KR102127418B1 - 부위-특이적인 뉴클레오티드 치환을 통해 글리포세이트-내성 벼를 수득하는 방법 - Google Patents

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Abstract

타겟 식물의 내인성 EPSPS 단백질의 보존된 영역의 아미노산 서열의 8번 위치에서 트레오닌 (T)을 이소루신 (I)으로 치환하고, 12번 위치에서 프롤린 (P)을 세린 (S)으로 치환하여, 식물, 즉 글리포세이트-내성 식물을 수득하는 단계를 포함하는, 부위-특이적인 뉴클레오티드 치환에 의해 글리포세이트-내성 벼를 수득하는 방법이 제공된다. CRISPR-매개 NHEJ 경로를 이용해 2개의 gRNA 부위를 설계함으로써 gRNA 부위 사이의 영역을 치환하는 부위-특이적인 뉴클레오티드 치환 및 단편 치환을 달성하는 방법이 제공된다.

Description

부위-특이적인 뉴클레오티드 치환을 통해 글리포세이트-내성 벼를 수득하는 방법
본 발명은 생물공학적 육종 분야에 속하며, 부위-특이적인 뉴클레오티드 치환에 의해 글리포세이트-내성 벼를 수득하는 방법, 및 부위-특이적인 뉴클레오티드 치환 및 단편 치환을 수행하는 방법에 관한 것이다.
벼는 중국, 그리고 심지어 세계적으로도 주된 식품 작물이다. 중국에서, 벼의 전체 면적, 전체 생산량 및 단위 면적 당 수율이 리스트의 1위를 차지하고 있으며, 재배 면적은 약 5억 mu.에 이른다. 중국에서, 논 잡초 발생 면적은 벼 재배 면적의 약 45%를 차지한다. 벼의 생산량은 일반적으로 잡초를 방제하지 않을 경우 5% 내지 15% 감소하며, 연간 감소율은 약 5천만 톤이다. 일부 심각한 경우에는, 생산량은 15% 내지 30% 감소할 수 있다. 논 잡초를 방제하기 위해, 많은 인력과 물질 자원 및 재정 자원이 투입되며, 또한 상당량의 제초제도 사용되었다. 따라서, 제초제-내성 벼를 개발하는 것이 매우 중요하다. 전통적인 육종법은 시간 소모적이고, 이용가능한 생식질 (germplasm) 자원들도 부족한 편이다. 형질전환 기술과 게놈 편집 기술의 개발로, 글리포세이트 내성 벼를 육종하기 위한 효과적인 방법이 마련되었다.
게놈 편집 기술은 최근 수년간 부상하고 있는 새로운 기술로서, 주로 3가지 타입의 서열 특이적인 뉴클레아제, 즉, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZNF), 전사 활성인자-유사 작동자 뉴클레아제 (TALEN: transcription activator - like effector nuclease) 및 주기적 간격으로 분포하는 짧은 회문 구조 반복 서열 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/CRISPR 관련 (CRISPR/Cas9) 시스템을 포함한다. 이들 인공적인 뉴클레아제는 DNA 이중 가닥 절단 (DSB)을 DNA 타겟 부위에 형성하고, DNA 손상으로 생긴 DSB는 손상된 DNA를 복구하기 위한 2가지 복구 기전으로서 세포내 선천적인 비-상동적인 말단-연결 (NHEJ, non-homologous ending-joining) 또는 상동적인 재조합 (HR)을 활성화한다: HR에 의한 복구 가능성은 매우 낮으며; 유기체는 NHEJ에 의해 대부분 복구되는데, 절단된 염색체가 재-연결되지만, 연결이 대개 정확하지 않아, 수개의 뉴클레오티드의 삽입 또는 결손이 절단된 위치에서 발생하여 프래임쉬프트 돌연변이 또는 단백질 번역의 조기 종결로 이어져, 따라서 타겟 유전자의 부위-특이적인 넉아웃이 생기게 될 것이다.
글리포세이트는, 대다수의 식물들에서 광대역의, 효율적이며, 저 독성 및 저잔류성이고, 비-선택적인 장점을 가진, 비-선택적인 제초제이며, 전세계적으로 가장 많이 사용되는 제초제이다. 이의 작용 기전은, 주로, 시킴산 (shikimic acid) 경로에서 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타제 (EPSPS)의 활성을 경쟁적으로 저해하여, 방향족 아미노산의 합성을 차단하는 경로에 의존하며, 궁극적으로 식물을 고사시킨다.
본 발명은 글리포세이트-내성 식물을 수득하는 방법을 개시한다.
본 발명에 의해 제공되는 글리포세이트-내성 식물을 수득하는 방법은 다음과 같은 단계를 포함한다: 오직 타겟 식물의 내인성 EPSPS 단백질의 보존된 영역의 아미노산 서열의 8번 위치에서 트레오닌 (T)을 이소루신 (I)으로 치환하고, 12번 위치에서 프롤린 (P)을 세린 (S)으로 치환하여, 식물, 즉, 글리포세이트-내성 식물을 수득하는 단계; 타겟 식물의 내인성 EPSPS 단백질의 보존된 영역의 아미노산 서열은 서열번호 2에 기재된다.
치환 후 수득되는 보존된 영역의 아미노산 서열은 서열번호 7로 기재된다.
본 방법에 따르면, "오직 타겟 식물의 내인성 EPSPS 단백질의 보존된 영역의 아미노산 서열의 8번 위치에서 트레오닌 (T)을 이소루신 (I)으로 치환하고, 12번 위치에서 프롤린 (P)을 세린 (S)으로 치환"하는 단계는, 하기 a), b), c), d), e) 또는 f)를 타겟 식물의 세포 또는 조직에 도입한 다음, 수득한 세포 또는 조직을 완전한 식물로 배양함으로써, 구현된다;
a) 유전 물질 1, 유전 물질 2 및 공여 벡터: 유전 물질 1은 서열 특이적인 뉴클레아제 1을 발현할 수 있는 원형 DNA 플라스미드, 선형 DNA 단편 또는 시험관내 전사된 RNA이고; 유전 물질 2는 서열 특이적인 뉴클레아제 2를 발현할 수 있는 원형 DNA 플라스미드, 선형 DNA 단편 또는 시험관내 전사된 RNA임;
b) 유전 물질 12 및 공여 벡터: 유전 물질 12은 서열 특이적인 뉴클레아제 1을 발현할 수 있으며 또한 서열 특이적인 뉴클레아제 2를 발현할 수 있는 원형 DNA 플라스미드, 선형 DNA 단편 또는 시험관내에서 전사된 RNA임;
c) 비-유전 물질 1, 비-유전 물질 2 및 공여 벡터: 비-유전 물질 1은 서열 특이적인 뉴클레아제 1을 발현할 수 있는 mRNA이고; 비-유전 물질 2는 서열 특이적인 뉴클레아제 2를 발현할 수 있는 mRNA임;
d) 비-유전 물질 1, 비-유전 물질 2 및 공여 벡터: 비-유전 물질 1은 시험관내에서 발현된 서열 특이적인 뉴클레아제 1의 단백질이고; 비-유전 물질 2는 시험관내에서 발현된 서열 특이적인 뉴클레아제 2의 단백질임;
e) 공여 벡터;
f) 서열 특이적인 뉴클레아제 1을 발현할 수 있으며 또한 서열 특이적인 뉴클레아제 2를 발현할 수 있는 공여 벡터;
공여 벡터는 돌연변이 타겟 서열을 운반하는 벡터이고; 돌연변이 타겟 서열은, 타겟 단편의 1의 5' 말단에서 타겟 단편 2의 3' 말단까지, 타겟 식물의 게놈내 서열에 대응되는 DNA 단편 서열을 포함하되, 원하는 뉴클레오티드 돌연변이를 포함하며; 타겟 단편 1은 내인성 EPSPS 단백질의 보존된 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 상류에 있는 타겟 식물의 게놈내 인트론 영역 (인트론 영역 1으로 지칭됨) 또는 프로모터 영역에 위치하고; 타겟 단편 2는 내인성 EPSPS 단백질의 보존된 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 하류에 있는 타겟 식물의 게놈내 인트론 영역 (인트론 영역 2로 지칭됨)내 또는 3'-UTR 영역에 위치하고; 뉴클레오티드 돌연변이는 타겟 식물의 내인성 EPSPS 단백질의 보존된 영역의 아미노산 서열의 8번 위치에서 트레오닌 (T)이 이소루신 (I)으로 치환되고, 12번 위치에서 프롤린 (P)이 세린 (S)으로 치환된 돌연변이이다.
돌연변이 타겟 서열은, 타겟 단편 1의 5' 말단에서 타겟 단편 2의 3' 말단까지 타겟 식물의 게놈내 서열에 대응되는 DNA 단편 서열일 수 있으되, 원하는 뉴클레오티드 돌연변이를 포함하며; 상류 및/또는 하류 상동적인 서열을 더 포함할 수 있으며, 상류 상동적인 서열은 타겟 식물의 게놈내 타겟 단편 1의 상류에 위치된 서열 세그먼트이고, 하류 상동적인 서열은 타겟 식물의 게놈내 타겟 단편 2의 하류에 위치된 서열 세그먼트이다.
