KR102148333B1

KR102148333B1 - Dha의 에틸 에스테르로 미세 조류에 의해 생산되는 오일을 연속적으로 강화시키는 방법

Info

Publication number: KR102148333B1
Application number: KR1020147032688A
Authority: KR
Inventors: 사무엘 패티니에; 필리프 루텡
Original assignee: 로께뜨프레르
Priority date: 2012-05-29
Filing date: 2013-05-28
Publication date: 2020-08-26
Also published as: FR2994696B1; US20150159116A1; FR2994696A1; KR20150021920A; FR2991337A1; EP2854558B1; CN104394702B; US9303231B2; WO2013178937A2; WO2013178936A2; CA2874710C; CN108624393A; WO2013178936A3; FR2991337B1; CN104394702A; WO2013178937A3; EP2854558A2; ES2961399T3; CA2874710A1

Abstract

본 발명은 미생물을 발효시킴으로써 생산된 DHA의 에틸 에스테르가 강화된 오일을 제조하는 방법으로서, 소위 "단경로(short path)" 분자 증류에 의한 정제 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.

Description

DHA의 에틸 에스테르로 미세 조류에 의해 생산되는 오일을 연속적으로 강화시키는 방법{METHOD FOR CONTINUOUSLY ENRICHING AN OIL PRODUCED BY MICROALGAE WITH ETHYL ESTERS OF DHA}

본 발명은, 미세조류로부터 유래하는 천연 지방산, 즉 도코사헥사엔산 또는 DHA의 에틸 에스테르가 풍부한 오일을 산업적으로 생산할 수 있도록 만드는 연속적인 방법에 관한 것이다.

더 구체적으로, 본 발명은, 본래

- DHA가 중간 정도로 풍부하고,

- 본질적으로 스쿠알렌으로 이루어진 불감화(unsaponifiable) 화합물들을 다량으로 함유

하는 미세조류 유래 오일로부터 DHA의 에틸 에스테르가 풍부한 오일의 생산에 관한 것이다.

본 발명을 위해서, 용어 "미세조류 유래 오일"은 트라우스토키트리알레스 종(Thraustochytriales sp.)의 과의 미세조류로부터 추출되는 오일을 의미하는 것으로 의도된다.

본 발명을 위해서, 표현 "트라우스토키트리알레스 종의 과의 미세조류"는 종, 즉 쉬조키트리움 종(Schizochytrium sp.), 오란티오키트리움 종(Aurantiochytrium sp.) 및 트라우스토키트리움 종(Thraustochytrium sp.)에 속하는 미세조류를 의미하는 것으로 의도된다.

본 발명을 위해서, 용어 "DHA가 중간 정도로 풍부한 오일"은 전체 지방산의 30질량% 내지 45질량%(간단히 나타내기 위해서, 용어 전체 지방산의 "중량"이 사용됨)의 DHA를 함유하는 오일을 의미하는 것으로 의도된다.

본 발명을 위해서, 표현 "본질적으로 스쿠알렌으로 이루어진 불감화 화합물들을 다량으로 함유하는 오일"은, 마찬가지로 스쿠알렌 15% 내지 25%를 포함하여 불감화 화합물을 약 10중량% 내지 30중량% 함유하는 오일을 의미하는 것으로 의도된다.

마지막으로, 표현 "미세조류로부터 유래하는 DHA의 에틸 에스테르로 오일을 강화하는 것"은, 오일 중 DHA 함량을 1.5배 내지 2배로 증가시킬 수 있는 방법으로서, 이 경우에 처음 DHA 함량이 DHA가 전체 지방산의 30중량% 내지 45중량%인 것에서 DHA 에틸 에스테르 함량이 전체 지방산의 60중량% 내지 70중량%인 오일로 되는 방법을 의미하는 것으로 의도된다.

지질은 단백질 및 탄수화물과 함께 다량 영양소의 3대 주요군 중 하나를 이룬다.

지질 중에서도 트리글리세라이드와 인지질은 특히 구별된다.

트리글리세라이드는 섭취되는 식품 지질의 대략 95%에 상당한다. 유기체에서 트리글리세라이드는 주로 지방 조직에 존재하며, 에너지의 주요 저장 형태를 이룬다.

인지질은 무엇보다도 유동성을 제공하는 세포 막의 구성 성분이므로, 인지질은 구조적 지질이다.

트리글리세라이드와 인지질은 주로 지방산으로 이루어져 있고, 둘 다 식사에 의해 제공되며, 이것들 중 일부는 유기체에 의해 합성된다.

"필수" 다가 불포화 지방산의 음식물 공급원으로서는 식물성 오일(즉, 오메가 6 및 오메가 9 지방산)과, 특히 오메가 3 지방산을 다량으로 함유하는 어유가 있다.

다가 불포화 지방산은 마지막 메틸 작용기로부터 출발하여, 첫 번째 이중 결합의 위치에 따라서 분류된다.

따라서 오메가 "x" 또는 "nx"에 대한 명명법에 있어서, "x"는 첫 번째 불포화 결합의 위치에 해당한다.

생물학적으로 관심이 있는 다가 불포화 지방산 대다수는 오메가 6(아라키돈산 또는 ARA) 또는 오메가 3(에이코사펜타엔산 또는 EPA, 도코사헥사엔산 또는 DHA) 군에 속한다.

추가적으로 명명법에 있어서, 또한 사슬을 구성하는 탄소의 수로 정의되는데, EPA는 C20:5로 기술되고, DHA는 C22:6으로 기술된다.

이렇게 하여 "5"와 "6"은 각각 EPA와 DHA에 의해 나타내어지는, 탄소 사슬 중 불포화 결합의 수에 해당한다.

