KR102148298B1 - 나노 입자가 제거된 세포 배양 배지의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 나노 입자가 제거된 세포 배양 배지 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게 본 발명은 한외여과 방법을 통해 세포 배양 배지 조성물로부터 나노 입자를 제거하는 방법, 상기 방법으로 나노 입자가 제거된 세포 배양 배지 조성물 및 이를 이용한 세포 배양 배지의 제조에 관한 것이다. 본 발명의 세포 배양 배지 조성물로부터 나노 입자를 제거하는 방법은 목적하는 세포밖 소포체 생산을 위한 세포 배양 전에 배지에 존재하는 나노 입자를 효과적으로 제거함으로써 시험관 내에서 세포 유래 세포밖 소포체를 보다 효율적으로 생산할 수 있도록 한다. 본 발명에 따른 나노 입자 제거 방법은 세포 배양액에 존재하는 세포 생장에 필수적인 물질은 유지하면서 고가의 장비 없이 불필요한 나노 입자를 효과적으로 제거할 수 있으며, 시료량의 제한 없이 적용 가능할 뿐만 아니라, 단시간에 효율적이고 일관된 결과를 제공한다는 장점이 있다. 또한 본 발명과 세포밖 소포체 분리 기술을 결합함으로써 시험관 내에서 세포 유래 세포밖 소포체의 분리 및 분석 효율을 극대화할 수 있어, 신규 바이오 마커의 발굴, 질병 치료, 다중 오믹스 연구 및 세포밖 소포체의 특성 연구에 파급효과가 큰 필수 기술이 될 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 나노 입자가 제거된 세포 배양 배지의 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게 본 발명은 한외여과 방법을 통해 세포 배양 배지 조성물로부터 나노 입자를 제거하는 방법, 상기 방법으로 나노 입자가 제거된 세포 배양 배지 조성물 및 이를 이용한 세포 배양 배지의 제조에 관한 것이다.
세포밖 소포체(extracellular vesicles)는 보편적인 세포 기작으로, 인간에서 박테리아에 이르기까지 모든 생명체 또는 세포에서 자연적으로 분비되는 나노 크기의 소포체이다. 진핵세포에서 유래한 세포밖 소포체의 경우, 적혈구 분화, 면역반응 조절 등에 관여하며, 특히 암세포 미세환경에서는 암의 전이, 혈관형성 등에 대한 중요한 기능들이 밝혀짐으로써 암을 포함한 다양한 질병의 진단 마커로 활용이 가능해 많은 관심을 받고 있다.
원핵세포로부터 분비되는 세포밖 소포체는 진핵세포의 세포밖 소포체와 유사하게 원핵세포의 구성물을 함유하고 있으며, 인체에서 전신염증을 비롯, 유입 경로에 따라 급성 폐염증 질환을 유도하고, 피부의 경우, 국소 피부 조직의 염증반응을 만성적으로 유도하여 현대인의 대표 질병 중 하나인 아토피성 피부염(atopic dermatitis)의 원인이 될 수 있음이 보고되었다. 또한 인체에서 박테리아 유래 세포밖 소포체과 암 발병과의 연관성이 대두됨에 따라 원핵세포 유래 세포밖 소포체 또한 많은 관심을 받고 있다.
세포밖 소포체의 가장 중요한 기능은 이들이 세포간 정보 교환 메커니즘의 중요한 요소라는 점이다. 따라서, 세포밖 소포체의 구성 성분에 대한 기초 연구와 다양한 질병의 진단과 더불어 치료 표적으로 의학 분야에서 많은 관심을 받고 있다.
세포밖 소포체는 생체 내 또는 시험관 내의 모든 종류의 세포로부터 분비되는 생체 나노 입자로서, 혈액, 소변, 침, 눈물 등과 같은 체액에 존재하고 세포에서 유래한 지질이중층을 포함하며, 20 ~ 10,000 nm 범위의 다양한 크기를 갖는 막 구조의 소포체이다.
세포밖 소포체는 다른 세포 및 조직에 결합하여 막 구성요소, 단백질, RNA 등의 세포 내 물질을 전달하는 운송체 역할을 하기 때문에 세포밖 소포체를 분비한 원래 세포(모세포)의 단백질, 지질, 아미노산, RNA 등을 그대로 포함하고 있어, 모세포의 생리적.병리적 특성을 알 수 있는 중요한 근거가 된다. 또한 세포밖 소포체에 포함되어 있는 핵산, 성장호르몬, 단백질 등은 세포막 형태의 인지질에 의해 보호되고 있어, 가용성 형태의 성장인자 및 사이토카인보다 안정적인 기능을 수행할 수 있다는 점이 알려지면서, 세포밖 소포체의 중요성이 점차 증대되고 있으며, 세포밖 소포체에 포함된 구성물질을 분석하여 질병의 진단, 치료를 포함한 다양한 용도로의 활용 가능성이 기대되고 있다.
종래의 세포밖 소포체 분리 기술로는 초고속 원심분리(ultra-centrifugation), 밀도 구배법, 크기별 제외법(size exclusion), 그리고 폴리머를 이용한 침전 방법 등이 있으며, 이 중 초고속 원심분리법이 가장 널리 사용되고 있다. 상기 기술들은 나노 입자를 상대적으로 작은 물질로부터 분리하는데 효과적이며, 따라서 시료내 세포밖 소포체를 용해성 단백질을 포함한 다양한 물질들로부터 분리하는데 적용되고 있다.
세포밖 소포체 연구의 현 동향은, 상기 방법을 통하여 생체 시료 및 시험관 내에서 세포를 배양하여 분리한 세포밖 소포체의 단백체, 유전체 분석 및 기능 연구를 통하여 신규 바이오 마커 발굴 및 신규한 질병 치료 기술 개발에 집중하고 있다.
시험관 내에서 세포를 배양하여 세포밖 소포체를 생산하는 경우, 세포의 생장에 있어 필수적인 물질을 포함한 배지를 제조하여 세포를 배양하고 상기 세포 배양(추출)액으로부터 세포 유래 세포밖 소포체를 분리하여 분석한다.
