KR102116954B1 - Composition for cryopreservation and lyophilization of fetal stem cells - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 줄기세포의 동결보존 및 동결건조에 사용하기 위한 세포 보존용 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 동결보존 및 동결건조용 배지 조성물은 해동되거나 재수화된 후에도 줄기세포의 생존율 및 배양율을 유지할 수 있도록 하며, 향후 세포치료제의 제조에 이용할 수 있는 특징을 갖는다.The present invention relates to a composition for cell preservation for use in cryopreservation and lyophilization of stem cells. Specifically, the medium composition for cryopreservation and freeze-drying of the present invention allows to maintain the survival rate and culture rate of stem cells even after thawing or rehydration, and has characteristics that can be used in the manufacture of cell therapy products in the future.
줄기세포는(Stem cell)는 자기 복제(Self-renewal)가 가능하고 다양한 조직의 세포로 분화(Differentiation) 할 수 있는 능력을 가진 미분화 세포로서, 신체 조직의 회복 및 세포 재생 능력을 가지고 있어 현재 확실한 치료법이 없는 퇴행성 질병이나 심한 외상과 같은 치료가 어려운 조직 손상에 있어 의학적 활용도가 매우 높은 차세대 치료 대안으로 활발한 연구가 진행 중이다.Stem cells (Stem cells) are self-replicating (Self-renewal) and are undifferentiated cells that have the ability to differentiate into cells of various tissues. Active research is underway as a next-generation treatment alternative with very high medical utilization for degenerative diseases without treatment or severe tissue trauma such as severe trauma.
줄기세포를 포함한 세포는 인위적으로 동물의 조직의 일부 및 유기체로부터 분리하여 생체 외(in vitro)의 배양 접시 또는 시험관에서 배양이 가능하며, 생명공학(Biotechnology)분야의 기초 기술, 의약품 생산 및 세포치료제 개발연구 등에 이용되고 있다. 적절한 조건의 배양시스템에서 줄기세포는 계속 증식이 가능하며, 계대배양(subculture)을 통해 증식을 유지한다. 하지만 장기간에 걸쳐 계대배양을 할 경우, 세포 내 돌연변이 및 오염으로 인한 세포 손실이 일어날 수 있으므로, 이를 최소화하고 노화와 형질전환을 방지하는 등 세포가 가지고 있는 특성이 변하지 않는 안정적인 세포주(cell line)를 유지하기 위해 세포 보존 기술은 매우 중요하다.Cells, including stem cells, can be artificially separated from animal tissues and organisms, and cultured in vitro in culture dishes or test tubes. Basic technologies in the field of biotechnology, pharmaceutical production and cell therapy It is used for development research. Stem cells can continue to proliferate in a culture system under appropriate conditions, and maintain proliferation through subculture. However, when passaged over a long period of time, cell loss due to mutation and contamination in the cell may occur, thus minimizing this and preventing aging and transformation. Cell retention techniques are very important to maintain.
세포 보존 기술은 세포 배양 기술의 발전과 더불어, 생물학적 연구를 기초로 한 생명공학 분야에 널리 이용되고 있으며, 그 중 동결 보존(cryopreservation) 방법이 주로 사용되고 있다. 동결 보존 방법은 세포를 동결배지에 현탁하여 세포의 온도를 일정하게 낮추어 최종적으로 -196℃에 냉동 보존 하는 것으로 일반적으로 세포에 내동성을 부여하고 보호하는 역할로 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO), 글리세롤(glycerol)등의 동해방지제와 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)또는 이를 포함한 세포배양 배지가 주 성분으로 이용되고 있다.그러나, 이와 같은 세포 동결 보존 방법은 동해방지제 DMSO와 동물 유래 혈청 FBS가 갖는 세포 독성, 동물 병원성 오염 등의 세포 손상을 야기할 수 있으므로, 새로운 세포 보존 방법과 조성액에 대한 개발과 검증이 필요하다.Cell preservation technology is widely used in the field of biotechnology based on biological research with the development of cell culture technology, and among them, cryopreservation method is mainly used. The cryopreservation method is to suspend the cells in a freezing medium and lower the temperature of the cells constantly to finally cryopreserve at -196 ° C. Generally, dimethyl sulfoxide (DMSO) is used to protect and protect the cells. ), Glycerol (glycerol), etc., and anti-freeze inhibitors and fetal bovine serum (FBS) or cell culture medium containing the same are used as the main components.However, such cell cryopreservation method is derived from the anti-freeze inhibitor DMSO and animals. Since the serum FBS can cause cell damage such as cytotoxicity and animal pathogenic contamination, it is necessary to develop and verify new cell preservation methods and composition solutions.
