KR100851040B1

KR100851040B1 - 췌장 베타세포로의 분화능을 가지는 성체 줄기세포

Info

Publication number: KR100851040B1
Application number: KR1020070006130A
Authority: KR
Inventors: 강경선
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2007-01-19
Filing date: 2007-01-19
Publication date: 2008-08-12
Also published as: KR20080068394A

Abstract

본 발명은 인간조직 유래 성체 줄기세포를 네스틴 양성세포가 없는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 성체 줄기세포를 인슐린 분비 췌장 베타 유사세포로 분화시키는 방법 및 그 방법에 의해 수득한 췌장 베타세포에 관한 것이다. 본 발명에 따른 인간 조직 유래 성체 줄기세포는 췌장 베타세포 유사세포로 분화능력이 있기 때문에 당뇨병 질환에 관한 세포 치료에 유용하다.

제대혈, 인슐린 분비 췌장 베타 유사세포, 성체 줄기세포

Description

췌장 베타세포로의 분화능을 가지는 성체 줄기세포{Adult Stem Cells Having an Ability of Differentiation into Pancreas β Cells}

도 1의 a는 인간 제대혈 유래 성체 줄기세포(배아줄기세포의 특정 성질 공유하고 있음)의 집합으로 형성된 콜로니 사진이고, 인간 제대혈 유래 성체 줄기세포에서의 배아줄기세포 특이 발현단백질인 Oct4(b), SSEA4(c)을 발현을 확인한 사진이다.

도 2는 각각의 인자에 대하여 면역염색한 사진이다 [a 및 d: C-펩타이드(빨간색); b 및 e :인슐린(녹색); c 및 f: 췌장 베타세포 유사구조]

도 3은 C-펩타이드(a) 및 Oct4(b)의 웨스턴 블롯 분석 결과이다.

본 발명은 제대혈을 포함하는 인간조직 유래 성체 줄기세포를 네스틴 양성세포가 없는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 성체 줄기세포를 췌장 베타세포(인슐린 생산세포)로 분화시키는 방법 및 그 방법에 의해 수득한 췌장 베타 유사 세포에 관한 것이다.

21세기의 생명공학은 인간복지를 최종목표로 식량, 환경, 건강 문제에 새로운 해결책의 가능성을 제시하고 있으며, 최근에 줄기세포의 이용기술은 난치병 치료의 새로운 장으로 떠오르고 있다. 이전까지는 인간의 난치병 치료를 위해 장기이식이나 유전자 치료 등이 제시되었으나, 면역거부와 공급 장기 부족, 벡터개발이나 질환유전자에 대한 지식부족으로 효율적인 실용화가 미진하였다.

이에 줄기세포연구에 대한 관심이 고조되어, 증식과 분화를 통해 모든 기관을 형성할 능력을 가진 만능 줄기세포가 대부분의 질병 치료는 물론 장기 훼손을 근원적으로 해결할 수 있는 것으로 인식되었다. 또한, 많은 과학자가 인체의 거의 모든 장기 재생은 물론 난치병이었던 파킨슨병, 각종 암, 당뇨병과 척수손상등의 치료에 이르기까지 다양하게 줄기세포의 적용 가능성을 제시해 왔다.

줄기세포(stem cells)란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능 줄기세포(totipotent stem cells), 전능성(전분화능) 줄기세포(pluripotent stem cells), 다능성(다분화능) 줄기세포(multipotent stem cells)로 분류할 수 있다.

만능 줄기세포(totipotent stem cells)는 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있는 만능의 성질을 가진 세포로 난자와 정자의 수정 이후 8세포기까지의 세포가 이러한 성질을 가지며 이 세포를 분리하여 자궁에 이식하면 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있다. 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells)는 외배엽, 중배엽, 내배엽층 유래의 다양한 세포와 조직으로 발생할 수 있는 세포로서, 수정 4-5일 후 나타나는 배반포(blastocyst)의 안쪽에 위치한 내세포괴(inner cell mass)에서 유래하며, 이를 배아 줄기세포라 하며 다양한 다른 조직 세포로 분화되지만 새로운 생명체를 형성하지는 못한다. 다능성(다능성) 줄기세포(multipotent stem cells)는 이 세포가 포함되어 있는 조직 및 기관을 형성하는 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 줄기세포이다.

다능성 줄기세포는 성체 골수에서 최초로 분리되었고 (Jiang, Y. et al., Nature, 418:41, 2002), 그 후 다른 여러 성체 조직에서도 확인되었다 (Verfaillie, C.M. et al , Trends Cell Biol ., 12:502, 2002). 다시 말해, 골수는 가장 널리 알려진 줄기세포의 소스이지만, 다능성 줄기세포는 피부, 혈관, 근육 및 뇌로부터도 확인되었다 (Toma, J.G. et al ., Nat . Cell Biol., 3:778, 2001; Sampaolesi, M. et al., Science, 301:487, 2003; Jiang, Y. et al ., Exp . Hematol., 30:896, 2002). 그러나, 골수와 같은 성체 조직내의 줄기세포는 매우 드물게 존재하고, 이러한 세포들은 분화유도 하지 않고 배양하기 어려워서, 특이적으로 스크린된 배지들이 없으면 그 세포들을 배양하기 어렵다. 즉, 줄기세포들을 분리하여 체외에서 보존하기가 매우 어렵다는 단점이 있다.

