KR102154254B1 - 우수한 면역기능 증진 효과를 갖는 신규한 유산균 및 이를 포함하는 식품조성물, 건강기능성 식품 조성물 및 프로바이오틱스 - Google Patents

우수한 면역기능 증진 효과를 갖는 신규한 유산균 및 이를 포함하는 식품조성물, 건강기능성 식품 조성물 및 프로바이오틱스 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역기능 증진 효과가 우수한 신규한 수탁번호 KCCM12687P로 기탁된 Lactococcus lactis subsp. lactis GCWB1176 균주를 제공한다.
또한, 상기 신규한 균주를 포함하는 면역기능 증진 효과가 우수한, 식품 조성물, 건강기능성 식품 조성물 및 프로바이오틱스를 제공한다.

Description

우수한 면역기능 증진 효과를 갖는 신규한 유산균 및 이를 포함하는 식품조성물, 건강기능성 식품 조성물 및 프로바이오틱스{Novel Lactic Acid Bacteria with Excellent Immune function enhancing effect and Food Composition Containing the Same and Health Functional Food Composition Containing the Same and Probiotics comprising the Same}
본 발명은 우수한 면역기능 증진 효과를 갖는 신규한 유산균 및 이를 포함하는 식품 조성물, 건강기능성 식품 조성물 및 프로바이오틱스에 관한 것이다.
사람을 포함한 동물의 위장관 내에서 숙주의 장내 미생물 환경을 개선하여 숙주의 건강에 유익한 영향을 주는 살아있는 미생물을 통칭하여 프로바이오틱스라고 한다.
프로바이오틱스의 일종인 유산균은 인체의 소화계에 공생하면서 섬유질 및 복합 단백질들을 분해하여 중요한 영양 성분으로 만드는 역할을 수행한다. 유산균(lactic acid bacteria)은 탄수화물을 분해를 하고, 이를 이용하여 유산을 만드는 세균으로서, 산소가 적은 곳에서 잘 증식하는 통성 혐기성균 또는 편성 혐기성균이다. 유산균은 크게 5개 속으로 구분할 수 있는데, 스트렙토코커스(Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 루코노스탁(Leuconostoc), 비피도박테리아(Bifidobacteria) 그리고 페디오코커스(Pediococcus)로 분류된다.
연쇄상 구균인 스트렙토코커스 속 미생물은 동형발효균으로, 우유를 발효시켜 유산을 생성함으로써 부패균이나 병원균을 억제하는 것으로 알려져 있다. 락토바실러스 속 미생물은 동형 또는 이형발효를 하는 유산간균으로, 유제품이나 채소의 발효과정에서 흔히 볼 수 있는 균이며, 쌍구균인 루코노스탁 속 미생물은 이형 발효를 하며 채소류의 발효에 주로 관여한다. 또한, 비피도박테리아 속 미생물은 산소가 있는 곳에서는 생육하지 못하는 편성 혐기성균으로, 당을 발효하여 유아에게 유용하게 대사될 수 있는 L(+)형의 유산을 생성한다. 마지막으로, 페디오코커스 속 미생물은 사련균의 형태를 가지는 동형 발효균으로, 김치나 절임 식품에 존재하며 소시지 등의 육류 발효에 관여한다.
최근 면역증진에 관한 관심이 높아지면서, 유산균을 이용하는 면역증진 방법에 대해서도 다양한 연구가 이루어지고 있다. 유산균은 인체에 안전하며 면역증진 이외에 인체에 다양한 유익한 효용을 제공하므로, 면역증진에도 효과적인 유산균을 얻을 수 있다면 인류의 건강증진에 큰 도움이 될 수 있을 것으로 예상된다.
그러나, 지금까지 면역증진효능이 있다고 알려진 유산균은 면역증진에 대한 효과가 충분하지 않아서 면역증진용으로 사용하기는 부족한 단점이 있었다.
대한민국 특허공개 제10-2016-0082863호
본 발명은 Nitric oxide (NO) 생성량을 증가시키며, 사이토카인(TNF-α, IFN-γ, IL1-β, IL-10, IL-12 등) 분비를 증가시키며, NK cell 활성도 및 세포증식률을 증가시키며, 대식세포의 탐식능(Phagocytic Activity)을 증가시키는 신규한 Lactococcus lactis subsp. lactis GCWB1176 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기와 같이 우수한 면역증강 효과를 갖는 Lactococcus lactis GCWB 1176 균주를 포함하는 식품 조성물, 건강기능성 식품 조성물 및 프로바이오틱스를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여
본 발명은,
수탁번호 KCCM12687P로 기탁된 Lactococcus lactis subsp. lactis GCWB1176 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은
수탁번호 KCCM12687P로 기탁된 Lactococcus lactis subsp. lactis GCWB1176 균주, 이의 배양물, 농축물, 페이스트화물, 분무건조물, 동결건조물, 진공건조물, 드럼건조물, 액상물, 희석물 및 파쇄물을 포함하는 면역기능 증진용 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은
수탁번호 KCCM12687P로 기탁된 Lactococcus lactis subsp. lactis GCWB1176 균주, 이의 배양물, 농축물, 페이스트화물, 분무건조물, 동결건조물, 진공건조물, 드럼건조물, 액상물, 희석물 및 파쇄물을 포함하는 면역기능 증진용 건강기능성 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은
수탁번호 KCCM12687P로 기탁된 Lactococcus lactis subsp. lactis GCWB1176 균주를 포함하는 프로바이오틱스를 제공한다.