세포 배양을 위한 배지를 제조함에 있어, 세포의 생장에 필요한 구성 요소를 포함해야 하는데, 이러한 구성 요소에는 동물의 혈청을 포함하는 천연물과, 각종 아미노산, 비타민, 무기 염분, 포도당, 금속 이온 등과 같은 물질 등이 포함된다. 그러나 세포 배지의 천연물 재료에는 다양한 크기의 나노 입자가 존재하며, 또한 천연물 이외의 구성 요소들의 조합에 의해서도 다양한 크기의 나노 입자 또는 나노 입자 크기의 침전물이 생성될 수 있다. 이러한 상기 세포 배양 배지에 존재하는 나노 입자들은 세포 유래 세포밖 소포체의 분리 및 분석에 큰 영향을 미친다는 문제점이 있다.
원핵세포 배양의 경우, 미생물 증식에 필요한 모든 영양소를 포함한 복합 배지(complex medium)를 통상적으로 이용하는데 이 복합 배지의 주된 재료로 펩톤(peptone), 트립톤(tryptone)과 같은 단백질 가수분해물, 육즙(meat extract), 맥아 추출물(malt extract), 효모 추출물(yeast extract), 감자 추출물(potato extract) 등의 천연물을 사용한다. 하지만 이들 천연물 재료에는 천연물에서 유래한 나노 입자가 다량 존재할 뿐만 아니라 천연물 이외의 구성 요소들의 조합에 의해서도 다양한 크기의 나노 입자 또는 나노 입자 크기의 침전물이 생성될 수 있다. 따라서, 미생물 유래 세포밖 소포체를 분리하기 위해서는 이들 각 재료에 포함된 나노 입자를 제거하는 과정이 선행되어야 하는데, 나노 입자는 통상의 여과법(filtration)으로 제거하기가 어렵다는 문제가 있다.
유핵 세포의 경우, 시험관 내에서 세포를 배양하기 위하여 동물 유래 혈청을 첨가하여 배양하며, 통상적으로는 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS)을 사용한다. 동물 유래 혈청에는 세포의 정상적 생장 및 생리적 활성유지에 필수적인 각종 단백질, 폴리펩티드, 호르몬, 영양소와 대사물질, 무기물질, 호르몬, 불용성 물질들에 대한 운반체 등이 포함되어 있다.
또한 혈청에는 다양한 지단백질(lipoproteins)이 존재하는데, 이들은 세포 구성에 필수적인 세포막 생성에 있어 기본이 되는 콜레스테롤(cholesterol) 및 트리글리세라이드(triglyceride)를 전달하는 중요한 인자이다. 또한 지단백질은 혈액 내 세포밖 핵산(extracellular nucleic acids)을 운반하는 운반체로 작용한다고 알려져 있으며(Nat Cell Biol, 2011, Vicker et al., ISSN: 1476-4679), 혈액 내 세포밖 핵산을 운반하는 세포밖 소포체의 기능과 매우 유사한 특성을 가진다. 지단백질에는 고밀도 지단백질(HDL; 5 ~ 15 nm, 1.063 g/mL), 저밀도 지단백질(LDL; 18 ~ 28 nm, 1.019 ~ 1.063 g/mL), 중간 조밀도 지단백질(IDL; 25 ~ 50 nm, 1.006 ~ 1.019 g/mL), 초저밀도 지단백질(VLDL; 30 ~ 80 nm, 0.950 ~ 1.006 g/mL), 킬로미크론(chylomicron; 100 ~ 1000 nm, 0.95 g/mL 정도) 등이 있는데, 이들은 크기(nm)와 밀도(g/mL)가 다양한 나노 입자들이다.
또한, 혈청에는 여러 지단백질 나노 입자와 더불어 다양한 세포로부터 생산되고 분비된 세포밖 소포체가 존재한다. 이들 세포밖 소포체와 지단백질들은 세포밖 핵산을 운반하면서 크기 및 밀도가 여러 면에서 유사한 나노 입자이며 상기 기술한 통상의 세포밖 소포체 분리방법으로는 양자를 선택적으로 분리하기 어렵다는 문제가 있다(Biochem Biophys Res Commun, 2009, Looze et al., ISSN: 1090-2104; J Extracell Vesicles, 2014, Yuana et al., ISSN: 2001-3078; Sci Rep, 2016, Sodar et al., ISSN: 2045-2322).
또한 혈청에 존재하는 세포밖 핵산은 여러 형태로 존재하는데, 상기 지단백질과 세포밖 소포체뿐만 아니라 단백질과 결합한 나노 입자의 형태로도 존재한다.
따라서 우태아혈청과 같은 동물 유래 혈청을 포함한 세포 배양액에서 세포를 배양한 후, 배양액으로부터 세포 유래 세포밖 소포체를 분리할 경우 세포 배양 배지에 원래 존재하는 나노 입자, 혈청 내 지단백질과 혈청 내 세포밖 소포체, 그리고 혈청 내 세포밖 핵산에 오염되어, 목적하는 세포밖 소포체를 정제하기 어려울 뿐만 아니라, 이로부터 유전체 및 단백체 분석을 할 때 여러 가지 문제점을 야기한다.
이러한 문제점을 극복하기 위하여 종래에는 i) 우태아혈청을 포함하지 않는 배지로서 나노 입자가 없는 제한 배지(nano particle-free defined medium; xenobiotic-free defined medium)에서 세포를 배양하거나, ii) 우태아혈청을 포함하는 통상의 세포 배양액으로 배양한 후에 세포를 세척하고, 다시 우태아혈청을 포함하지 않은 기초 배지(basal medium)에서 세포를 배양함으로써 세포 유래 세포밖 소포체를 생산, 정제하는 방법을 이용하였다. 그러나 나노 입자가 없는 제한배지(nano particle-free defined medium; xenobiotic-free meidum)에서 세포를 배양할 경우, 배지 가격이 매우 비쌀 뿐 아니라 배양 조건이 각기 다른 다양한 세포 배양에 범용적이지 않아 세포밖 소포체의 생산에 있어 효용성이 떨어진다. 그리고 기초 배지에서 세포밖 소포체를 생산하는 경우, 배양액에 생장 필수 요소가 결여되어 있어 세포의 사멸을 포함한 다양한 생리학적 변화가 야기되는 문제점이 있었다. 모세포의 생리학적 변화는 세포 사멸에 따른 세포사멸체(apoptotic body)를 생성시키고 세포밖 소포체의 생산량 및 생성된 세포밖 소포체의 구성물질과 기능의 변화를 초래할 수 있기 때문이다.
