible for various metabolic syndromes, including obesity, due to fat that accumulates and transforms from unconsumed energy. Hypothyroidism is also caused by a reflexive action that reduces heat production in response to insufficient nutrition in the body after a diet for weight loss.

테오필린(THEO)과 아미노필린(AMPY)이 심각한 저온 상황에서 인간과 다른 포유동물의 열생성을 증가시켜 저온 내성을 향상시킨다고 보고되었으나, 심계 항진, 동빈맥, 기외 수축, 심실성 부정맥 등의 부작용이 보고되어 만성질환 치료를 위한 장기 투여에는 적합하지 않다. Theophylline (THEO) and aminophylline (AMPY) have been reported to improve low-temperature tolerance by increasing the heat production of humans and other mammals in severe low-temperature conditions, but side effects such as heart palpitations, sinus tachycardia, extracorporeal contractions, and ventricular arrhythmia have been reported. Therefore, it is not suitable for long-term administration for chronic disease treatment.

바이페린(RSAD2, cig5 또는 vig1)은 항바이러스 활성을 가지고, 신호경로 또는 Th2 세포 발달을 매개하며, 세포 대사를 조절하는, IFN-유도 다중기능 단백질이다. 바이페린은 ER(endoplasmic reticulum)에서 골지체로의 가용성 단백질의 수송을 차단하며, 미토콘드리아의 지방산 β-산화를 억제하여 ATP 생성을 감소시키고 세포 지방생성을 증가시키는 다양한 기능을 한다.Biperine (RSAD2, cig5 or vig1) is an IFN-derived multifunctional protein that has antiviral activity, mediates signaling pathways or Th2 cell development, and regulates cellular metabolism. Biperine blocks the transport of soluble proteins from the ER (endoplasmic reticulum) to the Golgi apparatus, inhibits the fatty acid β-oxidation of mitochondria, reduces ATP production, and increases cellular adipogenesis.

지방 조직은 에너지 균형과 항상성을 조절하는 중추적 대사기관이다. 지방 조직에는 백색 지방조직(WAT)과 갈색 지방조직(BAT)의 2가지 주요 형태가 있는데, WAT는 지방을 저장하는 기능을 하며, BAT는 주로 열생성을 위해 지방을 태우는 역할을 한다. BAT는 다중 미토콘드리아 및 다방성 지질방울을 가지는데, 이는 미토콘드리아 UCP1(uncoupling protein 1)의 유도를 통해 열 생성에 중요한 역할을 한다. WAT은 갈색화(browning) 과정을 통해서도 열 생성에 기여한다. 열생성의 활성화는 에너지 소모를 증가시키고 비만, 인슐린 저항성 2형 당뇨와 같은 대사 질환을 개선시킨다. 한편, 지방산 β-산화가 결핍된 마우스에서는 지방 과다가 나타나면서 저온 스트레스에 민감해져, 지방산 β-산화가 열생성 및 지방조직 분화에 관여한다고 예상할 수 있으나, 지방산 β-산화-매개 열생성이 어떠한 기작에 의해 조절되는지는 알려져 있지 않다.Adipose tissue is the central metabolic organ that regulates energy balance and homeostasis. There are two main types of adipose tissue: white adipose tissue (WAT) and brown adipose tissue (BAT). WAT functions to store fat, and BAT primarily burns fat for heat production. BAT has multiple mitochondria and multiple lipid droplets, which play an important role in heat generation through the induction of mitochondrial uncoupling protein 1 (UCP1). WAT also contributes to heat generation through the browning process. The activation of heat production increases energy expenditure and improves metabolic diseases such as obesity and insulin resistant type 2 diabetes. On the other hand, in mice deficient in fatty acid β-oxidation, excessive fat appears and becomes sensitive to low-temperature stress, and it can be expected that fatty acid β-oxidation is involved in heat generation and differentiation of adipose tissue, but fatty acid β-oxidation-mediated heat production is It is not known whether it is controlled by mechanisms.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.Throughout this specification, a number of papers and patent documents are referenced and citations are indicated. The disclosure contents of the cited papers and patent documents are incorporated by reference in this specification as a whole, and the level of the technical field to which the present invention belongs and the contents of the present invention are more clearly described.

비특허문헌 1. J Interferon Cytokine Res. 2011 Jan; 31(1): 131-135. Non-Patent Document 1. J Interferon Cytokine Res. 2011 Jan; 31(1): 131-135.

본 발명자들은 생체 내에서의 열생성을 증가시킴으로써 대사증후군을 비롯한 다양한 열생성 저하증(thermogenic hypofunction)을 치료하고 저온 노출 환경에 대한 내성을 부여할 수 있는 효율적인 열생성 증진제를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 인터페론(IFN)-유도 단백질인 바이페린을 억제하는 물질을 개체에 투여할 경우 개체의 간, 심장, 지방 등의 조직에서 열 생성률이 현저히 증가하고, 열생성/지방산 β-산화 관련 유전자의 발현이 증가하며, 이를 통해 저온 환경 하에서도 체온이 유지될 수 있음을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors have made extensive research efforts to develop an effective thermogenic enhancer capable of treating various thermogenic hypofunctions including metabolic syndrome by increasing thermogenicity in vivo and imparting resistance to a low-temperature exposure environment. As a result, when a substance that inhibits biperin, an interferon (IFN)-inducing protein, is administered to an individual, the rate of heat production in tissues such as liver, heart, and fat of the individual is significantly increased, and the thermogenic/fatty acid β-oxidation-related gene By finding that the expression of is increased, and through this, the body temperature can be maintained even in a low temperature environment, the present invention has been completed.

따라서 본 발명의 목적은 생체 내 열생성(thermogenesis) 증진용 조성물을 제공하는 데 있다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a composition for enhancing thermogenesis in vivo.

본 발명의 다른 목적은 저온 내성(cold-tolerance) 증진용 조성물을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a composition for improving cold-tolerance.

본 발명의 또 다른 목적은 생체 내 열생성(thermogenesis) 증진용 조성물의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a method for screening a composition for enhancing thermogeneration in vivo.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.Other objects and advantages of the present invention will become more apparent by the following detailed description, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 바이페린(viperin) 억제제를 유효성분으로 포함하는 생체 내 열생성(thermogenesis) 증진용 조성물을 제공한다.According to one aspect of the present invention, the present invention provides a composition for enhancing thermogeneration in vivo, comprising a viperin inhibitor as an active ingredient.

본 발명자들은 생체 내에서의 열생성을 증가시킴으로써 대사증후군을 비롯한 다양한 열생성 저하증(thermogenic hypofunction)을 치료하고 저온 노출 환경에 대한 내성을 부여할 수 있는 효율적인 열생성 증진제를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 인터페론(IFN)-유도 단백질인 바이페린을 억제하는 물질을 개체에 투여할 경우 개체의 간, 심장, 지방 등의 조직에서 열 생성률이 현저히 증가하고, 열생성/지방산 β-산화 관련 유전자의 발현이 증가하며, 이를 통해 저온 환경 하에서도 체온이 유지될 수 있음을 발견하였다. The present inventors have made extensive research efforts to develop an effective thermogenic enhancer capable of treating various thermogenic hypofunctions including metabolic syndrome by increasing thermogenicity in vivo and imparting resistance to a low-temperature exposure environment. As a result, when a substance that inhibits biperin, an interferon (IFN)-inducing protein, is administered to an individual, the rate of heat production in tissues such as liver, heart, and fat of the individual is significantly increased, and the thermogenic/fatty acid β-oxidation-related gene It was found that the expression of is increased, and through this, body temperature can be maintained even in a low temperature environment.

본 명세서에서 용어“열생성(thermogenesis) 증진”은 외부로부터의 열공급이 없는 상태에서 대상체 내의 열생성량이 자율적으로(utonomously) 증가하도록 하는 것을 의미한다. 따라서 “열생성 증진용 조성물”은“열생성 저하증(thermogenic hypofunction)의 예방 또는 치료용 조성물”과 동일한 의미로 사용된다.In the present specification, the term "promoting thermogenesis" refers to autonomously increasing the amount of heat produced in a subject in the absence of external heat supply. Therefore, “composition for enhancing thermogenic” is used in the same meaning as “composition for preventing or treating thermogenic hypofunction”.

본 명세서에서 용어“억제제”는 바이페린의 활성 또는 발현의 저하를 야기시키는 물질을 의미하며, 이에 의해 바이페린의 활성 또는 발현이 탐지 불가능해지거나 무의미한 수준으로 존재하게 되는 경우 뿐 아니라, 바이페린에 의한 지방산 β-산화와 열생성의 억제가 유의하게 저하될 수 있을 정도로 바이페린의 활성 또는 발현을 저하시키는 물질을 의미한다. In the present specification, the term “inhibitor” refers to a substance that causes a decrease in the activity or expression of biperin, whereby the activity or expression of biperin becomes undetectable or exists at an insignificant level, as well as It refers to a substance that lowers the activity or expression of biperin to such an extent that the inhibition of fatty acid β-oxidation and heat generation by the fatty acid can be significantly reduced.

바이페린의 억제제는 예를 들어 당업계에 이미 그 서열 및 구조가 공지된 단백질인 바이페린의 발현을 유전자 수준에서 억제하는 shRNA, siRNA, miRNA, 리보자임(ribozyme), PNA(peptide nucleic acids) 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드와, 단백질 수준에서 억제하는 항체 또는 앱타머 뿐 아니라, 바이페린의 활성을 억제하는 화합물, 펩타이드 및 천연물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.Inhibitors of biperin are, for example, shRNA, siRNA, miRNA, ribozyme, peptide nucleic acids (PNA) that inhibit the expression of biperin, a protein whose sequence and structure are already known in the art, at the gene level. Antisense oligonucleotides and antibodies or aptamers that inhibit at the protein level, as well as compounds, peptides, and natural products that inhibit the activity of biperine, but are not limited thereto.

본 명세서에서 용어“shRNA(small hairpin RNA)”는 in vivo 상에서 스템-루프(stem-loop) 구조를 이루는 단일 가닥으로 50-70개로 구성된 뉴클레오타이드로서, RNA 간섭을 통해 타겟 유전자의 발현을 억제하기 위한 타이트한 헤어핀 구조를 만드는 RNA 서열을 의미한다. 통상적으로 5-10개의 뉴클레오타이드의 루프 부위 양쪽으로 상보적으로 19-29개의 뉴클레오타이드의 긴 RNA가 염기쌍을 이루어 이중가닥의 스템을 형성하며, 언제나 발현되도록 하기 위하여 U6 프로모터를 포함하는 벡터를 통해 세포 내로 형질도입되며 대개 딸세포로 전달되어 타겟 유전자의 발현억제가 유전되도록 한다. As used herein, the term “shRNA (small hairpin RNA)” is a single strand consisting of 50-70 nucleotides constituting a stem-loop structure in vivo, and is used to inhibit the expression of a target gene through RNA interference. It refers to an RNA sequence that creates a tight hairpin structure. Typically, long RNAs of 19-29 nucleotides complementary to both sides of the loop portion of 5-10 nucleotides form a double-stranded stem by base pairing, and in order to be expressed at any time, into the cell through a vector containing the U6 promoter. It is transduced and is usually delivered to daughter cells, allowing the expression of the target gene to be inherited.

본 명세서에서 용어“siRNA”는 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 타겟 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 가장 바람직하게는 20 내지 70 염기이고, 타겟 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt)말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3 말단 돌출한 구조와 5 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하다. As used herein, the term “siRNA” refers to a short double-stranded RNA capable of inducing RNAi (RNA interference) through cleavage of a specific mRNA. It is composed of a sense RNA strand having a sequence homologous to the mRNA of the target gene and an antisense RNA strand having a sequence complementary thereto. The total length is 10 to 100 bases, preferably 15 to 80 bases, most preferably 20 to 70 bases, and if the expression of the target gene can be suppressed by the RNAi effect, the blunt end or cohesive Both ends are possible. The structure of the adhesive end can be a structure that protrudes at the 3 end and a structure which protrudes at the 5 end.

본 명세서에서 용어 “miRNA(microRNA)”는 세포내에서 발현되지 않는 올리고뉴클레오타이드로서 짧은 스템-루프 구조를 가지면서 타겟 유전자의 mRNA와 상보적인 결합을 통하여 타겟 유전자 발현을 억제하는 단일 가닥 RNA분자를 의미한다.As used herein, the term “miRNA (microRNA)” refers to a single-stranded RNA molecule that suppresses the expression of a target gene through complementary binding to the mRNA of the target gene while having a short stem-loop structure as an oligonucleotide that is not expressed in cells. do.