오메가 3 지방산 군의 DHA는, 유기체가 알파-리놀렌산으로부터 합성할 수 있거나, 지방이 많은 어류(참치, 연어, 청어 등)의 소비에 의해 제공되는 지방산이다.

DHA는 막 구조와, 뇌 및 망막의 발달과 기능에 있어서 중요한 역할을 담당한다.

어유는 주로 오메가 3형 지방산, 예를 들어 DHA 및 EPA의 공급원으로서 사용되지만, 이러한 오메가 3형의 지방산들은 또한 미세조류의 오일에서도 발견되며, 상기 지방산들은 미세조류의 오일로부터 예를 들어 임의의 선택된 균주, 예를 들어 쉬조키트리움 속의 균주로부터 유래하는 오일(EPA는 단지 미량만 함유하지만, DHA는 다량 함유함)과의 혼합물로서 추출되거나, 아니면 별도로 추출된다.

DHA 및/또는 EPA로 어유를 강화시키는 통상적인 방법들은, 오일을 구성하는 지방산의 사슬 길이 또는 이 지방산의 불포화도에 관한 선택성을 바탕으로 한다.

무엇보다도, 추후에 DHA 및/또는 EPA 사슬을 분리할 수 있도록 글리세라이드 주쇄에 결합된 지방산을 분리할 필요가 있다.

글리세롤 사슬로부터 지방산을 분리하는 이러한 공정은 에탄올 에스테르결합 전이 반응(가에탄올 분해)에 의해 수행된다.

후속적으로 가장 일반적으로 사용되고, 지방산 그대로 또는 지방산의 에스테르에 대하여 수행되는 강화 방법으로서는

- 결정화,

- 역류 추출,

- 분자 증류(molecular distillation), 또는

- 조제용 크로마토그래피

가 있다.

강력한 강화를 얻기 위하여, 일반적으로 다양한 방법들이 조합된다.

그러나, 이러한 방법들은 다음과 같은 단점들을 가진다:

- 고온 강화 방법은 지방산의 열 열화(thermal degradation)(이성체화, 과산화, 올리고머화)를 일으킴;

- 크로마토그래피 기술의 단점들로 인하여 종종 독성을 띠는 용매들이 여전히 다량으로 사용됨.

뿐만 아니라, 이러한 기술들을 사용하는 대규모의 생산은 용이하지 않다.

이와 같은 이유들로 인하여, 대안적 방법들이 개발 및 연구되고 있으며, 상기 방법들은 초임계 유체의 사용을 바탕으로 하는데, 특히 초임계 CO₂를 이용하는 분획화 방법을 바탕으로 한다.

초임계 CO₂를 사용하여 DHA 및/또는 EPA로 어유를 강화하기 전 단계로서는 메탄올 또는 에탄올을 사용하는 지방산의 에스테르결합 전이 반응이 있다.

초임계 CO₂를 사용하여 지방산의 에틸 에스테르들을 분획화하는 방법은, 예를 들어 문헌에 자세히 기술되어 있다.

그러나 인용된 대부분의 방법들은 특히 DHA만의 에틸 에스테르가 아닌, EPA와 DHA의 에틸 에스테르를 이용하는 연합 강화를 기술함이 주목되어야 한다.

더욱이, 이들 방법의 대다수는

- 회분식 방법이고,

- 초임계 유체를 과다량으로 사용하며,

- 수율이 낮고,

- 마지막으로, 생산성이 낮다.

게다가, 다수의 경우 컬럼에 적용되는 100℃의 온도는 지방산의 열화를 야기할 수 있다.

적용되는 압력은 또한 너무 크며, 압력의 감소는 직접적으로 초임계 CO₂의 소모 증가를 가져온다.

다시 말해서, 이들 방법은 경제적으로 실행 가능한 조건 하에서 산업적 규모로 사용될 수 없다.

EPA 및 DHA의 에틸 에스테르로 어유를 강화시키는 방법은, 예를 들어 특허 출원 JP 제2005-255971호에 기술되어 있다.

온도 범위와 압력 범위는 각각 35℃ 내지 200℃ 및 100×10⁵ Pa 내지 500×10⁵ Pa이다.

본 발명자들은 고함량을 얻기 위하여 2가지의 연속적인 추출을 권고한다.

첫 번째 추출은 미가공 물질을 대상으로 수행되고, 두 번째 추출은 첫 번째 방법으로부터 유래하는 잔류물을 대상으로 수행되는 방법이다.

사용되는 컬럼은 높이가 3 m이고 지름은 50 ㎜다. 이 컬럼은 개별적인 가열 챔버들을 6개 포함한다.

초임계 CO₂의 유속 대 처리된 오일의 유속의 비율로서 정의되는 용매의 수준(높은 DHA의 백분율을 얻는데 사용됨)은 높게 유지된다.

이러한 2가지의 연속적인 추출은 또한 방법을 복잡하게 하여, 해당 방법이 산업상 이용될 수 없게 만든다.

이러한 요소들을 살펴보았을 때, 초임계 유체를 사용하여 지방산으로 오일을 강화시키는 기술의 선택이 바람직한 것으로 보이지만, 여전히 최적화 연구를 필요로 한다.

상기 언급된 바와 같이, 오메가 3 지방산의 또 다른 공급원은 미세조류이다.

그러나, 미세조류 유래 오일 중 불감화 화합물의 존재와 연관된 기타 다른 추가적인 문제점들이 있으므로, 미세조류 유래 오일 관련 분야에 있어서 상황은 훨씬 더 복잡하다.

따라서, 미정제 오일의 에스테르결합 전이 반응은 현실적인 관점에서 사실상 대규모로 진행될 수 없기 때문에, 보통 어유를 대상으로 수행되는 에스테르결합 전이 반응 공정은 기술적 큰 문제점을 가지지 않는 반면, 미세조류 유래 오일에 대해서는 문제가 된다.