동결 건조 기술은 물질을 동결 한 다음 수증기의 부분압을 낮추어 얼음을 직접 기체로 승화시킴으로써 수분을 제거하는 공법으로, 보존과 운반의 편리성을 위해 현재 식품, 제약 및 생명공학 분야에서 많이 쓰이고 있다. 세포 분야에는 아직 임상 연구 중인 분야이지만, 이 기술이 정착된다면 일반 세포 동결 시 필요한 기계나 설비가 필요하지 않아 가격적 비용 절감이 예상되며, 장기 보존이 가능하고 활용 지역 및 운송수단에 제약을 받지 않아 특히 줄기세포 치료제 분야에서 매우 중요한 기술로 이용될 수 있을 것으로 예상된다. 그러나, 동결건조시 혹독한 환경에 줄기세포가 장시간 노출되면서 재수화가 잘되지 않는 등 세포치료제의 품질 및 효과가 저하될 우려가 있다.Freeze-drying technology is a method of removing water by freezing the material and subliming the ice directly into a gas by lowering the partial pressure of water vapor. Currently used in food, pharmaceutical and biotechnology fields for convenience in preservation and transportation. In the cell field, it is still in clinical research, but if this technology is settled, it is expected to reduce cost by not requiring machines or equipment required for normal cell freezing, long-term preservation is possible, and it is not restricted by the region and transportation used. In particular, it can be used as a very important technology in the field of stem cell therapy. However, there is a concern that the quality and effectiveness of the cell therapy product may be deteriorated, such as poor rehydration as the stem cells are exposed to the harsh environment for a long time during lyophilization.
따라서 본 발명에서는 태아 유래 줄기세포를 포함한 세포의 새로운 세포 안정적인 보존을 위해, 동해방지제와 동물 유래 혈청 성분이 없는 동결 보존용 및 동결 건조용 배지 조성물을 제시하고자 하며, 치료 시장 확보를 위해 운반 및 치료제 작용 특성상 살아있는 줄기세포를 안정하게 수송하는 방법이 필요한 세포치료제 분야에 도움이 될 것으로 기대 한다.Therefore, in the present invention, for the stable preservation of new cells, including embryo-derived stem cells, the present invention is intended to present a freeze-preservation and freeze-drying medium composition free of animal-derived antiseptics and animal-derived serum components. It is expected to be useful in the field of cell therapy products that require a method of stably transporting live stem cells due to its action characteristics.
본 발명은 알부민류; 단당류, 이당류, 당알코올, 다당류 또는 이들의 조합인, 당류; 수용성 중합체; 및 항산화제를 포함하는, 줄기세포의 동결보존 또는 동결건조 보조제용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.The present invention is albumin; Monosaccharides, disaccharides, sugar alcohols, polysaccharides, or combinations thereof, sugars; Water-soluble polymers; And it is an object to provide a composition for freeze-preservation or lyophilization of the stem cells, including antioxidants.
본 발명의 다른 목적은, 상기 동결보존 또는 동결건조 보조제용 조성물 및 줄기세포를 포함하는 세포치료제를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for a cryopreservation or lyophilization adjuvant and a cell therapy comprising stem cells.
본 발명의 또 다른 목적은, 줄기세포 배양물에 상기 동결보존 또는 동결건조 보조제용 조성물을 첨가하는 단계를 포함하는, 줄기세포 보관 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for storing stem cells, comprising the step of adding the composition for freeze-preservation or lyophilization aid to the stem cell culture.
상기 과제를 해결하기 위한 하나의 구현예로서, 알부민류; 단당류, 이당류, 당알코올, 다당류 또는 이들의 조합인, 당류; 수용성 중합체; 및 항산화제를 포함하는, 줄기세포의 동결보존 또는 동결건조용 보조제 조성물을 제공한다.As one embodiment for solving the above problems, albumin; Monosaccharides, disaccharides, sugar alcohols, polysaccharides, or combinations thereof, sugars; Water-soluble polymers; And it provides an auxiliary composition for freeze-preservation or lyophilization of stem cells, including an antioxidant.
상기 “동결보존(cryopreservation) 또는 동결건조(lyophilization) 보조제”는 줄기세포가 동결 스트레스에 의해서 손상되거나 기능을 잃음으로써 해동하거나 재수화하더라도 원래의 줄기세포로 회복되지 못하는 현상을 예방하기 위해 배양시 사용될 수 있는 구성 성분의 조합을 의미할 수 있다. The “cryopreservation or lyophilization supplement” may be used during cultivation to prevent the stem cells from being restored to the original stem cells even if thawed or rehydrated by damage or loss of function due to freezing stress. It can mean a combination of components that can.
상기 조성물은 배양액이나 용매를 더 포함할 수 있다. 상기 배양액 또는 용매는, 예를 들어, DMEM (Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium), DPBS (Dulbecco's phosphate Buffered Saline), RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 배지, MEM(Minimum Essential Media) 배지, 또는 이의 조합이 있으나, 이에 제한되지 않는다.The composition may further include a culture medium or a solvent. The culture medium or solvent is, for example, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), DPBS (Dulbecco's phosphate Buffered Saline), RPMI (Roswell Park Memorial Institute) medium, MEM (Minimum Essential Media) medium, or a combination thereof There are, but are not limited to this.
상기 조성물은 해동 또는 재수화된 후에도 곧바로 배양 배지로 사용될 수 있다. 이 경우, 줄기세포가 성장하기에 적합하도록 적절한 배양액이나 용매와 혼합하여 사용될 수 있다.The composition can be used as a culture medium immediately after thawing or rehydration. In this case, it can be used by mixing with a suitable culture medium or a solvent so that the stem cells are suitable for growth.
상기 "줄기세포"는 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 새로운 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 의미할 수 있다. 상기 줄기세포는, 만능 줄기세포(totipotent stem cells), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells), 또는 다분화능(다능성) 줄기세포(multipotent stem cells)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The "stem cell" may mean a cell having the ability to differentiate into two or more new cells while having the ability to self-replicate. The stem cells may be, but are not limited to, totipotent stem cells, pluripotent stem cells, or multipotent stem cells.
