KR102165688B1 - 그람 양성균 배양용 배양액 - Google Patents

Abstract

본 발명은 일반적인 그람 양성균뿐만 아니라 폐렴구균까지 동시에 배양할 수 있는 그람 양성균 배양용 배양액에 관한 것이다. 본 발명은 육류 추출물; 카제인 가수분해물; 항산화효소; 계면활성제; 전분; 및 고형화제를 포함하는 그람 양성균 배양용 배양액을 제공한다.

Description

그람 양성균 배양용 배양액{Culture Broth For Gram-Positive Bacteria}

본 발명은 그람 양성균 배양용 배양액에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 일반적인 그람 양성균뿐만 아니라 폐렴구균까지 동시에 배양할 수 있는 그람 양성균 배양용 배양액에 관한 것이다.

그람 염색은 모든 세균을 크게 두 가지로 구분할 수 있도록 하는 가장 중요한 세균 동정법으로 통상 그람 염색법에 의하여 자색으로 염색되는 세균을 그람 양성균, 자색으로 염색되지 않으며, 대조색인 사프라닌에 의하여 적색으로 염색되는 세균을 그람 음성균이라 한다.

그람 염색법은 세균을 크리스탈 바이올렛으로 염색한 다음, 매염제인 아이오딘으로 처리하고, 에탄올 탈색 및 사프라닌 대조염색의 과정을 거쳐 진행된다. 그람 염색은 세포벽의 펩티도글리칸의 함량차이에 의하여 달라지는 것으로, 일반적인 그람 양성균은 1개의 세포막위에 두터운 펩티도글리칸 층을 가지고 있으며, 그람 음성균은 2개의 세포막을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 그람염색을 수행하는 가장 큰 이유는 그람염색의 양성 및 음성 여부에 따라 사용되는 배양법 및 항생제가 달라지기 때문이다.

그람 양성균은 이러한 그람 염색법에 의하여 자색으로 염색되는 세균을 통칭하는 것으로, 세포벽의 외면에 펩티도글리칸 층을 포함하고 있다. 그람 양성균은 대표적으로 유산균, 고초균, 탄저균, 나병균, 포도상구균, 디프테리아균, 연쇄상 구균, 파상풍균, 방선균 등이 알려져 있다. 이와는 반대로 그람 음성균은 살모넬라균, 이질균, 티푸스균, 대장균, 콜레라균, 페스트균, 임균, 수막염균, 백일해균 등이 알려져 있다.

그람 양성균은 페니실린과 같은 베타락탐계, 반코마이신과 같은 글리코펩타이드계, 에리스로마이신과 같은 마크로라이드계가 높은 항균성을 가지고 있는 것으로 알려져 있지만, 그람 음성균에 강한 항균성을 가지는 아미노글리코사이드계 항생제는 그람 양성균에 약한 항균력을 가지는 것으로 알려져 있다.

일반적으로 항생제 감수성 검사를 위한 그람 양성균의 배양을 위해서는 MHB(Mueller hinton broth)가 사용되지만 일부 그람 양성균의 경우 뮬러-힌튼 배지(MHB)내에서는 균의 성장이 느리며, ROS(reactive oxygen species)효소를 가지고 있지 않아 일반적인 그람 양성균과는 다른 배양액을 사용하여야 한다.

MHB로 배양되지 않은 대표적인 그람 양성균의 일종인 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae)은 지역사회 획득 폐렴뿐만 아니라, 세균성 수막염, 중이염 및 부비동염의 가장 흔한 원인균으로 임상적으로 중요한 병원균 중의 하나이다. 1967년에 페니실린 내성이 임상검체에서 처음 보고 되었지만, 그 후 별 문제없이 페니실린이 폐렴구균에 의한 수막염 등의 일차치료약제로 계속 사용되었다. 그러나 1970년 후반기에 패니실린에 대한 중등도 내성 및 고도 내성균이 출현하면서 폐렴구균에 대란 페니실린 치료 실패 예들이 보고되기 시작하였다. 내성 폐렴구균에 의한 수막염 치료로 광범위 세팔로스포린(cephalosporin)을 사용하여 치료에 실패한 예들도 보고되고 있으며 퀴놀론계의 항균제에도 내성을 보이는 균주도 보고되고 있다. 따라서 가장 효과적인 치료제 선택을 위해서는 빠르고 정확한 항균제 감수성 검사 방법이 요구되는 실정이다.

현재 페니실린 감수성 선별검사로 옥사실린(oxacillin) 1 g 디스크를 이용한 디스크 확산법이 널리 시행되고 있다. 그러나 이 검사만으로는 페니실린의 MIC가 0.12-1.0 g/mL인 중등도 내성(intermediate)균주와 MIC가 2.0 g/mL 이상인 내성(resistant) 균주를 감별할 수 없는 제한점을 가지고 있다. 이를 극복하기 위하여 사용되는 액체 희석법은 신뢰도는 높지만 검사과정이 복잡하고 많은 시간이 소요되는 단점을 가지고 있다. 한편 기존에 사용되던 자동화 검사 장비의 microbroth dilution panel 또한 항균제의 조성과 농도가 부적합하여 폐렴구균 감수성 검사가 불가능하였다. 최근에는 여러 항균제에 대한 MIC를 빠르고 간편하게 검사할 수 있는 E-test가 개발되어 일부 검사실에서 쓰이고 있으나 폐렴구균의 경우 혈액을 기반으로 하는 배양액에서만 배양할 수 있음에 따라 기존의 그람 양성균과는 분리하여 검사를 수행하여야 하므로 검사기간이 많이 걸리고 추가적인 비용이 발생하는 문제점을 가지고 있다.