서열 특이적인 뉴클레아제 1은 타겟 식물의 게놈내 타겟 단편 1과 공여 벡터내 타겟 단편 1을 특이적으로 절단할 수 있으며; 서열 특이적인 뉴클레아제 2는 타겟 식물의 게놈내 타겟 단편 2와 공여 벡터내 타겟 단편 2를 특이적으로 절단할 수 있으며; 서열 특이적인 뉴클레아제 1 및 서열 특이적인 뉴클레아제 2가 타겟 식물의 게놈내 및 공여 벡터내 타겟 단편 1과 타겟 단편 2를 동시에 절단하면, 공여 벡터의 타겟 부위 2곳 사이에 치환된 뉴클레오티드를 포함하는 단편이 타겟 식물의 게놈의 타겟 부위 2곳 사이에 삽입될 수 있으며, 따라서 부위-특이적인 뉴클레오티드 치환을 가진 게놈 서열을 수득할 수 있다.
서열 특이적인 뉴클레아제 (예, 서열 특이적인 뉴클레아제 1 또는 서열 특이적인 뉴클레아제 2)는 타겟 식물의 게놈 및 공여 벡터의 타겟 단편을 동시에 특이적으로 절단하여, 잠재적으로 수개의 뉴클레오티드의 삽입 돌연변이 및/또는 결손 돌연변이를 만들 수 있으며, 이러한 돌연변이는 프로모터 영역 및/또는 인트론 영역 및/또는 UTR 영역 (비-번역된 영역)에 위치하여, 따라서 일반적으로 단백질의 기능에는 영향이 없을 것이며; 2종의 서열 특이적인 뉴클레아제 (예, 서열 특이적인 뉴클레아제 1 또는 서열 특이적인 뉴클레아제 2)가 타겟 식물의 게놈 및 공여 벡터의 타겟 단편 1과 타겟 단편 2를 동시에 절단하여, 2개의 타겟 부위 사이에 위치한 서열의 뉴클레오티드 치환 돌연변이가 생길 수 있다.
서열 특이적인 뉴클레아제 1 및 서열 특이적인 뉴클레아제 2 둘다 CRISPR/Cas9 뉴클레아제, TALEN 뉴클레아제, 아연 핑거 서열 또는 게놈 편집을 수행할 수 있는 임의의 서열 특이적인 뉴클레아제일 수 있으며; 서열 특이적인 뉴클레아제 1 및 서열 특이적인 뉴클레아제 2는 동일한 타일이거나 또는 서로 다른 타입일 수 있다.
본 방법에 따르면, 식물은 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물일 수 있다. 단자엽 식물은 벼과 (gramineous) 식물일 수 있다. 특히, 벼과 식물은 벼일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 구체적으로, 식물은 벼 (오리자 사티바 L. 자포니카, cv. 니폰베어 (Oryza sativa L. japonica. cv. Nipponbare)이다.
즉, 게놈 DNA 레벨에서, 타겟 식물의 내인성 EPSPS 단백질의 보존된 영역의 아미노산 서열에서 돌연변이될 잔기 (8번 위치 및 12번 위치)는 타겟 식물의 내인성 EPSPS 단백질의 제2 엑손에 위치하며; 인트론 영역 1은 제1 인트론이며, 이의 뉴클레오티드 서열은 서열목록에서 서열번호 3의 1-704번 위치에 대응되며; 인트론 영역 2는 제2 인트론이고, 이의 뉴클레오티드 서열은 서열목록에서 서열번호 3의 950-1030번 위치에 대응된다. 서열 특이적인 뉴클레아제 1과 서열 특이적인 뉴클레아제 2는 CRISPR/Cas9 뉴클레아제이고, 타겟 단편 1은 서열목록에서 서열번호 3의 1-704번에 대응되는 뉴클레오티드 서열에서 식 5'- NX - NGG - 3' 또는 5'- CCN - NX - 3'에 해당되는 단편이고; N은 A, G, C 및 T 중 임의의 하나이고; 14≤X≤30이고, X는 정수 (예, X는 20)이고; NX는 X개의 연속적인 뉴클레오티드이다. 타겟 단편 2는 서열목록에서 서열번호 3의 950-1030번 위치에 대응되는 뉴클레오티드 서열에서 식 5'- NX - NGG - 3' 또는 5'- CCN - NX - 3'에 해당되는 단편이고; N은 A, G, C 및 T 중 임의의 하나이고; 14≤X≤30이고, X는 정수 (예, X는 20임)이고; NX는 X개의 연속적인 뉴클레오티드이다.
아울러, 타겟 단편 1의 뉴클레오티드 서열은 서열목록에서 서열번호 4로 표시되며; 타겟 단편 2의 뉴클레오티드 서열은 서열목록에서 서열번호 5로 표시된다.
이에, 본 발명에 따라, 구체적으로, 유전 물질 1은 pHUN411 벡터의 BsaI 제한 효소 부위 2개 사이의 소형 단편을 서열목록에서 서열번호 4의 1-20번 위치에 대응되는 DNA 단편으로 치환하여 수득되는 재조합 플라스미드 (pHUN411-C3)이고; 구체적으로, 유전 물질 2는 pHUN411 벡터의 BsaI 제한 효소 부위 2개 사이의 소형 단편을 서열목록에서 서열번호 5의 1-20번 위치에 대응되는 DNA 단편으로 치환하여 수득되는 재조합 플라스미드 (pHUN411-C4)이다.
구체적으로, 공여 벡터에 의해 운반되는 돌연변이 타겟 서열의 뉴클레오티드 서열은 서열목록에서 서열번호 6이다. 특히, 공여 벡터는 서열목록에서 서열번호 6에 나타낸 DNA 단편을 pEASY - Blunt 벡터 (TransGen Biotech Co., Ltd, catalogue number:CB101)에 삽입함으로써 수득되는 재조합 플라스미드 (pEPSPS-donor)이다.
본 발명에서, pHUN411-C3, pHUN411-C4 및 pEPSPS-donor는 벼의 캘러스 (Oryza sativa L. japonica. cv. Nipponbare)에 1:1:2 몰비로 도입된다.
본 방법에 따르면, 세포는, 도입 수여체로서 사용될 수 있으며 조직 배양에 의해 완전한 식물로 재생될 수 있는 임의의 세포일 수 있으며; 조직은 도입 수여체로서 사용될 수 있으며 조직 배양에 의해 완전한 식물로 재생될 수 있는 임의의 세포일 수 있다. 구체적으로, 예를 들어, 세포는 원형질체 세포 (protoplast cell) 또는 현탁 세포 (suspensioncell)일 수 있으며; 예를 들어, 조직은 캘러스 (callus), 미숙배 (immature embryo) 또는 성숙배 (mature embryo)일 수 있다.
본 방법에 있어서, a), b), c), d) 또는 e)를 타겟 식물의 세포 또는 조직에 도입하는 방법은 유전자 총 방법 (gene gun approach), 아그로박테리움 감염 방법 (agrobacterium infection approach), PEG-매개 원형질체 형질전환 방법 (PEG-mediated protoplast transformation approach) 또는 그외 도입 방법일 수 있다.
또한, 아래 생물학적 물질들 중 임의의 하나가 본 발명의 보호 범위에 포함된다:
(1) 오직 벼 내인성 EPSPS 단백질의 보존된 영역의 아미노산 서열의 8번 위치에서 트레오닌 (T)을 이소루신 (I)으로 치환하고 12번 위치에서 프롤린 (P)을 세린 (S)으로 치환함으로써 제조된 단백질; 상기 벼 내인성 EPSPS 단백질의 보존된 영역의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 2임;
(2) 상기 단백질의 코딩 유전자;
(3) 상기 코딩 유전자를 포함하는, 발현 카세트, 재조합 벡터, 재조합 박테리움 또는 형질전환 세포주.
상기한 형질전환 세포주는 비-증식성 물질 (non-propagating material)이다.
또한, 본 발명은 타겟 유전자에서 타겟 뉴클레오티드를 치환하는 방법으로서, 타겟 뉴클레오티드가 하나 이상의 비-연속적인 뉴클레오티드일 수 있고, 또한 연속적인 뉴클레오티드 수개에 의해 형성된 단편일 수 있는, 방법을 제공한다.