본 명세서에서 용어“리보자임(ribozyme)”은 RNA의 일종으로 특정한 RNA의 염기 서열을 인식하여 자체적으로 이를 절단하는 효소와 같은 기능을 가진 RNA 분자를 의미한다. 리보자임은 타겟 mRNA 가닥의 상보적인 염기서열로 특이성을 가지고 결합하는 영역과 타겟 RNA를 절단하는 영역으로 구성된다.In the present specification, the term "ribozyme" refers to an RNA molecule that has the same function as an enzyme that recognizes the base sequence of a specific RNA and cuts it by itself as a kind of RNA. Ribozyme is composed of a region that binds with specificity with a complementary nucleotide sequence of a target mRNA strand and a region that cleaves the target RNA.

본 명세서에서 용어“PNA(Peptide nucleic acid)”는 핵산과 단백질의 성질을 모두 가지면서 DNA 또는 RNA와 상보적으로 결합이 가능한 분자를 의미한다. PNA는 자연계에서는 발견되지 않고 인공적으로 화학적인 방법으로 합성되며, 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization)를 통해 이중가닥을 형성하여 타겟 유전자의 발현을 조절한다. In the present specification, the term "PNA (Peptide nucleic acid)" refers to a molecule capable of complementarily binding to DNA or RNA while having both the properties of a nucleic acid and a protein. PNA is not found in nature and is artificially synthesized by chemical methods, and it forms double strands through hybridization with natural nucleic acids of complementary nucleotide sequences to regulate the expression of target genes.

본 명세서에서 용어 “안티센스 올리고뉴클레오타이드”는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열로서 타겟 mRNA 내의 상보적 서열에 결합하여 이의 단백질로의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해하는 핵산 분자를 의미한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5(3):343-55, 1995). 올리고뉴클레오타이드 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당숄포네이 등으로 변형될 수 있다. As used herein, the term “antisense oligonucleotide” is a nucleotide sequence that is complementary to the sequence of a specific mRNA and binds to the complementary sequence in the target mRNA and translates it into a protein, translocation into the cytoplasm, maturation, or any other It refers to a nucleic acid molecule that inhibits essential activity for an overall biological function. Antisense oligonucleotides can be modified at the site of one or more bases, sugars or backbones to enhance efficacy (De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol. , 5(3):343-55, 1995). . The oligonucleotide skeleton may be modified with phosphorothioate, phosphotriester, methyl phosphonate, short-chain alkyl, cycloalkyl, short-chain heteroatomic, heterocyclic sugar scholphone, and the like.

본 발명에 따르면, 본 발명의 바이페린 억제제는 바이페린의 활성을 단백질 수준에서 저해하는 바이페린 특이적 항체일 수 있다. 바이페린을 특이적으로 인식하는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다.According to the present invention, the biperin inhibitor of the present invention may be a biperin-specific antibody that inhibits the activity of biperin at the protein level. Antibodies that specifically recognize biperin are polyclonal or monoclonal antibodies, preferably monoclonal antibodies.

본 발명의 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519 (1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,567호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; 및 Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984에 상세하게 기재되어 있다. Antibodies of the present invention are conventionally practiced in the art, for example, a fusion method (Kohler and Milstein, European Journal of Immunology , 6:511-519 (1976)), a recombinant DNA method (US Pat. No. 4,816,567). ) Or phage antibody library method (Clackson et al, Nature , 352:624-628 (1991) and Marks et al, J. Mol. Biol. , 222:58, 1-597 (1991)). . General procedures for antibody production are described in Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; And Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques , CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984.

본 발명은 항체 대신 바이페린에 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용하여 이의 활성을 억제할 수도 있다. 본 명세서에서 용어“앱타머”는 특정 표적물질에 높은 친화력과 특이성으로 결합하는 단일 줄기의(single-stranded) 핵산(RNA 또는 DNA) 분자 또는 펩타이드 분자를 의미한다. 앱타머의 일반적인 내용은 Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):426-30(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):14272-7(1998)에 상세하게 개시되어 있다.The present invention may inhibit its activity by using an aptamer that specifically binds to biperin instead of an antibody. In the present specification, the term "aptamer" refers to a single-stranded nucleic acid (RNA or DNA) molecule or a peptide molecule that binds to a specific target material with high affinity and specificity. The general description of aptamers is Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):426-30(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):14272-7(1998).

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 의한 열생성은 지방 조직에서의 열생성이다.According to a specific embodiment of the present invention, heat generation by the composition of the present invention is heat generation in adipose tissue.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 Ucp1, Pgc1α, Cidea, Pparα, Pparβ/δ, Cpt1, 아디포넥틴, Fabp4 및 C/ebpα로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현을 증가시킨다.According to a specific embodiment of the present invention, the composition of the present invention increases the expression of one or more genes selected from the group consisting of Ucp1 , Pgc1α , Cidea, Pparα, Pparβ/δ , Cpt1 , adiponectin, Fabp4 and C/ebpα .

본 명세서에서 용어“발현의 증가”는 상기 나열된 유전자의 발현 정량값이 본 발명의 바이페린 억제제를 투여하지 않은 대조군에 비하여 측정 가능할 정도로 증가한 경우를 의미하며, 구체적으로는 대조군에 비해 발현량이 110% 이상인 경우를 의미하고, 보다 구체적으로는 120% 이상인 경우를 의미하며, 가장 구체적으로는 130% 이상인 경우를 의미한다.In the present specification, the term “increased expression” refers to a case where the quantified value of the expression of the genes listed above is measurably increased compared to the control group to which the biperin inhibitor of the present invention is not administered, and specifically, the expression level is 110% compared to the control group. It means the case of the above, more specifically, the case of 120% or more, and most specifically, the case of 130% or more.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 아드레날린 신호 경로 활성화제를 추가적인 유효성분으로 포함한다. According to a specific embodiment of the present invention, the composition of the present invention comprises an adrenaline signaling pathway activator as an additional active ingredient.

후술하는 실시예에서 보는 바와 같이, 본 발명의 바이페린 억제제는 아드레날린 신호 경로를 경유하여 지방산 β-산화와 지방조직에서의 열생성을 유도하며, 바이페린을 억제하는 동시에 아드레날린 신호 경로를 활성화시킬 경우 이러한 열생성은 더욱 증가하였다. 따라서 아드레날린 신호 경로 활성화제는 열생성 증진을 위해 추가되는 보조적 유효성분으로서 이용될 수 있다. As shown in the examples to be described later, the biperine inhibitor of the present invention induces fatty acid β-oxidation and heat production in adipose tissue via the adrenergic signaling pathway, and inhibits biperin and activates the adrenergic signaling pathway. This heat generation was further increased. Therefore, the adrenaline signaling pathway activator can be used as an auxiliary active ingredient added to enhance heat production.

구체적으로는, 상기 아드레날린 신호 경로 활성화제는 β3-아드레날린 수용체(ADRB3) 아고니스트이며, 보다 구체적으로는 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.Specifically, the adrenaline signaling pathway activator is a β3-adrenergic receptor (ADRB3) agonist, and more specifically, a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

화학식 1Formula 1

Figure 112019093578736-pat00001
Figure 112019093578736-pat00001

상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 Cl-316243 (5-[(2R)-2-[[(2R)-2-(3-클로로페닐)-2-하이드록시에틸]아미노]프로필]-1,3-벤조디옥솔-2,2-디카복실산)이다.The compound represented by Formula 1 is Cl-316243 (5-[(2R)-2-[[(2R)-2-(3-chlorophenyl)-2-hydroxyethyl]amino]propyl]-1,3 -Benzodioxole-2,2-dicarboxylic acid).

본 명세서에서 용어“약제학적으로 허용되는 염”은 약학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다. 적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 트리플루로초산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등을 들 수 있다. 적합한 염기로부터 유도된 염은 나트륨 등의 알칼리 금속, 마그네슘 등의 알칼리 토금속, 및 암모늄 등을 포함할 수 있다. 구체적으로는, 본 발명에서 사용되는 약제학적으로 허용되는 염은 나트륨염이다.In the present specification, the term “pharmaceutically acceptable salt” includes salts derived from pharmaceutically acceptable inorganic acids, organic acids, or bases. Examples of suitable acids are hydrochloric acid, bromic acid, sulfuric acid, nitric acid, perchloric acid, fumaric acid, maleic acid, phosphoric acid, glycolic acid, lactic acid, salicylic acid, succinic acid, toluene-p-sulfonic acid, tartaric acid, acetic acid, trifluroacetic acid, citric acid, methane And sulfonic acid, formic acid, benzoic acid, malonic acid, naphthalene-2-sulfonic acid, and benzenesulfonic acid. Salts derived from suitable bases may include alkali metals such as sodium, alkaline earth metals such as magnesium, and ammonium and the like. Specifically, the pharmaceutically acceptable salt used in the present invention is a sodium salt.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 바이페린(viperin) 억제제를 유효성분으로 포함하는 저온 내성(cold-tolerance) 증진용 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a composition for enhancing cold-tolerance, comprising a viperin inhibitor as an active ingredient.

본 발명에서 이용되는 바이페린 억제제에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.Since the biperin inhibitor used in the present invention has already been described above, description thereof will be omitted to avoid excessive duplication.

본 명세서에서 용어“저온 내성(cold-tolerance)”은 생존, 생장 및 생체 기능을 저하시킬 수 있는 낮은 온도에 일정 기간 노출된 경우에도 생존 능력, 생장 능력 및 정상적인 생체기능을 유지하는 개체의 능력을 의미하며, 구체적으로는 저온 노출시 본 발명의 조성물을 투여하지 않은 대조군에 비해 보다 높은 체온을 유지하는 능력을 의미한다. 구체적으로,“저온(cold)”은 상온(room temperature) 미만을 의미하며, 보다 구체적으로는 15℃ 이하, 보다 더 구체적으로는 10℃ 이하, 가장 구체적으로는 5℃ 이하의 환경을 의미한다. As used herein, the term “cold-tolerance” refers to the ability of an individual to maintain viability, growth ability, and normal biological function even when exposed to a low temperature for a certain period of time that may degrade survival, growth and biological function. It means, specifically, refers to the ability to maintain a higher body temperature than the control group to which the composition of the present invention was not administered when exposed to low temperatures. Specifically, "cold" means less than room temperature, more specifically 15°C or less, more specifically 10°C or less, and most specifically 5°C or less.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 생체 내 열생성(thermogenesis) 증진용 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다:According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for screening a composition for promoting thermoogenesis in vivo comprising the following steps:

(a) 바이페린(viperin)을 포함하는 생물학적 시료에 후보물질을 접촉시키는 단계; (a) contacting a candidate substance with a biological sample containing viperin;

(b) 상기 시료 내 바이페린의 활성 또는 발현량을 측정하는 단계, (b) measuring the activity or expression level of biperine in the sample,

상기 바이페린의 활성 또는 발현량이 감소한 경우, 상기 후보물질은 생체 내 열생성(thermogenesis) 증진용 조성물로 판정한다. When the activity or expression level of the biperine decreases, the candidate substance is determined as a composition for promoting thermoogenesis in vivo.

본 발명에서 지시하는“열생성 증진”의 의미에 대해서는 이미 상술하였으므로 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.Since the meaning of “improving heat generation” indicated in the present invention has already been described above, description thereof is omitted to avoid excessive redundancy.

본 발명에서 용어“생물학적 시료”는 인간을 포함한 포유동물로부터 얻어지는, 바이페린을 발현하는 세포를 포함하고 있는 모든 시료로서, 조직, 기관, 세포 또는 세포 배양액을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로는, 본 발명에서 이용되는 생물학적 시료는 간 조직, 심장 조직, 지방 조직, 이들로부터 유래한 세포 및 세포 배양액으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함한다. In the present invention, the term "biological sample" is any sample containing cells expressing biperin obtained from mammals including humans, and includes, but is not limited to, tissues, organs, cells, or cell culture. Specifically, the biological sample used in the present invention includes any one or more selected from the group consisting of liver tissue, heart tissue, adipose tissue, cells derived therefrom, and cell culture fluid.

