KR102133689B1

KR102133689B1 - Manufacturing method of conjugate between lava seawater-originated minerals and dermabiotics-derived nucleotide, and functional dermabiotics cosmetic composition using the mineral-nucleotide

Info

Publication number: KR102133689B1
Application number: KR1020200022439A
Authority: KR
Inventors: 이창완; 양서진; 김두성; 김경민; 김예향; 차소윤; 최지휘; 이승훈
Original assignee: 에스케이바이오랜드 주식회사
Priority date: 2020-02-24
Filing date: 2020-02-24
Publication date: 2020-07-13

Abstract

The present invention relates to a method for producing a mineral-nucleotide conjugate derived from dermabiotics cultured in lava seawater. The mineral-nucleotide conjugate is not toxic to skin and has a function of regenerating skin cells, strengthening skin barriers, soothing skin, and maintaining skin flora, thereby being provided as a functional cosmetic composition or an external preparation for skin containing the same.

Description

용암해수 유래 미네랄과 더마바이오틱스 유래 뉴클레오티드의 결합체 제조방법 및 이를 이용한 기능성 더마바이오틱스 화장품 조성물 {Manufacturing method of conjugate between lava seawater-originated minerals and dermabiotics-derived nucleotide, and functional dermabiotics cosmetic composition using the mineral-nucleotide} Manufacturing method of lava seawater-derived minerals and dermabiotics-derived nucleotides and functional dermabiotics cosmetic composition using the mineral-nucleotides and functional dermabiotics cosmetic composition using the mineral-nucleotide }

본 발명은 피부노화(skin aging)의 내재적요인(intrinsic factors)과 외재적요인(extrinsic factors)을 동시에 해결하기 위해 유용 피부 미생물(더마바이오틱스, dermabiotics)을 천연미네랄 함량이 풍부한 용암해수를 배양용수로 사용하여 고농도 배양한 후, 균체를 회수하여 용암해수 미네랄 농축수 재배양을 통해 균체 내에 미네랄-뉴클레오티드를 대량 생성하게 하고 열압추출법을 통해 열 안정성이 우수한 미네랄-뉴클레오티드 결합체(conjugate)를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명에서는 열압추출 이후, 냉각원심분리를 통해 피부세포의 염증반응을 일으키는 균체 세포벽 성분(세포벽, 당지질, 지질단백질 등)을 막여과 방법을 통해 선택적으로 제거하여 미네랄-뉴클레오티드를 정제하는 방법을 제공하며, 이렇게 제조된 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체는 열 안정성이 있으며 피부 장벽강화와 관련된 기능성 단백질의 발현 및 제3의 피부층인 피부 마이크로바이옴의 조절 기능이 있음을 제시한다. The present invention is useful for solving both intrinsic factors and extrinsic factors of skin aging at the same time, useful skin microorganisms (dermabiotics, dermabiotics) are used as culture water for lava sea water rich in natural mineral content. After cultivation at high concentrations, the cells are recovered, and lava seawater mineral concentrated water is cultivated to generate a large amount of mineral-nucleotides in the cells, and heat-pressure extraction method is used to prepare a mineral-nucleotide conjugate having excellent thermal stability. It is about. In the present invention, after thermal pressure extraction, a method of purifying mineral-nucleotides by selectively removing cell wall components (cell walls, glycolipids, lipid proteins, etc.) that cause inflammatory reactions of skin cells through cooling centrifugation through membrane filtration methods Provided, Dermabiotics-derived mineral-nucleotide conjugate cultured in lava seawater thus prepared is thermally stable and suggests that it has the function of regulating the skin micro-biome, the third skin layer, and the expression of functional proteins related to skin barrier strengthening. do.

피부는 표피층, 진피층, 각질층 3개의 다층구조로 구성되어있으며 표피층은 피부 각질층 바로 아래에 있으며 투과장벽, 선천성 면역, 자외선에 대한 보호, 상처회복, 비타민 D의 합성의 기능을 담당하고 있고 진피층은 표피에 영양분을 공급하고 피부 재생을 담당하는 층으로 병원체 침입억제, 상처수복, 피부의 구조 및 탄력 유지의 기능을 한다. 피부 구조에서 가장 바깥에 위치한 각질층은 두께가 약 0.5mm의 아주 얇은 층으로 형성되어 있다. 사멸한 피부세포 25~30개로 구성된 각질층은 우리 피부를 보호하는 역할을 하며 각질형성세포(keratinocyte)의 분화는 기저세포의 분열-유극세포에서의 합성-과립세포에서의 자기분해과정-각질세포에서의 재구축 과정의 4단계로 구성되며 피부장벽을 형성한다. 이 피부장벽을 형성하는 과정은 젊은 피부를 기준으로 약 4주간의 세포재생(regeneration)이 일어난다. 피부는 외부로부터 오는 물리적, 화학적 자극으로부터 인체를 보호하는 역할을 하지만, 피부노화의 대표적 외재적 요인인 자외선에 지속적으로 노출되면 피부세포의 DNA를 손상시키고 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 생성하여 피부의 콜라겐 합성을 억제시키고 분해를 촉진하여 피부를 노화시켜 주름을 생성한다. 피부노화의 내재적 요인은 부모로부터 물려받은 유전적 요인에 따라 달라지는 것이 자연노화의 정설로 받아지고 있으나, 제3의 피부층으로 불리는 피부 마이크로바이옴(skin microbiome)의 변화에 따라 피부노화의 속도와 상태가 달라진다. The skin is composed of three layers of epidermal layer, dermal layer, and stratum corneum. The epidermal layer is directly under the stratum corneum and is responsible for the function of permeation barrier, innate immunity, protection against ultraviolet rays, wound healing, and synthesis of vitamin D. The dermal layer is the epidermis. It is a layer responsible for supplying nutrients to the skin and regenerating the skin. The outermost stratum corneum in the skin structure is formed of a very thin layer about 0.5 mm thick. The stratum corneum composed of 25 to 30 dead skin cells serves to protect our skin and the differentiation of keratinocytes is the division of basal cells-synthesis in polar cells-autolysis in granule cells-in keratinocytes It consists of 4 stages of the rebuilding process of and forms a skin barrier. In the process of forming this skin barrier, cell regeneration occurs for about 4 weeks based on young skin. Skin protects the human body from physical and chemical stimuli from the outside, but when exposed to ultraviolet rays, a representative external factor of skin aging, it damages the DNA of skin cells and releases reactive oxygen species (ROS). To inhibit the collagen synthesis of the skin and accelerate the decomposition, thereby aging the skin to create wrinkles. Although it is accepted as the theory of natural aging that the internal factors of skin aging depend on genetic factors inherited from parents, the rate and condition of skin aging due to changes in skin microbiome called the third skin layer Is different.

또한, 지역과 인종 그리고 연령에 따른 피부상태와 유형이 상이함에 대하여 통계적으로 확인된 보고가 있다. Kompaore 등(Skin Pharmacol.,1993;6: 200-207) 은 아시아인, 백인, 흑인에 대해서 경피 수분 손실량을 측정한 결과, 백인보다 아시아인과 흑인이 더 높게 나타났다고 보고한 바 있으며, Man 등(Skin Pharmacol. Physiol.,200;22:190-199)은 중국인 남성과 여성의 연령대별 피지량을 측정한 결과, 여성의 이마가 남성의 이마보다 피지량이 낮았으며 여성의 경우 30대 이후 크게 감소하는 경향을 보였으나 남성의 경우 50대까지 비슷한 경향을 보이다가 점차 감소한 것으로 보고하였다. Marrakchi 등 (Contact dermatitis, 2007;57:28-34) 은 24~34세로 이루어진 청년층과 66~83세로 이루어진 노년층의 수분량, 피지량 등을 비교한 결과 청년층의 수분량이 이마, 뺨에서 노년층보다 높았으며, 피지량은 청년층과 노년층에서 큰 차이가 없었다고 보고한 바 있다.In addition, there have been statistically confirmed reports of differences in skin condition and type according to region, race, and age. Kompaore et al. (Skin Pharmacol., 1993;6: 200-207) reported percutaneous moisture loss in Asians, Caucasians and African Americans, and reported that Asians and African Americans were higher than Caucasians. Skin Pharmacol.Physiol.,200;22:190-199) measured sebum levels by age group in Chinese men and women, and women's foreheads had lower sebum levels than men's foreheads, and women tended to decrease significantly after their 30s. However, males reported similar tendencies until their 50s, and then gradually decreased. Marrakchi et al. (Contact dermatitis, 2007; 57:28-34) compared the moisture content and sebum content of young people aged 24 to 34 with those aged 66 to 83. As a result, the moisture content of young people was higher than that of older people on the forehead and cheeks. The amount of sebum was reported to have no significant difference between the young and old.

국가별 피부특성은행 구축 사업보고서에 따르면, 한국인의 경우 여성 피부 유형은 복합성>건성>중성>지성 순이며, 남성 피부 유형은 지성>복합성>중성>건성 순으로 차이를 보였다.According to the national skin characteristics bank construction business report, in the case of Koreans, female skin types were in the order of complexity>dry>neutral>oily, and male skin types were in the order of oily>complex>neutral>dry.

최근 연구 주제로 각광 받고 있는 피부 마이크로바이옴(Skin microbiome)은 피부에 분포하는 상재균총의 생태계를 의미하며 주로 스테필로코커스(Staphylococcus) 속, 프로피오니박테리움(Propionibacterium) 속 등의 피부에 존재하는 미생물이 피부세포와 상호 작용을 통한 균형을 유지하여 건강한 피부상태를 유지시켜 주는 것으로 보고되고 있다. 피부 마이크로바이옴을 구성하는 상재균총은 연령대, 여자와 남자, 인종, 사는 지역에 따라 상이하게 나타나며, 특히 연령대별 피부 우점종이 피부건강을 유지시키는 것으로 보고되고 있다. Skin microbiome, which has been spotlighted as a topic of recent research, refers to the ecosystem of the flora that is distributed in the skin, and is mainly present in the skin of the genus Staphylococcus , Propionibacterium , etc. It is reported that microorganisms maintain a healthy skin condition by maintaining a balance through interaction with skin cells. The skin flora that constitutes the skin microbiome varies depending on the age group, woman and man, race, and region of residence, and it is reported that skin dominant species by age group maintain skin health.

최근 산업계에서는 미생물을 핵심소재로 활용한 화장품이 개발되면서 미생물을 파쇄물 형태(lysate)로 제조하여 화장품에 사용하여 미생물 크기로 인한 피부투과문제, 방부제에 의한 사멸문제, 경쟁적 저해문제를 회피하여 피부 속 면역수용체들과 직접 반응하여 피부장벽 등의 개선하고자 하였다. 시판되는 미생물을 이용한 원료들 중 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속이나 락토바실러스(Lactobacillus) 속의 유산균을 피부에 사용하는 원료들로 시판되고 있는데 그 중, 비피다발효농축물 등이 대표적인 예로 유산균 세포 파쇄물을 주성분으로 하고 있다. 그러나 세포 구성성분 중 피부와 면역반응을 일으키는 것으로 알려져 있는 성분인 펩티도글리칸(peptidoglycan), 당지질(lipopolysaccharide), 지질단백질(lipoprotein) 등이 세포벽에 존재하는데 이 성분이 과다할 경우 피부발진, 아토피, 홍반 등의 피부 트러블을 일으킬 수 있다. 또한 세포질 내 유효성분인 미생물 뉴클레오티드(bacterial nucleotides)의 열 안정성이 Tm값(DNA 이중나선이 풀리는 온도) 기준으로 70~105℃ 이므로 세포벽을 완전히 파쇄할 수 있는 온도인 121℃ 이상을 적용하기에는 유효성분 변성이 되어 피부장벽개선에 도움이 되지 않게 된다. 또한 피부보호작용을 위한 미생물 소재의 응용에서 문제점 중 다른 하나는 세포 파쇄물을 피부에 적용 시, 피부 상재균총에게는 선택적 생장인자(growth factors)가 아니기 때문에 피부 유해균이 이를 생장영양원으로 사용한다면 건강한 피부 마이크로바이옴의 균형이 깨지게 된다. 현재 국제화장품 원료로 등재되어 있는 각종 미생물 세포 파쇄물은 인간의 피부 마이크로바이옴에 영향을 미칠 수 있는 조정제 단위의 성분이 다량 함유되어있기 때문에 피부 마이크로바이옴의 불균형 문제는 해결되지 않고 있다. Recently, with the development of cosmetics using microorganisms as a core material in the industry, the microorganisms are manufactured in lysate and used in cosmetics to avoid skin penetration problems caused by microbial size, problems caused by preservatives, and competitive inhibition problems. It was intended to improve skin barriers by directly reacting with immunoreceptors. Of using a commercially available microbial material Bifidobacterium (Bifidobacterium) in or Lactobacillus bacteria (Lactobacillus) There are commercially available as the material used for the genus of lactic acid bacteria to the skin of which, bipyridinium the lactic acid bacteria cell lysate Examples include fermentation concentrate representative It has as a main component. However, among the cell components, peptidoglycans (peptidoglycan), glycolipids (lipopolysaccharide), and lipoproteins, which are known to cause an immune reaction with the skin, are present in the cell wall. , May cause skin problems such as erythema. In addition, since the thermal stability of bacterial nucleotides, which are active ingredients in the cytoplasm, is 70-105°C based on the Tm value (the temperature at which the DNA double helix is released), it is an effective ingredient to apply at least 121°C, the temperature that can completely break the cell wall. It becomes denatured and does not help improve the skin barrier. In addition, one of the problems in the application of the microbial material for skin protection is that it is not a selective growth factor for the skin bacterial flora when applying cell debris to the skin, so if harmful skin is used as a growth nutrient, healthy skin micro The balance of the biome is broken. Various microbial cell debris currently listed as ingredients for international cosmetics do not solve the imbalance problem of skin microbiome because they contain a large amount of the components of the regulator unit that can affect human skin microbiome.

용암해수는 바닷물이 현무암층과 사니질층에 자연여과 되면서 지층 안으로 흘러 들어 오랜 기간 숙성된 물로서, 제주도만이 보유한 독특한 수자원이며, 제주에서는 1980년대부터 용암해수의 저온성, 청정성 등의 특성으로부터 용암해수를 넙치 양식장의 사육수로 활발히 사용하여 왔으며, 5~6년 전부터는 건강, 미용 등의 측면에서 사우나 등의 용수로 사용되며 각광을 받고 있다. 용암해수는 사용목적에 따라 염분을 제거한 탈염 용암해수를 이용하거나 채취한 상태 그대로를 사용하기도 한다. Lava seawater is water that has been aged for a long time as the seawater is naturally filtered into basalt and sandy layers and matured for a long time.It is a unique water resource possessed only by Jeju Island. In Jeju, lava seawater has been developed from the characteristics of low temperature and cleanliness of lava seawater since 1980s. Has been actively used as a breeding water for halibut farming, and has been in the spotlight since it was used as water for saunas in terms of health and beauty since 5-6 years ago. Depending on the purpose of use, lava seawater may be used as desalted lava seawater from which salt has been removed or as it is collected.

용암해수에는 일반 해수나 심층수, 삼다수보다 나트륨, 마그네슘, 칼슘, 칼륨 등의 필수 미네랄뿐만 아니라 일반 유용 미네랄 성분들(철, 망간, 아연, 몰리브덴, 셀레늄 등)이 더 많이 함유되어 있다. 그 중에서도 인슐린 분비를 안정시키거나 당뇨병, 고지혈증 등의 개선효과가 있다고 알려진 바나듐, 혈액순환 촉진, 면역력 증강, 항암작용을 갖는 게르마늄, 지방의 산화작용억제, 심장과 간을 유지하는 상승효과, 라디칼 소거능력, 항암, 불임, 노화 및 콜레스테롤 수치 개선효과가 있는 셀레늄의 함유는 해양심층수에서도 보고된 적이 없는 용암해수만의 특징이다. 게다가 이들 미네랄은 이온화된 상태에 있으며, 이온화된 미네랄은 인체나 타 동물에 대해 소화흡수가 용이하다. 또한, 용암해수는 대장균, 질산성질소, 인산염인, 페놀류 등이 검출되지 않은 청정한 지하수 자원이며, 비소, 수은, 카드늄 등 유해성분이 검출되지 않거나 납이 극히 미량이 검출되기 때문에 산업화 적용에 장애요인이 없는 청정 원료이다. 특히, 용암해수에 포함된 마그네슘, 칼슘 등의 미네랄은 더마바이오틱스의 증식에 반드시 필요한 원소이며, 사람에게도 필수 영양소로 섭취를 권장하고 있다. Lava seawater contains more essential minerals (sodium, manganese, zinc, molybdenum, selenium, etc.) as well as essential minerals such as sodium, magnesium, calcium, and potassium than ordinary seawater, deep water, and samdasoo water. Among them, vanadium, which is known to stabilize insulin secretion or improve diabetes, hyperlipidemia, etc., promote blood circulation, enhance immunity, germanium with anticancer activity, inhibit oxidation of fat, synergistic effect to maintain heart and liver, radical scavenging The inclusion of selenium, which has the effect of improving ability, anti-cancer, infertility, aging and cholesterol levels, is characteristic of lava seawater that has never been reported in deep ocean water. In addition, these minerals are in an ionized state, and the ionized minerals can be easily digested and absorbed by the human body or other animals. In addition, lava seawater is a clean groundwater resource in which E. coli, nitrate nitrogen, phosphate phosphorus, phenols, etc. are not detected, and harmful elements such as arsenic, mercury, and cadmium are not detected, or trace amounts of lead are detected, which causes obstacles to industrial application. There is no clean raw material. In particular, minerals such as magnesium and calcium contained in lava seawater are essential elements for the proliferation of Dermabiotics, and it is recommended for human consumption as an essential nutrient.