특히 위에서 살펴본 바와 같이, 폐렴구균의 경우 일반적으로 사용되는 배양액인 MHB배양액에서는 배양이 되지 않음에 따라 배양액을 따로 준비해야 하며, 이렇게 준비되는 배양액은 동물의 혈액을 기반으로 하고 있어 그 보관기간이 매우 짧아 자동화 기기에는 사용이 어려우므로 이를 개선하기 위한 노력이 필요하다.

(0001) 대한민국 공개특허 제10-2017-0007312호 (0002) 대한민국 공개특허 제10-2001-0082326호

전술한 문제를 해결하기 위하여, 본 발명은 일반적인 그람 양성균뿐만 아니라 폐렴구균까지 동시에 배양할 수 있는 그람 양성균 배양용 배양액을 제공하고자 한다.

전술한 문제를 해결하기 위하여, 본 발명은 육류 추출물; 카제인 가수분해물; 항산화효소; 계면활성제 및 전분을 포함하는 그람 양성균 배양용 배양액을 제공한다.

일 실시예에 있어서, 상기 배양액은 연쇄상 구균(Streptococcus)과 다른 그람 양성균을 동시 배양 가능한 것일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 연쇄상 구균은 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae)일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 항산화효소는 활성산소 또는 과산화수소를 산소로 전환하는 카탈라아제일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 카탈라아제는 소의 간에서 유래된 것일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 계면활성제는 비이온성 계면활성제일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 육류 추출물은 소고기 추출물일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 그람 양성균 배양용 배양액은 배양액 100중량부 대비 육류 추출물 0.01~1중량부, 카제인 가수분해물 0.1~5중량부, 카탈라아제 0.01~0.5중량부, 계면활성제 0.001~0.1중량부 및 전분 0.01~1중량부를 포함할 수 있다.

본 발명에 의한 그람 양성균 배양용 배양액은 기존의 배양액과는 다르게 그람 양성균뿐만 아니라 포도상구균 및 폐렴구균을 동시에 배양 가능하여 다종의 항생제 검사를 동시에 수행하는 자동화기기에 유용하게 사용될 수 있다.

또한 본 발명에 의한 그람 양성균 배양용 배양액은 혈액 기반의 배양액과는 달리 장기 보관시에도 그 성능의 하락이 나타나지 않으므로, 항생제 감수성 검사용 자동화기기에 사용되는 원료로서 유용하게 사용될 수 있다.

또한 본 발명에 의한 그람 양성균 배양용 배양액은 혈액 제제를 사용하지 않음에 따라 혈액제제에 포함되는 적혈구, 백혈구 등과 같은 이물질이 관찰되지 않으므로 광학적 관찰을 기반으로 한 항생제 감수성 검사에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 기존에 폐렴구균 배양시 사용되는 용혈된 말 혈액(horse lysed blood) 및 이를 이용한 배양용 배지의 사진을 나타낸 것이다.
도2는 기존에 사용되는 자동화된 진단기기의 사진을 나타낸 것으로 내부에 장입되는 배양액, 건조 항생제 및 피펫을 나타낸 사진이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 의한 폐렴구균 성장률 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 의한 일반 그람 양성균의 성장률 실험결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 의한 방치 기간에 따른 균 성장률을 비교한 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 의한 1개월 방치 후 각 배지의 성장률을 비교한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 의한 각 방치기간에 따른 LHB의 성장률을 비교한 결과 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 의한 일정기간 방치 후 배지의 사진을 나타낸 것이다.

이하에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐리게 할 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략하기로 한다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한, 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예를 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서에 개시된 기술은 여기서 설명되는 구현예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 단지, 여기서 소개되는 구현예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 기술의 기술적 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 도면에서 각 장치의 구성요소를 명확하게 표현하기 위하여 상기 구성요소의 폭이나 두께 등의 크기를 다소 확대하여 나타내었다. 전체적으로 도면 설명시 관찰자 시점에서 설명하였고, 일 요소가 다른 요소 위에 위치하는 것으로 언급되는 경우, 이는 상기 일 요소가 다른 요소 위에 바로 위치하거나 또는 그들 요소들 사이에 추가적인 요소가 개재될 수 있다는 의미를 모두 포함한다. 또한, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명의 사상을 다양한 다른 형태로 구현할 수 있을 것이다. 그리고 복수의 도면들 상에서 동일 부호는 실질적으로 서로 동일한 요소를 지칭한다.

발명에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 발명에서, 포함하다 또는 가지다 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

한편, 본 명세서에서 서술되는 용어의 의미는 다음과 같이 이해되어야 할 것이다. “제1 ” 또는“제2 ” 등의 용어는 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하기 위한 것으로 이들 용어들에 의해 권리범위가 한정되어서는 아니 된다. 예를 들어, 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다.

또, 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함하는 것으로 이해되어야 하고, “포함하다” 또는 “가지다”등의 용어는 기술되는 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또, 방법 또는 제조 방법을 수행함에 있어서, 상기 방법을 이루는 각 과정들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않은 이상 명기된 순서와 다르게 일어날 수 있다. 즉, 각 과정들은 명기된 순서와 동일하게 일어날 수도 있고 실질적으로 동시에 수행될 수도 있으며 반대의 순서대로 수행될 수도 있다.

본 발명은 육류 추출물; 카제인 가수분해물; 항산화효소; 계면활성제 및 전분을 포함하는 그람 양성균 배양용 배양액에 관한 것이다.