제대혈은 최근에 많은 양의 줄기세포를 가지고 있는 것으로 알려지면서 연구가 활발히 이루어지고 있다. 제대혈이 조혈모세포의 풍부한 원천으로 알려진 이후, 임상적으로 제대혈 이식을 통해 혈액 관련 질환을 치료하고자 하는 시도가 많이 이루어지고 있으며, 자가이식 치료를 위하여 제대혈을 냉동시켜 수년 후 사용가능한 상태로 보존하는 제대혈 은행이 국내에서도 활성화되고 있다. 제대혈은 골수와는 달리 분만 과정에서 버려지는 제대(Umbilical cord)에서 간단한 시술을 통해 얻을 수 있으며, 그 양에 비해 수많은 조혈모세포 및 줄기세포를 포함하고 있다.

말초 혈액 이식과 비교하여, 인간 제대혈 이식은 소아 및 성인 환자들 치료에 훨씬 희망적인 방법이다 왜냐하면, 빠른 유용성(rapid availability), 전염병 전이의 적은 위험, 이식편대숙주(graft-versus-host) 병의 적은 위험 때문이다. 제대혈 이식은 지금까지 잘 연구되어 왔고, 조혈 기능이상과 관련한 질병의 치료에 이용되고 있다.

McGuckin 등은 제대혈의 비조혈 세포 군집(CD45-)으로부터 SSEA-3+, SSEA-4+ 및 Oct4+ 배아줄기세포 유사세포를 분리하였다 [McGuckin, C.P. et al ., Cell Proliferation 38, 245-255, 2005]. 최근에, Yong Zhao 등은 SSEA-3 및SSEA-4뿐만 아니라 전사인자 Oct4 및 나노그(Nanog)와 함께, 배아줄기세포 특이적 분자 마커의 발현을 포함하는 배아줄기세포-유사 특성을 나타내는 인간 제대혈에 대한 줄기세포의 군집을 획득하였다 [Zhao, Y. et al., Experimental Cell Research , 312:2454-2464, 2006]. 그리고, Polesskaya 등은 내재하는 CD45 양성세포의 동원(mobilization)은, 일단 그들이 Wnt 경로(pathway)에 의해 활성화되면, 손상(injury) 후의 재생에 있어서 중요한 요소임을 제시하였다[Polesskaya, A. et al., Cell , 113:841-852, 2003]. Yeh S.P 등 역시 다양한 수준에서 골수 유래 중간엽 줄기세포에 의해 CD45가 발현된다고 보고하였다 [Yeh, S.P., et al ., Leukemia, 19:1505-1507, 2005]. 이러한 모든 증거들은 CD45가 혈액-리니지 세포의 마커일 뿐만 아니라, 줄기세포에서 발현되는 것을 시사한다.

생체밖에서(in vitro) 다른 종류의 줄기세포뿐만 아니라 배아줄기세포로부터 인슐린 생산 세포로의 분화는 잘 연구되어 있다. 네스틴 발현 세포의 선택 후 베타세포 분화를 유도하는 대부분의 프로토콜에도 불구하고, Przemyslaw 등은 네스틴 양성세포 선택 없는 새로운 프로토콜을 개발하였다 [Przemyslaw B. et al ., Int. J. Dev . Biol ., 48:1095-1104, 2004]. 본 발명의 세포 콜로니는 특정 배아줄기세포(ESC) 특성을 나타내기때문에, 그들을 베타세포 분화로 유도하기 위하여 유사한 프로토콜을 적용하였다. 고농도 포도당 조건(high glucose condition)의 활성이 없으면 인슐린 또는 C-펩타이드는 검출되지 않았다. Yong Zhao 등은 인간 제대혈 유래 줄기세포는 당뇨병에 걸린 STZ 마우스 모델에서 치료적인 혈당 효과를 생성할 수 있음을 증명하였다 [Zhao Y et al ., Cell Research , 312:2454-2464, 2006]. 인슐린 생산 췌장세포-유사구조로의 생체외 분화는 제대혈 유래 세포의 줄기세포 특성을 입증하는 새로운 증거를 제공한다.

한편, 당뇨병(Diabetic mellitus; DM)은 많은 나라에서 높은 질병률 및 사망률을 가져오는 질환 중의 하나로서, 인슐린 분지 췌장 세포의 파괴에 의한 절대적 인슐린 결핍에 따른 타입1 당뇨병과 감소된 인슐린 민감성(sensitivity)에 의한 상대적 인슐린 결핍에 따른 타입2 당뇨병이 있다. 최근에, 당뇨병, 특히 타입1 당뇨병에 대한 세포 대체 치료요법이 많은 주목을 받아왔다. 그러나, 췌장 베타세포의 이식이 많은 환자들로 하여금 외인성(exogenous) 인슐린 주입으로부터 벗어나게 해 줄 수 있지만, 장기 기증자도 충분하지 않고 환자도 항거부 치료법(anti-rejection therapies)의 위험을 감수해야했다 [Lewis E.C. et al ., Cytokine , 34:106-113, 2006].

오늘날, 줄기세포 치료요법을 통하여 당뇨병을 치료하기 위한 대체적인 수단을 찾기 위하여 많은 노력을 기울이고 있다. 줄기세포는 자기 재생 능력을 가지고, 많은 종류의 리니지(lineage) 세포로 분화할 수 있는 능력을 가지는 세포의 그룹이다. 배아 줄기세포(ESCs), 골수 유래 중간엽 줄기세포 및 췌장 줄기세포를 포함하여 많은 종류의 줄기세포의 인슐린-생산 췌장 베타 세포로 분화와 관련하여 다수의 보고가 있어왔다. 그들 대부분의 방법들이 네스틴(nestin)선택에 기초한 다단계(multi-step) 프로토콜을 통하여 수행된다. 줄기세포는 과혈당 조건을 바로잡기 위해 인슐린 생산 세포로의 분화 전 또는 후에 환자에게 이식된다.

