KR102155837B1 - 홍경천 추출물을 유효성분으로 포함하는 항스트레스용 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

홍경천 추출물을 유효성분으로 포함하는 항스트레스용 조성물 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 홍경천(Rhodiola sacra)을 열수추출하는 단계; 및 상기 열수추출물을 초임계 추출하는 단계;를 포함하는 항스트레스 활성이 증대된 홍경천 추출물의 제조방법 및 상기 제조방법으로 제조된 홍경천 추출물을 유효성분으로 포함하는 건강기능식품에 관한 것이다.

Description

홍경천 추출물을 유효성분으로 포함하는 항스트레스용 조성물 및 이의 제조방법{Anti-stress compositon containing Rhodiola sacra extracts and preparation method thereof}
본 발명은 홍경천 추출물을 유효성분으로 포함하는 항스트레스용 조성물의 제조방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 항스트레스용 건강기능식품에 관한 것이다.
스트레스(Stress)란 심신에 자극이 가해지면서 이에 대응하기 위한 긴장상태를 말하며, 이때 스트레스를 야기하는 인자를 스트레서(Stresser)라 한다. 스트레서는 현대 사회인에 있어서 가정과 직장의 전반적인 생활에 걸쳐 존재한다. 스트레스는 인체에 긴장상태를 유지하여 앞으로 일어날 변화에 빠르게 대처할 수 있는 순기능을 부여하며, 인체 내 항상성 원리에 의하여 스트레스가 완화되므로 일반적으로는 크게 걱정할 필요는 없다. 하지만 심신이 감당하기 힘든 규모의 스트레스 요인이 작용하거나, 지속적인 스트레스 상태 혹은 반복적으로 스트레스에 노출될 경우 만성화 될 가능성이 있으며, 이로 인해 불면증이나 우울증 등이 유발되어 신체적, 정신적 기능 장애가 유발될 수 있다.
강도가 심각한 스트레스는 의학적 치료방법을 통하여 치료할 수 있지만, 일시적인 스트레스는 일반인에게 빈번하게 일어남에도 불구하고 의학적 치료로 접근이 용이하지 않기 때문에 자가 치료에 의존할 수밖에 없다. 현재 의약품으로 판매되고 있는 항스트레스 제제 등은 효과는 우수하나 부작용의 문제가 있기 때문에 의사의 관리가 필요하다. 이에 일상적으로 큰 제약없이 섭취가 가능하며, 스트레스 완화에 도움을 줄 수 있는 건강기능식품의 개발은 현대인의 삶의 질 향상 측면에서 시급한 시점이며, 단독성분으로서 스트레스를 완화시키는데 도움을 줄 수 있는 생약성분 유래의 건강기능식품의 개발이 절실히 요구되고 있다.
한편, 인체는 상해나 자극을 받으면, 항상성을 유지하기 위해 시상하부-뇌하수체-부신 축의 연쇄적 과정을 통하여 자신을 보호하려고 하는 반응을 발현시킨다. 즉, 스트레스 자극이 대뇌 등의 자극을 통해 시상하부의 부신피질 자극 호르몬인 유리인자(CRF)의 생성 및 분비와 교감신경의 흥분을 유도하고, CRF는 뇌하수체전엽에서 부신피질 자극 호르몬(ACTH)의 생성과 분비를 자극하고, ACTH는 부신피질 세포의 분화와 증식 및 코르티코스테론(corticosterone)의 생성 분비를 자극한다.
이 과정에서 생성된 코르티코스테론이나 아드레날린 등의 호르몬들이 혈액 내로 분비되어 맥박과 혈압의 증가, 호흡률의 증가, 근육의 긴장, 뇌, 심장과 근육으로 가는 혈류량의 증가, 피부, 소화기관, 신장, 간으로 가는 혈류량의 감소, 당과 지방, 콜레스테롤 양의 증가, 혈소판이나 혈액 응고인자의 증가 등과 같은 반응들이 나타난다. 이러한 일련의 과정에 의해 변하는 스트레스 정도를 나타내는 지표로 활용되고 있다.
홍경천(Rhodiola sacra)은 유럽과 아시아의 고산지대에 널리 분포되어 서식하는 식물로서, 신경계통의 자극, 우울증의 감소, 작업능력의 향상, 고산병의 예방 등에 유효한 전통약물로 동유럽과 아시아에 오래전부터 사용되어 왔으며, 일교차가 크고, 건조하며, 산소가 희박하고, 자외선이 강한 고산환경에서도 생존할 수 있는 적응력을 가진 식물이다.
