KR102142254B1

KR102142254B1 - 3,4''-다이하이드록시플라본을 이용한 소변줄기세포의 분리 효율 향상 및 소변줄기세포유래 만능줄기세포의 조혈줄기세포 분화 효율을 촉진시키는 방법

Info

Publication number: KR102142254B1
Application number: KR1020180041144A
Authority: KR
Inventors: 조쌍구; 조성하; 김경석
Original assignee: 스템엑소원 주식회사
Priority date: 2018-04-09
Filing date: 2018-04-09
Publication date: 2020-08-07
Also published as: KR20190118031A

Abstract

본 발명은 3,2'-다이하이드록시플라본(3,2'-dihydroxyflavone) 또는 3,4'-다이하이드록시플라본(3,4'-dihydroxyflavone)을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 분화 촉진용 조성물에 관한 것이다.

Description

3,4'-다이하이드록시플라본을 이용한 소변줄기세포의 분리 효율 향상 및 소변줄기세포유래 만능줄기세포의 조혈줄기세포 분화 효율을 촉진시키는 방법{Method for improving separation efficiency of urine stem cells using 3,4'-dihydroxyflavones and promoting hematopoietic stem cell differentiation efficiency of urine stem cell-derived pluripotent stem cells}

본 발명은 3,2'-다이하이드록시플라본 또는 3,4'-다이하이드록시플라본을 유효성분으로 포함하는 소변 유래-유도 만능줄기세포의 분화 촉진용 조성물 및 분화 촉진 방법에 관한 것이다.

유도만능줄기세포는 배아 줄기세포가 가지는 윤리적 문제들(ethical issues)을 해결 할 수 있는 세포로, 인체를 구성하는 모든 세포로 전분화가 가능한 다능성(pluripotency)을 가지고 있어 줄기세포를 이용한 치료제의 원천으로 주목 받고 있다. 유도만능줄기세포는 야마나카 팀교수팀이 2006년에 쥐의 배성섬유아세포에 4개의 인자(Oct3/4, Sox2, c-Myc, Klf4)를 도입하는 것으로 ES세포와 같은 분화 다능성세포를 만들어 낼 수 있음에 대한 논문을 발표함으로서 알려졌다. 인간의 유도만능줄기세포를 만들기 위해서는 공여자(Donor)로부터 성체세포(somatic cell)을 채취하여 제작이 이루어지는데, 공여자의 섬유아세포(fibroblast), 혈액 등으로부터 세포를 채취해서 리프로그래밍(reprogramming)이라는 과정을 통한다. 최근 리프로그래밍 과정을 위한 공여자로부터의 세포 채득 방법에 대해 좀 더 안전하고 효율적인 방법을 찾기위한 연구도 진행 되고 있는 추세이다. 특히 혈액 등의 채취와 같은 침습성(invasive)방법에서는 간혹 채혈시 발생 할 수 있는 혈종이나, 감염의 우려, 혈액을 매개로한 질병에 걸려있는 환자로 부터의 채혈 등에 관한 문제점을 개선하기 위한 방법으로 공여자의 소변으로부터 세포를 분리하는 방법들이 발명 되었다. 또한, 유도만능줄기세포를 이용한 여러 인체 구성세포로의 분화를 시도하는 지금, 현재 분화능에 관해 개선되어야 할 부분들은 여전히 연구대상이며, 분화능을 높이고, 정확성을 높이는 연구등이 필요하다.

