KR102161720B1 - Egfr 돌연변이 비소세포 폐암의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Egfr 돌연변이 비소세포 폐암의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 JNK(c-Jun N-terminal kinase) 활성화제를 유효성분으로 포함하는, EGFR-돌연변이 비소세포 폐암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 대한 것이다.
본 발명의 EGFR-돌연변이 비소세포 폐암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물은 EGFR-돌연변이 비소세포 폐암 세포의 EGFR 수준을 현저히 감소시켜 세포사멸을 유발함으로써, 비소세포 폐암의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다. 특히 게피티니브 또는 엘로티니브가 효과를 발휘하지 못하는 비소세포성 폐암도 효과적으로 치료하고 예방할 수 있도록 한다.
또한, 본 발명의 EGFR 티로신 키나아제 억제제에 대한 비소세포폐암의 내성 저해용 조성물은 EGFR 티로신 키나아제 억제제에 대한 내성을 효과적으로 극복하게 한다.

Description

EGFR 돌연변이 비소세포 폐암의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating non small cell lung cancer harboring the EGFR mutations}
본 발명은 JNK(c-Jun N-terminal kinase) 활성화제를 유효성분으로 포함하는, EGFR-돌연변이 비소세포 폐암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 대한 것이다.
티로신 키나아제 수용체의 HER 패밀리 중 하나인 EGFR(epidermal growth factor receptor)은 세포증식, 신생혈관형성, 침윤 및 전이를 매개한다(Harari PM, et al. J Clin Oncol. 2007;25:4057-65; Yarden Y, et al. Nat Rev Mol Cell Biol. 2001;2:127-37). EGFR의 비정상적인 발현은 다수의 종양에서 빈번히 관찰되고, 강력한 종양 형성 잠재력(oncogenic potential)이 있는 것으로 알려져 있다(Hirsch FR, et al. J Clin Oncol. 2003;21:3798-807; Rubin Grandis J, et al. J Natl Cancer Inst. 1998;90:824-32).
게피티니브(gefitinib) 및 엘로티니브(erlotinib)와 같은 1세대 EGFR 티로신 키나아제 억제제(TKI)는 가역적으로 EGFR 인산화효소 도메인 내의 ATP 클레프트(ATP cleft)에 결합하여 EGFR의 자기인산화를 억제한다(Mendelsohn J, et al. J Clin Oncol. 2003;21:2787-99). 비록 이러한 EGFR TKI가 엑손 19의 작은 인-프레임 결실(in-frame deletions) 또는 엑손 21의 L858R 미스센스 돌연변이와 같은 EGFR 활성화 돌연변이를 갖는 진행성 비소세포폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC) 환자에 효과가 있는 것으로 보였으나, 대부분의 환자는 EGFR 엑손 20에서의 이차적인 T790M 돌연변이를 통하여 상기 EGFR TKI에 대한 내성을 나타내었다(Pao W, et al. PLoS Med. 2005;2:e73). 그러나, EGFR T790M의 획득으로 인한 가역적인 EGFR TKI에 대하여 내성을 획득한 환자를 위한 표준 치료법이 없는 실정이다(Riely GJ. J Thorac Oncol. 2008;3:S146-9).
아파티니브(afatinib, BIBW 2992)는 비가역적인 2세대 EGFR TKI 중 하나이다. 최근의 전임상 연구에 따르면, 아파티니브는 EGFR T790M을 갖는 비소세포폐암에서 인 비트로 및 인 비보에서 항-종양 활성을 나타내었다. 상기 결과에 기초하여 아파티니브는 EGFR T790M을 갖는 비소세포폐암 환자를 위한 표준 치료 선택(standard therapeutic option)이 될 것으로 기대되었다(Li D, et al. Oncogene. 2008;27:4702-11). 그러나, 아파티니브는 EGFR 활성화 돌연변이를 갖는 비소세포폐암 세포에서 보다 EGFR T790M을 갖는 비소세포폐암 세포에서 100 배 낮은 효과를 보였다(Takezawa K, et al. Mol Cancer Ther. 2010;9:1647-56). 또한, 아파티니브는 최근의 임상 3상에서 미미한 효능을 나타내었으며, 이는 아파티니브의 효능을 향상시키기 위한 새로운 전략의 개발이 필요함을 의미한다(Miller VA, et al. Lancet Oncol. 2012;13:528-38).
따라서, EGFR-돌연변이 비소세포폐암, 특히 EGFR 티로신 키나아제 억제제에 대하여 내성을 획득한 비소세포폐암을 효과적으로 치료할 수 있는 새로운 계열의 치료제 개발이 필요하다.
KR 10-2017-0015848 A
본 발명의 목적은 JNK(c-Jun N-terminal kinase) 활성화제를 유효성분으로 포함하는, EGFR-돌연변이 비소세포 폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 JNK(c-Jun N-terminal kinase) 활성화제를 유효성분으로 포함하는, EGFR 티로신 키나아제 억제제에 대한 비소세포폐암의 내성 저해용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 JNK(c-Jun N-terminal kinase) 활성화제를 유효성분으로 포함하는, EGFR-돌연변이 비소세포 폐암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 JNK(c-Jun N-terminal kinase) 활성화제를 유효성분으로 포함하는, EGFR-돌연변이 비소세포 폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 JNK 활성화제는 아니소마이신(anisomycin) 또는 이의 유도체일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 비소세포폐암은 EGFR의 엑손 19번 내의 결실 돌연변이 또는 엑손 21번의 점돌연변이를 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 비소세포폐암은 EGFR의 엑손 20번의 T790M 돌연변이를 추가적으로 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 비소세포폐암은 게피티니브(gefitinib) 또는 엘로티니브(erlotinib)에 대하여 내성을 나타내는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 비소세포폐암은 EGFR의 엑손 20번의 T790M 돌연변이에 의하여 가역적 EGFR 티로신 키나아제 억제제에 대하여 내성을 나타내는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 약학 조성물은 액제, 산제, 에어로졸, 주사제, 수액제(링겔), 패치, 캡슐제, 환제, 정제, 데포(depot) 또는 좌제의 형태로 제형화될 수 있다.
상기 비소세포 폐암은 편평세포암종, 선암종, 대세포암종, 선편평상피암종 및 육종암종으로 이루어진 군에서 선택된 1종 일 수 있다.
또한, 본 발명은 JNK(c-Jun N-terminal kinase) 활성화제를 유효성분으로 포함하는, EGFR 티로신 키나아제 억제제에 대한 비소세포폐암의 내성 저해용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 EGFR 티로신 키나아제 억제제는 게피티니브(gefitinib) 또는 엘로티니브(erlotinib)일 수 있다.
또한, 본 발명은 JNK(c-Jun N-terminal kinase) 활성화제를 유효성분으로 포함하는, EGFR-돌연변이 비소세포 폐암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 EGFR-돌연변이 비소세포 폐암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물은 EGFR-돌연변이 비소세포 폐암 세포의 EGFR 수준을 현저히 감소시켜 세포사멸을 유발함으로써, 비소세포 폐암의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다. 특히 게피티니브 또는 엘로티니브가 효과를 발휘하지 못하는 비소세포성 폐암도 효과적으로 치료하고 예방할 수 있도록 한다.
또한, 본 발명의 EGFR 티로신 키나아제 억제제에 대한 비소세포폐암의 내성 저해용 조성물은 EGFR 티로신 키나아제 억제제에 대한 내성을 효과적으로 극복하게 한다.
도 1은 EGFR-돌연변이 NSCLC는 EGFR-WT 비소세포폐암보다 호기성 해당작용에 더 많이 의존한다는 것을 나타내는 결과이다. [a] EGFR-돌연변이 NSCLC 내의 당분해(glycolysis) 대사산물 풀을 LC-MS/MS으로 분석하였다. 또한, Western blot으로 EGFR knockdown을 확인하였다. [b] EGFR knockdown에 대한 당분해 효소의 mRNA 수준 변화를 나타내는 흐름도이다. 유의한 변화를 보이는 효소의 유전자 이름은 회색 굵은 글씨로 강조 표시하였다. [c] 및 [d] 대조군(shGFP) 또는 EGFR-타겟팅 shRNA를 발현하는 EGFR-돌연변이 NSCLC를 완전배지에 플레이팅하고; 포도당 섭취량과 젖산 생산량을 YSI 2300 STA + Glucose-Lactate 분석기를 사용하여 시간 경과에 따라 각각 측정하였다. [e] 실시간 당분해(glycolytic) 속도를 세포 외 유속 분석기를 사용하여 측정하였다. 대조군(shGFP) 또는 EGFR-타겟팅 shRNA를 발현하는 PC9 세포를 포도당(10 mM), 올리고마이신(1 μM) 및 2DG(20 mM)로 순차적으로 처리하였다. [f] 및 [g] EGFR-WT 및 EGFR-돌연변이 NSCLCs를 완전배지에 도말하고; 포도당 섭취량과 젖산 생산량을 YSI 2300 STA + Glucose-Lactate 분석기를 사용하여 시간 경과에 따라 측정하였다. [h] 실시간 당분해(glycolytic) 속도를 세포 외 유속 분석기를 사용하여 측정하였다. 세포를 포도당 (10 mM), 올리고마이신(1 μM) 및 2DG(20 mM)로 순차적으로 처리하였다. [i], [j] 및 [k] PC9, H1975 및 A549 종양 세포 이종 이식편을 보유한 SCID 마우스를 2DG(재료 및 방법)로 처리하였다. 종양의 크기는 정해진 날에 계산되었다. 화살표는 약물 치료 중단 시기를 나타낸다. [l] EGFR-돌연변이 NSCLC를 완전배지에 도말하고, 다음 날 글루코스 또는 글루타민이 없는 배지로 교체하였으며, 추가로 24 시간 동안 항온 배양한 후 표지된 항체로 면역 블로팅하였다. [m] 세포를 2DG(10 mM) 또는 BPTES(10 μM)로 48 시간 동안 처리하고 표지된 항체로 면역 블로팅하였다. [n] EGFR-돌연변이 NSCLC를 완전배지에 도말하고, 다음 날에 글루코즈가없는 배지로 교체하거나 2DG(10 mM)로 24 시간 동안 처리한 후, 표지된 항체로 면역 블로팅하였다. Glc, 포도당; Gln, 글루타민; G6P, 글루코스-6-포스페이트(Glucose-6-phosphate); FBP, 과당 1,6-비스포스페이트(Fructose 1,6-bisphosphate); 3PG, 3-포스포글리세레이트(3-phosphoglycerate); PEP, 포스포에놀피루베이트(phosphoenolpyruvate); PYR, 피루브산; LAC, 젖산. *, p <0.05; **, p <0.01.