타겟 유전자에서 타겟 뉴클레오티드를 치환하는 방법에서, 타겟 유기체의 타겟 유전자내 타겟 뉴클레오티드를 치환하는 단계는 아래 a), b), c), d) 또는 e)를 타겟 유기체의 세포 또는 조직으로 도입함으로써 구현되며:
a) 유전 물질 1, 유전 물질 2 및 공여 벡터: 유전 물질 1은 서열 특이적인 뉴클레아제 1을 발현할 수 있는 원형 DNA 플라스미드, 선형 DNA 단편 또는 시험관내 전사된 RNA이고; 유전 물질 2는 서열 특이적인 뉴클레아제 2를 발현할 수 있는 원형 DNA 플라스미드, 선형 DNA 단편 또는 시험관내 전사된 RNA임;
b) 유전 물질 12 및 공여 벡터: 유전 물질 12은, 서열 특이적인 뉴클레아제 1을 발현할 수 있으며 또한 서열 특이적인 뉴클레아제 2를 발현할 수 있는, 원형 DNA 플라스미드, 선형 DNA 단편 또는 시험관내에서 전사된 RNA임;
c) 비-유전 물질 1, 비-유전 물질 2 및 공여 벡터: 비-유전 물질 1은 서열 특이적인 뉴클레아제 1을 발현할 수 있는 mRNA이고; 비-유전 물질 2는 서열 특이적인 뉴클레아제 2를 발현할 수 있는 mRNA임;
d) 비-유전 물질 1, 비-유전 물질 2 및 공여 벡터: 비-유전 물질 1은 시험관내에서 발현된 서열 특이적인 뉴클레아제 1의 단백질이고; 비-유전 물질 2는 시험관내에서 발현된 서열 특이적인 뉴클레아제 2의 단백질임;
e) 서열 특이적인 뉴클레아제 1를 발현할 수 있으며 또한 서열 특이적인 뉴클레아제 2를 발현할 수 있는 공여 벡터;
공여 벡터는 돌연변이 타겟 서열을 운반하는 벡터이고; 상기 돌연변이 타겟 서열은 타겟 단편 1의 5' 말단에서 타겟 단편 2의 3' 말단까지 상기 타겟 유기체의 게놈내 서열에 대응되는 DNA 단편 서열을 포함하되, 원하는 뉴클레오티드 돌연변이를 포함하며; 상기 타겟 단편 1은 상기 타겟 유기체의 게놈내 타겟 유전자의 타겟 뉴클레오티드의 상류에 있는 인트론 영역 또는 프로모터 영역에 위치되며; 상기 타겟 단편 2는 상기 타겟 유기체의 게놈내 타겟 유전자의 타겟 뉴클레오티드의 하류에 있는 인트론 영역 또는 3'-UTR에 위치된다. 서열 특이적인 뉴클레아제 2종의 타겟 부위들은 프로모터 영역 및/또는 인트론 영역 및/또는 UTR 영역 (비-번역되는 영역)에 위치되며, 타겟 유전자의 발현은 일반적으로 이러한 영역에서의 수개의 뉴클레오티드의 삽입 및 결손에 의해 영향을 받지 않을 것이다.
돌연번이 타겟 서열은 원하는 뉴클레오티드 치환을 포함하는 타겟 단편 1의 5' 말단에서 타겟 단편 2의 3' 말단까지 타겟 유기체의 게놈내 서열에 대응되는 DNA 단편 서열일 수 있으며; 상류 및/또는 하류 상동적인 서열을 더 포함할 수 있으며, 이 상류 상동적인 서열은 타겟 유기체의 게놈내 타겟 단편 1의 상류에 위치되는 서열의 세그먼트이고, 하류 상동적인 서열은 타겟 유기체의 게놈내 타겟 단편 2의 하류에 위치되는 서열의 세그먼트이다.
서열 특이적인 뉴클레아제 1은 타겟 유기체의 게놈내 및 공여 벡터내 타겟 단편 1을 특이적으로 절단할 수 있으며; 서열 특이적인 뉴클레아제 2는 타겟 유기체의 게놈내 및 공여 벡터내 타겟 단편 2를 특이적으로 절단할 수 있다. 공여 벡터는 공여 벡터의 상류 상동적인 서열과 하류 상동적인 서열에 의해 타겟 유기체의 게놈내 타겟 유전자로 인가된다. 서열 특이적인 뉴클레아제 1과 서열 특이적인 뉴클레아제 2가 타겟 유기체의 게놈내 및 공여 벡터내 타겟 단편 1과 타겟 단편 2를 동시에 절단하고, 공여 벡터의 2개의 타겟 부위 사이에서 치환될 뉴클레오티드를 포함하는 단편이 타겟 유기체의 게놈의 2개의 타겟 부위 사이에 삽입될 수 있으며, 따라서 부위-특이적인 뉴클레오티드 치환을 가진 게놈 서열이 수득될 수 있다.
타겟 유기체는 타겟 식물, 타겟 동물 또는 타겟 미생물일 수 있다. 서열 특이적인 뉴클레아제 1과 서열 특이적인 뉴클레아제 2는 CRISPR/Cas9 뉴클레아제, TALEN 뉴클레아제, 아연 핑거 뉴클레아제 또는 유전자 편집을 구현할 수 있는 임의의 서열 특이적인 뉴클레아제일 수 있다. 서열 특이적인 뉴클레아제 1과 서열 특이적인 뉴클레아제 2는 동일한 타입일 수 있으며, 또한 서로 다른 타입일 수 있다.
일부 구현예에서, 타겟 유기체는 벼 또는 아라비돕시스와 같은 단자엽 또는 쌍자엽 등의 식물이다. 세포는, 도입 수여체로서 사용될 수 있고 조직 배양에 의해 완전한 식물로 재생될 수 있는, 임의의 세포일 수 있으며; 조직은, 도입 수여체로서 사용될 수 있고 조직 배양에 의해 완전한 식물로 재생될 수 있는, 임의의 세포일 수 있다. 특히, 예를 들어, 세포는 원형질체 세포 또는 현탁 세포일 수 있으며; 예를 들어, 조직은 캘러스, 미숙배 또는 성숙배일 수 있다. a), b), c), d) 또는 e)를 타겟 식물의 세포 또는 조직으로 도입하는 방법은 유전자 총 방법, 아그로박테리움 감염 방법, PEG-매개 원형질체 형질전환 방법 또는 그외 도입 방법일 수 있다.
일 특정 구현예에서, 식물은 아라비돕시스이고; 타겟 유전자는 서열번호 9의 Atsnc1(At4g16890)이고; 서열 특이적인 뉴클레아제 1은 서열번호 12에 대응되는 sgDNA를 포함하고; 서열 특이적인 뉴클레아제 2는 서열번호 13에 대응되는 sgDNA를 포함하고; 돌연변이 타겟 서열은 서열번호 14로 표시되고; 타겟 뉴클레오티드의 치환으로 서열번호 10의 Atsnc1의 엑손 3이 서열번호 11로 교체되고, 따라서 슈도모나스 시링가에 마쿨리콜라 ES4326 (Pseudomonas syringae pv maculicola ES4326) 및 페로노스포라 파라시티카 Noco2 (Peronospora parasitica Noco2)에 대한 내성이 식물에 부여된다.
본 발명에서, CRISPR-매개 NHEJ 경로에 따라, EPSPS 유전자의 제1 인트론 및 제2 인트론에 각각 위치되는 2개의 gRNA 사이트를 설계하며, 이들 2개의 gRNA는 게놈 및 공여 벡터내 타겟 단편 1과 2를 동시에 CRISPR/ Cas9 기법을 통해 절단하여, 뉴클레오티드(들)가 치환되는 타겟 부위들 사이의 서열에 대응되는 단편이 게놈내 타겟 부위들 사이에 삽입되어 벼의 제2 엑손을 치환할 기회를 가지게 됨으로써, 보존된 영역에 아미노산 2개에 대해 부위-특이적인 돌연변이가 달성되며, 이로써 글리포세이트 내성을 가진 벼가 제조된다. 이는 새로운 제초제-내성 식물 품종을 육종하는데 상당한 의미를 가진다.
또한, 본 발명은 타겟 유전자에서 타겟 뉴클레오티드의 부위-특이적인 치환 방법을 제공한다.
도 1은 CRISPR/Cas9 기법을 위한 2개의 타겟 부위 (C3 및 C4)의 서열과 OsEPSPS 유전자의 구조를 도시한 개략도이다.
도 2는 벼 원형질체에서 C3 및 C4를 타겟팅하는 OsEPSPS의 활성을 검출하는 방법과 해당 서열분석 결과를 도시한 것이다. a)는 원형질체에서 타겟 부위 C3의 PCR/RE 검출 결과를 나타낸 것이고, b)는 타겟 부위 C3의 서열분석 결과를 나타낸 것이고, c)는 원형질체에서 타겟 부위 C4의 PCR/RE 검출 결과를 나타낸 것이고, d)는 타겟 부위 C4의 서열분석 결과를 나타낸 것이다. WT는 야생형 벼 (Oryza sativa L. japonica. cv. Nipponbare)의 게놈 서열을 의미하고, "-"는 결손 돌연변이를 표시하며, "+"는 삽입 돌연변이를 표시하고, "- / +" 다음에 오는 숫자는 결손 또는 삽입된 뉴클레오티드의 수를 표시하고 (소문자는 삽입된 뉴클레오티드임), M1 내지 M4는 4가지 돌연변이 타입을 표시한다.
도 3은 치환을 포함하는 공여 벡터 (pEPSPS - donor)의 구조를 도시한 개략도이다. a)는 벼 게놈내 EPSPS의 보존된 영역의 DNA 서열과 보존된 영역의 코딩된 아미노산 서열을 나타낸 것이고, b)는 공여 벡터내 EPSPS의 보존된 영역의 DNA 서열과 코딩된 아미노산 서열을 나타낸 것이고, 진한 아미노산은 치환 아미노산이다. 이후의 검출을 용이하게 하기 위해, 효소 부위 PvuI이 동의 돌연변이 (synonymous mutation)에 의해 수득된다.