배아 줄기세포는 어떠한 종류의 리니지 세포로도 분화할 수 있다고 여겨지고 있으나, 윤리적 한계와 제한된 소스가 태아줄기세포에 대한 연구의 장애가 되고 있다. 또한, 배아 줄기세포에 의하여 인슐린 생산 세포를 제조할 수 있지만, 동물로의 이식 후에 기형 형성의 사례도 보고되고 있다. 골수 중간엽 줄기세포 및 췌장 줄기세포와 같은 성체 줄기세포는 그들 고유의 한계로서 높은 면역성을 가진다. 태아 줄기세포, 특히 제대혈 줄기세포는 그들의 낮은 면역성 및 상대적으로 소스 획득이 용이하는 점때문에, 주로 임상에서 줄기세포 치료요법의 수단으로서 장점을 가진다.

단지 소수의 논문이 인간 제대혈(UCB) 줄기세포의 임상적 적용에 대하여 보고하고 있을 뿐이다. 그러나, 본 발명자들의 앞선 연구에서, UCB 줄기세포를 척수 손상 및 버거씨병(Buerger's Disease)을 앓고 있는 환자에서 적용하였다. Shuro Yoshida 등은 성숙 T 및 B 세포가 적고 NK(natural killer)세포의 극히 낮은 활성을 보여주는 NOD/SCID/₂m^null 마우스에서 UCB-유래 줄기세포가 인슐린 생산 세포를 생성시킬 수 있다는 것을 성공적으로 입증하였다 [Yoshida S. et al ., Stem Cells, 23;1409-1416, 2005]. 이식 준비된 체도세포의 세계적 부족과 결부하여, 타입I 당뇨병에 대하여 췌도세포 이식에 기초한 치료요법의 성공은 췌도세포 대체 조직의 새로운 소스를 개발하는 노력에 자극이 되어왔다. 여러 연구에서 성공적으로 태아줄기세포(ESCs)는 인슐린을 생산하는 췌도세포 유사 구조로 유도되었다. 그러나, ESC의 소스는 윤리적 기술적 염려가 존재한다.

Tai 등은 췌장 줄기세포를 포함한 다수의 인간 성체 줄기세포에서 Oct4 유전자가 발현한다는 것을 보여주었다 [Tai, M.H. et al ., Pancreas , 26:e18-e26, 2003]. 최근에 인간 제대혈로부터 유래된 줄기세포가 배아줄기세포의 일부 특성을 공유하고 있다는 몇몇의 보고가 있었다 [McGuckin C. P et al, Cell Proliferation, 38;245-255, 2005; Zhao Y et al., Experiment Cell Research , 312:2454-2464, 2006]. 또한, 성체 줄기세포를 췌장 베타세포로 분화시키는 방법에 대하여, 배아줄기세포를 이용하는 방법(KR10-2004-0068197)이나, 성체줄기세포를 이용하되 nestin-positive cell을 사용한 경우(US 20050054102)이 알려져 있고, 세포 융합, 즉 fusion-dependent 및 fusion-independent 메커니즘 모두를 사용하여 인간 제대혈 유래 세포로부터 인슐린 생산 세포를 만드는 방법이 보고되어 있는 실 정이다[Yoshide S. at al ., Stem Cells , 23:1409-1416, 2005] 본 발명자들은 좀 더 용이한 방법으로 성체 줄기세포를 췌장 베타세포로 분화시키는 방법을 찾고자 하였고, 현재까지 배아 줄기세포를 인슐린 생산 세포 구조로 유도할 수 있는지에 대한 많은 연구가 있어왔기 때문에, 본 발명자들은 그러한 과정을 제대혈로부터 유래된 줄기세포에 적용할 수 있을지에 대하여 의문을 가졌다.

이에 본 발명자들은, 배아줄기세포-유사 인간 제대혈-유래 줄기세포를 수득한 후, 배아 줄기세포를 췌장 베타 세포로 유도시키는 것으로 보고된 프로토콜을 변경시켜서 네스틴 양성세포의 선택없는 프로토콜을 착안하고, 이를 배지로 이용하여 인간 조직-유래 줄기세포를 인슐린 생산 세포 구조로 분화시킬 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 주된 목적은 인간 조직 유래 성체 줄기세포를 인슐린 분비 췌장 베타 유사세포로 분화시키는 방법 및 상기 방법에 의해 수득되는 인슐린 분비 췌장 베타 유사세포를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 인간 조직 유래 단핵세포를 bFGF, 페니실린, 스트렙토마이신, 글루타민 및 FBS를 함유하는 배지에서 배양시키는 단계를 포함하는, 인간 조직 유래 성체 줄기세포의 제조방법 및 상기 방법에 의해 수득되는 성체 줄기세포를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 인간 조직 유래 성체 줄기세포 또는 인슐린 분비 췌장 베타 유사세포를 유효성분으로 함유하는 당뇨병 치료용 세포 치료제를 제공하는데 있다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인간조직 유래 성체 줄기세포를 네스틴 양성세포가 없는 배지에서 배양하여 상기 성체 줄기세포를 췌장 베타 유사세포로 분화시키는 방법 및 상기 방법에 의해 수득한 췌장 베타 유사세포를 제공한다. 상기 췌장 베타 유사세포는 인슐린 및 C-펩타이드는 발현되고 Oct4는 발현되지 않는 특성을 나타낸다.