한국공개특허 제10-2017-0126564호

본 발명의 목적은 3,2'-다이하이드록시플라본(3,2'-dihydroxyflavone) 또는 3,4'-다이하이드록시플라본(3,4'-dihydroxyflavone)을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 분화 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 3,2'-다이하이드록시플라본 또는 3,4'-다이하이드록시플라본을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 증식 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 3,2'-다이하이드록시플라본(3,2'-dihydroxyflavone) 또는 3,4'-다이하이드록시플라본(3,4'-dihydroxyflavone)을 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포의 분화를 촉진시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 3,2'-다이하이드록시플라본 또는 3,4'-다이하이드록시플라본을 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포의 증식을 촉진시키는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 3,2'-다이하이드록시플라본(3,2'-dihydroxyflavone) 또는 3,4'-다이하이드록시플라본(3,4'-dihydroxyflavone)을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 분화 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 줄기세포는 유도만능줄기세포인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유도만능줄기세포는 소변유래 세포에서 리프로그래밍된 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 분화는 조혈모세포로의 분화인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 3,2'-다이하이드록시플라본 또는 3,4'-다이하이드록시플라본은 1 내지 20 μM의 농도인 것일 수 있고, 바람직하게는 5 내지 15 μM의 농도인 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 10 μM의 농도인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 3,2'-다이하이드록시플라본 또는 3,4'-다이하이드록시플라본은 EB(Embryoid Bodies)의 형성률을 증가시키는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 3,2'-다이하이드록시플라본 또는 3,4'-다이하이드록시플라본을 유효성분으로 포함하는 줄기세포의 증식 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 줄기세포는 조혈모세포인 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 3,2'-다이하이드록시플라본(3,2'-dihydroxyflavone) 또는 3,4'-다이하이드록시플라본(3,4'-dihydroxyflavone)을 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포의 분화를 촉진시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 3,2'-다이하이드록시플라본 또는 3,4'-다이하이드록시플라본을 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포의 증식을 촉진시키는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 3,2'-다이하이드록시플라본 또는 3,4'-다이하이드록시플라본은 소변유래-유도만능줄기세포에서 조혈모세포로의 분화를 촉진시키는 효과, 즉, EB 형성률을 증가시키는 효과가 있어 줄기세포의 의한 세포치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 3,2'-DHF(3,2'-dihydroxyflavone), 3,4'-DHF(3,4'-dihydroxyflavone)의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 소변유래 세포의 분리과정을 나타낸 것이다.
도 3은 분리된 소변유래 세포의 형태(morphology)를 나타낸 것이다(scale bar: 0.2mm).
도 4는 소변유래 세포에 대하여 여러 바이오마커의 발현여부를 확인한 결과이다.
도 5는 소변유래 세포로부터 유도만능줄기세포를 제작한 과정 및 제작된 유도만능줄기세포의 형태(morphology)를 나타낸 것이다.
도 6는 소변유래-유도만능줄기세포에 대하여 만능줄기세포의 마커인 Oct4, Sox2 및 Nanog의 발현여부를 확인한 결과이다.
도 7는 소변유래-유도만능줄기세포에서 4일 동일 EB로 형성된 세포의 형태(morphology)를 나타낸 것이다.
도 8은 EB를 single cell로 분리하고 원심분리한 후 튜브 아래쪽에 가라앉은 세포의 양을 비교한 결과(위쪽), EB 형성이 끝난 후 현미경을 통해 EB의 수를 센 결과(왼쪽아래 패널) 및 전체 세포수를 측정한 결과(오른쪽아래 패널)를 나타낸 것이다.
도 9는 소변유래-유도만능줄기세포에서 조혈모세포로의 분화과정(위쪽) 및 조혈모세포로의 분화 효율을 FACS 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 10은 소변유래-유도만능줄기세포에서 조혈모세포로의 분화 후 세포수를 비교한 결과이다(왼쪽중간 패널: 전체세포수; 오른쪽중간 패널: CD34가 발현되는 세포수; 및 CD34+CD45+와 CD34+인 세포수로서 FACS 분석정보를 토대로 분화된 세포정도를 전체 세포군으로부터 유추함).

본 발명에서의 용어, "줄기세포"는 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성(pluripotent)이거나 전능성(totipotent)이 있는 자가-재생산능(self-renewal)을 갖는 세포를 의미하며, 배아줄기세포, 유도만능줄기세포 및 성체줄기세포를 포함한다.