본 발명의 신규한 균주인 Lactococcus lactis subsp. lactis GCWB1176 균주는 Nitric oxide (NO) 생성량을 크게 증가시키며, 사이토카인(TNF-α, IFN-γ, IL1-β, IL-10, IL-12 등) 분비를 현저하게 증가시키며, NK cell 활성도 및 세포증식률을 크게 증가시키며, 대식세포의 탐식능(Phagocytic Activity)을 증가시키는 효과를 제공한다. 따라서, 본 발명의 Lactococcus lactis subsp. lactis GCWB1176 균주는 우수한 면역기능 증진 효과를 제공한다.
또한, 본 발명의 식품 조성물, 건강기능성 식품 조성물 및 프로바이오틱스는 상기 Lactococcus lactis subsp. lactis GCWB1176 균주를 포함함으로써 우수한 면역기능 증진 효과를 제공한다.
도 1은 대식세포주에서 5종의 균주 시료들에 의한 Nitric oxide (NO) 생성량을 측정(실험예 1-2)하여 나타낸 그래프이며,
도 2 및 3은 대식세포주에서 5종의 균주 시료들에 의한 식균활성(Phagocytic Activity )을 측정(실험예 1-4)하여 나타낸 그래프이며,
도 4는 5종의 균주 시료들에 의한 ICR mouse의 비장 세포 증식률을 측정(실험예 2-1)하여 나타낸 그래프이며,
도 5는 ICR mouse의 비장 세포주에서 5종의 균주 시료들에 의한 Nitric oxide (NO) 생성량을 측정(실험예 2-2)하여 나타낸 그래프이며,
도 6은 면역억제제인 Cyclophosphamide 유도 면역억제 SPF ICR 마우스 모델에서 시료인 Lactococcus lactis subsp. lactis GCWB1176 균주 투여에 따르는 마우스의 체중, 비장 및 흉선의 무게 변화를 측정(실험예 3-2)하여 나타낸 그래프이며,
도 7은 면역억제제인 Cyclophosphamide 유도 면역억제 SPF ICR 마우스 모델에서 시료인 Lactococcus lactis subsp. lactis GCWB1176 균주 투여에 따르는 사이토카인 분비능 변화를 측정(실험예 3-3)하여 나타낸 그래프이며,
도 8은 면역억제제인 Cyclophosphamide 유도 면역억제 SPF ICR 마우스 모델에서 시료인 Lactococcus lactis subsp. lactis GCWB1176 균주 투여에 따르는 NK 세포 활성도 및 세포증식 변화를 측정(실험예 3-4)하여 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명은,
수탁번호 KCCM12687P로 기탁된 Lactococcus lactis subsp. lactis GCWB1176 균주에 관한 것이다.
상기 신규한 균주인 Lactococcus lactis subsp. lactis GCWB1176 균주는 상기 이름으로 명명하여 2020년 3월 31일에 한국미생물보존센터에 기탁하였다. 수탁번호는 KCCM12687P이다.
상기 균주는 각 지역에서 수집한 치즈로부터 분리 및 동정할 수 있다. 본 발명의 발명자들은 각 지역에서 수집한 치즈로부터 다양한 신규 균주를 분리 및 동정하고, 그들 중에서 Lactococcus lactis subsp. lactis GCWB1176 균주가 종래의 알려진 유산균들과 비교하여 현저히 우수한 면역기능 증진 효과를 제공함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
즉, 상기 Lactococcus lactis subsp. lactis GCWB1176 균주는 Nitric oxide (NO) 생성량을 크게 증가시키는 효과를 제공한다. 면역 반응의 관점에서는 초기 염증반응이 있어야 면역세포가 활성을 띄게 되고 그로 인해 면역이 증진되므로, 항염증과는 정반대로 NO의 발현이 오히려 면역을 증가시키는 역할을 한다.
또한, 사이토카인(TNF-α, IFN-γ, IL1-β, IL-10, IL-12 등) 분비를 증가시키며, NK cell 활성도 및 세포증식률을 현저히 증가시키는 효과를 제공한다.
또한, 대식세포의 탐식능(Phagocytic Activity)을 증가시키는 효과를 제공한다.
특히, 상기 Lactococcus lactis subsp. lactis GCWB1176 균주는 in vitro 및 in vivo에서 매우 현저한 사이토카인(TNF-α, IFN-γ, IL1-β, IL-10, IL-12 등) 분비 증가 효과를 제공하며, NK cell 활성도 및 세포증식률을 향상시키는 효과를 제공한다.
본 발명의 균주는 1ⅹ101 ~ 1ⅹ1013 CFU/g의 생균 함량을 갖는 것이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은
상기 수탁번호 KCCM12687P로 기탁된 Lactococcus lactis subsp. lactis GCWB1176 균주, 이의 배양물, 농축물, 페이스트화물, 분무건조물, 동결건조물, 진공건조물, 드럼건조물, 액상물, 희석물 및 파쇄물을 포함하는 면역기능 증진용 식품 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은
상기 수탁번호 KCCM12687P로 기탁된 Lactococcus lactis subsp. lactis GCWB1176 균주, 이의 배양물, 농축물, 페이스트화물, 분무건조물, 동결건조물, 진공건조물, 드럼건조물, 액상물, 희석물 및 파쇄물을 포함하는 면역기능 증진용 건강기능성 식품 조성물에 관한 것이다.
