KR102117828B1 - 레귤론 변이를 통한 지방산 및 지방산 유도체 생산에서 불포화도 감소 - Google Patents

Abstract

본 발명은 대장균(Escherichia coli)에서 생성되는 불포화지방산 생산을 줄이기 위해 FadR 전사조절인자(이후 FadR)의 레귤론(regulon)을 재배선(rewiring)시킨 균주를 제작하는 것을 목적으로 한다. FadR은 대장균 내 존재하는 전사조절인자로 지방산 합성 관련 유전자의 발현을 유도한다. 대장균에서 FadR의 발현은 지방산 및 지방산 유도체의 효과적인 과생산 방법이지만 부산물로 다량의 불포화지방산이 생산되는 것이 문제였다.
본 발명에서는 상기 문제를 해결하기 위해 불포화지방산 합성에 관련된 유전자의 프로모터에서 FadR 결합부위를 제거하고, 포화지방산 합성 관련 유전자를 FadR 레귤론에 포함시켰다. 더 나아가 포화지방산 합성 관련 유전자의 프로모터를 FadR에 더 강하게 발현되는 프로모터로 교체한 균주를 제작하였다. 최종적으로 FadR이 발현되는 조건에서도 지방산 및 지방산 유도체 생산에서 불포화지방산의 비율이 낮은 균주를 제작하였다.

Description

레귤론 변이를 통한 지방산 및 지방산 유도체 생산에서 불포화도 감소 {PRODUCTION OF FATTY ACIDS AND FATTY ACID DERIVATIVES WITH THE REDUCED DEGREE OF UNSATURATEDNESS THROUGH ENGINEERING REGULON}

본 발명은 지방산 및 지방산 유도체 생산에서 FadR 과발현으로 인한 불포화지방산 합성 증가를 억제하기 위해, FadR 레귤론을 재배선시킨 재조합 대장균, 이를 제조하는 방법 및 응용에 관한 것이다. 본 발명은 전사조절인자를 사용한 대사공학 접근법의 효과를 극대화시키는 레귤론의 변이 방법이다.

화석연료가 고갈되고, 석유기반 공정에서 발생하는 오염 및 온실가스 배출 문제가 꾸준히 제기됨에 따라 이를 대체하기 위한 생물학적 공정에 대한 연구가 최근 활발히 진행되고 있다. 이와 관련하여, 바이오연료 및 그 유도체 생산은 석유기반 공정을 대체하기 위한 지속가능한 기술이다. 화석연료를 대체하기 위해 옥수수 등 작물 기반 혹은 폐작물 기반 바이오연료들이 연구되었으나 시장가격, 수득률, 생산공정 등 여러 단점에 의해 실현되기 어렵다는 점이 있었다. 이러한 단점을 해소하기 위해 미생물을 이용한 생산 공정이 다음 세대 바이오연료로 대두되고 있다.

지금까지의 미생물을 이용한 바이오연료 생산은, 지방산 합성을 시작으로 다양한 물질을 합성해왔다. 지방산은 자연계에 존재하는 모든 물질들을 구성하는 막(membrane)의 성분으로, 석유기반 탄소사슬 유도체와 구조적으로 가장 유사하고 에너지함유량이 높기 때문에, 석유기반 물질 합성을 위한 시작물질로 적합하다. 연료에 사용될 수 있는 알칸(alkane), 알켄(alkene) 등이 지방산 합성과정을 거쳐 합성된바 있으며, 지방산 및 트리글리세라이드(triglyceride) 형태로 바이오연료를 합성하거나, 이에 사용한 연구 또한 존재한다.

생물공정에서는 석유기반 물질을 합성하기 위해 지방산 합성에 추가적으로 효소를 사용하여 고분자 단량체, 화장품 구성 물질 등을 합성한 바 있다. 예를 들어, AlkB 혹은 cytochrome P450 (이후 P450)을 도입하여 지방산으로부터 오메가-수산화지방산(ω-hydroxy fatty acid)을 합성한바 있다. 더 나아가 트랜스아미나제(transaminase) 및 산화효소를 도입하여, 나일론 단량체를 합성한 바 있다.

한국 특허 공개 10-2015-0032930 (2015.03.31) 미국 특허 공개 2013-0059295 (2013.03.07) 한국 특허 공개 10-2016-0020516 (2016.02.23) PCT 출원 공개 WO2008-119082 (2008.10.02) 한국 특허 등록 10-1828714 (2018.02.13)

Fuzhong Zhang et al., Enhancing fatty acid production by the expression of the regulatory transcription factor FadR. Metabolic Engineering 14 (2012) 653-660. Xiao et al., Metabolic Engineering for Enhanced Medium Chain Omega Hydroxy Fatty Acid Production in Escherichia coli, Frontiers in Microbiology 9 (2018) 139.

지방산 및 지방산 유도체의 물성은 탄소사슬 길이와 포화도에 의해 결정된다. 이러한 물성은 후속 합성된 고분자 및 화합물의 물성을 결정하므로 순도 높은 분리 공정이 요구된다. 하지만, 생물공정을 통해 만들어진 지방산 및 그 유도체는, 길이와 불포화도가 다양해 분리공정에 많은 비용이 소모된다는 문제점이 있다.

이를 해결하기 위해 다양한 기질특이성의 티오에스터라제(thioesterase)에 대한 연구가 진행되었으나, 균주의 종류 및 상태에 따라 세포 내 중간체 농도가 변하여 티오에스터라제의 기질특이성이 제대로 작용하지 못하는 것이 보고되고 있다. 즉, 균주에 존재하는 지방산 합성 전구체를 원하는 목표 지방산에 맞게 형성하는 것 또한 중요하다.

한편, FadR 전사조절인자(이후, FadR)는 대장균에서 지방산 합성과 분해를 조절하는 전사조절인자로 알려져 있다. FadR은 지방산 합성에 관여하는 다수의 유전자를 과발현시키고 지방산 분해에 관여하는 유전자들을 억제한다. 이러한 기전은 세포 내 존재하는 아세틸-코에이(acyl-CoA)가 FadR과 상호작용하면서 이뤄지게 된다. FadR 과발현은 지방산 대량 생산 전략 중 효과적인 방법이다. 하지만 불포화지방산 합성에 관여하는 대장균 유전자(예를 들면, fabA 및 fabB) 또한 FadR에 의해 과발현되기 때문에 부산물로 불포화지방산이 생성되는 문제가 FadR 과발현과 항상 얽혀 있다. 특히 fabA 및 fabB 유전자는 세포에 필수적인 유전자이기 때문에 단순 제거 (knock-out)를 진행시킬 수 없다.

이에, 본 발명은 FadR 전사조절인자의 장점인 지방산 증대 효과를 확보하고 단점인 불포화지방산(부산물) 합성을 최소화하기 위해 FadR 레귤론(regulon)을 변화시킨 균주를 제작하였다.

먼저, 지방산 생산 감소 유전자를 제거했다. 그리고, 불포화지방산 합성에 관여하는 유전자(예를 들어, fabA와 fabB)가 FadR의 과발현에 영향을 받지 않도록 프로모터에서 FadR 결합부위를 제거하였다. 그 결과, 불포화지방산의 생산은 급격하게 감소하였지만, 동시에 총 지방산의 생산도 감소하였다. 따라서, 지방산 생산성 감소 문제를 해결하기 위해 FadR 레귤론 중 하나인 fabI 오페론에 fabA의 이소효소(isozyme)인 fabZ를 포함시켰다. fabZ는 FadR에 의해 발현이 조절되지 않으므로, FadR에 의해 활성화되지 않는 fabZ를 선택하였다. 그리고, fabI 오페론의 프로모터를 FadR에 의해 더 강하게 발현하는 프로모터로 교체하였다.

결과적으로 FadR 전사조절인자를 과발현시켜도 불포화지방산 생산 비율이 낮고, 포화지방산의 생산 비율이 높은 지방산 생산 균주를 제작하였다.

또한, 본 발명은 상기 균주에 CYP 시스템 등 지방산 유도체를 생산하는 효소를 도입하여 오메가-수산화지방산 등 지방산 유도체를 생산하였다.

구체적으로, 본 발명은 하기를 제공한다.