본 발명은 또한, 인간 조직에서 분리한 단핵세포를 bFGF, 페니실린, 스트렙토마이신, 글루타민 및 FBS를 함유하는 배지에서 배양한 다음 회수하는 것을 특징으로 하는, (a) Oct4 및 SSEA4 발현능을 가짐; (b) CD29, CD31, CD44, 및 CD45에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내고,　CD4, CD20, CD34, 및 CD51에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타냄; (c) 플라스틱에 부착되어 성장하며, 둥근형태(round-shape) 또는 선형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타냄; (d) 중배엽, 내배엽 및 외배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐; 및 (e) 인슐린 분비 췌장 베타 유사세포로 분화되는 특성을 가지는 특성을 나타내는 인간 조직 유래 성체 줄기세포의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의하여 수득되고, (a) Oct4 및 SSEA4 발현능을 가짐; (b) CD29, CD31, CD44, 및 CD45에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타 내고,　CD4, CD20, CD34, 및 CD51에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타냄; (c) 플라스틱에 부착되어 성장하며, 둥근형태(round-shape) 또는 선형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타냄; (d) 중배엽, 내배엽 및 외배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐; 및 (e) 인슐린 분비 췌장 베타 유사세포로 분화되는 특성을 가지는 인간 조직 유래 성체 줄기세포를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 췌장 베타 유사세포로의 분화능을 가진 인간 조직유래 성체 줄기세포 또는 분화된 췌장 베타 유사세포를 유효성분으로 함유하는 당뇨병 치료용 세포치료제를 제공한다

특히, 본 발명의 인간조직 유래 성체 줄기세포는 유방, 골수, 제대혈, 혈액, 간장, 피부, 위장관, 태반, 및 자궁 등으로 구성된 군에서 선택된 인간 조직 유래 줄기세포으로부터 선택할 수 있다. 바람직하게는 제대혈 유래 성체 줄기세포를 선택할 수 있다.

1. 용어의 정의

본 발명에서 사용된 용어 '줄기세포'는 조직 및 기관의 특수화된 세포를 형성하도록 비제한적으로 재생할 수 있는 마스터 세포를 지칭한다. 줄기세포는 발달가능한 만능성 또는 다능성 세포이다. 줄기세포는 2개의 딸줄기세포, 또는 하나의 딸줄기세포와 하나의 유래('전이(transit)') 세포로 분열될 수 있으며, 이후에 조직의 성숙하고 완전한 형태의 세포로 증식된다.

본 발명에서 사용된 용어 '성체 줄기세포'는 발생과정이 진행되어 배아의 각 장기가 형성되는 단계 혹은 성체단계에서 나타나는 줄기세포를 지칭한다. 성체 줄기세포는 그 분화능이 일반적으로 특정 조직을 구성하는 세포로만 한정된다. 이러한 성체줄기세포는 성인이 된 후에도 대부분의 장기에 남아 정상적으로 혹은 병리적으로 발생하는 세포의 손실을 보충하는 역할을 담당한다.

본 발명에서 사용된 용어 '분화(differentiation)'는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다. 일반적으로 비교적 단순한 계(系)가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계(部分系)로 분리되는 현상이다. 예를 들면, 개체발생에서 처음에 동질적이었던 알 부분 사이에 머리나 몸통 등의 구별이 생기거나 세포에도 근세포라든가 신경세포 등의 구별이 생기는 것과 같이 처음에 거의 동질이었던 어떤 생물계의 부분 사이에 질적인 차이가 생기는 것, 또는 그 결과로서 질적으로 구별할 수 있는 부역 또는 부분계로 나누어져 있는 상태를 분화라고 한다.

본 발명에서 사용된 용어 '세포치료제'는 사람으로부터 분리, 배양 및 특수한 저작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방 의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식·선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다. 세포치료제는 세포의 분화정도에 따라 크게 체세포치료제, 줄기세포치료제로 분류되며 본 발명은 특히 줄기세포 치료제에 관한 것이다.

2. 제대혈 유래 줄기세포의 분리 및 정제

본 발명에서 일 양태로 사용하는 제대혈은 인간에서 태반과 태아를 연결하는 제대정맥으로부터 채취한 혈액으로서 분만 후 태반이 박리되기 전에 채취한다. 제대혈-단핵세포(mononuclear cells, MNCs)는 표준 시험법에 따라 피콜-하이팩(ficoll-hypaque) 밀도구배 원심분리에 의해 단일 분만(parturient)로부터 헤파린 처리된 제대혈로부터 제조되었다 (T.Tondreau et al., Mesenchymal Stem Cells Derived from CD133-Positive Cells in Mobilized Peripheral Blood and Cord Blood: Proliferation, Oct4 Expression, and Plasticity Stem Cells 23:1105, 2005).

구체적으로, 분만 후 태반이 박리되기 전에 채취한 제대혈을 인산염 완충용액(PBS)과 혼합하여 희석한 후, 희석된 제대혈과 동량의 피콜-하이팩 용액에 중첩시킨다. 이때, 피콜-하이팩 용액은 사용 전에 실온이 되도록 하며, 희석된 제대혈의 부피가 피콜-하이팩 용액 부피의 3배가 넘지 않도록 하는 것이 바람직하다. 이를 원심분리하여 적혈구층, 단핵세포층 및 혈청층을 분리한다. 파스퇴르 피펫(pasteur piptte) 등을 이용하여 단핵세포층만을 새로운 튜브로 옮기고, PBS 등으로 세척하여 단핵세포층 채취시 혼입된 피콜-하이팩 용액이나 오염된 혈소판을 제거한다.

본 발명에서 상기 분리한 세포를 배양하기 위하여 사용하는 배지는 동물세포 배양용 배지로서 무기염류, 아미노산, 비타민류 및/또는 보조인자를 포함하는 포유동물 세포요법용 배지로서 동물세포 배양 기술분야에서 동물세포 배양을 위해 통상적으로 사용하는 배지를 사용할 수 있다. 상업적으로 입수가능한 동물세포 배양용 배지로 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 등이 있다.