면역은 체내에 존재하는 자기방어체계로서 인체가 외부로부터 침입해오는 각종 물질이나 생명체를 자기 자신에 대한 이물질로 인식하여 제거하고 대사시키는 과정이다. 외부 자극에 의한 손상이나 병원 미생물의 침입으로부터 자신을 방어하기도 하지만 염증반응 등과 같이 자기 자신의 조직에 손상을 줄 수도 있다. 면역은 면역기능의 변화를 조절하여 정상으로 회복시키거나 변화의 폭을 줄여 주는 작용으로 면역기능 억제나 면역기능 증진으로 구분된다.
본 발명에서 면역기능 증진이란 면역을 조절하여 생체방어 능력을 증강시키는 기능을 의미한다. 상기 면역기능 증진의 기능성을 확인할 수 있는 바이오 마커로는 NK 세포, 싸이토카인, 탐식능, NO, iNOS, COX2, 보체계, 림프구 아집단 비율, 면역글로블린, 세포 생존율, 비장세포 증식, 비장, 흉선 등의 조직 무게 등을 들 수 있다.
본 발명의 면역기능 증진용 건강기능성 식품 조성물의 기능성은 하기 실시예 및 시험예에서 상기 기능성 마커들에 의해 확인된다.
또한, 본 발명은
상기 수탁번호 KCCM12687P로 기탁된 Lactococcus lactis subsp. lactis GCWB1176 균주, 이의 배양물, 농축물, 페이스트화물, 분무건조물, 동결건조물, 진공건조물, 드럼건조물, 액상물, 희석물 및 파쇄물을 포함하는 면역결핍성 질환 또는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
상기 약학 조성물에서 상기 면역결핍성 질환으로는 면역결핍, 인체면역결핍바이러스병, 장감염 질환, 특정 감염성 질환, 박테리아 감염, 곰팡이 감염, 기생충성 질환, 알러지 질환, 피로, 일과성 열피로, 병감 및 피로, 신경무력증 등을 들 수 있으며,
상기 염증성 질환으로는 만성 및 급성 비염, 만성 및 급성 위염, 장염, 궤양성 위염, 급성 및 만성 신장염, 급성 및 만성 간염, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐섬유증, 과민성 대장 증후군, 염증성 통증, 허리 통증, 섬유 근육통, 근막 질환, 통풍, 관절염, 류머티즘성 관절염, 강직성 척추염, 호지킨병, 췌장염, 결막염, 홍채염, 공막염, 포도막염, 피부염, 아토피성 피부염, 습진, 결핵성 여성골반염증질환, 염증성 관절염, 중추신경계통의 염증성 질환, 염증성 다발신경병증 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 기술된 식품 조성물 또는 건강기능성 식품 조성물은 상기 유효성분 이외에, 식품 제조시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제, 감미제 및 향미제를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어, 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어, 덱스트린, 사이클로 덱스트린 등;과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜을 들 수 있다. 상기 감미제로는 천연 감미제(타우마틴, 스테비아 추출물, 레바우디오시드 A, 글리시리진 등) 및 합성 감미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 그러나 이들로 한정되는 것은 아니며, 이 분야에서 공지된 성분들로서 본 발명의 효과를 저해하지 않는 성분들은 모두 사용될 수 있다.
상기 식품 조성물 또는 건강기능성 식품 조성물의 예로는 환자영양식, 육류, 곡류, 카페인 음료, 일반음료, 유제품, 초콜렛, 빵류, 스넥류, 과자류, 피자, 젤리, 면류, 껌류, 아이스크림류, 알코올성 음료, 술, 비타민 복합제, 그 밖의 건강보조식품류 등을 들 수 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 상기와 같은 식품 조성물 또는 건강기능성 식품 조성물의 형태로 제조될 경우, 면역기능 증진을 위하여 편하고 쉽게 복용할 수 있어서 바람직하다.
본 발명에 있어서 상기 건강기능성 식품 조성물 및 약학 조성물은 과립제(granules), 리모나데제(lemonades), 산제(powders), 시럽제(syrups), 액제(liquids and solutions), 엑스제(extracts), 엘릭실제(elixirs), 유동엑스제(fluidextracts), 현탁제(suspesions), 전제(decoctions), 침제(infusions), 정제(tablets), 주정제(spirits), 캅셀제(capsules), 트로키제(troches), 환제(pills), 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀제 형태로 제조될 수 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
상기 약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
또한, 본 발명은
수탁번호 KCCM12687P로 기탁된 Lactococcus lactis subsp. lactis GCWB1176 균주를 포함하는 프로바이오틱스에 관한 것이다.
상기 프로바이오틱스는 하기 실시예에서 분리된 5종의 유산균 균주 중에서 선택되는 1종 이상을 더 포함할 수 있으며, 이 밖에 본 발명의 목적에 도움이 되는 공지의 균주를 더 포함할 수 있다.
상기 프로바이오틱스는 1Х101 ~ 1Х1013CFU/g의 생균 함량을 갖는 것을사용할 수 있으며, 상기 프로바이오틱스는 면역기능 증진용으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 Lactococcus lactis subsp. lactis GCWB1176 균주의 투여량은 투여방법, 복용자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중증도 등을 고려하여 결정하는 것이 좋다.
일 예로, 상기 Lactococcus lactis subsp. lactis GCWB1176 균주는 1일 1ⅹ101 ~ 1ⅹ1013 CFU/g의 생균 함량을 1회 또는 2회 이상으로 분할하여 투여할 수 있다.