(1) 불포화지방산 비율이 낮은 지방산 또는 지방산 유도체를 생산하기 위한 재조합 대장균으로서 하기를 특징으로 하는 재조합 대장균:

a) fadD, fadE, poxB, plsX, fadL, fadB 및 fadA 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 지방산 생산 감소 유전자가 제거됨;

b) fabA, fabB, 또는 fabA 및 fabB의 프로모터에서 FadR의 결합부위가 변이됨;

c) fabZ가 FadR 레귤론 중 fabI 오페론에 추가됨;

d) 티오에스터라제가 발현됨; 및

e) FadR이 과발현됨.

(2) 상기 fabI 오페론의 프로모터가 accA 프로모터로 교체된 것을 특징으로 하는 재조합 대장균.

(3) 상기 지방산 또는 지방산 유도체가 팔미트산 또는 오메가-수산화팔미트산인 재조합 대장균.

(4) 상기 FadR의 결합부위가 변이된 fabA의 프로모터의 염기서열이 서열식별번호:1 이고, FadR의 결합부위가 변이된 fabB의 프로모터의 염기서열이 서열식별번호:2 인 재조합 대장균.

(5) 상기 fabZ가 추가된 fabI 오페론의 염기서열이 서열식별번호:3 인 재조합 대장균.

(6) 상기 accA 프로모터의 염기서열이 서열식별번호:4 인 재조합 대장균.

(7) 상기 티오에스터라제가 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 박테로이드 프라질리스(Bacteroides fragilis) 및 대장균(Escherichia coli)로 이루어진 군으로부터 선택되는 균으로부터 유래된 티오에스터라제인 재조합 대장균.

(8) 상기 티오에스터라제가 서열식별번호:5 의 염기서열로 이루어지는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 유래 티오에스터라제, 서열식별번호:6 의 염기서열로 이루어지는 박테로이드 프라질리스(Bacteroides fragilis) 유래 티오에스터라제 및 서열식별번호:7 의 염기서열로 이루어지는 대장균(Escherichia coli) 유래 티오에스터라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 재조합 대장균.

(9) 상기 재조합 대장균에서, 추가로 지방산 유도체를 생산하는 유전자가 과발현된 재조합 대장균.

(10) 상기 지방산 유도체를 생산하는 유전자가 시토크롬 P450, AlkBGT, 트랜스아미나제(transaminase), 알코올 옥시다아제(alcohol oxidase), 알데히드 옥시다아제(aldehyde oxidase), 및 디하이드로지나아제(dehydrogenase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소의 유전자인 재조합 대장균.

(11) 상기 시토크롬 P450이 CYP153A35 또는 CYP153A35 D131S/G297A인 재조합 대장균.

(12) 상기 CYP153A35 의 유전자가 서열식별번호:12 의 염기서열로 이루어지고, CYP153A35 D131S/G297A 의 유전자가 서열식별번호:13 의 염기서열로 이루어지는 재조합 대장균.

(13) 상기 재조합대장균에서, FadL, CamAB, 또는 FadL 및 CamAB가 추가로 과발현된 재조합 대장균.

(14) 상기 재조합 대장균을 제조하는 방법으로서 하기 단계를 포함하는 제조방법:

a) fadD, fadE, poxB, plsX, fadL, fadB 및 fadA 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 지방산 생산 감소 유전자를 제거하는 단계;

b) fabA, fabB, 또는 fabA 및 fabB 의 프로모터에서 FadR의 결합부위에 변이를 가하는 단계;

c) fabZ를 FadR 레귤론 중 fabI 오페론에 추가시키는 단계;

d) 티오에스터라제를 발현시키는 단계; 및

e) FadR을 과발현시키는 단계.

(15) 상기 제조방법에 있어서, f) 상기 fabI 오페론의 프로모터를 accA 프로모터로 교체하는 단계를 추가로 포함하는 제조방법.

(16) 상기 제조방법에 있어서, g) 지방산 유도체를 생산하는 유전자를 과발현시키는 단계를 추가로 포함하는 제조방법.

(17) 상기 제조방법에 있어서, 제조방법이 CRISPR-Cas9 시스템을 이용하는 것인 제조방법.

(18) 불포화지방산 비율이 낮은 지방산 또는 지방산유도체를 생산하기 위한 재조합 대장균의 공동배양 시스템으로서, 상기 공동배양 시스템은 지방산을 생산하기 위한 재조합 대장균 및 지방산을 가공하기 위한 재조합 대장균을 포함하고, 여기서 상기 지방산을 생산하기 위한 재조합 대장균은 하기를 특징으로 하는 것인 공동배양 시스템:

a) fadD, fadE, poxB, plsX, fadL, fadB 및 fadA 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 지방산 생산 감소 유전자가 제거됨;

b) fabA, fabB, 또는 fabA 및 fabB의 프로모터에서 FadR의 결합부위가 변이됨;

c) fabZ가 FadR 레귤론 중 fabI 오페론에 추가됨;

d) 티오에스터라제가 발현됨;

e) FadR이 과발현됨; 및

f) 상기 fabI 오페론의 프로모터가 accA 프로모터로 교체됨.

(19) 상기 지방산을 가공하기 위한 재조합 대장균은 지방산 유도체를 생산하는 유전자가 과발현된 것을 특징으로 하는 재조합 대장균인 공동배양 시스템.

(20) 상기 공동배양 시스템에서, 지방산을 생산하기 위한 재조합 대장균 대 지방산을 가공하기 위한 재조합 대장균의 비율이 OD(600 nm) 값을 기준으로 9 대 1 인 공동배양 시스템.

본 발명은 재조합 대장균에서 포화지방산을 생산하는 과정 중 생산되는 불포화지방산의 비율을 감소시키기 위해, FadR 레귤론이 변이된 균주 및 FadR 레귤론이 변이된 균주를 제조하는 형질전환 방법을 제공한다. 본 발명은 상기 재조합 대장균에 여러 균주에서 유래된 티오에스터라제를 사용함으로써 지방산 길이를 조절할 수 있으며, 추가되는 유전자 조합에 따라 생산되는 지방산 유도체를 다양화시킬 수 있다.

본 발명의 재조합 균주는, FadR 과발현 조건에서도 불포화지방산 생합성 경로가 과발현되지 않아 부산물인 불포화지방산 생합성이 적고, FadR 과발현의 장점인 지방산 과생산을 달성하여 선택적으로 포화지방산을 다량 합성할 수 있는 방법을 제공한다.

도 1은, 포도당으로부터 포화지방산을 생산하기 위한 대장균의 대사공학 개념도를 나타낸 것이다.
도 2는, 본 실시예에서 사용된 티오에스터라제의 선별 및 FadR 발현의 효과를 나타낸 것이다.
도 3은, 야생형 대장균의 지방산 합성과정과 FadR 전사조절인자에 영향을 받는 유전자 및 반응을 표시한 모식도이다.
도 4는, FadR 레귤론 변이 균주들에서 어느 부분이 변이되었는지 보여주는 모식도이다.
도 5는, 본 실시예에서 사용된 FadR 레귤론 변이 균주에서 생산된 지방산 생산량 및 분포를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은, 본 실시예에서 오메가-수산화지방산을 생산하기 위해 선택적 포화지방산을 생산하는 대장균에 포함시킨 유전자 전략을 나타낸 모식도이다.
도 7은, 본 실시예에서 사용된 선택적 오메가-수산화지방산 생산 균주에서 생산된 오메가-수산화팔미트산(ω-hydroxypalmitic acid) 생산량 및 분포를 나타낸 것이다.
도 8은, 본 실시예에서 선택적 지방산 생산 균주와 지방산 산화 균주를 포함한 공동배양 시스템을 통한 오메가-수산화팔미트산 생산량을 나타낸 것이다.

본 발명에서 사용되는 용어는 다르게 정의되지 않는 한, 실시예가 해당되는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 것과 동일하다. 일반 용어의 경우 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 이상적이거나 과도하게 해석되어선 안 된다. 한편, 본 발명에서 사용되는 용어는 당업계에서 통상적으로 사용되는 것으로 당업자라면 그 의미를 누구나 이해할 수 있을 것이나, 본 명세서에서 간략히 설명하면 다음과 같다:

(1) 레귤론 (regulon) - 레귤론이란 한 전사조절인자에 조절되어 과발현 혹은 억제되는 유전자군을 칭한다.