도 2는 EGFR knockdown은 전사 수준에서 당분해(glycolytic) 유전자 발현을 감소시키는 것을 나타낸다. 당분해 유전자의 발현은 대조군 shRNA(shGFP) 또는 EGFR을 표적으로하는 두 개의 독립적인 shRNA를 발현하는 PC9 세포에서 정량적 RT-PCR로 결정하였다. p <0.05; **, p <0.01.
도 3은 포도당 결핍이 EGFR-돌연변이 NSCLC 세포의 성장 및 사멸에 더욱 민감하게 하는 것을 나타낸다. [a] 내지 [d] 세포를 완전배지에 도말하고, 다음날 글루코스 또는 글루타민이 없는 배지로 교체한 후 24 시간 더 배양한 후 세포 성장을 분석하였다. [e] 내지 [h] EGFR-WT(A549 및 H1299) 및 EGFR-돌연변이 NSCLC(PC9 및 H1975)를 완전배지에 도말하였다. 24 시간 후, 상기 배지를 글루코스 또는 글루타민이 없는 배지로 교체하였다; 세포사멸은 annexin V/PI로 염색하고 유세포분석기로 분석하였다. [i] 내지 [l] 세포를 2DG(10 mM) 또는 BPTES(10 uM)로 24 시간 동안 처리한 후, annexin V/PI로 염색하고 유세포분석기로 세포사멸을 분석하였다.
도 4는 EGFR-돌연변이 NSCLC의 생존에 TCA 회로의 탄소원으로서 포도당이 필수적임을 나타낸다. [a] PC9 세포를 완전배지에 도말하고, 다음날 포도당 또는 글루타민이 없는 배지로 교체한 후, 24 시간 더 배양하고, 세포 내 ATP를 분석하였다. [b] 산소 소비 속도는 세포 플럭스분석기로 측정하였다. PC9 세포를 완전배지에 도말하고, 다음날 포도당 또는 글루타민이 없는 배지로 교체하였다. 세포를 oligomycin(2 μM), FCCP(5 μM) 및 rotenone(2 μM)으로 순차적으로 처리하였다. [c] 대조군(shGFP) 또는 EGFR shRNA(shEGFRs)를 발현하는 PC9 세포의 TCA 대사산물 풀을 LC-MS/MS를 통해 분석하였다. [d] 및 [e] EGFR-돌연변이 NSCLC를 완전배지에 도말하고, 다음 날 메틸 피루베이트(MPYR; 7 mM) 또는 α-케토글루타레이트(AKG; 7 mM)를 보충한 글루코스가 없는 배지로 교체한 후, 24 시간 더 배양하고, annexin V/PI로 염색한 후 유세포분석기로 세포사멸을 분석하였다. [f] 및 [g] EGFR- 돌연변이 NSCLC를 MPYR(7 mM) 또는 AKG (7 mM)의 존재하에 2DG (10 mM)로 처리하고, annexin V/PI로 염색한 후 유세포분석기로 세포사멸을 분석하였다. [h] 세포를 완전배지에 도말하고, 다음날 MPYR고 보충(7 mM)한 글루코스가 없는 배지로 교체한 후, 24 시간 동안 더 배양하고, 표지된 항체로 면역 블로팅하였다. [i] 세포를 2DG(10 mM) 및 MPYR(7 mM)로 24 시간 동안 처리하고 표지된 항체로 면역 블로팅하였다. NS, 유의하지 않음. *, p <0.05; **, p <0.01.
도 5는 EGFR-매개 해당작용의 증대가 TCA 회로의 중요한 연료원임을 나타낸다. [a] 2DG(10 mM) 또는 BPTES(10 uM)로 처리한 PC9 세포의 TCA 대사산물 풀을 LC-MS/MS를 통해 분석하였다. [b] 대조군(shGFP) 또는 EGFR shRNA(shEGFR)를 발현하는 PC9 세포에서 산소 소비량을 세포외 플럭스분석기로 측정하였다. 세포를 oligomycin(2 uM), FCCP(5 uM), rotenone(2 uM)으로 순차적으로 처리하였다. [c] PC9 세포를 완전배지에 도말하고, 다음날 메틸피루베이트(MPYR; 7 mM) 또는 α-케토글루타레이트(AKG; 7 mM)가 보충된 무혈청 배지로 교체하고, 24 시간 동안 더 배양한 후, 세포 내 ATP를 분석하였다.
도 6은 미토콘드리아의 ATP 생산이 EGFR 안정에 필요하다는 것을 나타낸다. [a] 및 [b] EGFR-돌연변이 NSCLC를 메틸피루베이트(7 mM)의 부재 또는 존재하에 로테논(rot)으로 48 시간 동안 처리하고, 표지된 항체로 면역 블로팅하였다. [c] 및 [d] EGFR-돌연변이 NSCLC를 메틸피루베이트의 부재 또는 존재하에 Rot(5 uM)로 처리하고, 아넥신 V/PI 염색 및 유세포분석기로 세포사멸을 분석하였다. Rot, Rotenone; NS는 유의미하지 않다.
도 7은 EGFR 안정성을 유지하기 위해서 지속된 JNK 비활성이 필요하다는 것을 나타낸다. [a] EGFR-돌연변이 NSCLC를 완전배지에 도말하고, 다음 날 포도당 또는 글루타민이 없는 배지로 교체한 후, 24 시간 더 배양하고, JNK 및 P-JNK에 대해 면역 블로팅하였다. [b] EGFR-돌연변이 NSCLC를 로테논으로 처리하고 JNK 및 P-JNK에 대해 면역 블로팅하였다. [c] EGFR-돌연변이 NSCLC를 anisomycin으로 24 시간 동안 처리하고 표지된 항체로 면역 블로팅하였다. [d] 내지 [g] EGFR-돌연변이 및 EGFR-WT NSCLC을 anisomycin으로 24 시간 동안 처리하고, annexin V/PI 염색 및 유세포분석기로 세포사멸을 분석하였다. [h] 및 [i] PC9 및 H1975 종양 세포 이종이식편을 갖는 SCID 마우스를 anisomycin으로 처리하였다(Materials and Methods). 종양의 크기는 명시된 날에 계산되었다. 화살표는 약물치료 중단시기를 나타낸다. [j] 및 [k] EGFR-돌연변이 NSCLC는 SP600125(15 μM)이 포함하거나 포함하지 않는, 완전배지 또는 포도당이 없는 배지에서 배양한 후, 아넥신 V/PI 염색 및 유세포분석기로 세포사멸을 분석하였다. [l] EGFR-돌연변이 NSCLC를 SP600125(15 μM)를 포함하거나 포함하지 않는, 완전배지 또는 포도당이 없는 배지에서 24 시간 동안 배양한 후, EGFR에 대해 면역 블로팅하였다. ANS, 아니소마이신; SP, SP600125. **, p <0.01.
도 8은 Anisomycin이 EGFR 신호 전달 경로를 억제하고 생체 내에서 JNK 활성화를 통해 세포사멸을 활성화시키는 것을 나타낸다. PC9 및 H1975 종양 세포 이종이식편을 갖는 SCID 마우스를 anisomycin으로 3 일 동안 처리하고, EGFR-관련 신호 분자 및 JNK에 대해 웨스턴 블랏팅하였다.
도 9는 ROS가 JNK 매개-EGFR 역전(turnover)을 유도하는 것을 나타낸다. [a] 및 [b] EGFR-돌연변이 NSCLC를 완전배지에 도말하고, 다음 날 포도당이 없는 배지로 교체하거나, 2DG(10 mM) 또는 로테논(5 μM)으로 24 시간 동안 처리하거나 배양한 후, DCFDA 분석 또는 MitoSox Red 분석을 수행하였다. [c] EGFR-돌연변이 NSCLC를 정해진 용량의 H2O2로 24 시간 동안 처리하고, 아넥신 V/PI 염색 및 유세포분석기로 세포사멸을 분석하였다. [d] 및 [e] EGFR-돌연변이 NSCLC를 정해진 용량의 H2O2로 24 시간 동안 처리하고, 표지된 항체로 면역 블로팅하였다. [f] 내지 [m] EGFR-돌연변이 NSCLC를 완전배지에 도말하고, 다음 날 NAC(4 mM)-보충된 포도당이 없는 배지로 교체한 후 24 시간 동안 배양하거나, NAC(4 mM)의 부재 또는 존재하에 2DG(10 mM) 또는 로테논(5 μM)으로 24 시간 동안 처리한 후, [f] 및 [g] 아넥신 V/PI 염색 및 유세포분석기로 세포사멸을 분석하거나, [h] 내지 [m] 표지된 항체로 면역 블로팅하였다. NAC, N-아세틸-L-시스테인. *, p <0.05; **, p <0.01.
도 10은 JNK가 ROS의 하류(downstream) 타겟임을 나타낸다. [a] 내지 [c] EGFR-WT NSCLC를 NAC의 부재 또는 존재하에 anisomycin으로 24 시간 동안 처리한 후, annexin V/PI 염색 및 유세포분석기로 세포사멸을 분석하거나, 표지된 항체 면역 블로팅하였다.