또한, 상기 성분들을 포함하는 식품 조성물, 건강기능성 식품 조성물, 약학 조성물, 프로바이오틱스는 유효성분을 기준으로 하였을 때 1일 1ⅹ101 ~ 1ⅹ1013 CFU/g의 생균 함량을 1회 또는 2회 이상으로 분할하여 투여할 수 있다.
그러나 상기의 투여량은 일 예에 불과하며, 복용자의 상태에 따라 의사의 처방에 의해 변화될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 락토코쿠스 락티스 아종 락티스 ( Lactococcus lactis subsp. lactis ) GCWB1176의 분리 및 동정
(1) 프로바이오틱스의 분리
각 지역에서 수집한 치즈를 그의 10배가 되는 양의 멸균된 생리식염수에 넣고 균질화 하였다. 균질화된 시료는 멸균된 생리식염수에 10 단계씩 희석하여 평판희석법(Dilution plating method)으로 균주를 분리하였다. 희석한 균주 샘플을 MRS 배지(MRS broth agar; BD Difco)에 도말 접종한 후, 37℃에서 72시간 혐기 배양하였다. MRS agar plate에서 나타난 콜로니를 pH indicator인 0.005% BCP 를 포함한 PCA 배지(MBcell, South Korea)에 2차 접종하여 보라색 배지가 노락색으로 변하는 콜로니를 MRS agar plate에 3차 접종하여 프로바이오틱스를 순수 분리 하였다.
(2) 락토코쿠스 락티스 아종 락티스 GCWB1176의 동정
상기 (1)에서 순수 분리된 균주에 대해 염색체 DNA 추출 및 정제를 수행하였다. 두 개의 유니버셜 프라이머(Universal primers)인 27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') 및 1492R(5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')을 사용하여 16s rRNA 유전자 증폭을 수행한 후, 증폭된 16s rRNA 유전자의 시퀀싱 분석을 수행하였다. 분석한 16s rRNA 시퀀스 데이터와 EzTaxon server(http://www.ezbiocloud.net)을 이용하여 GRAS(Generally Recognized as Safe)에 해당하는 4종의 균주만 선별하여 하기 표 1에 나타내었다.
동정된 균주
Pediococcus acidilactici GCWB1085
Lactococcus lactis subsp. cremoris GCWB1177
Lactococcus lactis subsp. lactis GCWB1176
Bifidobacterium longum GCWB 1136
상기 Lactococcus lactis subsp. lactis GCWB1176의 16S rRNA 염기서열 분석 결과는 다음과 같았다:
<16S rRNA of bacterial strain, Lactococcus lactis subsp. lactis GCWB1176>
Figure 112020044745011-pat00001
실시예 2: Bifidobacterium breve GCWB1144의 분리 및 동정
(1) 프로바이오틱스의 분리
생후 3개월 된 영아의 분변을 멸균된 생릭식염수에 10 단계씩 희석하여 평판희석법(Dilution plating method)으로 균주를 분리하였다. 희석한 분변 샘플을 BSM agar배지(Bifidus Selective Medium Agar; Sigma, USA)에 도말 접종한 후, 37℃에서 72시간 혐기 배양하였다. BSM agar plate에서 나타난 콜로니를 pH indicator인 0.005% BCP 를 포함한 PCA 배지(MBcell, South Korea)에 2차 접종하여 보라색 배지가 노란색으로 변하는 콜로니를 BL agar 배지(MBcell, South Korea)에 3차 접종하여 프로바이오틱스를 순수 분리 하였다.
(2) Bifidobacterium breve GCWB1144의 동정
상기 실시예 1에서 순수 분리된 균주에 대해 염색체 DNA 추출 및 정제를 수행하였다. 두 개의 유니버셜 프라이머(Universal primers)인 27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') 및 1492R(5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')을 사용하여 16s rRNA 유전자 증폭을 수행한 후, 증폭된 16s rRNA 유전자의 시퀀싱 분석을 수행하였다. 분석한 16s rRNA 시퀀스 데이터와 EzTaxon server(http://www.ezbiocloud.net)을 이용하여 GRAS(Generally Recognized as Safe)에 해당하는 1종의 균주만 선별하여 하기 표 2에 나타내었다.
동정된 균주
Bifidobacterium breve GCWB1144
실험예 1: 대식세포 사용 면역증진 효능 평가
1-1) 균주의 세포 독성 평가(LDH leakage and CCK-8 assay)
마우스 대식세포주 RAW 264.7 cell line을 한국세포주은행에서 분양 받아 세포 농도가 5Х105 cells/㎖이 되도록 현탁하고, 96-well plate에 100 ㎕씩 분주하여 시료를 하기 표 3에 나타낸 농도 별로 처리 한 다음 24시간 배양하였다.
세포 독성은 CCK-8 assay kit 및 Cytotoxicity LDH Assay Kit를 이용하여 측정하고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
농도
(㎍/ml)		 LDH
(Fold of control) (24 hr)		 MTT
(% of control)
(24 hr)
정상군 - 1.00±0.02 100.0±2.85
부형제 - 0.94±0.02 104.3±3.32
GCWB1085 1 0.96±0.03 105.3±2.35
10 0.97±0.01 108.9±5.31
100 0.94±0.03 113.1±4.62*
1000 0.56±0.02*** 102.8±1.68
GCWB1177 1 1.01±0.01 95.9±1.91
10 0.98±0.04 95.6±3.37
100 0.76±0.01*** 95.2±2.74
1000 0.64±0.02*** 92.1±2.30
Lactococcus lactis subsp. lactis
GCWB1176		 1 0.96±0.03 100.8±2.98
10 0.98±0.01 105.8±4.59
100 1.00±0.02 92.7±4.03
1000 0.87±0.01** 63.3±1.86***
GCWB1136 1 0.97±0.00 102.7±4.82
10 1.03±0.02 102.1±7.88
100 1.03±0.02 97.6±4.78
1000 1.20±0.01 93.5±3.83
GCWB1144 1 1.00±0.01 97.5±4.60
10 0.97±0.02 101.9±1.82
100 0.85±0.01* 95.0±6.47
1000 0.96±0.04 98.1±5.99
*P < 0.001 vs. normal group. **P < 0.01 vs. normal group. ***P < 0.05 vs. normal group.