이러한 기술적 불가능성은 불감화 화합물, 예를 들어 스쿠알렌이 가변적 함량으로, 그러나 종종 높은 함량으로 존재하는 것과 연관되어 있다.

결과적으로, 이용 가능한 화합물의 상당한 손실은 비난받고 있다.

스쿠알렌은, 특히 미세조류 유래 오일에 존재하면서, 약학적, 미용 및 영양상 관심이 있는 다가 불포화 탄화수소이다.

스쿠알렌은 임의의 선택된 균주, 예를 들어 쉬조키트리움 속의 균주에서 15질량%를 넘는, 때로는 높은 가변적 함량으로 발견된다.

선행 기술에서 스쿠알렌은, 예를 들어 분자 증류에 의하거나, 아니면 오일로부터 스쿠알렌을 추출하고 이후에 미량의 스쿠알렌만을 함유하는 오일을 생성하는 것을 의도한다면, 몇몇 연속적인 단계들을 수행함으로써, 본질적으로 트리글리세라이드로 이루어진 지질로부터 분리될 수 있는 것으로 알려져 있다.

미세조류 유래 오일의 모든 구성 성분들은 특히 열에 만감하므로, 이러한 방법은 통상적으로 매우 강한 진공 하에서 수행되어야 하며, 이는 용량이 매우 큰 장치가 필요하지만, 이러한 장치는 생산성이 많이 떨어진다.

그러므로 다음과 같은 기타 다른 접근 방법들이 권고될 수 있다:

- 분자 증류를 사용하는 것이 요구된다면, 통상적으로 수행되는 공정보다 더 효율적인 방법, 또는

- 중간 정도의 온도에서 수행하고, 산화에 매우 불안정적인 불포화 생성물들을 공기와의 어떠한 접촉에 대해서도 보호하는 것을 보장함과 동시에, 한 해당 오일 수백 또는 수천 메트릭톤의 오일을 처리하는 처리 능력에 이르기까지 용이하게 산업화 가능한 방법.

본 출원인 회사가 아는 바로는, 분자 증류 기술에 의해, 미세조류를 사용하여 오일을 DHA의 에틸 에스테르로 강화시키는 효율적이고도 산업화 가능한 방법은 현재로서 당업자에게 알려져 있지 않다.

미세조류에 의해 생산되는 DHA를 강화시키는 효율적인 방법을 개발하는 것과 관련하여, 본 출원인 회사는 자체적으로 연구를 발전시켜 왔으며, 초기 오일의 DHA 함량보다 2배 초과로 DHA의 강화를 보장하도록 분자 증류 기술을 조정하는 것에서 성공을 거두게 되었다.

그러므로, 본 발명은 미생물을 발효시킴으로써 생산된 DHA의 에틸 에스테르가 강화된 오일을 제조하는 방법으로서, "단경로(short path)" 분자 증류에 의한 정제 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.

미생물은 우선적으로 트라우스토키트리알레스 종의 과에 속하는 미세조류이며, 훨씬 더 우선적으로는 쉬조키트리움 종, 오란티오키트리움 종 및 트라우스토키트리움 종에 속하는 미세조류이다.

분자 증류법의 수행

본 발명에 따라서 DHA의 에틸 에스테르가 강화된 오일을 제조하는 이러한 방법에 있어서, 다음과 같은 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법이 수행된다:

1) DHA 풍부 트리글리세라이드와, 본질적으로 스쿠알렌으로 이루어진 불감화 화합물의 혼합물을 함유하는 미정제 오일을, 트라우스토키트리알레스 과의 미세조류의 발효로부터 제조하는 단계;

2) 선택적으로, 생성된 미정제 오일을 일련의 탈고무, 탈산, 탈색 및 탈취 단계들에 의해 정련하는 단계;

3) 스쿠알렌을 "단경로" 분자 증류로 추출하여, 스쿠알렌이 제거된 라피네이트를 얻는 단계;

4) 염기성 촉매 또는 효소성 촉매, 바람직하게는 효소성 촉매의 존재 하에서 알코올 에스테르결합 전이 반응에 의해 생성된 라피네이트를 에스테르결합 전이시키는 단계;

5) 단계 4)의 지방산 에스테르 혼합물을 "단경로" 분자 증류에 의해 분획화하여, 단쇄 지방산 에스테르가 풍부한 추출물과, 장쇄 지방산 에스테르가 매우 풍부한 라피네이트를 얻는 단계;

6) 단계 5) 동안 얻은 장쇄 지방산 에스테르의 혼합물을 "단경로" 분자 증류에 의해 정제하여, 장쇄 에스테르가 매우 풍부한 추출물로서 불순물이 제거된 추출물을 얻는 단계;

7) 선택적으로, 일련의 탈색 및 탈취 단계에 의해 장쇄 에스테르 분획이 매우 풍부한 이러한 추출물을 정련하는 단계; 및

8) DHA의 에틸 에스테르가 강화된, 생성된 화합물을 수집하는 단계.

본 발명에 따른 이러한 방법의 제1 단계는, DHA 풍부 트리글리세라이드와, 본질적으로 스쿠알렌으로 이루어진 불감화 화합물들의 혼합물을 함유하는 미정제 오일을, 트라우스토키트리알레스 과의 미세조류의 발효로부터 제조하는 것으로 이루어져 있다.

트라우스토키트리알레스 과에 속하는 미세조류로서, 예를 들어 다음과 같은 균주들이 시판되고 있다:

- 쉬조키트리움 종(참조: ATCC 20888)

- 오란티오키트리움 종(참조: ATCC PRA 276).