따라서 상기와 같은 문제점을 해결하는 방법으로, 세포밖 소포체를 제거한 우태아혈청을 제조하고, 이를 세포 배양액에 첨가하여 배양하는 방법이 도입되었다. 우태아혈청에서 세포밖 소포체를 제거하는 통상의 방법에는 우태아혈청을 16 ~ 18시간 동안 초고속 원심분리하고 침전된 물질을 제외한 상층액을 분리하는 방법과, 우태아혈청에 폴리머를 첨가하여 우태아혈청의 세포밖 소포체를 침전시키고, 원심분리를 통하여 침전물을 제외한 용액을 분리하는 방법이 주로 사용되었다.
그러나 상기 초고속 원심분리를 이용한 방법은 고가 장비가 요구된다는 점, 초고속 원심분리기에 적용 가능한 시료의 부피가 제한적이라는 점, 장시간 높은 회전수로 운용해야 하는 점 등 장비의 사용에 따른 문제점이 있을 뿐만 아니라, 우태아혈청의 점도가 높아서 세포밖 소포체 침전이 불완전하게 이루어진다는 점과 초고속 원심분리 후 세포밖 소포체가 제거된 혈청의 수득 방법이 확립되어 있지 않아, 우태아혈청에 존재하는 나노 입자를 완전히 제거할 수 없고 오히려 세포 생장에 필수적인 요소들이 감소할 수 있다는 문제점이 존재한다.
또한, 상기 폴리머 침전을 통해 우태아혈청의 세포밖 소포체를 제거하는 방법은 침전을 위해 첨가한 폴리머 및 화학물질을 우태아혈청으로부터 제거하지 못하며, 첨가 물질이 제거되지 않은 배지를 이용하여 세포를 배양할 때 미지의 세포 반응, 세포 사멸 등 다양한 생리학적 변화가 야기될 수 있으며, 해당 세포에서 생산되는 세포밖 소포체의 생산량 변화 또는 구성 물질과 기능의 변화를 초래할 수 있다는 문제점이 있다.
따라서 효과적인 세포 유래 세포밖 소포체 분석 및 기능 연구를 위해서는 배양 전 세포 배양액 내 존재하는 나노 입자 및 우태아혈청 유래 지단백질, 세포밖 소포체 및 이들과 결합한 세포밖 핵산의 효과적인 제거 기술 개발이 시급한 실정이다. 이러한 기술은 세포밖 소포체의 분리 기술과 더불어 해당 분야의 발전에 있어 가장 핵심적인 기술이다.
본 발명의 목적은 세포 배양 배지 조성물을 한외여과(ultrafiltration, UF)하여 여과액과 잔류물로 분리하는 단계 및 상기 여과액을 수득하는 단계를 포함하는 세포 배양 배지 조성물의 나노 입자 제거 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 나노 입자가 제거된 세포 배양 배지 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 나노 입자가 제거된 세포 배양 배지 조성물을 포함하는 세포 배양 배지 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 세포 배양 배지 조성물을 한외여과(ultrafiltration, UF)하여 여과액과 잔류물로 분리하는 단계 및 상기 여과액을 수득하는 단계를 포함하는 세포 배양 배지 조성물의 나노 입자 제거 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에서 상기 세포 배양 배지 조성물은 천연물 유래 추출물을 포함할 수 있으며, 상기 천연물 유래 추출물은 동물 유래 혈청, 단백질 가수분해물, 효모 추출물(yeast extract), 육즙(meat extract), 맥아 추출물(malt extract) 및 감자 추출물(potato extract)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 세포 배양 배지 제조에 첨가되는 동물, 식물 또는 미생물 등의 천연물 유래 물질이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일실시예에서 상기 동물 유래 혈청은 우태아혈청(fetal bovine serum), 우아혈청(bovine calf serum) 및 말혈청(horse serum)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 세포 배양 배지 제조를 위해 첨가되는 동물 유래 혈청이라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 천연물 유래 추출물 또는 다양한 크기의 나노 입자를 포함하는 세포 배양 배지 조성물을 한외여과하면 한외여과 막의 다공보다 큰 나노 입자는 막을 통과하지 못하고, 작은 입자는 다공을 통과하여 배지 조성물의 기능을 유지하면서 나노 입자를 효과적으로 제거할 수 있다. 이를 통하여 대량의 세포 배양 전 배지 조성물 또는 동물 유래 혈청에서 빠르고 쉽게 불필요한 나노 입자, 지단백질, 세포밖 소포체 및 이들과 결합한 세포밖 핵산을 제거하고, 이를 세포 유래 세포밖 소포체 생산에 효과적으로 적용할 수 있으며, 이렇게 생산한 세포밖 소포체는 진단, 치료, 다중 오믹스 연구, 세포밖 소포체 특성 연구 등에 활용이 용이하다.