홍경천의 주요성분은 Salidroside, Tyrosol 및 배당체를 비롯하여 전분, 단백질, 지방, 당분, 플라본류 화합물, 아미노산, 무시원소, 미량의 정유 등을 포함하고 있다. 홍경천 유래의 성분들이 미백, 수렴 등의 미용용도와, 항암, 항산화, 노화방지, 간섬유화 억제 등의 효과가 있음이 연구되었다.
한편, 한국공개특허 2014-0136763호에서는 홍경천을 극성용매 또는 비극성용매로 추출한 추출물로 P 물질 분비저해, CGRP 분비저해, 히스타민 유리저해, 인터페론감마유리 저해를 동해 항스트레스 효과를 확인하였으나, 스킨, 크림 등의 외용제 용도로 개발된 바가 있고, 한국 공개특허 제2016-0067137호에는 홍경천을 냉침, 초음파, 환류, 냉각, 열수, 실온, 가온, 초임계 추출방법으로 추출하여 피부온도 스트레스 완화용 화장료 조성물이 개시되어 있다. 이와 같이 홍경천은 항스트레스에 효과가 있음이 연구되고 있으나 아직 연구가 부족한 실정이다.
본 발명이 해결하고자 하는 첫 번째 과제는 홍경천을 열수추출 및 초임계 이산화탄소 추출법으로 추출하여 항스트레스 활성이 증대된 홍경천 추출물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 제조방법으로 제조된 홍경천 추출물을 유효성분으로 포함하는 항스트레스용 또는 피로개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 홍경천(Rhodiola sacra) 열수추출물을 초임계 이산화탄소로 120 내지 300 bar 및 30 내지 50 ℃에서 추출한 추출물을 유효성분으로 포함하는 항스트레스용 또는 피로개선용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 홍경천(Rhodiola sacra)을 열수추출하는 단계; 및 (2) 상기 열수추출물을 초임계 추출하는 단계;를 포함하는 항스트레스 활성이 증대된 홍경천 추출물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 홍경천은 열수추출하기 전에 아스퍼질러스 속 균주로 발효시키는 단계를 더 포함하여 수행할 수 있다.
상기 아스퍼질러스 속 균주는 아스퍼질러스 카와치(Aspergillus kawachii), 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae) 및 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori) 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 발효는 25 내지 40 ℃의 온도에서 6 내지 72시간 동안 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 초임계 추출은 이산화탄소를 추출용매로 120 내지 300 bar 및 30 내지 50 ℃에서 추출하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 항스트레스 활성이 증대된 홍경천 추출물을 유효성분으로 포함하는 항스트레스용 또는 피로개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 홍경천 추출물은 항스트레스 활성이 증대되었으며, 피로개선 효과가 우수하고, 독성이 없어 인체에 안전하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 홍경천(Rhodiola sacra) 열수추출물을 초임계 이산화탄소로 120 내지 300 bar 및 30 내지 50 ℃에서 추출한 추출물을 유효성분으로 포함하는 항스트레스용 또는 피로개선용 조성물을 제공한다.
본 발명에 의하면, 상기 홍경천 열수추출물은 건조 홍경천, 생 홍경천 또는 홍경천 발효물을 원료로 사용하여 열수추출한 것일 수 있다.
상기 홍경천 발효물은 홍경천을 아스퍼질러스 속 균주로 25 내지 40 ℃의 온도에서 6 내지 72시간 동안 발효시킨 것일 수 있으며, 상기 아스퍼질러스 속 균주는 아스퍼질러스 카와치(Aspergillus kawachii), 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae) 및 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori) 중에서 선택되는 어느 하나 일 수 있고, 바람직하게는 아스퍼질러스 카와치일 수 있다. 상기 아스퍼질러스 카와치로 발효시킨 홍경천 발효물을 열수추출하여 얻은 추출물은 마우스를 대상으로 한 항스트레스 테스트에서 특히 우수한 스트레스 개선 효과를 나타내었다.
다음으로, 본 발명은 (1) 홍경천(Rhodiola sacra)을 열수추출하는 단계; 및 (2) 상기 열수추출물을 초임계 추출하는 단계;를 포함하는 항스트레스 활성이 증대된 홍경천 추출물의 제조방법을 제공한다.