게다가, 본 출원인 회사는 또한 자체 생산한 균주, 즉 쉬조키트리움 종 균주(2011년 4월 14일, 프랑스 소재 파스퇴르 연구소 산하 국립 미생물 배양 수집소에 CNCM No. I-4469로 기탁되어 있으며, 또한 중화인민공화국 우한 430072 소재 우한 대학교 산하 중국 표준주 수집 센터에 No. M 209118로 기탁되어 있음)를 보유하고 있다.

배양은 종속 영양 조건 하에서 수행된다. 일반적으로 배양 단계는 균주를 재생시키기 위한 예비 배양(preculturing) 단계와, 이후의 실전 배양 또는 발효 단계를 포함한다. 이 마지막 단계는 관심이 있는 지질 화합물을 생산하기 위한 단계에 해당한다.

이러한 미세조류를 배양하기 위한 조건은 당업계에 널리 알려져 있다. 이후 바이오매스는, DHA와, 본질적으로 스쿠알렌으로 이루어진 불감화 화합물의 혼합물을 함유하는 미정제 오일을 얻도록 처리된다.

이러한 처리는, 더욱이 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다.

글리세라이드(주로 트리글리세라이드)와 불감화 화합물(주로 스쿠알렌), 그리고 선택적으로 더 낮은 비율의 유리 지방산 및 인지질로 이루어진 미정제 오일을 얻을 수 있다. 이하에 예시될 바와 같이, DHA의 함량은 전체 지방산의 30중량% 내지 45중량%%이고, 15% 내지 25%의 스쿠알렌을 포함하는 불감화 화합물이 10중량% 내지 30중량%인 것은 상기 기술된 CNCM I-4469 균주로부터 용이하게 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 이러한 가공의 제2 단계는, 일련의 탈고무, 탈산, 탈색 및 탈취 단계들을 통해 생성된 미정제 오일을 선택적으로 정련하는 것으로 이루어져 있다.

이렇게 하여, 스쿠알렌을 추출하기에 앞서, 사전에 스쿠알렌이 풍부한 미정제 오일을 대상으로 조정련(coarse refining)을 수행한다.

다음과 같은 단계들 중 하나 이상의 단계들이 구상될 수 있다:

- 탈고무: 산성 매질 중 침전에 의한 인지질의 제거;

- 탈산: 염기를 사용한 유리 지방산의 중화. 스쿠알렌이 비말동반되는 것이 방지되기 위해서 유리 지방산을 제거하기 위한 분자 증류의 사용은 삼가되어야 하는 것으로 보임.

- 탈색: 활성탄을 이용한 처리에 의함.

- 탈취(진공 증류, 증기 스트리핑 등).

이러한 정련 단계들은 식물성 오일 정련 분야에서 전문가에 의해 일반적으로 사용되는 단계이다.

본 발명에 따른 이러한 방법의 제3 단계는, 스쿠알렌이 제거된 라피네이트를 얻기 위하여 "단경로" 분자 증류에 의해 스쿠알렌을 추출하는 것으로 이루어져 있다.

미정제(또는 부분 정제) 오일 중 스쿠알렌은 분자 증류에 의해 추출된다.

0.1 mbar 미만의 진공에 있어서, 스쿠알렌의 비점은 약 200℃다.

고진공에 의해 온도를 제한할 수 있으므로, 스쿠알렌과 다가 불포화 지방산의 열화/중합 위험을 제한할 수 있다.

본 출원인 회사는, 이러한 장치 상에서의 체류 시간을 매우 짧게, 즉 1분 미만으로 조절하는 것이 중요하다는 것을 발견하게 되었다. 일반적으로 본 출원에 있어서, 바람직하게 "단경로"란, 접촉 시간이 1분 미만인 것을 의미하는 것으로 이해된다.

이렇게 하여 질소로 비활성화된 공급물 저장기로부터, 오일은 25℃ 내지 150℃의 범위로 온도가 조절되는 제1 회로를 통하여 탈기 장치로 펌핑된다(미량의 물과 용매 제거).

탈기 장치의 배출구에서, 오일은 ("단경로") 증발 챔버로 펌핑된 후, 50℃ 내지 150℃, 바람직하게는 100℃ 내지 140℃의 온도 범위, 특히 대략 120℃로 온도가 조절되는 회로에 도달하게 된다.

증발 장치의 온도는 150℃ 내지 250℃, 바람직하게는 200℃ 내지 240℃의 범위, 특히 대략 220℃로 조절된다.

응축 장치는 0℃ 내지 50℃, 바람직하게는 10℃ 내지 30℃의 온도 범위, 특히 대략 20℃로 조절된다.

증발 챔버 내 압력은 10^-2mbar 미만, 바람직하게는 10^-3mbar 미만의 고진공으로 조절된다.

주로 스쿠알렌을 함유하는 증류액과 주로 트리글리세라이드를 함유하는 잔류물은 수집 회로를 통하여 비활성화된 저장 탱크로 운반된다.

라피네이트 중 스쿠알렌의 함량은 5% 미만, 바람직하게는 2% 미만이다.

스쿠알렌의 제거는, 추후 에틸 에스테르의 형태로 DHA를 강화시키는 일련의 공정에 들어갈 수 있는, 관심이 있는 정제된 분획(DHA 풍부 트리글리세라이드)(라피네이트)을 얻을 수 있게 한다.

이러한 라피네이트는 DHA를 약 40중량% 함유하는 아미노산 프로필을 가진다.

본 발명에 따른 이러한 방법의 제4 단계는, 염기성 촉매 또는 효소성 촉매, 바람직하게는 효소성 촉매의 존재 하에서 알코올 에스테르결합 전이 반응에 의해 생성된 라피네이트를 대상으로 에스테르결합 전이 반응시키는 것으로 이루어져 있다.