용출된 DNA는 분해 요소 중 온도에 의한 변성값(melting Temperature(Tm))을 가지고 있는데, 이는 Double strand DNA가 single strand DNA로 되는 온도 변화에 있어 그 중간 값을 지칭한다. 세포파쇄 후 용출된 DNA는 기존 알려진 Tm값들 70~105℃로 이 온도 조건에서 뉴클레오티드로 분해하게 되고 이들은 퓨린과 피리미딘으로 이뤄져 내부 수소 결합에 의해서 뉴클레오티드 간의 안정화를 시킨다. 하지만 분해된 뉴클레오티드는 구성요소 중 인산기는 강한 음전하를 띄고 있어 서로 반발력을 가지고 있다. 이러한 특징을 가진 뉴클레오티드를 추출하기 위해 세포벽 및 세포질을 파쇄를 위해 Tm값 70~105℃ 보다 높은 온도 121℃의 열압조건에서도 뉴클레오티드가 안정한 상태를 유지를 해야 한다. The eluted DNA has a melting temperature (Tm) among the decomposition elements, which refers to the intermediate value in the temperature change from double strand DNA to single strand DNA. After cell crushing, the eluted DNA is decomposed into nucleotides at this temperature condition with known Tm values of 70 to 105°C, and these are composed of purine and pyrimidine to stabilize between nucleotides by internal hydrogen bonding. However, the decomposed nucleotides have a strong negative charge among the components, so they have repulsion. In order to extract nucleotides having these characteristics, in order to crush cell walls and cytoplasm, the nucleotides must be maintained in a stable state even at a thermal pressure of 121° C. higher than the Tm value of 70 to 105° C.

이에 본 발명자들은 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스로부터 분리된 미네랄-뉴클레오티드가 기존의 일반 배지에서 배양된 더마바이오틱스 유래 뉴클레오티드에 비해 피부장벽 강화와 피부 손상 억제 기능이 현저하게 우수함을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다. Accordingly, the present inventors confirmed that mineral-nucleotides isolated from Derma Biotics cultured in lava seawater have significantly better skin barrier strengthening and skin damage suppression function than Derma Biotics-derived nucleotides cultured in conventional medium. Was completed.

대한민국 등록특허 제10-1347694호 (발명의 명칭 : 탈염 용암해수의 발효물의 제조 방법과 그 방법에 의하여 얻어진 발효물 및 그 발효물을 이용한 화장료 조성물, 출원인 : 재단법인 제주테크노파크, 등록일 : 2013년12월27일)Republic of Korea Registered Patent No. 10-1347694 (Invention name: Method for manufacturing fermentation product of desalted lava seawater and cosmetic composition using the fermentation product obtained by the method and the fermentation product, Applicant: Jeju Techno Park, Foundation Date: December 2013 Month 27) 대한민국 등록특허 제10-1693574호 (발명의 명칭 : 틴달화 유산균 사균체를 유효성분으로 포함하는 피부 보습 또는 주름개선용 조성물, 출원인 : 한국 한의학 연구원, 등록일 : 2017년01월02일)Republic of Korea Registered Patent No. 10-1693574 (Invention name: Composition for improving skin moisturizing or wrinkles, which contains a tindalized lactic acid bacterium as an active ingredient, Applicant: Korea Institute of Oriental Medicine, Registration Date: January 02, 2017)

Zakostelska Z, Kverka M, Klimesova K, Rossmann P, Mrazek J, et al. (2011) Lysate of Probiotic Lactobacillus casei DN-114 001 Ameliorates Colitis by Strengthening the Gut Barrier Function and Changing the Gut Microenvironment. PLoS ONE 6(11)Zakostelska Z, Kverka M, Klimesova K, Rossmann P, Mrazek J, et al. (2011) Lysate of Probiotic Lactobacillus casei DN-114 001 Ameliorates Colitis by Strengthening the Gut Barrier Function and Changing the Gut Microenvironment. PLoS ONE 6(11)

본 발명의 목적은 천연미네랄 함량이 풍부한 용암해수를 별도의 전처리 없이 더마바이오틱스를 증식시키는 배양용수로 사용하여 더마바이오틱스의 세포질 내에 용암해수 유래 천연미네랄이 축적 되면서 미네랄-뉴클레오티드 결합체의 생성을 유도하는 기술을 제공하는 데에 있다.An object of the present invention is to use natural nutrient-rich lava seawater as a culture water to proliferate Dermabiotics without additional pre-treatment to induce the generation of mineral-nucleotide complexes as natural minerals derived from lava seawater accumulate in the cytoplasm of Dermabiotics. It is about providing technology.

상기 미네랄-뉴클레오티드 결합체는 더마바이오틱스의 열압추출 공정을 통해 제조하여 열 안정성이 우수하고, 이를 통해 기존보다 피부장벽 강화 기능과 자외선으로 인한 피부 세포의 보호 효과가 있으며, 피부 마이크로바이옴을 조절하여 피부상태를 개선한다. The mineral-nucleotide complex is manufactured through the thermal pressure extraction process of Derma Biotics, and thus has excellent thermal stability. Through this, it has a skin barrier strengthening function and a protective effect of skin cells due to ultraviolet rays, and by controlling the skin microbiome. Improve skin condition.

본 발명은 (제1단계) 용암해수를 배양용수로 이용한 배지에서 더마바이오틱스를 배양하여 1차 배양액을 얻는 단계;The present invention (first step) culturing Derma Biotics in a medium using lava seawater as culture water to obtain a primary culture solution;

(제2단계) 상기 배양액으로부터 균체를 회수한 후, 용암해수 미네랄 농축수에 배양하여 2차 배양액을 얻는 단계; 및(Second step) After recovering the cells from the culture medium, culturing in lava seawater mineral concentrate to obtain a secondary culture medium; And

(제3단계) 상기 2차 배양액을 열압추출 및 냉각정제하여 미네랄-뉴클레오티드가 포함된 상등액을 회수하는 단계;(3rd step) recovering the supernatant containing the mineral-nucleotide by extracting and cooling and purifying the secondary culture solution by thermal pressure;

를 포함하는 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체의 제조방법에 관한 것이다. It relates to a method for producing a mineral-nucleotide conjugate derived from Derma Biotics cultured in lava seawater containing a.

상기 제1단계의 배지는 구성 성분으로서, 포도당, 효모추출물, 소이펩톤, 카제인이 포함되고, 상기 구성 성분을 용암해수가 30~70%(v/v) 포함된 물에 용해하고 멸균한 배지인 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 제1단계의 배지는 총 부피 1ℓ 기준, 포도당 1~5%(w/v), 효모추출물 0.5~5%(w/v), 소이펩톤 0.5~5%(w/v), 카제인 0.5~3%(w/v)가 되도록 각 성분을 용암해수가 30~70%(v/v) 포함된 물에 용해하고 멸균하여 준비된 증식 배양용 배지일 수 있다. The medium of the first step is a medium containing glucose, yeast extract, soypeptone, and casein, and dissolving the component in water containing 30 to 70% (v/v) of lava seawater and sterilizing the medium. It is characterized by. Preferably, the medium in the first step is 1 to 5% (w/v) glucose, 0.5 to 5% (w/v) yeast extract, 0.5 to 5% soypeptone (w/v), casein Each component may be a medium for propagation culture prepared by dissolving and sterilizing each component in water containing 30 to 70% (v/v) of lava seawater so as to be 0.5 to 3% (w/v).

상기 제1단계의 배양 시, 10 내지 50%(w/v)의 포도당 및 10 내지 50%(w/v)의 수산화나트륨 혼합 용해액을 적하하여 배양 중 pH를 6.0~7.5로 유지하는 방법을 이용할 수 있다. 이 혼합 용해액은 각각 포도당 용액과 수산화나트륨 용액을 1:0.5 내지 1:2의 부피비로 혼합한 것일 수 있다. When incubating the first step, 10 to 50% (w/v) of glucose and 10 to 50% (w/v) of sodium hydroxide mixed solution are added dropwise to maintain a pH of 6.0 to 7.5 during culture. Can be used. The mixed solution may be a mixture of glucose solution and sodium hydroxide solution in a volume ratio of 1:0.5 to 1:2, respectively.

상기 제1단계 배양에 적용되는 더마바이오틱스는 락토바실러스 속 (Lactobacillus sp.), 비피도박테리움 속 (Bifidobacterium sp.), 스트렙토코커스 속 (Streptococcus sp.), 락토코커스 속 (Lactococcus sp.), 엔테로코커스 속 (Enterococcus sp.), 페디오코커스 속 (Pediococcus sp.), 바이셀라 속 (Weissella sp.), 사카로마이세스 속 (Saccharomyces sp.), 바실러스 속 (Bacillus sp.), 스테필로코커스 속 (Staphylococcus sp.) 및 프로피오니박테리움 속 (Propionibacterium sp.)으로 이루어진 군에서 하나 이상의 균주일 수 있다. Dermabiotics applied to the first step culture is Lactobacillus sp., Bifidobacterium sp., Streptococcus sp., Lactococcus sp., Enterococcus sp., Pediococcus sp., Weissella sp., Saccharomyces sp., Bacillus sp., Staphylococcus It may be one or more strains from the group consisting of the genus ( Staphylococcus sp.) and the genus Propionibacterium sp.

상기 제2단계의 용암해수 미네랄 농축수는 1L당 칼슘 220mg 이상, 마그네슘 1,130mg 이상, 셀레늄 0.013mg 이상이 포함되도록 용암해수를 감압농축 또는 삼투농축하여 얻은 미네랄수인 것을 특징으로 한다. The lava seawater mineral concentrate in the second step is characterized in that it is mineral water obtained by concentrating the lava seawater under reduced pressure or osmosis to include more than 220mg of calcium per 1L, more than 1,130mg of magnesium, and 0.013mg of selenium.

상기 제3단계의 열압추출은 120~130℃, 0.12~0.30MPa에서 15~200분간 수행할 수 있다. The thermal pressure extraction of the third step may be performed at 120 to 130° C. and 0.12 to 0.30 MPa for 15 to 200 minutes.

상기 제3단계의 냉각정제는 3~5℃로 유지된 상태에서 3,000~8,000 rpm에서 10~30분간 원심분리하여 수행할 수 있으며, 이 후, 200 nm 이하의 기공크기(pore size)를 갖는 나노막을 이용한 여과공정을 이용하여 미네랄-뉴클레오티드 결합체를 수거할 수 있다. 상기 나노막의 기공크기는 바람직하게는 20~200 nm일 수 있다. Cooling and purification of the third step can be performed by centrifugation at 3,000 to 8,000 rpm for 10 to 30 minutes while being maintained at 3 to 5°C, and thereafter, nano having a pore size of 200 nm or less. Mineral-nucleotide conjugates may be collected using a membrane filtration process. The pore size of the nano-membrane may be preferably 20 to 200 nm.

상기 제3단계의 상등액 내의 뉴클레오티드의 농도 범위는 200~2,000㎍/㎖일 수 있다. The concentration range of the nucleotide in the supernatant of the third step may be 200 to 2,000 μg/ml.

상기 제3단계의 상등액 내의 미네랄-뉴클레오티드에 칼슘 50~200 mg/L, 마그네슘 300~800 mg/L, 셀레늄 0.001~0.01 mg/L가 포함되는 것이 바람직하다. The mineral-nucleotide in the supernatant of the third step preferably contains 50 to 200 mg/L of calcium, 300 to 800 mg/L of magnesium, and 0.001 to 0.01 mg/L of selenium.

본 발명은 상기 방법으로 제조한 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체를 제공하며, 상기 결합체를 포함하는 피부장벽 강화용 화장료 조성물을 제공한다.The present invention provides a dermabiotics-derived mineral-nucleotide conjugate cultured in lava seawater prepared by the above method, and provides a cosmetic composition for strengthening the skin barrier comprising the conjugate.

상기 결합체 또는 이를 함유하는 화장료 조성물은 SPT(Serine palmitolytransferase), Filaggrin, Claudin-1의 발현을 증강시켜 피부장벽을 강화하는 것을 특징으로 한다. The conjugate or a cosmetic composition containing the same is characterized by enhancing the expression of SPT (Serine palmitolytransferase), Filaggrin, and Claudin-1 to strengthen the skin barrier.

상기 결합체 또는 이를 함유하는 화장료 조성물은 UV 손상에 따른 피부세포의 회복 효능이 더 있는 것을 특징으로 한다. 상기 화장료 조성물은 PGC-1α(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α)의 발현을 증강시켜 피부세포의 회복 효능이 있는 것을 특징으로 한다.The combination or the cosmetic composition containing the same is characterized in that it has a more effective efficacy of skin cells due to UV damage. The cosmetic composition is characterized by enhancing the expression of PGC-1α (Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α), which has the effect of restoring skin cells.

상기 결합체 또는 이를 함유하는 화장료 조성물은 피부 마이크로바이옴의 균총을 조절하는 효능이 더 있을 수 있다. 특히, 상기 피부 마이크로바이옴으로서 피부 상재균인 스테필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)와 큐티박테리움 아크네스(Cutibacterium acnes)의 균수를 증가하게 하거나 항상성이 유지되는 효능이 있다. The conjugate or cosmetic composition containing the same may further have an effect of controlling the microflora of the skin microbiome. In particular, as the skin microbiome, there is an effect of increasing the number of bacteria of the skin flora, Staphylococcus epidermidis and Cutibacterium acnes , or maintaining homeostasis.

본 발명은 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체의 제조방법 및 상기 결합체를 함유하여 제조한 피부 장벽강화 기능, 피부 마이크로바이옴 조절 기능 및 열 안정성이 우수한 화장료 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to a method for preparing a dermabiotics-derived mineral-nucleotide conjugate cultured in lava seawater and a cosmetic composition having excellent skin barrier strengthening function, skin microbiome control function and thermal stability prepared by containing the conjugate.