상기 “알부민류”는 알부민으로 분류되는 단백질류를 의미하는 것으로, 예를 들어, 인간혈청알부민, 소혈청알부민, α-락트알부민, 난알부민 또는 이들의 조합이 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 알부민류는, 전체 조성물을 기준으로 1 내지 30 w/v%, 1 내지 25 w/v%, 1 내지 20 w/v%, 1 내지 15 w/v%, 3 내지 15 w/v%, 5 내지 15 w/v%, 또는 6 내지 12 w/v%일 수 있다.The "albumins" refers to proteins classified as albumin, for example, human serum albumin, bovine serum albumin, α-lactalbumin, egg albumin, or a combination thereof, but is not limited thereto. The albumin, 1 to 30 w / v%, 1 to 25 w / v%, 1 to 20 w / v%, 1 to 15 w / v%, 3 to 15 w / v%, based on the total composition, 5 to 15 w / v%, or 6 to 12 w / v%.
상기 “당류”는 단당류, 이당류, 이들의 환원당인 당알코올, 단일 또는 혼합된 다수 당의 폴리머 등을 의미할 수 있고, 상기 다당류는 3당류 이상 당류를 의미할 수 있다. 상기 단당류는, 예를 들어, 만노스, 글루코스, 아라비노스, 프럭토스, 갈락토스 등이 있고; 상기 이당류는, 수크로스, 트레할로스, 말토스, 락토스, 셀로비오스, 겐티오비오스, 이소말토스, 멜리보우스, 등이 있고; 상기 당알코올은 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨 등이 있고; 상기 다당류는, 라피노스, 덱스트란, 전분, 히드록시에틸 전분, 시클로덱스트린, 셀룰로스, 헤타스타치, 올리고당이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 당류는 두 종류 이상의 혼합물로 사용될 수 있다.The “saccharides” may refer to monosaccharides, disaccharides, sugar alcohols which are reducing sugars thereof, polymers of single or mixed multiple sugars, etc., and the polysaccharides may mean three or more saccharides. The monosaccharides include, for example, mannose, glucose, arabinose, fructose, galactose, and the like; The disaccharides include sucrose, trehalose, maltose, lactose, cellobiose, genthiobiose, isomaltose, meliboose, and the like; The sugar alcohol includes mannitol, sorbitol, xylitol, erythritol, maltitol and the like; The polysaccharides include, but are not limited to, raffinose, dextran, starch, hydroxyethyl starch, cyclodextrin, cellulose, hetastarch, and oligosaccharides. The sugar can be used in a mixture of two or more kinds.
일 구체예에서, 상기 조성물은 이당류 및 다당류의 조합을 포함할 수 있다. In one embodiment, the composition may include a combination of disaccharides and polysaccharides.
일 구체예에서, 상기 조성물은 트레할로스 및 헤타스타치의 조합을 포함하는 것일 수 있다. In one embodiment, the composition may include a combination of trehalose and hetastarch.
상기 단당류, 이당류 또는 당알코올은, 전체 조성물을 기준으로 0.01 내지 0.5 M, 0.02 내지 0.4 M, 또는 0.05 내지 0.3 M일 수 있고, 상기 다당류는 전체 조성물을 기준으로 1 내지 30 w/v%, 1 내지 20 w/v%, 1 내지 15 w/v%, 1 내지 10 w/v%, 3 내지 30 w/v%, 3 내지 20 w/v%, 또는 3 내지 10 w/v%일 수 있다.The monosaccharide, disaccharide or sugar alcohol may be 0.01 to 0.5 M, 0.02 to 0.4 M, or 0.05 to 0.3 M based on the total composition, and the polysaccharide is 1 to 30 w / v%, 1 based on the total composition. To 20 w / v%, 1 to 15 w / v%, 1 to 10 w / v%, 3 to 30 w / v%, 3 to 20 w / v%, or 3 to 10 w / v% .
상기 수용성 중합체는, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 폴록사머, 카르복시비닐폴리머, 히알루론산 또는 이들의 조합이 있으나, 제한되지 않는다. 일 구체예에서, 상기 수용성 중합체는 폴리비닐피롤리돈일 수 있다. 상기 수용성 중합체는 전체 조성물을 기준으로 1 내지 20 w/v%, 1 내지 15 w/v%, 1 내지 10 w/v%, 또는 2 내지 8 w/v%일 수 있다.The water-soluble polymer is polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, hydroxymethylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxyethylcellulose, methylcellulose, poloxamer, carboxyvinyl polymer, hyaluronic acid, or a combination thereof, but is limited. Does not work. In one embodiment, the water-soluble polymer may be polyvinylpyrrolidone. The water-soluble polymer may be 1 to 20 w / v%, 1 to 15 w / v%, 1 to 10 w / v%, or 2 to 8 w / v% based on the total composition.