상기 육류 추출물은 상기 배양액에 단백질 즉 질소와 탄소를 공급하기 위하여 사용되는 것으로, 소, 돼지, 양, 닭 또는 생선의 추출물을 사용할 수 있다. 상기 육류 추출물은 상기와 같은 동물의 근육, 지방, 내장, 뼈 또는 껍질의 추출물을 사용할 수 있지만, 단백질의 추출량을 높이기 위하여 바람직하게는 근육에서 추출한 추출물을 사용할 수 있다. 아울러 장기 보관성이 우수하고, 다양한 균체의 배양이 용이하며, 지방 함량이 낮은 소고기 추출물을 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 상기 소고기 추출물은 상기 소고기에서 영양분을 추출한 다음, 이를 농축하여 제조되는 것으로, 일반적으로는 소고기의 열수 추출물이 사용된다. 이를 더욱 상세히 살펴보면 소고기에서 지방을 제거한 다음, 소고기를 적절한 크기로 절단하고, 이를 100℃의 물에 10~120분간 침지하여 소고기에 포함된 영양성분을 추출한다. 이후 액체를 분리하고, 분리된 액체를 농축하여 분말상으로 제조된 것을 사용한다. 이때 상기 농축에는 가열건조, 감압건조, 또는 동결건조와 같은 건조법이 사용될 수 있으며, 타 세균에 의한 오염을 방지하기 위하여 최종 건조된 분말을 살균하여 사용하는 것이 바람직하다.

상기 육류 추출물은 상기 배양액 100중량부 대비, 0.01~1중량부가 포함될 수 있다. 상기 육류 추출물이 0.01중량부 미만으로 첨가되는 경우 단백질의 공급이 원활하지 않아 미생물의 배양이 어려울 수 있으며, 1중량부를 초과하여 포함되는 경우 더 이상의 미생물 배양 효율 증대는 없으면서 가격이 비싸질 수 있다.

상기 카제인 가수분해물은 우유에서 분리된 카제인을 가수분해하여 생성되는 산물을 의미하는 것으로, 상기 육류 추출물에서 공급하지 못하는 다른 종류의 단백질을 공급하는 목적으로 사용된다. 일반적으로 미생물 배양용 배양액은 다양한 미생물을 균일하게 배양할 수 있는 것이 바람직하다. 하지만 상기 육류 추출물만으로는 다종의 미생물을 배양하기 어려우며, 이에 따라 상기 카제인 가수분해물을 포함하는 것으로 더욱 다양한 미생물에 적용 가능한 미생물 배양용 배양액을 제조할 수 있다.

상기 카제인은 다양한 방법에 의하여 가수분해될 수 있지만, 가열에 의하여 가수분해되거나 효소를 첨가하여 가수분해되는 것이 바람직하며, 열에 의한 단백질의 변성을 방지하기 위하여 효소를 첨가하여 가수분해하는 것이 더욱 바람직하다. 이때 사용되는 효소는 프로테아제가 사용될 수 있으며, 펩신 트립신, 키모트립신 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다.

상기 카제인 가수분해물은 배양액 100중량부 대비, 0.1~5중량부를 포함할 수 있다. 상기 카제인 가수분해물이 0.1중량부 미만으로 포함되는 경우 카제인으로 인하여 공급되는 단백질이 줄어들어 미생물의 배양이 용이하지 않을 수 있으며 5중량부를 초과하여 포함하는 경우 더 이상의 성능 향상 없이 배양액의 가격만 높아질 수 있다.

상기 항산화효소는 미생물 배양시 발생하는 활성산소 또는 과산화수소를 제거하기 위하여 사용되는 것이다, 일반적인 그람 양성균은 활성산소(ROS, reactive oxygen species)를 제거하기 위한 효소를 가지고 있어 배지에서 배양하기 용이하지만 연쇄상 구균의 경우 활성산소를 제거하기 위한 효소를 가지고 있지 않아 기존의 배지에서는 배양이 어렵다는 단점을 가지고 있다. 이를 해결하기 위하여 말 또는 양의 혈액을 이용한 혈액제제를 이용하여 배양을 수행하였다. 하지만 혈액제제의 경우 생체조직의 일종이므로 그 사용기간이 짧고 보관이 용이하지 못하여 디스크 확산법에 주로 사용되고 있으며, 자동화 검사장비에는 제한적으로만 사용되고 있다. 특히 배양액의 장기보관이 필수적인 자동화 검사장비는 그람 양성균의 검사시 이러한 연쇄상 구균을 위한 혈액제제를 포함하는 배양액을 따로 준비해야 되는 단점을 가지고 있다.