본 발명의 방법에서 세포 배양 배지 조성물로부터 제거하고자 하는 나노 입자는 천연물 유래 추출물에 존재하거나 세포 배양 배지 조성물의 혼합에 의해 발생하는 나노 크기의 입자일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서 상기 세포 배양 배지 조성물에 포함된 천연물 유래 추출물에 존재하는 나노 입자는 세포밖 소포체, 지단백질 및 세포밖 핵산으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 용어 "세포밖 소포체"는 고세균(Archaea), 원핵생물(Prokarya) 또는 진핵생물(Eukarya)의 세포로부터 유래한 생체 나노 입자를 통칭하며, 세포밖 소포체(exosome), 아그로좀(argosomes), 덱소좀(dexosomes), 엑토좀(ectosomes), 엑소베지클(exovesicle), 온코좀(oncosome), 프로미노좀(prominosome), 프로스타좀(prostasome), 톨레로좀(tolerosome), 미세입자(microparticle), 미세소포(microvesicle), 나노소포(nanovesicle), 수포성 소포(blebbing vesicle), 출아성 소포(budding vesicle), 세포밖 소포체-유사 소포(exosome-like vesicle), 매트릭스 소포(matrix vesicle), 막 소포(membrane vesicle), 탈피성 소포(shedding vesicle), 막 입자(membrane particle), 탈피성 미세소포(shedding microvesicle), 막 수포(membrane bleb), 에피디디모좀(epididimosome), 프로미니노좀(promininosome), 텍소좀(texosome) 또는 아키오좀(archeosome)을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일반적으로 목적하는 세포를 배양함으로써 생산되는 세포밖 소포체는 질병의 진단, 치료, 다중 오믹스 연구, 세포밖 소포체 특성 연구 등에 유익하게 이용되지만, 목적 세포를 배양하기 위한 배양액에 사용되는 동물 유래 혈청에 존재하는 동물 세포 유래 세포밖 소포체의 경우, 목적하는 세포밖 소포체 활용에 방해가 된다. 따라서 본 발명의 방법은 동물 유래 혈청에 존재하는 동물 유래 세포밖 소포체, 지단백질 등 불필요한 나노 입자를 제거하는 것을 목적으로 하며, 이를 통해 목적하는 세포밖 소포체의 정제 및 분석을 용이하게 한다.
본 발명의 상기 지단백질은 고밀도 지단백질(HDL), 저밀도 지단백질(LDL), 중간밀도 지단백질(IDL) 및 초저밀도 지단백질(VLDL)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 상기 세포밖 핵산은 DNA, RNA, mRNA(mesenger RNA) miRNA(microRNA), tRNA(transfer RNA), siRNA(small interfering RNA) 및 lncRNA(long non-coding RNA )로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 이는 단백질과 결합한 형태도 포함한다.
본 발명의 일실시예에서 상기 세포 배양 배지 조성물의 혼합에 의해 발생하는 나노 입자는 2 이상의 세포 배양 배지 조성물을 혼합하거나, 2 이상의 세포 배양 배지를 조합하여 배지를 제조하고자 할 때 배지 조성물 내에 포함된 물질들 사이의 반응으로 생성될 수 있는 나노 크기 입자를 의미하며, 그 종류는 한정되지 않는다.
본 발명에서 "한외여과 (ultrafiltration)"라 함은 반투막을 이용하여 용액 내의 물질을 크기에 따라 분리하는 것으로서 분자 크기가 5 ~ 100 nm(300 ~ 1,000,000 Dalton) 정도의 범위를 분획하는 기술을 의미한다. 한외여과 방식은 종래 당류, 단백질 등의 생체물질, 고분자 물질 등의 분리에 이용되고, 수처리에서는 초순수제조, 폐액 폐수처리, 배수 재이용 등에서 사용된다. 또한 한외여과 막(membrane)은 다공성(porous)인 정밀여과막 수준의 세공 크기를 갖고 있으며 그 막에 의해 효과적인 배제도를 나타내는 용질의 최소 분자량으로 정의되는 분획 분자량(Molecular Weight Cut Off, MWCO)에 따라 그 분리 성능을 나타내는 막을 의미한다.
본 발명에서 상기 한외여과 방식은 압력 또는 원심력에 수직인 방식과 수평인 방식을 모두 포함할 수 있으며, 특히 본 발명의 한외여과 방식은 대용량 처리를 위해 접선 유동 여과(Tangential Flow Filtration, TFF) 시스템을 이용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 상기 한외여과는 50 ~ 1,000 kDa 컷오프 한외여과 막(cut-off membrane)을 이용할 수 있고, 바람직하게는 300 ~ 700 kDa 컷오프 한외여과 막을 이용하는 것이 좋고, 보다 바람직하게는 400 ~ 600 kDa 컷오프 한외여과 막을 이용하는 것이 좋고, 가장 바람직하게는 450 ~ 550 kDa 컷오프 한외여과 막을 이용하는 것이 좋다. 한외여과 막의 분획 분자량이 50 kDa 미만인 경우 동물 유래 혈청으로부터 세포 생장에 필요한 각종 단백질, 영양소 등이 지나치게 많이 걸러질 수 있고, 분획 분자량이 1,000 kDa보다 큰 경우 혈청 유래 엑소좀을 포함하는 나노 입자 불순물이 완전히 제거되지 못하는 단점이 있다.
본 발명의 나노 입자 제거 방법에서 상기 잔류물을 한외여과 막에 다시 주입하여 여과액과 잔류물로 2차 분리하는 단계 및 상기 여과액을 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다. 여과액을 수득하고 남은 잔류물 중에 미처 여과액을 통과하지 못한 단백질, 호르몬, 영양소 등의 유용 분자가 남아 있을 수 있으므로, 잔류물을 한외여과하여 여과액을 수득하는 과정을 반복함으로써 세포 배양 배지용 동물 유래 혈청의 수득량을 높일 수 있다.
본 발명의 나노 입자 제거 방법은 세포 배양 배지 제조에 있어서 불필요한 나노 크기 입자를 제거함으로써 생산하고자 하는 세포밖 소포체의 수득, 정제 및 활용을 용이하게 하는 것을 목적으로 한다. 따라서 본 발명의 나노 입자 제거 방법은 세포 배양 배지에 포함되는 유효 성분의 전처리 단계로 활용할 수 있으며, 조성물을 혼합한 후에 후처리 단계로 활용할 수도 있다.
본 발명은 또한 상기 한외여과 방법으로 나노 입자가 제거된 세포배양 배지 조성물을 제공한다. 본 발명의 세포 배양 배지 조성물은 동물 세포, 식물 세포 또는 미생물 세포로부터 유래한 세포밖 소포체, 지단백질 또는 세포밖 핵산은 제거되고, 배양하고자 하는 세포 생장에 도움이 되는 물질들을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 나노 입자가 제거된 세포 배양 배지 조성물을 포함하는 세포 배양 배지 및 이의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 세포 배양 배지 제조 방법은 (a) 세포 배양 배지 조성물을 한외여과(UF)하여 여과액과 잔류물로 분리하는 단계, (b) 상기 여과액을 수득하는 단계 및 (c) 상기 수득한 여과액을 배지에 첨가하여 혼합하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (c) 단계에서 나노 입자가 제거된 세포 배양 배지 조성물 여과액을 혼합한 후에 다시 한외여과하여 여과액과 잔류물로 2차 분리하는 단계 및 상기 여과액을 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이는 상기한 바와 같이 배지 조성물의 혼합으로 인해 새롭게 생성될 수 있는 나노 입자를 추가로 제거하기 위한 과정이다.