상기 항산화제는, L-카르니틴, 알카노일 L-카르니틴, 비타민 E, 비타민 A, 비타민 C, 글루타치온, 폴리페놀, 안토시아닌, 안토시아노이드, 셀레늄, 식이섬유 또는 이들의 조합이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 셀레늄은 셀레늄염(selenite)일 수 있고, 예를 들어, 아셀렌산나트륨 (Na2SeO3)일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 항산화제는 셀레늄일 수 있다. 상기 항산화제는 전체 조성물을 기준으로, 10 내지 80 nM, 20 내지 70 nM, 또는 30 내지 60 nM일 수 있다.The antioxidants include, but are not limited to, L-carnitine, alkanoyl L-carnitine, vitamin E, vitamin A, vitamin C, glutathione, polyphenols, anthocyanins, anthocyanoids, selenium, dietary fiber, or combinations thereof. . The selenium may be a selenium salt (selenite), for example, sodium selenite (Na 2 SeO 3 ). In one embodiment, the antioxidant may be selenium. The antioxidant may be 10 to 80 nM, 20 to 70 nM, or 30 to 60 nM based on the total composition.
일 구현예에 따른 줄기세포의 동결보존 또는 동결건조용 보조제 조성물은, 다른 화학적 동결방지제 및/또는 알부민을 제외한 동물 유래 혈청 성분을 포함하지 않는 것일 수 있다. 상기 “화학적 동결방지제”는 예를 들어, 다이메틸 설폭사이드(Dimethyl sulfoxide; DMSO), 글리세롤 등이 있고, 동물 유래 혈청 성분으로는, 알부민을 제외하고, 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)이 있다. DMSO와 같은 화학적 동결방지제는 줄기세포나 이를 투여 받을 개체에 세포 독성 성분으로 작용할 수 있고, FBS와 같은 동물 유래 혈청 성분은 그 동물로부터 유래된 병원성 인자로 인해 줄기세포 배양물이 오염되어 세포치료제를 오염시킬 위험이 있다.The composition for adjuvant for cryopreservation or lyophilization of stem cells according to one embodiment may not include other chemical cryoprotectants and / or serum components derived from animals other than albumin. The "chemical cryoprotectant" includes, for example, dimethyl sulfoxide (DMSO), glycerol and the like, and serum components derived from animals, except albumin, fetal bovine serum (FBS) have. Chemical antifreeze agents, such as DMSO, can act as cytotoxic components in stem cells or individuals to be administered them, and animal-derived serum components, such as FBS, are contaminated with stem cell cultures due to pathogenic factors derived from the animals. There is a risk of contamination.
상기 조성물은, 필요에 따라, pH 완충제, 계면활성제, 완충액, 염 등을 더 포함할 수 있다. 상기 pH 완충제는 글라이신, 히스티딘, 글루타메이트, 숙시네이트, 포스페이트, 아세테이트, 아스파르테이트 또는 이들의 조합이 있고, 상기 계면활성제는 나트륨 라우릴 술페이트, 디옥틸 나트륨 술포숙시네이트, 디옥틸나트륨 술포네이트, 케노데옥시콜산, N-라우로일사르코신 나트륨염, 리튬 도데실 술페이트, 1-옥탄술폰산 나트륨염, 나트륨 콜레이트 수화물, 나트륨 데옥시콜레이트, 글리코데옥시콜산 나트륨염, 벤즈알코늄 클로라이드, 트리톤(Triton) X-100, 트리톤 X-114, 라우로마크로골 (lauromacrogol) 400, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리소르베이트 20, 40, 60, 65 및 80 또는 이들의 조합이 있으나, 이에 제한되지 않는다.The composition, if necessary, may further include a pH buffer, a surfactant, a buffer, a salt, and the like. The pH buffer is glycine, histidine, glutamate, succinate, phosphate, acetate, aspartate or a combination thereof, and the surfactant is sodium lauryl sulfate, dioctyl sodium sulfosuccinate, dioctyl sodium sulfonate , Kenodeoxycholic acid, N-lauroylsarcosine sodium salt, lithium dodecyl sulfate, 1-octanesulfonic acid sodium salt, sodium cholate hydrate, sodium deoxycholate, glycodeoxycholate sodium salt, benzalkonium chloride, Triton X-100, Triton X-114, lauromacrogol 400, polyoxyl 40 stearate, polysorbate 20, 40, 60, 65 and 80, or combinations thereof, but is not limited thereto. Does not.
상기 조성물은 줄기세포의 동결보존 또는 동결건조에 적합한 구성성분을 포함하므로, 줄기세포의 동결보존 및 동결건조에 사용하기 위한 세포 보존용으로 이용될 수 있다.Since the composition contains components suitable for cryopreservation or lyophilization of stem cells, it can be used for cell preservation for use in cryopreservation and lyophilization of stem cells.
본 발명의 다른 일 구현예는, 줄기세포 및 상기 줄기세포의 동결보존 또는 동결건조용 보조제 조성물을 포함하는, 세포치료제를 제공한다.Another embodiment of the present invention provides a cell therapy agent comprising a stem cell and an adjuvant composition for cryopreservation or lyophilization of the stem cell.
상기 "세포치료제"란, 사람 및 동물로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.The "cell therapy agent" refers to a drug (US FDA regulation) used for the purpose of treatment, diagnosis and prevention with cells and tissues prepared through separation, culture and special manipulation from humans and animals, restoring the function of cells or tissues. Refers to a drug used for the purpose of treatment, diagnosis, and prevention through a series of actions such as proliferation screening of living autologous, allogeneic, or xenogeneic cells in vitro, or changing the biological properties of cells by other methods.