본 발명에서는 상기 DMEM 배지에 bFGF(basic fibroblast growth factor)[R&D Sytem Minneapolis, MN], 페니실린, 스트렙토마이신, 글루타민(Gibco, grand island, NY) 및 20%의 FBS를 첨가하여 배양시킨다. 이러한 줄기세포는 플라스틱에 부착되어 성장하며, 둥근형태(round-shape) 또는 선형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타낸다.

바람직한 실시 양태에서, 배양된 세포는 당해 분야에 공지된 기법, 예를 들어 밀도 구배 원심분리, 자석 세포분리, 유세포분석기, 또는 다른 세포 분리법을 사용하여, 또는 당해 분야에 공지된 분류 방법을 사용하여 분류된다.

일례로, 수득한 줄기세포액으로부터 목적의 표면항원을 발현하고 있는 다능성 줄기세포를 수득하는 방법으로서는 소팅 기능을 가진 플로우 사이토미터를 사용한 FACS 법(Int. Immunol., 10(3):275, 1998), 자기 비즈를 사용하는 방법, 다능성 줄기세포를 특이적으로 인식하는 항체를 사용한 패닝법(J. Immunol., 141(8):2797, 1998) 등이 있다. 또한, 대량의 배양액 등으로부터 다능성 줄기세포를 수득하는 방법으로서는, 세포의 표면에 발현되어 분자(이하, 표면 항원이라 칭함)를 특이적으로 인식하는 항체를 단독 또는 조합하여 이를 칼럼으로서 사용하는 방법이 있다.

플로우 사이토미터 소팅 방식으로서는, 수적하전 방식, 셀캡쳐 방식 등을 들 수 있다. 한 실시양태에서, 세포 표면 표지-특이적 항체 또는 리간드는 분명한 형광 라벨로 표지된다. 세포는 세포 분류기를 통해 처리되어 그들의 사용된 항체에 대한 결합능력에 기초하여 세포가 분리된다. FACS-분류된 입자는 96웰 또는 384웰 플레이트의 개별 웰(well)내에 직접 침착되어 분리 및 클로닝을 촉진시킬 수 있다.

어떠한 방법으로도 세포의 표면항원을 특이적으로 인식하는 항체를 형광으로 표지하고, 표지된 항체와 항원의 결합체에 대한 형광을 측정하여 형광 강도를 전기 신호로 변환함으로서 세포의 항원 발현량을 정량할 수 있다. 또한, 사용하는 형광물질의 종류를 조합함으로서, 복수의 표면 항원을 발현하고 있는 세포를 분리하는 것도 가능하다. 여기에 사용가능한 형광물질로는, FITC(fluorescein isothiocyanate), PE(phycoerythrin), APC(allo-phycocyanin), TR(TexasRed), Cy3, CyChrome, Red613, Red670, TRI-Color, QuantumRed 등이 있다.

본 발명에서 사용 가능한 하나의 방법인 플로우 사이토미터를 사용한 FACS 법으로서는, 상기에서 수득한 줄기세포용액을 수집하고, 원심분리 등의 방법으로 세포를 분리한 후, 직접 항체로 염색하는 방법과 한번 적당한 배지 중에서 배양, 증식을 실시한 후에 항체를 염색하는 방법을 이용할 수 있다. 세포의 염색은 우선, 표면 항원을 인식하는 일차항체와 목적 세포 샘플을 혼합하고, 얼음 위에서 30분 내지 1시간 인큐베이션한다. 일차 항체가 형광으로 표지되어 있는 경우에는 세정 후 플로우 사이토미터로 분리를 실시한다. 일차 항체가 형광 표지되어 있지 않는 경우에는 세정 후 일차 항체에 대해서 결합 활성을 갖는 형광 표지된 이차 항체 와 일차 항체가 반응한 세포를 혼합하고, 다시 얼음물에서 30분 내지 1시간 인큐베이션한다. 세정 후, 일차 항체와 이차 항체에서 염색된 세포를 플로우 사이토미터로 분리를 실시한다.

3. 제대혈 유래 성체 줄기세포의 특성

장기간 배양 후 세포들을 표면 CD 시리즈 항원 마커들, 예를 들어 CD4(T cell marker), CD20(B cell marker), CD29(mononuclear cell marker), CD31(endothelial cell and stem cell marker), CD34(hematopoietic stem cell marker), CD44(hematopoietic cell marker), CD45(hematolineage cell marker), CD90(mononuclear stem cell marker), CD105(endothelial cell marker), 및 CD133(hematopoietic stem cell marker)들로 캐릭터라이제이션하여 FACS 분석에 적용할 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 수득된 바람직한 제대혈 유래 줄기세포는 하기 세포 표면 표지의 존재에 의해 규명될 수 있다: CD29, CD31, CD44, 및 CD45에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내고,　CD4, CD20, CD34, 및 CD51에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타낸다. 이러한 세포 표면 표지는 당해 분야에 익히 공지된 방법에 따라, 예를 들어 유세포분석기에 의해 일괄적으로 측정된 후 세척하고, 항-세포 표면 표지 항체로 착색된다.