(1) LDH assay 결과
상기 표 3의 5종의 유산균을 마우스 Raw264 .7 대식세포에 1 내지 1,000 ㎍/ml의 농도로 24 시간 처리 한 후 LDH assay를 수행 한 결과, 5종 모두 세포독성이 나타나지 않았다. 다만, GCWB1085, GCWB1177, GCWB1176, 및 GCWB1144 균주의 100 ㎍/ml 또는 1,000 ㎍/ml 농도에서는 LDH 값이 유의적으로 감소되었다.
(2) MTT assay 결과
상기 표 3의 5종의 유산균을 마우스 Raw264.7 대식세포에 1 내지 1,000 ㎍/ml의 농도로 24 시간 처리 한 후 MTT assay를 수행 한 결과, 5종 모두 100 ㎍/ml 이하의 농도에서는 세포독성이 나타나지 않았다. 다만, GCWB1176 균주의 1,000 ㎍/ml 농도에서는 세포독성이 확인되었다.
(3) 실험 수행 농도
모든 균주에서 세포독성이 나타나지 않은 1 내지 100 ㎍/ml 농도로 이후 실험을 수행하였다.
1-2) Nitric oxide (NO) 측정
마우스 대식세포주 RAW 264.7 cell line을 한국세포주은행에서 분양 받아 세포 농도가 5Х105 cells/㎖이 되도록 현탁하고, 96-well plate에 100 ㎕씩 분주하였다. 시료인 상기 표 3의 균주 5종을 각각 1 ㎍/ml 및 10 ㎍/ml의 농도로 48 시간 처리(양성 대조군은 LPS 10 ng/ml로 처리)한 다음을 24시간 배양하였다. 이후, 배양액 50μL를 96-well plate 옮겨 담고 Griess reagent I(NED solution)과 Griess reagent II (Sulfanilamide solution)를 동량으로 혼합한 후, 암실에서 10분간 반응시킨 후, 30분 이내에 microplate reader를 이용하여 540 nm에서 측정하였다.
상기 실험결과는 도 1에 그래프로 도시하였다. 도 1로부터 확인되는 바와 같이, 본 발명의 GCWB1176 균주의 경우, 1 ㎍/ml 및 10 ㎍/ml 농도에서 모두 NO 생성량을 크게 증가시킨 것으로 확인되었다.
면역 반응의 관점에서는 초기 염증반응이 있어야 면역세포가 활성을 띄게 되고 그로 인해 면역이 증진되므로, 항염증과는 정반대로 NO의 발현이 오히려 면역을 증가시키는 역할을 한다. 그러므로, 상기 실험으로부터 본 발명의 GCWB 1176 균주는 우수한 면역기능 증진 효과를 갖는 것을 확인할 수 있다.
1-3) 사이토카인 분비능 측정
마우스 대식세포주 RAW 264.7 cell line을 한국세포주은행에서 분양 받아 세포 농도가 5Х105 cells/㎖이 되도록 현탁하여 96-well plate에 100 ㎕씩 분주하였다. 시료인 상기 표 3의 균주 5종을 각각 1 ㎍/ml, 10 ㎍/ml, 100 ㎍/ml의 농도로 처리(양성 대조군은 LPS 10 ng/ml로 처리)한 후, TNF-α 3시간, IFN-γ 30 시간, IL-1β 30 시간, IL-10 20 시간, IL-12 20 시간 동안 배양하였다. 이후, 배양액 상층액에서 배양배지로 분비된 사이토카인(TNF-α, IFN-γ, IL1-β, IL-10, IL-12)의 양을 ELISA kit(R&D system)를 사용하여 측정하였다. 측정결과는 하기 표 4에 나타내었다.
Fold
용량
(㎍/ml)		 TNF-α IFN-γ IL-1β IL-10 IL-12
정상군 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
부형제(ONLY) -0.61 1.00 1.02 1.04 1.03
LPS 10 ng/ml
+ ConA 1ug/ml		 2527.61# 372.69# 11.01# 1.91# 1.44#
GCWB1085 1 1.04 10.36* 1.07 0.84 1.82**
10 1.06 42.69* 1.27** 1.09 7.88*
100 1.75* 286.08* 1.82* 1.63* 10.42*
GCWB1177 1 1.01 1.26** 1.01 1.04 1.08
10 1.98* 5.15* 1.13*** 1.77* 1.82*
100 3.96* 24.57* 1.66* 3.77* 2.12*
Lactococcus lactis subsp. lactis
GCWB1176		 1 0.99 6.36* 1.06 0.89 2.93*
10 1.53* 67.89* 1.28*** 1.13 7.70*
100 23.73* 190.31* 2.50* 3.99* 10.55*
GCWB1136 1 1.00 2.28* 1.09 1.17*** 1.10***
10 1.09** 9.28* 1.07 1.76* 1.73*
100 1.64* 16.87* 1.16*** 3.16* 2.11*
GCWB1144 1 0.92 1.08 0.96 0.99 1.08
10 1.02 10.20* 1.13** 1.73* 1.66*
100 3.14* 13.32* 1.21* 3.70* 1.80*
#P<0.001 vs. normal. *P < 0.001 vs. normal group. **P < 0.01 vs. normal group. ***P < 0.05 vs. normal group.