본 발명의 세포 배양 배지 조성물로부터 나노 입자를 제거하는 방법은 목적하는 세포밖 소포체 생산을 위한 세포 배양 전에 배지에 존재하는 나노 입자 및 세포밖 핵산을 효과적으로 제거함으로써 시험관 내에서 세포 유래 세포밖 소포체를 보다 효율적으로 생산할 수 있도록 한다. 본 발명에 따른 나노 입자 제거 방법은 세포 배양액에 존재하는 세포 생장에 필수적인 물질은 유지하면서 고가의 장비 없이 불필요한 나노 입자를 탁월하게 제거할 수 있으며, 시료량의 제한 없이 적용 가능할 뿐만 아니라, 단시간에 효율적이고 일관된 결과를 제공한다는 장점이 있다. 또한 본 발명과 세포밖 소포체 분리 기술을 결합함으로써 시험관 내에서 세포 유래 세포밖 소포체의 분리 및 분석 효율을 극대화할 수 있어, 신규 바이오 마커의 발굴, 질병 치료, 다중 오믹스 연구 및 세포밖 소포체의 특성 연구에 파급효과가 큰 필수 기술이 될 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 한외여과 방법으로 세포 배양 배지 조성물로부터 나노 입자를 제거하는 방법을 설명한 모식도이다.
도 2 는 본 발명의 일실시예에 따른 방법으로 한외여과 막의 분자량 컷오프에 따른 우태아혈청에 존재하는 나노 입자 제거의 효율을 확인한 결과이다.
도 3 은 본 발명의 일실시예에 따른 한외여과 방법으로 말혈청에 존재하는 나노 입자 제거 효과를 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 방법으로 한외여과와 초고속 원심분리에 의한 우태아혈청에 존재하는 나노 입자 제거 효과를 비교한 결과이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 방법으로 한외여과와 초고속 원심분리에 의한 우태아혈청에 존재하는 지단백질의 주성분인 콜레스테롤의 제거 효과를 비교한 결과이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 방법으로 한외여과와 초고속 원심분리에 의한 우태아혈청에 존재하는 RNA의 제거 효과를 비교한 결과이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 방법으로 한외여과와 초고속 원심분리로 전처리한 우태아혈청의 전자현미경(TEM) 비교 분석 결과이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따라 대장암세포의 배양액에서 한외여과를 통하여 대장암 세포 유래 세포밖 소포체의 제거를 확인한 결과이다.
도9는 본 발명의 일실시예에 따른 방법으로 한외여과로 전처리한 우태아혈청을 이용한 대장암 유래 세포 배양 결과이다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 방법으로 한외여과로 전처리한 우태아혈청을 이용한 혈관 내피 세포 배양 결과이다.
도 11는 본 발명의 일실시예에 따른 방법으로 한외여과로 전처리한 우태아혈청을 이용한 진피 섬유아세포 배양 결과이다.
도 12은 본 발명의 일실시예에 따른 방법으로 한외여과로 전처리한 우태아혈청을 이용한 중배엽 줄기 세포 배양 결과이다.
도 13은 본 발명의 일실시예에 따른 방법으로 한외여과로 전처리하였을 때 미생물 배지에 존재하는 나노 입자의 효과적인 제거를 확인한 결과이다.
도 14는 본 발명의 일실시예에 따른 방법으로 한외여과로 전처리한 미생물 배지를 이용하여 여러 미생물을 배양한 결과이다.
도 2 는 본 발명의 일실시예에 따른 방법으로 한외여과 막의 분자량 컷오프에 따른 우태아혈청에 존재하는 나노 입자 제거의 효율을 확인한 결과이다.
도 3 은 본 발명의 일실시예에 따른 한외여과 방법으로 말혈청에 존재하는 나노 입자 제거 효과를 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 방법으로 한외여과와 초고속 원심분리에 의한 우태아혈청에 존재하는 나노 입자 제거 효과를 비교한 결과이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 방법으로 한외여과와 초고속 원심분리에 의한 우태아혈청에 존재하는 지단백질의 주성분인 콜레스테롤의 제거 효과를 비교한 결과이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 방법으로 한외여과와 초고속 원심분리에 의한 우태아혈청에 존재하는 RNA의 제거 효과를 비교한 결과이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 방법으로 한외여과와 초고속 원심분리로 전처리한 우태아혈청의 전자현미경(TEM) 비교 분석 결과이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따라 대장암세포의 배양액에서 한외여과를 통하여 대장암 세포 유래 세포밖 소포체의 제거를 확인한 결과이다.
도9는 본 발명의 일실시예에 따른 방법으로 한외여과로 전처리한 우태아혈청을 이용한 대장암 유래 세포 배양 결과이다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 방법으로 한외여과로 전처리한 우태아혈청을 이용한 혈관 내피 세포 배양 결과이다.
도 11는 본 발명의 일실시예에 따른 방법으로 한외여과로 전처리한 우태아혈청을 이용한 진피 섬유아세포 배양 결과이다.
도 12은 본 발명의 일실시예에 따른 방법으로 한외여과로 전처리한 우태아혈청을 이용한 중배엽 줄기 세포 배양 결과이다.
도 13은 본 발명의 일실시예에 따른 방법으로 한외여과로 전처리하였을 때 미생물 배지에 존재하는 나노 입자의 효과적인 제거를 확인한 결과이다.
도 14는 본 발명의 일실시예에 따른 방법으로 한외여과로 전처리한 미생물 배지를 이용하여 여러 미생물을 배양한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
1.