본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 “시험물질”은 바이페린을 발현하는 세포를 포함하는 시료에 첨가되어 바이페린의 활성 또는 발현량에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시험물질은 화합물, 뉴클레오타이드, 펩타이드 및 천연 추출물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 시험물질을 처리한 생물학적 시료에서 바이페린의 발현량 또는 활성을 측정하는 단계는 당업계에 공지된 다양한 발현량 및 활성 측정방법에 의해 수행 될 수 있다. 측정 결과, 바이페린의 발현량 또는 활성이 감소한 경우 상기 시험물질은 생체 내 열생성 증진용 조성물로 판정될 수 있다.The term “test substance” used while referring to the screening method of the present invention is an unknown used in screening to examine whether it is added to a sample containing biperin-expressing cells and affects the activity or expression level of biperin. Means the substance of. The test substances include, but are not limited to, compounds, nucleotides, peptides, and natural extracts. The step of measuring the expression level or activity of biperin in a biological sample treated with the test substance may be performed by various methods for measuring expression level and activity known in the art. As a result of the measurement, when the expression amount or activity of biperin is decreased, the test substance may be determined as a composition for enhancing heat generation in vivo.

본 명세서에서 용어“발현의 감소”는 바이페린의 발현량이 대상체 내에서의 열생성이 유의하게 증가, 개선 또는 회복될 수 있을 정도로 감소하는 것을 의미한다. 구체적으로는 대조군에 비하여 활성 또는 발현량이 20% 이상 감소한 상태, 보다 구체적으로는 30% 이상 감소한 상태, 더욱 구체적으로는 40% 이상 감소한 상태를 의미할 수 있다.In the present specification, the term “reduction in expression” means that the amount of expression of biperin is significantly increased, improved, or decreased to such an extent that heat production in a subject can be recovered. Specifically, it may mean a state in which the activity or expression level is reduced by 20% or more, more specifically, by 30% or more, and, more specifically, by 40% or more compared to the control group.

본 명세서에서 용어“활성의 감소”란 대조군에 비하여 단백질의 생체내 고유한 기능이 측정 가능할 정도로 유의하게 감소하는 것을 말하며, 구체적으로는 지방산 β-산화 및 열생성을 억제하는 바이페린의 활성이 저하되어 대상체 내에서의 열생성이 유의하게 증가, 개선 또는 회복될 수 있을 정도로 바이페린의 활성이 감소하는 것을 말한다. 활성(activity)의 감소는 단순한 기능(function)의 감소 뿐 아니라 안정성(stability)의 감소로 기인한 궁극적인 활성 저해를 포함한다.In the present specification, the term “reduction in activity” refers to a significant decrease in the intrinsic function of the protein in vivo compared to the control group. Specifically, the activity of biperin, which inhibits fatty acid β-oxidation and heat production, decreases. It refers to a decrease in the activity of biperin to the extent that heat production in the subject can be significantly increased, improved, or recovered. Reduction in activity includes not only a simple decrease in function, but also the ultimate inhibition of activity due to a decrease in stability.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:

(a) 본 발명은 생체 내 열생성(thermogenesis) 증진용 조성물 및 저온 내성(cold-tolerance) 증진용 조성물을 제공한다.(a) The present invention provides a composition for enhancing thermogeneration in vivo and a composition for improving cold-tolerance.

(b) 본 발명은 생체 내에서의 열생성을 증가시킴으로써 대사증후군을 비롯한 다양한 열생성 저하증(thermogenic hypofunction)을 치료하고 저온 노출 환경에 대한 내성을 부여할 수 있는 효율적인 열생성 증진제로 유용하게 이용될 수 있다.(b) The present invention can be usefully used as an efficient thermogenic enhancer capable of treating various thermogenic hypofunctions including metabolic syndrome by increasing thermogenicity in vivo and imparting resistance to a low-temperature exposure environment. I can.