(1) TNF-α 측정 결과
본 발명의 GCWB1176 균주의 경우, 10 ㎍/ml 이상의 농도에서 TNF-α의 양을 유의적으로 증가시킨 것으로 확인되었다.
(2) IFN-γ 측정 결과
본 발명의 GCWB1176 균주의 경우 1, 10 및 100 ㎍/ml 이상의 농도에서 IFN-γ의 양을 유의적으로 증가시킨 것으로 확인되었다.
(3) IL-1β 측정 결과
본 발명의 GCWB1176 균주의 경우, 10 ㎍/ml 이상의 농도에서 IL-1
Figure 112020044745011-pat00002
의 양을 유의적으로 증가시킨 것으로 확인되었다.
(4) IL-10 측정 결과
본 발명의 GCWB1176 균주의 경우, 100 ㎍/ml 이상의 농도에서 IL-10의 양을 유의적으로 증가시킨 것으로 확인되었다.
(5) IL-12 측정 결과
본 발명의 GCWB1176 균주의 경우, 1, 10 및 100 ㎍/ml의 모든 농도에서 IL-12의 양을 매우 현저하게 증가시킨 것으로 확인되었다.
(6) 사이토카인 분비능 실험결과
상기 데이터에서 확인되는 바와 같이, ICR mouse의 대식세포주에서 본 발명의 GCWB1176 균주는 사이토카인 분비를 유의적으로 증가시키는 것으로 확인되었다.
1-4) 대식세포 탐식능(Phagocytic Activity) 측정
마우스 대식세포주 RAW 264.7 cell line을 한국세포주은행에서 분양 받아 세포 농도가 5Х105 cells/㎖이 되도록 현탁하여 96-well plate에 100 ㎕씩 분주하였다. 시료인 상기 표 3의 균주 5종을 각각 10 ㎍/ml 및 100 ㎍/ml의 농도로 24 시간 처리(양성 대조군은 LPS 10 ㎍/ml로 처리)한 후, 100 ㎕의 fluorescein-5-isothiocyanate(FITC)-labeled E. coli (Molecular Probe, Eugene, OR, U.S.A.)를 2 시간 동안 처리하였다. 이후, 상층액 중에 남아있는 탐식 되지 않은 세포를 세척하여 제거하고, 형광분석기로 FITC를 분석하여 탐식된 E. coli를 측정하였다. 또한, 세포 생존력을 cck-8 assay로 측정하여 대식세포 활성도를 보정하였다.
상기 실험결과는 도 2 및 3에 나타내었다. 도 2 및 3에서 확인되는 바와같이, 본 발명의 GCWB1176 균주의 경우, 10 ㎍/ml 및 100 ㎍/ml 농도에서 모두 Phagocytic Activity를 크게 증가시킨 것으로 확인되었다.
실험예 2: ICR mouse의 비장 세포 사용 면역증진 효능 평가
2-1) ICR mouse의 비장 세포 증식능 측정
비장 세포를 분리하기 위하여, ICR mouse에서 무균적으로 비장을 적출한 후 RPMI 1640 용액으로 세척하고 분쇄하였다. 분리된 세포 현탁액을 200 mesh stainless steel sieve에 통과시 후 4℃, 1,200 rpm에서 3분간 원심분리하였다. cell pellet을 ACK buffer에 5분간 현탁시켜 적혈구를 제거하고, 유출된 비장세포는 10% fetal bovine serum와 1% penicillin-streptomycin을 함유하고 있는 RPMI 1640에 세포의 농도가 1Х105 cell/㎖이 되도록 현탁하여 96 well plate에 각각 200 ㎕씩을 분주하였다.
시료인 상기 표 3의 균주 5종을 각각 1 ㎍/ml 및 10 ㎍/ml의 농도로 72 시간 처리(양성 대조군은 LPS 100 ng/ml으로 처리)하여 48 시간 동안 배양하고, 비장세포의 증식을 CCK-8 assay kit를 이용하여 측정하여 하기 표 5 및 도 4에 나타내었다.
용량 (㎍/ml) WST-1 (72 hr)
정상군 - 100.0±1.2
LPS 100 ng/ml - 112.2±1.5#
GCWB 1085 1 95.1±1.3
10 98.6±3.5
GCWB 1177 1 113.1±9.3
10 129.8±6.2**
Lactococcus lactis subsp. lactis
GCWB1176		 1 119.9±3.6*
10 102.9±3.7
GCWB1136 1 135.0±1.8*
10 147.5±2.2*
GCWB1144 1 124.2±2.8*
10 166.0±9.6*
#P<0.001 vs. normal. *P < 0.001 vs. normal group. **P < 0.01 vs. normal group. ***P < 0.05 vs. normal group.
상기 표 5 및 도 4에서 확인되는 바와 같이,
본 발명의 GCWB1176 균주의 경우, 10 ㎍/ml 농도에서 비장 세포 증식률을 유의적으로 증가시킨 것으로 확인되었다.