한외여과
막의 분자량 컷오프에 따른
우태아혈청의
나노 입자 제거
우태아혈청에 존재하는 나노 입자를 제거하기 위하여 분자량 1,000 kDa 이하의 다양한 컷오프의 한외여과 막을 가진 접선 유동 여과 시스템을 이용, 각각의 분자량 컷오프의 한외여과 막을 통과한 여과액을 수확하고 FBSdUF1000kDa, FBSdUF500kDa, FBSdUF100kDa 라 명명하였다. 한외여과 막을 통과시키지 않은 우태아혈청(FBS)을 대조군으로 사용하여 각 여과액의 나노파티클 농도를 측정하였다. Nanosight LM10 장비를 이용(카메라 레벨 12, 검출 한계 3 조건에서 60초 동안 추적 기록)하여 나노파티클 분석(NTA)을 수행하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 우태아혈청 원액에 다량 존재하는 나노 입자가 분자량 1,000 kDa 컷오프 이하(1,000 kDa, 500 kDa, 100 kDa)의 한외여과 막을 통과하지 못하고, 막을 통과한 여과액에서는 이들이 효과적으로 제거되었음을 확인할 수 있다.
실시예
2.
한외여과를
이용한
말혈청의
나노 입자 제거
말혈청에 존재하는 나노 입자의 제거를 위하여 분자량 500 kDa 컷오프의 한외여과 막을 가진 접선 유동 여과 시스템을 이용, 한외여과 막을 통과한 여과액을 수확하고 HSdUF500kDa 라 명명하였다. 한외여과 막을 통과시키지 않은 말혈청(HS)을 대조군으로 사용하여 각 여과액의 나노파티클 농도를 측정하였다.
상기 실시예 1과 동일한 조건에서 Nanosight LM10 장비를 이용하여 나노파티클 분석(NTA)을 수행하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 말혈청 원액에 다량 존재하는 나노 입자가 본 발명의 한외여과 방법을 이용한 여과액에서 효과적으로 제거됨을 확인할 수 있다.
실시예
3.
한외여과와
초고속 원심분리에 의한
우태아혈청에
존재하는 나노 입자 제거 효과 비교
본 발명의 방법인 한외여과와 통상적으로 사용되고 있는 초고속 원심분리에 따른 우태아혈청에 존재하는 나노 입자 제거 효율을 확인하기 위하여 나노파티클 분석(Nanoparticle Tracking Analysis, NTA)을 수행하였다.
구체적으로 우태아혈청 원액을 500 kDa 컷오프 한외여과 막(cut-off membrane)을 가진 접선 유동 여과(tangential flow filtration, TFF) 시스템에 도입하여 500 kDa 이하의 분자량을 가진 여과액을 수확하고, 이를 FBSdUF라 하였다. 본 발명에 대한 비교 실시예로서 통상의 방법인 우태아혈청 원액을 100,000 x g에서 18시간 동안 초원심 분리(ultracentrifugation)를 수행하여 그 상층액만 수확하고, 이를 FBSdUC라 하였다.
전처리 하지 않은 우태아혈청 원액과 상기 방법으로 얻은 FBSdUC 및 FBSdUF에 존재하는 나노 입자 확인 및 정량을 위하여 Nanosight LM10 장비를 이용(카메라 레벨 12, 검출 한계 3 조건에서 60초 동안 추적 기록)하여 나노파티클 분석(NTA)을 수행하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 우태아혈청 원액에 다량 존재하는 나노 입자가 본 발명의 한외여과 방법을 이용한 여과액인 FBSdUF에서는 효과적으로 제거되지만, 통상적으로 사용되고 있는 초고속 원심분리 방법에 의해 제조된 FBSdUC에는 우태아혈청 원액에 존재하는 나노 입자가 거의 제거되지 않음을 확인할 수 있다.
실시예
4.
한외여과와
초고속 원심분리에 의한
우태아혈청에
존재하는
지단백질(lipoprotein)의
제거 효과 비교
본 발명의 방법인 한외여과와 통상적으로 사용되고 있는 초고속 원심분리에 따른 우태아혈청에 존재하는 나노 입자 제거 효율을 확인하기 위하여 HDL 및 LDL/VLDL 콜레스테롤 분석 키트(Cholesterol Assay Kit)를 사용하여 콜레스테롤 분석을 수행하였다.
구체적으로, 전처리 하지 않은 우태아혈청 원액과 상기 실시예 3의 방법으로 얻은 FBSdUC 및 FBSdUF를 1/10로 희석하고 콜레스테롤 분석 키트용 시료와 혼합하여 실온에서 45분 반응시킨 후 형광으로 콜레스테롤 양을 측정하였다. 그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 초원심 분리 방법으로 나노 입자를 제거한 FBSdUC는 유의한 수준으로 콜레스테롤을 제거하지 못했지만, 본 발명의 한외여과 방법을 이용한 FBSdUF에서 콜레스테롤의 양이 현저히 줄어든 것을 확인할 수 있다.
실시예
5.
한외여과와
초고속 원심분리에 의한
우태아혈청에
존재하는 RNA 제거 효과 비교
본 발명의 방법인 한외여과와 통상적으로 사용되고 있는 초고속 원심분리에 따른 우태아혈청에 존재하는 혈청 내 RNA의 제거 효율을 확인하기 위하여 총 RNA 분석을 수행하였다.
구체적으로, 동일 부피의 전처리를 하지 않은 우태아혈청 원액과 상기 실시예 3의 방법으로 얻은 FBSdUC 및 FBSdUF에서 총 RNA를 추출하고 Bioanalyzer를 이용하여 RNA 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 우태아혈청 원액에 존재하는 RNA가 본 발명의 한외여과 방법을 통한 FBSdUF에서 효과적으로 제거되었음을 확인할 수 있었다. 하지만, 초고속원심 분리 방법의 경우에는 한외여과 방법에 비해 혈청에 존재하는 작은 크기의 RNA가 제거되지 않음을 확인하였다.
실시예
6.
한외여과와
초고속 원심분리 방법으로 전처리한
우태아혈청의
전자현미경(TEM) 분석
우태아혈청을 포함한 세포 배양액을 제조함에 있어서, 본 발명의 방법인 한외여과와 통상적으로 사용되고 있는 초고속 원심분리를 이용하여 우태아혈청을 전처리한 경우 배양액 내 세포밖 소포체 및 지단백질의 존재 여부를 확인하기 위해 투과전자현미경(Transmission Electron Microscope, TEM)을 사용하였다.