또한 자동화 검사장비에 많이 사용되는 광학적 분석방법에서는 상기 혈액제제에 포함되는 다양한 이물질에 의하여 분석결과의 신뢰도가 떨어질 수 있다. 이를 상세히 살펴보면, 일반적인 혈액제제의 경우 연쇄상 구균을 배양하는데 필요한 항산화 효소를 공급할 수 있지만, 항산화 효소 외에도 적혈구, 백혈구, 혈소판과 같은 세포성 물질이 포함되어 있다. 따라서 광학적 분석방법을 사용하는 경우 혈액에 포함된 상기 적혈구, 백혈구, 혈소판과 같은 세포성 물질에 의하여 원하는 미생물의 동정의 관찰이 방해를 받거나 세포성 물질을 미생물로 오인하는 오동작으로 인하여 검사결과의 신뢰성이 떨어질 수 있다. 이를 개선하기 위하여 용혈된 혈액(horse lysed blood, sheep lysed blood)을 이용하고 있지만, 혈액은 용혈이후 대량의 세포 잔해를 남김에 따라, 잔해에 의한 결과 이상을 개선하지는 못하고 있다. 연쇄상 구균의 배양용으로 사용되는 용혈된 말 혈액(horse lysed blood)의 경우 최초에는 디프테리아균(Corynebacterium diphtheriae)의 배양에 사용된 것으로 배지에서 텔루라이트(tellurite)의 제거시 더욱 빠른 성장을 보이는 것으로 알려져 있다. 또한 용혈된 혈액은 파열된 적혈구에서 니코틴아마이드 아데닌 디뉴클레오티드가 용출되어 인플루엔자, 캠필로박터 등의 성장을 자극하는 것으로 알려져 있다. 항생제 감수성 실험에서는 상기 용혈된 말 혈액을 배지에 첨가하는 것으로 트리메토프림 및 설폰아마이드와의 반응을 개선시킬 수 있다. 아울러 연쇄상 구균의 배양에 있어 기존의 배지에 용혈된 말 혈액을 첨가하는 것으로 그람 양성균과 동일한 배지에서 배양하는 것이 가능하다.

본 발명의 경우 이러한 혈액제제를 대신하여 항산화효소를 첨가하는 것으로 항산화 효소를 생산하지 않는 연쇄상 구균을 그람 양성균과 동시에 배양할 수 있을 뿐만 아니라 배양액의 사용기한을 크게 늘릴 수 있음에 따라 자동화 검사장비에 사용될 수 있는 그람 양성균 배양용 배양액을 제공할 수 있다.

상기 항산화 효소는 활성산소 또는 과산화수소를 제거할 수 있는 효소인 수퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD), 카탈라아제, 글루타치온, 비타민C, 비타민E 또는 티올을 사용할 수 있지만 바람직하게는 카탈라아제를 사용할 수 있다.

활성산소 또는 과산화수소는 세포를 산화시켜 노화를 일으키거나 사멸시키는 원인으로 지적되는 물질로서 미생물의 생장을 제한하는 요소로서 작용할 수 있다. 대부분의 미생물은 자기방어기작의 일종으로 이러한 활성산소 또는 과산화수소를 분해할 수 있는 항산화효소를 기가지고 있으며, 이는 그람 양성균도 마찬가지이다. 항산화 효소는 다음과 같은 반응을 통하여 활성산소 및 과산화수소를 제거하고 있다.

본 발명의 카탈라아제는 활성산소 또는 과산화수소를 제거하기 위한 효소로서 동물의 간 또는 미생물에 의하여 합성될 수 있다. 이러한 카탈라아제의 합성을 위하여 미생물(세균 또는 진균류)을 사용하여 제조하는 것도 가능하지만, 바람직하게는 동물의 간에서 유래한 카탈라아제, 더욱 바람직하게는 상업적으로 생산할 수 있는 소의 간에서 유래한 카탈라아제를 사용할 수 있다.

미생물에 의한 카탈라아제 생산방법은, 페니실리움 크리소제눔(Penicillium chrysogenum), 페니실리움 노타툼(Penicillium notatum)등의 페니실리움 속 미생물과 아스퍼질러스 니거와 같은 미생물로부터 카탈라아제를 추출하는 방법으로, 높은 효소활성을 가지는 카탈라아제가 생산되고는 있지만, 연쇄상 구균과의 활성이 떨어져 배양액에 사용되기는 어려울 수 있다.

동물의 간에서 카탈라아제를 추출하는 방법은, 살균제로써 톨루엔, 자일렌, 에틸아세테이트, 클로로포름 등을 처리하여 몰드(mold)의 사멸 뒤 자기분해에 의한 방법으로 추출하고, 아세톤, 에탄올, 메탄올, 암모늄 설페이트 등을 이용하여 침전, 회수하고, 수용성 용매 또는 물에 재용해 후 비수용성 물질을 제거하여 효소액을 제조하는 방법으로 소의 간에서 추출된 카탈라제는 분자량 250kDa으로 4개의 서브유니트(subunit)로 구성되었다. 이외에도 동물의 간을 갈아서 효소를 추출하고, 아세톤을 이용한 결정화방법으로 회수하여 감압건조한 후 다시 물에 녹여 비수용성 물질을 제거하여 수용성 카탈라제 효소액을 제조하거나, 동물의 간으로부터 유기용매인 부탄올을 이용하여 추출하고, 아세톤에 의한 침전 및 결정화방법으로 제조, 또는 혈액으로부터 에탄올 등의 용매를 사용하여 정제하는 제조방법을 통하여 제조될 수 있다.

상기 카탈라아제는 2,000~60,000unit/mg의 조성을 가질 수 있으며, 건조 파우더 또는 현탁액이 사용될 수 있다. 상기 카탈라아제가 2,000unit/mg미만의 조성을 가지는 경우 상기 카탈라아제에 의한 활성산소 제거효과를 기대하기 어려우며, 60,000unit/mg이상의 조성을 가지는 카탈라아제는 더 이상의 성능 향상은 없으면서도 상업적으로 판매되지 않아 사용시 가격이 비싸고 이에 따라 검사비용이 상승할 수 있다. 아울러 상기 건조 파우더의 경우 건조시 열에 의한 상기 카탈라아제의 활성저하를 방지하기 위하여 열풍건조 보다는 동결건조를 사용하는 것이 바람직하다.