이를 위해 탈염되지 않은 용암해수를 더마바이오틱스 배양을 위한 1차 배양용수로 적용하여 내재된 천연미네랄을 통해 더마바이오틱스의 고농도 증식을 유도하고 이후 더마바이오틱스 균체를 회수하여 용암해수 미네랄 농축수를 이용해 2차 배양한다. 이로써 더마바이오틱스 세포질 내에 미네랄 축적 및 세포질 내 존재하는 세포활성화 물질인 뉴클레오티드 및 구성체, 예를 들어 DNA, RNA, 리보솜, 소포체들의 물질량 증가와 용암해수 내 미네랄이온과 뉴클레오티드의 결합체를 얻을 수 있고, 이를 열압추출을 통해 수거함으로 열 안정성이 우수한 미네랄-뉴클레오티드 결합체를 고농도로 수거할 수 있다. 이후 기공크기가 200 나노미터(nanometer) 이하인 나노막 필터를 이용한 여과공정을 통해 피부 및 마이크로바이옴의 독성과 원료의 발효취 생성에 영향을 미치는 더마바이오틱스의 세포벽, 세포질, 단백질 및 단백질염 성분을 효과적으로 제거함으로써 정제된 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체를 제조하여, 이를 피부독성이 없고 피부 세포 재생, 피부장벽 강화, 피부 진정효과, 피부 상재균총의 유지가 가능한 화장료 조성물, 이의 의약품의 피부외용제 등으로 제공할 수 있다. To this end, demineralized lava seawater is applied as the primary culture water for cultivation of Dermabiotics to induce high-density proliferation of Dermabiotics through intrinsic natural minerals, and then recover Dermabiotics cells to use lava seawater mineral concentrate. Second culture. By doing so, it is possible to obtain mineral accumulation in the dermabiotics cytoplasm and increase the amount of substances of nucleotides and constructs, such as DNA, RNA, ribosomes, and vesicles, which are the cell-activating substances present in the cytoplasm, and obtain a combination of mineral ions and nucleotides in lava seawater, By collecting through thermal pressure extraction, mineral-nucleotide conjugates having excellent thermal stability can be collected at a high concentration. The cell wall, cytoplasm, protein and protein salt components of Derma Biotics affect the toxicity of skin and microbiome and the production of fermentation odor of raw materials through a filtration process using a nano-membrane filter having a pore size of 200 nanometers or less. By effectively removing the Dermabiotics-derived mineral-nucleotide complex cultured in purified lava seawater, it has no skin toxicity and is capable of skin cell regeneration, skin barrier strengthening, skin soothing effect, and skin cosmetic composition maintenance. It can be provided as an external skin preparation for pharmaceuticals.

도 1은 본 발명에 따른 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체의 제조방법을 나타내는 공정도이다.
도 2은 실시예 1과 비교예 1의 용암해수 농도별 배지에 배양된 배양액 내의 더마바이오틱스 생균수 및 상기 더마바이오틱스로부터 추출된 뉴클레오티드의 상관관계를 비교한 결과 그래프이다.
도 3은 배양용수로서 용암해수 30(v/v)% 에서 배양된 1차 배양액에 이후의 2차 배양을 일반상수 또는 용암해수 미네랄 농축수로 차별화하여 수행한 후 얻은 더마바이오틱스의 열압추출 시간에 따라 수득된 상등액 내 뉴클레오티드의 농도를 비교한 결과 그래프이다.
도 4는 MTT assay를 통해 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체가 처리 농도 5(v/v)%까지 세포독성이 없음을 확인한 결과 그래프이다.
도 5는 JC-1 staining 측정을 통해 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체가 UVB에 조사된 fibroblast cell의 mitochondrial function 활성화를 통해 세포의 회복효과를 유전자 발현을 통해 확인한 결과이다.
도 6은 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체가 피부 노화시 감소되는 PGC-1α의 발현을 UVB로 처리된 fibroblast cell에서 증가시키는 결과를 확인한 그래프이다.
도 7은 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체가 ceramide 합성 관련 효소 Serine palmitolytransferase(SPT) 유전자 발현(a); filaggrin 유전자 발현(b) 및 단백질 발현(c); 및 Tight Junction protein(TJ protein)에 대한 claudin-1 유전자 발현(d);의 촉진 기능을 통해 피부장벽 강화 기능이 있음을 확인한 결과이다.
도 8은 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체에 의한 피부 상재균의 증식을 확인한 평가 결과이다.
도 9는 종래 기술을 이용한 균체 파쇄물 내 뉴클레오티드(제조예 2)와 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체의 대량생산 샘플 사진이다.
도 10a와 도 10b는 종래 기술을 이용한 균체 파쇄물 내 뉴클레오티드(제조예 2)와 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체의 순도를 UV값으로 측정한 결과이다.
도 11은 더마바이오틱스로 적용이 가능한 다양한 균주들로 제조한 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체의 filaggrin 유전자 발현 비교를 통해 피부장벽 강화 효능을 확인한 결과이다.1 is a process diagram showing a method for producing a mineral-nucleotide conjugate derived from Derma Biotics cultured in lava seawater according to the present invention.
FIG. 2 is a graph comparing the correlation between the number of Dermabiotics viable cells and nucleotides extracted from the Dermabiotics in the culture medium cultured in the lava seawater concentration medium of Example 1 and Comparative Example 1.
FIG. 3 shows the thermal pressure extraction time of Derma Biotics obtained after differentiating the secondary culture after the primary culture incubated in lava seawater 30 (v/v)% as cultured water with normal constant or lava seawater mineral concentrate. It is a graph comparing the concentration of nucleotides in the supernatant obtained according to.
Figure 4 is a graph confirming that Derma Biotics-derived mineral-nucleotide conjugates cultured in lava seawater through MTT assay have no cytotoxicity up to a treatment concentration of 5 (v/v)%.
Figure 5 is a result confirming the cell's recovery effect through gene expression by activating the mitochondrial function of the fibroblast cell irradiated with UVB, dermabiotics-derived mineral-nucleotide conjugate cultured in lava seawater through JC-1 staining measurement.
6 is a graph confirming the result of increasing the expression of PGC-1α, which is reduced by derma biotics-derived mineral-nucleotide conjugates cultured in lava seawater, in UVB-treated fibroblast cells.
7 is a dermabiotics-derived mineral-nucleotide conjugate cultured in lava seawater, a ceramide synthesis-related enzyme Serine palmitolytransferase (SPT) gene expression (a); filaggrin gene expression (b) and protein expression (c); And Tight Junction protein (TJ protein) for claudin-1 gene expression (d); is a result of confirming that the skin barrier strengthening function through the promoting function.
8 is an evaluation result confirming the proliferation of dermatophytes by derma biotics-derived mineral-nucleotide conjugates cultured in lava seawater.
Figure 9 is a photograph of a mass production sample of nucleotides (Preparation Example 2) and derma biotics-derived mineral-nucleotide conjugates cultured in lava seawater using a prior art technique.
10A and 10B are results obtained by measuring the purity of nucleotides (Preparation Example 2) and derma biotics-derived mineral-nucleotide conjugates cultured in lava seawater using a conventional technique as UV values.
11 is a result of confirming the effect of strengthening the skin barrier through a comparison of filaggrin gene expression of dermabiotics-derived mineral-nucleotide conjugates cultured in lava seawater prepared with various strains applicable to dermabiotics.

본 발명은 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체의 제조방법에 관한 것이다. The present invention relates to a method for preparing a mineral-nucleotide conjugate derived from Dermabiotics cultured in lava seawater.

보다 더 바람직하게는, 상기 제조방법은, Even more preferably, the manufacturing method,

(a) 용암해수를 이용한 고농도 더마바이오틱스 생산단계(a) Production stage of high concentration derma biotics using lava seawater

용암해수가 30~70%(v/v) 포함된 물을 배양용수로 이용하여 제조된 배양용 배지를 준비하고 균체를 접종하여 1x10¹⁰ CFU/ml 단위 이상의 생균 배양액을 얻는 1차 배양 단계; A primary culture step of preparing a culture medium prepared by using water containing 30-70% (v/v) of lava seawater as the culture water, and inoculating the cells to obtain a viable culture solution of 1x10 ¹⁰ CFU/ml or more;

(b) 더마바이오틱스 균체 내 미네랄-뉴클레오티드 결합체 형성단계(b) Formation of mineral-nucleotide complex in Dermabiotics cells

상기 배양액에서 더마바이오틱스 균체를 회수 후, 용암해수 미네랄 농축수만 함유된 제한배지(칼슘 220mg/L, 마그네슘 1,130mg/L, 셀레늄 0.013mg/L 이상을 포함)에 회수된 균체를 현탁 후 배양하여 균체 내에 용암해수 미네랄-뉴클레오티드 결합체를 형성하는 2차 배양 단계;After recovering the Dermabiotics cells from the culture solution, the recovered cells are suspended and cultured in a limited medium (containing calcium 220 mg/L, magnesium 1,130 mg/L, selenium 0.013 mg/L or more) containing only lava seawater mineral concentrate. A secondary culture step of forming a lava seawater mineral-nucleotide conjugate in a cell;

(c) 열압추출, 냉각정제를 통한 미네랄-뉴클레오티드 결합체의 회수 단계(c) Step of recovery of mineral-nucleotide complex through heat pressure extraction and cooling purification

2차 배양액을 0.12 MPa 이상의 열압추출 조건으로 세포를 파쇄하여 미네랄-뉴클레오티드를 용출시키고 파쇄된 균체의 세포벽, 세포질 내 단백질 및 당단백질 성분을 3~5℃에서 냉각 침전시키고 원심분리 후 나노막으로 여과하여 고순도의 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체를 제조하는 단계로 구성된다. Cells are crushed in a secondary culture solution with a heat pressure extraction condition of 0.12 MPa or more to elute mineral-nucleotides, and the cell wall of the crushed cells, the protein and glycoprotein components in the cytoplasm are cooled and precipitated at 3~5°C, and centrifuged and filtered through a nanomembrane It comprises a step of preparing a mineral-nucleotide conjugate derived from Derma Biotics cultured in high-purity lava seawater.

상기 (a)단계의 배지는 바람직하게는, 더마바이오틱스 균주의 배양이 가능한 모든 배지일 수 있으나, 더 바람직하게는, 구성 성분으로, 포도당, 효모추출물, 소이펩톤, 카제인이 포함되고, 상기 구성 성분을 용암해수가 30~70%(v/v) 포함된 물에 용해하고 멸균하여 준비된 배양용 배지일 수 있다. The medium of step (a) is preferably, may be any medium capable of culturing the Dermabiotics strain, more preferably, as a component, glucose, yeast extract, soypeptone, casein is included, and the composition The component may be a culture medium prepared by dissolving and sterilizing lava seawater in water containing 30 to 70% (v/v).

보다 더 바람직하게는 상기 제1단계의 배지는 총 부피 1ℓ 기준, 포도당 1~5%(w/v), 효모추출물 0.5~5%(w/v), 소이펩톤 0.5~5%(w/v), 카제인 0.5~3%(w/v)가 되도록 각 성분을 용암해수가 30~70%(v/v) 포함된 물에 용해하고 멸균하여 준비된 증식 배양용 배지일 수 있다. 상기 배지 멸균은 121~123℃에서 30분간 수행하는 것이 좋다. 상기 제1단계 배양에 적용되는 더마바이오틱스는 락토바실러스 속 (Lactobacillus sp.), 비피도박테리움 속 (Bifidobacterium sp.), 스트렙토코커스 속 (Streptococcus sp.), 락토코커스 속 (Lactococcus sp.), 엔테로코커스 속 (Enterococcus sp.), 페디오코커스 속 (Pediococcus sp.), 바이셀라 속 (Weissella sp.), 사카로마이세스 속 (Saccharomyces sp.), 바실러스 속 (Bacillus sp.), 스테필로코커스 속 (Staphylococcus sp.) 및 프로피오니박테리움 속 (Propionibacterium sp.)으로 이루어진 군에서 하나 이상의 균이며, 바람직하게는 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 불가리쿠스 (Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 가쎄리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 존소니이(Lactobacillus johnsonii), 락토바실러스 프란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 브레브(Bifidobacterium breve),비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 스트렙토코커스 페칼리스(Streptococcus faecalis), 스트렙토코커스 페시움(Streptococcus faecium), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis ssp. lactis), 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium), 페디오코커스 아시도락티시이(Pediococcus acidolacticii), 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 류코노스톡 카르노숨(Leuconostoc carnosum), 류코노스톡 시트레움(Leuconostoc citreum), 류코노스톡 가시코미타튬(Leuconostoc gasicomitatum), 류코노스톡 겔리둠(Leuconostoc gellidum), 류코노스톡 인해(Leuconostoc inhae), 류코노스톡 김치이(Leuconostoc kimchii), 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides), 류코노스톡 파라메센테로이데스(Leuconostoc paramesenteroides), 바이쎌라 시바리아(Weissella cibaria), 바이쎌라 콘푸사(Weissella confusa), 바이쎌라 코리엔시스(Weissella koreensis), 바이쎌라 소리(Weissella soli), 바이쎌라 비리데센스(Weissella viridescens), 스테필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스테필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes), 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 칼스베르겐시스(Saccharomyces carlsbergensis), 사카로마이세스 볼라우디(Saccharomyces boulardii), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 코아귤란스(Bacillus coagulans), 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) 등으로 이루어진 군에서 하나 이상이 선택 될 수 있다. 상기 제1단계의 배양조건은 70~150rpm, 30~40℃ 조건으로 18~24시간 인 것이 바람직하다. Even more preferably, the medium of the first step is based on a total volume of 1 ℓ, glucose 1-5% (w/v), yeast extract 0.5-5% (w/v), soypeptone 0.5-5% (w/v) ), casein 0.5 to 3% (w / v) so that each component may be a medium for growth culture prepared by dissolving and sterilizing lava seawater in water containing 30 to 70% (v/v). The medium sterilization is preferably performed at 121 ~ 123 ℃ for 30 minutes. Dermabiotics applied to the first step culture is Lactobacillus sp., Bifidobacterium sp., Streptococcus sp., Lactococcus sp., Enterococcus sp., Pediococcus sp., Weissella sp., Saccharomyces sp., Bacillus sp., Staphylococcus One or more fungi from the group consisting of the genus Staphylococcus sp. and Propionibacterium sp., preferably Lactobacillus acidophilus , Lactobacillus bulgaricus , lacto Bacillus Kasei (Lactobacillus casei), Lactobacillus buffer momentum (Lactobacillus fermentum), Lactobacillus is Serena (Lactobacillus gasseri), Lactobacillus helveticus (Lactobacillus helveticus), Lactobacillus ramno suspension (Lactobacillus rhamnosus), Lactobacillus zone soniyi (Lactobacillus johnsonii ), Lactobacillus plantarum , Lactobacillus reuteri , Bifidobacterium bifidum , Bifidobacterium breve , Bifidobacterium ins. infantis ), Bifidobacterium lactis , Bifidobacterium longum , Streptococcus pecalis ( S) treptococcus faecalis , Streptococcus faecium , Lactococcus lactis ssp. lactis ), Enterococcus faecalis , Enterococcus faecium , Pediococcus acidolacticii , Pediococcus pentosaceus , Leuconostock carnosum ( Leuconostoc carnosum ), Leuconostoc citreum , Leuconostoc gasicomitatum , Leuconostoc gellidum , Leuconostoc inhae , Leuconostoc inhae , Kimchi ( Leuconostoc inhae ) Leuconostoc kimchii), current Kono Stock lactis (Leuconostoc lactis), current Kono Stock mesen teroyi death (Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides), current Kono Stock Farah mesen teroyi death (Leuconostoc paramesenteroides), by cibaria (Weissella cibaria), by Weissella confusa , Weissella koreensis , Weissella soli , Weissella viridescens , Staphylococcus aureus , and Staphylococcus aureus dummy disc (Staphylococcus epidermidis), propynyl sludge tumefaciens arc Ness (Propionibacterium acnes), saccharose in my process celebrity bicyclic on (Saccharomyces cerevisiae), saccharose in my process Carlsbad Bergen sheath (Saccharomyces carlsbergensis), saccharose in my process carambola Woody (Saccharomyces boulardii ), Bacillus subtilis , Bacillus coagulans ( Bacillus coagulans ), Bacillus licheniformis ( Bacillus licheniformis ), etc. One or more may be selected from the group consisting of. The culture conditions of the first step is preferably 70 to 150 rpm, 30 to 40 ℃ conditions for 18 to 24 hours.

상기 (b)단계에서 균체 회수는 원심분리, 한외여과(ultrafiltration) 등이 이용될 수 있지만 바람직하게는 원심분리를 이용하여 5,000~8,000rpm에서 10~30분간 수행하는 것이 좋다. 회수된 균체를 멸균 증류수로 2회 세척(washing)하고 최종 용암해수 미네랄 농축수(제한배지)에 현탁한다. 이후 제한배지에 현탁된 균체를 30~45℃에서 15~20시간 동안 2차 배양하여 미네랄-뉴클레오티드를 형성시킨다. 보다 바람직하게는 균체를 접종 후 37℃에서 16시간 동안 배양한다.‘제한배지’란 증식에 요구하는 영양소를 충분히 포함하고 있지 않고 성분이 한정되어 있는 배지를 의미하기에, 본 발명의 실시예에서는 제한배지로서 용암해수를 감압 또는 삼투농축 방식으로 농축하한 용암해수 미네랄 농축수를 멸균하여 제한배지로 사용하였다. In the step (b), centrifugation, ultrafiltration, etc. may be used to recover the cells, but it is preferable to perform centrifugation at 5,000 to 8,000 rpm for 10 to 30 minutes. The recovered cells are washed twice with sterile distilled water and suspended in final lava seawater mineral concentrate (limited medium). Thereafter, the cells suspended in the restricted medium are cultured for 2 to 15 hours at 30 to 45° C. to form mineral-nucleotides. More preferably, the cells are cultured at 37° C. for 16 hours after inoculation. The term “restricted medium” refers to a medium that does not contain enough nutrients required for proliferation and has limited components. In the examples of the present invention, As a limiting medium, lava seawater mineral concentrated water in which lava seawater was concentrated under reduced pressure or osmotic concentration was used as a limiting medium.