상기 용어 "배아 줄기세포"는 수정란이 모체의 자궁에 착상하기 직전인 포배기 배아에서 내세포괴(inner cell mass)를 추출하여 체외에서 배양한 것으로서, 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성(pluripotent)이거나 전능성(totipotent)이 있는 자가-재생산능(self-renewal)을 갖는 줄기세포를 의미한다.

상기 용어, "유도만능줄기세포(iPSC: induced pluripotent stem cells)"는 분화가 끝난 체세포 또는 제한된 분화능을 가지는 세포에 세포 분화 관련 유전자를 주입하여 리프로그래밍 과정을 통해 분화 이전의 세포 단계로 되돌린 만능성을 유도한 세포를 말한다. 유도만능줄기세포는 배아줄기세포와 거의 같은 특성을 가지고 있는데, 구체적으로 비슷한 세포모양을 보여주고, 유전자 및 단백질 발현 패턴이 유사하며, 생체 내외에서 다분화능을 가지는 특성을 가지고 있다. 인간 배아줄기세포와 같이 여성의 난자 등으로부터 획득하는 것이 아니라, 이미 분화가 끝난 체세포 등에서 유도된 것이기 때문에 인간 배아줄기세포와 같은 윤리적 문제점을 수반하지 않으며, 환자의 체세포에서 줄기세포로 전환할 수 있기 때문에 면역 거부 반응의 문제도 적다. 다만, 이러한 유용성에도 불구하고 역분화 효율이 낮아 충분한 수의 유도만능줄기세포를 얻을 수 없다는 단점이 있다.

상기 용어, "리프로그래밍(reprogramming)"이란 분화된 세포를 만능성(pluripotent)을 가지는 상태로 복원 또는 전환될 수 있는 프로세스를 의미한다. 본 발명에서 상기 리프로그래밍이란 0% 내지 100% 미만의 분화능을 가지는 분화된 세포들을 미분화 상태로 되돌리는 과정이라면 모두 이에 포함하며, 바람직하게는 0%의 분화능을 가지는 분화된 세포 또는 0% 초과 내지 100% 미만의 분화능을 가지는 일정부분 분화된 세포를 100% 분화능을 가지는 세포로 복원 또는 전환시키는 것을 모두 포함한다. 이러한 리프로그래밍은 리프로그래밍 유도인자(reprogramming factor)에 의하여 수행될 수 있다.

상기 용어, "리프로그래밍 유도인자"는 분화된 세포에 처리 또는 발현되는 경우 iPSC 특이적 유전자의 발현을 가져와 만능성을 가지는 유도만능줄기세포로 유도하는 물질을 의미한다. 상기 리프로그래밍 유도인자는 분화된 세포의 리프로그래밍을 유도하는 물질이면 본 발명에 제한없이 포함될 수 있으며, 그 예로 Oct3/4, sox-2, c-Myc 및 Klf-4 등을 들 수 있으나, 적용할 세포의 종류에 따라 선택할 수 있으며, 상기 예에 제한되는 것은 아니다.

상기 용어 "성체줄기세포"는 분화된 조직에서 발생하는 줄기세포로 자가 재생산이 가능하며 유래 조직의 모든 세포 타입으로 분화될 수 있는 미분화된 세포를 의미한다. 구체적으로 상기 성체줄기세포는 제대혈(탯줄혈액), 성인의 골수, 비장, 난소, 정소, 말초혈액, 양수, 뇌, 혈관, 골격근, 피부 또는 위장관의 상피, 각막, 치아의 치수, 망막, 간 또는 췌장으로부터 추출해 낼 수 있으며, 뼈와 간, 혈액 등 구체적 장기의 세포로 분화되기 직전의 원시세포를 의미한다. 예를 들어, 척수는 조혈모세포(Hematopoietic stem cell, HSC) 및 중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cell)를 가지는 것으로 보고되고 있으며 뇌로부터 유래한 줄기세포인 신경줄기세포(Neural stem cell)는 뇌실하 영역(subventricular zone), 뇌실 영역(ventricular zone) 및 CNS(central nervous system)의 해마(hippocampus)로부터 분리된다고 알려져 있다. 일반적으로 성체 줄기세포는 증식이 어려우나 쉽게 분화되는 경향이 강한 것으로 알려져 있어, 여러 종류의 성체 줄기세포를 사용하여 실제 의학에서 필요로 하는 장기 재생을 할 수 있을 뿐 아니라 이식된 후 각 장기의 특성에 맞게 분화할 수 있는 특성을 지니고 있다.