아울러 상기 항산화 효소는 배양액 100중량부 대비 0.01~0.075중량부, 바람직하게는 0.05중량부가 포함될 수 있다. 상기 항산화 효소가 0.01 중량부 미만으로 포함되는 경우 항산화 효과를 기대하기 어려워 그람 양성균과 연쇄상 구균의 동시 배양이 어려울 수 있으며, 0.075중량부를 초과하는 경우 초과된 효소로 인하여 배양속도가 줄어들 수 있다.

상기 계면활성제는 상기 항산화 효소의 안정성과 활성을 유지하기 위하여 첨가되는 것으로 양이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제 또는 비이온성 계면활성제가 사용될 수 있으며, 바람직하게는 비이온성 계면활성제가 사용될 수 있다. 단백질만 단독으로 있을 경우, 그 양과 시간의 흐름에 따라 단백질 뭉침 현상(aggregation)이 발생할 수 있다. 단백질 뭉침 현상이 발생한 단백질은 활성면이 노출되지 않고 구조적으로 변형되어 본래의 능력을 잃을 수 있다. 계면활성제는 친수성과 소수성면이 존재하며 적정 농도를 위와 같은 단백질에 가해주면 단백질끼리 뭉치게 되는 면에 계면활성제가 상호작용하게 되며 단백질 뭉침 현상의 발생을 막아준다. 단, 계면활성제의 농도가 높아지게 되면 단백질의 구조 자체를 풀어버려 단백질이 본연의 기능을 잃을 수 있어 적정 농도를 유지하는 것이 중요하다.

상기 계면활성제는 상기 배양액 100중량부 대비 0.001~0.03중량부, 바람직하게는 0.01중량부가 사용될 수 있다. 상기 계면활성제가 0.001중량부 미만으로 첨가되는 경우 계면활성제에 의한 항산화 효소 활성 증가가 나타나지 않아 연쇄상 구균의 증식 속도가 느려질 수 있으며, 0.03중량부를 초과하여 첨가되는 경우 과도한 계면활성제로 인하여 단백질의 구조가 풀리는 현상이 나타나 미생물 전체의 증식이 저하될 수 있다.

상기 전분은 미생물의 배양시 발생하는 독소를 흡착하기 위하여 포함되는 것으로, 독소에 의한 항생제의 활성감소를 방지할 수 있다. 특히 전분의 경우 미생물의 성장에 주는 영향이 미미하므로, 다른 다공성 흡착제에 비하여 미생물의 생장을 방해하지 않으면서도 독소의 흡수가 가능하다. 또한 상기 전분은 배양액에 포도당을 공급할 수도 있다. 포도당 대사를 수행하는 미생물의 경우 상기 육류 추출물만으로는 원활한 배양이 어려울 수 있어 이 경우 상기 전분은 미생물에 포도당을 공급하는 에너지원으로도 사용될 수 있다. 상기 전분은 식물에서 유래한 다당류로서 가수분해되어 포도당을 제공할 수 있다. 이외에도 상기 전분은 배양액을 이용한 배지의 제조시 알파화 또는 호화과정을 거쳐 배지에 점성을 높여 줄 수 있는 고형화제로서 작용할 수도 있다.

상기 전분은 상기 배양액 100중량부 대비 0.01~1중량부가 포함될 수 있다. 0.01중량부 미만으로 포함되는 경우 전분에 의한 미생물 증식효과를 기대하기 어려우며, 1중량부를 초과하여 포함되는 경우 전분이 응집되어 배양액에 불량이 발생하거나 배지 제조시 점도가 너무 높아져 실험진행이 어려울 수 있다.

상기 고형화제는 배양액에 포함되는 경우 고형의 배지를 제조하게 된다. 액상의 배지를 사용하는 경우 상기 고형화제의 사용이 필요 없지만 고형의 배지를 사용하는 경우 상기 고형화제를 혼합하여 배지에 점성과 탄성을 더해주는 것이 바람직하다.

상기 고형화제는 한천(agar), 아가로즈(agarose), 젤라틴(gelatin), 알기네이트(alginate), 콜라겐(collagen) 또는 피브린(fibrin)에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 한천을 사용할 수 있다. 일반적인 배지의 제조시 배양액과 물을 혼합한 다음, 일정온도로 가열하여 살균을 수행하게 된다. 이때 상기 고형화제는 공급되는 열에 의하여 내부의 수소결합이 끊어지면서 물에 용해되며, 표면장력으로 인하여 평평한 표면을 만들게 된다. 이후 가열을 멈추고 냉각하게 되면, 가열시 끊어졌던 수소결합이 연결되면서 배지의 점성을 올려 탄성 또는 점탄성을 가지는 배지를 제조할 수 있다. 액체 배지의 경우 내부에서 미생물의 유동에 의하여 미생물의 농도를 균일하게 배양하기에는 좋지만, 미생물이 고정되지 않고 움직임에 따라 각 지점에 따른 효과의 변화를 알기 어려움과 동시에 광학적 분석법을 사용하기에 어렵다는 단점을 가지고 있다. 따라서 탄성 또는 점탄성을 가지는 배지를 사용하는 것으로 배지 내부 또는 표면에 위치하는 미생물의 움직임을 최소화하여 용이한 관찰을 수행하도록 할 수 있다. 아울러 상기 한천의 경우 다른 고형화제에 비하여 분자간의 결합이 느슨함에 따라 항생제의 확산이 용이하므로 고형화제로의 사용이 용이할 수 있다. 상기 고형화제는 상기 배양액 100중량부 대비 0.1~5중량부가 포함될 수 있다. 상기 고형화제가 0.1중량부 미만으로 포함되는 경우 배지 제조시 고형화가 미흡하여 유동성이 높은 배지가 제조됨에 따라 원활한 시험이 어려우며, 5중량부를 초과하는 고형화제가 포함되는 경우 배지내부 분자간의 결합이 많아져 항생제의 확산이 어려워짐에 따라 항생제 감수성 검사를 수행할 수 없게 된다.