2-2) Nitric oxide (NO) 측정
비장 세포 농도가 5Х105 cells/㎖이 되도록 현탁하고, 96-well plate에 100 ㎕씩 분주하였다. 시료인 상기 표 3의 균주 5종을 각각 1 ㎍/ml 및 10 ㎍/ml의 농도로 48 시간 처리(양성 대조군은 LPS 10 ng/ml로 처리)한 다음을 24시간 배양하였다. 이후, 배양액 50μL를 96-well plate 옮겨 담고 Griess reagent I(NED solution)과 Griess reagent II (Sulfanilamide solution)를 동량으로 혼합한 후, 암실에서 10분간 반응시킨 후, 30분 이내에 microplate reader를 이용하여 540 nm에서 측정하였다.
상기 실험결과는 도 5에 그래프로 도시하였다. 도 5로부터 확인되는 바와 같이, 본 발명의 GCWB1176 균주의 경우, 1 ㎍/ml 및 10 ㎍/ml 농도에서 모두 NO 생성량을 유의적 증가시킨 것으로 확인되었다.
2-3) 사이토카인 분비능 측정
비장 세포의 농도가 1Х105 cell/㎖이 되도록 현탁하여 96 well plate에 각각 200 ㎕씩을 분주하였다.
시료인 상기 표 3의 균주 5종을 각각 1 ㎍/ml, 10 ㎍/ml, 100 ㎍/ml의 농도로 처리(양성 대조군은 LPS 10 ng/ml 및 ConA 1ug/ml로 처리)한 후, TNF-α 3시간, IFN-γ 30 시간, IL-1β 30 시간, IL-10 20 시간, IL-12 20 시간 동안 배양하였다. 이후, 배양액 상층액에서 배양배지로 분비된 사이토카인(TNF-α, IFN-γ, IL1-β, IL-10, IL-12)의 양을 ELISA kit(R&D system)를 사용하여 측정하였다. 측정결과는 하기 표 6에 나타내었다.
Fold
구분 용량
(㎍/ml)		 TNF-α IFN-γ IL-1β IL-10 IL-12
정상군 - 1.00 1.00 1.00 1.00 1
부형제(ONLY) - 1.00 0.97 1.03 0.93 0.99
LPS 10ng/ml - 567.56# 177177.48# 8.80# 3.67# 1.77#
GCWB1085 1 1.02 31.46* 1.02 1.23** 2.71*
10 0.99 17843.10* 1.27** 2.30* 29.24*
100 10.90* 45424.15* 1.95* 7.71* 46.40*
GCWB1177 1 0.94 1.08 1.02 0.77 1.11
10 2.17* 27.19* 1.17** 1.59* 2.46*
100 15.17* 678.35* 2.08* 3.88* 3.06*
Lactococcus lactis subsp. lactis
GCWB1176		 1 24.26* 1100.77** 1.06 1.57* 4.33*
10 473.40* 47671.44* 1.40** 5.13* 27.32*
100 195.33* 63751.74*** 2.90* 11.66* 39.86*
GCWB1136 1 1.03 4.32* 1.07 1.15** 1.15*
10 1.36* 105.81* 1.19** 1.87* 2.24*
100 2.97* 268.91* 1.30* 3.41* 2.88*
GCWB1144 1 0.94 1.03 0.97 1.04 1.06
10 1.18* 102.20* 1.27* 1.82* 2.19*
100 8.94* 254.19* 1.39* 3.97* 2.46*
#P<0.001 vs. normal. *P < 0.001 vs. normal group. **P < 0.01 vs. normal group. ***P < 0.05 vs. normal group.
(1) TNF-α 측정 결과
본 발명의 GCWB1176 균주의 경우, 1, 10 및 100 ㎍/ml의 모든 농도에서 TNF-α의 양을 매우 현저하게 증가시킨 것으로 확인되었다.
(2) IFN-γ 측정 결과
본 발명의 GCWB1176 균주의 경우, 1, 10 및 100 ㎍/ml의 모든 농도에서 IFN-γ의 양을 매우 현저하게 증가시킨 것으로 확인되었다.
(3) IL-1β 측정 결과
본 발명의 GCWB1176 균주의 경우, 10 ㎍/ml 이상의 농도에서 IL-1β의 양을 현저하게 증가시킨 것으로 확인되었다.
(4) IL-10 측정 결과
본 발명의 GCWB1176 균주의 경우, 1, 10 및 100 ㎍/ml의 모든 농도에서 IL-10의 양을 현저하게 증가시킨 것으로 확인되었다
(5) IL-12 측정 결과
본 발명의 GCWB1176 균주의 경우, 1, 10 및 100 ㎍/ml의 모든 농도에서 IL-12의 양을 매우 현저하게 증가시킨 것으로 확인되었다.
(6) 사이토카인 분비능 실험결과
상기 데이터에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 GCWB1176 균주의 경우 사이토카인 분비능이 정상군 및 다른 균주들과 비교하여 현저히 우수한 것으로 확인되었다.
실험예 3: 면역억제제인 Cyclophosphamide 유도 면역억제 동물모델에서 시료의 면역증진 효능 측정(in vivo assay)
3-1) 실험 방법
6주령 SPF ICR mouse(체중: 20 ± 2 g)를 ㈜ 샘타코로부터 구입하여, 면역억제제인 cyclophosphamide를 80 mg/kg 농도로 3일 동안(1회/day) 복강 투여한 후, 시료인 GCWB1176 균주를 하기 표 8에 기재된 농도로 각각 16일 간 경구로 1 일 1 회 투여하였다.