(2) 오페론 (Operon) - 오페론이란 염색체 상에 프로모터, 작동자, 구조 유전자가 인접해 있어 조절유전자에 의해 일괄적으로 제어되는 mRNA의 전사단위를 의미한다. 즉, 기능적으로 관련된 유전자를 묶어 한번에 조절하는 메커니즘이다.

(3) CRISPR-Cas9 시스템 - CRISPR-Cas9 시스템은 특정 염기서열에 특이적으로 결합하는 RNA (gRNA) 와 특정 염기서열을 자르는 가위 역할인 Cas9 뉴클리아제(nuclease) 효소로 구성되어 있다. gRNA는 특정 표적 염기서열의 DNA 에 결합할 수 있고, Cas9 효소에도 결합할 수 있다. gRNA가 특정 염기서열을 인식하고 결합하면, Cas9 효소가 특정 염기서열을 절단한다. 보통 Cas9 효소를 제일 많이 사용하지만 다른 절단 효소(예를 들어, Cpf1)를 사용할 수도 있다. DNA가 절단되면 유전 물질을 추가하거나 제거할 수 있으며, DNA를 변이시킬 수도 있다.

(4) 가이드 RNA (gRNA) - 표적 염기서열을 인식하는 RNA를 가이드 RNA 라고 한다.

(5) 상동재조합 (Homologous recombination) - 상동재조합은 절단된 DNA 두 가닥 중 한 가닥이 반대편 상동염색체로 침투해 상보적인 서열을 찾아 접합하여 염기를 이어가면서 재조합된 유전자를 만드는 과정을 의미한다. "상동염색체"란 부계와 모계로부터 각각 물려받은 모양과 크기가 같은 두개의 염색체를 의미한다.

(6) 지방산의 “오메가” 위치 - 지방산의 카르복실기로부터 가장 멀리 위치한 탄소를 말한다. 예를 들어, 탄소 16개로 이뤄진 포화지방산인 팔미트산의 오메가 위치는 카르복실기로부터 16번째 탄소위치를 말한다.

(7) 지방산 유도체 - 지방산 또는 지방산 유도체를 의미하고, 이는 지방산 또는 이의 유도체로 칭할 수 있다. "지방산"이란 용어는 화학식 RCOOH를 갖는 카르복실산을 의미한다. R은 지방족기, 바람직하게는 알킬기를 나타낸다. R은 약 4 내지 22 개의 탄소 원자들을 포함할 수 있다. 지방산들은 포화, 단일불포화 또는 다중불포화될 수 있다. "지방산 유도체"는 생산 숙주 유기체의 지방산생합성 경로의 일부에서 만들어지는 생성물이다.

(8) 지방산 생합성 경로 - 지방산들 및 이들의 유도체들을 생산하는 생합성 경로를 의미한다. 지방산 생합성 경로는 원하는 특성들을 갖는 지방산 유도체들을 생산하도록 본 명세서에 설명되는 것을 외에 효소 활성을 갖는 추가적인 효소들 또는 폴리펩티드들을 포함할 수 있다.

(9) PCR - 중합 효소 연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction)으로서, DNA의 어떤 영역을 특이적으로 증폭시키는 방법을 의미한다.

(10) 형질전환 - 외래성 유전자가 도입됨에 의한 숙주 세포의 유전자형의 변형을 의미하며, 그 형질전환에 사용된 방법과 상관없이 외래성 유전자가 숙주 세포 내로 도입된 것을 의미한다. 이는 유전자 도입에 있어서 당업자에게 공지된 임의의 방법들, 예를 들어, DNA-충전된 입자들로의 포격, 원형질체를 이용한 형질전환, DNA의 미세주입, 전기천공, 컴피턴트(competent) 세포의 접합 또는 형질전환, 화학물질 또는 아그로박테리아-매개된 형질전환을 포함할 것이다. 또한, 외래성 유전자는 벡터나 유리 핵산(예를 들어, DNA, RNA)의 보조 하에 세포 내로 도입될 수 있으며, 재조합에 의해 숙주 게놈 내로 삽입되거나 세포에서 유리 형태로 존재할 수 있다.

(11) 벡터 - 단일가닥, 이중가닥, 원형 또는 초나선 DNA 또는 RNA로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 벡터는 재조합 단백질을 생산할 수 있도록 적절한 거리에 작동적으로 연결되어 있는 구성요소들을 포함할 수 있다. 이러한 구성요소에는 복제 오리진, 프로모터, 인핸서, 5'mRNA 리더 서열, 리보솜 결합부위, 핵산 카세트, 종결 및 폴리아데닐화 부위, 및 선별가능한 표지 서식 등이 포함될 수 있으며, 상기 구성요소들은 특이적인 용도에 따라 하나 또는 그 이상이 빠질 수도 있다. 핵산 카세트는 발현할 재조합 단백질의 삽입을 위한 제한효소 부위를 포함할 수 있다. 기능적 벡터에 있어서, 핵산 카세트는 번역 개시 및 종결 부위를 포함하는 발현될 핵산 서열을 함유한다. 필요에 따라 벡터에 내에 두 종류의 카세트를 삽입할 수 있는 벡터를 사용하기도 하며 상기 언급한 기능들이 부가적으로 서열화 될 수 있다. 재조합 벡터에 삽입된 유전자는 발현용 대장균 균주 BL21(DE3) 등을 사용할 수 있으나, 삽입된 벡터의 종류에 따라 달라질 수 있다. 이러한 벡터 및 발현 균주는 당업자라면 용이하게 선택할 수 있다.

(12) 이소효소(isozyme 또는 isoenzyme) - 아미노산의 서열은 다르지만 같은 화학 반응을 촉매하는 효소들을 이소효소라고한다.

(13) 유전자 - RNA 또는 단백질의 발현에 영향을 미치는 작동가능하게 연결된 핵산 서열들[예를 들어, 프로모터 또는 증폭자(enhancer) 서열들을 포함하나 이로 제한되지 않는 이러한 서열들] 또는 RNA 또는 단백질의 발현에 영향을 미치는 서열들을 인코딩하는 작동가능하게 연결된 핵산 서열들[예를 들어, 리보솜 결합 부위들 또는 번역 조절(translational control) 서열들을 포함하나 이로 제한되지 않는 이러한 서열들]뿐만 아니라, RNA 생성물과 단백질 생성물 중 하나를 인코딩하는 핵산 서열들을 칭한다.

(14) 발현 조절(Expression control) 서열 - 본 기술분야에 알려져 있고, 예를 들어 숙주 세포 내에서 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 위하여 제공되는 프로모터, 증폭자, 폴리아데닐화 신호(polyadenylation signal), 전사종결자(transcription terminator), 내부 리보솜 유입점(internal ribosome entry sites: IRES) 및 이와 유사한 것들을 포함한다. 발현 조절 서열들은 특히 전사에 관련된 세포성 단백질들과 상호작용을 한다.

본 발명의 방법들에서, 발현 조절 서열은 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된다. 적절한 분자들(예를 들어, 전사 활성화인자 단백질들)이 발현 조절 서열(들)에 결합되는 경우에, 폴리뉴클레오티드 서열 및 발현조절 서열(들)이 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 "작동가능하게 연결된다"는 것을 의미한다. 작동가능하게 연결된 프로모터들은 전사 및 번역의 방향에 관하여 선택된 폴리뉴클레오티드 서열의 상류(upstream)에 위치된다. 작동가능하게 연결된 증폭자들은 선택된 폴리뉴클레오티드의 상류, 내부(within) 또는 하류(downstream)에 위치될 수 있다.

(15) 발현의 변화된 수준 및 발현의 변형된 수준 - 이 용어들은 통용되어 사용되고, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 탄화수소가 동일한 조건들 하에서 대응하는 야생형 세포 내에서의 이들의 농도와 비교하여 조작된 숙주 세포 내에서 상이한 농도로 존재한다는 것을 의미한다.

(16) 조절 서열(regulatory sequences) - 궁극적으로 단백질의 발현을 제어하는 단백질을 인코딩하는 DNA 서열들에 작동가능하게 연결된, DNA 내의 염기들의 서열을 칭한다. 조절 서열의 예시들은 프로모터 서열, 전사인자 결합 서열(transcription factor binding sequences), 전사 종결 서열, 증폭자 요소(enhancer elements)와 같은 전사조절인자(modulators) 결합부위, RNA 안정성에 영향을 미치는 뉴클레오티드 서열, 및 번역 조절 서열 (이를 테면, 리보솜 결합 부위(예를 들어, Shine-Dalgarno sequences in prokaryotes or Kozak sequences in eukaryotes), 개시 코돈, 종결 코돈)을 포함하나, 이로 제한되지 않는다.