구체적으로 상기 실시예 3의 방법으로 얻은 FBSdUC 및 FBSdUF를 각각 1/10으로 희석하여 실제 세포 배양 시 사용하는 합성 배지를 제조하였다. 다음으로 배지 자체에 존재하는 세포밖 소포체(extracellular vesicle) 및 지단백질(lipoprotein) 과 같은 나노 입자의 존재를 확인하기 위해 세포밖 소포체 분리에 통상적으로 이용하는 폴리머 기반 침전(polymer-based precipitation) 및 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography, SEC) 방법을 사용하여 나노 입자를 분리하였다. 다음으로 분리된 시료 내에 나노 입자의 존재를 확인하기 위해 JEM 1011 현미경을 이용하여 전자현미경(TEM) 분석을 수행하였다. 100 kV 가속 전압(acceleration voltage)에서 촬영된 결과를 도 7에 나타내었다.
그 결과, FBSdUC를 사용한 배지의 경우 나노 입자로 추정되는 평균 30 nm정도의 물질(흰색 화살표)이 다량 존재하는데 반해 FBSdUF를 사용한 배지의 경우 상기 물질이 관찰되지 않음을 확인할 수 있었다. 결과로, 우태아혈청 원액을 본 발명의 한외여과 방법으로 전처리함으로써 세포밖 소포체 및 지단백질을 포함하는 나노 입자를 효과적으로 제거할 수 있음을 알 수 있다.
실시예
7.
한외여과
방법에 의한 대장암 유래 세포 배양액에서
세포밖
소포체 제거 확인
본 발명의 한외여과 방법이 우태아혈청으로부터 세포밖 소포체를 제거하는 데 효과적인지 알아보기 위하여 세포밖 소포체의 통상적인 마커인 테트라스패닌 (tetraspanin) 분자의 웨스턴 블럿(Western Blot)을 수행하였으며, 우태아혈청의 경우 소 종 특이적 항체의 부재로 하기와 같은 방법을 사용하였다.
먼저 상기 실시예 1의 방법으로 우태아혈청 원액의 나노 입자를 제거한 후, 기초 배지 (basal medium)에 1/10로 희석하여 세포 배지를 제조하였다. 이 후 본 배지를 이용하여 대장암 세포를 48시간 동안 배양한 후 그 배양액을 수확하여, 우태아혈청 전처리 방법과 동일하게 분자량 500 kDa 컷오프 막을 이용하여 한외여과를 수행하였다. 한외여과 처리하지 않는 배양액(Input), 잔존물(Retentate; > 500 kDa) 및 여과액(Filtrate; < 500 kDa) 분획을 각각 수획한 후 인간 종 특이적 테트라스패닌 항체(hCD63, hCD9)를 이용하여 대장암 세포 유래 세포밖 소포체의 존재 여부를 확인하였다.
그 결과 도 8에 나타난 바와 같이, 본 발명의 방법에 따라 여과된 500 kDa 이하의 여과액 분획에서 세포밖 소포체 마커 단백질이 존재하지 않음을 확인할 수 있었다. 따라서 우태아혈청 내 존재하는 세포밖 소포체가 500 kDa 컷오프 막을 통과하지 못하며 한외여과 후 여과액에는 세포 유래 세포밖 소포체가 제거될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예
8.
한외여과
방법으로 전처리한
우태아혈청을
이용한 대장암 유래 세포 배양
500 kDa 컷오프 막을 이용하여 한외여과를 수행한 우태아혈청(FBSdUF)을 기초 배지(basal media)에 희석하여 실제 세포 생장에 미치는 영향을 확인하였다.
대장암 유래 세포인 SW480 세포를 통상의 세포배양 배지인 10% 우태아혈청을 포함한 RPMI 기초배지(10% FBS/RPMI)로, 37℃ 조건에서 24시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고, 남은 배지 성분이 없도록 과량의 PBS를 이용하여 2회 세척하여 세포 시료를 준비하였다. 상기 실시예 1의 방법으로 준비한 FBSdUF를 포함하여 제조한 10% FBSdUF/RPMI(실험군)와 통상적으로 사용하는 배지인 10% FBS/RPMI(대조군)에 각각 상기 세포 시료를 첨가하고 37℃ 조건에서 24시간 동안 추가 배양을 하였다. 24시간 후 WST-1 assay를 이용하여 세포 생존도(cell viability)를 측정하고(도 9A), 배지 내 세포 이미지를 확인(도 9B)하였다. 그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 본 발명의 방법으로 전처리한 우태아혈청을 사용하더라도 통상적인 배지와 비교하여 세포 생장에 차이가 없음을 확인할 수 있었다.
실시예
9.
한외여과
방법으로 전처리한
우태아혈청을
이용한 혈관
내피 세포
배양
500 kDa 컷오프 막을 이용하여 한외여과를 수행한 우태아혈청(FBSdUF)을 기초 배지(basal media)에 희석하여 혈관 내피 세포 생장에 미치는 영향을 확인하였다. 구체적으로 혈관 내피 세포인 HUVEC 세포를 통상의 세포배양 배지인 20% 우태아혈청을 포함한 M199 기초배지(20% FBS/M199)로, 37℃ 조건에서 24시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고, 남은 배지 성분이 없도록 과량의 PBS를 이용하여 2회 세척하여 세포 시료를 준비하였다. 상기 실시예 1의 방법으로 준비한 FBSdUF를 포함하여 제조한 20% FBSdUF/M199(실험군)와 통상적으로 사용하는 배지인 20% FBS/M199(대조군)에 각각 상기 혈관 내피 세포 시료를 첨가하고 37℃ 조건에서 24시간 동안 추가 배양을 하였다. 24시간 후 WST-1 assay를 이용하여 세포 생존도(cell viability)를 측정하고, 배지 내 세포 이미지를 확인하였다. 그 결과 도 10에 나타난 바와 같이, 본 발명의 방법으로 전처리한 우태아혈청을 사용하더라도 통상적인 배지와 비교하여 세포 생존도(도 10A) 및 세포 생장 이미지(도 10B)에 차이가 없음을 확인할 수 있었다.
실시예10
.