도 1은 지방 조직에서 바이페린의 내재적 발현이 대사 및 열생성을 조절함을 보여주는 그림이다. 도 1a는 SPF 및 GF 마우스의 다양한 조직에서의 바이페린 발현을 보여준다. 도 1b는 WT 및 바이페린 KO 마우스의 지방 조직인 eWAT, iWAT 및 BAT의 육안 형태를 나타낸다. 도 1c는 WT 및 바이페린 KO 마우스에 15주령부터 30주령까지 RC 또는 HFD를 먹이고(15 주간 섭식) 지방 조직의 바이페린 발현을 조사한 결과이다(n=3). 데이터는 생물학적으로 독립적인 시료들의 평균±표준오차로 나타냈다. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 vs. WT.
도 2는 바이페린 결핍이 지방조직에서의 열생성-관련 유전자 및 단백질의 발현을 촉진시킴을 보여주는 그림이다. RC 또는 HFD를 15주간 먹인 WT 및 바이페린 KO 마우스에서 지방 조직을 분리하였다. 도 2a는 지방 조직에서 열생성 및 지방산 β-산화 관련 유전자의 상대적인 mRNA 수준을 보여준다(n=6). 도 2b는 BAT에서 바이페린 및 UCP1의 단백질 발현을 나타낸다(n=3). 도 2c는 지방 조직에서 UCP1에 대한 면역조직화학 염색결과를 보여준다(스케일바:200μm). 도 2d는 지방 조직의 면역형광 염색 결과를 나타낸다. DAPI, 핵(파란색); 바이페린(녹색); MFN-1, 미토콘드리아 마커(붉은색). 화살표는 미토콘드리아에 위치한 바이페린을 가리킨다(스케일바:50 μm). 데이터는 생물학적으로 독립적인 시료들의 평균±표준오차로 나타냈다. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001 vs. WT.
도 3은 바이페린 결핍이 열생성을 촉진하고 저온 내성을 가져옴을 보여주는 그림이다. 도 3a는 7일간의 저온 노출기간 동안 21주령 WT 및 바이페린 KO 마우스의 직장 온도를 보여준다(n=4-7). 만성적인 저온에 노출시킨 WT 및 바이페린 KO 마우스에서의 지방조직의 총중량(n=4-7)(도 3b), 지방조직에서 열생성 및 지방산 β-산화 관련 유전자의 상대적인 mRNA 수준(n=4-7)(도 3c), BAT에서 바이페린 및 UCP1의 단백질 발현(n=3)(도 3d) 및 지방 조직에서 UCP1에 대한 면역조직화학 염색 결과(스케일바: 200μm)(도 3e)를 각각 나타내었다.
도 4는 β3-아드레날린 수용체(ADRB3) 아고니스트가 바이페린 KO 마우스에서 열발생 표현형을 촉진함으로 보여주는 그림이다. WT 및 바이페린 KO 마우스에 ADRB3 아고니스트인 CL-316243를 복강(1mg/kg 체중/일)으로 3일간 투여하였다. CL-처리 마우스에 대해서, 도 4a는 지방 조직의 총중량(n = 6), 도 4b는 지방 조직에서의 열생성- 및 지방산 β-산화-관련 유전자의 상대적인 mRNA 수준(n = 6), 도 4c는 iWAT에서의 바이페린과 UCP1의 단백질 발현 수준(n = 3), 그리고 도 4d는 지방 조직의 UCP1에 대한 면역조직화학 염색 결과(스케일바: 200μm)를 각각 나타낸다. 데이터는 생물학적으로 독립적인 시료들의 평균±표준오차로 나타냈다. *P<0.05; **P<0.001 vs. WT.
도 5는 바이페린이 지방세포-자율적으로 지방산 β 산화-매개 열생성을 조절함을 보여주는 그림이다. 간질혈관분획(stromal vascular fraction, SVF)을 BAT로부터 분리한 뒤 성숙한 갈색 지방세포로 분화시켰다. 도 5a는 분화하는 동안 갈색 지방세포에서의 지방생성-, 열생성- 및 지방산 β-산화-관련 유전자의 상대적인 mRNA 수준을 나타낸다. 도 5b 및 5c는 CL-처리된 갈색 지방세포(도 5b) 및 ETO(에토목실; 좌측)- 또는 RAN(라노라진; 우측)-처리된 갈색 지방세포(도 5c)에서의 열생성-관련 유전자의 상대적인 mRNA 수준을 각각 보여준다. 도 5d는 CL 처리(상단) 또는 ETO 처리(하단) 후 WT 및 바이페린 KO 갈색 지방세포에서의 OCR 및 미토콘드리아 파라미터(기저 호흡, ATP 생성, 양이온 누출 및 최대 호흡)를 보여준다. 데이터는 2개의 독립적인 실험값에 대한 평균±표준오차로 나타냈다. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001 vs. WT.
도 6은 RC 또는 HFD를 장기간 동안 먹인 어린 WT 및 바이페린 KO 마우스의 체중 변화를 보여주는 그림이다. WT 및 바이페린 KO 마우스에 RC 또는 HFD를 6주령에서 21주령까지 먹였다(15주간 섭식). 데이터는 생물학적으로 독립적인 시료들의 평균±표준오차로 나타냈다.
도 7은 RC 또는 HFD를 단기간 동안 먹인 중간 연령 WT 및 바이페린 KO 마우스의 표현형을 보여주는 그림이다. WT 및 바이페린 KO 마우스에 RC 또는 HFD를 16주령에서 20주령까지 먹였다(4주간 섭식). 도 7a는 체중변화를(n=5-7), 도 7b는 기관 무게를(n=5-7) 각각 나타낸다. 데이터는 생물학적으로 독립적인 시료들의 평균±표준오차로 나타냈다.
도 8은 RC 또는 HFD를 장기간 동안 먹인 어린 마우스의 지방조직에서 열생성-관련 유전자의 발현을 보여주는 그림이다. WT 및 바이페린 KO 마우스에 RC 또는 HFD를 6주령에서 21주령까지 먹였다(15주간 섭식). RC(도 8a) 또는 HFD(도 8b)를 먹인 마우스의 지방조직에서 열생성- 및 지방산 β-산화 관련 유전자의 상대적인 mRNA 수준을 각각 타나낸다(n=3-4). 데이터는 생물학적으로 독립적인 시료들의 평균±표준오차로 나타냈다. *P<0.05,**P<0.01 and ***P<0.001 vs. WT.
도 9는 RC 또는 HFD를 단기간 동안 먹인 중간 연령 마우스의 지방조직에서 열생성-관련 유전자의 발현을 보여주는 그림이다. WT 및 바이페린 KO 마우스에 RC 또는 HFD를 16주령에서 20주령까지 먹였다(4주간 섭식). RC(도 9a) 또는 HFD(도 9b)를 먹인 마우스의 지방조직에서 열생성- 및 지방산 β-산화 관련 유전자의 상대적인 mRNA 수준을 각각 타나낸다(n=3-4). 데이터는 생물학적으로 독립적인 시료들의 평균±표준오차로 나타냈다. *P<0.05, **P<0.01 and ***P<0.001 vs. WT.
도 10은 RC 또는 HFD를 장기간 먹인 중간 연령 마우스의 지방조직에서 사이토카인 발현을 관찰한 결과이다. WT 및 바이페린 KO 마우스를 RC 또는 HFD를 15주령에서 30주령까지 먹였다(15주간 섭식). 도 10a는 지방조직에서 바이페린에 대한 면역조직화학 염색 결과를 나타내며(스케일바:200μm), 도 10b는 지방조직의 면역형광 염색 결과를 보여준다. DAPI, 핵(blue); 바이페린(파란색); F4/80, 대식세포 마커(붉은색). 화살표는 대식세포에 위치한 바이페린을 가리킨다. 닫힌 화살표 머리는 바이페린을, 열린 화살표 머리는 대식세포를 각각 나타낸다. 도 10c 및 d는 RC를 먹인 마우스(도 10c)와 HFD를 먹인 마우스(도 10d)의 지방조직에서 사이토카인의 상대적인 mRNA 수준을 각각 나타낸다(n=3-4). 데이터는 생물학적으로 독립적인 시료들의 평균±표준오차로 나타냈다. *P<0.05 vs. WT.
도 11은 저온 노출 또는 CL를 처리한 뒤 HFD를 먹인 WT 및 바이페린 KO 마우스의 열발생 표현형을 보여주는 그림이다. WT 및 바이페린 KO 마우스에 HFD를 6주령부터 21주령까지 먹였다(15주간 섭식). 7일간 저온 노출된 21주령 마우스의 직장 온도를(n=4-5)(도 11a), BAT(n=3)에서 바이페린 및 UCP1의 발현을(도 11b), 지방조직에서 UCP1에 대한 면역조직화학 염색 결과를(도 11c) 각각 나타내었다. WT 및 바이페린 KO 마우스에 CL-316243을 3일간 복강투여(1mg/kg 체중/d)하였다. HFD을 먹인 CL-처리 21주령 마우스에서 iWAT과 BAT에서의 바이페린 및 UCP1 단백질의 발현을 각각 측정하고(n=3)(도 11d 및 도 11e)(n=3), 지방조직에서의 UCP1에 대한 면역조직화학 염색을 수행하였다(도 11f)(스케일바:200μm). 데이터는 생물학적으로 독립적인 시료들의 평균±표준오차로 나타냈다. *P<0.05 및 **P<0.01 vs. WT.
도 12는 HFD 섭식 및/또는 저온 노출 후 WT 마우스의 갈색 지방조직에서의 바이페린 발현수준을 비교한 결과를 보여준다. WT 마우스에 RC 또는 HFD를 15주간 먹이거나 또는 저온상태에 7일간 노출시킨 후 BAT에서의 단백질 발현을 측정하였다(n=3). 데이터는 생물학적으로 독립적인 시료들의 평균±표준오차로 나타냈다.
도 13은 갈색 지방세포에서 바이페린의 세포 자율기능(Cell-autonomous function)을 보여주는 그림이다. BAT으로부터 SVF를 분리하여 성숙 갈색 지방세포로 분화시켰다. 도 13a는 분화하는 동안 갈색 지방세포에서 지방생성 및 열생성-관련 유전자의 상대적인 RNA 수준을 나타낸다. 도 13b는 분리된 SVF 및 SVF-분화된 갈색 지방세포에서 사이토카인의 상대적 mRNA 수준을 나타낸다. 데이터는 2개의 독립적인 실험값에 대한 평균±표준오차로 나타냈다. *P<0.05, **P<0.01 및 ***P<0.001 vs. WT.
도 14는 백색 지방세포에서 바이페린의 세포 자율기능(Cell-autonomous function)을 보여주는 그림이다. eWAT으로부터 SVF를 분리하여 성숙 백식 지방세포로 분화시켰다. 도 14a는 분화하는 동안 백색 지방세포에서 지방생성 및 열생성-관련 유전자의 상대적인 mRNA 수준을 나타낸다. 도 14b는 ETO(에토목실)- 또는 RAN(라노라진)을 처리한 백색 지방세포에서의 바이페린 및 UCP1의 상대적인 mRNA 수준을 나타낸다. 데이터는 2개의 독립적인 실험값에 대한 평균±표준오차로 나타냈다. *P<0.05, **P<0.01 및 ***P<0.001 vs. WT1 is a diagram showing that the intrinsic expression of biperin in adipose tissue regulates metabolism and heat production. 1A shows biperine expression in various tissues of SPF and GF mice. 1B shows the macroscopic morphology of eWAT, iWAT and BAT, which are adipose tissues of WT and biperin KO mice. FIG. 1C is a result of WT and biperine KO mice fed with RC or HFD from 15 weeks to 30 weeks of age (15 weeks of feeding) and investigated the expression of biperin in adipose tissue (n=3). Data are expressed as the mean±standard error of biologically independent samples. *P <0.05; **P <0.01; ***P <0.001 vs. WT.
2 is a diagram showing that biperine deficiency promotes the expression of thermogenic-related genes and proteins in adipose tissue. Adipose tissue was isolated from WT and biperine KO mice fed RC or HFD for 15 weeks. 2A shows the relative mRNA levels of genes related to thermogeneration and fatty acid β-oxidation in adipose tissue (n=6). Figure 2b shows the protein expression of biperin and UCP1 in BAT (n=3). 2C shows the results of immunohistochemical staining for UCP1 in adipose tissue (scale bar: 200 μm). 2D shows the results of immunofluorescence staining of adipose tissue. DAPI, nucleus (blue); Biperine (green); MFN-1, mitochondrial marker (red). Arrows point to biperine located in the mitochondria (scale bar: 50 μm). Data are expressed as the mean±standard error of biologically independent samples. *P<0.05;**P<0.01;***P<0.001 vs. WT.
3 is a diagram showing that biperine deficiency promotes heat generation and results in low temperature tolerance. Figure 3a shows the rectal temperature of 21-week-old WT and biperine KO mice during a 7-day cold exposure period (n=4-7). Total weight of adipose tissue in WT and biperine KO mice exposed to chronic low temperature (n=4-7) (Fig.3b), relative mRNA levels of genes related to thermogenic and fatty acid β-oxidation in adipose tissue (n=4 -7) (Fig. 3c), protein expression of biperin and UCP1 in BAT (n = 3) (Fig. 3d) and immunohistochemical staining results for UCP1 in adipose tissue (scale bar: 200 μm) (Fig. 3e), respectively. Indicated.
Figure 4 is a diagram showing that the β3-adrenergic receptor (ADRB3) agonist promotes the thermogenic phenotype in biperine KO mice. CL-316243, an ADRB3 agonist, was administered intraperitoneally (1 mg/kg body weight/day) to WT and biperine KO mice for 3 days. For CL-treated mice, Figure 4a is the total weight of adipose tissue (n = 6), Figure 4b is the relative mRNA levels of thermogenic- and fatty acid β-oxidation-related genes in adipose tissue (n = 6), Figure 4c Is the protein expression levels of biperine and UCP1 in iWAT (n = 3), and Figure 4d shows the immunohistochemical staining results (scale bar: 200 μm) for UCP1 in adipose tissue, respectively. Data are expressed as the mean±standard error of biologically independent samples. *P<0.05;**P<0.001 vs. WT.
5 is a diagram showing that biperin regulates fat cell-autonomous fatty acid β oxidation-mediated heat production. The stromal vascular fraction (SVF) was isolated from BAT and then differentiated into mature brown adipocytes. 5A shows the relative mRNA levels of adipogenesis-, thermogenic- and fatty acid β-oxidation-related genes in brown adipocytes during differentiation. 5B and 5C show thermogenic-related genes in CL-treated brown adipocytes (FIG. 5B) and ETO (ethomoxil; left)- or RAN (ranorazine; right)-treated brown adipocytes (FIG. 5C). Shows the relative mRNA levels of each. Figure 5d shows OCR and mitochondrial parameters (basal respiration, ATP production, cation leakage and maximal respiration) in WT and biperine KO brown adipocytes after CL treatment (top) or ETO treatment (bottom). Data are expressed as the mean±standard error for two independent experimental values. *P<0.05;**P<0.01;***P<0.001 vs. WT.
6 is a diagram showing the change in body weight of young WT and biperin KO mice fed RC or HFD for a long period of time. WT and biperine KO mice were fed either RC or HFD from 6 to 21 weeks of age (15 weeks of feeding). Data are expressed as the mean±standard error of biologically independent samples.
FIG. 7 is a diagram showing the phenotype of middle-aged WT and biperine KO mice fed RC or HFD for a short period of time. WT and biperine KO mice were fed either RC or HFD from 16 to 20 weeks of age (4 weeks of feeding). Figure 7a shows the weight change ( n = 5-7), Figure 7b shows the weight of the organ ( n = 5-7), respectively. Data are expressed as the mean±standard error of biologically independent samples.
8 is a diagram showing the expression of thermogenic-related genes in adipose tissue of young mice fed with RC or HFD for a long period of time. WT and biperine KO mice were fed either RC or HFD from 6 to 21 weeks of age (15 weeks of feeding). Relative mRNA levels of thermogenic- and fatty acid β-oxidation-related genes in adipose tissue of mice fed with RC (Fig. 8a) or HFD (Fig. 8b) are shown, respectively ( n = 3-4). Data are expressed as the mean±standard error of biologically independent samples. * P <0.05,** P <0.01 and *** P <0.001 vs. WT.
9 is a diagram showing the expression of thermogenic-related genes in adipose tissue of middle-aged mice fed with RC or HFD for a short period of time. WT and biperine KO mice were fed either RC or HFD from 16 to 20 weeks of age (4 weeks of feeding). Relative mRNA levels of thermogenic- and fatty acid β-oxidation-related genes in adipose tissue of mice fed with RC (Fig. 9a) or HFD (Fig. 9b) are shown, respectively ( n = 3-4). Data are expressed as the mean±standard error of biologically independent samples. * P <0.05, ** P <0.01 and *** P <0.001 vs. WT.
Figure 10 This is the result of observing cytokine expression in adipose tissue of middle-aged mice fed with RC or HFD for a long time. WT and biperine KO mice were fed either RC or HFD from 15 to 30 weeks of age (15 weeks of feeding). Figure 10a It shows the results of immunohistochemical staining for biperine in adipose tissue (scale bar: 200 μm), and FIG. 10B shows the results of immunofluorescence staining of adipose tissue. DAPI, nucleus (blue); Biperine (blue); F4/80, macrophage marker (red). Arrows point to biperine located in macrophages. Closed arrow heads represent biperine and open arrow heads represent macrophages. Figures 10c and d show the relative mRNA levels of cytokines in adipose tissues of mice fed with RC (Figure 10c) and mice fed with HFD (Figure 10d), respectively ( n = 3-4). Data are expressed as the mean±standard error of biologically independent samples. * P <0.05 vs. WT.
Figure 11 The figure shows the thermogenic phenotype of WT and biperine KO mice fed HFD after cold exposure or CL treatment. WT and biperine KO mice were fed with HFD from 6 to 21 weeks of age (15 weeks of feeding). Rectal temperature of 21-week-old mice exposed to cold for 7 days ( n = 4-5) (Fig. 11A), expression of biperine and UCP1 in BAT ( n =3) (Fig. 11B), immunity to UCP1 in adipose tissue The histochemical staining results (Fig. 11c) are shown respectively. CL-316243 was administered intraperitoneally to WT and biperine KO mice for 3 days (1 mg/kg body weight/d). In CL-treated 21-week-old mice fed with HFD, expressions of biperin and UCP1 proteins in iWAT and BAT were respectively measured ( n = 3) (Figs. 11D and 11E) ( n =3), and UCP1 in adipose tissues Immunohistochemical staining was performed for (Fig. 11f) (scale bar: 200 μm). Data are expressed as the mean±standard error of biologically independent samples. * P <0.05 and ** P <0.01 vs. WT.
12 shows the results of comparing the expression level of biperin in brown adipose tissue of WT mice after HFD feeding and/or low temperature exposure. WT mice were fed with RC or HFD for 15 weeks or exposed to cold conditions for 7 days, and then protein expression in BAT was measured ( n = 3). Data are expressed as the mean±standard error of biologically independent samples.
13 is a diagram showing the cell-autonomous function of biperin in brown adipocytes. SVF was isolated from BAT and differentiated into mature brown adipocytes. 13A shows the relative RNA levels of adipogenesis and thermogenic-related genes in brown adipocytes during differentiation. 13B shows the relative mRNA levels of cytokines in isolated SVF and SVF-differentiated brown adipocytes. Data are expressed as the mean±standard error for two independent experimental values. * P <0.05, ** P <0.01 and *** P <0.001 vs. WT.
14 is a diagram showing the cell-autonomous function of biperin in white adipocytes. SVF was isolated from eWAT and differentiated into mature white phagocyte adipocytes. 14A shows the relative mRNA levels of adipogenesis and thermogenic-related genes in white adipocytes during differentiation. 14B shows the relative mRNA levels of biperin and UCP1 in white adipocytes treated with ETO (ethomoxil)- or RAN (ranorazine). Data are expressed as the mean±standard error for two independent experimental values. * P <0.05, ** P <0.01 and *** P <0.001 vs. WT

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for describing the present invention in more detail, and it will be apparent to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples according to the gist of the present invention. .

실시예Example

실험방법Experiment method

동물 실험 Animal testing

모든 동물실험은 연세대학교 의과대학의 동물실험윤리위원회의 승인 하에 그 가이드라인을 준수하면서 수행하였다. 마우스는 SPFF(특정 병원체 부재, specific pathogen-free) 격리장치에서 22℃의 12시간 광조건/12시간 암조건에서 유지하고, 물과 먹이를 자유롭게 먹도록 하였다.All animal experiments were conducted under the approval of the Animal Experimental Ethics Committee of Yonsei University College of Medicine, while complying with the guidelines. Mice were maintained in an SPFF (specific pathogen-free) isolation device at 22°C for 12 hours in light conditions/12 hours in dark conditions, and were allowed to freely eat water and food.