도 11은 자가포식작용(Autophagy)이 EGFR 감소를 유도하는 것을 나타낸다. [a] EGFR 돌연변이 NSCLC를 완전배지에 도말하고, 다음 날에 포도당이 없는 배지로 교체하여 24 시간 동안 더 배양하거나, 2DG(10 mM) 또는 anisomycin(5 μM)으로 24 시간 처리한 후 표지된 항체로 면역 블로팅하였다. [b] GFP-LC3를 발현하는 PC9 세포를 완전배지에 도말하고, 다음 날 포도당이 없는 배지로 교체하여 24 시간 동안 더 배양하거나, 2DG(10 mM) 또는 anisomycin(5 μM)으로 24 시간 처리한 후, LC3 도트를 분석하였다. [c] EGFR-돌연변이 NSCLC를 완전배지에 도말하고, 다음 날에 SP600125의 부재 또는 존재하에 24 시간 동안 상기 배지를 포도당이 없는 배지로 교체하거나 2DG(10mM)로 처리한 후, 표지된 항체로 면역 블로팅하였다. [d] EGFR-돌연변이 NSCLC를 트레할로오스로 24 시간 동안 처리하고 지시된 항체로 면역 블로팅하였다. [e] EGFR-돌연변이 NSCLC를 완전배지에 도말하고, 다음 날에 클로로퀸의 부재 또는 존재하에 24 시간 동안 상기 배지를 포도당이 없는 배지로 교체하거나 2DG(10mM)로 처리한 후, 표지된 항체로 면역 블로팅하였다. [f] EGFR-돌연변이 NSCLC를 chloroquine의 부재 또는 존재 하에서 anisomycin(5 μM)으로 24 시간 처리하였고, 표지된 항체로 면역 블로팅하였다. [g] 대조군(shGFP) 또는 ATG7 shRNAs (shATGs)를 발현하는 EGFR-돌연변이 NSCLC를 완전배지에 도말하고, 다음날 포도당이 없는 배지로 교체하거나 2DG (10 mM)로 24 시간 동안 처리한 후, 표지된 항체로 면역 블로팅하였다. [h] 대조군(shGFP) 또는 ATG7 shRNAs(shATGs)를 발현하는 EGFR 돌연변이 NSCLC를 anisomycin (5 μM)으로 24 시간 동안 처리하고, 표지된 항체로 면역 블로팅하였다. TRE, 트레할로오스; CQ, 클로로퀸
도 12는 자가포식작용의 활성화는 EGFR-돌연변이 NSCLC에서 아폽토틱 세포사멸을 유도한다. [a] EGFR-돌연변이 NSCLC를 완전배지에 도말하였다; 다음 날 클로로퀸(10uM)의 부재 또는 존재하에 24 시간 동안 상기 배지를 포도당이 없는 배지로 대체하거나 또는 2DG(10mM)로 처리 한 후, 표지된 항체로 면역 블로팅하였다. [b] EGFR-돌연변이 NSCLC를 클로로퀸의 부재 또는 존재하에 anisomycin(5 uM)으로 24 시간 처리하였고 표지된 항체로 면역 블로팅하였다. [c] 대조군(shGFP) 또는 ATG7 shRNAs(shATGs)를 발현하는 EGFR-돌연변이 NSCLC를 완전배지에 도말하고, 클로로퀸(10uM)의 부재 또는 존재하에 24 시간 동안 상기 배지를 포도당이 없는 배지로 교체하거나 2DG(10 mM)로 처리한 후, 표지된 항체로 면역 블로팅하였다. [d] 대조군(shGFP) 또는 ATG7 shRNAs(shATGs)를 발현하는 EGFR-돌연변이 NSCLC를 클로로퀸의 부재 또는 존재하에 anisomycin(5 μM)으로 24 시간 처리하고 표지된 항체로 면역 블로팅하였다.
도 13은 JNK 활성화가 EGFR-TKI 내성 NSCLC를 세포사멸에 민감하게 하는 것을 나타낸다. [a] 및 [b] 세포를 완전배지에 도말하고, 다음날 포도당 또는 글루타민이 없는 배지로 대체하고 24 시간 더 배양한 후, 세포 증식을 분석하였다. [c] 및 [d] 세포를 완전배지에 도말하고, 다음날 포도당 또는 글루타민이 없는 배지로 대체하고 24 시간 더 배양한 후, 아넥신 V/PI 염색 및 유세포분석기로 세포사멸을 분석하였다. [e] 및 [f] 세포를 2DG (10 mM) 또는 BPTES (10 μM)로 24 시간 동안 처리한 후, annexin V/PI 염색 및 유세포분석기로 세포사멸을 분석하였다. [g] 세포를 완전배지에 도말하고, 다음날 포도당 또는 글루타민이 없는 배지로 대체하거나 2DG(10 mM) 또는 BPTES(10 μM)로 24 시간 동안 처리한 후, 표지된 항체로 면역 블로팅하였다. [h] 세포를 anisomycin으로 24 시간 동안 처리하고 표지된 항체로 면역 블로팅하였다. [i] 및 [j] 세포를 anisomycin으로 24 시간 동안 처리하고 annexin V/PI 염색 및 유세포분석기로 세포사멸을 분석하였다. *, p <0.05; **, p <0.01.
도 14는 포도당 결핍은 EGFR 의존성이 없는 EGFR-TKIs 내성 세포주의 성장에 최소한의 영향만을 미친다는 것을 나타낸다. [a] Western blotting으로 EGFR knockdown을 확인했다. [b] 대조군 shRNA(shGFP) 또는 EGFR에 대한 두 개의 독립적인 shRNA를 발현하는 EGFR-TKI 내성 세포주의 세포 생존 능력을 MTT 분석으로 분석하였다. [c] 및 [d] 세포를 완전배지에 도말하고, 다음 날 포도당 또는 글루타민이 없는 배지로 대체하고, 24 시간 더 배양한 후, 세포 성장을 분석하였다.
도 15는 TMA block에서 P-JNK 및 EGFR에 대한 면역 조직 화학 염색 결과이다. [a] P-JNK 및 [d] EGFR에 대한 면역 조직 화학 염색 사진이다. [b] 및 [c] 인산화된 JNK 발현은 EGFR 돌연변이가 있는 TMA 조직에서 유의하게 감소한다. [e] 및 [f] P-JNK와 EGFR 발현 사이에 유의한 네가티브적 상관 관계가 나타났다. [g] autophagy 매개 EGFR 감소를 억제하는 EGFR 돌연변이 NSCLC에서의 EGFR-조절 호기성 해당작용을 묘사하는 모델이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 JNK(c-Jun N-terminal kinase) 활성화제를 유효성분으로 포함하는, EGFR-돌연변이 비소세포 폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 JNK 활성화제는 특별히 제한되지는 않으나, 아니소마이신(anisomycin) 또는 이의 유도체인 것이 바람직하다. 상기 아니소마이신은 (2S,3S,4S)-4-히드록시-[(4-메톡시페닐)메틸]-피롤리딘-3-일-아세테이트로도 표기할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "비소세포폐암"은 본 기술분야에 종사하는 당업자에게 알려진 의미대로 사용된다. 예를 들면, 비소세포폐암은 폐의 상피 세포(epithelial cells)로부터 발생하는 악성 종양(malignant cell)으로서, 현미경 하에서 관찰자, 예를 들면, 조직병리학자(histopathologist)에 의하여 관찰된 종양 세포의 크기 및 모양에 따라 분류된 것이다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 비소세포폐암은 편평세포암, 선암, 큰세포암, 선편평상피암 또는 육종암이다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 비소세포폐암은 EGFR-돌연변이를 갖는다. 상기 용어, "EGFR-돌연변이"는 EGFR을 암호화하는 ErbB1 유전자의 뉴클레오타이드 서열에서의 변화로 키나아제 활성을 증가시키는 것을 의미한다. 증가된 키나아제 활성은 핵산에서의 변화에 대한 직접적인 결과이며, 유전자가 암호화하는 단백질과 연관된다.
하나의 특정예에서 상기 EGFR-돌연변이는 엑손 19번의 번역틀내(해독틀내) 결실 돌연변이 또는 엑손 21번의 점돌연변이이다. 상기 엑손 19번 내의 결실(in-frame deletions) 돌연변이의 예로는 E746-A750del, S752-I759del, K747-A750del 및 K747-E749+A750에서의 돌연변이를 들 수 있으며, 상기 엑손 21번의 점돌연변이의 예로는 L858R 및 L861Q 점돌연변이를 들 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 비소세포폐암은 EGFR 활성화 돌연변이 외에 가역적(reversible) EGFR TKI에 대한 내성을 유발하는 EGFR 돌연변이를 추가적으로 갖는다. 하나의 특정예에서는 상기 EGFR TKI에 대한 내성을 유발하는 EGFR 돌연변이는 EGFR의 엑손 20번의 T790M 돌연변이이다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 비소세포폐암은 게피티니브 또는 엘로티니브와 같은 가역적 EGFR TKI에 대한 내성을 나타내는 것일 수 있다.
가역적인 EGFR TKI는 E746-A750의 결실 돌연변이 및 L858R 점돌연변이와 같은 EGFR 활성화 돌연변이를 갖는 비소세포폐암의 치료에 효과가 있으나, 비소세포폐암에 T790M과 같은 이차적인 돌연변이가 생기면 가역적인 EGFR TKI에 대한 저항성(내성)을 나타내게 되어 폐암 치료에 더 이상 유효하지 않게 된다. 이러한 내성을 나타내는 비소세포폐암의 치료를 위하여 아파티니브와 같은 비가역적인 2세대 EGFR TKI가 개발되었으나, 상기 비가역적인 EGFR TKI는 내성을 획득한 비소세포폐암에 대하여 제한적인 효과만 나타내어 비소세포폐암 치료에 미흡한 문제가 있었다.