본 발명에 있어서 상기 배양액은 연쇄상 구균과 다른 그람 양성균을 동시에 배양할 수 있다. 기존의 항생제 감수성 검사에서 그람 양성균 배양용 배양액으로 많이 사용되는 뮬러-힌튼 배지의 경우 미생물에 대한 선택성이 낮아 그람 양성균과 그람 음성균을 비롯한 다양한 미생물을 배양할 수 있는 장점을 가지고 있다. 하지만 뮬러-힌톤 배지의 경우 연쇄상 구균의 배양이 불가능하여 그람 양성균과 연쇄상 구균의 동시검사가 불가능하였다. 따라서 연쇄상 구균의 배양을 위하여 용혈된 말 또는 양 혈액을 포함하는 배지를 따로 준비해야 하는 불편함을 가지고 있었다. 또한 상기 용혈된 말 또는 양 혈액의 경우 생체물질이므로, 그 품질을 유지할 수 있는 기간이 수일 ~ 수주로 매우 짧아 기기내에 배양액을 장입하여 검사를 시행하는 자동화 검사장비에는 사용이 더욱 어려웠다. 따라서 항생제 검사시 그람 양성균에 대한 검사를 수행한 다음, 연쇄상 구균에 대한 검사를 재차 수행해야 되므로 그 시간 및 비용에 낭비가 있어 왔다. 하지만 본 발명의 경우 항산화 효소 및 계면활성제를 포함함에 따라 연쇄상 구균과 그람 양성균의 동시배양이 가능함과 동시에 배양액의 품질도 4개월 이상 유지됨으로서 자동화 검사장비에 유용하게 사용될 수 있다. 특히 항생제 감수성 검사가 많이 필요로 하는 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae)의 진단에 사용될 수 있다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부한 도면을 참조하여 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 설명하기로 한다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어 관련된 공지의 기능 또는 공지의 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략하기로 한다. 그리고 도면에 제시된 어떤 특징들은 설명의 용이함을 위해 확대 또는 축소 또는 단순화된 것이고, 도면 및 그 구성요소들이 반드시 적절한 비율로 도시되어 있지는 않다. 그러나 당업자라면 이러한 상세 사항들을 쉽게 이해할 것이다.

실시예 1

소고기 추출물 분말 2g, 카제인 가수분해물 17.5g, 전분 1.5g을 혼합한 다음, 물 900mL와 혼합하여 배양액을 제조하였다. 상기 배양액을 121℃, 100kPa의 조건에서 멸균하여 MHB배지를 제조하였다. 이후, 소 간 유래 카탈라아제 동결건조 분말(C9322, 시그마 알드리치, 2,000~5,000unit/mg, 평균 분자량 250kDa) 500mg을 증류수로 용해시킨 뒤 이물질을 제거한 뒤 필터링한다. 비이온성 계면활성제(sigma aldrich, Pluronic F-127) 1g역시 증류수로 용해시킨 뒤 필터링한다. 카탈라아제 용액과 계면활성제 용액을 앞서 제작한 MHB 배지에 희석하여 배지 제작을 완료한다.

실시예 2

상기 실시예 1에서 카탈라아제를 100mg 사용한 것을 제외하고 동일하게 실시하였다.

실시예3

상기 실시예 1에서 카탈라아제를 750mg 사용한 것을 제외하고 동일하게 실시하였다.

실시예4

상기 실시예 1에서 비이온성 계면활성제로 Triton X-100((sigma aldrich)를 사용한 것을 제외하고 동일하게 실시하였다.

실시예5

상기 실시예 1에서 비이온성 계면활성제 0.1g을 사용한 것을 제외하고 동일하게 실시하였다.

실시예6

상기 실시예 1에서 비이온성 계면활성제 3g을 사용한 것을 제외하고 동일하게 실시하였다.

비교예 1

상기 실시예 1에서 카탈라아제를 사용하지 않은 것을 제외하고 동일하게 실시하였다.

비교예 2

상기 실시예 1에서 카탈라아제를 1g 사용한 것을 제외하고 동일하게 실시하였다.

비교예 3

상기 실시예 1에서 계면활성제를 사용하지 않은 것을 제외하고 동일하게 실시하였다.

비교예 4

상기 실시예 1에서 비이온성 계면활성제 5g을 사용한 것을 제외하고 동일하게 실시하였다.

비교예 5

배지로서 기존의 그람 양성균 배양에 사용되는 뮬러-힌튼 배지(MHB)를 사용한 것을 제외하고 실시예 1과 동일하게 실시하였다.

비교예 6

뮬러-힌튼 배지에 용혈된 말 혈액(LHB)을 혼합한 배지를 사용한 것을 제외하고 실시예1과 동일하게 실시하였다.

실험예 1

상기 실시예 1~6 및 비교예 1~5에서 제조된 배지의 성장률 실험을 실시하였다.

폐렴구균(Streptococcus pneumoniae)30검체와 7종류의 항생제(Levofloxacin, Linezolid, Penicillin, Tetracycline, Trimethoprim/sulfamethoxazole, Vancomycin, Cefotaxime)를 이용하여 일치율, 에러율, 균성장률을 비교하였다.