(17) 프로모터 - 프로모터는 전사(DNA에서 RNA를 합성하는 단계)의 시작에 관여하는 유전자의 상류 영역을 가리킨다. 즉, RNA 중합효소가 결합하는 DNA 가닥의 한 부위, 또는 DNA 한 가닥에 상보적인 RNA 합성, 즉 전사가 시작되는 부위를 말한다.

(18) 야생형 균주 - 대조군으로서 작용하는 균주를 의미한다. "형질전환, 재조합 또는 조작된 균주"는 예를 들어 아실-CoA, 지방산, 지방족 알데히드, 짧은 사슬형 및 긴 사슬형 알코올, 탄화수소, 지방족 알코올, 에스테르(예를 들어, 왁스, 지방산 에스테르 또는 지방족 에스테르), 말단 올레핀, 내부 올레핀 및 케톤을 포함하는 하나 이상의 지방산 유도체들을 생산하는데 사용되는 미생물이다. 일부 실시예들에서, 형질전환 균주는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드들을 포함하고, 각각의 폴리뉴클레오티드는 지방산 생합성 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다.

(19) 배양하는(culturing) 또는 배양(cultivation) - 액체 또는 고체 배지 내에서 적합한 조건들 하에서 재조합 숙주 세포들의 개체군(population)을 성장시키는 것을 칭한다.

본 발명의 재조합 대장균은 불포화지방산 비율이 낮은 지방산 또는 지방산 유도체를 생산하기 위한 재조합 대장균으로서 하기를 특징으로 하는 재조합 대장균이다:

a) 지방산 생산 감소 유전자가 제거됨;

b) fabA, fabB, 또는 fabA 및 fabB의 프로모터에서 FadR의 결합부위가 변이됨;

c) fabZ가 FadR 레귤론 중 fabI 오페론에 추가됨;

d) 티오에스터라제가 발현됨; 및

e) FadR이 과발현됨.

상기 재조합 대장균의 야생형 대장균은 BL21(DE3) 일 수 있다.

상기 지방산 또는 지방산 유도체는 팔미트산 또는 오메가-수산화팔미트산일 수 있다.

상기 지방산 생산 감소 유전자는 fadD, fadE, poxB, plsX, fadL, fadB 및 fadA 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

본 발명은 대장균에서 fabA 유전자가 FadR에 의해 활성화되지 않도록 FadR의 결합부위가 변이된 균주를 제공한다. 상기 변이된 fabA의 프로모터는 서열식별번호:1 로 표시되는 염기서열을 가질 수 있다.

본 발명은 대장균에서 fabB 유전자가 FadR에 의해 활성화되지 않도록 FadR의 결합부위가 변이된 균주를 제공한다. 상기 변이된 fabB의 프로모터는 서열식별번호:2 로 표시되는 염기서열을 가질 수 있다.

본 발명은 대장균에서 fabA 유전자 변이에 의한 지방산 생산감소를 해결하기 위해, fabA의 이소효소인 fabZ를 FadR 레귤론에 추가한 균주를 제공한다. 특히, 상기 fabZ는 FadR 레귤론 중 fabI 오페론에 추가될 수 있으며, fabZ가 포함된 fabI 오페론은 서열식별번호:3 으로 표시되는 염기서열을 가질 수 있다.

상기 티오에스터라제는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) (서열식별번호:5), 박테로이드 프라질리스(Bacteroides fragilis) (서열식별번호:6), 대장균(Escherichia coli) (서열식별번호:7) 에서 유래된 티오에스터라제를 사용할 수 있으며, 상기 균주 외에도 목적성에 맞는 티오에스터라제를 사용할 수 있다.

상기 fadR 유전자는 대장균(Escherichia coli) 유래 fadR의 염기서열을 사용할 수 있다.

본 발명은 포화도를 더 향상시키기 위해 fabI의 프로모터를 FadR에 의해 더 강하게 발현하는 프로모터로 교체한 균주를 제공한다. 특히, accA 프로모터로 fabI의 프로모터를 교체한 균주를 제공한다. 상기 accA 프로모터는 서열식별번호:4 로 표시되는 염기서열을 가질 수 있다.

추가로, 본 발명의 대장균은 추가로 지방산 유도체를 생산하는 유전자가 과발현될 수 있다.

상기 지방산 유도체를 생산하는 유전자는 시토크롬 P450, AlkBGT, 트랜스아미나제(transaminase), 알코올 옥시다아제(alcohol oxidase), 알데히드 옥시다아제(aldehyde oxidase), 및 디하이드로지나아제(dehydrogenase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소의 유전자일 수 있다.

상기 시토크롬 P450은 고르도니아 알카니보란스(Gordonia Alkanivorans) 유래 CYP153A35 또는 CYP153A35의 돌연변이로서 더 높은 활성을 갖는 CYP153A35 D131S/G297A일 수 있다. 상기 CYP153A35의 유전자는 서열식별번호: 12 로 표시되는 염기서열을 가질 수 있다. 상기 CYP153A35 D131S/G297A의 유전자는 서열식별번호: 13 으로 표시되는 염기서열을 가질 수 있다.

시토크롬 P450을 과발현하는 재조합 대장균은 추가로 FadL, CamAB, 또는 FadL 및 CamAB가 과발현될 수 있다. FadL은 대장균 유래의 지방산 수송자로 지방산을 세포 내부로 다시 들어오게 만들 수 있다. CamAB는 NADH 의존성 전자전달시스템으로 시토크롬 P450에 전자를 전달하는 역할을 한다.

본 발명의 재조합 대장균은 FadR을 과발현한 상황에서도 85%이상 비율의 포화지방산을 유지할 수 있다.

본 발명의 재조합 대장균은 불포화지방산를 추가하지 않은 배지에서도 성장 및 지방산 생산이 가능하다.

상기 재조합 대장균은 길이 특이적인 티오에스터라제를 도입할 경우 해당 길이의 포화지방산을 대량생산할 수 있다.

추가로, 본 발명은 포화도가 높은 지방산을 생산하는 균주에 시토크롬(cytochrome) P450을 도입하여 오메가-수산화지방산을 생산하는 균주를 제공하며, 선택성이 높게 지방산 유도체 생산을 할 수 있음을 제시한다.

상기 재조합 대장균은 길이 특이적인 티오에스터라제를 도입하고 cytrochorme P450, AlkBGT, 트랜스아미나제(transaminase), 알코올 옥시다아제(alcohol oxidase), 알데히드 옥시다아제(aldehyde oxidase), 및 디하이드로지나아제(dehydrogenase) 등 생물학적 유도체 효소를 도입하여 해당 길이의 포화도가 높은 지방산 유도체를 대량생산 할 수 있다.

본 발명의 재조합 대장균은 하기 어느 하나의 방법에 따라 제조될 수 있다.

본 발명은 전사조절인자 발현을 통한 물질 대량생산 시스템에서 원치 않는 유전자의 발현을 조절하기 위해 CRISPR-Cas9 system을 이용해 재조합 대장균의 유전체를 변이시키는 방법을 제시한다.

본 발명의 불포화지방산 비율이 낮은 지방산 또는 지방산유도체 생산을 위한 재조합 대장균의 제조방법은 하기 단계를 포함한다:

a) 지방산 생산 감소 유전자를 제거하는 단계;

b) fabA, fabB, 또는 fabA 및 fabB 의 프로모터에서 FadR의 결합부위에 변이를 가하는 단계;

c) fabZ를 FadR 레귤론 중 fabI 오페론에 추가시키는 단계;

d) 티오에스터라제를 발현시키는 단계; 및

e) FadR을 과발현시키는 단계.

상기 제조방법은 f) 상기 fabI 오페론의 프로모터를 accA 프로모터로 교체하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 제조방법은 g) 지방산 유도체를 생산하는 유전자를 과발현시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 재조합 대장균은 공동배양(co-culture) 시스템을 도입할 경우에도 성공적으로 원하는 분포의 지방산을 추가 균주에 전달시킬 수 있다.