이 후, 제한배지에는 화장분 분야, 고분자 및 저분자 기능성 생물소재 등이 이용될 수 있는 어떤 기능성 액상 혹은 분말 생물소재도 가능하다. Thereafter, any functional liquid or powdered biomaterials that can be used in the cosmetic field, high molecular weight and low molecular weight functional biomaterials can be used in the restricted medium.

상기 (c)단계에서 열압추출 조건은 형성된 미네랄-뉴클레오티드를 회수하기 위해 더마바이오틱스 세포를 파쇄하는 15~200분의 시간, 120~130℃의 온도 및 0.12~0.30MPa의 압력 조건인 것을 특징으로 한다. 상기 조건으로 용암해수 미네랄-뉴클레오티드 결합체(conjugate) 외의 세포벽, 세포질 내 단백질 성분을 열 변성시키고, 열 변성된 성분을 3~5℃로 냉각 침전시켜 3,000~8,000rpm에서 10~30분간 원심분리하여 미네랄-뉴클레오티드를 회수하고 잔여 성분을 나노막을 이용하여 제거함으로써 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체를 제조한다. 이 과정을 통해 피부에 사용시 피부 발진, 홍반, 아토피를 유발할 수 있는 균 세포벽, 세포질 및 미생물 유래 단백질을 제거하며 피부 및 피부상재균에 대한 부작용을 줄일 수 있다. 상기 원심분리는 열압추출 조건을 통해 파쇄된 세포벽, 세포질에 포함된 펠렛을 제거할 수 있는 조건으로 예컨대, 3,000~8,000 rpm이 사용될 수 있으며, 나노막은 200 나노미터(nanometer) 이하의 막 필터로 여과하여 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드만을 정제하는 제조방법을 제공한다. In step (c), the thermo-pressure extraction condition is characterized in that the time of 15 to 200 minutes, the temperature of 120 to 130° C., and the pressure of 0.12 to 0.30 MPa are crushed to derma biotics cells to recover the formed mineral-nucleotide. do. Under the above conditions, the cell wall other than the lava seawater mineral-nucleotide conjugate is thermally denatured to protein components in the cytoplasm, and the thermally denatured components are cooled and precipitated at 3 to 5°C, and centrifuged at 3,000 to 8,000 rpm for 10 to 30 minutes. -By recovering the nucleotides and removing the remaining components using a nano-membrane, a mineral-nucleotide conjugate derived from Dermabiotics cultured in lava seawater is prepared. Through this process, when used on the skin, skin rashes, erythema, and atopic skin cells that can cause atopy are removed, and proteins derived from the cytoplasm and microorganisms can be reduced and side effects on the skin and skin flora can be reduced. The centrifugation can be used, for example, 3,000 to 8,000 rpm as a condition that can remove pellets contained in the cell wall and cytoplasm, which are crushed through thermo-pressure extraction conditions, and the nano-membrane is filtered with a membrane filter of 200 nanometers or less. By providing a manufacturing method for purifying only the dermabiotics-derived mineral-nucleotide.

본 발명에 있어 바람직하게는 피부장벽강화, 피부 활력, 피부 상처치유를 갖는 것을 특징으로 하는 피부 개선용 더마바이오틱스 화장품 조성물을 제공한다. In the present invention, it is preferred to provide a dermabiotics cosmetic composition for skin improvement, which is characterized by having skin barrier strengthening, skin vitality, and skin wound healing.

본 발명은 상기 본 발명의 제조방법으로 제조된 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체를 제공할 수 있다.The present invention can provide a mineral-nucleotide conjugate derived from Dermabiotics cultured in lava seawater prepared by the method of the present invention.

상기 화장료에는 일반적으로 이용되는 성분 모두를 포함할 수 있다. 예를 들면 유화제, 점증제, 유제, 계면활성제, 윤활제, 알코올류, 수용성 고분자제, 겔화제, 안정화제, 비타민, 무기염류, 유화제, 향료 같은 일반적인 보조 성분을 포함할 수 있다. 상기 성분들은 제형 또는 사용목적에 따라 그 첨가량을 화장료 고유의 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 선택할 수 있다. 상기 성분들의 첨가량은 예를 들어 조성물 총 중량에 대하여 0.1~100 중량%, 바람직하게는 0.1~30 중량%일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.The cosmetic composition may include all of the commonly used ingredients. For example, it may include general auxiliary ingredients such as emulsifiers, thickeners, emulsions, surfactants, lubricants, alcohols, water-soluble polymers, gelling agents, stabilizers, vitamins, inorganic salts, emulsifiers, and fragrances. The above ingredients can be selected depending on the formulation or purpose of use, within the range that does not impair the inherent effects of cosmetics. The added amount of the components may be, for example, 0.1 to 100% by weight, preferably 0.1 to 30% by weight, based on the total weight of the composition, but is not limited thereto.

또한, 화장료의 종류는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 화장수, 유액, 젤, 크림, 에센스, 팩, 앰플, 로션, 세정료, 비누, 바디제품류, 비누, 오일 등의 스킨케어 화장료, 립스틱, 파운데이션 등의 메이크업 화장료, 두발용 화장료 등을 들 수 있고, 그 제형은 특별히 제한되지 않는다.In addition, the type of the cosmetic is not particularly limited, for example, lotion, latex, gel, cream, essence, pack, ampoule, lotion, cleaning agent, soap, body products, soap, oil and other skin care cosmetics, lipstick, Makeup cosmetics such as foundations, cosmetics for hair, and the like, and the formulation is not particularly limited.

이하 본 발명을 더 쉽게 이해할 수 있도록, 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나 여기서 설명되는 비교예와 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다. Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in detail so that the present invention may be more easily understood. However, the comparative examples and examples described herein are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not construed as being limited by them. Rather, it is provided to sufficiently convey the spirit of the present invention to those skilled in the art so that the contents introduced herein are thorough and complete.

<제조예 1: 일반상수가 포함된 기본배지에서의 더마바이오틱스 배양액 제조><Production Example 1: Preparation of Dermabiotics culture medium in a basic medium containing general constants>

본 발명에서 더마바이오틱스 균주를 배양하기 위한 기본배지(일반상수 배지)로서 1ℓ 당 포도당 3%(w/v), 효모추출물 2%(w/v), 소이펩톤 2%(w/v), 카제인 1%(w/v)가 되도록 각 성분을 물(증류수)에 용해하여 121~123℃, 30분간 멸균하였다. In the present invention, 3% (w/v) of glucose per 1 liter, 2% of yeast extract (w/v), and 2% of soypeptone (w/v) as a basic medium (general constant medium) for culturing Dermabiotics strains, Each component was dissolved in water (distilled water) so that casein was 1% (w/v) and sterilized at 121 to 123°C for 30 minutes.

이렇게 멸균된 일반상수 배지에 더마바이오틱스 종배양액을 발효조의 멸균된 기본 배지에 접종하고 100rpm, 37℃ 조건으로 20시간 동안 배양하되, 40%(w/v) 포도당 및 40%(w/v) 수산화나트륨이 1:1의 부피비로 혼합된 수용액(이하, 포도당-수산화나트륨 용해액이라 함)을 일정시간 간격으로 점적하면서 pH를 5.0~7.5로 유지하며 배양하였다(Fed-batch culture 수행). * 더마바이오틱스 종배양액 : 유산균인 락토바실러스 플란타룸 균주를 Lactobacilli MRS Broth(BD)에서 37℃ 조건에서 24시간 배양한 것, 이하 더마바이오틱스 종배양액이라 함은 이를 말함. The Dermabiotics seed culture solution was inoculated into the sterilized basic medium of the fermenter in a sterilized general constant medium and incubated for 20 hours at 100 rpm and 37° C., but 40% (w/v) glucose and 40% (w/v) An aqueous solution in which sodium hydroxide was mixed at a volume ratio of 1:1 (hereinafter, referred to as a glucose-sodium hydroxide solution) was added dropwise at regular intervals while maintaining the pH at 5.0 to 7.5 and incubating (performed fed-batch culture). * Dermabiotics seed culture solution: Lactobacillus plantarum strain, a lactic acid bacteria, was cultured in Lactobacilli MRS Broth (BD) for 24 hours at 37°C, hereinafter referred to as Dermabiotics seed culture solution.

<제조예 2: 더마바이오틱스 유래 뉴클레오티드의 제조><Production Example 2: Preparation of nucleotides derived from Derma Biotics>

제조예 1에서 얻은 더마바이오틱스 배양액을 원심분리(6,000 rpm, 20분)하고 균체 만을 회수하여 멸균 상수(증류수)로 세척(washing)하고 이를 1회 반복하였다. The Dermabiotics culture solution obtained in Preparation Example 1 was centrifuged (6,000 rpm, 20 minutes), and only the cells were recovered, washed with sterile constant (distilled water) and repeated once.

이 후 균체를 멸균된 상수에 현탁하여 37℃에서 16시간 동안 2차 배양하였다. 이후 121℃의 온도 및 0.15 MPa의 압력 조건으로 120분간 열압추출하여 더마바이오틱스 세포를 파쇄시키고 4℃로 냉각(chilling)후에 더마바이오틱스 파쇄액을 원심분리(6,000rpm, 20분)을 이용하여 더마바이오틱스 유래 뉴클레오티드를 회수하였다.Thereafter, the cells were suspended in sterilized constant water and cultured for 2 hours at 37°C for 16 hours. Then, the dermabiotic cells were crushed by thermal pressure extraction at a temperature of 121°C and a pressure of 0.15 MPa for 120 minutes, and after cooling to 4°C, the dermabiotic crushing solution was centrifuged (6,000 rpm, 20 minutes). Dermabiotics-derived nucleotides were recovered.

<제조예 3: 더마바이오틱스 유래 뉴클레오티드의 정제물 제조><Production Example 3: Preparation of purified product of nucleotides derived from Derma Biotics>

이 후 균체를 멸균된 상수에 현탁하여 37℃에서 16시간 동안 2차 배양하였다. 이후 121℃의 온도 및 0.15 MPa의 압력 조건으로 120분간 열압추출하여 더마바이오틱스 세포를 파쇄시키고 4℃로 냉각(chilling)후에 더마바이오틱스 파쇄액을 원심분리(6,000rpm, 20분)을 최종 상등액만을 회수하였다. 회수한 상등액은 200 나노미터(nanometer) 이하의 나노막 필터로 최종 여과하여 더마바이오틱스 유래 뉴클레오티드 정제물을 회수하였다.Thereafter, the cells were suspended in sterilized constant water and cultured for 2 hours at 37°C for 16 hours. After thermal pressure extraction for 120 minutes at a temperature of 121°C and a pressure of 0.15 MPa, the Dermabiotics cells were crushed, and after cooling to 4°C, the Dermabiotics crushed solution was centrifuged (6,000 rpm, 20 minutes) to the final supernatant. Bays were recovered. The recovered supernatant was finally filtered through a nano-membrane filter of 200 nanometers or less to collect a nucleotide purified product derived from Dermabiotics.

<실시예 1: 용암해수 농도별 더마바이오틱스의 배양액 제조><Example 1: Preparation of culture medium of Derma Biotics by lava seawater concentration>

용암해수가 10~90%(v/v) 포함된 용암해수 혼합액 또는 용암해수 자체(100%)를 배양용수로 준비하고, 상기 배양용수를 제조예 1에서 이용한 기본 배지 제조 조건에서 물(용암해수 0% 상태) 대신 사용하였다. 이렇게 각 농도별 용암해수가 포함된 배양용수를 사용하여 배지를 제조예 1에서와 같이 멸균하였다. A lava seawater mixture containing 10 to 90% (v/v) of lava seawater or lava seawater itself (100%) was prepared as culture water, and water was used in the basic medium preparation conditions using the culture water in Preparation Example 1 (lava seawater 0 % State) instead. In this way, the culture medium containing lava seawater for each concentration was sterilized as in Preparation Example 1.

다음으로 멸균된 용암해수 배지에 제조예 1에서와 같이 더마바이오틱스 종배양액을 접종하고, 100rpm, 37℃ 조건으로 20시간 동안 포도당-수산화나트륨 용해액을 사용하여 pH를 5.0~7.5로 간격으로 점적하면서 pH를 5.0~7.5로 유지하며 배양하였다(Fed-batch culture 수행)Next, the Dermabiotics seed culture solution was inoculated into the sterile lava seawater medium as in Preparation Example 1, and the pH was dropped at intervals of 5.0 to 7.5 using glucose-sodium hydroxide solution for 20 hours at 100 rpm and 37°C. While maintaining the pH at 5.0 ~ 7.5 and cultured (Fed-batch culture performed)

<실시예 2 : 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체의 제조><Example 2: Preparation of mineral-nucleotide conjugate derived from Derma Biotics cultured in lava seawater>

실시예 1의 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 배양액을 원심분리 (6,000 rpm, 20분)하고 균체 만을 회수하여 멸균 상수(증류수)로 세척(washing)하고 이를 1회 반복하였다. 이 후 균체를 용암해수를 1/10부피 이상으로 농축하여 제조한 미네랄 농축수(칼슘 220mg, 마그네슘 1,130mg, 셀레늄 0.013mg 이상) 에 현탁 후, 37℃에서 16시간 동안 2차 배양하였다. 이후 121℃의 온도 및 0.15 MPa의 압력 조건으로 120분간 열압추출하여 더마바이오틱스 세포를 파쇄시키고 4℃로 냉각(chilling)후에 더마바이오틱스 파쇄액을 원심분리(6,000rpm, 20분)을 이용하여 최종 상등액만을 회수하였다. 회수한 상등액은 200 나노미터(nanometer) 이하의 나노막 필터로 최종 여과하여 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드를 회수하였다. The Dermabiotics culture medium cultured in the lava seawater of Example 1 was centrifuged (6,000 rpm, 20 minutes), and only the cells were recovered, washed with sterile constant (distilled water) and repeated once. After that, the cells were suspended in mineral concentrated water (calcium 220 mg, magnesium 1,130 mg, selenium 0.013 mg or more) prepared by concentrating the lava seawater to 1/10 or more by volume, followed by secondary culture at 37°C for 16 hours. Then, the dermabiotic cells were crushed by thermal pressure extraction at a temperature of 121°C and a pressure of 0.15 MPa for 120 minutes, and after cooling to 4°C, the dermabiotic crushing solution was centrifuged (6,000 rpm, 20 minutes). Only the final supernatant was recovered. The recovered supernatant was finally filtered with a nano-membrane filter of 200 nanometers or less to collect mineral-nucleotides derived from Dermabiotics.

<실험예 1: 용암해수 농도 별 더마바이오틱스 생균수 및 뉴클레오티드 함량 확인><Experimental Example 1: Confirmation of the number of living cells and nucleotides of Derma Biotics by concentration of lava seawater>

제조예 1과 실시예 1의 배양액을 취하여 생리식염수로 희석 후 희석액을 페트리디쉬(petridish)에 1ml 분주하고 멸균된 Lactobacilli MRS Agar(BD, USA) 20ml을 혼합하여 굳혔다. 37℃ 정치배양기에서 48시간 배양된 콜로니(colony)를 개수하여 더마바이오틱스 생균수를 확인하였고 이를 도 2에 나타내었다(이하, 더마바이오틱스 생균수 측정법이라 한다). The culture solution of Preparation Example 1 and Example 1 was taken, diluted with physiological saline, 1 ml of the diluted solution was dispensed in petridish, and 20 ml of sterilized Lactobacilli MRS Agar (BD, USA) was mixed and hardened. The number of colonies cultured for 48 hours in a stationary incubator at 37°C was counted to confirm the number of Dermabiotics viable cells, and this is shown in FIG. 2 (hereinafter, referred to as a method for measuring the number of Dermabiotics viable cells).