	EA	CA	VME	ME	mE
실시예 1	92.1%	97.9%	0%	0%	2.1%
실시예 2	82.2%	80%	1.1%	0%	3.6%
실시예 3	87.8%	98.1%	2.4%	0%	1%
실시예 4	89.8%	97.3%	0%	0%	2.7%
실시예 5	87.8%	86.5%	3.3%	0%	3.9%
실시예 6	82.1%	81.4%	4.6%	0%	2.6%
비교예 1	65.7%	75.4%	4.7%	4.9%	8.4%
비교예 2	82.4%	91.5%	1.5%	0%	3.1%
비교예 3	78.4%	75.7%	3.6%	1.1%	1.5%
비교예 4	69.8%	74.1%	4.5%	2.3%	4.7%
비교예 5	68.1%	76.4%	4.9%	5.4%	7.5%
비교예 6	83.3%	92.4%	0%	1.7%	1.4%

상기 표1에서 EA는 Essential agreement로 AST 수행 시 MIC 일치율을 비교하는 지표이며, CA는 Categorical agreement로 AST 수행 시 SIR (interpretation) 일치율을 비교하는 지표이다. VME는 Very Major Error로 BMD는 Susceptible (항생제 감수성)이지만 비교하고자 하는 장비에서 Resistance (항생제 저항성)로 결과를 내는 경우를 나타내고 ME는 Major Error로 BMD는 Resistance (항생제 저항성)이지만 비교하고자 하는 장비에서 Susceptible (항생제 감수성)로 결과를 내는 경우를 나타낸다. mE는 minor Error로 BMD가 I (intermediate)로 판단했을 때 비교하려는 장비가 S나 R로 판단한 경우 또는 BMD가 S나 R로 판단했을 때 비교하려는 장비가 I로 판단한 경우를 나타낸다.

표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 실시예 1~4의 경우 높은 일치율(82%이상)을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 특히 기존에 사용되는 용혈된 말 혈액(LHB)을 혼합하여 사용한 비교예 6과 동일 또는 우수한 수준의 일치율을 보이고 있어 기존의 검사법을 대체하여 사용될 수 있는 것으로 나타났다. 다만 항산화효소를 사용하지 않은 비교예 1 및 5의 경우 일치율이 하락하여 검사에 사용하기 어려울 것으로 판단되며, 계면활성제를 사용하지 않거나(비교예 3) 과도하게 계면활성제를 사용한 경우(비교예 4)에는 일치율이 떨어지는 것을 확인할 수 있어 계면활성제에 의한 항산화효소의 활성 증가를 확인할 수 있었다. 항산화효소를 과량으로 사용한 비교예 2의 경우 실시예들과 유사한 효과를 가지는 것으로 나타났지만, 과량의 항산화효소로 인하여 균의 성장률이 떨어지는 것을 확인하였다.

에러율에 있어서도 본 발명의 경우 위음성(VME)을 나타내는 검사결과가 현저하게 적으며, 위양성(ME)의 경우 거의 나타나지 않는 것을 확인하였지만, 비교예 들에서는 높은 위양성을 나타내고 있으며, 치명적인 결과로 작용할 수 있는 위음성도 나타나고 있어 본 발명의 실시예만이 항생제 감수성 검사에 사용될 수 있음을 나타낸다.

균성장률의 경우 균 성장률은 BMD결과와의 비교하지 않고, dRAST 장비에서 매 시간마다 측정한 bacteria growth value 그래프로 나타내어 표시하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, 본원 발명의 실시예1(CATS)의 경우 기존에 사용되는 LHB와 동일하거나 더욱 빠른 성장을 보이는 것으로 나타났으며, LHB를 사용하지 않은 MHB의 경우 그 성장률이 매우 떨어지는 것을 확인할 수 있었다.

즉 본원 발명의 실시예의 경우 LHB를 사용한 비교예 6와 비교할 때, 동일수준 이상의 일치율 및 성장률을 나타내었지만, 생산성 및 안정성을 본 발명의 실시예가 높은 것을 확인하였다.

실험예 2

연쇄상구군을 제외한 다른 그람 양성균에 사용이 가능한 것을 확인하기 위하여 선별한 그람 양성균(Staphylococcus spp. and Enterococcus spp.) 100검체를 이용하여 일치율, 에러율 및 균 성장률을 확인하는 실험을 실시하였다.

	EA	CA	VME	ME	mE
실시예 1	96.1%	95.8%	2.9%	0.5%	1.5%
실시예 2	91.3%	91.1%	2.1%	0.2%	1.6%
실시예 3	95.4%	97.1%	2.5%	0.1%	1.4%
실시예 4	94.3%	97.4%	1.1%	0.4%	2.1%
실시예 5	96.7%	89.7%	3.9%	0.6%	1.7%
실시예 6	93.1%	89.4%	4.1%	0.1%	2.0%
비교예 5	96.3%	96%	4.7%	1.2%	1.5%

표 2에 나타난 바와 같이 본 발명에 의한 실시예의 경우 MHB에 비하여 큰 차이가 없거나 더 높은 수치를 가지는 것을 확인하였다. 도 4에 나타난 바와 같이, 성장률의 경우 동일한 균 성장 정도를 나타내는 수치까지의 시간이 실시예가 빠른 것으로 나타나 더욱 빠른 검사가 가능한 것을 확인하였다. 따라서 본원 발명의 실시예의 경우 기존의 MHB를 대체하여 사용할 수 있는 것을 확인하였다.

실험예 3

미리 제조한 배지를 일정기간(1일, 1개월, 2개월 4개월)을 방치한 다음, 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae)30검체와 7종류의 항생제를 이용하여 일치율, 에러율, 균성장률을 비교하였다.