먼저, 홍경천을 열수추출한다. 상기 홍경천은 그대로(生) 사용할 수도 있으나, 건조 또는 발효시킨 홍경천을 이용하는 것이 독성이 적으므로 바람직하다. 특히, 발효시킨 홍경천은 독성이 현저히 저감되고 항 스트레스 활성 물질의 함량이 증대되므로 보다 바람직하다.
상기 발효시킨 홍경천은 홍경천을 아스퍼질러스 속 균주로 발효시킨 것일 수 있다. 상기 아스퍼질러스 속 균주는 앞에서 제시한 바와 같다. 상기 발효를 위한 조건은 25 내지 40 ℃의 온도에서 6 내지 72 시간 동안 수행함으로써 이루어질 수 있다. 상기 발효 과정에서 상기 균주로 발효하기 전에 홍경천을 멸균하는 것이 바람직하다. 상기 멸균 방법은 당해 분야에서 통상적으로 실시되는 어떠한 방법이든 이용이 가능하며, 예를 들어, 고압멸균, 고온멸균 및 저온멸균 방법이 있을 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 열수추출은 100 ℃에서 0.5 내지 12 시간 동안 수행하여 이루어질 수 있으며, 추출 수율을 향상시키고, 항스트레스 활성 효과가 더욱 증진된 추출물을 얻기 위하여 홍경천을 분쇄하거나 또는/및 홍경천을 물에 현탁하여 초음파 처리한 뒤 열수 추출할 수 있다. 본 발명에서는 상기 초음파 처리를 통해, 홍경천 내의 섬유소등 단단한 결합조직(rigid structural matrix)이 해리되어 생리활성 성분이 쉽게 유리됨으로써 유효성분의 추출수율이 향상되는 결과를 얻었다.
본 발명에 의하면, 상기 초음파 처리는 15-25 kHz, 500-800 watt 및 20 amplitude의 조건으로 20 내지 35 ℃에서 2 내지 20 분간 초음파를 조사하는 것일 수 있다. 초음파 초사시간이 상기 범위 미만이 추출수율의 향상을 기대하기 어렵고항스트레스 활성효과를 추가로 얻기 어려웠다. 초음파 조사시간이 증가할수록 항 스트레스 활성 효과도 함께 증가하는 경향을 나타내었으나, 20 분을 초과하면 추출 수율은 크게 증가하였으나, 항스트레스 활성 향상 효과가 초음파를 조사하지 않는 경우보다 저하되는 것을 확인하였다.
본 발명의 추출물은 상술한 추출 용매에 의한 추출물뿐만 아니라 통상적인 정제 과정을 추가로 수행한 추출물도 포함한다. 예를 들어 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리, 크로마토그래피법(크기, 이온, 소수성 또는 용매친화성)에 의한 분리 등 다양한 정제방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 추출물의 범주에 포함된다.
본 발명에 의하면, 상기 (2) 단계는 초임계 이산화탄소를 추출용매로 사용하여 유속을 5 내지 20 ml/min의 속도로 투입하여 추출하는 것일 수 있는데, 30 내지 50 ℃에서 40분 내지 150분간 추출하는 것일 수 있는데, 더욱 바람직하게는 120 내지 300 bar의 압력으로 추출하는 것일 수 있다.
이산화탄소는 초임계 상태에서 유기 용매에 가까운 성질을 가지는데 온도 및 압력이 높아질수록 일반적인 비극성 성질뿐만 아니라 극성의 성질이 향상되어 양쪽성 성질을 나타내게 되어 추출능이 향상된다. 본 발명에 따르면, 초임계 추출 조건에서 추출압이 100 bar에서는 추출능이 낮은 문제가 있었으며, 350 bar이상이면 추출능이 향상될 수 있으나 스트레스 개선에 관여하지 않는 성분도 함께 추출되어 추출물 중의 스트레스 개선에 효과적인 물질의 함량 비율이 낮아지는 것을 확인하였다. 이에 추출압이 120 bar 또는 300 bar, 바람직하게는 150 내지 250 bar인 것이 스트레스 개선 효과를 극대화할 수 있는 범위인 것으로 추정하였다. 또한 추출시간이 상기 범위를 미만이면 추출되는 항스트레스 활성을 나타내는 성분의 함량이 낮아 바람직하지 않으며, 추출시간이 상기 범위를 초과하면 추출수율은 향상되나 스트레스 개선에 관여하지 않는 성분이 함께 추출되는 문제가 있다.