본 발명은 불포화지방산 비율이 낮은 지방산 또는 지방산유도체를 생산하기 위한 재조합 대장균의 공동배양 시스템으로서, 상기 공동배양 시스템은 지방산을 생산하기 위한 재조합 대장균 및 지방산을 가공하기 위한 재조합 대장균으로 이루어진 것을 특징으로 하는 공동배양 시스템을 제공한다. 여기서 상기 지방산을 생산하기 위한 재조합 대장균은 하기를 특징으로 한다:

a) 지방산 생산 감소 유전자가 제거됨;

b) fabA, fabB, 또는 fabA 및 fabB의 프로모터에서 FadR의 결합부위가 변이됨;

c) fabZ가 FadR 레귤론 중 fabI 오페론에 추가됨;

d) 티오에스터라제가 발현됨;

e) FadR이 과발현됨; 및

f) 상기 fabI 오페론의 프로모터가 accA 프로모터로 교체됨.

상기 공동배양 시스템에서 지방산을 가공하기 위한 재조합 대장균은 지방산 유도체를 생산하는 유전자가 과발현된 것일 수 있다.

상기 공동배양 시스템에서 지방산을 생산하기 위한 재조합 대장균 대 지방산을 가공하기 위한 재조합 대장균의 비율이 OD(600 nm) 값 기준으로 1:99, 1:9, 3:7, 5:5, 7:3, 9:1 또는 99:1 일 수 있으며, 바람직하게는 9:1 일 수 있다.

본 발명을 통해 불포화지방산 생산비율을 낮춘 지방산 및 지방산 유도체 생산 대장균 균주를 제작하였다.

하기 설명하는 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있다. 또한, 하기 설명하는 실시예들은 실시형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 이들에 대한 모든 변경, 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 실시예에서 사용한 용어는 특정 상황을 한정하려는 의도가 아니며 실시예를 설명하기 위한 것이다.

FadR 레귤론 변이 균주 제작 방법

본 발명에서는 Cas9 단백질을 사용하여 대장균 유전체에 존재하는 FadR 결합 부위에 변이를 가하였다. 대장균에 Cas9 단백질을 이용해 변이를 진행하기 위해서 pCas (Addgene #62225)와 pTargetF (Addgene #62226), 2개의 플라스미드를 사용하였다.

표적 염기서열을 겨냥하는 가이드 RNA (이후 gRNA) 를 발현하는 pTargetF를 만들기 위해, 목표 서열이 포함된 프라이머로 pTargetF를 PCR로 증폭, 제한효소 절단처리, 리가아제 처리하여 선별된 벡터를 사용하였다. 상동재조합 (Homologous recombination, HR)을 이용해 치환하고자 하는 염기서열 (editing template)을 PCR을 통해 만들었다. 프로모터의 FadR 결합부위에서 10개 이하의 염기서열을 바꾸는 경우, 바꾸고자 하는 염기서열을 프라이머에 포함시켰으며, 바뀌는 프로모터를 기준으로 양쪽의 200 ~ 300 개의 염기를 각각 대장균 염색체로부터 증폭시켰다. 증폭된 2개의 염기서열은 PCR을 통해 이어서 붙여져 약 400 ~ 550 개의 염기서열을 완성하였다. 유전자 한 개를 새롭게 넣는 경우, 유전자를 넣으려는 위치를 기준으로 양쪽의 200 ~ 300개의 염기를 각각 대장균의 염색체로부터 증폭시켰으며, 상동재조합을 작동시켜 유전자를 염색체 넣을 수 있도록 양쪽 끝에 해당 염색체를 PCR로 붙였다. Cas9의 효율을 증대시키기 위해 해당 치환하고자 하는 염기서열(editing template)을 해당 pTargetF의 BamHi/Xhoi site 혹은 BamHi/Xbai site에 클로닝하였다.

변이를 가하려는 대장균에 pCas 벡터를 형질전환 후, 항생제(스트렙토마이신 및 카나마이신)가 포함된 LB 아가 플레이트 (agar plate)로 30℃에서 형질전환 대장균을 선별했다. 하나의 콜로니를 해당 항생제가 포함된 LB 배지에 접종하여 30℃에서 하룻밤(overnight) 배양하였다. 50ml의 항생제와 10mM L-아라비노스(L-arabinose)를 포함한 LB 배지에 해당 배양액을 1 v/v%로 넣어주었다. 배양액 OD(600nm)가 0.4~0.8에 도달하면 전기천공(electroporation) 형질전환을 위해 4℃ 증류수로 3번 세척하였다. 전기천공(electroporation)을 위한 컴피턴트(competent) 세포에 해당 pTargetF를 500ng ~ 2μg 추가하였다. 전기천공 직후에는 10mM L-아라비노스가 포함된 LB 배지(media)를 넣어주고 1 ~ 2시간 동안 30℃에서 대장균 상태를 회복시켰다. 해당 항생제가 포함된 LB 아가 플레이트 (agar plate)에서 자라는 대장균을 선별하였고, 부분적인 염기서열 분석을 통해 Cas9에 의한 대장균 유전체 서열 변화를 확인하였다.

대장균 내 존재하는 pTargetF와 pCas를 제거하기 위한 절차는 다음과 같다. IPTG 0.2mM 및 카나마이신(Kanamycin) 항생제가 포함된 LB 배지(media)에서 12시간 동안 30℃ 에서 배양을 진행하여 pTargetF 벡터를 제거하였다. pTargetF 제거가 확인된 균주는 40℃ ~ 42℃에서 12시간 동안 배양을 진행하여 pCas 벡터를 제거하였다. 벡터 제거 여부는 해당 항생제를 포함한 LB 아가 플레이트 (agar plate)에서 대장균의 생존여부로 확인하였다. 확인된 대장균 균주는 단일 콜로니를 선별하여 추후 재조합 대장균 제작에 사용되었다.

재조합 단백질의 발현

본 발명에서 사용된 유전자들은 T7 RNA 폴리머라제(polymerase)에 의해 발현될 수 있는 발현 시스템을 기반으로 구축되었다. 재조합 효소 발현을 위해 목표 유전자들을 PCR로 증폭시켰다. 목표 유전자에는 대장균 유래 tesA, fadL 및 fadR, 박테로이드 프라질리스(Bacteroides fragilis) 유래 티오에스터라제, 락토바실러스 브레비스 (Lactobacilus brevis) 유래 티오에스터라제, 고르도니아 알카니보란스(Gordonia alkanivorans) 유래 CYP153A35, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 유래 CamAB 등이 포함된다. 해당 증폭 유전자는 상황에 적합하게 pCDF, pET24ma, 또는 pET28a 벡터 중 하나를 선정하여, 제한효소를 사용해 T7 프로모터와 터미네이터 사이에 삽입되었다. 2개 이상의 유전자를 하나의 벡터에 삽입할 경우, PCR를 이용해 벡터와 추가할 유전자를 이어 붙이는 작업을 진행하였다. 해당 벡터들은 전기천공(electroporation)을 이용해 대장균에 형질전환되었다. 형질전환 대장균들은 항생제가 포함된 LB 아가 플레이트 (agar plate)에서 선별되었으며, 단일 콜로니는 적합 항생제가 포함된 LB 배지(media)에서 12 ~ 15시간 동안 37℃에서 200rpm으로 배양되었다. 이 배양액은 1 v/v%로 4 ml의 항생제를 포함한 새로운 LB 배지에 접종되었다. 배양액의 OD(600nm)가 0.7 ~ 0.9에 도달하면 IPTG 0.05mM를 추가하였고, 6시간 동안 단백질 발현을 유도하였다.

재조합 단백질의 발현 확인은 다음과 같이 진행되었다. Tris-HCl 50 mM pH 8.0 버퍼(buffer)로 세척된 세포 펠렛(pellet)에 버그 버스터(bug buster) 용액을 처리하여 세포 추출물을 준비하였다. 버그 버스터 용액은 세포 내 단백질 분석을 위해 세포를 용해시키는 용액으로, 세포 펠렛을 용액에 푼 뒤, 상온에서 20분 처리하면 세포 용해액이 바로 준비되기 때문에 다수의 소량샘플 분석에 쓰기에 용이하다.

세포 추출물을 15분 동안 13000 rpm으로 4℃에서 원심 분리시켰고, 상층액을 취해 SDS-PAGE 분석을 진행하였다.