동물식이 Animal diet

본 발명에서는 야생형(WT) 및 바이페린(Rsad2) 녹아웃(KO) C57BL/6 수컷 마우스를 종래에 보고된 바와 같이 이용하였다(1). WT 및 바이페린 KO 마우스를 함께 배양하면서 일반식이(RC) 또는 고지방 식이(HFD)(60% of the 총 칼로리의 60%가 지방, 20%가 탄수화물, 20%가 단백질)(D12492; Research Diets)를 15주령에서 30주령까지(15 주간 섭식) 또는 6주령에서 21주령까지(15 주간 섭식) 먹였다.In the present invention, wild-type (WT) and biperin (Rsad2) knockout (KO) C57BL/6 male mice were used as previously reported (1). Normal diet (RC) or high fat diet (HFD) (60% of the total calories are 60% fat, 20% carbohydrates, 20% protein) while incubating WT and biperine KO mice together (D12492; Research Diets) Were fed from 15 to 30 weeks of age (15 weeks of feeding) or 6 to 21 of weeks (15 weeks of feeding).

조직 분리 Tissue separation

간, 심장, 중뇌, eWAT, iWAT 및 BAT를 RC 또는 HFD를 먹인 WT 및 바이페린 KO 마우스로부터 적출하였다. GF(germ-free) C57BL/6 마우스의 조직은 Charles D. Surh 박사(POSTECH)로부터 제공받았다. Liver, heart, midbrain, eWAT, iWAT and BAT were excised from WT and biperine KO mice fed RC or HFD. The tissues of germ-free (GF) C57BL/6 mice were provided by Dr. Charles D. Surh (POSTECH).

체온 및 저온 노출 Body temperature and low temperature exposure

열중립 적응을 위해, 20주령 WT 및 바이페린 KO 수컷 마우스(케이지당 한 마리)를 동물 인큐베이터(Dae Han Bio Link)에 넣고 30℃에서 12시간 광조건/12시간 암조건으로 2-3일간 RC 또는 HFD를 먹였다(2, 3). 저온 노출을 위해 인큐베이터를 4℃까지 감온하고 마우스를 넣은 뒤 7일간 자유롭게 물과 먹이를 먹도록 하였다. 저온노출 동안 상이한 시간간격으로 심부체온(core body temperature)을 측정하였다. 또한, HFD를 먹인 21주령 WT 및 바이페린 KO 마우스에 ADRB3 아고니스트인 CL-316243(Sigma-Aldrich)을 1mg/kg 체중/일로 3일간 복강 투여하였다.For heat-neutral adaptation, 20-week-old WT and biperin KO male mice (one per cage) were placed in an animal incubator (Dae Han Bio Link) for 2-3 days at 30°C under light conditions for 12 hours/12 hours in dark conditions. HFD was fed (2, 3). For low-temperature exposure, the incubator was cooled to 4°C, and mice were placed in the incubator to freely eat water and food for 7 days. Core body temperature was measured at different time intervals during low temperature exposure. In addition, the ADRB3 agonist CL-316243 (Sigma-Aldrich) was administered intraperitoneally to 21-week-old WT and biperine KO mice fed HFD at 1 mg/kg body weight/day for 3 days.

조직학적 분석. Histological analysis.

지방 조직을 채집하고 PBS에 용해된 4%(wt/vol) 파라포름알데히드로 고정한 뒤 파라핀에 포매하였다. 파라핀-포매된 조직 단면을 자일렌으로 탈파라핀화하고 100%, 95% 및 70%(vol/vol) 에탄올로 재수화하였다. 이들 샘플을 H&E(hematoxylin and eosin) 염색, 면역조직화학 및 면역형광 분석에 사용하였다. 압력 용기(Dako Denmark) 내 타겟 회수용액에서 항원을 회수하였다. 내인성 퍼옥시다제 활성을 3% H2O2(vol/vol)로 블로킹하고 무혈청의 바로 사용 가능한(ready-to-use) 단백질 블로킹 용액(Dako Denmark)에서 단백질을 블로킹하였다. 면역형광을 위해 샘플을 바이페린 특이적 1차 항체(MaP.VIP), MFN-1 특이적 1차 항체(Santa Cruz Biotechnology) 및 UCP1 특이적 1차 항체(Abcam)와, Alexa Fluor 488- 또는 555-접합 2차(Invitrogen)로 처리하였다. 이미지는 공초점 현미경(LSM 700; Carl Zeiss)으로 캡쳐하였다.Adipose tissue was collected, fixed with 4% (wt/vol) paraformaldehyde dissolved in PBS, and embedded in paraffin. Paraffin-embedded tissue sections were deparaffinized with xylene and rehydrated with 100%, 95% and 70% (vol/vol) ethanol. These samples were used for H&E (hematoxylin and eosin) staining, immunohistochemistry and immunofluorescence analysis. The antigen was recovered from the target recovery solution in a pressure vessel (Dako Denmark). Endogenous peroxidase activity was blocked with 3% H 2 O 2 (vol/vol) and proteins were blocked in a serum-free ready-to-use protein blocking solution (Dako Denmark). For immunofluorescence, samples were prepared with a biperin-specific primary antibody (MaP.VIP), MFN-1-specific primary antibody (Santa Cruz Biotechnology), and UCP1-specific primary antibody (Abcam), and Alexa Fluor 488- or 555. -Treated with conjugation secondary (Invitrogen). Images were captured with a confocal microscope (LSM 700; Carl Zeiss).

면역블롯 분석. Immunoblot analysis.

WT 및 바이페린 KO 마우스에서 채집한 지방 조직을 프로테아제 억제제(Complete Mini; F. Hoffmann-La Roche) 및 포스파타제 억제제(PhosSTOP; F. Hoffmann-La Roche)와 함께 1×RIPA 완충액에서 균질화하였다 1× RIPA buffer with 프로테아제 억제제 (Complete Mini; F. Hoffmann-La Roche) and 포스파타제 억제제 (PhosSTOP;F. Hoffmann-La Roche). 모든 샘플을 6,000×g로 20분간 4℃에서 원심분리하고 상층액을 수집하였다. 단백질 농도는 비시초닌산 어세이(Thermo Fisher Scientific)를 통해 측정하였다. 단백질을 10% SDS/PAGE 겔을 통해 분리하고 PVDF 막으로 옮겼다. 블롯을 PBS에 용해된 5% 탈지유 및 0.05% Tween에서 1시간 동안 블로킹하고 1차 항체와 함께 배양한 뒤 probed with 항-Ig 호스래디쉬-접합 2차 항체로 표지한 다음 강화 화학발광 시약(Thermo Fisher Scientific)과 함께 배양하였다. GRP94(Abcam, Cambridge, UK) 또는 α-튜블린을 로딩 대조군으로 사용하였다.Adipose tissues collected from WT and biperine KO mice were homogenized in 1×RIPA buffer with a protease inhibitor (Complete Mini; F. Hoffmann-La Roche) and a phosphatase inhibitor (PhosSTOP; F. Hoffmann-La Roche). 1× RIPA buffer with protease inhibitor (Complete Mini; F. Hoffmann-La Roche) and phosphatase inhibitor (PhosSTOP; F. Hoffmann-La Roche). All samples were centrifuged at 6,000×g for 20 minutes at 4° C. and the supernatant was collected. Protein concentration was measured by visichonic acid assay (Thermo Fisher Scientific). Proteins were separated through a 10% SDS/PAGE gel and transferred to a PVDF membrane. Block the blot in 5% skim milk and 0.05% Tween dissolved in PBS for 1 hour, incubate with the primary antibody, and label with an anti-Ig horseradish-conjugated secondary antibody probed with an enhanced chemiluminescence reagent (Thermo Fisher Scientific). GRP94 (Abcam, Cambridge, UK) or α-tubulin was used as a loading control.

RNA 추출, cDNA 제작 및 정량적 실시간 PCR. RNA extraction, cDNA production and quantitative real-time PCR.

Qiagen RNeasy Mini Kit을 이용하여 세포 또는 지방 조직으로부터 총 RNA를 분리하였다. cDNA 합성은 RNA 1μg을 가지고 Prime Script First-Strand cDNA 합성 키트(TaKaRa Bio)를 이용하여 제조자의 지시에 따라 수행하였다. cDNA는 SYBR Green PCR Kit(Applied Biosystems)을 이용하여 qRT-PCR로 정량화하였다. 반응을 95℃에서 10분간 수행한 뒤 95℃에서 30초, 55℃에서 1분, 72℃에서 30초의 3단계 PCR 프로그램을 50사이클 반복하였다. PCR에 사용된 프라이머는 표 1에 나열하였다. CPT1는 CPT1A, CPT1B 및 CPT1C의 3개의 이성질체를 가지는데, 본 발명에서는 Cpt1b에 대한 프라이머를 사용하였다. PCR은 각 시료에 대해 3회 반복하였다. 정량화는 Ct(2-ΔΔCt) 비교 방법으로 수행하였다. 각 샘플의 Ct 값은 β-액틴 유전자에 대해 정규화하였다. 2개의 독립적 실험을 통계적으로 분석하여 P 값을 각 도면에 표시하였다.Total RNA was isolated from cells or adipose tissue using the Qiagen RNeasy Mini Kit. cDNA synthesis was performed according to the manufacturer's instructions using Prime Script First-Strand cDNA synthesis kit (TaKaRa Bio) with 1 μg of RNA. cDNA was quantified by qRT-PCR using the SYBR Green PCR Kit (Applied Biosystems). The reaction was carried out at 95° C. for 10 minutes, followed by 50 cycles of a 3-step PCR program of 30 seconds at 95° C., 1 minute at 55° C., and 30 seconds at 72° C. Primers used in PCR are listed in Table 1. CPT1 has three isomers of CPT1A, CPT1B and CPT1C. In the present invention, primers for Cpt1b were used. PCR was repeated 3 times for each sample. Quantification was performed by Ct(2 -ΔΔCt ) comparison method. The Ct value of each sample was normalized to the β-actin gene. Two independent experiments were statistically analyzed and the P values were shown in each figure.

정량적 실시간 PCR에 사용된 마우스 특이적 프라이머 서열 Mouse specific primer sequence used for quantitative real-time PCR 유전자gene 정"??*tablet"??* 역방향Reverse ViperinViperin GTGAATACTTGGGCAAGCTGTGAATACTTGGGCAAGCT CAAATACTCCCCATAGTCCCAAATACTCCCCATAGTCC Ucp1Ucp1 GGCCTCTACGACTCAGTCCAGGCCTCTACGACTCAGTCCA TAAGCCGGCTGAGATCTTGTTAAGCCGGCTGAGATCTTGT Pgc1αPgc1α CCCTGCCATTGTTAAGACCCCCTGCCATTGTTAAGACC TGCTGCTGTTCCTGTTTTCTGCTGCTGTTCCTGTTTTC Prdm16Prdm16 CAGCACGGTGAAGCCATTCCAGCACGGTGAAGCCATTC GCGTGCATCCGCTTGTGGCGTGCATCCGCTTGTG CideaCidea TGCTCTTCTGTATCGCCCAGTTGCTCTTCTGTATCGCCCAGT GCCGTGTTAAGGAATCTGCTGGCCGTGTTAAGGAATCTGCTG PparγPparγ GTGCCAGTTTCGATCCGTAGAGTGCCAGTTTCGATCCGTAGA GGCCAGCATCGTGTAGATGAGGCCAGCATCGTGTAGATGA PparαPparα TCGGCGAACTATTCGGCTGTCGGCGAACTATTCGGCTG GCACTTGTGAAAACGGCAGTGCACTTGTGAAAACGGCAGT Pparβ/δPparβ/δ TTGAGCCCAAGTTCGAGTTTGTTGAGCCCAAGTTCGAGTTTG CGGTCTCCACACAGAATGATGCGGTCTCCACACAGAATGATG Cpt1bCpt1b TCTATGAGGGCTCGCGTCTATGAGGGCTCGCG CGTCAGGGTTGTAGCACGTCAGGGTTGTAGCA IL-6IL-6 CCTCTGGTCTTCTGGAGTACCCCTCTGGTCTTCTGGAGTACC ACTCCTTCTGTGACTCCAGCACTCCTTCTGTGACTCCAGC IL-10IL-10 ATAACTGCACCCACTTCCCAATAACTGCACCCACTTCCCA GGGCATCACTTCTACCAGGTGGGCATCACTTCTACCAGGT IL-13IL-13 GCAGCATGGTATGGAGTGTGGCAGCATGGTATGGAGTGTG TGGCGAAACAGTTGCTTTGTTGGCGAAACAGTTGCTTTGT IL-1βIL-1β GTGGCTGTGGAGAAGCTGTGGTGGCTGTGGAGAAGCTGTG GAAGGTCCACGGGAAAGACACGAAGGTCCACGGGAAAGACAC TNF-αTNF-α ATGAGCACAGAAAGCATGATGAGCACAGAAAGCATG AGTAGACAGAAGAGCGTGGTAGTAGACAGAAGAGCGTGGT TGF-βTGF-β CCTGCAAGACCATCGACATGCCTGCAAGACCATCGACATG TGTTGTACAAAGCGAGCACCTGTTGTACAAAGCGAGCACC C/ebpαC/ebpα CAAAGCCAAGAAGTCGGTGGACAACAAAGCCAAGAAGTCGGTGGACAA TCATTGTGACTGGTCAACTCCAGCTCATTGTGACTGGTCAACTCCAGC 아디포넥틴Adiponectin CCGGGACTCTACTACTTCTCTTCCGGGACTCTACTACTTCTCTT TTCCTGATACTGGTCGTAGGTTTCCTGATACTGGTCGTAGGT Fabp4Fabp4 ACACCGAGATTTCCTTCAAACTGACACCGAGATTTCCTTCAAACTG CCATCTAGGGTTATGATGCTCTTCCCATCTAGGGTTATGATGCTCTTC β-액틴β-actin GCTCCGGCATGTGCAAGCTCCGGCATGTGCAA AGGATCTTCATGAGGTAGTAGGATCTTCATGAGGTAGT

SVF 분리 및 지방세포로의 분화. SVF isolation and differentiation into adipocytes.