가장 바람직한 구현예에 따르면, (A) 홍경천을 마쇄하는 단계, (B) 상기 마쇄된 홍경천을 물에 현탁하여 초음파 처리하는 단계, (C) 상기 초음파 처리된 홍경천을 세포벽 분해효소로 가수분해하는 단계, 및 (D) 상기 가수분해된 홍경천을 초임계 추출하는 단계를 통해 홍경천 초임계 추출물을 제조함에 있어서, ① 상기 (D) 단계의 초임계 추출은 (D1) 초임계 이산화탄소만을 이용하여 1차 초임계 추출하는 단계, 및 (D2) 상기 초임계 이산화탄소에 유기용매를 공급하며 2차 초임계 추출하는 단계를 포함하는 과정을 통해 수행하고, 이때 ② 메탄올 : 헥산올 : 디클로로메탄이 1 : 0.5 내지 1 : 0.5 내지 1의 중량비로 혼합된 유기용매를 사용하여, ③ 상기 초임계 이산화탄소 1 L를 기준으로 0.2 내지 0.5 mL/분의 속도로 공급하여 상기 (D2) 단계를 수행한다.
이러한 제조방법을 통해서 제조된 홍경천 추출물인 경우 스트레스 지표 중 하나인 혈중 코르티코스테론 함량이 전혀 증가하지 않는 반면, 위 ① 내지 ③ 중 어느 하나라도 충족되지 않으면, 그 정도의 차이는 있지만 모든 경우 혈중 코르티코스테론 함량이 증가함을 확인하였다.
본 발명에 따라 상기한 제조방법에 따라 홍경천을 열수추출 후 초임계추출 또는 아스퍼질러스 속 균주로 발효시킨 뒤 열수추출 및 초임계추출한 '홍경천 추출물'은 좁은 케이지에서 가두어 구속 스트레스를 부가한 쥐 모델에서 본 발명에 따른 홍경천 추출물을 경구투여한 결과 스트레스 지표물질인 코티졸, 글루코오스 및 젖산의 혈중농도가 감소하는 것을 확인하였으며, 동시에 세포독성은 낮아졌다. 따라서, 본 발명에 따른 홍경천 추출물은 항스트레스 또는 피로개선을 위한 건강증진용 기능식품으로 적용이 가능하다.
건강기능식품이란, 천연물의 추출물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 개선을 기대할 수 있으나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 건강기능식품은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 매우 유용하다. 이와 같은 건강기능식품에 있어서의 홍경천 추출물의 첨가량은, 대상인 건강기능식품의 종류에 따라 달라 일률적으로 규정할 수 없지만, 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 대상 식품에 대하여 통상 0.01 내지 50 중량%, 바람직하기로는 0.1 내지 20 중량%의 범위이다. 또한, 환제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태의 건강기능식품의 경우에는 통상 0.1 내지 100 중량% 바람직하기로는 0.5 내지 80 중량%의 범위에서 첨가하면 된다.
본 발명에 따른 홍경천 추출물을 항스트레스 또는 피로개선용 건강기능식품으로 사용하는 경우, 상기 홍경천 추출물을 유효성분으로 포함하는 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태로 제제화하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않으며, 유효성분의 혼합양은 각 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다.
액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
또한, 본 발명의 홍경천 추출물을 유효성분으로 포함하는 건강기능식품은 상기 유효성분 이외에 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있다. 상기 보조제로는 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제를 함유될 수 있으며, 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용될 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 제한되지 않으나, 본 발명의 조성물 전체 100 중량부%에 대하여 0.01-0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명에 따른 홍경천 추출물은 각종 식품에 첨가 가능한 식품 첨가물로서 이용이 가능하다. 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 알코올 음료류, 과자류, 다이어트바, 유제품, 육류, 초코렛, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 비타민 복합제 등이 있다.
본 발명의 식품 조성물은 유효성분으로서 홍경천 추출물뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제와 음료류로 제조되는 경우에는 본 발명의 한약재 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 및 각종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
실시예
이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
실시예 1-1
건조 홍경천을 분쇄한 다음 100 ℃에서 6 시간 동안 열수추출한 다음 필터하고 여액을 농축하였다. 농축된 여액은 250 bar 및 40 ℃에서 초임계 이산화탄소의 유속을 10 ml/min의 속도로 투입하여 2시간 동안 초임계 추출법으로 추출하여 홍경천 추출물을 제조하였다.