형질전환 대장균을 이용한 지방산 및 지방산 유도체 생산 방법과 분석

위 방법으로 얻은 형질전환 대장균을 이용해 지방산 및 지방산 유도체를 생산하였다. 상기 단일 콜로니를 배양하여 얻은 LB 배지 배양액을 항생제가 포함된 M9 배지에 접종하였다. 이 때, LB 배지 배양액은 새로운 M9 배지 4ml의 1v/v%만큼 접종하였으며, M9 배지에는 포도당 1.5%가 포함되어 있다. 지방산 및 지방산 유도체 생산을 유도하기 위해 M9 배양액의 OD(600nm)가 0.7~0.9에 도달했을 때 IPTG 0.05mM을 추가하였고 30℃에서 200rpm으로 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포 배양액의 일부분을 취해 염산으로 pH 2.0 이하의 조건을 형성하였고, 2배 부피의 에틸 아세테이트(ethyl acetate)로 지방산 및 지방산 유도체를 추출하였다. 에틸 아세테이트는 진공농축기를 이용해 모두 제거되었고, 고체형태의 추출물은 황산 2%가 포함된 메탄올 용액에 녹였다. 이 용액은 70 에틸 아세테이트에서 1시간 처리되었고, 지방산 및 지방산 유도체는 메틸 에스터 형태로 유도체화되었다. 메탄올 용액에 2배 부피의 헥산을 처리하여 메틸 에스터 형태의 지방산 및 지방산 유도체를 추출해내었고, 농축기(concentrator)로 해당 물질의 농도를 농축시켰다. 헥산(hexane)이 녹여진 용액들은 GC/MS를 사용해 분석되었다. 이후 실시예에서 지방산 생산에 관한 특별한 설명이 언급되어있지 않는 한, 이와 동일한 조건에서 실험이 진행되었다.

[ 실시예 ]

[ 실시예 1] 팔미트산 선택적 생산을 위한 재조합 대장균 제작 및 이를 이용한 반응계 구축

지방산 축적을 위해 도 1의 모식도와 같이 대장균 BL21(DE3) 균주에서 지방산 생산감소 유전자인 fadD 유전자를 제거하였다. 지방산 축적을 향상 시킨다고 알려진 sucC 유전자 또한 제거하여 PA 균주를 제작하였다.

sucC 유전자는 TCA 회로에 위치한 숙신산 탈수소효소(succinate dehydrogenase)의 유전자로, 해당 유전자를 제거하면 TCA 회로 방향으로의 아세틸-코에이(acetyl-coA) 사용량이 감소하고 지방산 합성 방향으로의 아세틸-코에이 사용량이 증대한다는 보고가 있다. 따라서, 아세틸-코에이의 사용이 지방산 합성에 집중될 수 있게 sucC 유전자를 제거하였다.

유리 지방산 중에서도 팔미트산 (탄소 16개의 포화지방산)을 주로 생산하는 티오에스터라제를 찾기 위해, 상기 재조합 대장균에 티오에스터라제를 과발현시키고자 하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이 대장균 유래 'tesA 유전자 (이후 ECTE)와 B.fragilis 유래 티오에스터라제 유전자 (이후 BFTE)를 과발현하였다. ECTE를 발현한 경우, 총 452.3 mg/L의 지방산이 생산되었으며 미리스틱산 (탄소 14개의 포화지방산)이 57.6%로 주되게 생성되었다. BFTE를 발현한 경우 총 220.6 mg/L의 지방산이 생성되었으며 팔미트산이 54.3%로 주되게 생성되었다.

지방산 생산을 증대시키기 위해 각 티오에스터라제를 발현하는 균주에 fadR 유전자를 과발현시켰다. ECTE와 FadR을 과발현시킨 경우, 총 1346.9 mg/L의 지방산이 생성되었으며 미리스틱산이 42.1%로 주되게 생성되었다. BFTE와 FadR을 과발현시킨 경우, 총 781.8 mg/L의 지방산이 생성되었으며 팔미트산이 48.3%로 주되게 생성되었다.

결과적으로 2개의 티오에스터라제에서 모두 지방산 생산이 증대되었다. 하지만 불포화지방산 생산 또한 증대되는 것을 확인할 수 있었다. ECTE의 경우, fadR을 동시에 과발현시킬 경우 불포화도가 19.4%에서 30.4%로 증가하였다. BFTE의 경우에도 불포화도가 25.5%에서 33.4%로 증가하였다. 팔미트산을 선택적으로 생산하기 위해 추후 실시예들에서는 BFTE과 FadR을 과발현시킨 재조합 대장균을 사용하기로 결정하였다.

[ 실시예 2]: 불포화지방산 생산성 감소를 위한 재조합 대장균의 제작 및 지방산 생산 분석

야생형 대장균에서는 도 3의 모식도와 같이 지방산 합성 과정에 관여하는 유전자들 (FabG, FabA, FabI, FabB, FabF, FabH, Acc, FabD)이 FadR 전사조절인자에 의해 과발현된다. 여기서 FabA와 FabB는 불포화지방산 합성경로에 특이적으로 관여하는 효소이며 과발현시에 불포화지방산의 비율을 증대시킨다. 또한, 상기 FabA 및 FabB의 유전자는 대장균 생존에 필수적인 유전자이므로 단순히 제거 (knock-out)시킬 수 없다.

앞선 실시예 1에서 나타난 바와 같이, FadR을 과발현시키면 전체 지방산 생산량이 증가하지만, 지방산 중 불포화지방산의 비율 또한 증가한다. FadR 과발현의 장점을 유지하며 불포화지방산 생산 증가를 해소하기 위해, 도 4의 모식도와 같이 대장균의 FadR 레귤론에 변이를 가하였다.

fabA 프로모터의 FadR 결합부위에 변이를 가하기 위해, 서열식별번호:8 을 겨냥하는 gRNA를 발현시켜 fabA 프로모터 주변 서열을 서열식별번호:1 의 서열로 바꿔, 도 4와 같이 fabA의 발현이 FadR에 의해 과발현되지 않는 균주 PA-A를 제작하였다. 그리고, fabB 프로모터의 FadR 결합부위에 변이를 가하기 위해 서열식별번호:9 를 겨냥하는 gRNA를 발현시켜 fabB 프로모터 주변 서열을 서열식별번호:2 의 서열로 바꿔, 도 4와 같이 fabB의 발현이 FadR에 의해 과발현되지 않는 균주 PA-B를 제작하였다.

균주 PA-A와 균주 PA-B에 FadR과 BFTE를 발현시켰을 때, 초기균주 대비 총 지방산 생산량이 각각 76.2% 및 46.4% 감소하였다. 또한, 초기균주에서 33.4%였던 불포화도가 PA-A균주에서 15.4%로, PA-B균주에서 35.7%로 변하였다. 따라서, 균주 PA-A 및 균주 PA-B에서는 전체 유리 지방산 생산량이 감소하는 것을 확인할 수 있었고, 균주 PA-A에서만 불포화지방산의 생산량이 크게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 추후 실시예에서는 PA-A균주에 추가적인 변이를 가하기로 결정하였다.

PA-A균주의 지방산 생산 감소를 해결하기 위해 도4의 PA-AZ와 같이, 대장균 유래 fabZ를 fabI 오페론에 포함시켜 fabZ 또한 FadR 레귤론에 포함시키고자 하였다. 여기서 FabZ는 FabA와 같은 반응에 관여하는 이소효소(isozyme)이며, 포화지방산 생산을 위한 중간체에 대해 기질특이성이 높다. 따라서 PA-AZ균주는 야생형 FadR 레귤론에서 fabA를 배제시키고 대신 fabZ를 포함시킨 균주라 설명이 가능하겠다.