도 4는 PCR/RE를 이용함으로써 CRISPR-매개 부위-특이적인 돌연변이 벼 OsEPSPS 유전자의 T0-세대 돌연변이 검출 결과와 서열분석 결과를 나타낸 것이다. a)는 T0-세대 돌연변이의 PCR/RE 검출 결과로서, 1-16은 서로 다른 재생 계통이며, PCR 산물은 PvuI 제한효소로 절단되며, ck는 야생형 벼 (Oryza sativa L. japonica. cv. Nipponbare) 대조군이고; b)는 돌연변이 1, 5 및 7의 서열분석 결과를 나타낸 것으로, G는 야생형 벼 (Oryza sativa L. japonica. cv. Nipponbare)의 EPSPS 유전자의 부분 서열을 표시하며: 좌측 서열은 C3 부위 서열이고, 중간은 EPSPS의 보존된 영역의 DNA 서열이고, 우측은 C4 부위 서열이고; D는 공여 벡터의 EPSPS 유전자의 부분 서열을 표시하며: 좌측 서열은 C3 부위 서열이고, 중간 서열은 부위-특이적인 돌연변이를 가진 EPSPS의 보존된 영역의 DNA 서열이고, 우측은 C4 부위 서열이다. "-"는 결손 돌연변이를 표시하고, "+"는 삽입 돌연변이를 표시하고, "- / +" 다음에 오는 숫자는 결손 또는 삽입된 뉴클레오티드의 개수를 표시한다 (소문자는 삽입된 뉴클레오티드를 표시함).
도 5는 1 mg/L 글리포세이트가 첨가된 N6 배양 배지에서 벼 식물의 성장을 나타낸 것이다. 10일간 배양 후, a)는 OsEPSPS 유전자에서 TIPS 부위-특이적인 돌연변이를 유발함으로써 수득된 돌연변이 T0-1이고; b)는 야생형 벼 (Oryza sativa L. japonica. cv. Nipponbare) 대조군이다.
달리 언급되지 않은 한, 아래 실시예들에서 사용되는 실험 방법들은 모두 통례적인 방법이다.
달리 언급되지 않은 한, 아래 실시예들에서 사용되는 재료, 시약 등은 상업적으로 이용가능하다.
pHUN411 벡터: "Hui- Li Xing, Li Dong, Zhi - Ping, Wang Hai - Yan Zhang, Chun - Yan Han, Bing, Liu Xue- Chen Wang, Qi - JunChen. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplexgenome editing in the plants. The BMC plant biology. 14: 327- 338 (2014)"에 기술되어 있으며, the Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences로부터 공개적으로 수득할 수 있다. 이 플라스미드는 가이드 RNA를 전사하고 동시에 Cas9 단백질 발현시키기 위해 사용할 수 있다.
실시예 1. 벼의 OsEPSPS 타겟 부위 선택 및 CRISPR 벡터 구축
I. OsEPSPS 타겟 부위 선택
OsEPSPS 유전자의 유전자좌 번호는 06g04280이고, OsEPSPS 유전자는 벼 염색체 6번에 위치하며, 8개의 엑손과 7개의 인트론을 포함하며, 아미노산 515개를 코딩한다. OsEPSPS 유전자의 보존된 영역은 제2 엑손에 위치하며, 넉아웃 벡터 구축을 위해 선택된 타겟 부위들은 각각 제1 인트론과 제2 인트론에 위치한다 (도 1). 벼 게놈에서 OsEPSPS 유전자의 제1 인트론, 보존된 영역을 포함하는 제2 엑손 및 제2 인트론의 서열은 서열번호 3에 나타내는데, 서열번호 3에서 1-704번 위치는 제1 인트론이고, 705-949번 위치는 제2 엑손이고, 950-1030번 위치는 제2 인트론이다.
CRISPR 넉아웃 기법을 위한 타겟 이중 가닥 중 가닥 하나는 다음의 구조를 가진다: 5 - Nx - NGG - 3, PAM (NGG)에서 N은 각각 A, T, C 및 G 중 임의의 하나이고, Nx에서 N은 각각 A, T, C 및 G 중 임의의 하나이고, x는 20이다. OsEPSPS 유전자의 타겟 서열은 하기에 나타내며, PAM (protospacer adjacent motif)은 밑줄 표시된다. 타겟 C3는 제1 인트론에 위치하며, 타겟 C4는 제2 인트론에 위치한다.
C3: 5'- TACTAAATATACAATCCCTTGGG - 3' (서열번호 4);
C4: 5'- AAAATATGTATGGAATTCATGGG - 3' (서열번호 5).
벼를 넉아웃 벡터로 형질전환한 후, Cas9 단백질이 gRNA의 매개 하에 타겟 서열 영역을 절단하여 DNA 이중-가닥 절단을 형성하고, 유기체의 자가-손상 복구 기전이 촉발되어, 돌연변이 ('돌연변이'는 삽입 돌연변이, 결손 돌연변이, 치환 돌연변이 및 기타 형태 등의 임의의 돌연변이를 치징하며, 이들 돌연변이 대부분이 기능 불활성화 돌연변이임)가 세포가 자발적으로 갭을 복구하는 과정 중에 도입될 것이다.
전술한 타겟 서열 C3는 BsaJI 효소 절단 인지 서열 (진한 이탤릭체 서열)을 포함하며, BsaJI 제한 효소에 의해 절단될 수 있으며; 전술한 타겟 서열 C4는 EcoRI 효소 절단 인지 서열 (진한 이탤릭체 서열)을 포함하며, EcoRI 제한 효소에 의해 절단될 수 있다. C3 타겟 서열의 절단 후, 돌연변이가 발생한 경우, BsaJI 효소 절단 인지 서열이 파괴되어 제한 효소 BsaJI에 의해 절단되지 않을 수 있으며; 돌연변이가 발생되지 않았다면, BasJI 효소 절단 인지 서열은 제한 효소 BsaJI에 의해 절단될 수 있다. 마찬가지로, C4 타겟 서열 영역을 절단한 후, 만일 돌연변이가 발생한 경우, EcoRI 효소 절단 인지 서열이 파괴되었을 것이고, 그래서 제한 효소 EcoRI에 의해 절단될 수 없으며; 만인 돌연변이가 발생하지 않은 경우, EcoRI 효소 절단 인지 서열은 제한 효소 EcoRI에 의해 절단될 수 있다.
II. 재조합 벡터 구축
1. pHUN411 플라스미드 (이 플라스미드는 BsaI 제한 효소 인지 부위 2개를 포함함)를 제한 효소 BsaI로 절단하였으며, 약 12.5kb의 벡터 백본을 회수하여 HUN411로 명명하였다.
2. 단계 I에서 설계된 C3 및 C4 타겟 부위에 따라, 코헤시브 말단 (밑줄 표시됨)을 가진 프라이머를 다음과 같이 합성하였다:
C3 - F: 5'- GGCGTACTAAATATACAATCCCTT - 3';
C3 - R: 5'- AAACAAGGGATTGTATATTTAGTA - 3'.
C4 - F: 5'- GGCGAAAATATGTATGGAATTCAT - 3';
C4 - R: 5'- AAACATGAATTCCATACATATTTT - 3'.
3. C3-F 및 C3-R 뿐만 아니라 C4-F 및 C4-R을 각각 어닐링하여, C3 및 C4로 명명되는 코헤시브 말단을 가진 이중 가닥 DNA를 만들고, 이를 단계 I의 겔 회수 산물 HUN411과 연결하여, 재조합 플라스미드 pHUN411-C3 및 pHUN411-C4를 수득하였다.
재조합 플라스미드 pHUN411 - C3의 구조는 다음과 같이 설명된다: 재조합 플라스미드는, pHUN411 벡터의 2개의 BsaI 제한 효소 부위 사이의 소형 단편 (약 1.2kb)을 서열번호 4의 1-20번에 대응되는 DNA 단편으로 치환하여 수득되며, 이 플라스미드는 서열번호 4를 포함하는 가이드 RNA를 전사하고 Cas9 단백질을 발현하는데 사용될 수 있다.
재조합 플라스미드 pHUN411-C4의 구조는 다음과 같이 설명된다: 재조합 플라스미드는, pHUN411 벡터의 2개의 BsaI 제한 효소 부위 사이의 소형 단편 (약 1.2kb)을 서열번호 5의 1-20번에 대응되는 DNA 단편으로 치환하여 수득되며, 이 플라스미드는 서열번호 5를 포함하는 가이드 RNA를 전사하고 Cas9 단백질을 발현하는데 사용될 수 있다.
실시예 2. 벼 원형질체의 형질전환 및 원형질체에서 재조합 벡터의 활성 검출
실시예 1에서 구축한 재조합 플라스미드 pHUN411 - C3 및 pHUN411- C4를 각각 PEG-매개 방식을 통해 벼 (Oryza sativa L. japonica. cv. Nipponbare)의 원형질체에 전달하였다. 원형질체의 게놈 DNA를 추출하였으며, 타겟 부위 C3 및 C4를 포함하는 OsEPSPS 유전자를 특이 프라이머를 사용한 PCR에 의해 증폭시켰다. 그런 후, 타겟 부위 C3 및 C4를 포함하는 PCR 증폭 산물을 각각 제한 효소 BsaJI 및 EcoRI으로 절단하였다 (PCR 증폭 산물의 일부 밴드를 절단할 수 없다면, 이는 실시예 1에서 설계된 타겟 부위가 효과적이라는 것을 의미함). 제한 효소로 절단할 수 없는 PCR 증폭 산물은 겔 회수를 수행하여, pEASY - Blunt 벡터 (TransGen Biotech Co., Ltd., catalogue number:CB101)에 삽입하였으며, 개개 콜로니를 서열분석을 위해 선별하였다.