또한 동시에, 제조예 1과 실시예 1의 배양액을 원심분리(6,000 rpm, 20분)하고 균체 만을 회수하여 멸균 상수(증류수)로 세척(washing)하고 이를 1회 반복하였다. 이 후 균체를 멸균된 상수에 현탁하여 37℃에서 16시간 동안 2차 배양하였다. 이후 121℃의 온도 및 0.15 MPa의 압력 조건으로 120분간 열압추출하여 더마바이오틱스 세포를 파쇄시키고 4℃로 냉각(chilling)후에 더마바이오틱스 파쇄액을 원심분리(6,000rpm, 20분)후 후, 잔여 성분을 200 나노미터(nanometer) 이하의 나노막 필터로 최종 여과를 통해 뉴클레오티드를 확인하였다. In addition, at the same time, the culture solution of Preparation Example 1 and Example 1 was centrifuged (6,000 rpm, 20 minutes), and only the cells were recovered, washed with sterile constant (distilled water) and repeated once. Thereafter, the cells were suspended in sterilized constant water and cultured for 2 hours at 37°C for 16 hours. After thermal pressure extraction at a temperature of 121°C and a pressure of 0.15 MPa for 120 minutes, the Dermabiotics cells were crushed and cooled to 4°C, followed by centrifugation of the Dermabiotics crushing solution (6,000 rpm, 20 minutes). The nucleotide was confirmed by final filtration of the residual component with a nano-membrane filter of 200 nanometers or less.

각 용암해수 농도별 더마바이오틱스 배양액으로 제조된 뉴클레오티드의 UV 파장 흡수도(230nm, 260nm, 280nm)를 확인하여 뉴클레오티드 농도를 도 2에 같이 나타내었다(이하, 더마바이오틱스 유래 뉴클레오티드 측정법이라 한다). The nucleotide concentration is shown in FIG. 2 by checking the UV wavelength absorbance (230 nm, 260 nm, 280 nm) of the nucleotides prepared by the Dermabiotics culture solution for each lava seawater concentration (hereinafter referred to as a nucleotide measurement method derived from Dermabiotics).

도 2에서 용암해수 농도 0%는 제조예 1에서 얻은 배양액을 이용하여 배양한 더마바이오틱스 생균수 또는 더마바이오틱스 유래 뉴클레오티드를 뜻한다. In Figure 2, the lava seawater concentration of 0% means the number of Dermabiotics viable cells or Dermabiotics-derived nucleotides cultured using the culture solution obtained in Preparation Example 1.

도 2의 결과를 분석하면, 실시예 1 및 제조예 1의 농도별 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 생균수 및 더마바이오틱스 유래 뉴클레오티드 함량을 확인하였을 때, 실시예 1 중 30~70(v/v)% 용암해수가 적용된 배지에서 배양된 더마바오이틱스 생균수, 상기 더마바이오틱스 유래 뉴클레오티드가 용암해수를 전혀 적용하지 않은 제조예 1을 통해 배양된 균체 대비 증가하는 것을 알 수 있고, 80(v/v)% 이상의 용암해수가 적용된 배지에서 배양된 더마바이오틱스 생균수, 상기 더마바이오틱스 유래 뉴클레오티드는 제조예 1을 통해 배양된 더마바이오틱스 에서와 유사하게 제조되는 것으로 나타났다. Analyzing the results of FIG. 2, when confirming the number of Dermabiotics viable cells and nucleotides derived from Dermabiotics cultured in lava seawater according to concentrations of Example 1 and Preparation Example 1, 30 to 70 (v/ v)% Dermabiotics viable cells cultured in a medium to which lava seawater was applied, the nucleotides derived from the Dermabiotics can be seen to increase compared to cells cultured through Preparation Example 1 in which no lava seawater was applied, and 80(v /v)% Dermabiotics viable cells cultured in a medium to which lava seawater was applied, and the nucleotides derived from Dermabiotics were found to be prepared similarly to Dermabiotics cultured through Preparation Example 1.

이는 용암해수의 첨가량이 증가한다고 하여 무조건 더마바이오틱스의 배양이 증가하지 않음을 파악할 수 있고, 용암해수에 의해 염 농도가 80(v/v)% 이상 높아지면 더마바이오틱스 배양성을 저해하는 것으로 확인된다. 이에 용암해수 내의 적정 미네랄 농도가 더마바이오틱스 배양 및 뉴클레오티드 형성에 있어 중요한 요소인 것을 알 수 있다.This can be seen that the cultivation of Dermabiotics does not increase unconditionally by increasing the amount of lava seawater added, and when the salt concentration is increased by 80 (v/v)% or higher by lava seawater, the Dermabiotics culture is inhibited. Is confirmed. Accordingly, it can be seen that the proper mineral concentration in the lava seawater is an important factor in culturing Dermabiotics and forming nucleotides.

또한, 위의 결과 중 가장 최적의 더마바이오틱스 생균수 증가와 뉴클레오티드 형성이 고농도로 증가되는 조건은 1차배양의 배지용 배양용수로 용암해수 30~70(v/v)% 인 것을 사용하는 것이 좋고, 이 중 30(v/v)%인 것을 사용하는 것이 가장 최적인 조건임을 확인할 수 있다.In addition, among the above results, it is preferable to use 30-70 (v/v)% of lava seawater as the culture medium for primary culture as the most optimal condition for increasing the number of Dermabiotics viable cells and increasing nucleotide formation. , Of these, it can be confirmed that the most optimal condition is to use 30(v/v)%.

<실험예 2: 2차 발효 용수와 열압추출 시간에 따른 더마바이오틱스 유래 뉴클레오티드와 미네랄 함량 확인><Experimental Example 2: Determination of nucleotides and minerals derived from Dermabiotics according to the second fermentation water and the time of hot pressure extraction>

이 실험에서는 용암해수를 배양용수로 이용하여 배양된 더마바이오틱스 배양액으로부터 더마바이오틱스를 원심분리를 통해 회수한 후, 이후의 2차 배양 조건에 따라 회수되는 뉴클레오티드의 양을 비교하였다. In this experiment, the amount of nucleotides recovered according to the subsequent secondary culture conditions was compared after collecting Derma Biotics through centrifugation from Derma Biotics culture medium cultured using lava seawater as culture water.

이를 위해 실시예 1에서 얻은 용암해수가 30(v/v)% 농도로 배양된 더마바이오틱스 배양액을 원심분리 (6,000 rpm, 20분)하고 균체 만을 회수하여 멸균 상수(증류수)로 세척(washing)하고 이를 1회 반복하였다. 이 후 균체를 일반상수와 용암해수 미네랄 농축수(칼슘 220mg/L, 마그네슘 1,130mg/L, 셀레늄 0.013mg/L 이상)에 각각 현탁 후, 37℃에서 16시간 동안 2차 배양하였다. 이후 121℃의 온도 및 0.15 MPa의 압력 조건으로 열압추출하되, 최적의 열압추출 조건을 확인하기 위하여 열압추출 시간을 30분, 120분으로 나누어 수행하였다.To this end, the lava seawater obtained in Example 1 was centrifuged (6,000 rpm, 20 minutes) and cultured with Derma Biotics culture at a concentration of 30 (v/v)%, and only the cells were recovered and washed with sterile constant (distilled water). And this was repeated once. After that, the cells were suspended in normal constant water and lava seawater mineral concentrate (calcium 220 mg/L, magnesium 1,130 mg/L, selenium 0.013 mg/L or more), respectively, and then incubated at 37°C for 16 hours. Thereafter, hot-pressure extraction was performed at a temperature of 121° C. and a pressure of 0.15 MPa, but the hot-pressure extraction time was divided into 30 minutes and 120 minutes in order to confirm optimal heat pressure extraction conditions.

열압추출하여 더마바이오틱스 세포가 파쇄된 이후, 파쇄액을 4℃로 냉각(chilling)후에 원심분리(6,000rpm, 20분)을 이용하여 최종 상등액만을 회수하였다. 회수한 상등액은 200 나노미터(nanometer) 이하의 나노막 필터로 최종 여과하여 더마바이오틱스 유래 뉴클레오티드 또는 미네랄-뉴클레오티드를 회수하였다. 각 조건별 뉴클레오티드 함량을 Nanodrop 2000(Thermo, USA)을 이용하여 UV 파장 흡수도를 확인하여 2차 발효 용수와 열압추출 시간에 따른 더마바이오틱스 유래 뉴클레오티드 함량 농도를 도 3에 나타내었다. After the Dermabiotics cells were crushed by thermal pressure extraction, only the final supernatant was recovered by centrifugation (6,000 rpm, 20 minutes) after cooling the crushing solution to 4°C. The recovered supernatant was finally filtered with a nano-membrane filter of 200 nanometers or less to collect nucleotides or mineral-nucleotides derived from Dermabiotics. The nucleotide content of each condition was confirmed by using Nanodrop 2000 (Thermo, USA) to confirm the UV wavelength absorbance, and the concentration of nucleotide content derived from Dermabiotics according to the secondary fermentation water and the time of heat extraction was shown in FIG. 3.

도 3의 결과에 따르면 용암해수 미네랄 농축수로 2차 배양된 더마바이오틱스 유래 뉴클레오티드 함량을 확인하였을 때, 상수 2차 배양 대비 약 1.5배 뉴클레오티드 함량이 증가된 것을 확인할 수 있었으며, 이는 용암해수 미네랄 농축수 제한배지를 통해 2차 발효를 수행함으로써 더마바이오틱스 세포내에 미네랄이 흡수되어 미네랄-뉴클레오티드가 다량 형성된 것임을 입증한다. 이 결과는 이후의 표 1을 통해 다시 한번 설명하기로 한다. According to the results of FIG. 3, when the nucleotide content derived from Derma Biotics secondary cultured with lava seawater mineral concentrate was confirmed, it was confirmed that the nucleotide content was increased by about 1.5 times compared to the constant secondary culture, which is the concentration of lava seawater mineral. By performing secondary fermentation through a limited number of medium, it is proved that minerals are absorbed into Derma Biotics cells and that mineral-nucleotides are formed in large quantities. This result will be explained once again through Table 1 below.

또한 이렇게 형성된 미네랄-뉴클레오티드는 열압처리 시간이 120분일 때 가장 많은 양이 추출되는 것을 알 수 있는데, 용암해수 미네랄 농축수 2차 배양 및 열압추출 시 더마바이오틱스 세포 내외에서 미네랄 이온들이 가열에 의해 반응성이 증가하여 세포 내외에서 세포질 및 세포벽을 조밀하게 파쇄하고 미네랄-뉴클레오티드로 결합되어 열 안정성을 나타내는 것임을 입증하는 결과라 할 수 있다. 즉, 용암해수가 미네랄 농축수가 더마바이오틱스 배양 및 세포파쇄에 있어 중요한 요소이고, 열압추출 시간 또한 중요한 요소라 할 수 있다. In addition, it can be seen that the largest amount of the mineral-nucleotide thus formed is extracted when the heat pressure treatment time is 120 minutes. When the lava seawater mineral concentrate is secondaryly cultured and the pressure is extracted, mineral ions inside and outside the Dermabiotics cells are reactive by heating. This increase can be said to be a result that proves that the cytoplasm and the cell wall are densely crushed inside and outside the cell, and combined with mineral-nucleotides to exhibit thermal stability. That is, lava seawater is an important factor in culturing Dermabiotics and crushing cells, and mineral concentration water is also an important factor in the time of extracting heat.

다음으로는 용암해수로부터 이입되어 뉴클레오티드에 결합되는 미네랄 농도를 확인하기 위하여 상기 방법으로 제조된 시료의 미네랄 함량을 분석하였다. 약 0.1~1g 범위의 무기질(칼슘, 마그네슘, 셀레늄) 표준시약을 적정 및 희석(질산) 후, 취하여 표준용액으로 하였다. 상기 방법으로 제조된 시료를 질산으로 희석하였다. 표준용액과 시료를 microwave로 1시간동안 분해하고 냉각시킨 뒤 3차증류수로 50 mL fill-up하여 ICPOES(PerkinElmer precisely optical Emission spectrometer, Optima 5300DV)로 표준용액과 함께 분석하여 미네랄 함량을 표 1로 나타내었다.Next, the mineral content of the sample prepared by the above method was analyzed in order to confirm the concentration of minerals that are introduced from lava seawater and bound to nucleotides. Standard reagents of mineral (calcium, magnesium, selenium) in the range of about 0.1 to 1 g were titrated and diluted (nitric acid), and taken as standard solutions. The sample prepared by the above method was diluted with nitric acid. After dissolving and cooling the standard solution and sample for 1 hour in a microwave, 50 mL fill-up with tertiary distilled water is analyzed with ICPOES (PerkinElmer precisely optical emission spectrometer, Optima 5300DV) with the standard solution to show the mineral content in Table 1. Did.

열처리 시간Heat treatment time 2차 배양방법Second culture method 미네랄 함량(mg/L)Mineral content (mg/L) 30min30min 일반상수
2차배양General constant
Second culture 칼슘calcium 1010 마그네슘magnesium 120120 셀레늄Selenium 00 용암해수 미네랄
농축수 2차배양Lava seawater minerals
Second culture of concentrated water 칼슘calcium 7272 마그네슘magnesium 221221 셀레늄Selenium 0.0020.002 120min120min 일반상수
2차배양General constant
Second culture 칼슘calcium 2222 마그네슘magnesium 232232 셀레늄Selenium 00 용암해수 미네랄
농축수 2차배양Lava seawater minerals
Second culture of concentrated water 칼슘calcium 132132 마그네슘magnesium 532532 셀레늄Selenium 0.0060.006

표 1과 같이 용암해수 미네랄 농축수 2차 배양 시 더모바이오틱스 내의 뉴클레오티드와 결합하는 미네랄의 양이 현저하게 증가하는 것을 확인할 수 있다. 또한 반복적으로 실험하여 본 발명의 방법대로 2차 배양 시 칼슘 50~200 mg/L, 마그네슘 300~800 mg/L, 셀레늄 0.001~0.01 mg/L인 미네랄-뉴클레오티드가 포함된 상등액을 얻을 수 있었다. As shown in Table 1, it can be seen that the amount of the mineral binding to the nucleotide in Dermobiotics is significantly increased during the secondary culture of lava seawater mineral concentrate. In addition, repeated experiments were performed to obtain supernatant containing mineral-nucleotides of calcium 50-200 mg/L, magnesium 300-800 mg/L, and selenium 0.001-0.01 mg/L during the second culture according to the method of the present invention.

<실험예 3: 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체의 피부 세포독성 확인> <Experimental Example 3: Confirmation of dermal cytotoxicity of derma biotics-derived mineral-nucleotide complex cultured in lava seawater>

본 실험예에서는 피부 및 마이크로바이옴의 독성과 원료의 발효취 생성에 영향을 미치는 더마바이오틱스의 세포벽, 세포질, 단백질 및 단백질염 성분을 200 나노미터(nanometer) 이하의 나노막 필터로 효과적으로 제거함으로써 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체의 세포독성이 개선되었음을 증명하고자 하였다. In this experimental example, dermabiotics cell wall, cytoplasm, protein and protein salt components, which affect the toxicity of skin and microbiome and fermentation of raw materials, are effectively removed with a nano-membrane filter of 200 nanometers or less. The aim was to prove that the cytotoxicity of the dermabiotics-derived mineral-nucleotide complex cultured in lava seawater was improved .

이를 위해 용암해수 30(v/v)% 1차 배양 및 용암해수 미네랄 농축수로 2차 배양하여 얻은 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드를 실시예 2의 대표 시료로 사용하며, '용암해수 배양 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체’또는 ‘용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체’라 한다. To this end, Dermabiotics-derived mineral-nucleotide obtained by primary cultivation of lava seawater 30 (v/v)% and secondary cultivation with lava seawater mineral concentrate is used as a representative sample of Example 2, and said,'Lava seawater culture Dermabio It is called'Tix derived mineral-nucleotide conjugate' or'Dermabiotics derived mineral-nucleotide conjugate cultured in lava seawater'.

또한 제조예 2에서 얻은 뉴클레오티드는 ‘일반상수 배양 더마바이오틱스 유래 뉴클레오티드’ 또는 ‘일반상수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 뉴클레오티드’라 한다. In addition, the nucleotide obtained in Preparation Example 2 is referred to as'nucleotide derived from Dermabiotics in general constant culture' or'nucleotide derived from Dermabiotics cultured in normal constant'.