상기 세포치료제는 해동 또는 재수화 후에도 줄기세포의 생존율 및 배양효율을 유지하므로, 장기 보관 또는 취급이 용이한 동결물 또는 동결건조물 형태로 가공된 것일 수 있다. 상기 “동결물”은 줄기세포가 상기 줄기세포 및 상기 줄기세포의 동결보존 또는 동결건조용 보조제 조성물 또는 이를 포함하는 배양액에 현탁되거나 첨가된 상태로 동결된 것을 의미할 수 있고, 상기 “동결건조물”은 상기 동결물이 추가적인 건조 단계를 거쳐 용매는 현저히 감소되거나 실질적으로 제거된 상태의 산물을 의미할 수 있다. 일 구체예에 따른, 동결보존용 보조제 조성물은 20 내지 38 ℃, 25 내지 38℃, 또는 30 내지 38℃에서, 10 분 이내, 5 분 이내, 3 분 이내, 또는 2 분 이내에 해동하기에 적합한 것일 수 있다.Since the cell therapy agent maintains the survival rate and culture efficiency of stem cells even after thawing or rehydration, it may be processed into a frozen or lyophilized form that is easy to store or handle for a long time. The “frozen substance” may mean that the stem cell is frozen in suspension or added to the stem cell and an auxiliary composition for cryopreservation or lyophilization of the stem cell or a culture solution containing the same, and the “frozen substance”. Silver may refer to a product in which the frozen material is significantly reduced or substantially removed through the additional drying step. According to one embodiment, the cryopreservation aid composition is suitable for thawing at 20 to 38 ° C, 25 to 38 ° C, or 30 to 38 ° C, within 10 minutes, within 5 minutes, within 3 minutes, or within 2 minutes. Can be.
상기 세포치료제는 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 "약학적으로 허용되는" 이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 것을 말한다. 상기 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한없이 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 각종 제형의 형태로 통용되는 기법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명의 조성물인 세포치료제는 질병부위로 이동을 유도할 수 있다면 어떠한 경로를 통해서든지 투여 가능하다. 경우에 따라서는 줄기세포를 병변으로 향하게 하는 수단을 구비한 비히클에 로딩하는 방안을 고려할 수도 있다. 따라서 본 발명의 조성물은 국소 (협측, 설하, 피부 및 안내 투여를 포함), 비경구 (피하, 피내, 근육내, 점적, 정맥 내, 동맥 내, 관절 내 및 뇌척수액 내를 포함) 또는 경피성 투여를 포함한 여러 경로를 통해 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구로, 가장 바람직하게는 발병부위에 직접 투여한다. 일 양태로서 줄기세포는 적합한 희석제에 약 1×103 내지 5×106 세포/ml의 농도로 현탁시켜 개체에 투여할 수 있는데, 이 희석제는 세포를 보호 및 유지하고, 목적하는 조직에 주입시 사용에 용이하도록 하는 용도로 사용된다. 상기 희석제로는 생리식염수, 인산완충용액, HBSS 등의 완충용액, 혈장, 뇌척수액, 또는 혈액성분 등이 있을 수 있다. 또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있도록 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 주사제이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액, Hank 용액 또는 멸균된 수용액 등의 수성용제, 올리브 오일 등의 식물유, 에틸올레인산 등의 고급 지방산 에스테르 및 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 또는 글리세린 등의 비수성용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 점막 투과를 위해, 통과할 배리어에 적합한 당업계에 공지된 비침투성제가 사용될 수 있으며, 변질방지를 위한 안정화제로 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등과, 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등의 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제 등의 약학적 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 필요시, 세포치료제에서 상기 줄기세포의 동결보존 또는 동결건조용 보조제 조성물은 사용 전에 제거될 수 있다.The cell therapeutic agent may further include a pharmaceutically acceptable carrier. The "pharmaceutically acceptable" refers to those that are not toxic to cells or humans exposed to the composition. The carrier may be used without limitation as long as it is known in the art, such as buffers, preservatives, painless agents, solubilizers, isotonic agents, stabilizers, bases, excipients, lubricants, and preservatives. The pharmaceutical composition of the present invention can be prepared according to commonly used techniques in the form of various formulations. The cell therapeutic agent, which is a composition of the present invention, can be administered through any route as long as it can induce migration to a diseased site. In some cases, it may be possible to consider a method of loading stem cells into a vehicle equipped with means for directing the lesions to the lesion. Accordingly, the compositions of the present invention are topical (including buccal, sublingual, dermal and intraocular administration), parenteral (including subcutaneous, intradermal, intramuscular, drip, intravenous, intraarterial, intraarticular and cerebrospinal fluid) or transdermal administration. It can be administered through several routes, including, preferably parenterally, most preferably directly to the affected area. In one aspect, the stem cells can be administered to an individual by suspending them in a suitable diluent at a concentration of about 1 × 10 3 to 5 × 10 6 cells / ml, which protects and maintains the cells and injects them into the desired tissue. It is used to facilitate use. The diluent may include physiological saline, phosphate buffer solution, buffer solution such as HBSS, plasma, cerebrospinal fluid, or blood components. In addition, the pharmaceutical composition can be administered by any device so that the active agent can migrate to the target cell. The preferred mode of administration and formulation is an injection. The injectable solution is a physiological saline solution, an aqueous solvent such as a ring gel solution, a Hank solution or a sterilized aqueous solution, a vegetable oil such as olive oil, a higher fatty acid ester such as ethyl oleic acid, and a non-aqueous solvent such as ethanol, benzyl alcohol, propylene glycol, polyethylene glycol or glycerin. Non-permeable agents known in the art suitable for barriers to be passed can be used for mucosal permeation, ascorbic acid, sodium hydrogen sulfite, BHA, tocopherol, EDTA A pharmaceutical carrier such as emulsifier, buffer for pH adjustment, phenylmercuric nitrate, chimerosal, benzalkonium chloride, phenol, cresol, benzyl alcohol, etc., may be additionally included as a preservative for preventing the growth of microorganisms. If necessary, the adjuvant composition for cryopreservation or lyophilization of the stem cells in the cell therapy product may be removed prior to use.