본 발명의 조성물은 JNK(c-Jun N-terminal kinase) 활성화제를 유효성분으로 포함함으로써, EGFR TKI에 대해 저항성(내성)을 나타내는 비소세포폐암도 효과적으로 치료하고 예방할 수 있다.
하기 실시예에서 증명된 바와 같이, JNK(c-Jun N-terminal kinase) 활성화제는 T790M 돌연변이를 갖는, 즉 EGFR TKI에 대한 저항성(내성)을 나타내는 비소세포폐암 세포의 성장을 억제하고 세포사멸을 현저히 유도하였다(도 13i 및 도 13j 참조).
상기 JNK(c-Jun N-terminal kinase) 활성화제는 야생형 EGFR은 억제하지 않고 EGFR 변이체만을 선택적으로 억제할 수 있다.
상기 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등을 들 수 있다.
본 발명에 따른 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물은 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다.
또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 JNK(c-Jun N-terminal kinase) 활성화제는 약학조성물 총중량에 대하여 0.01 내지 40 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 30 중량%로 포함될 수 있다. 상기 함량이 상기 하한치 미만일 경우에는 EGFR T790M 변이체 저해 효과, EGFR-TKI에 대한 내성 극복 효과, 및 EGFR-돌연변이 NSCLC에 대한 세포사멸 유발 효과가 미미하며, 상기 상한치를 초과할 경우에는 사용량에 따른 효과가 미미한 문제가 야기될 수 있다.
상기 약학조성물의 유효성분인 본 발명에 따른 JNK(c-Jun N-terminal kinase) 활성화제의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중, 질환에 따라 달라질 수 있으나, 0.001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.01 내지 10 mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 JNK(c-Jun N-terminal kinase) 활성화제의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 기관지내 흡입, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 JNK(c-Jun N-terminal kinase) 활성화제를 유효성분으로 포함하는, EGFR 티로신 키나아제 억제제(이하, 'TKI'라 함)에 대한 비소세포폐암의 내성 저해용 조성물을 제공한다.
상기 내성 저해용 조성물에 포함되는 유효성분은 본 발명의 약학 조성물에 포함되는 유효성분과 동일한 것이기 때문에, 이 둘 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 명세서에서 용어, "내성"은 비소세포폐암 세포가 가역적인 EGFR TKI와 같은 항암제에 저항성을 나타내는 것으로, 게피티니브와 같은 EGFR TKI를 이용하여 폐암 환자를 치료할 때, 치료 초기부터 치료 효과가 없거나 초기에는 암 치료 효과가 있었으나 계속적인 치료 과정에서 암 치료 효과가 상실(감소)되는 것을 의미한다. 이와 같이, 항암제를 암환자에게 계속 투여하면 점차적으로 효과가 감소하는 것이 잘 알려져 있으며, 특히 비소세포폐암의 경우에는 EGFR의 돌연변이로 인하여 가역적인 EGFR TKI에 대하여 내성을 획득할 수 있음이 알려져 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 비소세포폐암은 EGFR의 엑손 20번의 T790M 돌연변이에 의하여 EGFR TKI에 대한 내성을 나타낸다. 하나의 특정예에서는 상기 EGFR TKI는 게피티니브 또는 엘로티니브이다.
JNK(c-Jun N-terminal kinase) 활성화제는 가역적 EGFR TKI에 내성을 나타내는 비소세포폐암의 EGFR TKI에 대한 내성을 극복하게 하므로, 본 발명의 내성 저해용 조성물은 가역적 EGFR TKI에 무반응성 또는 저하된 반응성을 나타내는 비소세포폐암 환자의 치료를 위하여 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 JNK(c-Jun N-terminal kinase) 활성화제를 유효성분으로 포함하는, EGFR-돌연변이 비소세포 폐암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 EGFR-돌연변이 비소세포 폐암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 포함되는 유효성분은 본 발명의 약학 조성물에 포함되는 유효성분과 동일한 것이기 때문에, 이 둘 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명에서 "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 상기 건강기능식품 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다.
상기 식품의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 비제한적인 예로는, 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 또는 비타민 복합제 등을 들 수 있다.
본 발명의 상기 건강기능식품 조성물이 음료 조성물인 경우, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비제한적인 예로 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 수크로오스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 들 수 있다. 상기 첨가되는 추가 성분의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴삼 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 박에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 천연 과일 주스, 과일 음료 또는 야채 음료 등의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 사용되거나 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가물의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.01 내지 99% 중량으로 포함한다. 그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.
이하, 본 발명에 따른 EGFR-돌연변이 비소세포 폐암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 대해 실시예를 들어 상세히 설명하기로 한다.
실시예
실험재료 및 실험방법
세포 준비
EGFR WT(A549 및 H1299) 및 EGFR-돌연변이 비소세포 폐암(이하, NSCLC) 세포(HCC827 및 H1975)는 American Type Culture Collection으로부터 구입하였다. PC-9 세포주는 Nishio Kazuto 박사(일본 국립 도쿄 병원)의 친절한 선물이었으며 이전에 특성화되었다. PC-9/GR(게피티닙 저항성 세포주)과 PC-9/ER(엘로티닙 저항성 세포주) 세포가 이전 연구의 일환으로 확립되었다. 모든 세포는 10 % 소 태아 혈청(FBS), 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신으로 보충된 RPMI 1640 배지(모두 Thermo Scientific, Waltham, MA, USA로부터 구입함)에서 배양하였으며, 5 % CO2가 포함된 가습 챔버에서 37 ℃에서 배양하였다. 상기 세포주는 초기 팽창 및 동결로부터 10 내지 15 구획 내에서 사용되었고, 마이코플라스마 오염에 대해 통상적으로 시험한 후, 연구 이전에 전술된 바와 같이 짧은 연쇄반복 염기서열(short tandem repeat(STR)) DNA 프로파일에 의해 인증되었다. 글루코스 또는 글루타민 결핍 실험군을 위해, 글루코스(R1383) 또는 글루타민(R0883)을 함유하지 않은 RPMI 1640을 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)로부터 입수하였다.
세포 증식 어세이(Cell proliferation assay)
각각의 세포를 24-웰 플레이트(밀도: 2,000 cells/well)에 도말하였다. 영양 결핍을 위해, 세포를 완전 배양 배지(10 mM 글루코스, 2 mM 글루타민)에 도말한 후, 다음 날 글루코스 또는 글루타민-free 배지로 교환하였다. 배지는 실험 전반에 걸쳐 변경하지 않았다. 정해진 시간 간격으로, 세포를 10 % 포르말린으로 고정시키고, 0.1 % 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 염료를 10 % 아세트산으로 추출하고 광학 밀도(OD) 595 nm에서 세포 증식을 측정하였다.
시약 및 항체
Anisomycin(1290) 및 SP600125(1496)는 Tocris Bioscience(Bristol, United Kingdom)에서 입수하였으며, 메틸-피루브산(Methyl-pyruvate)(371173), 로테논(R8875), 디메틸 α-KG(349631), BPTES (SML0601), 및 2DG(2-Deoxy-D-glucose; D6134)는 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다.
AKT(9272), p-AKT(4060), cleaved PARP(9541), cleaved-카스파제-3 (9661), ERK(9102), 및 p-JNK에 대한 항체는 각각 Cell Signaling Technology(Beverly, MA, USA)에서 구입하였고, β-actin(sc-47778), EGFR(sc-03), p-ERK(sc-7383), 및 JNK(sc-7345)에 대한 항체는 각각 Santa Cruz Biotechnology(Dallas, TX, USA)에서 구입하였다.
포도당 소비 및 젖산 생산 분석(Glucose consumption and lactate production assay)
각각의 세포를 6-웰 플레이트(2×105 cells/well)에 도말하였다. 배지는 실험 전반에 걸쳐 변경하지 않고 지정된 시간 간격으로 수집하였다. 배지 내의 포도당 및 젖산 농도는 YSI 2300 STAT Plus Glucose-Lactate Analyzer를 사용하여 측정하였다.
ECAR and OCR 측정
세포외 산성화 속도(ECAR)와 산소 소비 속도(OCR)는 XF24 세포외 플럭스 분석기(Seahorse Bioscience)로 측정하였다. 간단히 말하면, 세포를 24-well Seahorse plate에 도말한 후 37 ℃, 5 % CO2에서 배양하였다. 다음 날 배지를 버퍼가 없는 DMEM으로 교체하고, 세포를 CO2없이 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. OCR 측정을 위해 올리고마이신(oligomycin), FCCP 및 로테논을 각각 최종농도 2 μM, 5 μM 및 2 μM로 가하였다. 또한, ECAR 측정을 위해 글루코스, 올리고마이신 및 2DG를 각각 최종농도 10 mM, 1 μM 및 20 mM로 가하였다.