	EA				CA				VME				ME				mE
	1일	1월	2월	4월	1일	1월	2월	4월	1일	1월	2월	4월	1일	1월	2월	4월	1일	1월	2월	4월
실시예 1	87.2	91	93.6	92.6	97.9	94.8	98.6	97.9	0	3.2	0	0	0	0	0	0	2.1	4.4	1.4	2.1
실시예 2	82.2	83.4	83.1	83.0	80	81.4	81.1	80.9	1.1	0.3	3.0	0	0	0	0	0	3.6	3.7	3.4	3.6
실시예 3	87.8	87.7	88.4	87.1	98.1	98.0	97.4	97.4	2.4	0	0	1.1	0	0	0	0	1	1.1	1.1	0.7
실시예 4	89.8	89.7	89.1	87.8	97.3	97.1	97.2	97.1	0	0	0.9	1.4	0	0	0	0	2.7	1.7	1.5	3.1
실시예 5	87.8	87.1	87.4	87.5	86.5	87.1	89.1	85.4	3.3	2.7	2.1	2.8	0	0	0	0	3.9	3.8	3.1	3.1
실시예 6	82.1	82.5	81.4	81.5	81.4	81.6	81.4	81.0	4.6	4.1	3.9	3.4	0	0	0	0	2.6	3.4	2.4	2.1
비교예 6	90	89.3	88.1	86.2	98	96.6	94.1	95.1	2.5	3.7	11.1	8.6	0	0	0	0	1	2	1.5	1.5

표 3에 나타난 바와 같이 용혈된 말 혈액을 사용한 비교예 6의 경우 1개월이 지난 시점에서 성능이 떨어지고 있는 것을 확인할 수 있었다. 특히 일치율의 감소를 확인할 수 있었으며, 위양성율 역시 높아지고 있어 1개월이 지난 시점에서는 더 이상 성능을 유지할 수 없는 것으로 나타났다. 하지만 본 발명의 실시예의 경우 4개월까지도 고의 동등한 성능을 유지하고 있음을 확인하였으며, 이에 따라 4개월간 보관하더라도 배지로서의 사용에 문제가 없는 것을 확인하였다.

또한 도 8에 나타난 바와 같이, 비교예 6의 일부 웰에서 이물질의 관찰이 늘어난 것을 확인하였으며, 시간이 지남에 따라 배지의 색상이 선홍빛에서 갈색으로 변질되는 것을 확인하였다. 즉 기존에 사용되는 용혈된 말혈액(LHB)기반의 배지의 경우 그 보관 기간이 매우 짧은 것(1개월 이내)을 확인할 수 있었으며, 본원 발명의 실시예의 경우 그람 양성균에 대해서는 기존의 MHB와 동등하거나 높은 성능을 가지고 있으며, 폐렴구균에 대헤서는 혈액 기반 배지(비교예 6)과 동일한 성능을 가지고 있음과 더불어 높은 보존 기간을 가지고 있는 것을 확인할 수 있었다.

성장률 비교 실험은 장기적인 성장률의 차이를 알아보기 위하여 1,2,3,6개월간의 성장률을 비교하였다. 본원 발명의 실시예 1(CATS), 비교예 5(MHB) 및 비교예 6(LHB)를 이용하여 성장률을 dRAST 장비에서 매 시간마다 측정한 bacteria growth value 그래프로 나타내어 표시하였다. 도 5에 나타난 바와 같이 본 발명의 실시예 1에 의한 배지를 사용한 경우 기간의 경과가 있은 후에도 성장률에 큰 차이를 나타내지 않는 것을 확인할 수 있었다. 도 6에 나타난 바와 같이, 1개월 이후 성장률은 MHB가 가장 낮은 것을 확인할 수 있었으며, LHB도 일정 부분 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 다만 MHB의 경우 도 3에 나타난 바와 같이 시간이 경과되지 않는 경우에도 성장률이 낮은 것으로 나타났으므로, 1개월이 경과하는 경우에도 성장률에서는 큰 차이를 보이지 않았으며, 다만 LHB의 경우 도 3에서는 본 발명의 실시예와 유사한 성장률을 보이고 있었지만, 1개월이 경과된 이후에는 성장률이 일정부분 감소하는 것으로 나타나 그 성능이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. LHB를 사용한 성장률 실험에서는 도 7에 나타난 바와 같이 3개월 이후 성장률의 감소가 나타나기 시작하면서, 6개월 이후에는 매우 낮은 성장률을 보이고 있어 그 활성이 떨어져 배지로서 사용하기 어려운 것으로 확인되었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (8)

1. 배양용 배지 100중량부 대비 육류 추출물 0.01~1중량부, 카제인 가수분해물 0.1~5중량부, 항산화효소 0.001~0.075중량부, 계면활성제 0.01~0.3중량부 및 전분0.01~1중량부로 이루어지며,
   폐렴구균(Streptococcus pneumoniae)을 배양 가능한 그람 양성균 배양용 배지.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서,
   상기 항산화효소는 활성산소 또는 과산화수소를 산소로 전환하는 카탈라아제인 그람 양성균 배양용 배지.
   
5. 제4항에 있어서,
   상기 카탈라아제는 소의 간에서 유래된 것인 그람 양성균 배양용 배지.
   
6. 제1항에 있어서,
   상기 계면활성제는 비이온성 계면활성제인 그람 양성균 배양용 배지.
   
7. 제1항에 있어서,
   상기 육류 추출물은 소고기 추출물인 그람 양성균 배양용 배지.
   
8. 삭제

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