DHA가 강화될 수 있게 하기 위해서, 추후 DHA 사슬을 분리할 수 있도록 글리세린 주쇄에 결합된 지방산을 분리할 필요가 있다.

글리세롤 사슬로부터 지방산을 분리하는 이러한 공정은 우선적으로 효소성 에탄올 에스테르결합 전이 반응(가에탄올 분해)에 의해 수행된다.

이러한 전환은 글리세롤 방출이 수반된다.

효소성 가에탄올 분해는, 노보자임(Novozyme)으로부터 시판되는 효소 N435(칸디다 앤타르티카(Candida antartica))와 에탄올을 화학양론적 비율로 이용하여 회분 방식의 공정으로 50℃에서 수행된다.

이러한 조건 하에서, 90% 초과의 전환율은 반응이 개시된 지 대략 8시간 후에 얻어진다.

반응 후에, 지방산은 에틸 에스테르로 전환된 분획 중에 주로 분포하게 되며(90% 초과), 나머지는 잔여 글리세라이드(모노-, 디-, 트리클리세라이드)의 형태로 남게 된다.

에틸 에스테르의 분획화를 수행하기 전에, 효소성 전환 후 반응 혼합물은 효소를 추출하기 위해 여과 단계를 거치게 된다.

글리세롤은 침강 또는 원심 분리에 의해 분리된다. 혼합물은 또한 잔류 글리세롤을 제거하기 위해 물로 세정될 수 있다.

만일 에탄올 잔류 농도가 높으면, 에탄올은 진공 하 증발에 의해 제거될 수 있다.

본 발명에 따른 이러한 방법의 제5 단계는, "단경로" 분자 증류에 의해 제4 단계에서 얻은 지방산 에스테르의 혼합물을 분획화하여, 단쇄 지방산 에스테르가 풍부한 추출물과 장쇄 지방산 에스테르가 매우 풍부한 라피네이트를 얻는 것으로 이루어져 있다.

제4 단계에서 기술된 바와 같이 얻은 에틸 에스테르의 혼합물은 출발 오일(starting oil)에 해당하며 따라서 관심이 있는 DHA 이외의 지방산을 포함하는 지방산 프로필을 가진다.

분획화 공정의 목적은, 사슬이 DHA보다 짧은(C 22 미만인) 지방산의 최대량을 제거하는 것이다.

본 공정을 수행하는데 사용된 증류 기술은 에틸 에스테르의 휘발성 차이(에틸 에스테르 자체의 분자량과 지방족 사슬의 길이에 좌우됨)를 이용한다.

상기 설명된 바와 같이, 이러한 기술로 고진공 그리고 또한 매우 짧은 체류 시간(1분 미만)에 의해 온도를 제한할 수 있으므로, 다가 불포화 지방산의 열화/중합 위험을 제한할 수 있다.

0.1 mbar 미만의 진공에 있어서, 에틸 에스테르의 비점은 일반적으로 250℃ 미만의 온도 범위에 있다.

이러한 공정은 실제로 다음의 2 단계로 수행된다:

- 분자 증류의 제1 단계는 분획화 자체이며, 목적은 "단쇄" 에틸 에스테르 분획을 분리하여 다가 불포화 지방산에 대한 잔류물을 농축시키는 것임,

- 제2 단계는, 다가 불포화 지방산에 대하여 농축된 에틸 에스테르가 분자량이 큰 불순물들(잔류 글리세라이드, 스테롤, 안료, 불감화 화합물 등)로부터 분리된다는 의미에서, 정제 단계를 대신하는 것임.

질소로 비활성화된 공급물 저장기로부터 나온 것으로서, 가에탄올 분해에서 생성된 혼합물은, 25℃ 내지 100℃, 예를 들어 70℃ 내지 100℃의 범위, 특히 대략 100℃로 온도가 조절되는 제1 회로를 통하여 탈기 장치로 보내어진다(미량의 에탄올 제거)

탈기 장치의 배출구에서, 오일은 50℃ 내지 100℃, 예를 들어 70℃ 내지 90℃의 온도 범위, 특히 대략 85℃로 온도가 조절되는 회로를 통하여 ("단경로") 증발 챔버로 펌핑된다.

증발 장치의 온도는 100℃ 내지 200℃, 바람직하게는 100℃ 내지 150℃의 범위, 특히 대략 110℃로 조절된다.

온도는, 이론상 예측치에 상응하는 라피네이트/증류액의 중량비를 얻어, 다가 불포화 지방산의 순도 및 수율을 최적화하는 분리가 가능하도록 조절된다.

주로 "단쇄" 에틸 에스테르를 함유하는 증류액과, 주로 "장쇄" 에틸 에스테르 그리고 또한 불순물을 함유하는 라피네이트는 수집 회로를 통하여 비활성화된 저장 탱크로 운반된다.

라피네이트 중 DHA 에틸 에스테르 함량(중량%)은 45% 초과, 바람직하게는 50% 초과이다.

증류액 중 DHA 함량은 20% 미만, 바람직하게는 10% 미만이다.

본 발명에 따른 이러한 방법의 제6 단계는, 제5 단계 동안 얻은 장쇄 지방산 에스테르의 혼합물을 "단경로" 분자 증류에 의해 정제하여, 불순물이 제거되었으며 장쇄 에스테르가 매우 풍부한 추출물을 얻는 것으로 이루어져 있다.

질소로 비활성화된 공급물 저장기로부터, 제5 단계 후에 얻어진 라피네이트는 25℃ 내지 100℃, 바람직하게는 70℃ 내지 100℃의 범위, 특히 대략 100℃로 온도가 조절되는 제1 회로를 통하여 탈기 장치로 보내어진다.

탈기 장치의 배출구에서, 오일은 50℃ 내지 150℃, 예를 들어 70℃ 내지 90℃의 온도 범위, 특히 대략 85℃로 온도가 조절되는 회로를 통하여 ("단경로") 증발 챔버로 펌핑된다.