본 발명에서의 용어, "조혈모세포" 또는 "조혈줄기세포"는 다양한 혈액 세포 및 면역체계를 형성하는 림프구의 모체세포로서, 예를 들어 B 세포, T 세포와 같은 임파구, 과립구, 혈소판 및 적혈구로 발달할 수 있는 줄기세포를 말한다. 골수이식에 필수적인 세포로, 정상인의 골수혈액에는 모든 혈액세포를 만들어낼 수 있는 능력을 지닌 세포(CD34 양성 세포)가 약 1% 존재하는데 이를 조혈모세포라고 한다. 제대혈(탯줄혈액) 및 비장을 비롯한 온 몸에서 발견되지만, 특히 골수에서 대량으로 생산되며, 똑같은 자신을 만들어낼 수 있는 자가 복제 기능도 가지고 있다. 말초혈액 조혈모세포는 골수에서 유래한 것으로, 혈류를 순환하는 조혈모세포로서 자가 복제 및 성숙된 세포로 분화하는 성질을 가지고 있다.

본 발명에서의 용어, 줄기세포의 "증식"은 줄기세포의 분화(differentiation)와는 구분되는 개념으로서, 줄기세포가 구체적인 세포로 분화되지 않고, 줄기세포의 특성을 그대로 유지한 채, 세포가 분열되어 세포의 전체 수가 증가되는 것을 의미한다.

본 발명에서의 용어, "분화"란 덜 특화된 세포가 특정한 세포로 발달하여 세포의 크기나 모양, 막전위, 대사활성, 신호에 대한 반응이 특정한 유형의 세포로 변화하는 현상을 의미한다. 상기 분화는 주로 다세포 생물이 단일 접합자(zygote)에서 복잡한 조직을 형성하는 과정 중에 일어나거나, 성인이 되었을 때 손상된 조직을 복구하는 경우 성체줄기세포가 특정한 세포로 분화하게 된다.

본 발명에서의 용어, "배지"는 인 비트로(in vitro)에서 세포의 성장 및 생존을 유지하는데 필요한 영양물질을 포함하는 조성물을 의미한다.

본 발명에서의 용어, "계대 배양"이란 세포를 건강한 상태로 지속적으로 장기간 배양하기 위해 주기적으로 세포의 일부를 새로운 배양용기에 옮긴 후 배양배지를 갈아주면서 세포의 대를 계속 이어서 배양하는 방법을 의미한다. 한정된 공간을 가진 배양용기 내에서 세포의 수가 늘어나면서 일정시간이 지나면 증식 영양분이 소비되거나 오염 물질이 쌓여 세포가 자연히 죽게 되므로, 건강한 세포의 수를 늘리기 위한 방법으로 사용되며, 통상적으로 한 차례 배지(배양용기)를 교체하는 것 또는 세포군을 나누어 배양하는 것을 1 계대(1 passage)라고 한다.

본 발명의 유효성분은 3,2'-다이하이드록시플라본(3,2'-dihydroxyflavone) 또는 3,4'-다이하이드록시플라본(3,4'-dihydroxyflavone)으로서, 각 구조는 하기 화학식과 같다.