한외여과
방법으로 전처리한
우태아혈청을
이용한 진피 섬유아세포 배양
500 kDa 컷오프 막을 이용하여 한외여과를 수행한 우태아혈청(FBSdUF)을 기초 배지(basal media)에 희석하여 진피 섬유아세포(dermal fibroblast) 생장에 미치는 영향을 확인하였다. 구체적으로 사람의 진피 섬유아세포인 hDF 세포를 통상의 세포배양 배지인 10% 우태아혈청을 포함한 DMEM 기초배지(10% FBS/DMEM), 37℃ 조건에서 24시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고, 남은 배지 성분이 없도록 과량의 PBS를 이용하여 2회 세척하여 세포 시료를 준비하였다. 상기 실시예 1의 방법으로 준비한 FBSdUF를 포함하여 제조한 10% FBSdUF/DMEM(실험군)과 통상적으로 사용하는 배지인 10% FBS/ DMEM(대조군)에 각각 상기 섬유아세포 시료를 첨가하고 37℃ 조건에서 24시간 동안 추가 배양을 하였다. 24시간 후 WST-1 assay를 이용하여 세포 생존도(cell viability)를 측정하고, 배지 내 세포 이미지를 확인하였다. 그 결과 도 11에 나타난 바와 같이, 본 발명의 방법으로 전처리한 우태아혈청을 사용하더라도 통상적인 배지와 비교하여 세포 생존도(도 11A) 및 세포 생장 이미지(도 11B)에 차이가 없음을 확인할 수 있었다.
실시예
11.
한외여과
방법으로 전처리한
우태아혈청을
이용한 중배엽 줄기세포 배양
500 kDa 컷오프 막을 이용하여 한외여과를 수행한 우태아혈청(FBSdUF)을 기초 배지(basal media)에 희석하여 중배엽 줄기세포(mesenchymal stem cell) 생장에 미치는 영향을 확인하였다. 구체적으로 사람의 중배엽 줄기세포 인 hMSC 세포를 통상의 세포배양 배지인 10% FBS/DMEM, 37℃ 조건에서 24시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고, 남은 배지 성분이 없도록 과량의 PBS를 이용하여 2회 세척하여 세포 시료를 준비하였다. 상기 실시예 1의 방법으로 준비한 FBSdUF를 포함하여 제조한 10% FBSdUF/DMEM(실험군)과 통상적으로 사용하는 배지인 10% FBS/ DMEM(대조군)에 각각 상기 섬유아세포 시료를 첨가하고 37℃ 조건에서 24시간 동안 추가 배양을 하였다. 24시간 후 WST-1 assay를 이용하여 세포 생존도(cell viability)를 측정하고, 배지 내 세포 이미지를 확인하였다. 그 결과 도 12에 나타난 바와 같이, 본 발명의 방법으로 전처리한 우태아혈청을 사용하더라도 통상적인 배지와 비교하여 세포 생존도(도 12A) 및 세포 생장 이미지(도 12B)에 차이가 없음을 확인할 수 있었다.
실시예
12.
한외여과를
이용하여 미생물 배지에서 나노 입자 제거
효모 추출물 및 미생물 배지에 존재하는 나노 입자의 제거 기능을 분석하기 위하여 분자량 100 kDa 컷오프의 한외여과 막을 가진 접선 유동 여과 시스템을 이용하였다. 효모 추출물을 포함하는 미생물 배지를 상기 한외여과 막을 통과시킨 후 여과액을 수확하고 LBdUF100kDa 라 명명하였다. 한외여과 막을 통과시키지 않은 미생물 배지를 대조군으로 사용하여 여과액의 나노파티클 농도를 측정하였다.
상기 실시예 1과 동일한 조건에서 Nanosight LM10 장비를 이용하여 나노파티클 분석(NTA)을 수행하였으며, 그 결과를 도 13에 나타내었다. 도 13에 나타난 바와 같이, 미생물 배지에 다량 존재하는 나노 입자가 본 발명의 한외여과 방법을 이용한 여과액에서 효과적으로 제거됨을 확인할 수 있다.
실시예
13.
한외여과
방법으로 나노 입자가 제거된 미생물 배지에서 다양한 미생물의 배양
100 kDa 컷오프 막을 이용하여 한외여과를 수행한 미생물 배지에서 다양한 미생물 (Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Acinetobacter baumannii) 각각의 성장 곡선을 분석하였다. 각 미생물을 전처리하지 않은 LB배지와 상기 실시예 12에서 한외여과로 전처리한 LB배지(LBdUF100kDa)에 접종하고 37℃ 조건에서 진탕 배양하면서 시간별 미생물 농도를 확인하기 위하여 600 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과 도 14에 나타난 바와 같이, 본 발명의 방법으로 전처리한 미생물 배지를 사용하더라도 전처리하지 않은 미생물 배지와 비교하여 미생물의 생장에 있어 차이가 없음을 확인할 수 있었다.
Claims (22)
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- 미생물 배양 배지 조성물을 100 ~ 500 kDa 컷오프 한외여과 막(cut-off membrane)을 이용하여 한외여과(ultrafiltration, UF)한 후 여과액과 잔류물로 분리하는 단계 및 상기 여과액을 수득하는 단계를 포함하는 나노 입자가 제거된 미생물 배양 배지 조성물의 제조 방법.
- 제18항에 있어서,
상기 미생물 배양 배지 조성물은 천연물 유래 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 나노 입자가 제거된 미생물 배양 배지 조성물의 제조 방법.
- 제19항에 있어서,
상기 천연물 유래 추출물은 단백질 가수분해물, 효모 추출물(yeast extract), 육즙(meat extract), 맥아 추출물(malt extract) 및 감자 추출물(potato extract)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 나노 입자가 제거된 미생물 배양 배지 조성물의 제조 방법.
- 제18항에 있어서,
상기 잔류물을 한외여과 막에 다시 주입하여 여과액과 잔류물로 2차 분리하는 단계 및 상기 여과액을 수득하는 단계를 더 포함하는 나노 입자가 제거된 미생물 배양 배지 조성물의 제조 방법.
- 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 나노 입자가 제거된 미생물 배양 배지 조성물.
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CN112851753B (zh) * | 2020-12-23 | 2023-05-02 | 西北民族大学 | 一种马铃薯蛋白水解物,制备及在贴壁细胞培养中的应用 |
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