RC를 먹인 3주령 내지 6주령 수컷 마우스로부터 갈색 및 백색 지방 간질혈관분획(stromal vascular fraction, SVF)을 종래에 보고된 방법을 조금 변형하여 수득하였다(4). 요약하면, 지방 조직을 잘게 다진 뒤 1형 콜라게나아제(Worthington Biochemical) 1mg/mL를 포함하는 HBSS(Hanks’balanced salt solution)용액에서 37℃에서 50분 간 분해하였다. 조직 부유액을 45μm 세포 스트래이너로 여과하고 470×g로 15분간 원심분리하였다. 펠렛을 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 지방세포 배양 배지에 재부유하고 플레이팅하였다. 컨플루언스에 도달하면, 500μM 3-이소부틸-1-메틸잔틴(IBMX), 0.5μM 덱사메타손, 20nM 인슐린, 125μM 인도메타신 및 1nM T3(이상 Sigma-Aldrich)를 이용하여 1차 갈색 지방세포의 분화를 자극하였다. 백색 지방 전구세포는 500μM IBMX, 1μM 덱사메타손 및 10μg/mL 인슐린이 보충된 표준 배양액에서 배양하였다. 세포는 자극 6일째에 완전히 분화하여 1nM T3 및 20nM 인슐린이 보충된 보존 배지로 옮겼다. 완전 분화된 지방세포에 100nM CL-316243, 50μM 에토목실(etomoxir) 또는 50μg/mL 라노라진(ranolazine) (이상 Sigma-Aldrich)을 24시간 동안 처리하였다. 세포는 5% CO2의 가습 인큐베이터에서 37℃로 배양하였으며, 배양액은 2일에 한 번씩 교체하였다.Brown and white adipose stromal vascular fraction (SVF) from 3 to 6 week old male mice fed with RC was obtained by slightly modifying the previously reported method (4). In summary, after the adipose tissue was finely chopped, it was digested for 50 minutes at 37°C in a HBSS (Hanks' balanced salt solution) solution containing 1 mg/mL of type 1 collagenase (Worthington Biochemical). The tissue suspension was filtered through a 45 μm cell strainer and centrifuged at 470×g for 15 minutes. The pellet was resuspended in adipocyte culture medium supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin and plated. When confluence is reached, use 500 μM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), 0.5 μM dexamethasone, 20 nM insulin, 125 μM indomethacin, and 1 nM T3 (above Sigma-Aldrich) of primary brown adipocytes. Differentiation was stimulated. White adipocytes were cultured in a standard culture medium supplemented with 500 μM IBMX, 1 μM dexamethasone and 10 μg/mL insulin. Cells were completely differentiated on day 6 of stimulation and transferred to a preservation medium supplemented with 1 nM T3 and 20 nM insulin. Completely differentiated adipocytes were treated with 100 nM CL-316243, 50 μM etomoxir or 50 μg/mL ranolazine (above Sigma-Aldrich) for 24 hours. Cells were cultured at 37° C. in a humidified incubator of 5% CO 2 , and the culture solution was replaced every 2 days.

1차 갈색 지방세포의 세포 호흡 분석. Cell respiration analysis of primary brown adipocytes.

1차 갈색 지방세포의 세포 OCR은 Seahorse XF96 세포외 유동 분석기 (Seahorse Bioscience)를 이용하여 측정하였다. 분화된 지방세포를 10,000세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 지방세포에 100nM CL-316243 또는 50μM 에토목실을 24시간 동안 처리하였다. 기준선 세포 OCR은 비처리 세포에서 측정하였다. 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체의 억제제인 올리고마이신(complex V 억제제) 1μM, 카르보닐사이아나이드-4-(트리플루오로메톡시)페닐하이드라존[(FCCP;미토콘드리아 언커플러(uncoupler)] 1μM 및 로테논/안티마이신 A(complex I/Ⅲ 억제제) 0.5μM를 순차적으로 처리하였다. 기저 호흡, ATP 생성, 양이온 누출 및 최대 호흡을 포함하는 미토콘드리아 파라미터는 억제제 첨가 전후로 OCR로부터 계산하였다. 기저 호흡은 기준선 세포 OCR에서 비미토콘드리아 호흡을 뺌으로써 도출하였다. ATP 생성은 기준선 세포 OCR에서 올리고마이신 rate를 뺌으로써 측정하였으며, 양이온 누출은 올리고마이신 rate에서 비미토콘드리아성 호흡을 뺌으로써 도출하였다. 최대 호흡은 FCCP rate에서 비미토콘드리아성 호흡을 뺌으로써 계산하였다. 비미토콘드리아성 호흡은 로테논/안티마이신 A의 첨가 후 측정하였다.Cellular OCR of primary brown adipocytes was measured using a Seahorse XF96 extracellular flow analyzer (Seahorse Bioscience). Differentiated adipocytes were plated at a density of 10,000 cells/well. Adipocytes were treated with 100 nM CL-316243 or 50 μM etomoxil for 24 hours. Baseline cell OCR was measured in untreated cells. Oligomycin inhibitor of mitochondrial respiratory chain complex (complex V inhibitor) 1 μM, carbonyl cyanide-4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone [(FCCP; mitochondrial uncoupler] 1 μM and rotenone/anti 0.5 μM of mycin A (complex I/III inhibitor) was sequentially treated Mitochondrial parameters including basal respiration, ATP production, cation leakage and maximal respiration were calculated from OCR before and after inhibitor addition. Basal respiration was ratio in baseline cell OCR ATP production was determined by subtracting the mitochondrial respiration, ATP production was measured by subtracting the oligomycin rate from the baseline cell OCR, and the cation leakage was derived by subtracting the non-mitochondrial respiration from the oligomycin rate. It was calculated by subtracting respiration Non-mitochondrial respiration was measured after addition of rotenone/antimycin A.

통계적 분석. Statistical analysis.

데이터는 평균±표준오차로 나타냈었다. 통계적 유의성은 비대응 양측분포 Student t-검정을 이용하여 결정하였다. P < 0.05인 경우 통계적 유의성을 가지는 것으로 간주하였다.Data were expressed as mean±standard error. Statistical significance was determined using a noncorresponding two-sided Student t- test. If P <0.05, it was considered to have statistical significance.

실험결과Experiment result

바이페린의 내재적 발현이 지방대사 및 열생성을 조절한다.Intrinsic expression of biperine regulates fat metabolism and heat production.

본 발명자들은 IFN-유도 단백질인 바이페린의 내재적 발현이 특정 조직에서 새로운 기능을 제공할 것이라 가정하였다. 이런 관점에서, SPF 마우스 및 GF 마우스의 다양한 조직에서 바이페린 발현을 스크리닝하였다(도 1a). 바이페린은 간, 심장, 부고환 WAT(eWAT), 서혜 WAT(iWAT) 및 BAT에서 발현되었으나, 뇌에서는 발현되지 않았다. WT 및 바이페린 KO 마우스의 조직 크기 비교 결과 바이페린 KO 마우스에 비해 WT 마우스가 eWAT 및 iWAT의 크기가 더 컸다(도 1b). 이러한 결과는 지방 조직에서 바이페린의 내재적 발현은 대사조절 기능과 관련되어있을 수 있음을 시사한다. 이러한 가설을 시험하기 위해, WT 및 바이페린 KO 마우스에 RC 또는 HFD를 15주령에서 30주령까지 먹이고(15주간 섭식;장기간) 마우스 표현형을 비교하였다. The present inventors hypothesized that the intrinsic expression of biperin, an IFN-inducing protein, would provide a new function in certain tissues. In this regard, biperin expression was screened in various tissues of SPF mice and GF mice (Fig. 1A). Biperine was expressed in liver, heart, epididymis WAT (eWAT), inguinal WAT (iWAT) and BAT, but not in brain. As a result of comparing the tissue size of WT and biperin KO mice, WT mice had larger eWAT and iWAT sizes than biperin KO mice (FIG. 1B). These results suggest that the intrinsic expression of biperin in adipose tissue may be related to metabolic regulatory functions. To test this hypothesis, WT and biperine KO mice were fed RC or HFD from 15 to 30 weeks of age (15 weeks of feeding; long term) and the mouse phenotypes were compared.

본 발명자들은 상이한 연령과 기간 동안 RC 또는 HFD를 먹인 WT 및 바이페린 KO 마우스의 표현형을 비교하였다. 마우스에 RC 또는 HFD를 6주령에서 21주령까지(15주간 섭식)(도 6) 또는 16주령에서 20주령까지(4주간 섭식; 단기간)(도 7) 먹였다. HFD를 단기간 먹인 마우스를 제외한 모든 마우스에서 표현형을 반복적으로 비교하였으며(도 6 및 도 7), 그 결과 바이페린-매개 표현형은 마우스의 연령보다는 섭식 기간에 좌우됨을 발견하였다.We compared the phenotypes of WT and biperine KO mice fed RC or HFD for different ages and periods. Mice were fed with RC or HFD from 6 weeks of age to 21 weeks of age (15 weeks of feeding) (FIG. 6) or from 16 weeks of age to 20 weeks of age (4 weeks of feeding; short period) (FIG. 7). The phenotypes were repeatedly compared in all mice except for the mice fed with HFD for a short period of time (FIGS. 6 and 7 ), and as a result, it was found that the biperine-mediated phenotype was dependent on the feeding period rather than the age of the mice.

바이페린 결핍은 지방 조직에서의 열발생 유전자 발현을 촉진시킨다. Biperine deficiency promotes thermogenic gene expression in adipose tissue.