증발 장치의 온도는 100℃ 내지 250℃, 바람직하게는 180℃ 내지 220℃의 범위, 특히 대략 200℃로 조절된다. 온도는, 이론상 예측치에 상응하는 잔류물/증류액의 중량비를 얻어, 불순물의 효율적인 분리가 가능하도록 조절된다.

주로 정제된 "장쇄" 에틸 에스테르를 함유하는 증류액과, 불순물을 함유하는 잔류물은 수집 회로를 통하여 비활성화된 저장 탱크로 운반된다.

증류액 중 DHA 에틸 에스테르 함량(중량%)은 50% 초과, 바람직하게는 55% 초과이다.

잔류물 중 DHA의 함량은 30% 미만, 바람직하게는 20% 미만이다. 이렇게 하여 잔류물에는 불순물(불감화 화합물, 잔류 글리세라이드, 안료 등)이 농축되어 있다.

본 발명에 따른 이러한 방법의 제7 단계는 일련의 탈색 및 탈취 단계를 통하여 장쇄 에스테르 분획이 매우 풍부한 이러한 추출물을 선택적으로 정련하는 것으로 이루어져 있다.

제6 단계 동안 정제되었지만, DHA가 강화된 에틸 에스테르의 추출물은 필요하다면 탈색 단계(탈색 단계는 황색 빛으로 착색되는 것을 감소시키기 위한 단계임)와 탈취 단계로 이루어진 추가적인 정련을 거칠 수 있다.

이러한 탈색 단계는 식물성 오일을 정련하는데 통상적으로 사용되는 탈색과 유사한 방식으로 탈색 토(discoloring earth), 예를 들어 활성탄 상에서 수행된다(탈색 단계는 진공 하에서 증기 스트리핑에 의해 수행됨).

본 발명에 따른 방법의 이러한 우선적인 제2 방식의 제8 단계는, 마지막으로 DHA의 에틸 에스테르가 강화된, 생성된 조성물을 수집하는 것으로 이루어져 있다.

이렇게 하여 정제된 DHA의 에틸 에스테르는 조절되는 대기 조건 하에서(이상적으로는 질소로 비활성화되는 조건 하에서) 저장된다.

항산화제의 첨가는 이러한 분획화의 안정화에 유리할 수 있다.

본 발명은 또한 DHA의 에틸 에스테르가 강화된 조성물로서, 식품 부문에서 본 발명에 의한 방법에 따른 방법에 의해 얻어진 조성물의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 이하 실시예에 의해 더 명확하게 이해될 것이나, 이들 실시예는 예시적이면서 비제한적인 것으로 의도된다.

실시예 1: 쉬조키트리움 종 CNCM I-4469 균주로부터, 전체 지방산에 대하여 DHA를 30중량% 내지 45중량%, 그리고 스쿠알렌 15% 내지 25%를 포함하여 불감화 화합물을 10중량% 내지 30중량% 함유하는 오일의 제조

본 실시예는 DHA와, 본질적으로 스쿠알렌으로 이루어진 불감화 화합물의 혼합물을 함유하는 미정제 오일로서, 본 출원인 회사 소유인 쉬조키트리움 종 미세조류(2011년 4월 14일, 프랑스 소재 파스퇴르 연구소 산하 국립 미생물 배양 수집소에 No. CNCM I-4469로 기탁되어 있음)를 발효시킴으로써 생산된 오일을 얻는 방법을 설명한다.

이 경우, 발효는 20 ℓ들이 반응기 내에서의 실전 배양/생산 단계 전에, 2 단계로 이루어진 사전 연속 예비 배양 단계에서 수행되었다.

본 실험을 위해서, 제1 예비 배양 배지에 비타민을 첨가하였으나, 제2 예비 배양 배지와 생산 단계에 비타민을 첨가하는 것은 선택적이었다.

그러므로, 예비 배양 배지는 이하 표 I과 표 II에 제시된 조성을 가졌다.

[표 I]

[표 II]

일반적으로 클레롤(Clerol) "FBA3107" 소포제를 1 ㎖/ℓ로 사용하였다. 선택적으로, 오염 박테리아의 생장을 예방하기 위해 페니실린 G 나트륨 염을 50 ㎎/ℓ 사용하였다.

KH₂PO₄를 이용하여 글루코스를 멸균 처리하였으며, 이렇게 하여 침전물(암모늄-인산염-마그네슘)이 형성되는 것을 방지하여야 하므로 배지의 나머지로부터 글루코스를 분리하였다. 비타민 혼합물과 미량 원소는 멸균 여과 이후에 첨가하였다. 배양/생산 배지의 조성은 이하 표 III에 제공되어 있다.

[표 III]

비타민 혼합물과 미량 원소의 조성은 이하 표 IV 및 표 V에 제공되어 있다.

[표 IV]

[표 V]

예비 배양 조건

칸막이가 있는 500 ㎖들이 삼각 플라스크에 클레롤 FBA 3107 소포제(코그니스 게엠베하 뒤셀도르프(Cognis GmbH Dusseldorf)에 의해 시판)를 적가하여 제1 예비 배양액을 제조하였다.

배양 배지를 구성하는 성분들을 완전히 용해한 다음, 이 배양 배지를 여과하였으며, 선택적으로 상기 배지에 페니실린 G 나트륨 염을 0.25 ㎎/ℓ의 비율로 보충하였다.

페트리 접시에서 배양된 미세조류 콜로니들의 샘플을 채취하여 접종을 수행하였다(도말시 루프 하나당 10 ㎕의 비율).

100 rpm으로 진탕하면서(회전 진탕기 상에서), 28℃의 온도에서, 24시간 내지 36시간 동안 항온 처리를 지속하였다.