Metabolomics
세포는 10-cm 디쉬의 성장 배지(RPMI 1640, 10 % FBS)에서 ~ 60 % 컨플루언스까지 성장시켰다. 24 시간 후, 순차적으로 PBS와 H2O로 세척한 다음, 차가운 메탄올/H2O(80/20, v/v) 1.4 mL를 사용하여 세포를 수확한 후 용해시켰다; 5 μM의 내부표준물질(internal standard) 100 μL를 첨가했다. 대사물질(metabolite)은 클로로포름을 첨가한 후 수상으로부터 액체-액체 추출하였다. 상기 추출한 수상의 시료는 진공 원심분리를 통해 건조시킨 다음, 50 % 메탄올 50 ㎕로 복원(reconstituted)하고, LC-MS/MS 분석을 수행하였다. 상기 LC/MS/MS 시스템은 Agilent 1290 HPLC(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), Qtrap 5500(ABSciex, Concord, Ontario, 캐나다) 및 역상컬럼(Synergi fusion RP 50 x 2 mm)을 갖추고 있다. 3 μL의 시료를 LC-MS/MS 시스템에 주입하고 터보 스프레이 이온화 소스로 이온화시켰다. 음이온 모드에서 다중 반응 모니터링(MRM)을 사용하였고, 각 대사물질의 특정 전이에 해당하는 EIC(extracted ion chromatogram)를 정량화에 사용하였다. 각 EIC의 곡선 아래 영역은 내부 표준 EIC의 것으로 정규화되었다. 내부 표준물질에 대한 각 대사물질의 피크 면적비는 시료내 단백질 양을 이용하여 표준화한 다음 상대 비교를 위해 사용하였다.
qRT-PCR
TRIzol(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 총 RNA를 추출 하였다. oligo-dT 및 MMLV HP 역전사 효소(Epicentre, Madison, WI, USA)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 2 μg의 총 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. qRT-PCR은 SYBR 검출 프로토콜을 사용하여 AriaMax Real-Time PCR 장비 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)에서 수행되었다. 18S 리보솜 RNA를 대조군으로 하여 비교 Ct 방법(comparative Ct method)으로 cDNA를 계산하였다. 상기 PCR 을 반복하여 3 번 수행하였다.
ROS 측정(ROS quantification)
세포질 내 ROS를 측정하기 위해, 세포를 30 분 동안 2',7'- 디클로로디히드로 플루오레신디아세테이트(DCFDA; 2',7'-dichlorodihydro fluoresceindiacetate, 5 μM, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)와 함께 배양하였다. 실온에서 PBS로 세포를 두 번 세척하여 과량의 DCFDA를 제거하였다; 표지 세포를 트립신 처리하고, 헹구고, PBS로 재현탁시켰다. ROS 생성에 비례하는 고형광 2',7'-디클로로-플루오레신(DCF)에 대한 DCFDA의 산화를 유동 세포계측법으로 분석하였다. 미토콘드리아 ROS를 분석하기 위해 세포를 37 ℃에서 10 분 동안 5 μM MitoSOX™ 시약(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)과 함께 배양한 후 트립신 처리하고 PBS로 세척한 다음 PBS 200 μL으로 재현탁하였다. 염색된 세포를 정량화하고 유동 세포계측기 (BeckmanCoulter, Brea, CA, USA)로 분석하였다. 이때, 여기 파장(excitation wavelength)은 510 nm, 발광 파장(emission wavelength)은 580 nm이었다.
아폽토시스 분석(Apoptosis quantitation)
아폽토시스 세포사멸은 Annexin-V/FITC 분석을 사용하여 측정하였다. 세포를 트립신처리에 의해 수확하고, PBS로 세척하고, 아넥신-V FITC 및 요오드화 프로피듐(propidium iodide)을 함유하는 아넥신-V 결합 완충액(10 mM HEPES, pH 7.4, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2)으로 재현탁시켰다. 염색된 세포를 정량하고 유동 세포계측기(BeckmanCoulter, Brea, CA, USA)로 분석하였다.
웨스턴 블랏 분석
세포를 프로테아제 억제제 칵테일(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)을 함유하는 RIPA 용해 완충액 중에 용해시키고; 상기 용해물의 농도는 BCA 분석기(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)로 분석하였다. 상기 용해물은 동량의 Laemmli 로딩 염료와 혼합한 후 10 분간 가열하였다. 상기 용해물을 SDS-PAGE를 수행하고, 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인(EMD Millipore, Billerica, MA, USA)으로 옮겼다. 상기 멤브레인은 5 % 탈지분유 및 0.1 % Tween 20(TBS-T)를 함유한 Tris-완충 식염수(TBS)로 블로킹한 후, 4 ℃에서 1차 항체와 함께 밤새 배양(incubation)하였다. TBS-T로 세척한 후, 상기 블롯을 적절한 서양고추냉이 퍼옥시다아제-결합 2 차 항체에 1 시간 동안 노출시켰다. 상기 단백질-항체 복합체는 Enhanced chemiluminescence(ECL) 검출 시스템(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)을 사용한 Kodak X-선 필름으로 시각화하였다.
세포내 ATP 측정(Quantitation of intracellular ATP)
세포내 ATP 농도는 ATP Colorimetric/Fluorometric Assay Kit (Biovision Incorporated, Milpitas, CA, USA)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 측정하였다. 간략하게는, 세포를 100 μl의 ATP 분석 완충액에서 용해시키고; 상등액 50 ㎕를 수집하여 96-웰 플레이트에 가하였다. 그리고, 각 웰에 ATP 프로브, ATP converter, 및 현상액을 포함하는 50㎕의 ATP 분석 완충액을 첨가하였다. 흡광도는 570 nm에서 측정되었다.
이종이식 실험(Xenograft studies)
SCID(Female severe combined immunodeficiency) 마우스는 Charles River Laboratories에서 구입하였다. 모든 실험 절차는 아산 생명 과학 연구소의 동물 실험 및 사용위원회(프로토콜 2015-14-241)에 의해 승인되었다. 각 동물에게, Matrigel(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)과 혼합한 2×106 세포를 옆구리에 주사했다. 한 그룹 당 5 마리의 마우스에 대하여 종양 부피가 50-100 mm3에 이르렀을 때, 아니소마이신(anisomycin)(5 mg/kg, 종양 내, 주 5 일) 또는 2DG(2-Deoxy-D-glucose)(500 mg/kg, 복강 내, 주 5 일)로 2 주간 처치하였다. 각 종양의 길이(L)와 폭(W)을 캘리퍼를 사용하여 측정하였고, 종양 부피(TV)는 TV = (L×W2)/2로 계산하였다. 이종 이식 종양에서 EGFR- 관련 신호를 평가하기 위해, 약물 처리한 3 일 후에 종양을 수거하여, 용해시키고, 웨스턴 블랏팅으로 분석하였다.
렌티바이러스-매개 shRNA 표적(Lentiviral-mediated shRNA targets)
shRNA에 대한 하기의 RNAi 컨소시엄 클론 ID를 이 연구에서 사용하였다: shEGFR-1(TRCN0000195303) 및 shEGFR-2(TRCN0000298822).
조직 마이크로어레이(Tissue microarrays)
2009 년 6 월부터 2016 년 5 월까지 서울 아산병원에서 폐 절제술을 시행하여 얻은 폐 선암의 견본으로부터 조직 마이크로어레이 블록(TMA block)을 만들었다. 이 TMA 블록은 EGFR 돌연변이에 대해 126 개의 EGFR-돌연변이와 118 개의 야생형을 포함하는 244 개의 샘플을 포함했다. 상기 EGFR-돌연변이 군은 엑손 18 또는 엑손 20의 돌연변이를 제외하고는 엑손 19 또는 엑손 21에만 돌연변이를 갖는 표본을 포함하였다. 상기 엑손 18 내지 21 내의 EGFR-돌연변이 상태는 2015 년 8 월까지는 자동 ABI PRISM 3100 유전 분석기(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용한 직접 DNA sequencing 검사법으로 분석하였고, 그리고 그 후에는 PNA-매개 PCR 클램핑 방법과 함께 PNAClampTM EGFR Mutation Detection kit로 분석하였다. 연구 대상의 의학 기록은 2017 년 4 월에 후향적으로 검토되었다. 본 발명의 연구 계획은 아산병원의 기관 검토위원회(Institutional Review Board)에 의해 승인되었으며, 상기 검토위원회는 상기 분석(프로젝트 기관 식별번호 2016-0752)의 소급적 성질로 인해 피험자 동의 요건을 포기하였다. 그러나 이미 모든 연구 대상자들은 외과적 절제술 후 연구를 위해 추출된 폐를 이용하는 것에 대한 피험자 동의서를 제공받았다.
면역조직화학(Immunohistochemistry)
면역조직화학(IHC; Immunohistochemical) 염색은 P-JNK(1:100; 700031, ThermoScientific, Rockford, IL) 및 EGFR(1:200; 28-0005, ThermoScientific)을 포함하는 특정 일차 항체를 사용하여 수행되었다. IHC 데이터는 아산 병원과 한국 암센터 병원의 병리학자들에 의해 작성되었다. Chi-Square test를 이용하여 P-JNK와 EGFR 양성 및 음성 발현의 차이를 평가하였다.
통계 분석
모든 데이터는 평균±표준 편차로 표시하였다. 또한, 그룹간의 통계적 유의성을 결정하기 위하여 unpaired Student's t-test를 실시하였고, p < 0.05를 통계적으로 유의성 있는 값으로 고려하였다.
실험결과
Oncogenic EGFR에 의해 증대된 해당작용은 EGFR 수준의 유지에 필요하다
EGFR 돌연변이는 비소세포 폐암(NSCLC)을 가진 TKI-치료 환자의 임상 반응 및 생존 기간 연장에 중요하지만, 폐암의 신진대사에서 EGFR 돌연변이의 중요성은 알려져 있지 않다. NSCLC 대사에서 EGFR 돌연변이의 기능적 역할을 조사하기 위해 EGFR-돌연변이 NSCLC의 표적화된 액체 크로마토그래피- 탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS)에 의한 대사 분석을 통해 포도당 대사에 대한 EGFR의 영향을 알아보고자 하였다. EGFR-TKI 치료가 glycolysis metabolites를 감소시킨다는 최근 연구와 같이, 우리는 EGFR knockdown이 glycolysis metabolites(도 1a)를 현저히 감소시킨다는 것을 확인하였다. Myc 및 HIF-1과 같은 발암성 신호 전달 요소는 전사 조절을 통한 대사 재프로그램을 조절하며, EGFR 신호 전달 경로의 억제는 GLUT1 및 헥소키나제 2 mRNA의 수준을 감소시킨다. 이에 따라, EGFR knockdown은 전사 수준(도 1b 및 도 2)에서 해당작용을 일으키는(glycolytic) 유전자의 발현을 감소시켰고, 또한 EGFR-돌연변이 NSCLC에서 포도당 섭취 및 젖산 생산을 감소시켰다(도 1c 및 1d). 또한, EGFR knockdown은 세포외 산성화 속도를 감소시켰고(도 1e), 이는 EGFR 돌연변이가 전사 조절을 통해 포도당 분해(glycolytic) 플럭스를 증가시킨다는 것을 시사한다.