[화학식]

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 실험 재료 및 방법

1.1. 세포분리 및 배양

소변으로부터 세포를 분리하기 위해, 공여자들로부터 200~300ml 사이의 중간줄기(middle Flow) 소변을 소변채취용 용기에 제공받아 사용하였다. 상기 제공받은 소변은 50ml tube로 옮겨담아 1150rpm으로 원심분리한 후, 1% anti-biotics를 포함한 PBS(Sigma Aldrich)를 세포 펠렛에 다시 첨가하여 원심분리 과정을 통해 세척하였다. 배양용 플레이트는 0.2% Gelatin 코팅을 30분 동안 진행한 후 사용하였다(도 2). 세포는 10% FBS를 첨가한 REBM basal medium(Lonza)에 넣어 초기 3일동안 배양액을 절반씩 교체 해주며 세포부착을 유도하였고, 이후, REGM SingleQuot kit supplement(Lonza)을 이용하여 세포를 증식시켰다.

1.2. 세포 리프로그래밍 및 조혈모세포 분화

증식배양한 세포는 CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 제조사의 메뉴얼에 따라 리프로그래밍을 수행하였다. 리프로그래밍으로 형성된 유도만능줄기세포 콜로니는 Matrigel(BD Biosciences) 코팅한 배양 플레이트에 옮겨 mTeSR™1(STEMCELL Technologies) 과 10 μM의 Y-27632(STEMCELL Technologies)를 첨가하여 배양하였다.

증식배양된 유도만능줄기세포를 이용하여 조혈모세포로 분화시키기 위하여, 5일 동안은 EB의 형성을 유도하였다. 이후, 15% FBS가 들어간 IMDM 배지에 SCF (40ng/mL), FLT-3L (20ng/mL), IL-3 (10ng/mL), IL-6 (10ng/mL), BMP4 (20ng/mL)를 첨가하여 분화를 유도하였으며, 매일 절반의 배양 배지를 교체하고 총 21일간 분화를 진행하였다.

1.3. Total RNA 분리 및 RT-PCR 분석

제조사의 메뉴얼에 따라, Labozol total RNA extraction kit (Cosmo Genetech)를 사용하여 Total RNA을 추출하였다. 전체 RNA의 농도는 Nanodrop (ND1000) 분광 광도계(Nanodrop Technologies Inc., Wilmington DE, USA)로 측정였고, M-MuLV Reverse Transcriptase(Cosmo Genetech)를 이용하여 cDNA을 합성하였다. PCR 반응이 끝난 후에는 1 내지 1.5% 아가로스 젤에서 분석하였다.

1.4. 유세포 분석(FACS)

분화된 조혈모세포의 유세포 분석을 위해 세포 배양 플레이트에 있는 만능줄기세포유래 조혈모세포에 0.25% Trypsin을 3분간 처리하여 세포를 띄운 후 1,000rpm 에서 원심분리하였다. 이후, 상층액을 버리고, 1X PBS로 세척한 후 다시 원심분리하였다. 이후, Blocking Buffer (0.5% BSA, 2% FBS in PBS)를 30분 동안 얼음에서 반응시켰고, FACS Buffer (0.05% sodium azide, 0.5% BSA in PBS)가 들어간 각각의 1차 항체 (CD34, CD45)를 1시간 동안 얼음에서 반응시켰다. 세척 후, 2차 항체 (FITC, PE)를 30분 동안 얼음에서 반응시켰고, 세포들은 1X PBS로 두 차례 세척한 후, 1X PBS에 재부유하여 FACS Calibur로 분석하였다.

1.5. EB 형성률

EB 형성률은 EB 형성이 끝난 시점에 현미경을 통해 EB의 수를 세어 3번의 평균값으로 측정하였다. 또한, EB를 StemPro Accutase(Thermo Fisher Scientific)를 37℃에서 10분 동안 처리하고, 세포를 천천히 파이페팅하여 single cell로 분리한 후, 전체 세포수를 측정하였다.