한편, 상기 결합체 제조 시 보존성을 부여를 위해 보존료인 2.5(v/v)%의 1,2-hexanediol을 처방하여 각각 제조하였기에, 대조군(Control)에도 피부 세포독성 시험 시 공실험군의 의미로 멸균된 상수에 1,2-hexanediol을 처방하여 대조군으로 적용하였고, 제조예 3에도 같은 농도의 1,2-hexanediol을 적용하게 하였다. On the other hand, in order to impart preservation in the manufacture of the conjugate, preservatives of 2.5 (v/v)% of 1,2-hexanediol were prescribed and prepared, respectively. 1,2-hexanediol was prescribed as a control and applied as a control, and 1,2-hexanediol of the same concentration was applied to Preparation Example 3.

MTT assay는 살아있는 세포의 수를 측정함으로써 세포 증식이나 독성에 많이 사용되는 실험법으로 살아있는 세포는 미토콘드리아 내에서 수용성이고 노란색의 염인 MTT(3-[4,5-dimethlythiazole-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide)가 숙신산탈수소효소(succinate dehydrogenase 또는 mitochondrial dehydrogenase)에 의해 수불용성인 파란색의 포르마잔(formazan) 유도체로 환원되는 원리를 이용하는 것이다.MTT assay is an experimental method that is frequently used for cell proliferation or toxicity by measuring the number of living cells. Living cells are water-soluble and yellow salt MTT(3-[4,5-dimethlythiazole-2-yl]-2,5 in mitochondria. The principle is that diphenyltetrazolium bromide is reduced to a water-insoluble blue formazan derivative by succinic dehydrogenase or mitochondrial dehydrogenase.

이를 위해, 섬유아세포(human fibroblast) 및 각질세포(Human keratinocyte)를 24 well plate에 1.5×10⁵cells/well 의 밀도로 희석하여 10%(v/v) 소혈청을 포함하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium, Welgene, Korea) 배지로 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 1일 동안 배양하였다. 배양 후, 배지를 모두 제거하고, 소혈청이 함유되지 않은 DMEM 배지로 교체하고, 시험 시료를 각각 농도별로 첨가한 후, 1일 동안 배양하였다.To this end, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle) containing 10% (v/v) bovine serum by diluting fibroblasts (human fibroblasts) and keratinocytes (Human keratinocytes) at a density of 1.5×10 ⁵ cells/well in a 24 well plate Medium, Welgene, Korea) cultured at 37° C. in a 5% CO ₂ incubator for 1 day. After incubation, all of the medium was removed, replaced with DMEM medium without bovine serum, and each test sample was added for each concentration, followed by incubation for 1 day.

그 후 배지를 제거하고 0.25 ㎎/㎖의 MTT 용액을 처리하여 37℃에서 4시간 반응시켰다. 그 후 MTT 용액을 제거한 세포에 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 첨가하여 MTT formazan을 용해시키고 570nm에서 흡광도로 측정하였다. Thereafter, the medium was removed, and a 0.25 mg/ml MTT solution was treated to react at 37° C. for 4 hours. Thereafter, dimethyl sulfoxide (DMSO) was added to the cells from which the MTT solution was removed to dissolve MTT formazan and measured by absorbance at 570 nm.

이에 대한 결과는 도 4a와 도 4b에 나타내었고, 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체 제조액(상등액)의 농도 5(v/v)%까지 세포독성이 확인되지 않지만, 200 나노미터(nanometer) 이하의 나노막 필터로 여과되지 않은 일반상수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 뉴클레오티드는 3%(v/v) 처리군부터 세포독성이 나타났다. ※ 도 4 내지 도 8까지의 시료 농도 %는 모두 (v/v)%를 의미한다. The results for this are shown in FIGS. 4A and 4B, but cytotoxicity was not confirmed up to a concentration of 5 (v/v)% of the Derma Biotics-derived mineral-nucleotide conjugate preparation solution (supernatant) cultured in lava seawater, but 200 nanometers. Dermabiotics-derived nucleotides cultured in normal constants that were not filtered with nanometer filters below a nanometer showed cytotoxicity from the 3% (v/v) treatment group. ※ All sample concentrations in FIGS. 4 to 8 mean (v/v)%.

즉, 제조예 2의 시료에는 피부의 염증을 일으키는 세포구조물인 세포벽, 세포질, 단백질 및 단백질염 성분이 정제되지 않고 포함되어 있기 때문에 피부 기본 독성 평가에서 피부섬유아세포와 피부각질세포 모두에서 3% (v/v)이상 샘플처리시 세포사멸이 발생되는 것을 확인할 수 있다.That is, since the sample of Preparation Example 2 does not contain cell walls, cytoplasm, protein and protein salt components, which are cell structures that cause inflammation of the skin, 3% (in both fibroblasts and keratinocytes in skin basic toxicity evaluation) v/v) It can be seen that apoptosis occurs during sample processing.

반면, 실시예 2의 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체 처리군에서는 상기 염증 유발인자들이 200 나노미터(nanometer) 이하의 나노막 필터를 통해 제거됨으로써 5%(v/v)까지 피부 각 세포에 처리해도 세포독성이 나타나지 않는 것으로 피부 안전성(skin safety)을 확인할 수 있었다. 이러한 결과로 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체는 30%(v/v) 용암해수 배양을 통해 더마바이오틱스 생균수 2.0x10¹⁰CFU/ml의 고농도로 제조함에도 불구하고 세포독성을 나타내지 않는 형태로 제조되면서 더 많은 사용량 구현을 통해 피부건강 효능의 극대화를 기대할 수 있게 되었다. On the other hand, in the treatment group of dermabiotics-derived mineral-nucleotide conjugate cultured in lava seawater of Example 2, the inflammation-causing factors were removed through a nano-membrane filter of 200 nanometers or less to 5% (v/v). It was confirmed that skin safety was not observed even when treated with each cell of the skin. As a result of this, Dermabiotics-derived mineral-nucleotide conjugates cultured in lava seawater have improved cytotoxicity despite being produced at a high concentration of 2.0x10 ¹⁰ CFU/ml of Dermabiotics viable cells through 30% (v/v) lava seawater culture. As it is manufactured in a non-representative form, it is possible to expect maximization of skin health efficacy through implementation of more usage.

한편 나노막 여과공정 전/후의 시료를 비교하고자 제조예 2, 제조예 3, 실시예 2를 피부섬유아세포에 처리하여 역시 세포독성을 확인하였고 다음의 표 2에 나타내었다. 비교를 위해 실시예 2의 제조방법 중 200 나노미터(nanometer) 이하의 나노막 필터를 수행하지 않은 시료를 제조하여 비교군으로 사용하였다. Meanwhile, in order to compare samples before and after the nano-membrane filtration process, Preparation Example 2, Preparation Example 3, and Example 2 were treated with skin fibroblasts to confirm cytotoxicity and are shown in Table 2 below. For comparison, a sample without performing a nano-membrane filter of 200 nanometers or less in the manufacturing method of Example 2 was prepared and used as a comparison group.

그 결과 본 발명의 방법대로 용암해수 배양 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드의 제조를 위해 나노막 여과공정을 수행하여야만 세포독성이 거의 없는 시료의 제조가 가능함을 확인할 수 있다. As a result, it can be confirmed that the preparation of a sample with little cytotoxicity is possible only by performing a nano-membrane filtration process for the production of mineral-nucleotides derived from lava seawater culture Dermabiotics according to the method of the present invention.

samplesample 시료 농도
(%, v/v)Sample concentration
(%, v/v) 세포생존율 평균 (%)Cell viability average (%) ControlControl 3.0%3.0% 100.00100.00 일반상수 배양 더마바이오틱스 유래 뉴클레오티드
- 나노막 여과 전
(제조예 2)Nucleotide derived from Dermabiotics
-Before nano-membrane filtration
(Production Example 2) 3.0%3.0% 77.2477.24 일반상수 배양 더마바이오틱스 유래 뉴클레오티드 정제물- 나노막 여과 후
(제조예 3)Nucleotide purified from Dermabiotics in general constant culture-after nano-membrane filtration
(Production Example 3) 3.0%3.0% 94.3294.32 용암해수 배양 더마바이오틱스 유래
미네랄-뉴클레오티드 - 나노막 여과 전From lava seawater culture Derma Biotics
Mineral-nucleotide-before nano-membrane filtration 3.0%3.0% 78.3078.30 용암해수 배양 더마바이오틱스 유래
미네랄-뉴클레오티드 결합체 - 나노막 여과 후
(실시예 2)From lava seawater culture Derma Biotics
Mineral-nucleotide complex-after nano-membrane filtration
(Example 2) 3.0%3.0% 101.40101.40

<실험예 4: 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체의 세포활성 효과 확인> <Experimental Example 4: Confirmation of cell activity effect of mineral-nucleotide conjugate derived from Derma Biotics cultured in lava seawater>

미토콘드리아의 세포막 전위변화를 검증하기 위해, 섬유아세포(human fibroblast)를 35 mm plate 에 분주하여 24 시간 안정화한 후, serum-free medium 으로 교체하고 시료(실시예 2 및 제조예 3)를 처리하였다. To verify the mitochondrial cell membrane potential change, fibroblasts (human fibroblasts) were dispensed into 35 mm plates, stabilized for 24 hours, replaced with serum-free medium, and treated with samples (Example 2 and Preparation Example 3).

이후의 제조예 3에서 얻은 뉴클레오티드는 ‘일반상수 배양 더마바이오틱스 유래 뉴클레오티드 정제물’ 또는 ‘일반상수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 뉴클레오티드 정제물’이라 한다. The nucleotides obtained in Preparation Example 3 are referred to as'general constant culture Dermabiotics-derived nucleotide purification' or'general constant cultured Dermabiotics-derived nucleotide purification'.

1시간 뒤, 염류완충용액(HBSS) 버퍼로 세척 후 염류완충용액을 plate에 세포배양액만큼 넣은 후 총 조사량이 UVB 50 mJ/㎠이 될 때까지 조사하였다. UVB 조사 이후 Serum-free medium 으로 배지를 교체한 뒤 시료(실시예 2 및 제조예 3)를 처리하여 37℃, 5% CO₂ incubator 에서 24 시간 배양하였다. 배지 제거 후 1 ㎍/㎖ 의 JC-1 solution 을 처리하여 37℃, 5% CO₂ incubator 에서 빛이 없는 상태로 2 시간 반응시킨 뒤 배지를 제거하고 형광 현미경으로 관찰하였다.After 1 hour, after washing with a salt buffer solution (HBSS) buffer, the salt buffer solution was added to the plate as much as the cell culture solution, and then irradiated until the total irradiation amount reached 50 mJ/cm 2 of UVB. After UVB irradiation, the medium was replaced with a serum-free medium, and then treated with a sample (Example 2 and Production Example 3) at 37°C and incubated for 24 hours in a 5% CO ₂ incubator. After removing the medium, 1 μg/ml of JC-1 solution was treated and reacted for 2 hours without light in a 37° C., 5% CO ₂ incubator to remove the medium and observed under a fluorescence microscope.

이와 같은 JC-1 solution을 이용한 염색을 통해 건강한 mitochondria 상태라면 red:green의 비가 1:1로 확인되지만, mitochondrial dysfunction을 유도할 수 있는 stress가 가해진 상태나 세포의 손상이나 사멸이 유도된 상태라면 red:green 비가 0.5:1 등과 같이 green 값에는 변화가 없고 순전히 red 값이 현저하게 줄어들게 된다.Through staining with JC-1 solution, the ratio of red:green is confirmed to be 1:1 when healthy mitochondria is present, but red when stress is applied to induce mitochondrial dysfunction or cell damage or death is induced. There is no change in the green value, such as 0.5:1 :green ratio, and the red value is significantly reduced.

이에 도 5를 통해 확인한 바, 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체 처리군이 UVB 조사로 인해 미토콘드리아의 손상이 증가된 세포를 회복시키며, UVB 처리가 되지 않은 대조군 수준으로 미토콘드리아를 건강한 상태로 유지시키는 것으로 확인된다. 그러나 일반상수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 뉴클레오티드 정제물은 대조군 수준까지는 그 값이 상승되지 않아 미토콘드리아의 회복 상태가 더딘 것을 알 수 있다. As shown in FIG. 5, the dermabiotics-derived mineral-nucleotide conjugate culture group cultured in lava seawater restores cells with increased damage to mitochondria due to UVB irradiation, and healthy mitochondria as a control level without UVB treatment It is confirmed to remain in the state. However, the nucleotide purification derived from Dermabiotics cultured in a general constant does not increase its value to the control level, indicating that the recovery state of mitochondria is slow.

<실험예 5: 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체의 Mitochondrial biogenesis 유도를 통한 세포회복 효과 ><Experimental Example 5: Cell recovery effect through induction of mitochondrial biogenesis of dermabiotics-derived mineral-nucleotide complex cultured in lava seawater>

섬유아세포(human fibroblast)를 35 mm plate 에 분주하여 24 시간 안정화한 후, serum-free medium 으로 교체하고 샘플을 처리하였다. 1시간 뒤, 염류완충용액(HBSS)버퍼로 세척 후 염류완충용액(HBSS)을 첨가한 뒤 UVB 50 mJ/㎠을 조사하였다. Serum-free medium 으로 배지를 교체한 뒤 시료(실시예 2 및 제조예 3)를 처리하여 37℃, 5% CO₂ incubator 에서 24 시간 배양하였다. 배양 후 세포를 lysis reagent(Qiagen) 1ml로 모은 후, chloroform, 2-propanol, ethanol을 이용하여 RNA를 추출한다. 추출된 RNA를 DEPC가 처리된 정제수를 넣은 후, Qubit florometer(Invitrogen, USA)와 Qubit RNA BR Assay kit(Invitrogen, USA)를 사용하여 정량한 다음 cDNA를 합성하여 real-time PCR을 실시하였다. cDNA합성은 high capacity RNA-to-cDNA kit(Applied Biosystems, USA)를 사용하였고, kit의 방법에 의해 실험을 수행하였다. Real-time PCR은 kit(qPCRBIO SyGreen Blu Mic Lo-ROX, PCRBIOSYSTEMS, London, UK)를 사용하였고 kit의 방법에 의해 실험을 수행하였으며, applied Biosystems 7500 FAST Real-Time PCR System을 이용해 유전자를 증폭한 후 증폭산물을 정량 분석하였다. PCR에 사용된 primer는 표 3에 나타내었으며, 코스모진텍(KOREA)에서 합성하여 사용하였다.After fibroblasts (human fibroblast) were dispensed on a 35 mm plate and stabilized for 24 hours, the cells were replaced with serum-free medium and samples were treated. After 1 hour, after washing with a salt buffer solution (HBSS) buffer, a salt buffer solution (HBSS) was added, and then UVB 50 mJ/cm 2 was irradiated. After replacing the medium with a serum-free medium, the samples (Example 2 and Preparation Example 3) were treated and incubated for 24 hours in a 37°C, 5% CO ₂ incubator. After incubation, cells are collected with 1 ml of lysis reagent (Qiagen), and RNA is extracted using chloroform, 2-propanol, and ethanol. After adding the purified water treated with DEPC to the extracted RNA, quantitation was performed using a Qubit florometer (Invitrogen, USA) and a Qubit RNA BR Assay kit (Invitrogen, USA), and then cDNA was synthesized to perform real-time PCR. For cDNA synthesis, a high capacity RNA-to-cDNA kit (Applied Biosystems, USA) was used, and experiments were performed by the method of the kit. For real-time PCR, a kit (qPCRBIO SyGreen Blu Mic Lo-ROX, PCRBIOSYSTEMS, London, UK) was used, and experiments were performed by the method of the kit.After amplification of the gene using applied Biosystems 7500 FAST Real-Time PCR System The amplification product was quantitatively analyzed. The primers used for PCR are shown in Table 3, and were synthesized and used by Cosmogenetech (KOREA).