해당작용에서 EGFR의 기능을 더 알아보기 위해, EGFR-돌연변이 NSCLC에서의 포도당 섭취와 젖산 생산을 EGFR-WT NSCLC에서의 것과 비교하였다. 도 1f 및 1g에 나타낸 바와 같이, EGFR-돌연변이 NSCLC는 EGFR-WT NSCLC에 비해 포도당 섭취 및 젖산 생산이 현저히 증가하였고, 이러한 포도당 섭취 및 젖산 생산의 상대적 변화는 시간이 지남에 따라 점진적으로 증가하였다. 또한, EGFR-돌연변이 NSCLC는 EGFR-WT NSCLC에 비해 상당히 높은 세포외 산성화 속도를 나타내었다(도 1h); 이러한 결과는 EGFR-돌연변이 NSCLC의 해당작용이 더욱 증대된다는 것을 의미한다.
또한, 상기 해당작용의 증대가 EGFR-돌연변이 NSCLC 세포의 성장을 지원하기 위해 필요한 것인지 여부를 테스트했다. 포도당 결핍(deprivation)은 EGFR-돌연변이 NSCLC 세포의 증식을 현저히 감소시켰지만(도 3a 및 도 3b), EGFR-WT NSCLC에 미치는 영향은 미미했다(도 3c 및 도 3d). 또한, EGFR-돌연변이 NSCLC 세포의 생존에 대한 호기성 해당작용의 필요성을 확인하기 위해, 포도당 결핍(deprivation)에 대한 세포사멸을 조사했다. 그 결과, 포도당 결핍(도 3e 및 도 3f) 후, EGFR-돌연변이 NSCLC에서는 상당한 세포자멸사가 유발되었으나, EGFR-WT NSCLC에서는 세포사멸에 민감하지 않았다(도 3g 및 도 3h). 마찬가지로, BPTES가 아닌 2DG 처리는 EGFR-돌연변이 NSCLC에서만 세포자멸사를 촉진시켰다(도 3i 내지 도 3l). 참고로, 상기 2DG는 2-하이드록시기가 수소로 치환된 글루코스 분자로서 분자식이 C6H12O5이며, 해당작용(glycolysis)을 억제하는 것으로 알려져 있다. 또한, 상기 BPTES는 글루타미나아제(Glutaminase 1, GLS 1)의 저해제로서, NSCLC 세포에 BPTES를 처리하는 경우 ATP와 NADH가 유의미하게 감소하는 것으로 알려져 있다.
또한, EGFR-돌연변이 NSCLC의 생존을 위한 호기성 해당작용의 중요성을 확인하기 위해 우리는 EGFR-돌연변이 NSCLC 세포가 이종 이식으로 생체 내에서 성장할 수 있는 능력을 평가했다. 도 1i, 1j 및 1k에 나타낸 바와 같이, 2DG 처리는 EGFR-WT NSCLC에 비해 EGFR-돌연변이 NSCLC의 성장을 강력하게 감소시켰다. 이러한 데이터는 EGFR 돌연변이가 종양의 생존을 촉진하기 위해 전사 조절을 통한 포도당 신진대사 재프로그램을 매개한다는 것을 시사한다.
성장과 생존을 위해 EGFR에 의존하는 EGFR-돌연변이 NSCLC는 EGFR-WT NSCLC보다 EGFR 신호 전달에 더욱 강하게 의존한다. 성장과 생존에서 포도당 신진대사의 중요성을 감안할 때, EGFR 돌연변이 NSCLC에서 포도당 신진대사가 EGFR 신호 전달에 필요할 수 있다고 추측했다. 이에 따라, 영양 결핍이 EGFR 신호 전달에 영향을 미치는지 여부를 테스트하였다. 그 결과, 성장 또는 생존에 영향을 미치지 않는 글루타민(Gln)의 결핍은 EGFR 신호 전달에 유의한 영향을 미치지 않는 반면, 포도당 결핍은 시간 의존적으로 EGFR 수준을 현저히 감소시켰으며, EGFR 신호전달 요소인 AKT 및 ERK의 인산화를 저해하였다(도 1l). 상기 결과(도 3e 및 도 3f)와 마찬가지로, PARP 및 Caspase-3는 포도당 결핍시에만 절단되었다(도 1l). BPTES 처리는 EGFR 신호 전달에 아무런 영향을 미치지 못했지만, 2DG 처리는 EGFR 수준의 극격한 감소와 EGFR-돌연변이 NSCLC의 EGFR 신호전달 억제로 이어져 세포사멸을 유도했다(도 1m). 포도당 대사 억제가 강력한 세포사멸을 유도한다는 것을 고려할 때, 포도당 대사 억제가 다른 수용체 티로신 키나아제(RTK)를 억제할 수 있다고 추측했다. 이에 따라, 포도당 대사 억제시의 다른 RTKs의 인산화 및 전체 수준을 조사했다. 도 1N에 나타낸 바와 같이, 포도당 결핍 또는 2DG 처리는 IGF-1R 인산화를 현저하게 감소시켰고, MET 인산화는 미미하게 감소시켰다; 반대로 포도당 결핍이나 2DG 처리에 대하여 총 형태는 변하지 않았으며, RTKs 활성화와 결합된 억제는 세포사멸을 극심하게 증강시키는 것으로 나타났다. 종합하면, 이러한 결과들은 EGFR 돌연변이에 의해 증대되는 해당작용이 EGFR의 수준을 유지함으로써 EGFR-돌연변이 NSCLC 생존을 뒷받침한다는 것을 입증한다.
TCA 회로의 연료로서의 포도당은 EGFR-돌연변이 NSCLC의 생존에 필수적이다
포도당 및 글루타민은 증식하고 있는 종양 세포에서 에너지 및 생합성의 주요 원천이다. 세포는 동화 작용에서 사용하기 위해 포도당을 전환시키는 반면, 대체 에너지원인 글루타민은 TCA 회로에 연료를 공급하는 데 사용된다. TCA 회로 연료의 원천인 글루타민 대사를 차단하면 종양의 성장이 감쇄된다. 글루타민이 아니라 포도당의 결핍이 세포의 성장과 생존을 현저히 감소시킨다는 상기 실험예의 결과에 근거하여, 다른 종양과 달리 EGFR-돌연변이 NSCLC는 포도당을 TCA 회로의 탄소 연료원으로 이용할 것으로 추측했다. 이에 따라, 포도당 또는 글루타민이 없는 EGFR-돌연변이 NSCLC에서의 ATP 수준을 먼저 조사했다. 그 결과, ATP 수준이 글루타민 결핍에 의해서는 유의한 영향을 받지 않지만, 포도당 결핍에 의해서는 현저히 감소함을 확인하였다(도 4a). 미토콘드리아 ATP 생산을 위한 포도당의 필수성을 검증하기 위해 산소 소비속도(OCR; oxygen consumption rates)를 측정했다. 도 4b에 나타낸 바와 같이, 글루타민 결핍의 경우에 비해 포도당 결핍의 경우 산소 소비가 현저히 감소하였다. 또한, TCA 회로 중간물질의 수준에서 영양 결핍의 직접적인 효과를 탐구하기 위해, 대사 분석을 수행하였다. BPTES 처리는 TCA 회로 중간물질에 대해 유의한 억제 효과가 없었지만, 2DG 처리는 TCA 회로 중간물질의 수준을 현저히 감소시켰다(도 5a). 다음으로, EGFR이 미토콘드리아 대사 기능과 해당작용 플럭스의 증대를 통한 에너지 수준 유지에 필수적인지 여부를 조사했다. 그 결과, EGFR knockdown은 TCA 회로 중간물질의 수준뿐만 아니라 산소 소비속도의 현저한 감소를 가져오는 것을 확인하였다(도 4c 및 도 5b). 이러한 결과는 EGFR에 의해 증대된 해당작용(glycolysis)이 EGFR-돌연변이 NSCLC의 TCA 회로에 중요한 탄소 공급원임을 시사한다.
포도당 대사 억제에 의해 유도된 세포사멸이 불충분한 미토콘드리아 ATP 생산 때문인지를 알아보기 위해, TCA 회로의 기질을 제공하는 피루브산 또는 α-케토글루타레이트를 세포에 보충함으로써, 세포를 포도당 대사 억제-유도 세포사멸로부터 구하고자 시도하였다. 그 결과, 피루브산과 α-케토글루타레이트의 보충이 포도당 결핍에 의해 유도된 세포사멸로부터 EGFR-돌연변이 NSCLC를 구해내는 것을 확인하였다(도 4d 및 도 4e). 또한, 2DG 처리에 의해 유도된 세포사멸은 피루브산 또는 α-케토글루타레이트의 보충에 의해 현저하게 역전되었다(도 4f 및 도 4g). 또한, 피루브산과 α-케토글루타레이트의 보충이 포도당 결핍에 의해 감소된 ATP 수준을 현저히 회복시키는 것을 확인하였다(도 5c).