실시예 2. 소변유래줄기세포의 분리 및 세포의 형태

본 발명자들은 다양한 연령대의 소변을 채취하여 분리하였고, 성공적으로 소변유래 세포(urine-derived cells)를 분리하여 배양하였다(도 2). 상기 분리된 세포에서는 문헌상으로 나타나는 일반적인 두 가지 성장 형태가 모두 관찰되었다. 초기 소변으로부터 분리된 세포 펠렛(pellet)에는 여러 가지 세포군이 포함되어 있었고(도 3, 왼쪽), 그 중 세포의 형태가 단일세포로 자라는 타입 1(도 3, 가운데) 및 콜로니(colony)를 형성하여 자라는 타입 2(도 3, 오른쪽)의 세포를 확인하였다.

실시예 3. 세포의 특성 분석

본 발명자들은 상기 실시예 2에서 분리된 소변유래 세포에 대하여 여러 바이오마커를 이용하여 세포의 특성을 확인하는 실험을 수행하였다. 현재까지 소변유래 세포에 대한 특성을 규명하는 마커가 명확하게 규명 되어지지는 않았으므로, 본 분석은 공여자로부터 분리된 소변유래 세포를 여러 바이오마커를 활용하여 각 공여자로부터 얻은 세포에 대한 성격을 예측하는 정도의 것이었다. 그 결과, 도 4에서와 같이, Epithelial cells의 마커인 E-cadherin 및 ZO-1 은 발현되지 않았고, Fibroblast cells의 마커인 Vimentin, Fibronetin 중 Vimenetin은 발현되지 않았으나, Fibronectin은 발현이 확인되었다. 또한, Renal cells의 마커인 SLC2A1, L1CAM, NR3C2 중 SLC2A1 및 L1CAM의 발현이 확인되었다(도 4). 따라서, 분리된 소변유래 세포는 Fibroblast 및 Renal cells의 특성을 가지고 있는 것으로 확인되었다.

실시예 4. 유도만능줄기세포의 제작

본 발명자들은 상기 소변유래 세포를 성체세포 리프로그래밍을 통해 유도만능줄기세포로 전환하는 실험을 수행하였다. 실험 과정은 도 5의 위쪽 패널에 나타난 바와 같이, 소변샘플에서 세포를 분리하고 소변유래줄기세포 콜로니를 형성시킨 후, 일반적인 리프로그래밍 과정을 통해 유도만능줄기세포를 제작하였다(도 5, 위쪽). 그 결과, 소변샘플에서 소변유래 세포의 분리 후 35일 째에 유도만능줄기세포로 보여지는 콜로니가 형성됨을 확인하였다(도 5, 아래쪽).

이후, 본 발명자들은 형성된 콜로니의 세포들이 유도만능줄기세포인지 확인하는 실험을 수행하였다. 우선, Single Cell Capture 장비를 이용하여 단일세포 수준에서의 염색체 상의 비정상핵형이 발생하였는지 확인하였는데, 배양된 소변유래-유도만능줄기세포는 핵형에 문제가 없었고 안정적으로 제작되었음을 확인하였다. 또한, 만능줄기세포의 마커인 Oct4, Sox2 및 Nanog의 발현여부를 확인하는 실험을 수행하였다. 그 결과, 소변유래 세포에서 발현되지 않았던 Oct4, Sox2 및 Nanog가 소변유래-유도만능줄기세포에서는 발현됨을 확인하였다(도 6). 이로써, 소변유래 세포에서 유도만능줄기세포로의 제작 또는 형성되었음을 확인하였다.