타겟 부위 C3 및 C4를 포함하는 유전자를 각각 증폭시키기 위한 프라이머는 다음과 같은 서열을 가진다:
상류 프라이머 OsEC3 - F: 5'- CTAGGAATTATCTCTCAAGTCAATC - 3';
하류 프라이머 OsEC3 - R: 5'- CTCACTGTTCAGCAAGTTGTCC - 3'.
상류 프라이머 OsEC4 - F: 5'- TTCTTAATAGCTTTGATCGCG - 3';
하류 프라이머 OsEC4 - R: 5'- TAACCTTGCCACCAGGAAGTC - 3'.
실험 중에, 야생형 벼 (Oryza sativa L. japonica. cv. Nipponbare)의 미-절단 PCR 산물 대조군과 BsaJI 또는 EcoRI에 의해 절단된 야생형 PCR 산물 대조군을 세트로 사용하였다. 실험을 3번 반복 실시하였다.
원형질체에서 C3 재조합 벡터의 활성을 검출하기 위한 효소 절단 결과들은 도 2a에 나타내었으며, 여기서 1번 레인과 2번 레인은 형질전환된 원형질체로서, 이는 BsaJI에 의해 절단할 수 없었던 PCR 밴드 (크기는 예상된 바에 따르면 약 640 bp임)를 포함하고 있었으며, 이는 타겟 부위 C3가 효과적이라는 것을 의미하며; 3번 레인은 미-절단 야생형 PCR 산물 대조군이고; 4번 레인은 BsaJI에 의해 완전히 절단할 수 있었던 절단된 야생형 PCR 산물 대조군이다. 서열분석 결과 (도 2b), 수개의 뉴클레오티드의 삽입 또는 결손이 타겟 부위에서 발생한 것으로 확인되었으며, 재조합 벡터 pHUN411-C3가 타겟 부위 C3에서 부위-특이적인 유전자 편집을 수행한 것으로 검증되었다.
원형질체에서 C4 재조합 벡터의 활성을 검출하기 위한 효소 절단 결과는 도 2c에 나타내었으며, 여기서 1번 레인과 2번 레인은 형질전환된 원형질체로서, 이는 EcoRI에 의해 절단할 수 없었던 PCR 밴드 (크기는 예상된 바에 따르면 약 730 bp임)를 포함하고 있었으며, 이는 타겟 부위 C4가 효과적이라는 것을 의미하며; 3번 레인은 미-절단 야생형 PCR 산물 대조군이고; 4번 레인은 EcoRI에 의해 완전히 절단할 수 있었던 절단된 야생형 PCR 산물 대조군이다. 서열분석 결과 (도 2b), 수개의 뉴클레오티드의 삽입 또는 결손이 타겟 부위에서 발생한 것으로 확인되었으며, 재조합 벡터 pHUN411-C4가 타겟 부위 C4에서 부위-특이적인 유전자 편집을 수행한 것으로 검증되었다.
실시예 3. 공여 벡터 구축
본 실시예는 돌연변이 타겟 서열을 포함하는 공여 벡터를 구축하고, 그래서, 공여 벡터를 CRISPR/Cas9 뉴클레아제와 함께 사용하여, 벼 내인성 EPSPS 단백질에서 서열번호 2로 나타낸 보존된 영역 폴리펩타이드 (보존된 영역 폴리펩타이드의 코딩 유전자는 서열목록에서 서열번호 1임)의 8번 위치에서 트레오닌 (T)을 이소루신 (I)으로 치환하고, 12번 위치에서 프롤린 (P)을 세린 (S)으로 치환할 수 있도록 하기 위한 것이었다. 즉, 돌연변이 보존된 영역 폴리펩타이드의 서열은 서열목록에서 서열번호 7이었으며, 이 돌연변이는 이하 간단하게 TIPS 돌연변이로 칭하였다. 공여 벡터의 구체적인 구축 방법은 다음과 같다:
야생형 벼 (Oryza sativa L. japonica. cv. Nipponbare)의 게놈 DNA를 주형으로 사용하였으며, 프라이머 쌍 OsEPSPS-DF/OsEPSPS-DR을 PCR 증폭에 사용하였다. 증폭 산물에 대한 전기영동 검출을 수행하였다. 1.2 Kb의 타겟 밴드를 수득하였으며, PCR 산물을 정제하여, pEASY-Blunt 벡터 (TransGen Biotech Co., Ltd., catalogue number:CB101)에 연결하였다. EPSPS 단편을 함유한 클론을 PCR 검증 후 입수하고, 플라스미드를 추출하였다. 서열분석 결과, 수득된 플라스미드는 T-Blunt 벡터에 삽입된 서열번호 8로 표시되는 DNA 단편을 포함하는 것으로 확인되었으며, 이 단편은 TB-EPSPS-D로 명명되었다. 서열번호 8의 12-1041번 위치는 서열번호 3과 정확하게 일치하였다.
OsEPSPS-DF: 3'5' - CCCTCTCCGAGGTGAGACG - (서열번호 8의 1-19번 위치);
OsEPSPS-DR: 5'- TAACCTTGCCACCAGGAAGTC - 3' (서열번호 8의 1179-1199번 위치의 역 상보적인 서열).
플라스미드 TB-EPSPS-D를 주형으로 사용하였으며, 프라이머 OsEPSPS-TIPSF/OsEPSPS-TIPSR로 증폭하였다 (이후 검출을 용이하게 하기 위해, PvuI 제한효소 절단 부위를 이 둘 프라이머내 동의 돌연변이에 의해 설계하였다). PCR 산물에 DpnI을 처리하고, E. coli로 형질전환하였다. 클론을 선별하여, 서열분석하였다. 서열분석 후, 서열번호 6에 나타낸 DNA 단편을 T-Blunt 벡터에 삽입하여 수득되는 재조합 플라스미드는 pEPSPS-donor로 명명하였다. 서열번호 6과 서열번호 8의 차이는 OsEPSPS-TIPSF/OsEPSPS-TIPSR 프라이머에 도입된 돌연변이 부위 뿐이었으며, 보존된 영역내 돌연변이된 아미노산 서열은 서열목록에서 서열번호 7로 나타내었다.
PEPSPS-donor의 구조를 나타낸 개략도를 도 3에 나타내었다.
Figure 112018019070213-pct00001
돌연변이 뉴클레오티드는 프래임으로 표시하고, 돌연변이로 인해 생긴 PvuI 효소 절단 부위는 진하게 표시하였다.
실시예 4. 벼의 형질전환 및 TIPS EPSPS 돌연변이 검출
실시예 1에서 구축된 재조합 플라스미드 pHUN411-C3 및 pHUN411-C4와, 실시예 3에서 구축된 재조합 플라스미드 pEPSPS-donor를 유전자 총 형질전환 방법을 통해 동시에 벼 (Oryza sativa L. japonica. cv. Nipponbare)에 도입하였다. 벼 (Oryza sativa L. japonica. cv. Nipponbare)의 캘러스를 형질전환 수여체로서 사용하였으며; 공동-형질전환시 재조합 플라스미드 pHUN411-C3 : pHUN411-C4 : pEPSPS-donor의 몰 비는 1:1:2였다. 형질전환 후 조직 배양에 의해 완전한 식물 (즉, T0 세대)을 재생하였다.
T0-세대 형질전환 식물의 게놈 DNA를 추출하였으며, 타겟 부위 C3 및 C4와 TIPS 돌연변이 부위를 포함하는 특이 프라이머 OsEF1 및 OsER을 게놈 DNA를 PCR 증폭하는데 사용하였다.
OsEF1:5'- CAACAGGATCCTCCTCCTCTC - 3' (벼 게놈에서 서열번호 8/6 상류 30 bp에 위치됨);
OsER: 5'- TAACCTTGCCACCAGGAAGTC - 3' (서열번호 6의 1179-1199번 위치에 역 상보적인 서열).
PCR 산물을 단일 효소 PvuI으로 절단하였으며, 효소 절단 결과를 도 4a에 나타내었다. PCR 및 효소 절단 검출 후, T0-1, T0-5, T0-7 (각각 도 4a에서 레인 1, 5 및 7에 해당됨, 이들은 PCR 밴드 (약 1.2kb 크기) 외에도 PvuI의 절단으로 인한 타겟 밴드 (약 950bp 및 270bp의 크기)도 포함함)과 같은 TIPS 부위에 돌연변이를 가진 식물 3주를 수득하였으며, 나머지 번호의 식물 (각각 도 4에서 레인 2, 3, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 및 16에 해당됨)은 야생형에 속하였다.
또한, 돌연변이의 서열분석 결과를 도 4b에 나타내었다. 3종의 식물주 (T0-1, T0-5 및 T0-7)는 설계된 타겟 부위에 타겟 뉴클레오티드 돌연변이를 포함하며, 수개의 뉴클레오티드의 삽입 및 결손이 타겟 부위 C3과 C4에서 동시에 형성되었다. C3 및 C4는 인트론에 위치하기 때문에, OsEPSPS 유전자의 오픈 리딩 프래임은 수개의 뉴클레오티드의 삽입 및 결손에 의해 영향을 받지 않는다. 번역을 통해 제조된 단백질은 타겟 뉴클레오티드 돌연변이에 의해 영향을 받았는데, 이는 TIPS EPSPS 부위에 돌연변이를 포함하는 돌연변이체가 완전히 성공적으로 수득되었다는 것을 의미한다.