EGFR 수준의 유지에 있어서, 포도당 대사의 기능적 역할을 추가로 정의하기 위해, 포도당 대사 억제로 인해 감소된 EGFR 수준이 피루브산 보충에 의해 회복될 수 있는지를 알아보고자 하였다. 도 2H 및 2I에 나타낸 바와 같이, 피루브산 보충은 포도당 결핍 또는 2DG 처리를 통한 포도당 대사의 억제에 의해 감소된 EGFR 수준을 상당히 회복시키고, AKT 및 ERK의 인산화를 회복시켰다. 피루브산의 존재 하에서, 포도당 결핍 또는 2DG 처리에 의한 PARP 및 카스파제-3의 절단 또한 억제되었다. 이러한 결과는 EGFR-돌연변이 NSCLC에서 포도당이 TCA 회로의 연료로서 EGFR 수준을 유지하는데 필수적이라는 사실을 나타낸다.
EGFR 수준 유지를 위한 미토콘드리아에서의 포도당-유도 ATP 생산의 중요성을 확인하기 위해, 복합 I 억제제인 로테논을 사용하여 미토콘드리아 호흡 사슬을 억제한 후 EGFR 수준을 평가했다. 도 6의 결과와 같이, 로테논을 사용한 미토콘드리아 ATP 생산의 억제는 투여량 및 시간 의존적으로 EGFR 수준을 강하게 감소시켰다(도 6a 및 도 6b). EGFR 수준 유지에 있어서 미토콘드리아 호흡 사슬의 중요성을 감안할 때, 과량의 피루브산이 로테논 처리 후에 감소된 EGFR 수준을 회복시키지 못할 것이라고 추측했다. 이는 미토콘드리아 호흡 사슬이 복합 I 억제제 하에서 작동할 수 없기 때문이다. 실험 결과, 과량의 피루브산이 로테논 처리 후에 감소된 EGFR 수치를 회복시킬 수 없음을 확인하였다(도 6a 및 도 6b). 즉, 피루브산 보충은 로테논 매개 apoptosis로부터 EGFR-돌연변이 NSCLC를 구할 수 없었다(도 6c 및 도 6d). 종합하면, 이러한 결과는 미토콘드리아 ATP 생산이 EGFR 수준을 유지하는 데 중요하다는 것을 입증한다.
JNK의 활성화는 감소된 EGFR 수준을 통해 EGFR-돌연변이 NSCLC 세포 생존을 억제한다
포도당 유래 ATP 생산이 EGFR 돌연변이 NSCLC의 생존을 뒷받침하는 것에 대한 하류 메커니즘을 더 조사했다. JNK는 환경 스트레스에 반응하여 아폽토시스 및 세포사멸을 매개하지만, JNK 활성화가 종양의 세포사멸을 유도하는 기전은 불분명하다. 흥미롭게도, JNK는 포도당 결핍 후 시간 의존적으로 EGFR-돌연변이 NSCLC에서 강하게 활성화 되었으나, 글루타민 결핍에서는 그렇지 않았다(도 7a). 포도당 결핍-매개 JNK 활성화가, 억제된 미토콘드리아 ATP 생성에 의한 것인지 여부를 조사하기 위해, 로테논 처리시의 JNK 활성화 정도를 평가했다. 도 7b에 나타낸 바와 같이, 로테논 처리는 용량 의존적 및 시간 의존적 방식으로 JNK 활성화를 현저히 유도하였다. 다음으로, ATP 결핍-매개 JNK 활성화가 EGFR 수준을 감소시키는지 여부를 조사했다. 이전 결과와 마찬가지로, JNK-활성화제인 아니소마이신(anisomycin)으로 처리하는 경우 EGFR 수치가 현저히 감소하고, AKT와 ERK 인산화가 저해되며, 용량 의존적으로 PARP 및 caspase-3의 절단이 일어났다(도 7c). 또한, 상기 아니소마이신은 EGFR-WT NSCLC에서는 아폽토시스 세포사멸을 유발하지 않았지만, 아니소마이신-유도 JNK 활성화는 용량-의존적으로 EGFR-돌연변이 NSCLC에서 아폽토시스를 유발하였으며(도 7f 및 도 7g), 감소된 EGFR 수준을 통해 EGFR-돌연변이 NSCLC 종양(도 7h 및 도 7i)의 성장을 현저하게 감소시켰다(도 8). 이러한 결과는 포도당 결핍이 EGFR-돌연변이 NSCLC에서만 아폽토틱 세포사멸을 유도한다는 것을 의미한다. 또한, JNK 활성화에 필요한 조건을 확인하기 위해 EGFR-돌연변이 NSCLC에서 포도당 결핍으로 유도된 아폽토시스에 대한 JNK 억제 효과를 조사하였다. 실험 결과, JNK 억제제인 SP600125로 처리하는 경우 포도당 결핍으로 유도된 세포사멸(apoptosis)로부터 상당한 세포가 구해졌다(도 7j 및 도 7k). 마찬가지로, JNK의 억제는 포도당 결핍-매개 EGFR 수준의 감소를 현저하게 차단하였다(도 7l). 이러한 결과는 ATP 결핍-매개 JNK 활성화가 EGFR 수준을 감소시킴으로써 EGFR-돌연변이 NSCLC에서 세포사멸을 유발한다는 것을 시사한다.
ROS는 EGFR 수준의 JNK-매개 감소를 유도한다
ATP 생산은 세포 반응 산소종(ROS)의 원천을 제공하는 미토콘드리아의 주요 기능이고, 미토콘드리아 호흡 억제는 과량의 ROS를 유발한다. 상기 ROS가 MAPK(mitogen-activated protein kinase)를 활성화시키고, JNK 활성화를 유도할 수 있다는 이전의 연구를 고려하면, 포도당 결핍-매개성 미토콘드리아의 ATP 결핍이 ROS 수준의 상당한 증가와 JNK 활성화로 이어질 수 있다. 실제로, 포도당 결핍, 2DG 처리, 또는 로테논 처리에 의한 포도당 대사 억제가 세포질 및 미토콘드리아 모두에서 ROS 수준을 현저히 증가시킨다는 것을 확인하였다(도 9a 및 도 9b). 또한, 과산화수소(H2O2)의 처리는 EGFR 돌연변이 NSCLC에서 아폽토시스를 용량 의존적으로 활성화시켰다(도 9c).
ROS 축적이 EGFR 수준의 JNK 매개 감소를 가져올지 여부를 결정하기 위해 EGFR 신호 전달에 대한 ROS의 효과를 시험하였다. H2O2 처리는 EGFR 수준을 현저히 감소시키고, AKT 및 ERK 인산화를 억제하며, PARP 및 카스파 제-3를 용량 의존적으로 절단하였다(도 9d). 또한, H2O2 활성화 JNK도 농도 의존적으로 나타났으며(도 9e), 이는 ROS가 JNK에 의해 매개된 EGFR 수준의 감소를 통해 아폽토시스를 활성화시킬 수 있음을 나타낸다.
JNK에 의해 매개된 EGFR 수준의 감소가 실제로 ATP 결핍-유도 ROS 생성에 기인한 것인지를 확인하기 위해, N-아세틸-L-시스테인(NAC)의 부재 또는 존재 하에서 포도당 결핍, 2DG 처리, 또는 로테논 처리시의 아폽토틱 세포사멸을 평가하였다. 상기 NAC는 포도당 결핍, 2DG 처리, 또는 로테논 처리로 인한 세포사멸을 상당히 구제하였다(도 9f 및 도 9g). 반대로 NAC는 아니소마이신으로 유도되는 세포사멸은 구제하지 못하였고(도 10a), 이는 JNK가 ROS의 다운스트림 표적임을 시사한다. NAC 보충은 포도당 결핍, 2DG 처리, 또는 로테논 처리 후의 EGFR 수준의 유의한 회복, 및 AKT 및 ERK 인산화를 유도하였다; 포도당 결핍, 2DG 처리, 또는 로테논 처리시의 PARP 및 카스파제-3의 절단은 NAC에 의해 현저히 억제되었다(도 9h, 도 9i 및 도 9j). 중요한 것은 포도당 결핍, 2DG 처리, 또는 로테논 처리에 의해 유도된 JNK 활성화가 NAC에 의해 완전히 저해된다는 것이다(도 9k, 도 9l 및 도 9m). 반대로 NAC는 아니소마이신-감소된 EGFR 신호 또는 EGFR 수준을 회복시키지 못했고(도 10b), 또는 아니소마이신-유도 JNK 활성화를 억제할 수 없었다(도 10c). 포도당 대사는 불균형 산화 환원 상태와 같은 다른 메커니즘을 통해 ROS 수준에 영향을 줄 수 있다. 미토콘드리아에서 포도당-유도 ATP 생성의 억제가 ROS의 상향 조절의 주된 이유임을 확인하면서, 포도당 결핍 또는 2DG 처리를 통한 포도당 대사 억제가 compromised Pentose phosphate 경로를 통한 NADP+/NADPH 비율에 영향을 줄 수 있는지 여부를 시험하였다. 실제로, 포도당 대사 억제는 NADP+/NADPH 비율(데이터는 표시되지 않음)에 유의한 영향을 미치지 않았으며, 이는 ATP 결핍-매개 ROS 생성이 JNK-매개 EGFR 감소를 유도한다는 것을 나타낸다.
Autophagy는 JNK-매개 EGFR의 감소를 위해 필요하다
JNK가 EGFR 발현을 조절하는 메커니즘을 조사하고자 하였다. 2DG 또는 아니소마이신의 처리는 모두 EGFR 전사 수준에 유의한 영향을 미치지 않았다. 이전 연구는 autophagy의 활성화가 EGFR 저하를 일으키고, 차례로 세포 사멸을 유도한다는 것을 증명하였다(So KS, Kim CH, Rho JK, Kim SY, Choi YJ, Song JS, et al. Autophagosome-mediated EGFR down-regulation induced by the CK2 inhibitor enhances the efficacy of EGFR-TKI on EGFR-mutant lung cancer cells with resistance by T790M. PloS one 2014;9:e114000). 따라서 JNK가 autophagy를 활성화하는지, 그리고 이것이 EGFR 저하를 일으키는지 여부를 알아보고자 하였다. 그 결과, EGFR 수준을 현저하게 감소시키는 포도당 결핍, 2DG 처리 또는 아니소마이신의 처리가 LC3-II 수준을 유의하게 증가시키는 것을 확인하였다(도 11a). 이와 같은 autophagic 활성의 증가를 확인하기 위하여, GFP-LC3 리포터를 사용하여 LC3가 자가포식소체(autophagosome)로 결합하는 것을 조사했다. 도 11b에 나타낸 바와 같이, 정상 조건에서 배양된 세포에 비해 포도당 결핍, 2DG 처리 또는 아니소마이신의 처리시 GFP-LC3 puncta의 수가 크게 증가하였다.