본 발명의 다른 일 구현예는, 줄기세포 배양물에 상기 줄기세포의 동결보존 또는 동결건조용 보조제 조성물을 첨가하는 단계를 포함하는, 줄기세포 보관 방법을 제공한다.Another embodiment of the present invention provides a method for storing stem cells, comprising the step of adding an auxiliary composition for cryopreservation or lyophilization of the stem cells to the stem cell culture.
상기 줄기세포는, 영하의 온도에서 보관되는 것으로서, 예를 들어, -2 ℃이하, -15 ℃이하, -30 ℃이하, -50 ℃이하, -80 ℃이하, -100℃이하, -150 ℃이하, 또는 -180 ℃이하에서 보관하는 것을 의미할 수 있다.The stem cells are stored at sub-zero temperatures, for example, -2 ° C or less, -15 ° C or less, -30 ° C or less, -50 ° C or less, -80 ° C or less, -100 ° C or less, -150 ° C. Or, it may mean storing at or below -180 ° C.
상기 줄기세포를 보관하는 방법은, -1℃/분 내지 -5℃/분 또는 -1 ℃/분 내지 -2℃/분의 속도로 냉각하면서, -10℃ 내지 -25℃ 또는 -15℃ 내지 -25℃까지 냉각시키는 1차 냉각 단계; 상기 1차 냉각 후, 1차 냉각된 온도에서 30 분 내지 120 분 또는 45 분 내지 90분 인큐베이션하는 단계; 및 상기 인큐베이션 후 -10℃ 내지 -25℃ 또는 -15℃ 내지 -20℃로 급속 냉각하면서, -50℃ 내지 -200℃, -100℃ 내지 -200℃, 또는 -150 ℃ 내지 -200℃까지 냉각하는 2차 냉각 단계를 더 포함할 수 있다. 이러한 단계적 냉각은, 혹독한 온도로 냉각되는 동안 줄기세포의 손상을 더욱 줄일 수 있어 유리할 수 있다. The method for storing the stem cells, while cooling at a rate of -1 ° C / min to -5 ° C / min or -1 ° C / min to -2 ° C / min, -10 ° C to -25 ° C or -15 ° C to A primary cooling step of cooling to -25 ° C; After the primary cooling, incubating 30 minutes to 120 minutes or 45 minutes to 90 minutes at the primary cooled temperature; And after the incubation, while rapidly cooling to -10 ° C to -25 ° C or -15 ° C to -20 ° C, -50 ° C to -200 ° C, -100 ° C to -200 ° C, or -150 ° C to -200 ° C It may further include a secondary cooling step. This stepwise cooling may be advantageous because it can further reduce damage to stem cells while cooling to severe temperatures.
상기 줄기세포를 보관하는 방법은, 1차 냉각 및/또는 2차 냉각 후 이를 건조하는 단계를 더 포함할 수 있다. 동결하는 방법은 통상의 기술자에게 잘 알려진 방법에 따라 이루어질 수 있고, 예를 들어, 동결건조기의 얼음냉각기 온도 범위를 -30℃ 내지 -150℃ 또는 -50℃ 내지 -120℃로 하여 용매가 충분히 건조될 때까지 건조시킬 수 있다. 건조 단계는 동결 후 48시간 이후에 수행하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 시간 이내에 건조하는 경우 동결된 세포의 안정화가 이루어 지지 않아 건조 과정에 의해 유발되는 스트레스에 따른 손상이 유발될 확률이 높아질 수 있다.The method for storing the stem cells may further include drying after primary cooling and / or secondary cooling. The freezing method may be performed according to a method well known to those skilled in the art, and for example, the solvent may be sufficiently dried by setting the temperature range of the ice cooler of the freeze dryer to -30 ° C to -150 ° C or -50 ° C to -120 ° C. It can be dried until ready. It may be desirable to perform the drying step 48 hours after freezing. When drying within the time, the stabilization of the frozen cells is not achieved, which may increase the probability of damage caused by stress caused by the drying process.
본 발명의 줄기세포의 동결보존 또는 동결건조 보조제용 조성물은 줄기세포가 동결 스트레스에 대해 안정성을 유지할 수 있도록 하여, 해동되거나 재수화된 후에도 생존율과 배양율을 유지하여 줄기세포의 장기 보존에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 유해한 동결방지제나 동물 유래 혈청 성분을 포함하지 않으므로, 세포 독성이나 동물 유래 병원성 요인에 의한 오염을 최소화할 수 있다. 이러한 이점에 따라, 보관 안정성 및 사용 안전성이 모두 향상된 세포치료제를 제공할 수 있다.The composition for cryopreservation or lyophilization of the stem cells of the present invention allows the stem cells to maintain stability against freezing stress, thereby maintaining survival and culture rates even after thawing or rehydration, which is useful for long-term preservation of stem cells. Can be used. In addition, since it does not contain harmful cryoprotectants or animal-derived serum components, it is possible to minimize contamination by cytotoxicity or animal-derived pathogenic factors. According to these advantages, it is possible to provide a cell therapy product with improved storage stability and use safety.