실시예 5. TIPS EPSPS 부위 돌연변이체의 글리포세이트 내성 검증
실시예 4에서 수득한 TIPS EPSPS 부위 돌연변이체 3종 (T0-1, T0-5 및 T0-7)와 야생형 벼 (Oryza sativa L. japonica. cv. Nipponbare) 식물을 1 mg/L 글리포세이트가 첨가된 N6 배양 배지에 배치하고, 일반적인 배양 조건 하에 배양하였다. 내성 결과를 10일 후 기록하였다. 각 TIPS EPSPS 부위 돌연변이체 주들의 경우 식물 3주 이상에서 검증하였다.
그 결과, 야생형 벼 (Oryza sativa L. japonica. cv. Nipponbare) 식물은 백화되기 시작해 시들어 죽었으며, TIPS EPSPS 부위 돌연변이 식물들은 모두 정상적으로 생존 (이들의 잎은 녹색이었음)한 것으로 확인되었다. 도 5a는 TIPS EPSPS 부위 돌연변이된 T0-1이고, 도 5b는 야생형 벼 (Oryza sativa L. japonica. cv. Nipponbare) 대조군 식물을 나타낸다.
실시예 6. 아라비돕시스 탈리아나 ( Arabidopsis thaliana )에서 인트론-매개 부위-특이적인 유전자 치환
점 돌연변이 및 유전자 치환과 같이 게놈에 정확한 변이 달성은 쌍자엽 모델 식물인 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)에서의 기능성 게놈 실험들에 높은 가치를 지닌다. 본원에서, 본 발명자들은 아라비돕시스 탈리아나에서 CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 비-상동적인 말단 연결 (NHEJ) 경로를 통해 인트론-매개 부위-특이적인 유전자 치환 방식을 발표하였다.
Glu552 -> Lys552 치환을 야기하는 Atsnc1 (At4g16890)내 점 돌연변이 G1654-A)가, 발병-관련 (PR) 유전자를 구성적으로 발현하여, 식물에 슈도모나스 시링가에 pv 마쿨리콜라 ES4326 (Pseudomonas syringae pv maculicola ES4326) 및 페로노스포라 파라시티카 Noco2 (Peronospora parasitica Noco2)에 대한 내성을 부여할 수 있는 것으로, 기존에 확인되었다. 그래서, 본원에서는 내인성 Atsnc1 유전자의 아미노산 치환을 달성하기 위해 착수하였다. Atsnc1의 게놈 서열은 서열번호 9이다.
점 돌연변이는 Atsnc1의 엑손 3에서 발생하며, 엑손 3의 코딩 서열은 서열번호 10이다. 내인성 엑손 3을 점 돌연변이 (G1654-A) (서열번호 11)를 포함하는 새로운 엑손으로 치환하기 위해, Atsnc1의 인트론 2 및 인트론 3을 타겟팅하는 듀얼 sgRNA를 각각 설계하였다. Atsnc1의 인트론 2를 타겟팅하는 sgRNA는 서열번호 12 (S1)이고, Atsnc1의 인트론 3를 타겟팅하는 sgRNA는 서열번호 13 (S2)이다.
S1 sgRNA (AtU626 프로모터에 의해 구동됨), S2 sgRNA (AtU629 프로모터에 의해 구동됨) 및 하나의 뉴클레오티드 치환 (G1654-A)을 포함하는 공여 서열을, 히그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 (hpt) 및 Cas9 발현 카세트를 운반하는 pHEE401 벡터에 통합하여, 구조체 pHEE411-S1S2Donor를 제조하였다. 뉴클레오티드 치환을 포함하는 공여 서열은 서열번호 14이다.
아그로박테리움 균주 GV3101을 냉동-해동법을 이용해 최종 벡터 pHEE411-S1S2Donor로 형질전환한다. 아라비돕시스 Col-0 야생형 식물은 꽃 침지 (floral dip) 방법을 통한 형질전환에 사용하였다. 수집한 종자를 25 mg/L 히그로마이신이 첨가된 MS 플레이트에서 스크리닝하였다. 토양에서 키운 T1 형질전환 식물로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 타겟 부위를 둘러싼 단편을 유전자-특이 프라이머를 사용한 PCR에 의해 증폭시켜, 서열 분석하였다. 최종적으로, 유전자 치환 식물이 수득되었다.
SEQUENCE LISTING <110> INSTITUTE OF GENETICS AND DEVELOPMENTAL BIOLOGY, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES <120> METHOD FOR OBTAINING GLYPHOSATE-RESISTANT RICE BY SITE-DIRECTED NUCLEOTIDE SUBSTITUTION <130> GNCLN151277 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 39 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 ctcttcttgg ggaacgctgg aactgcaatg cgaccattg 39 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 2 Leu Phe Leu Gly Asn Ala Gly Thr Ala Met Arg Pro Leu 1 5 10 <210> 3 <211> 1030 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 3 gtgagacgcg gatcccttcc tcttgcgtga attccatttc tggagatgag attttagggg 60 gtttattagg tgaggtggct gtgtttgtga aatcctagga attatctctc aagtcaatct 120 aacgatgaga tataactgag gttctggttt taatcacaca ctcatataac caatttattg 180 aaacattttg gtttggcata agaaactgct tacgaaggta tgatatcctc ctacatgtca 240 ggctactaaa ttttcacgac ggtatgatcc actcaaaaca agtttcttaa cgagtctggt 300 gaggtctgtt atgaaatttg tgtaaactaa ggcaactttg gaggtttcgc actgtaccaa 360 tgttatgttt gaacattttg caagcagtgc tttctcccaa aattatgcaa 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ccctctccga ggtgagacgc ggatcccttc ctcttgcgtg aattccattt ctggagatga 60 gattttaggg ggtttattag gtgaggtggc tgtgtttgtg aaatcctagg aattatctct 120 caagtcaatc taacgatgag atataactga ggttctggtt ttaatcacac actcatataa 180 ccaatttatt gaaacatttt ggtttggcat aagaaactgc ttacgaaggt atgatatcct 240 cctacatgtc aggctactaa attttcacga cggtatgatc cactcaaaac aagtttctta 300 acgagtctgg tgaggtctgt tatgaaattt gtgtaaacta aggcaacttt ggaggtttcg 360 cactgtacca atgttatgtt tgaacatttt gcaagcagtg ctttctccca aaattatgca 420 attttgaggc tcctctacat cattataatt ccccaataca ttgctcttta ttcttaatag 480 ctttgatcgc gaaatttaac attttaattc ttgagctgtt attttgtagc atcagtttat 540 catgagccat gtttggtact aaatatacaa tcccttgggt ttatttgttt ccaagcatgt 600 cattaactta tcttaatgtg gacaagaaac tgatgcctgc ttacattgct attatttcaa 660 gcgggtattg atcctttgac atgtgattga tcattttttt ttctctggtt attagggcac 720 aacagtggtg gacaacttgc tgaacagtga ggatgttcac tacatgcttg aggccctgaa 780 agccctcggg ctctctgtgg aagcagataa agttgcaaaa agagctgtag tcgttggctg 840 tggtggcaag tttcctgttg agaaggatgc gaaagaggaa gtgcaactct tcttggggaa 900 cgctggaatt gcaatgcgat cgttgacagc agccgtgact gctgctggtg gaaatgcaac 960 gtatgttttt ttttttaatg tttatgaaaa tatgtatgga attcatgggg tatgttttat 1020 gacctttttc tttaccatca gttatgtgct tgatggagtg ccacgaatga gggagagacc 1080 gattggtgac ttggttgtcg ggttgaaaca acttggtgcg gatgtcgact gtttccttgg 1140 cactgaatgc ccacctgttc gtgtcaaggg aattggagga cttcctggtg gcaaggtta 1199 <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence of the mutated conserved region polypeptide <400> 7 Leu Phe Leu Gly Asn Ala Gly Ile Ala Met Arg Ser Leu 1 5 10 <210> 8 <211> 1199 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 8 ccctctccga ggtgagacgc ggatcccttc ctcttgcgtg aattccattt ctggagatga 60 gattttaggg ggtttattag gtgaggtggc tgtgtttgtg aaatcctagg aattatctct 120 caagtcaatc taacgatgag atataactga ggttctggtt ttaatcacac actcatataa 180 ccaatttatt gaaacatttt ggtttggcat aagaaactgc ttacgaaggt atgatatcct 240 cctacatgtc aggctactaa attttcacga cggtatgatc cactcaaaac aagtttctta 300 acgagtctgg tgaggtctgt tatgaaattt gtgtaaacta aggcaacttt ggaggtttcg 360 cactgtacca atgttatgtt tgaacatttt gcaagcagtg ctttctccca aaattatgca 420 attttgaggc tcctctacat cattataatt ccccaataca ttgctcttta ttcttaatag 480 ctttgatcgc gaaatttaac attttaattc ttgagctgtt attttgtagc atcagtttat 540 catgagccat gtttggtact aaatatacaa tcccttgggt ttatttgttt ccaagcatgt 600 cattaactta tcttaatgtg gacaagaaac tgatgcctgc ttacattgct attatttcaa 660 gcgggtattg atcctttgac atgtgattga tcattttttt ttctctggtt