또한, 본 발명의 제대혈 유래 줄기세포는 미분화상태의 세포 마커라고 할 수 있는 Oct4 또는 SSEA4의 마커를 이용하여 확인할 수 있다. Oct4는 줄기세포에서 미 분화상태 표지인자로써 잘 알려져 있고, 기술분야에서는 대한민국특허출원 제10-2004-0105716호 "인간 배아줄기세포에 특이적인 단일클론항체", 대한민국특허출원 제10-2004-0096780호 "포유류 배아 및 줄기세포의 미분화 상태 유지 Oct4 유전자 발현 억제용 이중나선 RNA", 대한민국특허출원 제10-2006-0092128호 "파골세포 기반 적소 유사 구조에 의해 증식능이 증가된 인간 제대혈 유래 다분화능 줄기세포 및 그 제조방법" 등에서 나타난 바와 같이, 미분화상태의 줄기세포임을 입증하기 위한 실험으로 Oct4 발현능 실험을 하는 것이 통상이다. 또한, SSEA4 (Stage Specific Embryonic Antigen 4)가 인간 배아줄기세포의 표면에 존재한다는 것도 당업자에게 이미 알려져있는 사실이다.

Oct4 및 SSEA4의 발현은 RT-PCR(Reverase Transcriptase-Polymerase Chain Reaction)을 이용한다. RT-PCR의 방법은 당분야에 공지되어 있는 기술이다. RT-PCR은 특정 부위의 RNA를 주형(template)로 하여 이에 상응하는 cDNA를 합성한 다음, 이를 이용하여 PCR 증폭을 시행하는 기술이며, 실험과정은 (1) 역전사효소(reverse transcriptase)를 이용하여 RNA로부터 cDNA를 제조하는 과정과 (2) cDNA를 이용하여 특정부위를 증폭시키는 과정으로 이루어지며 (2)과정은 게놈(genomic) DNA로부터 특정 유전자 부위를 증폭시키는 방법과 같다. 이 방법은 노던 블롯 하이브리다이제이션과 같은 방법을 통해 가능하던 RNA 분석보다 실험방법이 더욱 간단할 뿐만 아니라, 유전자의 염기서열 결정이 가능하기 때문에 주로 mRNA의 염기서열 및 전사량을 연구할 때 크게 도움이 되는 기술이다.

본 발명자가 분리한 성체 줄기세포도 Oct4 및SSEA-4에 양성반응을 나타낸다 (도 1). 즉, 배아 줄기세포의 특성을 보유하고 있는 성체 줄기세포인 것이다.

요컨대, 본 발명은 바람직한 일태양으로, 제대혈 유래 혈액에서 분리한 단핵세포를 bFGF, 페니실린, 스트렙토마이신, 글루타민 및 FBS를 함유하는 배지에서 배양한 다음 회수한, (a) Oct4 및 SSEA4 발현능을 가짐; (b) CD29, CD31, CD44, 및 CD45에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내고,　CD4, CD20, CD34, 및 CD51에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타냄; (c) 플라스틱에 부착되어 성장하며, 둥근형태(round-shape) 또는 선형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타냄; (d) 중배엽, 내배엽 및 외배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐; (e) 인슐린 분비 췌장 베타 유사세포로 분화되는 특성을 가지는 인간 제대혈 유래 성체 줄기세포를 제공한다.

4. 제대혈 유래 줄기세포의 췌장 베타세포로의 분화능 및 그 이용

본 발명에서는, 이미 공지된 배아줄기세포로부터 인슐린 생산 세포로의 분화 방법을 참조하되, 네스틴 양성세포의 선택없이 제대혈 유래 성체 줄기세포를 베타-유사세포로 분화시킨다. 5 내지 7일 후에, 일정 세포가 모여서 췌장 세포 유사구조를 형성한다(도 2).

네스틴은 원래 신경줄기세포의 특이 발현 단백질로 알려져 있고, 발생과정 중 뇌, 신경계에서만 특이 적으로 발현하는 것으로 알려져왔다. 그러나 최근들어, 췌장 및 안구유래의 줄기세포등에서 발현이 되어, 현재는 신경줄기세포 뿐만아니라 특정의 미분화된 세포의 마커로 이용되고 있다.

면역염색 결과 C-펩타이드(도 2A-a; 빨간색) 및 인슐린(도 2A-b; 녹색)이 검출된다. C-펩타이드 및 Oct4의 발현을 알아보기 위하여 웨스턴 블롯 분석을 수행할 수 있다. 본 발명의 췌장 세포 유사 구조는 인슐린 및 C-펩타이드 염색에서 양성 반응을 나타낸다.

분화 배지를 처리하지 않은 제대혈 유래 성체 줄기세포(대조군)에서는 C-펩타이드의 발현은 나타나지 않고 Oct4의 발현은 나타나는데 이러한 대조군과 비교해 볼때, 상기 웨스턴 블롯 분석 결과는 제대혈 유래 성체 줄기세포의 인슐린 생산 세포로의 성공적인 분화를 보여준다. 또한, C-펩타이드 발현은 상기 세포들에서 인슐린이 배지로부터 흡수되어져 나온다는 가능성을 배제시킨다.

C-펩타이드는 췌장 β세포의 인슐린 분비능을 알 수 있는 유용한 지표로서 호르몬 작용이 없으며, 방사면역 측정법으로 측정하여 C-펩타이드 면역반응도(C-peptide immunoreactivity, CRP)로 표현한다. C-펩타이드도 전구인슐린과 교차반응을 보이나 인슐린항체로 인한 간섭을 받지 않으므로 인슐린을 투여 받고 있는 환자에서는 유용한 검사 가운데 하나이다. C-펩타이드의 정상치는 공복시 1~2 ng/dL, 당부하시 4~6 ng/dL 이다

또한, 상기 분화들은 유세포 분석 또는 면역세포화학과 같은 기법을 사용하여 세포 표면 표지(예를 들어 조직-특이적 또는 세포-표지 특이적 항체로 세포를 염색함) 및 형태의 변화를 측정하면서, 광학 현미경 또는 공초점 현미경을 사용하여 세포의 형태를 조사함으로써, 또는 PCR 및 유전자-발현 프로파일과 같은 당해 분야에 익히 공지된 기법을 사용하여 유전자 발현상의 변화를 측정함으로써 확인될 수 있다.