도 1은 알부민 단백질의 함량 (0.1, 1, 5, 10%)에 따른 동결 보존 이후 해동 (Freeze thawing)과 동결 건조 이후 재수화 과정 (Freeze drying)을 거친 세포 생존율을 보여준다.
도 2는 수용성 중합체의 함량 (0.1, 1, 5%)에 따른 동결 보존 이후 해동 (Freeze thawing)과 동결 건조 이후 재수화 과정 (Freeze drying)을 거친 세포 생존율을 보여준다.
도 3 은 항산화제의 첨가 유무에 따른 동결 보존 이후 해동 (Freeze thawing)과 동결 건조 이후 재수화 과정 (Freeze drying)을 거친 세포 생존율을 보여준다.
도 4 는 알부민 단백질과 수용성 중함체의 첨가에 따른 동결 보존 이후 해동 (Freeze thawing)과 동결 건조 이후 재수화 과정 (Freeze drying)을 거친 세포 생존율을 보여준다.
도 5는 실시예 5의 배지에서의 동결 보존 이후 해동 (A)과 동결 건조 이후 재수화 과정 (B)을 거친 세포가 배양 접시 표면에 부착되어 줄기세포가 가지고 있는 섬유아세포 형태로 자라는 모양을 나타낸다. 세포의 형태는 Diff-quick으로 염색한 결과이다(X100).
도 6은 실시예 5의 배지에서의 동결 건조한 세포의 주사전자현미경에서의 분석 결과를 나타낸다. (A)와 (B)는 각각 X250, X650배율에서 동결 건조된 세포의 미세영역을 고배율로 관찰한 결과이다.1 shows the cell viability after freeze thawing and freeze drying after freeze drying according to the content of albumin protein (0.1, 1, 5, 10%).
FIG. 2 shows the cell viability after freeze thawing and freeze drying after freeze drying according to the content of the water-soluble polymer (0.1, 1, 5%).
FIG. 3 shows the cell viability after freeze thawing and freeze drying after freeze drying, depending on the presence or absence of addition of an antioxidant.
FIG. 4 shows the cell viability after freeze thawing and freeze drying after freeze drying after cryopreservation according to the addition of an albumin protein and a water-soluble intermediate.
Figure 5 shows the shape of the cells in the culture medium of Example 5 after thawing (A) after thawing (A) and rehydration (B) after freeze-drying are attached to the surface of the culture dish and grow in the form of fibroblasts possessed by stem cells. . Cell morphology is the result of staining with Diff-quick (X100).
6 shows the results of analysis in a scanning electron microscope of freeze-dried cells in the medium of Example 5. (A) and (B) are the results of observing the microregions of freeze-dried cells at high magnification at X250 and X650, respectively.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.Hereinafter, examples and the like will be described in detail to help understanding of the present invention. However, the embodiments according to the present invention may be modified in various other forms, and the scope of the present invention should not be construed as being limited to the following examples. The embodiments of the present invention are provided to more fully describe the present invention to those skilled in the art.
제조예 1: 줄기세포의 수득 및 배지의 제조Preparation Example 1: Obtaining stem cells and preparing the medium
1-1. 줄기세포의 수득 및 배양1-1. Stem cell harvest and culture
임신이 확인된 암말의 분만 시에 파열되지 않은 양막낭으로부터 말의 양수(amniotic fluid)를 멸균된 18 G를 장착한 50 cc 주사기로 획득하였다. 채집한 양수를, 5% 페니실린/스트렙토마이신 (penicillin/streptomycin) 항생제를 포함하는 PBS (phosphate Buffered Saline)와 1:1로 섞은 후, 3,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 펠렛(pellet)을 회수하였다. 회수한 펠렛을 다시 5 % 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 PBS를 이용해 세척 및 원심분리하는 과정을 2회 반복하여 단핵 세포를 분리하였다. 이를 15 % FBS, 1 % Glutamax 및 1 % 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute 1640) 배지를 이용하여 0.1% 젤라틴으로 코팅된 배양 접시를 통해 말과동물의 체온과 같은 38 ℃에서 5 % CO2 환경의 인큐베이터에 넣고 배양하여, 태아 유래 줄기세포를 얻었다.Amniotic fluid from the amniotic sac, which was not ruptured at the time of delivery of a mare with confirmed pregnancy, was obtained with a 50 cc syringe equipped with sterile 18 G. The collected amniotic fluid was mixed 1: 1 with PBS (phosphate buffered saline) containing 5% penicillin / streptomycin antibiotics, and centrifuged at 3,000 rpm for 10 minutes to recover pellets. The recovered pellet was washed again with PBS containing 5% penicillin / streptomycin and centrifuged twice to separate mononuclear cells. This was used at RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute 1640) medium containing 15% FBS, 1% Glutamax and 1% penicillin / streptomycin. In a 5% CO 2 environment incubated and cultured, embryo-derived stem cells were obtained.