attagggcac 720 aacagtggtg gacaacttgc tgaacagtga ggatgttcac tacatgcttg aggccctgaa 780 agccctcggg ctctctgtgg aagcagataa agttgcaaaa agagctgtag tcgttggctg 840 tggtggcaag tttcctgttg agaaggatgc gaaagaggaa gtgcaactct tcttggggaa 900 cgctggaact gcaatgcgac cattgacagc agccgtgact gctgctggtg gaaatgcaac 960 gtatgttttt ttttttaatg tttatgaaaa tatgtatgga attcatgggg tatgttttat 1020 gacctttttc tttaccatca gttatgtgct tgatggagtg ccacgaatga gggagagacc 1080 gattggtgac ttggttgtcg ggttgaaaca acttggtgcg gatgtcgact gtttccttgg 1140 cactgaatgc ccacctgttc gtgtcaaggg aattggagga cttcctggtg gcaaggtta 1199 <210> 9 <211> 4950 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 9 atggagatag cttcttcttc tggcagccgg agatacgacg ttttcccaag ctttcgtgga 60 gaagatgtcc gtgactcatt cctcagccat cttctcaagg agctcagggg caaagcaatc 120 acattcatag atgatgagat cgagaggagc cgctcaatcg gcccggagct tttatcggca 180 ataaaagaat cgagaatagc aatcgttatc ttctctaaga actatgcttc atccacctgg 240 tgcctgaatg aattggtgga gattcacaag tgttatacga atttgaatca aatggtgatt 300 ccgattttct tccacgttga tgcttcggaa gttaaaaaac agaccggcga atttggaaag 360 gtctttgaag agacatgcaa ggctaaatca gaggatgaga aacaaagttg gaagcaagct 420 ctagcagctg ttgcagttat ggccggatat gatcttcgga aatggtattt caatgaatag 480 acttcgtgat ttttttgttt tgcgttgctt ctttaatgaa acagttgact attgttatta 540 ggcctagtga agcagccatg attgaagagc ttgccgagga tgttttgaga aaaactatga 600 caccatcgga tgattttggc gacttagtcg gaattgaaaa tcatatagag gcaataaaat 660 cagtattgtg cttggaatcc aaggaagcta gaataatggt cgggatttgg ggacaatcag 720 ggattggtaa gagtaccata ggaagagctc tttacagtaa actctctatc cagttccacc 780 atcgcgcttt cataacatat aaaagcacca gcggtagtga cgtctctggc atgaagttga 840 ggtgggaaaa agaacttctc tcggaaatct taggtcaaaa ggacataaag atagagcatt 900 ttggtgtggt ggagcaaagg ttaaagcaac agaaagttct tatccttctt gatgatgtgg 960 atagtctaga gtttcttaag accttggtgg gaaaagctga atggtttgga tctggaagca 1020 gaataattgt gatcactcaa gataggcaac ttctcaaggc tcatgagatt gaccttatat 1080 atgaggtgga gttcccatct gaacatcttg ctcttacgat gttatgccga tctgcttttg 1140 ggaaagactc tccacctgat gattttaagg aactagcatt tgaagttgcg aagcttgccg 1200 gtaatcttcc gttgggtctt agtgtccttg gttcgtcttt aaagggaagg accaaagaat 1260 ggtggatgga gatgatgcct aggctccgaa atggtttgaa cggagatatt atgaaaacat 1320 taagagtcag ctacgataga ttacatcaaa aagatcaaga tatgttcctt tacatcgcgt 1380 gtttattcaa tggttttgaa gtcagttacg tcaaagattt acttaaagat aatgttgggt 1440 ttacaatgtt gactgagaag tccctcatac gtattacacc ggatggatat atagagatgc 1500 acaatttgct agagaaattg ggtagagaaa ttgatcgtgc aaagtccaag ggtaatcctg 1560 gaaaacgtcg atttctgacg aattttgaag atattcatga agtagtgacc gagaaaactg 1620 taagtttttt tcgcagctcc gtttgaatgc atgactttat attaatataa tcgtaatttg 1680 gggattgata aacttaagca attgttgcct catgcgtaat taaaatgtag ctttgatgtg 1740 tcagaaaatt aaaaagggtt gcgattgtta agattatatt agttttcttc ggattttttt 1800 tcaggggaca gaaactcttc ttggaatacg tttgccattc gaggaatatt tttcgacaag 1860 gccgttatta atagataaag aatcgttcaa aggcatgcgt aatctgcaat atctagaaat 1920 tggttattac ggggatctac ctcagagcct cgtttatttg ccccttaaac tcagattgct 1980 agactgggat gattgtccat tgaagtcttt gccatctact tttaaggcgg aatatctagt 2040 taacctcata atgaagtata gtaagcttga gaaactgtgg gaaggaactc tggtacgaat 2100 tctaaatttt attagttgtc agtttttaga acagaactgt ggtatatttg tgaacgtgtg 2160 tattctcttt ttccatattt tgttttcagc cccttggaag tctcaaggag atgaatttga 2220 ggtattccaa caatttgaaa gaaattccag atctttcttt agccataaac ctcgaggaat 2280 tagatcttgt tggatgcaaa tctttggtga cacttccttc ctcgattcag aatgccacta 2340 aactgatcta tttagatatg agtgattgca aaaagctaga gagttttcca accgatctca 2400 acttggaatc tctcgagtac ctcaatctca ctggatgccc gaatttgaga aactttccag 2460 caatcaaaat gggatgttca gacgttgact ttccggaagg gagaaatgag atcgtggtag 2520 aagattgttt ctggaacaag aatctccctg ctggactaga ttatctcgac tgccttacga 2580 gatgtatgcc ttgtgaattt cgcccagaac aactcgcttt tctcaatgtg aggggctaca 2640 agcatgagaa gctatgggaa ggcatccagg tacattgtta atgctatgct gatttttgtt 2700 taccttctgt tatataacta attaactata cccaaatttg ttattatggc ttgtgatcca 2760 cggttatgtc ttaccacggt tatgtcttat aataatgttt aattataatt ttaaacatat 2820 acagtataaa attaaaatga ttatcatcga taatgattga agcataccaa tgtttttttc 2880 agtcgcttgg aagtctcgaa gggatggatc tgtcagaatc tgaaaacctg acagaaattc 2940 cagatctttc aaaggccacc aagctcgagt ctttgatact caacaactgc aaaagtttgg 3000 tgacacttcc ttctacaatt gggaatcttc atagattggt gaggttggaa atgaaagaat 3060 gcacagggct ggaggttctt ccgaccgatg tcaacttgtc atctctcgaa accctcgatc 3120 tcagtggttg ctcaagtttg agaagttttc ctctgatttc aactaatatt gtatggctct 3180 atctggaaaa caccgccatt gaagaaattc cttctacaat tgggaatctt catagattgg 3240 tgaggttaga aatgaaaaaa tgcacagggc tggaggttct tccgaccgat gtcaacttgt 3300 catctctcga aaccctcgat ctcagtggtt gctcaagttt gagaagtttt cctctgattt 3360 cagagagtat caaatggctc tatctggaaa acaccgccat tgaagaaatt ccagatcttt 3420 caaaggccac taatctgaag aatttgaaac tcaacaattg caaaagtttg gtgacacttc 3480 ctactactat aggaaatctc caaaaattgg tgagctttga aatgaaagaa tgcacagggc 3540 tggaggttct tccgatcgat gtcaacttgt catctcttat gatcctcgat ctcagtggtt 3600 gctcaagtct gagaactttt cctctgattt caactaatat tgtatggctc tatctggaaa 3660 acaccgccat tgaagaaatc ccttctacaa ttgggaatct tcatagattg gtgaagttag 3720 aaatgaaaga atgcacaggg ctggaggttc ttccgaccga tgtcaacttg tcatctctta 3780 tgatcctcga tctcagtggt tgctcaagtc tgagaacttt tcctctgatt tcaactagaa 3840 tcgaatgtct ctatctgcaa aacaccgcca ttgaagaagt tccctgctgc attgaggatt 3900 tcacgaggct cactgtactt atgatgtatt gttgccagag gttgaaaacc atctccccaa 3960 acattttcag acttacaaga cttgagctcg ccgactttac agactgtaga ggtgtcatca 4020 aggcgttgag tgatgcaact gtggtagcga caatggaaga ccacgtttct tgtgtaccat 4080 tatctgaaaa cattgaatat atctgggata agttgtatcg tgttgcatac ctccaggaac 4140 attttagctt ccgtaattgc ttcaaattgg atagagatgc gcgagagctc atcctacgat 