미토콘드리아 생합성
유전자 확인용 프라이머Mitochondrial biosynthesis
Primer for gene identification 정방향Forward 역방향Reverse PGC-1αPGC-1α 5’-CTTTGCCCAGATCTTCCTGAAC-3’5’-CTTTGCCCAGATCTTCCTGAAC-3’ 5’-CACTGCACCACTTGAGTCCAC-3’5’-CACTGCACCACTTGAGTCCAC-3’ GAPDHGAPDH 5’-CAATGACCCCTTCATTGACC-3’5’-CAATGACCCCTTCATTGACC-3’ 5’-AAATGAGCCCCAGCCTTCT-3’5’-AAATGAGCCCCAGCCTTCT-3’

도 6의 결과에 따르면 UVB가 처리된 세포에서 손상된 세포를 회복시키기 위하여 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체가 피부 노화시 감소되는 PGC-1α의 발현을 5(v/v)% 동일 농도에서 일반상수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 뉴클레오티드 정제물 대비 16% 증가시켰으며, 이를 통해 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체는 피부의 손상 세포 회복 및 피부에 활력 효과를 나타낼 것으로 예상된다.According to the results of FIG. 6, the dermal biotics-derived mineral-nucleotide conjugate cultured in lava seawater to restore damaged cells in UVB-treated cells has 5 (v/v)% expression of PGC-1α, which decreases when aging the skin. Dermabiotics-derived nucleotide purified from normal water at the same concentration was increased by 16%, and through this, Dermabiotics-derived mineral-nucleotide conjugates cultured in lava seawater exhibited rejuvenating cell damage and vitality to skin Is expected.

<실험예 6: 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체를 이용한 피부장벽강화 효과 ><Experimental Example 6: Skin barrier strengthening effect using dermabiotics-derived mineral-nucleotide complex cultured in lava seawater>

각질세포(human keratinocyte)를 cell culture dish에 접종하여 24 시간 배양한다. 그 후 serum-free Epilife(gibco)배지으로 교체하고 시료(실시예 2 및 제조예 3)를 처리하여 3일간 배양한다. 배양 후 세포를 QIAzol™ Lysis reagent(Qiagen) 1ml로 모은 후, chloroform, 2-propanol, ethanol을 이용하여 RNA를 추출한다. 추출된 RNA를 DEPC가 처리된 정제수를 넣은 후, Qubit florometer(Invitrogen, USA)와 Qubit RNA BR Assay kit(Invitrogen, USA)를 사용하여 정량한 다음 cDNA를 합성하여 real-time PCR을 실시하였다. cDNA합성은 high capacity RNA-to-cDNA kit(Applied Biosystems, USA)를 사용하였고, kit의 방법에 의해 실험을 수행하였다. Real-time PCR은 kit(qPCRBIO SyGreen Blu Mic Lo-ROX, PCRBIOSYSTEMS, London, UK)를 사용하였고 kit의 방법에 의해 실험을 수행하였으며, applied Biosystems 7500 FAST Real-Time PCR System을 이용해 유전자를 증폭한 후 증폭산물을 정량 분석하였다. PCR에 사용된 primer는 표 4에 나타내었으며, 코스모진텍(KOREA)에서 합성하여 사용하였다.Incubate keratinocytes in a cell culture dish and incubate for 24 hours. Thereafter, the serum-free Epilife (gibco) medium is replaced, and the samples (Example 2 and Production Example 3) are treated and cultured for 3 days. After incubation, cells are collected with 1 ml of QIAzol™ Lysis reagent (Qiagen), and RNA is extracted using chloroform, 2-propanol, and ethanol. After adding the purified water treated with DEPC to the extracted RNA, quantitation was performed using a Qubit florometer (Invitrogen, USA) and a Qubit RNA BR Assay kit (Invitrogen, USA), and then cDNA was synthesized to perform real-time PCR. For cDNA synthesis, a high capacity RNA-to-cDNA kit (Applied Biosystems, USA) was used, and experiments were performed by the method of the kit. For real-time PCR, a kit (qPCRBIO SyGreen Blu Mic Lo-ROX, PCRBIOSYSTEMS, London, UK) was used, and experiments were performed by the method of the kit.After amplification of the gene using applied Biosystems 7500 FAST Real-Time PCR System The amplification product was quantitatively analyzed. The primers used for PCR are shown in Table 4 and were synthesized and used by Cosmogenetech (KOREA).

피부장벽 강화
유전자 확인용 프라이머Skin barrier strengthening
Primer for gene identification 정방향Forward 역방향Reverse Serine palmitoyl transferase (SPT)Serine palmitoyl transferase (SPT) 5’-TGGTCATTTGGCGCCAGGTC-3’5’-TGGTCATTTGGCGCCAGGTC-3’ 5’-TCCCAACCATTGGCTTCACATC-3’5’-TCCCAACCATTGGCTTCACATC-3’ Filaggrin (FLG)Filaggrin (FLG) 5’-CACGTGGCAGTCCTACAAGT-3’5’-CACGTGGCAGTCCTACAAGT-3’ 5’-CTTTTTGCCTTTCAGTGCCC-3’5’-CTTTTTGCCTTTCAGTGCCC-3’ Claudin-1(CLDN-1)Claudin-1 (CLDN-1) 5’-ACAACACCTTAGTTCCTCTA-3’5’-ACAACACCTTAGTTCCTCTA-3’ 5’-AGCAGTGATATGTCTCCT-3’5’-AGCAGTGATATGTCTCCT-3’ β-actinβ-actin 5’-GGCACCCAGCACAATGAAG-3’5’-GGCACCCAGCACAATGAAG-3’ 5’-CCGATCCACACGGAGTACTTG-3’5’-CCGATCCACACGGAGTACTTG-3’

도 7a에서 보는 바와 같이, 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체가 피부 장벽(brick and mortar) 기능 중 mortar(lipids)에 해당되는 ceramide 합성 관련 효소 Serine palmitoyl-transferase(SPT)에 대해 확인한 결과 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체 5(v/v)% 처리시, 일반상수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 뉴클레오티드 정제물 대비 53% 높아 피부장벽 강화 효과가 탁월하였다. As shown in Figure 7a, the derma biotics-derived mineral-nucleotide conjugate cultured in lava seawater is a ceramide synthesis-related enzyme Serine palmitoyl-transferase (SPT) corresponding to mortar (lipids) of the skin barrier (brick and mortar) function As a result of the treatment, when dermabiotics-derived mineral-nucleotide conjugate 5 (v/v)% cultured in lava seawater was treated, the skin barrier strengthening effect was excellent compared to 53% higher than the dermabiotics-derived nucleotide purified cultured in normal water.

도 7b의 결과에 따르면 terminally differentiation marker 중 하나로 피부 장벽을 구성함과 동시에 천연보습인자(Natural Moisturerizing Factor) 전사체 중 하나인 filaggrin(FLG)에 대한 효능을 확인한 결과 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체는 일반상수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 뉴클레오티드 정제물 대비 5(v/v)% 처리 농도에서 filaggrin(FLG)의 발현양이 3.5배 높게 나타났다. According to the results of FIG. 7B, as a result of confirming the efficacy of filaggrin (FLG), one of the transcripts of natural moisturerizing factor, while forming a skin barrier as one of the terminally differentiation markers, dermabiotics cultured in lava seawater are derived. In the mineral-nucleotide conjugate, the expression level of filaggrin (FLG) was 3.5 times higher at a concentration of 5(v/v)% compared to the nucleotide purified derived from Dermabiotics cultured in general constant.

또한, 이러한 결과를 토대로 filaggrin target 면역형광세포염색을 수행하였다. 면역형광세포염색은 다음의 방법을 이용하였다. In addition, filaggrin target immunofluorescent cell staining was performed based on these results. The following method was used for immunofluorescence cell staining.

human normal keratinocyte를 cell culture dish에 접종하여 하루 배양한하고, serum free Epilife(gibco)배지로 교체한 후 시료(실시예 2 및 제조예 3)를 농도 별로 처리하여 3일간 배양하였다. 세포 고정을 위해 4%(w/v) formaldehyde solution 처리한 후 0.1%(v/v) Triton X-100 solution을 처리하여 10분간 배양한다. 그 후 1% BSA solution으로 교체하여 1시간 후 filaggrin antibody (Invitrogen) 2 ㎍/㎖을 처리하여 반응시킨다. 그런 다음 Alexa Fluor® 488 conjugate antibody(Invitrogen)을 처리하여 반응시키고 DAPI(sigma) 1 ㎍/㎖을 넣어 촬영하였다. Human normal keratinocytes were inoculated in a cell culture dish, cultured for a day, and replaced with serum free Epilife (gibco) medium, and then treated with samples according to concentrations (Example 2 and Production Example 3) for 3 days. For cell fixation, treatment with 4% (w/v) formaldehyde solution followed by treatment with 0.1% (v/v) Triton X-100 solution for 10 minutes. Then, after replacing with 1% BSA solution for 1 hour, react with 2 μg/ml of filaggrin antibody (Invitrogen). Then, Alexa Fluor® 488 conjugate antibody (Invitrogen) was treated to react, and DAPI (sigma) 1 µg/ml was added and photographed.

그 결과 앞선 결과와 마찬가지로 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체 처리 농도 5%(v/v)에서 육안 평가 및 단백질 형광 염색을 통해 cell morphology에서도 분화된 모양이 가장 뚜렷하게 관찰되었으며 이 결과를 수치화하여 도 7c에서 확인하였다.As a result, the differentiated shape was most clearly observed in cell morphology through visual evaluation and protein fluorescence staining at a concentration of 5% (v/v) treated with Derma Biotics-derived mineral-nucleotide complex cultured in lava seawater. Was confirmed in Figure 7c.

이를 통해 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체의 농도 5(v/v)%에서 FLG과 SPT에 대해 일반상수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 뉴클레오티드 정제물 대비 더욱 뛰어난 효능을 보여, 민감해진 피부에 촉촉함을 주고 장벽을 탄탄하게 해줄 수 있는 moisture barrier에 대해 탁월한 효능을 나타내는 것을 알 수 있다.Through this, the concentration of the dermabiotics-derived mineral-nucleotide conjugate cultured in lava seawater is 5 (v/v)%, and it shows better efficacy compared to the Dermabiotics-derived nucleotide purified cultured in general constants for FLG and SPT. It can be seen that it exhibits excellent efficacy against the moisture barrier, which can moisturize the skin and strengthen the barrier.

또한, 도 7d의 결과에 따르면 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체가 water 및 ion의 passage를 조절하고 피부 장벽 강화 기능에 관여하는 tight junction protein(TJ)에 대한 claudin-1 유전자 발현을 확인하였다. In addition, according to the results of FIG. 7D, the dermabiotics-derived mineral-nucleotide complex cultured in lava seawater regulates passage of water and ions and expresses claudin-1 gene for tight junction protein (TJ), which is involved in skin barrier strengthening function. Was confirmed.

실험 결과 해당 조건 (24시간 treatment)에서 claudin-1 유전자 발현에 대해 비교군인 일반상수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 뉴클레오티드 정제물 대비 5(v/v)% 처리군에서 가장 뚜렷하게 시너지 효능이 나타난다. 즉, 용암해수 미네랄-뉴클레오티드 더바바이오틱스는 TJ protein의 claudin-1 유전자 발현을 일반상수 대비 45% 높게 유도시킴으로써 피부 장벽기능을 강화시키는 것을 알 수 있다.As a result of the experiment, the synergistic effect was most pronounced in the 5(v/v)% treatment group compared to the Dermabiotics-derived nucleotide purified cultured in the general group, which is the comparison group, for the claudin-1 gene expression under the corresponding conditions (24 hour treatment). That is, it can be seen that the lava seawater mineral-nucleotide thebabiotics enhances the skin barrier function by inducing the expression of claudin-1 gene of TJ protein 45% higher than the general constant.

<실험예 7: 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체의 피부 마이크로바이옴 조절 기능><Experimental Example 7: Skin microbiome regulation function of dermabiotics-derived mineral-nucleotide complex cultured in lava seawater>

용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체의 피부 마이크로바이옴의 균형조절과 관련된 항상성(homeostasis) 비교를 위해 피부 상재균인 스테필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)와 큐티박테리움 아크네스(Cutibacterium acnes)에 대한 증식 영향성을 평가하였다. Staphylococcus epidermidis and Cutybacterium arc for dermal biotics derived from lava seawater for comparison of homeostasis related to balance of skin microbiome of dermal biotics-derived mineral-nucleotide complex The effects of proliferation on the Ness ( Cutibacterium acnes ) were evaluated.

상세하게는 trypticase soy broth (TSB)에 피부 상재균 각각의 글리세롤 보관 용액을 1% (v/v)씩 접종하여 37℃, 18~20시간 진탕배양하고 배양종료액을 생리식염수로 희석해 O.D.600 ㎚ = 0.02~0.04로 맞추고(약 1x10⁷ CFU/ml) 생리식염수에 실시예 2, 제조예 3의 시료를 각각 3(v/v)% 첨가하였으며 농도에 맞게 희석한 실험 희석용액 9.9 ml에 피부 마이크로바이옴 균 배양희석액 100 ㎕씩 접종하고(최종균수 x10⁵ CFU/ml), 접종 후 0일차, 3일차, 6일차의 생균수를 10배수 다단계 희석하여 trypticase soy agar (TSA)에 1 ml씩 pour-plate를 제작하고 37℃에서 배양하였다. Specifically, the trypticase soy broth (TSB) was inoculated with 1% (v/v) of each glycerol storage solution of skin flora, shake cultured at 37°C for 18 to 20 hours, and the culture end solution was diluted with physiological saline to OD600 ㎚ = 0.02 to 0.04 (approximately 1x10 ⁷ CFU/ml), and 3 (v/v)% of the samples of Example 2 and Preparation Example 3 were added to physiological saline, respectively. Inoculate 100 μl of the culture solution of bio-bacteria (the final number of bacteria x10 ⁵ CFU/ml), and pour 1 ml of trypticase soy agar (TSA) by diluting the viable cells on day 0, day 3, and day 6 by 10-fold multi-step dilution. -plate was prepared and cultured at 37°C.

도 8에서 보는 바와 같이, 시간이 경과함에 따라 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체에 의해 피부 상재균인 스테필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)와 큐티박테리움 아크네스(Cutibacterium acnes)가 증식되어 항상성을 유지할 수 있는 것을 확인할 수 있었으며 일반상수 배양 더마바이오틱스 유래 뉴클레오티드 정제물은 이들 균총의 항상성 조절이 어려운 것을 확인할 수 있다. As shown in FIG. 8, the skin-derived bacteria Staphylococcus epidermidis and Cutibacterium acne are cut by the dermabiotics -derived mineral-nucleotide conjugate cultured in lava seawater over time. It was confirmed that acnes ) can proliferate and maintain homeostasis, and it is confirmed that the nucleotide purification derived from Dermabiotics in general constant culture is difficult to control homeostasis of these microflora.

<실험예 8 : 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체 대량생산><Experimental Example 8: Mass production of mineral-nucleotide complexes derived from Derma Biotics cultured in lava seawater>

상기 실시예 2의 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체 제조공법 및 제조예 2의 제조공법으로 100 L scale로 각 시료를 대량생산을 진행하였고 이에 대한 결과 사진을 도 9에 개시하였다. 또한 대량생산 후, 더마바이오틱스 뉴클레오티드 분석법에 의해 순도를 측정하여 도 10에 나타내었다.Mass production of each sample was performed at 100 L scale using the manufacturing method of the derma biotics-derived mineral-nucleotide conjugate cultured in the lava seawater of Example 2 and the manufacturing method of Preparation Example 2, and the results of this are shown in FIG. 9 . In addition, after mass production, the purity was measured by Dermabiotics nucleotide analysis and shown in FIG. 10.

도 9에서 보는 바와 같이, 종래의 기술인 제조예 2를 이용한 뉴클레오티드가 포함된 상등액(미생물 파쇄물)에는 각종 세포벽 성분과 지질단백질, 당단백질등이 포함되어 있어 열압추출간에 카라멜화(caramellization)가 진행되어 색상이 진한 갈색으로 변화하였으며, 발효 이상취 또한 나타내었다. 반면, 본 발명에 의한 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체 제조법(용암해수배양, 미생물 파쇄, 원심분리, 막분리 공정진행)을 적용하였을 때, 투명하고 발효이상취가 없는 안정한 원료가 제조되었다. As shown in FIG. 9, the supernatant (microbial lysate) containing nucleotides using the prior art Preparation Example 2 contains various cell wall components, lipoproteins, glycoproteins, and the like, and thus caramelization is performed between heat-pressure extractions. The color changed to a dark brown color, and also showed an abnormal fermentation. On the other hand, when applying the Dermabiotics-derived mineral-nucleotide complex cultured in lava seawater according to the present invention (lava seawater culture, microbial crushing, centrifugation, membrane separation process), it is a transparent and stable raw material without fermentation abnormalities Was prepared.

대량생산된 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체 원료에 대한 순도(purity)는 Absorbance ratio 260/280은 2.0~2.2, Absorbance ratio 260/230에서 1.8~2.0 이면 pure하다고 본다. Purity for mineral-nucleotide complex raw materials derived from Dermabiotics cultured in lava seawater produced in mass production is considered to be pure if Absorbance ratio 260/280 is 2.0-2.2 and Absorbance ratio 260/230 is 1.8-2.0.