본 발명의 제대혈 유래 줄기세포는, 줄기세포 또는 유래세포군집의 생착, 이식 또는 주입에 의해 강화, 치료 또는 대체되는 당뇨병의 치료 프로토콜에 사용될 수 있다. 상기 본 발명의 제대혈 유래 줄기세포는 인슐린 생산 세포 조직을 대체 또는 강화시켜, 새롭거나 변화된 조직이 되게 하거나 생물학적 조직 또는 구조와 결합시킬 수 있다. 또한, 전형적으로 배아 줄기세포가 사용되는 당뇨병 치료 프로토콜에서 배아 줄기세포는 본 발명의 제대혈 유래 줄기세포로 대체될 수 있다.

본 발명에서는 제대혈 유래 줄기세포만을 예시적으로 상세히 설명하였으나, 제대혈 유래 줄기세포 대신에 골수, 제대혈, 혈액, 간장, 피부, 위장관, 태반, 및 자궁 등의 다양한 인간조직 유래 성체 줄기세포를 대체하여 사용할 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

특히, 하기 설명 및 실시예에서는 제대혈 유래 줄기세포를 사용하고 있으나, 이 밖에도 골수, 제대혈, 혈액, 간장, 피부, 위장관, 태반, 및 자궁 등의 다양한 인간조직 유래 성체 줄기세포를 사용할 수 있다.

모든 통계학적 분석은 SPSS 버전 13 소프트웨어(SPSS Inc.;Chicago, IL, USA)를 사용하여 수행하였다.

실시예 1 : 제대혈에서 성체 줄기세포의 분리 및 배양

인간제대혈은 보라매 병원 임상시험심사위원회(IRB)에 의해 승인된 산모 동의하에 정상 분만후 즉시 제대정맥으로부터 얻었고, 이 실험은 서울대학교 생명윤리심의위원회에 의해 승인되었다. 제대혈-단핵세포(mononuclear cells, MNCs)는 표준 시험법에 따라 피콜-하이팩(ficoll-hypaque) 밀도구배 원심분리에 의해 단일 분만(parturient)로부터 헤파린 처리된 제대혈로부터 제조되었다.

수득한 세포에 10ng/ml의 bFGF(basic fibroblast growth factor)[R&D Sytem Minneapolis, MN], 100U의 페니실린, 1000U의 스트렙토마이신 및 2mM/L 글루타민(Gibco, grand island, NY)이 보충된, 20%의 FBS(Hyclone, Logan, UT) 및 DMEM 완전 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium)를 첨가하고 상기 세포 약 3~5 X 10⁸/ml를 플라스크 75 cm²에 도말하여 3일 동안 배양하였다. 3일 후에 현탁 세포를 새 75플라스크에 옮겼다. 7일 내지 10일 후에, 플라스크 바닥에 부착되어 있는 세포들은 합쳐져서 여러개의 콜로니가 나타났다. 3회 세척한 다음, 부착된 세포들에 트립신 처리(trypsinization)하여 10⁴/mL의 농도에서 새 용기(vessel)내로 계대배양하였다. 배양 후 7일마다, 적절한 양의 세포들이 분석에 사용되었다.

2주 후에, 일단 집합체(confluence) 및 콜로니(colony)가 형성되면, 세포들을 목적하던 용기 내로 계대배양하였다. 콜로니가 형성되면, 배양물은 면역 염색(immune-staining) 할 준비가 된 것이다. 인슐린 생산 세포를 단리한 경우에, 빽빽히 부착되어 있는 방추 모양 세포들이 떼어지지 않도록, 시간 조절 방식(time-controlled fashion)(3분 또는 5분)으로 바늘 또는 트립신 처리에 의해서 콜로니들을 제거하였다.

실시예 2: 제대혈 유래 다분화능 성체 줄기세포의 면역학적 특성

(1) 표면 항원 발현의 유세포분석(Flow cytometry analysis)

분리 후 UCB-유래 콜로니들의 표면 마커를 FACS 항체에 의해 분석하였다. 세포들을, CD4, CD20, CD29, CD34, CD44, CD45, CD90, CD105 및 CD133 항체(모두 Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA)와 결합된 형광물질 또는 피코에리스린(phycoerythrin)으로 염색하였다. 염색한 샘플들과 염색하지 않은 대조군 세포들을 각각 유세포분석기(FACS Calibur analyzer)에서 분석하였다.

그 결과, 아래에 표 1에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 제대혈 유래 줄기세포는 CD29 (85%), CD45 (78.44%), CD44 (92.09%), 및 CD31(90.53%)에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내고,　CD4, CD20, CD34, 및 CD51에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타냄을 알 수 있었다.

(2) 면역 조직 화학

상기 실시예 1에서 수득된 제대혈 유래 줄기세포를 PBS로 세 번 세척하고, 4% 파라포름 알데히드(paraformaldehyde)을 함유한 PBS로 30분간 고정하였다. PBS로 세 번 세척한 후, 0.1% Triton- X100(Gibco)을 함유한 PBS로 10분간 침투(permeabilization)시킨다. 실온에서 30분 동안 래빗 항-인간 Oct4(Rabbit anti-human Oct4; Santa Cruz Co, USA) 및 마우스 항-인간 SSEA-4(mouse anti-human SSEA-4; Santa Cruz Co, USA)을 일차항체로 사용하였다(1:200). 고트 항-래빗 IgG(goat anti-rabbit IgG;Santa Cruz Co, USA)가 결합된 레드-피코에리스린(Red-Phycoerythrin) 및 고트 항-마우스 IgG가 결합된 형광물질을 이차항체로 사용하였다.