바이페린 발현이 지방산 β-산화 매개된 열생성에 관련되었는지를 조사하기 위해, Ucp1, Pgc1α 및 Cidea와 같은 열생성 관련 유전자와 Pparα, Pparβ/δ 및 Cpt1와 같은 지방산 β-산화 관련 유전자의 발현 수준을 지방 조직에서 측정하였다(도 2a, 도 8 및 도 9). 이들 유전자의 발현 수준은 지방조직, 특히 RC를 먹인 바이페린 KO 마우스의 eWAT 및 iWAT에서 유의하게 증가하였다(도 2a, 도 8a 및 도 9a). 이들 유전자는 HFD를 장기간 먹인 바이페린 KO 마우스의 iWAT 및 BAT에서도 유의하게 증가하였지만, HFD를 단기간 먹인 경우에는 그렇지 않았다(도 2a, 도 8b 및 도 9b). UCP1 단백질 발현은 RC 또는 HFD를 먹인 바이페린 KO 마우스의 지방 조직에서 증가하였다(도 2b 및 2c). 바이페린 발현은 HFD를 먹인 WT 마우스의 지방조직에서도 증가하였다(도 2b 및 도 10a). 나아가, 바이페린은 RC 또는 HFD를 먹인 WT 마우스의 BAT에서 미토콘드리아로 이동하였다(도 2d). 이러한 데이터는 바이페린이 지방조직의 열생성을 저해하며, 이는 지방세포의 미토콘드리아에서 지방산 β-산화를 억제함으로써 이루어짐을 시사한다. 대식세포와 호산구 등의 면역세포에서 분비되는 IL-10 및 IL-13 등의 사이토카인은 지방조직의 열생성을 조절한다고 보고되었다(5-7). 본 발명자들은 최근 바이페린 결핍이 완전 분화된 골수유래 대식세포의 전염증성 및 항염증성 사이토카인의 발현을 촉진함을 밝혔다(8). 그러나, RC를 먹인 마우스 BAT의 대식세포에서 바이페린은 검출되지 않았다. HFD를 먹인 마우스의 BAT에서 소수의 바이페린-발현 대식세포가 관찰되었으나, HFD를 먹인 후 BAT로 침투하는 대식세포의 수는 증가하였다(도 10b). RC를 먹인 마우스의 BAT을 제외하고, RC 또는 HFD를 먹인 WT 및 바이페린 KO 마우스 간에 지방 조직에서의 사이토카인 유전자의 발현 수준은 거의 차이나지 않았다(도 10c 및 10d).To investigate whether biperine expression is involved in fatty acid β-oxidation-mediated thermogeneration , the expression levels of thermogenic genes such as Ucp1 , Pgc1α and Cidea and fatty acid β-oxidation related genes such as Pparα, Pparβ/δ and Cpt1. Was measured in adipose tissue (FIGS. 2A, 8 and 9 ). The expression levels of these genes were significantly increased in adipose tissue, especially eWAT and iWAT of biperin KO mice fed RC (FIGS. 2A, 8A and 9A ). These genes were also significantly increased in iWAT and BAT of biperin KO mice fed with HFD for a long period of time, but not when fed HFD for a short period of time (FIGS. 2A, 8B and 9B ). UCP1 protein expression was increased in adipose tissue of biperin KO mice fed with RC or HFD (FIGS. 2B and 2C ). Biperin expression was also increased in the adipose tissue of WT mice fed HFD (FIGS. 2B and 10A ). Furthermore, biperine migrated from the BAT of WT mice fed RC or HFD to the mitochondria (Fig. 2D). These data suggest that biperin inhibits the heat production of adipose tissue, which is achieved by inhibiting fatty acid β-oxidation in the mitochondria of adipocytes. It has been reported that cytokines such as IL-10 and IL-13, which are secreted by immune cells such as macrophages and eosinophils, regulate the heat production of adipose tissue (5-7). The present inventors have recently found that biperine deficiency promotes the expression of pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in fully differentiated bone marrow-derived macrophages (8). However, no biperine was detected in macrophages of mouse BAT fed RC. A small number of biperin-expressing macrophages were observed in the BAT of mice fed with HFD, but the number of macrophages infiltrating into the BAT after HFD-fed increased (FIG. 10B). Except for the BAT of the mice fed with RC, there was little difference in the expression level of the cytokine gene in the adipose tissue between WT and biperine KO mice fed with RC or HFD (FIGS. 10C and 10D ).

바이페린 결핍은 열생성을 촉진하고 저온 내성을 부여한다. Biperine deficiency promotes thermogeneration and imparts low temperature tolerance.

지방 조직의 열생성 조절에서 바이페린이 필수적임을 확인하기 위하여, RC를 먹인 WT 및 바이페린 KO 마우스를 7일간 4℃에서 유지하고 상이한 시간 간격으로 심부 체온을 측정하였다. 7일간의 저온 노출 동안 바이페린 KO 마우스의 체온이 WT 마우스에 비하여 높았으며(도 3a), 이를 통해 바이페린 결핍이 저온 내성을 증진시킴을 알 수 있었다. 저온에 노출된 바이페린 KO 마우스의 지방조직 질량은 감소하였는데(도 3b), 이를 통해 저온 노출 기간 동안 바이페린 KO 마우스에서 열생성이 WT 마우스에서보다 활발함을 알 수 있었다. 저온에 노출된 바이페린 KO 마우스의 지방조직에서 열생성 및 지방산 β-산화 관련 유전자 발현이 크게 증가되어 있었다(도 3c). 저온 노출 후 WT 마우스의 BAT에서 바이페린 단백질 발현이 증가하였으나(도 3d), BAT과 지방세포에서의 UCP1 단백질 발현은 바이페린 KO 마우스에서 WT 마우스보다 훨씬 높았다(도 3d 및 3e). 이들 데이터는 바이페린 발현의 증가가 저온 환경에서의 열생성을 억제하고 저온 내성을 저해함을 말해준다. 따라서, 바이페린이 지방조직에서의 저온-유도 열생성의 조절에 필수적임을 알 수 있다.In order to confirm that biperin is essential in the regulation of thermogenic adipose tissue, RC-fed WT and biperin KO mice were maintained at 4°C for 7 days and core body temperature was measured at different time intervals. During 7 days of low-temperature exposure, the body temperature of biperin KO mice was higher than that of WT mice (FIG. 3A), and through this, it was found that biperin deficiency enhances low-temperature resistance. The adipose tissue mass of biperin KO mice exposed to low temperature was decreased (FIG. 3B), and through this, it was found that heat generation in biperin KO mice during low temperature exposure is more active than in WT mice. In the adipose tissue of biperine KO mice exposed to low temperature, the expression of genes related to heat production and fatty acid β-oxidation was significantly increased (FIG. 3C ). After cold exposure, the expression of biperin protein was increased in BAT of WT mice (Fig. 3D), but UCP1 protein expression in BAT and adipocytes was much higher in biperin KO mice than in WT mice (Figs. 3D and 3E). These data suggest that increased biperine expression inhibits thermogeneration in cold environments and impairs cold tolerance. Thus, it can be seen that biperine is essential for the regulation of cold-induced heat production in adipose tissue.

바이페린 결핍은 아드레날린 신호경로를 통해 저온-유도 열생성을 촉진한다. Biperine deficiency promotes cold-induced heat generation through the adrenaline signaling pathway.

다음으로, 바이페린 KO 마우스 지방조직에서의 저온-유도 열생성 표현형이 아드레날린 신호경로에 의해 매개되는지 여부를 조사하기 위하여, 마우스를 ADRB3 아고니스트인 CL-316243로 3일간 자극하였다. CL-처리 바이페린 KO 마우스에서 지방 조직의 질량이 감소하여(도 4a), CL-처리 바이페린 KO 마우스에서의 열생성이 매우 활발함을 알 수 있었다. CL-처리 바이페린 KO 마우스의 지방조직에서 열생성 및 지방산 β-산화 관련 유전자의 발현 수준도 크게 증가하였다(도 4b). 바이페린 단백질 발현이 CL-처리 바이페린 WT 마우스의 iWAT에서 증가하였다(도 4c). 저온에 노출된 마우스와 마찬가지로, 지방 조직의 UCP1 단백질의 발현 증가는 CL-처리 바이페린 KO 마우스에서 CL-처리 바이페린 WT 마우스에 비해 더 두드러졌다(도 4c 및 4f). 이러한 결과를 통해 바이페린 KO 마우스의 저온환경으로 유도된 표현형이 아드레날린 신호 경로에 의해 유도됨을 알 수 있었다.Next, in order to investigate whether the cold-induced thermogenic phenotype in adipose tissue of biperine KO mice was mediated by the adrenaline signaling pathway, the mice were stimulated for 3 days with CL-316243, an ADRB3 agonist. It was found that the mass of adipose tissue was decreased in CL-treated biperin KO mice (FIG. 4A), so that heat generation in CL-treated biperin KO mice was very active. The expression levels of genes related to heat production and fatty acid β-oxidation were also significantly increased in adipose tissue of CL-treated biperine KO mice (FIG. 4B). Biperine protein expression was increased in iWAT of CL-treated biperine WT mice (FIG. 4C ). As with the mice exposed to low temperature, the increased expression of UCP1 protein in adipose tissue was more pronounced in CL-treated biperin KO mice compared to CL-treated biperin WT mice (Figs. 4C and 4F). Through these results, it was found that the phenotype induced in the low temperature environment of biperine KO mice was induced by the adrenaline signaling pathway.

HFD-유도된 바이페린 발현은 저온-유도 열생성 표현형을 강화한다. HFD-induced biperine expression enhances the cold-induced thermogenic phenotype.

바이페린 발현이 HFD 섭식 또는 저온 노출 후 WT 마우스의 지방 조직을 증가시켰기 때문에, HFD를 먹인 WT 및 바이페린 KO 마우스의 저온 노출 또는 CL 처리 후의 열발생 표현형을 관찰하였다. 마우스에 HFD를 먹이고 7일 동안 4℃ 환경에 둔 뒤 상이한 시간간격으로 심부 체온을 측정하였다. 저온 노출 후 RC를 먹인 마우스에서의 결과와 유사하게, 7일간의 저온 노출 기간 동안 HFD를 먹인 바이페린 KO 마우스의 체온이 WT 마우스에 비해 더 높았다(도 11a). HFD를 먹인 WT 마우스의 BAT에서 저온 노출 후 바이페린 발현은 크게 증가하였다(도 11b 및 12). 저온 노출 시 BAT과 지방세포에서의 UCP1 발현 증가는 HFD를 먹인 WT 마우스에서보다 HFD를 먹인 바이페린 KO 마우스에서 더 두드러졌다(도 11b 및 11c). 이는 HFD 및 저온으로 유도된 바이페린 발현으로 이의 열생성 억제활성이 더 증진되고 WT 및 바이페린 KO 마우스의 열발생 표현형을 더 강화시킴을 보여준다. 본 발명자들은 또한 HFD를 먹인 바이페린 KO 마우스의 지방조직에서의 저온-유도 열생성 표현형이 아드레날린 신호 경로로 매개되는지 여부를 조사하였다. HFD를 먹인 마우스를 ADRB3 아고니스트인 CL-316243로 3일간 자극하였다. 바이페린 단백질 발현은 HFD를 먹인 CL-처리 WT 마우스의 iWAT 및 BAT에서 증가하였다(도 11d 및 11e). 지방 조직에서 UCP1 발현의 증가는 HFD를 먹인 CL-처리 바이페린 KO 마우스에서 WT 마우스에 비해 더 두드러졌다(도 11d-11f). 이러한 결과는 HFD를 먹인 바이페린 KO 마우스의 저온-유도된 표현형이 아드레날린 신호 경로를 통해 매개된다는 사실을 보여준다. 이를 종합하면, 바이페린은 지방 조직의 열생성을 조절하는 데 필수적이며, 그 기능은 HFD 섭식 및/또는 저온 조건에서 보다 강화됨을 알 수 있다.Since biperine expression increased the adipose tissue of WT mice after HFD feeding or cold exposure, the thermogenic phenotype after cold exposure or CL treatment of WT and biperine KO mice fed HFD was observed. The mice were fed with HFD and placed in an environment of 4° C. for 7 days, and then the core body temperature was measured at different time intervals. Similar to the results in mice fed RC after cold exposure, the body temperature of biperin KO mice fed HFD during the 7-day cold exposure period was higher than that of WT mice (FIG. 11A ). After cold exposure in BAT of WT mice fed with HFD, biperine expression was significantly increased (FIGS. 11B and 12 ). The increase in UCP1 expression in BAT and adipocytes upon cold exposure was more pronounced in biperine KO mice fed HFD than in WT mice fed HFD (FIGS. 11B and 11C ). This shows that HFD and low temperature-induced biperine expression further enhances its thermogenic inhibitory activity and further enhances the thermogenic phenotype of WT and biperine KO mice. The present inventors also investigated whether the cold-induced thermogenic phenotype in adipose tissue of biperine KO mice fed with HFD is mediated by the adrenaline signaling pathway. Mice fed with HFD were stimulated for 3 days with CL-316243, an ADRB3 agonist. Biperine protein expression was increased in iWAT and BAT of CL-treated WT mice fed HFD (FIGS. 11D and 11E ). The increase in UCP1 expression in adipose tissue was more pronounced in CL-treated biperin KO mice fed HFD compared to WT mice (FIGS. 11D-11F ). These results show that the cold-induced phenotype of biperine KO mice fed HFD is mediated through the adrenaline signaling pathway. Taken together, it can be seen that biperine is essential for regulating the heat production of adipose tissue, and its function is more enhanced in HFD feeding and/or low temperature conditions.

바이페린은 지방세포-자율적으로 지방산 β-산화 매개된 열생성을 조절한다 Biperine regulates fatty acid β-oxidation-mediated thermoproduction in an adipocyte-autonomous manner

지방조직에서 바이페린의 세포-자율적인 기능을 시험하기 위해, BAT 또는 eWAT로부터 SVF를 분리하고 성숙한 갈색 또는 백색 지방세포로 분화시켰다(도 5, 도 13 및 도 14). 바이페린 결핍은 성숙한 갈색 지방세포(도 5a 및 도 13a)와 백색 지방세포(도 14a)에서 아디포넥틴, Fabp4 및 C/ebpα와 같은 지방생성-관련 유전자의 발현을 증진시킨다. 이를 통해 지방산 β-산화의 증가가 지방세포에서의 지방생성과 열생성을 모두 촉진함을 알 수 있다.To test the cell-autonomous function of biperin in adipose tissue, SVF was isolated from BAT or eWAT and differentiated into mature brown or white adipocytes (FIGS. 5, 13 and 14). Biperin deficiency enhances the expression of adipogenesis-related genes such as adiponectin, Fabp4 and C/ebpα in mature brown adipocytes (Figs. 5A and 13A) and white adipocytes (Fig. 14A). Through this, it can be seen that the increase in fatty acid β-oxidation promotes both adipogenesis and heat production in adipocytes.