바이오매스는 침강되므로(또는 플라스크 벽에 부착되므로), 삼각 플라스크를 철저하게 진탕한 후 3 ㎖ 내지 5 ㎖를 덜어내는데 세심한 주의를 기울였다.

제2 예비 배양을 위하여, 튜브가 장착되어 있으면서 칸막이가 있는 2 ℓ들이 삼각 플라스크를 사용하였다.

소포제와 효모 추출물을 물 100 ㎖에 적가하였다.

배지를 구성하는 모든 성분들을 탈염수 300 ㎖에 용해하고 나서 여과하였다. 상기 삼각 플라스크에 페니실린 G 나트륨 염을 선택적으로 미리 첨가할 수 있었으며, 여기에 소포제 액적을 첨가한 후 플라스크를 멸균 처리하였다.

이후 제1 예비 배양액 3 ㎖ 내지 5 ㎖로 접종을 수행하였다.

100 rpm으로 진탕하면서, 28℃에서, 24시간 내지 36시간 동안 항온 처리를 추가로 수행하였다.

20 ℓ 들이 반응기 내에서의 생산

다음과 같은 방법에 따라서 20 ℓ들이 반응기 내에서 실전 배양을 수행하였다:

- 반응기 내 배지의 일부를 멸균 처리하고, 나머지는 별도로 멸균 처리하여 침전물이 생성되지 않도록 함;

- 배양 배지를 0.5%v/v의 비율로 배양하는 제2 예비 배양 후에 생산된 바이오매스를 사용하여 접종을 수행함;

- 배양액을 30℃에 놓아둠;

- 산소 전달 속도를 35 mmol/ℓ/h 내지 40 mmol/ℓ/h로 고정시킴;

- 0.2 VVM 내지 0.3 VVM으로 통기시킴.

- 초기 pH는 5.5를 초과하게 함;

- 농도가 20%를 초과하면 즉시 글루코스를 공급하여 글루코스 농도를 15 g/ℓ 내지 70 g/ℓ로 유지시킴.

이하 표 VI은 본 출원인 회사의 쉬조키트리움 종을 이용하여 얻어진 결과들을 제시한다.

[표 VI]

바이오매스 회수

바이오매스의 원심 분리(5분, 5000 g) 및 희석(희석율: 1/펠릿 3V/물 1V)에 의해 2회 연달아 농축시킴으로써, 발효조로부터 추출한 바이오매스를 세정하여 세포 사이의 가용성 물질을 제거하였다.

전체 미정제 건조 물질에 대한 건조 세포 농도는 95%였다.

이후, 건조 물질은 12%로 조절하였다.

미정제 오일의 획득

수중 임펠러 및 칸막이가 장착된 2 ℓ들이 발효조 유형의 실험실용 반응기(예를 들어, 인터사이언스(Interscience)사에 의해 시판되는 것) 내에서 세정된 바이오매스를 교반하였다.

이러한 시스템에 의해 생성된 세포 용해액의 유화를 제한할 수 있으며, 이와 동시에 용해 효소의 작용에 필수적인 혼합이 잘 일어날 수 있게 하였다.

온도는 60℃로 조절하고, pH는 수산화나트륨으로 대략 8로 조절하였다.

이러한 조건들은 건조 중량을 기준으로 1%의 양으로 첨가된 알칼라아제 효소(노보자임)의 활성에 최적이었다.

용해 시간은 4시간으로 설정하였다.

용해 후, 에탄올 10%(V_에탄올/V_용해액)를 반응 혼합물(수중유 에멀젼)에 첨가하였으며, 이후 상기 혼합물을 15분 추가로 교반하였다.

이 다음, DHA 약 35중량%와 스쿠알렌 약 15중량%를 함유하는 미정제 오일이 얻어졌다.

실시예 2: 분자 증류에 의한 DHA 의 에틸 에스테르로 오일의 강화

실시예 1의 공정 조건으로부터 추론되는 공정 조건에 따라서 1 ㎥의 발효조 내에서 배양된 쉬조키트리움 조류로부터 생산된, 쉬조키트리움 종 조류 유래 오일을 사용하였다.

트리글리세라이드 분획은 다음과 같은 지방산 프로필을 가졌다:

(**: 전체 지방산 분획에 대한 화합물의 백분율(GC에 의한 표면 분포도))

불감화 분획은 본질적으로 스쿠알렌으로 이루어져 있다(미정제 오일 중 약 21.8%).

제1 단계: 스쿠알렌을 제거하기 위한 미정제 오일의 처리

VTA VK 83-6-SKR-T 단경로 증류 유닛을 사용하였다.

질소로 비활성화된 공급물 저장기로부터, 오일 8 ㎏을 3.5 ㎏/h의 유속으로 온도 120℃인 탈기 장치로 펌핑하였다.

탈기 장치의 배출구에서, 오일은 120℃로 유지되는 회로를 통하여 ("단경로") 증발 챔버를 통과하였다.

증발 장치의 온도는 220℃로 조절하였다.

응축 장치의 온도는 20℃로 설정하였다. 증발 챔버 내 진공은 가능한한 높게 유지하였다(< 10^-3mbar).

스쿠알렌을 함유하는 증류액과 트리글리세라이드를 함유하는 잔류물을 수집 회로를 통하여 비활성화된 저장 탱크로 운반하였다.

이 단계에서 증류액 대략 1.5 ㎏과 잔류물 대략 6 ㎏을 회수하였다.

증류액 중 스쿠알렌 함량은 94%였다.

잔류물 중 스쿠알렌 함량은 2% 미만이었다.