Oct4 및 SSEA4 이중 면역염색 결과, 본 발명의 인간 제대혈 유래 성체 줄기세포는 Oct4 및 SSEA4를 발현한다는 것을 확인하였다(도 1)

실시예 3: 제대혈 유래 줄기세포의 인슐린 분비 췌장 베타 유사세포로의 분화

바늘 또는 트립신 처리에 의해 수득한 콜로니를 인산 완충액(PBS,Gibco)에서 0.1% 트립신(Gibco):0.08%EDTA(sigma, Germany)(1:1)을 1분동안 분리하여 원심분리에 의하여 수득하였다. 베타세포 분화나 FACS 분석을 위하여 수득한 세포들을 사용하였다. 췌장 베타 세포(인슐린생산 세포)로 분화를 위하여, 20nM 프로게스테론(progesterone); 100 M 푸트레신(putrescine); 1 g/mL 라미닌(laminin); 25 g/mL 인슐린(insulin); 30 nM 소듐 세레나이트(selenite); 10 mM 니코틴아미드(nicotinamide,NA) (모두 Sigma); 50 g/mL 트란스페린(transferrin); 5 g/mL 피브로넥틴(fibronectin); B27 배지 보충물(희석 1:50) (모두 Gibco); 및 15% FCS로 보충된 DMEM/F12 (Gibco)를 함유하는 "N2 배지+ NA"내에서 poly-L-ornithine/ laminin-코팅된 조직 배양접시에 다시 플레이트하였다. 24시간 뒤에 배지를 교환하고 세포들을 "N2 배지+ NA"와 거의 동일하고 DMEM/F12 (Gibco)를 고농도의 DMEM(Gibco)로 대체시킨 점만 다른 분화배지에서 배양하였다.

배양 5 내지 7일 후에, 배양된 세포를 면역염색한 결과, 일정 세포가 모여서 췌장 세포 구조를 형성함을 확인할 수 있었다(도 2의 c).

실시예 4: 인슐린 분비 췌장 베타 유사세포의 특성

상기 기술한 Oct4 및 SSEA 이중 면역염색(double immunostaining)의 경우(실시예 2)와 같이, 고정(fixation) 및 침투(permeabilization) 후에 인슐린 및 C-펩타이드(peptide)의 이중 면역염색을 위하여, 마우스 항-인간 인슐린(mouse anti-human insulin; abcam, MA, USA; 1:100)을 배양물에 일차항체로서 첨가하였다. 4℃에서 밤새 배양(incubation)한 후, 고트 항-래빗 IgG가 결합된 피코에리스린(PE)(Santa Cruz Co, USA) 및 고트 항-마우스 IgG가 결합된 형광물질을 이차항체로서 첨가하였다. 면역염색 결과 C-펩타이드(도 2의 a; 빨간색) 및 인슐린(도 2의b; 녹색)이 검출되었다.

또한, C-펩타이드 및 Oct4의 발현을 알아보기 위하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 췌장 베타세포 유사구조를 세포용해(lysis)시키고 고염 완충액[high salt buffer,20 mM HEPES, pH 7.5; 25% glycerol; 0.42 M NaCl; 3 mM MgCl2; 0.2 mM EDTA; 1mM dithiothreitol; protease inhibitor cocktail (Sigma; St. Louis, MO,USA)]에서 단백질을 추출하였다. 단백질을 15% SDS PAGE 겔상에서 분리시키고 니트로셀룰로오스로 옮겼다. C-펩타이드 단백질 및 Oct4 단백질이 마우스 단일클론 항체 및 화학 발광 시약(ECL; Amersham; Piscataway, NJ, USA)으로 검출되었다.

본 발명의 췌장 세포 유사 구조는 인슐린 및 C-펩타이드 염색에서 양성 반응을 나타냈지만, 분화 배지를 처리하지 않은 대조군에서는 C-펩타이드의 발현은 나타나지 않고 Oct4의 발현이 나타났다(도 3).

본 발명은 인간 제대혈로부터 성체 줄기세포를 분리하고, 그 줄기세포가 배아 단계 특이적인 마커인 SSEA-4 및 다능성 줄기세포 마커인 Oct4가 발현하는 사실에 근거하여, 인슐린과 C-펩타이드를 동시 발현하는 인슐린-생산 췌도세포-유사 구조로 유도하는 방법을 제공함으로써 당뇨병에 대한, 인간 제대혈 유래 줄기세포에 기초한 치료법에 매우 유용한 장점을 가진다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

분리된 인간 제대혈 유래 성체 줄기세포를, 네스틴 양성세포의 선택없이 푸트레신(putrescine), 피브로넥틴(fibronectin), 트란스페린(transferrin) 및 니코틴아미드(nicotinamide)를 함유하는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 인간 제대혈 유래 성체 줄기세포를 인슐린 분비 췌장 베타 유사세포로 분화시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 분리된 인간 제대혈 유래 성체 줄기세포는 다음과 같은 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법:

(a) Oct4 및 SSEA4 발현능을 가짐;

(b) CD29, CD31, CD44, 및 CD45에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내고,　CD4, CD20, CD34, 및 CD51에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타냄; 및

(c) 인슐린 분비 췌장 베타 유사세포로 분화되는 특성을 가짐.
삭제
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삭제
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제1항 또는 제2항의 방법에 의해 분화되고, 인슐린 및 C-펩타이드는 발현되지만 Oct4는 발현되지 않는 특성을 나타내는 인슐린 분비 췌장 베타 유사세포.
삭제
제8항의 인슐린 분비 췌장 베타 유사세포를 유효성분으로 함유하는 당뇨병 치료용 세포치료제.