이를 실현시키기 위해 서열식별번호:10 을 겨냥하는 gRNA를 발현시켜 fabI 유전자 바로 뒤에 fabZ 유전자를 서열식별번호:3 과 같이 삽입하여 PA-AZ 균주를 완성하였다. FadR과 BFTE를 발현시킨 PA-AZ 균주는 FadR과 BFTE를 발현시킨 PA-A균주보다도 낮은 8.3%의 불포화도를 가졌지만, 총 823.3 mg/L의 지방산을 생산하였다. 이 때 팔미트산 생산 비율은 77.6%로 증가하였고, 총 639.4 mg/L의 팔미트산이 생성되었다.

fabZ 유전자를 FadR 레귤론에 추가한 효과를 강화하기 위해 도 4의 PA-AZ+ 균주와 같이 fabI 오페론의 프로모터를, FadR 전사조절인자에 의해 더 강하게 발현하는 accA 프로모터로 만들었다. 이를 실현시키기 위해 서열식별번호:11 을 겨냥하는 gRNA를 발현시켜 fabI의 프로모터 주변 서열을 서열식별번호:4 의 서열로 바꿔, 도 4와 같이 fabI 오페론을 강화시킨 균주 PA-AZ+를 제작하였다.

PA-AZ+ 균주에 BFTE와 FadR을 발현한 결과, 총 지방산 생산량은 814.5mg/L였다. 또한, 불포화도가 5.9%로 더 감소하였고 팔미트산 생산량은 675.8 mg/L로 총 지방산의 83.0%을 차지했다. 도 5에서 나타낸 바와 같이, FadR 레귤론의 변이를 통해 야생형 균주보다 불포화지방산의 비율이 낮고 팔미트산 비율이 향상된 재조합 대장균을 제작할 수 있었다. 최종적으로 팔미트산을 선택적으로 생산하기 위한 PA-AZ+균주를 제작하였다.

[ 실시예 3]: 오메가-수산화팔미트산 선택적 생산을 위한 재조합 대장균 제작 및 지방산 유도체 생산 분석

팔미트산을 오메가-수산화팔미트산으로 만들기 위한 균주를 제작하기 위해 도 6과 같은 전략이 도입되었다. Cytochrome P450 효소 (이후 P450)를 사용하여 지방산의 오메가 위치에 수산화기를 도입시킬 수 있으며, 외부로 배출된 지방산은 대장균 유래의 지방산 수송자(transporter)인 FadL에 의해 세포 내부로 다시 들어오게 만들 수 있다.

BFTE와 FadR을 발현시킨 PA균주에 G.alkanivorans 유래 CYP153A35와 Pseudomonas putida 유래 CamAB를 과발현시켜 CYP-0 균주를 제작하였다. CamAB 는 NADH 의존적 전자전달시스템으로서 CYP153A35 효소에게 전자를 전달하는 역할을 한다. CYP-0 균주는 36.8 mg/L의 오메가-수산화팔미트산을 생산하였으며 수산화지방산 중 59.8%를 차지하였다.

BFTE와 FadR을 발현시킨 PA-AZ+ 균주에 상기 CYP153A35와 CamAB를 동시발현시켰을 때 (균주 CYP-1), 오메가-수산화팔미트산 83.5 mg/L가 생산되었으며 생산된 하이드록시지방산 중 87.5%를 차지하였다. FadR 레귤론 변이 균주가 지방산 유도체의 선택적 생산을 향상시킬 수 있음을 증명하였다.

균주 CYP-1 에서, CYP153A35을 대신하여 CYP153A35의 돌연변이이며 활성이 향상된 CYP153A35 D131S/G297A를 도입한 균주 CYP-2는 오메가-수산화팔미트산을 156.9 mg/L가 생산하였다. CYP-2 균주에 FadL을 추가로 발현시킨 균주 CYP-3에서는 오메가-수산화팔미트산 생산이 209.4 mg/L로 증가하였으며 전체 수산화지방산 중 84.5%를 차지하였다.

[ 실시예 4]: 오메가-수산화팔미트산 선택적 생산을 향상 시키기 위한 공동배양 시스템과 생산량 분석

한 세포 내에서 오메가-수산화팔미트산 합성을 위해 필요한 조효소 부족현상 및 단백질 합성에 드는 부담을 줄이기 위해 지방산을 생산하기 위한 재조합 대장균 (CO-FFA) 및 지방산을 가공하기 위한 재조합 대장균(CO-CYP)을 포함하는 공동배양 시스템을 적용하였다. PA-AZ+ 균주에 BFTE와 FadR을 발현시킨 CO-FFA 균주와 PA-AZ+ 균주에 CYP153A35 D131S/G297A, FadL, CamAB를 도입한 CO-CYP 균주를 섞어 배양하여 오메가-수산화팔미트산 생산을 분업화하였다. CO-FFA 균주와 CO-CYP 균주를 OD(600 nm) 값 기준으로 1:99, 1:9, 3:7, 5:5, 7:3, 9:1, 99:1 비율로 섞어 초기 접종을 위한 최종 OD(600nm)가 약 0.08이 되도록 공동배양 시스템을 개시하였다

해당 시스템은 37℃ 200rpm에서 배양되었고 OD(600nm)가 0.7~0.9에 도달하게 되면 IPTG 0.05mM로 단백질 발현을 유도하였다. IPTG를 추가하고 24시간 이후에 지방산 및 지방산 유도체 분석을 진행하였다. 도 8에서 보이듯이, 섞어준 비율에 따라 생성된 오메가-수산화팔미트산 양은 다양화되었으며 CO-FFA균주 대 CO-CYP균주의 비율이 OD(600 nm) 값을 기준으로 약 9대 1일 때 가장 효과적으로 오메가-수산화팔미트산이 생산되었으며, 이는 401.0 mg/L을 생산하였다.

최근 바이오플라스틱 제작에 대한 요구가 증가하고 있다. 다양한 생성물이 나오는 생물공정에서 실제 플라스틱 제조를 위한 수준으로 선택적 지방산 및 지방산 유도체를 생산하는 것은 바이오산업에서 크게 요구되는 부분이다. 본 발명은 재활용 탄소원을 사용하면서 특정 길이의 포화지방산 및 포화지방산 유도체의 선택적 생산을 효과적으로 향상시킬 수 있는 방법을 제시하였다.

본 발명은 지방산 생산에만 한정되어 적용되지 않고, 전사조절인자 과발현을 사용하는 대사공학 접근법에 모두 적용할 수 있다. 레귤론을 조절함으로써 부산물을 줄이고 원하는 산물의 선택적 생산을 향상시킬 수 있을 것이라 기대된다.

<110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY R&DB FOUNDATION <120> PRODUCTION OF FATTY ACIDS AND FATTY ACID DERIVATIVES WITH THE REDUCED DEGREE OF UNSATURATEDNESS THROUGH ENGINEERING REGULON <130> Y18KP-120 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 110 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified fabA promoter <400> 1 cgttttccat ggccattacg ttggctgaac tggtttattc cgaaataaac ggaattgttc 60 agcgtacacg tgttagctat cctgcgtgct tcaataaaat aaggcttaca 110 <210> 2 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified fabB promoter <400> 2 cgatgtgtgt aaggctgcgc aaatttctct attaaatgaa tgaacgaact tgttcggcgt 60 acaagtgtac gc 72 <210> 3 <211> 1461 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fabI operon with fabZ gene situated after the stop codon of fabI <400> 3 ctatgttaac gccgttaccc gtgaaggctt caaaattgcc cacgacatca gctcctacag 60 cttcgttgca atggcaaaag cttgccgctc catgctgaat ccgggttctg ccctgctgac 120 cctttcctac cttggcgctg agcgcgctat cccgaactac aacgttatgg gtctggcaaa 180 agcgtctctg 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12 atgcagatcc tcgaccgcgt cgttgagacg gtgcaggcga acatcccgct ggaccgtcag 60 gttcagggcc tccagctctt ccacaagacg cgtgctcgcc tgctcggcga gtcgcggccg 120 gaaacctatg tggagcagcc tatcccgccg gtcaacgaag tcggtctgga cgagatcgac 180 atgagcaacc cgttcatgta ccggcagggg cagtgggttc cctacttcgc tcgcctccgc 240 gccgaggcgc cggtccacta tcagccggaa agccggttcg gcccgttctg gtcgatcacc 300 cgctacgacg acatcatgac agtcgacaag gaccacgaga ccttctcggc cgaacccttc 360 atcgtgatcg gcactccccc accgggcctc gacgtcgaga tgttcatcgc gatggacccg 420 ccgcggcatg acgagcagcg tcgcgccgtt cagggcgtcg tcgccccgaa gaatctcaag 480 gagatggaag ggctgatccg ggaacgcgtg tgcgaggttc tcgacaacct tcccgtcggc 540 gaaccgttca actgggtcga tcgcgtttcg gtcgagatca ccgcccggac cctggcgacc 600 atcctcgact tcccgtacga gcagcggcgc agtctcgtcc gctggtccga tctcgcgtcc 660 ggcagcgaag aggccaccgg cggcgccagc gatcccgacg aggtgtacgc ggcagccctg 720 gagatgaccc gtgccttcag cgcgctgtgg cacgacaagg ccgcacgacg cgccgccggc 780 gaggcaccgg gattcgacct catcagcatg ctgcagtccg atccgaagac cgccgaccta 840 gtgaagcgtc cgatggagtt catcggcaac ctgacgctgc tgatcgtcgg cggaaacgac 900 accacgcgca actcgatgtc gggcggtgtc tacgcactga acaagttccc cgccgagttc 960 gagaagctca aggctgatcc gagcctgatc ccgaacatgg tgtcggagat catccgctgg 1020 cagaccccgc tcgcgtacat gcgacgggtc gcgaagaagg atgcgattct caacggccaa 1080 ttcatccgca agggcgacaa gctggtgatg tggtacgcct cgggcaaccg ggacgagacc 1140 aagttcgaca gccccgacga actcatcatc gaccggccga acgcccgcaa ccacatggca 1200 ttcggtttcg gtgtgcaccg gtgcatgggc aaccgtctcg ccgaactgca gctgcgcatc 1260 ctctgggaag aactgctgca gcgcttcgat gacatcaagg tcatcgagga acccgagtac 1320 gtgcagtcca acttcgtccg tggttacagc aagctgatgg tcgaactcac gccgaagaca 1380 cggtcatga 1389 <210> 13 <211> 1389 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP153A35 D131S/G297A <400> 13 atgcagatcc tcgaccgcgt cgttgagacg gtgcaggcga acatcccgct ggaccgtcag 60 gttcagggcc tccagctctt ccacaagacg cgtgctcgcc tgctcggcga gtcgcggccg 120 gaaacctatg tggagcagcc tatcccgccg gtcaacgaag tcggtctgga cgagatcgac 180 atgagcaacc cgttcatgta ccggcagggg cagtgggttc 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Claims (20)