제2 단계: 처리된 오일의 에스테르결합 전이 반응

제1 단계로부터 생성된 잔류물 6 ㎏을 사용하여 에스테르결합 전이 반응을 회분식으로 진행시켰다. 본 반응은, 질소로 비활성화되었으며, 밀폐되었고, 진탕되는 자켓형 반응기 내 50℃에서 수행되었다(노보자임 435 600 g과 무수 에탄올 680 g 사용).

반응 혼합물을 이러한 조건 하에 8시간 동안 놓아두었다.

반응 후, 10㎛ 나일론 거름천으로 여과하여 효소를 분리해냈다. 여과액을 원심 분리하여(5분, 10,000 g) 글리세롤을 제거하였다. 오일, 즉 90%가 에틸 에스테르로 전환된 트리글리세라이드 분획 대략 6 ㎏을 회수하였다.

조성은 다음과 같다.

*: 미정제 혼합물 중 화합물의 중량%

**: 에틸 에스테르 분획에 대한 화합물의 백분율(GC에 의한 표면 분포도)

제3 단계: 에스테르의 분획화

VTA VK 83-6-SKR-T 단경로 증류 유닛을 사용하였다.

질소로 비활성화된 공급물 저장기로부터, 제2 단계에서 얻은 전환 생성물 6 ㎏을 1 ㎏/h의 유속으로 온도 100℃인 탈기 장치로 펌핑하였다.

탈기 장치의 배출구에서, 에틸 에스테르는 85℃로 유지되는 회로를 통하여 ("단경로") 증발 챔버를 통과하였다.

증발 장치의 온도는 110℃로 조절하였다.

단쇄(주로 C14 및 C16) 에틸 에스테르를 함유하는 증류액과, 장쇄 지방산 에틸 에스테르를 함유하는 잔류물을 수집 회로를 통하여 비활성화된 저장 탱크로 운반하였다.

이 단계에서 증류액 대략 2.6 ㎏과 잔류물 대략 3.6 ㎏을 회수하였다.

에틸 에스테르의 조성은 다음과 같다.

*: 미정제 혼합물 중 화합물의 중량%

본 단계에 기술된 분리 과정으로부터의 DHA 수율은 (증류액 중 DHA의 손실량을 기준으로) 대략 84%였다.

제4 단계: 에스테르의 정제:

VTA VK 83-6-SKR-T 단경로 증류 유닛을 사용하였다.

질소로 비활성화된 공급물 저장기로부터, 에틸 에스테르 3.6 ㎏을 5 ㎏/h의 유속으로 온도 100℃인 탈기 장치로 펌핑하였다.

증발 장치의 온도는 200℃로 조절하였다.

PUFA 에틸 에스테르를 함유하는 증류액과, 불순물을 함유하는 잔류물을 수집 회로를 거쳐 비활성화된 저장 탱크로 운반하였다.

이 단계에서 증류액 대략 2.9 ㎏과 잔류액 대략 0.4 ㎏을 회수하였다.

에틸 에스테르의 조성은 다음과 같다.

*: 미정제 혼합물 중 화합물의 중량%

본 단계에 기술된 분리 과정으로부터의 DHA 수율은 (증류액 중 DHA의 손실량을 기준으로) 대략 97%였다.

국립 미생물 배양 수집소

CNCMI-4469

20110414

Claims

쉬조키트리움 종(Schizochytrium sp.)에 의해 발효 브로스(broth)로부터 생산된 도코사헥사엔산(DHA)의 에틸 에스테르로 강화된 오일 조성물을 제조하는 방법으로서, 다음과 같은 단계들을 포함하는 방법:
1) DHA 풍부 트리글리세라이드와, 본질적으로 스쿠알렌으로 이루어진 불감화 화합물의 혼합물을 함유하는 미정제 오일을, 쉬조키트리움 종의 발효 브로스로부터 제조하는 단계;
2) 선택적으로, 생성된 미정제 오일을 일련의 탈고무, 탈산, 탈색 및 탈취 단계들에 의해 정련하는 단계;
3) 미정제 오일로부터 스쿠알렌을 "단경로" 분자 증류로 추출하여, 스쿠알렌이 제거된 라피네이트를 얻는 단계;
4) 염기성 촉매 또는 효소성 촉매의 존재 하에서 알코올 에스테르결합 전이 반응에 의해 생성된 라피네이트를 에스테르결합 전이시키는 단계;
5) 단계 4)의 지방산 에스테르 혼합물을 "단경로" 분자 증류에 의해 분획화하여, 단쇄 지방산 에스테르가 풍부한 추출물과, 장쇄 지방산 에스테르가 풍부한 라피네이트를 얻는 단계;
6) 단계 5) 동안 얻은 장쇄 지방산 에스테르의 혼합물을 "단경로" 분자 증류에 의해 정제하여, 장쇄 에스테르가 강화되고, 불순물이 제거된 추출물을 얻는 단계;
7) 선택적으로, 일련의 탈색 및 탈취 단계에 의해 장쇄 에스테르가 강화된 추출물을 정련하는 단계; 및
8) DHA의 에틸 에스테르로 강화된 생성된 오일 조성물을 수집하는 단계.
제1항에 있어서, 분자 증류 단계는 0.1 mbar 미만의 값으로 고진공 하에서 수행되는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 "단경로"는 접촉 시간이 1분 미만임을 의미하는, 방법.
제1항의 방법에 의해 얻을 수 있는 도코사헥사엔산의 에틸 에스테르로 강화된 오일 조성물.
식품 부문에서 사용하기에 적합한, 제4항의 오일 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 단계 3)에서 증발 장치의 온도는 200℃ 내지 240℃인, 방법.
제1항에 있어서, 단계 5)에서 증발 장치의 온도는 100℃ 내지 150℃인, 방법.
제1항에 있어서, 단계 6)에서 증발 장치의 온도는 180℃ 내지 220℃인, 방법.