이를 더마바이오틱스 뉴클레오티드 분석법으로 측정한 결과, 도 10 및 표 5에서 보는 바와 같이 뉴클레오티드가 고농도 농축됨으로써 UV 각 파장에서의 농도가 높게 측정되었으며 ratio를 통해 순도를 확인하였다. 특히, 제조공정상 혼입되는 단백질 등의 불순물이 제거됨으로써 그래프의 단일성을 유지할 수 있었다. As a result of the measurement by the Dermabiotics nucleotide analysis method, as shown in Fig. 10 and Table 5, the concentration of nucleotides at a high concentration of UV was measured and the purity was confirmed through the ratio. In particular, it was possible to maintain the unity of the graph by removing impurities such as proteins incorporated in the manufacturing process.

샘플Sample A230 (Abs)A230 (Abs) A260 (Abs)A260 (Abs) A280 (Abs)A280 (Abs) 260/280 ratio260/280 ratio 260/230 ratio260/230 ratio 용암해수 배양 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체(실시예 2)Mineral-nucleotide conjugate derived from lava seawater culture Derma Biotics (Example 2) 8.0138.013 14.55714.557 7.2517.251 2.012.01 1.821.82 일반상수 배양 더마바이오틱스 유래 뉴클레오티드(제조예 2)Nucleotide derived from Dermabiotics in General Constant Culture (Production Example 2) 51.1851.18 8.7028.702 7.1757.175 1.211.21 0.170.17

<실험예 9 : 다양한 더마바이오틱스 균주로 제조한 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체 효능 비교> <Experimental Example 9: Comparison of the efficacy of mineral-nucleotide conjugates derived from Derma Biotics cultured in lava seawater prepared with various strains of Derma Biotics>

다양한 더마바이오틱스들을 활용하여 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체 제조 시 효능을 확인하기 위하여 하기 표 6에 명시된 더마바이오틱스들로 실시예 2의 30(v/v)% 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체 제조공법을 적용하여 제조하였다.30(v/v)% lava seawater of Example 2 with Dermabiotics specified in Table 6 below in order to confirm the efficacy when preparing the Dermabiotics-derived mineral-nucleotide conjugate cultured in lava seawater using various Dermabiotics It was prepared by applying a method for manufacturing a mineral-nucleotide conjugate derived from Derma Biotics cultured in.

균주번호Strain number 균주명Strain name 1One Lactobacillus plantarumLactobacillus plantarum 22 Bifidobacterium longumBifidobacterium longum 33 Streptococcus thermophilusStreptococcus thermophilus 44 Lactococcus lactisLactococcus lactis 55 Enterococcus faecalisEnterococcus faecalis 66 Pediococcus pentosaceusPediococcus pentosaceus 77 Weissella cibariaWeissella cibaria 88 Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae 99 Bacillus subtilisBacillus subtilis 1010 Staphylococcus epidermidisStaphylococcus epidermidis 1111 Propionibacterium acnesPropionibacterium acnes

이 후, 실험예 6의 방법 중 Filaggrin 유전자 발현을 확인한 결과, 도 11에 제시한 바와 같이 양성대조군인 1.2mM CaCl₂ 대비 전반적으로 Filaggrin 유전자 발현이 증가되는 것을 확인하였고 본 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체 제조방법은 다양한 더마바이오틱스들로부터 피부장벽 강화 등의 효능을 구현할 수 있는 특화된 제조방법임을 확인할 수 있었다.Thereafter, as a result of confirming the expression of the Filaggrin gene in the method of Experimental Example 6, as shown in FIG. 11, it was confirmed that the expression of the Filaggrin gene increased overall compared to the 1.2mM CaCl ₂ positive control group, and Dermabio cultured in the lava seawater. It has been confirmed that the method for manufacturing a mineral-nucleotide complex derived from TIX is a specialized production method capable of realizing efficacy such as strengthening of a skin barrier from various derma biotics.

<화장료 제형예 1. 유연 화장수의 제조><Cosmetic formulation example 1. Preparation of flexible lotion>

하기 표 7의 조성과 같이, 실시예 2의 미네랄-뉴클레오티드 결합체 함유 상등액을 함유한 유연 화장수(스킨, 100g)를 통상의 방법에 따라 제조하였다. As shown in the composition of Table 7, the flexible lotion (skin, 100 g) containing the supernatant containing the mineral-nucleotide complex of Example 2 was prepared according to a conventional method.

원료Raw material 함량 (g)Content (g) 실시예 2의 미네랄-뉴클레오티드 결합체 함유 상등액The supernatant containing the mineral-nucleotide conjugate of Example 2 3.03.0 글리세린glycerin 3.03.0 부틸렌글리콜Butylene glycol 2.02.0 프로필렌글리콜Propylene glycol 2.02.0 폴리옥시에칠렌(60)경화 피마자유Polyoxyethylene (60) hardened castor oil 1.01.0 에탄올ethanol 10.010.0 트리에탄올아민Triethanolamine 0.10.1 방부제antiseptic 미량a very small amount 색소Coloring 미량a very small amount 향료Spices 미량a very small amount 정제수Purified water 잔량Balance

<화장료 제형예 2. 영양 화장수의 제조><Cosmetic formulation example 2. Preparation of nutritional lotion>

실시예 2의 미네랄-뉴클레오티드 결합체 함유 상등액의 상등액을 70(v/v)% 에탄올 수용액으로 추출한 후 용매를 제거한 농축액을 얻고, 이 농축액을 표 8과 같이 함유한 영양 화장수(로션, 100g)를 통상의 방법에 따라 제조하였다. After extracting the supernatant of the supernatant containing the mineral-nucleotide complex of Example 2 with an aqueous 70 (v/v)% ethanol solution, a concentrated solution from which a solvent was removed was obtained. It was prepared according to the method.

원료Raw material 함량 (g)Content (g) 실시예 2의 미네랄-뉴클레오티드 결합체 함유 상등액The supernatant containing the mineral-nucleotide conjugate of Example 2 1.01.0 시토스테롤Citosterol 1.71.7 폴리글리세릴 2-올레이트Polyglyceryl 2-oleate 1.51.5 세테아레스Seteares 1.21.2 콜레스테롤cholesterol 1.51.5 디세틸포스페이트Dicetyl phosphate 0.40.4 농글리세린Concentrated glycerin 5.05.0 선플라워오일Sunflower Oil 10.010.0 카르복시비닐폴리머Carboxyvinyl polymer 0.20.2 산탄검Shotgun Sword 0.30.3 방부제antiseptic 미량a very small amount 향료Spices 미량a very small amount 정제수Purified water 잔량Balance

<화장료 제형예 3. 영양크림의 제조><Cosmetic formulation example 3. Preparation of nutrient cream>

하기 표 9의 조성과 같이, 실시예 2의 미네랄-뉴클레오티드 결합체 함유 상등액을 함유한 영양크림(100g)을 통상의 방법에 따라 제조하였다. As shown in the composition of Table 9, the nutrient cream (100 g) containing the supernatant containing the mineral-nucleotide conjugate of Example 2 was prepared according to a conventional method.

원료Raw material 함량 (g)Content (g) 실시예 2의 미네랄-뉴클레오티드 결합체 함유 상등액The supernatant containing the mineral-nucleotide conjugate of Example 2 5.05.0 시토스테롤Citosterol 4.04.0 폴리글리세릴 2-올레이트Polyglyceryl 2-oleate 3.03.0 세라마이드Ceramide 0.70.7 세테아레스-4Seteares-4 2.02.0 콜레스테롤cholesterol 3.03.0 디세틸포스페이트Dicetyl phosphate 0.40.4 농글리세린Concentrated glycerin 5.05.0 선플라워오일Sunflower Oil 22.022.0 카르복시비닐폴리머Carboxyvinyl polymer 0.50.5 트리에탄올아민Triethanolamine 0.50.5 방부제antiseptic 미량a very small amount 향료Spices 미량a very small amount 정제수Purified water 잔량 Balance

이상과 같이, 본 발명에 대해 상기 제조예, 실시예 및 실험예를 참조하고 설명하였으나, 이는 예시적인 것에 불과하며, 본 발명에 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호범위는 첨부된 특허 청구 범위의 기술적 사항에 의해 정해져야 할 것이다. As described above, the present invention has been described and described with reference to the above manufacturing examples, examples, and experimental examples, but these are merely exemplary, and those skilled in the art to which the present invention pertains have various modifications and equivalents. It will be understood that other embodiments are possible. Therefore, the true technical protection scope of the present invention should be determined by the technical matters of the appended claims.

Claims

(제1단계) 용암해수를 배양용수로 이용한 배지에서 더마바이오틱스를 배양하여 1차 배양액을 얻는 단계;
(제2단계) 상기 배양액으로부터 균체를 회수한 후, 용암해수 미네랄 농축수에 배양하여 2차 배양액을 얻는 단계; 및
(제3단계) 상기 2차 배양액을 열압추출 및 냉각정제하여 미네랄-뉴클레오티드가 포함된 상등액을 회수하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체의 제조방법. (Step 1) culturing Derma Biotics in a medium using lava seawater as culture water to obtain a primary culture solution;
(Second step) After recovering the cells from the culture medium, culturing in lava seawater mineral concentrate to obtain a secondary culture medium; And
(3rd step) recovering the supernatant containing the mineral-nucleotide by extracting and cooling and purifying the secondary culture solution by thermal pressure;
Method of producing a mineral-nucleotide conjugate derived from Derma Biotics cultured in lava seawater, comprising a.

제1항에 있어서,
상기 제1단계의 배지는 구성성분으로서 포도당, 효모추출물, 소이펩톤, 카제인이 포함되고, 상기 구성 성분을 용암해수가 30~70%(v/v) 포함된 물에 용해하고 멸균한 배지인 것을 특징으로 하는 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체의 제조방법. According to claim 1,
The medium of the first step includes glucose, yeast extract, soy peptone, and casein as components, and the medium is sterile and dissolved in water containing 30 to 70% (v/v) of lava seawater. Method of producing a mineral-nucleotide conjugate derived from Derma Biotics cultured in lava seawater, characterized by.

제1항에 있어서,
상기 제1단계의 더마바이오틱스는 락토바실러스 속 (Lactobacillus sp.), 비피도박테리움 속 (Bifidobacterium sp.), 스트렙토코커스 속 (Streptococcus sp.), 락토코커스 속 (Lactococcus sp.), 엔테로코커스 속 (Enterococcus sp.), 페디오코커스 속 (Pediococcus sp.), 바이셀라 속 (Weissella sp.), 사카로마이세스 속 (Saccharomyces sp.), 바실러스 속 (Bacillus sp.), 스테필로코커스 속 (Staphylococcus sp.) 및 프로피오니박테리움 속 (Propionibacterium sp.)으로 이루어진 군에서 하나 이상의 균주인 것을 특징으로 하는 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체의 제조방법. According to claim 1,
The first stage of Dermabiotics is Lactobacillus sp., Bifidobacterium sp., Streptococcus sp., Lactococcus sp., Enterococcus genus ( Enterococcus sp.), Pediococcus sp., Weissella sp., Saccharomyces sp., Bacillus sp., Staphylococcus sp.) and propionibacterium ( Propionibacterium sp.) method of producing a mineral-nucleotide complex derived from Dermabiotics cultured in lava seawater, characterized in that at least one strain from the group consisting of.

제1항에 있어서,
상기 제2단계의 농축수는 1L당 칼슘 220mg 이상, 마그네슘 1,130mg 이상, 셀레늄 0.013mg 이상이 포함된 상태의 미네랄 농축수이며, 용암해수를 감압농축 또는 삼투농축하여 얻은 것을 특징으로 하는 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체의 제조방법. According to claim 1,
The concentrated water of the second step is a mineral concentrated water in a state containing more than 220mg of calcium per 1L, more than 1,130mg of magnesium, and more than 0.013mg of selenium, and is obtained from lava seawater characterized in that the lava seawater is concentrated under reduced pressure or osmosis. Method for preparing a cultured dermabiotics-derived mineral-nucleotide conjugate.

제1항에 있어서,
상기 제3단계의 열압추출 조건은 120~130℃, 0.12~0.30M Pa에서 15~200분간 수행되는 것을 특징으로 하는 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체의 제조방법. According to claim 1,
The third step of the thermo-pressure extraction conditions are 120 ~ 130 ℃, 0.12 ~ 0.30M Pa manufacturing method of mineral-nucleotide complex derived from Derma Biotics cultured in lava seawater, characterized in that performed for 15 to 200 minutes.

제1항에 있어서,
상기 제3단계의 냉각정제는 3~5℃로 유지된 상태에서 3,000~8,000 rpm에서 10~30분간 원심분리하고 200 nm 이하의 기공크기(pore size)를 갖는 나노막을 이용한 나노막 여과공정을 이용하여 미네랄-뉴클레오티드를 포함하는 상등액을 수거하여 실시하는 것을 특징으로 하는 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체의 제조방법. According to claim 1,
The cooling purification of the third step is centrifuged at 3,000-8,000 rpm for 10-30 minutes while being maintained at 3~5°C, and a nano-membrane filtration process using a nano-membrane having a pore size of 200 nm or less is used. Method for producing a mineral-nucleotide conjugate derived from Dermabiotics cultured in lava seawater, characterized in that the supernatant containing the mineral-nucleotide is collected and carried out.

제1항에 있어서,
상기 제3단계의 상등액 내 뉴클레오티드의 농도 범위는 200~2,000㎍/㎖인 것을 특징으로 하는 용암해수에서 배양된 더마바이오틱스 유래 미네랄-뉴클레오티드 결합체의 제조방법. According to claim 1,
Method for producing a mineral-nucleotide conjugate derived from Dermabiotics cultured in lava seawater, characterized in that the concentration range of the nucleotide in the supernatant of the third step is 200-2,000 μg/ml.

제1항의 방법으로 제조한 것을 특징으로 하는 미네랄-뉴클레오티드 결합체.Mineral-nucleotide conjugate, characterized in that produced by the method of claim 1.

제8항의 미네랄-뉴클레오티드 결합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부장벽 강화용 화장료 조성물.A cosmetic composition for strengthening the skin barrier, comprising the mineral-nucleotide conjugate of claim 8.

제9항에 있어서,
상기 조성물은 SPT(Serine palmitolytransferase), 필라그린(Filaggrin) 및 클라우딘-1(Claudin-1)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 유전자 또는 단백질의 발현을 증강시키는 것을 특징으로 하는 피부장벽 강화용 화장료 조성물.The method of claim 9,
The composition is a cosmetic composition for strengthening the skin barrier, characterized by enhancing the expression of one or more genes or proteins selected from the group consisting of SPT (Serine palmitolytransferase), Filaggrin and Cludin-1. .

제9항에 있어서,
상기 조성물은 UV 손상에 따른 피부세포의 회복 효능이 더 있는 것을 특징으로 하는 피부장벽 강화용 화장료 조성물.The method of claim 9,
The composition is a cosmetic composition for strengthening the skin barrier, characterized in that it further has the effect of recovering skin cells due to UV damage.

제11항에 있어서,
상기 조성물은 PGC-1α(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1α)의 발현을 증강시키는 효능이 있는 것을 특징으로 하는 피부장벽 강화용 화장료 조성물.The method of claim 11,
The composition is a cosmetic composition for strengthening the skin barrier, characterized in that it has the effect of enhancing the expression of PGC-1α (Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1α).

제9항에 있어서,
상기 조성물은 피부 상재균인 스테필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)의 총 균수를 유지하거나 증가하는 기능이 있는 것을 특징으로 하는 피부장벽 강화용 화장료 조성물.The method of claim 9,
The composition is a cosmetic composition for strengthening the skin barrier, characterized in that it has a function to maintain or increase the total number of Staphylococcus epidermidis ( Staphylococcus epidermidis ), which is a skin flora.

제9항에 있어서,
상기 조성물은 피부 상재균인 큐티박테리움 아크네스(Cutibacterium acnes)의 총 균수를 유지하거나 증가하는 기능이 있는 것을 특징으로 하는 피부장벽 강화용 화장료 조성물. The method of claim 9,
The composition is a cosmetic composition for strengthening the skin barrier, characterized in that it has a function of maintaining or increasing the total number of bacteria of the cutaneous bacterium acnes ( Cutibacterium acnes ).