4200 catgcttcaa gcctgtggcc ttaccaggtg aagaaatccc taagtatttc acgtatcgag 4260 cttatggaga ttccctaact gtcattgtac ctcagagctc tctttctcaa aatttcttgc 4320 gatttaaggc ttgcgtcgtg gttgaacctc tctccaaggg caagggtttt tatccattct 4380 tgaaggtaaa cgttggcttc aatggcaaac agtatcagaa atcattttct aaagatgcag 4440 aactggagct ttgtaagacg gatcatctgt ttttctgttc cttcaagttc cggtctgaag 4500 atcttccatc taaattgaat ttcaacgatg tggagtttaa gttttgttgc tccaatagga 4560 tcaaagaatg cggtgtacga ctcatgtatg tctctcaaga agagaacaac caacagacta 4620 cgagaagcga gaagcggatg cgggtatctt ttgacttttg atttgatttt ccaggatcga 4680 aataccatag ggacagacta tttaatagaa tctatcgttt gatttataat gcagatgaca 4740 tcggggacat ctgaagaaga tatcaactta ccctatggcc taattgtagc ggacacagga 4800 ttggccgctc taaatatgga gctttcgtta gggcagggag aaccatcatc atcaacatct 4860 ctagaggggg aagctttgtg tgttgattac atgataactg aagaacaaga taaaggaatt 4920 cctatcttgt ttcctgtttc tggtaactga 4950 <210> 10 <211> 288 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exon 3 <400> 10 gggacagaaa ctcttcttgg aatacgtttg ccattcgagg aatatttttc gacaaggccg 60 ttattaatag ataaagaatc gttcaaaggc atgcgtaatc tgcaatatct agaaattggt 120 tattacgggg atctacctca gagcctcgtt tatttgcccc ttaaactcag attgctagac 180 tgggatgatt gtccattgaa gtctttgcca tctactttta aggcggaata tctagttaac 240 ctcataatga agtatagtaa gcttgagaaa ctgtgggaag gaactctg 288 <210> 11 <211> 288 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mutated exon 3 <400> 11 gggacagaaa ctcttcttgg aatacgtttg ccattcgagg aatatttttc gacaaggccg 60 ttattaatag ataaagaatc gttcaaaggc atgcgtaatc tgcaatatct aaaaattggt 120 tattacgggg atctacctca gagcctcgtt tatttgcccc ttaaactcag attgctagac 180 tgggatgatt gtccattgaa gtctttgcca tctactttta aggcggaata tctagttaac 240 ctcataatga agtatagtaa gcttgagaaa ctgtgggaag gaactctg 288 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> s1 <400> 12 cctcatgcgt aattaaaatg tag 23 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> s2 <400> 13 cagtttttag aacagaactg tgg 23 <210> 14 <211> 435 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> donor sequence <400> 14 cctcatgcgt aattaaaatg tagctttgat gtgtcagaaa attaaaaagg gttgcgattg 60 ttaagattat attagttttc ttcggatttt ttttcagggg acagaaactc ttcttggaat 120 acgtttgcca ttcgaggaat atttttcgac aaggccgtta ttaatagata aagaatcgtt 180 caaaggcatg cgtaatctgc aatatctaaa aattggttat tacggggatc tacctcagag 240 cctcgtttat ttgcccctta aactcagatt gctagactgg gatgattgtc cattgaagtc 300 tttgccatct acttttaagg cggaatatct agttaacctc ataatgaagt atagtaagct 360 tgagaaactg tgggaaggaa ctctggtacg aattctaaat tttattagtt gtcagttttt 420 agaacagaac tgtgg 435

Claims (14)

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  10. 돌연변이 타겟 서열에 대한 타겟 단편 1의 5' 말단 내지 타겟 단편 2의 3' 말단까지의 타겟 유기체 게놈 내 타겟 유전자 서열에서 타겟 뉴클레오티드를 치환하는 방법으로서,
    상기 방법은 하기 a), b), c), d) 또는 e)를 상기 타겟 유기체의 세포 또는 조직에 도입하는 단계를 포함하고,
    a) 유전 물질 1, 유전 물질 2, 및 공여 벡터:
    상기 유전 물질 1은 주기적 간격으로 분포하는 짧은 회문 구조 반복 서열(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/CRISPR 관련 시스템의 서열 특이적인 뉴클레아제 1을 발현할 수 있는 원형 DNA 플라스미드, 선형 DNA 단편 또는 시험관내 전사된 RNA이고;
    상기 유전 물질 2는 주기적 간격으로 분포하는 짧은 회문 구조 반복 서열/CRISPR 관련 시스템의 서열 특이적인 뉴클레아제 2를 발현할 수 있는 원형 DNA 플라스미드, 선형 DNA 단편 또는 시험관내 전사된 RNA임;
    b) 유전 물질 12 및 공여 벡터:
    상기 유전 물질 12는 주기적 간격으로 분포하는 짧은 회문 구조 반복 서열/CRISPR 관련 시스템의 서열 특이적인 뉴클레아제 1을 발현할 수 있으며 또한 주기적 간격으로 분포하는 짧은 회문 구조 반복 서열/CRISPR 관련 시스템의 서열 특이적인 뉴클레아제 2를 발현할 수 있는, 원형 DNA 플라스미드, 선형 DNA 단편 또는 시험관내에서 전사된 RNA임;
    c) 비-유전 물질 1, 비-유전 물질 2, 및 공여 벡터:
    상기 비-유전 물질 1은 주기적 간격으로 분포하는 짧은 회문 구조 반복 서열/CRISPR 관련 시스템의 서열 특이적인 뉴클레아제 1을 발현할 수 있는 mRNA이고;
    상기 비-유전 물질 2는 주기적 간격으로 분포하는 짧은 회문 구조 반복 서열/CRISPR 관련 시스템의 서열 특이적인 뉴클레아제 2를 발현할 수 있는 mRNA임;
    d) 비-유전 물질 1, 비-유전 물질 2, 및 공여 벡터:
    상기 비-유전 물질 1은 주기적 간격으로 분포하는 짧은 회문 구조 반복 서열/CRISPR 관련 시스템의 시험관내에서 발현된 서열 특이적인 뉴클레아제 1의 단백질이고;
    상기 비-유전 물질 2는 주기적 간격으로 분포하는 짧은 회문 구조 반복 서열/CRISPR 관련 시스템의 시험관내에서 발현된 서열 특이적인 뉴클레아제 2의 단백질임;
    e) 주기적 간격으로 분포하는 짧은 회문 구조 반복 서열/CRISPR 관련 시스템의 서열 특이적인 뉴클레아제 1을 발현할 수 있으며 또한 주기적 간격으로 분포하는 짧은 회문 구조 반복 서열/CRISPR 관련 시스템의 서열 특이적인 뉴클레아제 2를 발현할 수 있는 공여 벡터;
    상기 공여 벡터는 돌연변이 타겟 서열을 운반하는 벡터이고,
    상기 돌연변이 타겟 서열은 타겟 단편 1의 5' 말단에서 타겟 단편 2의 3' 말단까지 상기 타겟 유기체의 게놈 내 타겟 유전자 서열에 대응되는 DNA 단편 서열을 포함하되, 원하는 타겟 뉴클레오티드 치환을 포함하며,
    상기 타겟 단편 1은 상기 타겟 유기체의 게놈 내 타겟 유전자의 타겟 뉴클레오티드의 상류에 있는 인트론 영역 또는 프로모터 영역에 위치하고,
    상기 타겟 단편 2는 상기 타겟 유기체의 게놈 내 타겟 유전자의 타겟 뉴클레오티드의 하류에 있는 인트론 영역 또는 3'-UTR에 위치하며,
    상기 서열 특이적인 뉴클레아제 1은 상기 공여 벡터 및 상기 타겟 유기체의 게놈 내 상기 타겟 단편 1을 특이적으로 절단할 수 있고,
    상기 서열 특이적인 뉴클레아제 2는 상기 공여 벡터 및 상기 타겟 유기체의 게놈 내 상기 타겟 단편 2를 특이적으로 절단할 수 있는,
    타겟 유기체 게놈 내 타겟 유전자 서열에서 타겟 뉴클레오티드를 치환하는 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 서열 특이적인 뉴클레아제 1이 CRISPR/Cas9 뉴클레아제이고,
    상기 서열 특이적인 뉴클레아제 2가 CRISPR/Cas9 뉴클레아제인, 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    상기 타겟 유기체가 벼를 포함하는 단자엽 식물이거나 아라비돕시스를 포함하는 쌍자엽 식물인, 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 세포는 도입 수여체로서 사용될 수 있고 조직 배양에 의해 완전한 식물로 재생될 수 있는 세포이고, 상기 조직은 도입 수여체로서 사용될 수 있고 조직 배양에 의해 완전한 식물로 재생될 수 있는 세포이며; 또는
    상기 세포는 원형질체 세포 또는 현탁 세포이고, 상기 조직은 캘러스, 미숙배 또는 성숙배이며;
    a), b), c), d), 또는 e)를 상기 타겟 식물의 세포 또는 조직으로 도입하는 방법이 유전자 총 방법, 아그로박테리움 감염 방법, 또는 PEG-매개 원형질체 형질전환 방법인, 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 식물이 아라비돕시스이고,
    상기 타겟 유전자가 서열번호 9의 Atsnc1(At4g16890)이며,
    상기 서열 특이적인 뉴클레아제 1이 서열번호 12에 대응되는 sgDNA를 포함하고,
    상기 서열 특이적인 뉴클레아제 2가 서열번호 13에 대응되는 sgDNA를 포함하며,
    상기 돌연변이 타겟 서열이 서열번호 14로 표시되고;
    상기 타겟 뉴클레오티드의 치환으로 서열번호 10의 Atsnc1의 엑손 3이 서열번호 11로 교체되어, 슈도모나스 시링가에 pv 마쿨리콜라 ES4326 (Pseudomonas syringae pv maculicola ES4326) 및 페로노스포라 파라시티카 Noco2 (Peronospora parasitica Noco2)에 대한 내성이 식물에 부여되는, 방법.
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