실시예 1-2
발효된 홍경천을 이용하여 실시예 1-1의 방법으로 홍경천 추출물을 제조하였다. 홍경천의 발효는 건조 홍경천을 분쇄한 다음, 분쇄된 홍경천 100 g에 수분 함량이 50 %가 되도록 첨가한 뒤 플라스크에 담아 오토클레이브에서 멸균시킨 뒤, 클린벤치에서 방냉시키고, 아스퍼질러스 카와치(Aspergillus kawachii) 5 g을 접종하여 28 ℃에서 3일간 배양하여 발효시켰다.
실시예 1-3
본 발명에 사용되는 초음파 추출방법은 초음파 추출기(SEEC-SONIC Ⅱ, UL-Tech. com. Uiwang, Korea)를 사용하여 20 kHz, 750 watt 및 20 amplitude 조건에서 초음파를 발생시켜 추출하였으며, 온도를 일정하게 유지하기 위하여 순환식 항온 수조(Circulator Water Bath)를 연결하여 사용하였다.
건조 홍경천을 물에 현탁한 후, 초음파를 5분간 조사하였다. 다음으로 홍경천을 실시예 1-2의 방법으로 발효 및 열수추출하여 홍경천 추출물을 제조하였다.
실시예 2-1
홍경천를 깨끗이 세척한 후 분쇄하고 나서, 물에 현탁하여 초음파 추출기(SEEC-SONIC II, UL-Tech. com. Uiwang, Korea)를 사용하여 20 kHz, 750 watt 및 20 amplitude 조건에서 5 분 동안 초음파를 처리하였다. 온도를 일정하게 유지하기 위하여 순환식 항온 수조(Circulator Water Bath)를 연결하여 사용하였다.
현탁액을 제거하고 나서 초음파 처리된 홍경천에 구연산을 첨가하여 pH가 5.8이 되도록 조절하였다. pH가 조절된 홍경천 분쇄물 100 g에 대하여 셀룰라아제, 베타-글루카나아제, 헤미셀룰라아제, 아라비나아제 및 자일란나아제를 포함하는 복합효소인 비스코자임 L(Viscozyme L) 1 g을 첨가하여 40 ℃의 온도에서 200 rpm의 속도로 교반하여 균질화시키면서 효소분해 반응을 수행하였다. 반응 종료 후, 100 ℃에서 10분 동안 가열하여 효소를 실활시킨 뒤, 용매를 제거하여 홍경천 효소 분해물을 제조하였다.
상기 제조된 홍경천 효소 분해물을 250 bar 및 40 ℃로 유지된 초임계 이산화탄소에 투입하여 2 시간 동안 1차로 초임계 추출을 수행하였다. 가압 추출기에 초임계 이산화탄소를 공급하는 것은 중단하고 나서, 메탄올 : 헥산올 : 디클로로메탄이 1 : 0.75 : 0.75의 중량비로 혼합된 유기용매를 가압 추출기에 공급하되, 초임계 이산화탄소 1 L를 기준으로 0.4 mL/분의 속도로 공급하며 2 시간 동안 2차로 초임계 추출하여, 최종 홍경천 초임계 추출물을 수득하였다.
실시예 2-2
초임계 이산화탄소만을 이용해서 초임계 추출을 1차만 수행한 것을 제외하고는 실시예 2-1과 동일하게 제조과정을 수행하여 홍경천 초임계 추출물을 수득하였다.
실시예 2-3
메탄올 : 헥산올 : 디클로로메탄를 중량비 1 : 1.5 : 1.5로 혼합한 유기용매를 사용한 것을 제외하고는 실시예 2-1과 동일하게 제조과정을 수행하여 홍경천 초임계 추출물을 수득하였다.
실시예 2-4
유기용매를 초임계 이산화탄소 1 L를 기준으로 1 mL/분의 속도로 공급한 것을 제외하고는 실시예 2-1과 동일하게 제조과정을 수행하여 홍경천 초임계 추출물을 수득하였다.
비교예 1
건조 홍경천을 분쇄한 다음 100 ℃에서 6 시간 동안 열수추출하여 홍경천 추출물을 얻었다.
비교예 2
건조 홍경천을 분쇄한 다음 250 bar 및 40 ℃에서 초임계 이산화탄소의 유속을 10 ml/min의 속도로 투입하여 2시간 동안 추출하여 홍경천 초임계 추출물을 제조하였다.