No. 시험군 (n=8) 농도
1 정상대조군 -
2 Cyclophosphamide (CTX) 150 mg/kg
3 CTX + GCWB1176-L 1×107 cfu/ml
4 CTX + GCWB1176-H 1×109 cfu/ml
3-2) 체중, 비장, 흉선 무게 변화 측정
체중 변화는 5, 10, 17일에 마우스 몸무게를 각각 측정하며 비장 및 흉선 무게는 최종 부검일에 측정함 cyclophosphamide 투여 후 24 일간 4 일 간격으로 관찰하고, 비장 및 흉선의 무게는 시험을 종료한 후 측정하였다.
상기 측정결과는 도 6에 나타내었다. 도 6에서 확인되는 바와 같이,
Cyclophosphamide(CTX) 투여군에서는 정상군과 비교 하여 유의성 있게 몸무게, 비장무게, 흉선 무게가 감소하였다. 반면, CTX + GCWB1176 저농도(1x107 cfu/ml) 투여군, 및 CTX + GCWB1176 고농도(1x109 cfu/ml) 투여군에서는 Cyclophosphamide(CTX) 단독 투여군과 비교하여 유의성 있게 몸무게, 비장무게, 흉선 무게가 증가하였다.
3-3) 사이토카인 분비능 측정
상기 3-1)의 시험 종료 후 혈청을 확보하고 -80℃에 보관하였다. 혈청 내 사이토카인(TNF-alpha, IFN-gamma, IL-4, IL-10, IL-2, IL-12) 양을 ELISA kit(R&D system, USA)을 이용하여 측정하였다.
상기 측정결과는 도 7에 나타내었다. 도 7에서 확인되는 바와 같이,
Cyclophosphamide(CTX) 투여군에서는 정상군과 비교하여 유의성 있게 TNF-alpha, IFN-gamma, IL-4, IL-10, IL-2, IL-12의 양이 감소하였다. 반면, CTX + GCWB1176 균주 저농도(1x107 cfu/ml) 투여군, 및 CTX + GCWB1176 고농도(1x109 cfu/ml) 투여군에서는 Cyclophosphamide(CTX) 단독 투여군과 비교하여 유의성 있게 TNF-alpha, IFN-gamma, IL-4, IL-10, IL-2, IL-12의 양이 증가한 것이 확인되었다.
3-4) NK cell 활성도 및 세포증식률 측정
NK cell 활성도는 CCK-8 assay kit를 이용하여 측정하였다. 상기 3-1)의 실험 종료 후 비장을 적출하고, 비장에서 분리한 Splenocytes(1 Х 106 cells/mL)를 분리하여 100 ㎕를 96 well plate에서 배양하였다. T-cell mitogen인 conA(2 ㎍/ml)를 처리한 후 target 세포인 YAC-1 cells (1 Х 104 cells/mL)을 100 ㎕ 혼합하여 20 시간 세포배양기에 배양하였다. 배양 후 CCK-8을 첨가 한 후 4시간 37℃에서 반응 시켰다. Microplate reader를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
상기 측정결과는 도 8에 나타내었다. 도 8에서 확인되는 바와 같이,
Cyclophosphamide(CTX) 투여군에서는 정상군과 비교하여 유의성 있게 NK 세포 활성도 및 세포증식 정도가 감소하였다. 반면, CTX + GCWB1176 균주 저농도(1x107 cfu/ml) 투여군, 및 CTX + GCWB1176 균주 고농도(1x109 cfu/ml) 투여군에서는 Cyclophosphamide(CTX) 단독 투여군과 비교하여 유의성 있게 NK 세포 활성도 및 세포증식능이 증가한 것이 확인되었다.
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  1. 삭제
  2. 수탁번호 KCCM12687P로 기탁된 Lactococcus lactis subsp. lactis GCWB1176 균주, 이의 분무건조물, 동결건조물, 진공건조물, 드럼건조물, 파쇄물, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 페이스트화물, 희석물 중 어느 하나를 포함하는,
    NK 세포 활성 및 세포 증식 증가, 대식세포 탐식능 증가, 및 IL-4 분비 증가 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 기전을 활성화시키는 면역기능 증진용 식품 조성물.
  3. 수탁번호 KCCM12687P로 기탁된 Lactococcus lactis subsp. lactis GCWB1176 균주, 이의 분무건조물, 동결건조물, 진공건조물, 드럼건조물, 파쇄물, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 페이스트화물, 희석물 중 어느 하나를 포함하는,
    NK 세포 활성 및 세포 증식 증가, 대식세포 탐식능 증가, 및 IL-4 분비 증가중에서 선택되는 어느 하나 이상의 기전을 활성화시키는 면역기능 증진용 건강기능성 식품 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 건강기능성 식품 조성물은 조미제, 감미제, 향미제로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 면역기능 증진용 건강기능성 식품 조성물.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 건강기능성 식품 조성물은 과립제(granules), 산제(powders), 정제(tablets), 캅셀제(capsules) 중 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 면역기능 증진용 건강기능성 식품 조성물.
  6. 수탁번호 KCCM12687P로 기탁된 Lactococcus lactis subsp. lactis GCWB 1176 균주를 포함하는, NK 세포 활성 및 세포 증식 증가, 대식세포 탐식능 증가, 및 IL-4 분비 증가 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 기전을 활성화시키는 면역기능 증진용 프로바이오틱스.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 프로바이오틱스는 1Х101 ~ 1Х1013 CFU/g의 생균 함량을 갖는 것을 특징으로 하는 면역기능 증진용 프로바이오틱스.
  8. 삭제
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