1. 불포화지방산 비율이 낮은 지방산 또는 지방산 유도체를 생산하기 위한 재조합 대장균으로서 하기를 특징으로 하는 재조합 대장균:
   a) 지방산 생산 감소 유전자인 fadD가 제거됨;
   b) fabA, fabB, 또는 fabA 및 fabB의 프로모터에서 FadR의 결합부위가 변이됨;
   c) fabZ가 FadR 레귤론 중 fabI 오페론에 추가됨;
   d) 티오에스터라제가 발현됨; 및
   e) FadR이 과발현됨.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 fabI 오페론의 프로모터가 accA 프로모터로 교체된 것을 특징으로 하는 재조합 대장균.
3. 제 1 항에 있어서, 지방산 또는 지방산 유도체가 팔미트산 또는 오메가-수산화팔미트산인 재조합 대장균.
4. 제 1 항에 있어서, FadR의 결합부위가 변이된 fabA의 프로모터의 염기서열이 서열식별번호:1 이고, FadR의 결합부위가 변이된 fabB의 프로모터의 염기서열이 서열식별번호:2 인 재조합 대장균.
5. 제 1 항에 있어서, fabZ가 추가된 fabI 오페론의 염기서열이 서열식별번호:3 인 재조합 대장균.
6. 제 2 항에 있어서, accA 프로모터의 염기서열이 서열식별번호:4 인 재조합 대장균.
7. 제 1 항에 있어서, 티오에스터라제가 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 박테로이드 프라질리스(Bacteroides fragilis) 및 대장균(Escherichia coli)로 이루어진 군으로부터 선택되는 균으로부터 유래된 티오에스터라제인 재조합 대장균.
8. 제 7 항에 있어서 티오에스터라제가 서열식별번호:5 의 염기서열로 이루어지는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 유래 티오에스터라제, 서열식별번호:6 의 염기서열로 이루어지는 박테로이드 프라질리스(Bacteroides fragilis) 유래 티오에스터라제 및 서열식별번호:7 의 염기서열로 이루어지는 대장균(Escherichia coli) 유래 티오에스터라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 재조합 대장균.
9. 제 1 항에 있어서, 추가로 지방산 유도체를 생산하는 유전자가 과발현된 재조합 대장균으로서, 상기 지방산 유도체를 생산하는 유전자가 시토크롬 P450, AlkBGT, 트랜스아미나제(transaminase), 알코올 옥시다아제(alcohol oxidase), 알데히드 옥시다아제(aldehyde oxidase), 및 디하이드로지나아제(dehydrogenase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소의 유전자인 재조합 대장균.
10. 삭제
11. 제 9 항에 있어서, 상기 시토크롬 P450이 CYP153A35 또는 CYP153A35 D131S/G297A인 재조합 대장균.
12. 제 11 항에 있어서, CYP153A35 의 유전자가 서열식별번호:12 의 염기서열로 이루어지고, CYP153A35 D131S/G297A 의 유전자가 서열식별번호:13 의 염기서열로 이루어지는 재조합 대장균.
13. 제 11 항에 있어서, FadL, CamAB, 또는 FadL 및 CamAB가 추가로 과발현된 재조합 대장균.
14. 제 1 항 내지 제 9 항 및 제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 재조합 대장균을 제조하는 방법으로서 하기 단계를 포함하는 제조방법:
    a) 지방산 생산 감소 유전자인 fadD를 제거하는 단계;
    b) fabA, fabB, 또는 fabA 및 fabB 의 프로모터에서 FadR의 결합부위에 변이를 가하는 단계;
    c) fabZ를 FadR 레귤론 중 fabI 오페론에 추가시키는 단계;
    d) 티오에스터라제를 발현시키는 단계; 및
    e) FadR을 과발현시키는 단계.
15. 제 14 항에 있어서 f) 상기 fabI 오페론의 프로모터를 accA 프로모터로 교체하는 단계를 추가로 포함하는 제조방법.
16. 제 14 항에 있어서 g) 지방산 유도체를 생산하는 유전자를 과발현시키는 단계를 추가로 포함하는 제조방법으로서, 상기 지방산 유도체를 생산하는 유전자가 시토크롬 P450, AlkBGT, 트랜스아미나제(transaminase), 알코올 옥시다아제(alcohol oxidase), 알데히드 옥시다아제(aldehyde oxidase), 및 디하이드로지나아제(dehydrogenase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소의 유전자인 제조방법.
17. 제 14 항에 있어서, 제조방법이 CRISPR-Cas9 시스템을 이용하는 것인 제조방법.
18. 불포화지방산 비율이 낮은 지방산 또는 지방산유도체를 생산하기 위한 재조합 대장균의 공동배양 시스템으로서, 상기 공동배양 시스템은 지방산을 생산하기 위한 재조합 대장균 및 지방산을 가공하기 위한 재조합 대장균을 포함하고,
    상기 지방산을 가공하기 위한 재조합 대장균은 지방산 유도체를 생산하는 유전자가 과발현된 것이고,
    상기 지방산 유도체를 생산하는 유전자가 시토크롬 P450, AlkBGT, 트랜스아미나제(transaminase), 알코올 옥시다아제(alcohol oxidase), 알데히드 옥시다아제(aldehyde oxidase), 및 디하이드로지나아제(dehydrogenase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소의 유전자이고,
    상기 지방산을 생산하기 위한 재조합 대장균은 하기를 특징으로 하는 것인 공동배양 시스템:
    a) 지방산 생산 감소 유전자인 fadD가 제거됨;
    b) fabA, fabB, 또는 fabA 및 fabB의 프로모터에서 FadR의 결합부위가 변이됨;
    c) fabZ가 FadR 레귤론 중 fabI 오페론에 추가됨;
    d) 티오에스터라제가 발현됨;
    e) FadR이 과발현됨; 및
    f) 상기 fabI 오페론의 프로모터가 accA 프로모터로 교체됨.
19. 삭제
20. 제 18 항에 있어서, 지방산을 생산하기 위한 재조합 대장균 대 지방산을 가공하기 위한 재조합 대장균의 비율이 OD(600 nm) 값을 기준으로 9 대 1 인 공동배양 시스템.

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