시험예 1. 과산화수소 유도 세포 독성 억제 효과 검증
과산화수소는 세포 내에서 히드록실라디칼(Hydroxyl radical)을 생성하여 지질과산화를 유발함으로써 세포막의 손상과 세포독성을 일으킨다. 실시예 1-1 내지 1-3 및 비교예 1 및 2에 따른 추출물이 과산화수소에 의한 세포독성 작용을 억제시킬 수 있는지 확인하였다.
실험은 HaCaT 세포를 이용하여 MTT 분석법으로 측정하였다. 대수증식기에 있는 HaCaT 세포를 웰(well) 당 8000개로 96웰 플레이트에 접종하여 DMEM 배지 200 ㎕에서 24 시간 동안 배양하였다. 실시예 1-1 내지 1-3 및 비교예 1 및 2의 추출물들을 각각 최종농도 50 ㎍/㎖로 배지에 첨가한 다음 4 시간 동안 반응시키고, 세포들은 PBS로 세척하였다. 과산화수소를 최종농도 1 mM로 포함하는 배지에 상기 세척된 세포들을 2 시간 동안 배양하여 산화적 스트레스를 유도하였고, 상기 세포들을 PBS로 세척하였다. 세척한 세포들은 0.5 ㎎/㎖의 MTT를 포함한 배지에서 다시 4시간 동안 배양하여 반응시켰다. 이때, 황색의 MTT는 살아있는 세포 내 미토콘드리아의 작용 하에 환원되어, 물에 용해되지 않는 자색의 포마잔(Formazan)으로 변화한다. MTT는 세포에 붙어있기 때문에, 디메틸설폭사이드(DMSO) 용액 200 ㎕로 상기 배양액을 용해하여, 세포를 파괴하고 MTT를 유리시켰다. 포마잔의 양은 살아있는 세포수에 정비례하므로, ELISA 판독기로 측정하였을 경우 나타나는 포마잔의 흡광도를 측정하여 세포독성을 계산하였다.
또한, 과산화수소 처리를 하였으나 상기 추출물을 첨가하지 않은 HaCaT 세포를 대조군으로 하여 상기 방법과 동일하게 실시하였다. 상기에서 용해시킨 시료들 각각을 ELISA 판독기의 540 ㎚로 흡광도를 측정한 뒤, 각 용액의 세포 독성을 하기 식 1로 환산하여 표 1에 나타내었다.
[식 1]
Figure 112018118573480-pat00001
구분 세포독성(%)
대조군 64.4
비교예 1 37.3
비교예 2 30.8
실시예 1-1 26.3
실시예 1-2 20.1
실시예 1-3 21.6
실시예 1-1 내지 1-3의 홍경천 추출물은 대조군 및 비교예 1 및 2보다 세포독성이 낮았으며, 특히, 발효시킨 홍경천 추출물이 낮은 세포독성을 나타내었다. 한편, 초음파 조사를 하는 경우에는 세포독성이 다소 증가하는 경향을 나타냈으나 유의적이지는 않았다.
시험예 2. 항스트레스 활성 테스트
190-210g 무게의 SPF(Specific Pathogene Free)급 6 주령 웅성 SD(Sprague-Dawley) 랫트 30 마리를 구입하여 1주간 적응기간을 두고 22±2℃, 55±10% 상대습도 및 12 시간 명암주기에서 고형사료와 수돗물을 자유롭게 섭취하도록 하였다. 무작위로 그룹당 8마리씩 5개 그룹으로 나누었다.
대조군 및 약물투여군은 랫트 몸무게 kg당 200 mg씩 1일 1회 4주간 경구투여하였다. 4주간 약물을 투여한 후 5시간 동안 구속케이지(DH-SCO3, 대한바이오링크)에서 수행하였다. 항스트레스 활성을 평가하기 위하여 스트레스 지표물질인 코티졸, 글루코오스 및 젖산의 혈중농도(㎍/㎗)를 측정하였으며, 이를 하기 표 1에 나타내었다.