지방조직의 면역세포에서 분비된 사이토카인이 지방세포의 열발생 표현형에 영향을 미칠 가능성을 차단하기 위해, WT 및 바이페린 KO 마우스의 BAT에서 분리한 SVF와 SVF로부터 분화된 갈색 지방세포의 사이토카인 발현량을 측정하였다(도 13b). SVF는 지방전구세포 뿐 아니라 면역세포도 포함하므로, 사이토카인은 배양액 내 면역세포로부터 유래할 수도 있다. WT 및 바이페린 KO 마우스의 SVF 또는 지방세포간 사이토카인 발현량에 거의 차이가 없었으며, 이를 통해 바이페린이 지방세포-자율적으로 열생성을 조절함을 알 수 있다. CL의 처리에 따른 열생성-관련 유전자 발현의 증가는 바이페린 KO 갈색 지방세포에서 크게 두드러졌는데, 이는 바이페린 발현이 CL 처리에 따라 WT 갈색 지방세포에서 증가했기 때문이다(도 5b). 이는 바이페린이 BAT에서 열발생 활성을 억제함을 보여준다.In order to block the possibility that the cytokine secreted from the immune cells of adipose tissue affects the thermogenic phenotype of adipocytes, the cytokines of brown adipocytes differentiated from SVF and SVF isolated from BAT of WT and biperine KO mice The expression level was measured (Fig. 13b). Since SVF includes not only adipocytes but also immune cells, cytokines may also be derived from immune cells in culture. There was almost no difference in the amount of cytokine expression between SVF or adipocytes in WT and biperine KO mice, and through this, it can be seen that biperin regulates the adipocyte-autonomous heat production. The increase in thermogenic-related gene expression according to the treatment of CL was remarkable in biperin KO brown adipocytes, because biperin expression increased in WT brown adipocytes according to CL treatment (FIG. 5B ). This shows that biperine inhibits thermogenic activity in BAT.

마지막으로, 바이페린이 지방조직의 열생성을 조절하는 메카니즘을 밝히기 위해, 지방산 β-산화의 억제제인 에토목실 또는 라노라진을 처리한 지방세포의 열생성-관련 유전자의 발현을 측정하였다(도 5c 및 도 14b). 그 결과, 바이페린 KO 지방세포의 열생성-관련 유전자의 발현은 억제제 처리 후에만 유의하게 감소하였다. 이를 통해 바이페린 결핍이 지방세포의 지방산 β-산화를 촉진함으로써 열생성을 증가시킴을 알 수 있었다 .Finally, in order to clarify the mechanism by which biperin regulates the thermogenicity of adipose tissue, expression of thermogenic-related genes in adipocytes treated with etomoxil or ranorazine, an inhibitor of fatty acid β-oxidation, was measured (Fig. 5c). And Fig. 14b). As a result, the expression of thermogenic-related genes in biperine KO adipocytes was significantly decreased only after inhibitor treatment. Through this, it was found that biperine deficiency increases thermogenicity by promoting fatty acid β-oxidation in adipocytes.

세포외 유입에 대한 분석을 통해 바이페린 KO 갈색 지방세포에서 산소 소모율(OCR)이 증가함을 확인하였다. 미토콘드리아 호흡 사슬 억제제의 첨가 전후에 기저 호흡, ATP 생성, 양이온 누출 및 최대 호흡을 포함하는 미토콘드리아 파라미터를 OCR로부터 계산하였다. 열생성의 핵심 요소인 양이온 누출(연합해지호흡; uncoupled respiration)과 다른 파라미터들은 바이페린 KO 갈색 지방세포에서 증가하였다. 나아가, CL 처리에 따른 양이온 누출 증가는 바이페린 KO 갈색 지방세포에서 더 두드러졌다(도 5d). 반면, 양이온 누출은 바이페린 KO 갈색 지방세포에서는 에토목실 처리 후에만 감소하였다(도 5d). 이러한 데이터를 통해 바이페린 발현이 지방산 β-산화를 억제하여 지방생성 및 지방세포의 열생성을 저해함을 알 수 있다.Through the analysis of extracellular influx, it was confirmed that the oxygen consumption rate (OCR) was increased in biperine KO brown adipocytes. Mitochondrial parameters including basal respiration, ATP production, cation leakage and maximal respiration before and after the addition of the mitochondrial respiratory chain inhibitor were calculated from OCR. Cation leakage (uncoupled respiration) and other parameters, a key factor in thermogeneration, were increased in biperine KO brown adipocytes. Furthermore, the increase in cation leakage according to CL treatment was more pronounced in biperine KO brown adipocytes (FIG. 5D). On the other hand, the leakage of cations decreased only after treatment with etomoxil in biperine KO brown adipocytes (FIG. 5D). From these data, it can be seen that biperine expression inhibits fatty acid β-oxidation, thereby inhibiting adipogenesis and thermogenic adipocytes.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As described above, specific parts of the present invention have been described in detail, and it is obvious that these specific techniques are only preferred embodiments and are not intended to limit the scope of the present invention to those of ordinary skill in the art. Therefore, it will be said that the substantial scope of the present invention is defined by the appended claims and their equivalents.

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DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ppar beta/delta R primer <400> 16 cggtctccac acagaatgat g 21 <210> 17 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cpt1b F primer <400> 17 tctatgaggg ctcgcg 16 <210> 18 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cpt1b R primer <400> 18 cgtcagggtt gtagca 16 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 F primer <400> 19 cctctggtct tctggagtac c 21 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 R primer <400> 20 actccttctg tgactccagc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-10 F primer <400> 21 ataactgcac ccacttccca 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-10 R primer <400> 22 gggcatcact tctaccaggt 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-13 F primer <400> 23 gcagcatggt atggagtgtg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-13 R primer <400> 24 tggcgaaaca gttgctttgt 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1 beta F primer <400> 25 gtggctgtgg agaagctgtg 20 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1 beta R primer <400> 26 gaaggtccac gggaaagaca c 21 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha F primer <400> 27 atgagcacag aaagcatg 18 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha R primer <400> 28 agtagacaga agagcgtggt 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-beta F primer <400> 29 cctgcaagac catcgacatg 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-beta R primer <400> 30 tgttgtacaa agcgagcacc 20 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C/ebp alpha F primer <400> 31 caaagccaag aagtcggtgg acaa 24 <210> 32 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C/ebp alpha R primer <400> 32 tcattgtgac tggtcaactc cagc 24 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adiponectin F primer <400> 33 ccgggactct actacttctc tt 22 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adiponectin R primer <400> 34 ttcctgatac tggtcgtagg t 21 <210> 35 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fabp4 F primer <400> 35 acaccgagat ttccttcaaa ctg 23 <210> 36 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fabp4 R primer <400> 36 ccatctaggg ttatgatgct cttc 24 <210> 37 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin F primer <400> 37 gctccggcat gtgcaa 16 <210> 38 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin R primer <400> 38 aggatcttca tgaggtagt 19 <110> Industry-Academic Cooperation Foundation Yonsei University <120> A Composition for Enhancing Thermogenesis In Vivo Comprising Viperin Inhibitors as Active Ingredients <130> HPC-8904 <160> 38 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Viperin F primer <400> 1 gtgaatactt gggcaagct 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Viperin R primer <400> 2 caaatactcc ccatagtcc 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ucp1 F primer <400> 3 ggcctctacg actcagtcca 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ucp1 R primer <400> 4 taagccggct gagatcttgt 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pgc1 alpha F primer <400> 5 ccctgccatt gttaagacc 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pgc1 alpha R primer <400> 6 tgctgctgtt cctgttttc 19 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prdm16 F primer <400> 7 cagcacggtg aagccattc 19 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prdm16 R primer <400> 8 gcgtgcatcc gcttgtg 17 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cidea F primer <400> 9 tgctcttctg tatcgcccag t 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cidea R primer <400> 10 gccgtgttaa ggaatctgct g 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ppar gamma F primer <400> 11 gtgccagttt cgatccgtag a 21 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ppar gamma R primer <400> 12 ggccagcatc gtgtagatga 20 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ppar alpha F primer <400> 13 tcggcgaact attcggctg 19 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ppar alpha R primer <400> 14 gcacttgtga aaacggcagt 20 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ppar beta/delta F primer <400> 15 ttgagcccaa gttcgagttt g 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ppar beta/delta R primer <400> 16 cggtctccac acagaatgat g 21 <210> 17 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cpt1b F primer <400> 17 tctatgaggg ctcgcg 16 <210> 18 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cpt1b R primer <400> 18 cgtcagggtt gtagca 16 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 F primer <400> 19 cctctggtct tctggagtac c 21 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 R primer <400> 20 actccttctg tgactccagc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-10 F primer <400> 21 ataactgcac ccacttccca 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-10 R primer <400> 22 gggcatcact tctaccaggt 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-13 F primer <400> 23 gcagcatggt atggagtgtg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-13 R primer <400> 24 tggcgaaaca gttgctttgt 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1 beta F primer <400> 25 gtggctgtgg agaagctgtg 20 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1 beta R primer <400> 26 gaaggtccac gggaaagaca c 21 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha F primer <400> 27 atgagcacag aaagcatg 18 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha R primer <400> 28 agtagacaga agagcgtggt 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-beta F primer <400> 29 cctgcaagac catcgacatg 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-beta R primer <400> 30 tgttgtacaa agcgagcacc 20 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C/ebp alpha F primer <400> 31 caaagccaag aagtcggtgg acaa 24 <210> 32 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C/ebp alpha R primer <400> 32 tcattgtgac tggtcaactc cagc 24 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adiponectin F primer <400> 33 ccgggactct actacttctc tt 22 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adiponectin R primer <400> 34 ttcctgatac tggtcgtagg t 21 <210> 35 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fabp4 F primer <400> 35 acaccgagat ttccttcaaa ctg 23 <210> 36 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fabp4 R primer <400> 36 ccatctaggg ttatgatgct cttc 24 <210> 37 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin F primer <400> 37 gctccggcat gtgcaa 16 <210> 38 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin R primer <400> 38 aggatcttca tgaggtagt 19

Claims (12)

삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 바이페린(viperin) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 또는 바이페린 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드의 발현을 억제하는 핵산 분자를 유효성분으로 포함하는 저체온증(hypothermia)의 예방 또는 치료용 조성물.
An antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to a viperin protein; Or a composition for the prevention or treatment of hypothermia (hypothermia) comprising a nucleic acid molecule that inhibits the expression of the nucleotide encoding the biperine protein as an active ingredient.
제 7 항에 있어서, 상기 조성물은 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물:
화학식 1
Figure 112020063893050-pat00047

The composition of claim 7, wherein the composition further comprises a compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof:
Formula 1
Figure 112020063893050-pat00047

 삭제delete 삭제delete 다음 단계를 포함하는 생체 내 열생성(thermogenesis) 증진용 조성물의 스크리닝 방법:
(a) 바이페린(viperin)을 포함하는 생물학적 시료에 후보물질을 접촉시키는 단계;
(b) 상기 시료 내 바이페린의 활성 또는 발현량을 측정하는 단계,
상기 바이페린의 활성 또는 발현량이 감소한 경우, 상기 후보물질은 생체 내 열생성(thermogenesis) 증진용 조성물로 판정한다.
Screening method of a composition for promoting thermoogenesis in vivo comprising the following steps:
(a) contacting a candidate substance with a biological sample containing viperin;
(b) measuring the activity or expression level of biperine in the sample,
When the activity or expression level of the biperine decreases, the candidate substance is determined as a composition for promoting thermoogenesis in vivo.
제 11 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 간 조직, 심장 조직, 지방 조직, 이들로부터 유래한 세포 및 세포 배양액으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. The method of claim 11, wherein the biological sample comprises at least one selected from the group consisting of liver tissue, heart tissue, adipose tissue, cells derived therefrom, and cell culture fluid.
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