실시예 5. 소변유래-유도만능줄기세포에서 조혈모세포로의 분화

본 발명자들은 소변유래-유도만능줄기세포(UC-iPSCs)에서 여러 세포로의 분화를 시도하였다. 특히, 본 발명자들은 분화를 진행하는 동안 플라보노이드 계열의 3,2'-DHF(3,2'-dihydroxyflavone)와 3,4'-DHF(3,4'-dihydroxyflavone)를 첨가한 경우, 대조군에 비해 유도만능줄기세포에서 EB(Embryoid Bodies)로의 형성률이 증가하였음을 확인하였다. 즉, 상기 플라보노이드를 처리한 경우, 세포의 형태에 있어서 대조군에 비해 콜로니의 크기가 컸음을 확인하였고(도 7), 형성된 콜로니의 수에 있어서도 대조군에 비해 1.5 배 정도 증가하였고, 전체 세포수는 2배 정도 증가하였음을 확인하였다(도 8). EB 형성은 조혈모세포 뿐만 아니라 여러 세포로의 분화 시 형성되어야하는 단계로서, 동일 시간 내에 상대적으로 크기가 크고 많은 수의 EB 형성이 추후 분화를 진행함에 있어 유리할 수 있다.

본 발명자들은 상기와 같이 소변유래-유도만능줄기세포에서 EB를 형성시키고, 조혈모세포로의 분화를 유도하는 실험을 수행하였다(도 9, 위쪽). 또한, 조혈모세포의 분화 유도 시, EB 형성에서와 마찬가지로 3,2'-DHF 및 3,4'-DHF를 첨가하여 분화의 효율을 높일 수 있는지 확인하는 실험을 수행하였다. 그 결과, 본 발명자들은 소변유래-유도만능줄기세포에서 조혈모세포로의 분화가 잘 유도될 수 있음을 확인하였다. 다만, 3,2'-DHF 및 3,4'-DHF의 첨가는 조혈모세포의 분화에 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다(도 9, 아래쪽)

본 발명자들은 조혈모세포로의 분화를 완료한 후, 총 세포수 및 CD34,CD45 발현하는 세포수를 유세포 분석기(Flow cytometry)를 통해 분석하였다. 그 결과, 3,2'-DHF 및 3,4'-DHF의 첨가한 경우 대조군에 비해 총 세포수가 증가됨을 확인하였다(도 10, 왼쪽중간 패널). CD34는 말초혈액 또는 골수에서 분리된 조혈모세포에 대한 양성마커로서, 3,2'-DHF 및 3,4'-DHF의 첨가한 경우 대조군에 비해 CD34가 발현되는 세포수가 많은 것을 확인하였다(도 10, 오른쪽중간 패널). 또한, 조혈모세포에 대한 바이오마커인 CD45를 CD34와 함께 발현하는 세포군(CD34+CD45+)에 대한 세포수를 분석하였다. 그 결과, 3,2'-DHF를 첨가한 경우 대조군에 비해 상기 CD34+CD45+의 세포수가 증가되었음을 확인하였다(도 10, 아래쪽 패널).

Claims

3,4'-다이하이드록시플라본(3,4'-dihydroxyflavone)을 유효성분으로 포함하는, 인간의 중간 줄기 소변으로부터 유래된 소변유래 세포로부터 리프로그래밍된 유도만능줄기세포에서 조혈모세포로의 분화 촉진용 조성물.
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제 1 항에 있어서,
상기 3,4'-다이하이드록시플라본은 1 내지 20 μM의 농도인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 3,4'-다이하이드록시플라본은 EB(Embryoid Bodies)의 형성률을 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
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시험관 내(in vitro)에서 3,4'-다이하이드록시플라본을 인간의 중간 줄기 소변으로부터 유래된 소변유래 세포로부터 리프로그래밍된 유도만능줄기세포에 처리하는 단계; 및
상기의 유도만능 줄기세포에 추가로 3,4'-다이하이드록시플라본을 더 처리하는 단계;를 포함하는 인간의 중간 줄기 소변으로부터 유래된 소변유래 세포로부터 리프로그래밍된 유도만능줄기세포의 조혈모세포로의 분화를 촉진시키는 방법.
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제 9 항에 있어서,
상기 3,4'-다이하이드록시플라본은 1 내지 20 μM의 농도인 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항에 있어서,
상기 3,4'-다이하이드록시플라본은 EB(Embryoid Bodies)의 형성률을 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
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