정상군(Normal): 무처리군
대조군(Control): 28일간 증류수 투여 후, 스트레스 유발군
약물투여군: 28일간 일 1회 홍경천 추출물 200 mg/kg 투여 후, 스트레스 유발군
구분 정상군 대조군 비교예 1 비교예 2 실시예 1-1 실시예 1-2 실시예 1-3
코티졸 5.42 39.56 32.61 30.59 26.15 23.34 21.81
글루코오스 108.31 157.64 140.81 129.16 124.29 120.02 116.23
젖산 11.26 28.12 19.15 18.56 12.34 11.83 11.76
표 2에 제시한 스트레스 지표물질의 혈중농도(㎍/㎗) 데에터를 살펴보면, 본 발명에 따른 홍경천 추출물을 경구투여한 군의 혈중에서 스트레스의 상승과 관련이 있는 스트레스 관련 지표물질의 농도가 낮았다. 또한, 홍경천 발효물을 원료로 이용한 실시예 1-2 및 1-3이 보다 항스트레스 활성을 나타내는 것을 확인하였다.
시험예 3: 혈중 코르티코스테론 농도 측정
약물로서, 실시예 1-1 내지 1-3 및 비교예 1 및 2의 홍경천 추출물을 사용하는 대신, 실시예 2-1 내지 2-4의 홍경천 추출물을 사용하는 것을 제외하고는, 위 시험예 2에 준하여 시험을 진행하였다.
구체적으로, 혈액을 혈청분리용 시험관에 넣고, 채혈 후 2시간 이내에 4℃에서 3,000 rpm으로 10분간 원심분리로 혈청을 분리한 후, -70℃에 보관한 다음, 혈청 중 코티코스테론의 농도 측정과 혈액생화학 분석에 이용하였다. 코르티코스테론의 농도 측정은 마우스 코르티코스테론 ELISA 키트(Abcam, USA)를 이용하여 제조회사의 실험방법에 따라 실험한 후 마이크로플레이트 리더(BioTek-EL800, BioTek Instruments, Inc.,USA)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였고, 표준시료의 흡광도로 작성한 표준곡선을 이용하여 혈청 중 코르티코스테론의 농도를 분석하였다.
그 결과, 실시예 2-1의 홍경천 추출물을 투여한 그룹에서는 40.98±31.67 ng/㎖의 혈중 코르티코스테론 농도를 보여, 무처리군인 정상군(41.46±33.22 ng/㎖와)과 통계적으로 유의미한 차이를 보이지 않는 반면, 실시예 2-2 내지 2-4의 홍경천 추출물을 투여한 그룹에서 약 30% 내지 70% 정도 혈중 코르티코스테론 농도가 통계적으로 유의적으로 증가함을 확인하였다(p<0.01).

Claims (4)

  1. (1) 홍경천(Rhodiola sacra)을 열수추출하는 단계; 및
    (2) 상기 열수추출물을 초임계 추출하는 단계;를 포함하는 항스트레스 활성이 증대된 홍경천 추출물의 제조방법으로서,
    상기 홍경천은 열수추출하기 전에 아스퍼질러스 속 균주로 발효시키는 것이고,
    상기 아스퍼질러스 속 균주는 아스퍼질러스 카와치(Aspergillus kawachii), 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae) 및 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori) 중에서 선택되는 어느 하나이며,
    상기 발효는 25 내지 40 ℃의 온도에서 6 내지 72 시간 동안 수행되고,
    상기 초임계 추출은 이산화탄소를 추출용매로 120 내지 300 bar 및 30 내지 50 ℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 항스트레스 활성이 증대된 홍경천 추출물의 제조방법.
  2. (A) 홍경천을 마쇄하는 단계,
    (B) 상기 마쇄된 홍경천을 물에 현탁하여 초음파 처리하는 단계,
    (C) 상기 초음파 처리된 홍경천을 세포벽 분해효소로 가수분해하는 단계, 및
    (D) 상기 가수분해된 홍경천을 초임계 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 홍경천 초임계 추출물의 제조방법으로서,
    상기 (D) 단계의 초임계 추출은 (D1) 초임계 이산화탄소만을 이용하여 1차 초임계 추출하는 단계, 및 (D2) 상기 초임계 이산화탄소에 유기용매를 공급하며 2차 초임계 추출하는 단계를 포함하는 과정을 통해 수행되고,
    상기 유기용매는 메탄올 : 헥산올 : 디클로로메탄이 1 : 0.5 내지 1 : 0.5 내지 1의 중량비로 혼합된 혼합 유기용매이며,
    상기 (D2) 단계에서 상기 유기용매는 상기 초임계 이산화탄소 1 L를 기준으로 0.2 내지 0.5 mL/분의 속도로 공급되는 것을 특징으로 하는 홍경천 초임계 추출물의 제조방법.
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