그리고, 포도당 결핍-매개 autophagy 활성화에 대한 JNK의 역할을 확인하기 위해, SP600125의 유무에 관계없이 포도당 신진대사 억제 이후 LC3-II 수준을 평가하였다. 포도당 결핍 또는 2DG 처리에 의해 유도된 LC3-II 수준의 증가는 JNK 억제에 의해 현저히 억제되었으며(도 11c), 이는 활성화된 JNK가 자가포식작용(autophagy) 활성화를 유도함을 나타낸다.
활성화된 자가포식작용(autophagy)이 EGFR 감소를 유도할 수 있는지 여부를 테스트하기 위해, 자가포식작용 활성화제(autophagy activator)가 EGFR의 수준에 미치는 영향을 조사하였다. 도 11d에 나타낸 바와 같이, 자가포식작용 활성화제로 알려진 트레할로스(trehalose)는 EGFR을 용량 의존적으로 현저히 감소시켰다. 또한, 포도당 결핍, 2DG 처리 또는 아니소마이신 처리로 인한 EGFR 수준의 감소는 강력한 autophagy 억제제인 chloroquine에 의해 급격히 억제되었다(도 11e 및 도 11f). 또한, 포도당 결핍, 2DG 처리 또는 아니소마이신 처리는 ATG7 넉다운시 EGFR 수준을 감소시키지 않았으며(도 11g 및 도 11h), 기능적 자가포식작용이 JNK 매개 EGFR 감소를 위해 요구된다. 자가포식작용이 포도당 결핍-매개 EGFR 감소에 필수적인 것을 감안하여, 상기 자가포식작용의 억제가 포도당 결핍-유도 세포자멸사를 억제할 수 있다고 추측했다. 실제로, 포도당 결핍, 2DG 처리 또는 아니소마이신 처리시 PARP와 caspase-3의 절단은 chloroquine에 의해 강하게 억제되었다(도 12a 및 도 12b). 또한, PARP와 caspase-3의 절단은 ATG7 knockdown시 급격히 차단되었다(도 12c 및 도 12d). 이러한 결과는 활성화된 JNK가 자가포식작용의 활성화를 매개하며, 이는 EGFR의 감소를 유도한다는 것을 나타낸다.
포도당 대사를 표적으로 하는 것은 EGFR-TKI에 대한 후천적 내성을 극복한다
EGFR-TKI-내성 subline은 이전의 연구에서 확립되었다. 이미 PC-9/GR 및 PC-9/ER 세포에서의 저항성이 2차 T790M 돌연변이에 기인한 반면, HCC827/GR 및 HCC827/ER 세포에서의 저항성은 각각 MET 및 AXL 활성화에 의해 매개된다는 사실이 보고되었다. EGFR 신호 전달에 대한 EGFR-TKIs 내성 세포주의 의존성은 획득된 EGFR-TKI 내성의 기전에 따라 다양하다. 우리는 EGFR knockdown을 이용하여 EGFR-TKI 내성 세포주가 EGFR 신호 전달에 미치는 영향을 평가했다. 도 14a 및 도 14b에 나타낸 바와 같이, META 또는 AXL에 의한 내성 세포(HCC827/GR 및 HCC827/ER)의 증식에는 유의한 변화가 없었으며, EGFR knockdown은 T790M에 의한 내성 세포(PC-9/GR 및 PC-9/ER)의 증식을 현저하게 감소시켰다.
포도당 결핍이 EGFR 수준을 현저하게 감소시켰기 때문에(도 1l 및 도 1m), 이러한 조건이 PC-9/GR 및 PC-9/ER 세포의 증식에 영향을 미친다고 추측하였다. 두 세포주의 증식 속도는 포도당 결핍(도 13a 및 도 13b)에 대한 반응으로 현저하게 억제되었지만, 포도당 대사 억제는 HCC827/GR 및 HCC827/ER 세포의 증식 속도에는 최소한의 영향만을 미쳤다(도 14c 및 도 14d). 포도당 결핍 또는 2DG 처리를 통한 포도당 대사 억제는 PC-9/GR 및 PC-9/ER 세포와 같은 EGFR 의존성 세포에서 상당한 아폽토시스를 유도하였다(도 13c 내지 도 13f).
다음으로, PC-9/GR 및 PC-9/ER 세포에서의 포도당 결핍-매개 세포자멸사에 JNK 활성화가 관여하는지를 조사하였다. 실험 결과, 포도당 결핍 또는 2DG 처리를 통한 포도당 대사 억제가 JNK를 현저하게 활성화시켰으며, 결과적으로 PC-9/GR 및 PC-9/ER 세포 모두에서 EGFR 수준 감소, AKT 및 ERK의 인산화 억제, 및 PARP 및 카스파제-3 절단을 야기하였다(도 13g). 포도당 대사 억제가 EGFR 신호전달 및 세포사멸에 미치는 영향은 아니소마이신-매개 JNK 활성화에서도 관찰되었다(도 13h). 아니소마이신은 용량 의존적으로 세포 사멸을 현저히 유도하였다(도 13i 및 도 13j).
이러한 결과는 EGFR 신호-의존성 EGFR-TKI-저항성 비소세포폐암 세포, 즉 T790M 돌연변이를 갖는 비소세포폐암 세포가 포도당 대사의 억제 또는 JNK 활성화제의 처리를 통해 EGFR-TKI에 대해 획득된 내성을 극복할 수 있음을 입증한다.
인산화된 JNK는 EGFR-돌연변이를 갖는 NSCLC 조직에서 감소한다
전임상 데이터에 기초하여, 우리는 EGFR-돌연변이 NSCLC 환자에서 EGFR-의존성 종양의 성장을 유지하기 위해 JNK의 활성이 감소될 수 있다는 가설을 세웠다. 이 가설을 시험하고 전임상 데이터를 평가하기 위해 126 개의 EGFR-돌연변이와 118 개의 WT-EGFR을 포함하는 244 개의 NSCLC 조직에서 면역조직화학법(IHC)으로 JNK와 EGFR의 인산화를 조사했다.
도 15a 내지 도 15c에 나타낸 바와 같이, 인산화된 JNK의 발현은 WT-EGFR(116 개중 27 개, 23.28 %)에 비해 EGFR-돌연변이 NSCLC(126 개 중 10 개에서 7.94 %)에서 현저히 감소한 것으로 나타났다.
또한 EGFR 돌연변이와 상관없이 모든 조직에서 인산화된 JNK와 EGFR 발현 간의 역상관관계가 관찰되었다(도 15d 내지 도 15f). 이러한 결과는 EGFR-돌연변이 NSCLC가 EGFR-의존성 종양의 성장을 유지하기 위해 JNK 활성의 감소를 필요로 함을 시사한다.
종합하면, EGFR-돌연변이 NSCLC은 EGFR 수준을 유지하기 위한 EGFR-조절에 의해 증대된 해당작용(glycolysis)에 대한 새로운 의존성을 나타낸다. 또한, 포도당-유도 TCA 회로 중간물질 생성의 중단은 ROS-매개 JNK 활성화를 초래하여, 자가포식작용-매개 EGFR 감소를 유도한다(도 15g).
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (15)

  1. JNK(c-Jun N-terminal kinase) 활성화제로서 아니소마이신(anisomycin)을 유효성분으로 포함하는 EGFR 티로신 키나아제 억제제 내성 비소세포폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
    상기 EGFR 티로신 키나아제 억제제는 게피티니브(gefitinib) 또는 엘로티니브(erlotinib)이고,
    상기 비소세포폐암은 EGFR의 엑손 20번의 T790M 돌연변이를 갖는 EGFR-돌연변이 비소세포폐암인 것을 특징으로 하는 EGFR 티로신 키나아제 억제제 내성 비소세포폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 비소세포폐암은 EGFR의 엑손 19번 내의 결실 돌연변이 또는 엑손 21번의 점돌연변이를 갖는 것을 특징으로 하는 EGFR 티로신 키나아제 억제제 내성 비소세포폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 비소세포폐암은 EGFR의 엑손 20번의 T790M 돌연변이에 의하여 상기 EGFR 티로신 키나아제 억제제에 대하여 내성을 나타내는 것을 특징으로 하는 EGFR 티로신 키나아제 억제제 내성 비소세포폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 JNK 활성화제는 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 40 중량%로 포함된 것을 특징으로 하는 EGFR 티로신 키나아제 억제제 내성 비소세포폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 0.001 내지 100 mg/kg/day의 양으로 투여되는 것을 특징으로 하는 EGFR 티로신 키나아제 억제제 내성 비소세포폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인 EGFR 티로신 키나아제 억제제 내성 비소세포폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    액제, 산제, 에어로졸, 주사제, 수액제(링겔), 패치, 캡슐제, 환제, 정제, 데포(depot) 또는 좌제의 형태로 제형화되는 것인 EGFR 티로신 키나아제 억제제 내성 비소세포폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 비소세포 폐암은 편평세포암, 선암, 큰세포암, 선편평상피암 또는 육종암인 것을 특징으로 하는 EGFR 티로신 키나아제 억제제 내성 비소세포폐암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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British Journal of Cancer, Vol. 87, pp. 1188-1194 (2002) 1부.*
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