1-2. 줄기세포 동결보존 또는 동결건조용 배지의 제조1-2. Stem cell cryopreservation or preparation of lyophilization medium
제조예 1-1에서 수득한 태아 유래 양수 줄기세포에 적합한 동결 배지를 하기의 표 1과 같은 조성으로 헤타스타치, 트레할로스, 알부민 단백질 (BSA), 수용성 중합체 (PVP) 및 항산화제 (Selenite)를 기본 용매 DPBS (Dulbecco's phosphate Buffered Saline)에 혼합하여 실시예 1-1 내지 4-3의 배지를 제조하였다. A freeze medium suitable for fetal-derived amniotic stem cells obtained in Preparation Example 1-1 was prepared with Hetastarch, Trehalose, Albumin Protein (BSA), Water-Soluble Polymer (PVP) and Antioxidant (Selenite) in the composition shown in Table 1 below. The medium of Examples 1-1 to 4-3 was prepared by mixing in basic solvent DPBS (Dulbecco's phosphate Buffered Saline).
(V/V%)Hetastarch
(V / V%)
(V/V%)Trehalos
(V / V%)
(V/V%)BSA
(V / V%)
(V/V%)PVP
(V / V%)
(V/V%)Selenite
(V / V%)
시험예 1: 배지의 줄기세포 보존력 평가Test Example 1: Evaluation of the storage capacity of stem cells in the medium
1-1. 줄기세포의 동결보존 및 해동1-1. Freeze preservation and thawing of stem cells
상기 제조예 1-1에서 수득된 태아 유래 줄기세포를 제조예 1-2에서 제조된 실시예의 각 배지에 동결한 뒤, 이를 해동하여 보존 배지의 줄기세포 보존력을 평가하였다.The embryo-derived stem cells obtained in Preparation Example 1-1 were frozen in each medium of the Example prepared in Production Example 1-2, and then thawed to evaluate the stem cell preservation ability of the storage medium.
구체적으로, 배양접시 내의 배지를 제거하고 PBS 로 세척 후 0.05% Typsin-EDTA를 이용하여 태아 유래 양수 줄기세포를 기저면에서 분리시켰다. 이후 새로운 5 % FBS가 포함된 배양액으로 Trypsin-EDTA 의 작용을 중지시키고, 세포 배양 접시에서 분리된 세포를 2.5×106/mL의 농도가 되도록 실시예 1-1 내지 4-3의 동결 배지에 혼합하였다. 동결 배지에 혼합된 세포는 2ml 동결 튜브(NUNC)에 담아 이소프로판올 (isopropanol) 동결 박스를 이용하여 -70℃ 냉동고에 1일 이상 냉동한 후 -196℃ 질소(LN2) 탱크로 옮겨서 보관하였다.Specifically, the medium in the culture dish was removed, washed with PBS, and then, 0.05% Typsin-EDTA was used to separate the embryonic-derived amniotic stem cells from the basal surface. Thereafter, the action of Trypsin-EDTA was stopped with a culture solution containing 5% FBS, and the cells isolated from the cell culture dish were added to the freezing medium of Examples 1-1 to 4-3 to a concentration of 2.5 × 10 6 / mL. Mixed. Cells mixed in the freezing medium were stored in a 2 ml freezing tube (NUNC) and frozen in a -70 ° C freezer for at least 1 day using an isopropanol freeze box, and transferred to and stored in a -196 ° C nitrogen (LN2) tank.
동결 보존된 세포의 생존율 및 배양 양상을 확인하기 위해 동결된 세포를 꺼내어 37℃ 항온 수조에서 빠르게 해동하였다. 2분 이내에서 해동된 세포 동결 현탁액을 확인한 뒤, 각 실시예의 배지를 이용하여 0.1 % 젤라틴으로 코팅된 배양 접시를 통해 38 ℃에서 5 % CO2 환경의 인큐베이터에 넣고 배양하였다.To check the survival rate and culture pattern of the cryopreserved cells, the frozen cells were taken out and thawed rapidly in a 37 ° C. constant temperature water bath. After confirming the thawed cell freeze suspension within 2 minutes, the medium of each example was used to incubate in a 5% CO 2 environment incubator at 38 ° C. through a culture dish coated with 0.1% gelatin.
1-2. 줄기세포의 동결건조 및 재수화(rehydration) 과정1-2. Freeze-drying and rehydration of stem cells
세포 동결 건조 과정 또한 상기 실시예 1-1 내지 4-3의 배지 조성을 통해 만들어진 세포 보존용 배지를 이용하여 태아 유래 줄기세포를 동결 건조한 뒤, 이를 재수화하여 보존 배지를 통한 유효성을 평가 하였다.Cell freeze-drying process In addition, after using the cell preservation medium prepared through the medium composition of Examples 1-1 to 4-3, freeze-drying the fetal-derived stem cells, and rehydrated to evaluate the effectiveness through the preservation medium.
상기의 동결 방법과 마찬가지로, 0.05% Typsin-EDTA를 이용하여 태아 유래 양수 줄기세포를 기저면에서 분리시켰으며 5 % FBS가 포함된 배양액으로 Trypsin-EDTA의 작용을 중지시키고, 세포 배양 접시에서 분리된 세포를 2.5×106/mL의 농도가 되도록 각 실시예의 배지에 혼합하였다. 동결 배지에 혼합된 세포는 2ml 동결 튜브(NUNC)에 담아 이소프로판올 (isopropanol) 동결 박스를 이용하여 -1℃/min 속도로 -20℃ 조건에서 1시간, 그 후 약 -18℃/min 속도로 급속 동결 과정을 거쳐 -196℃ 질소 탱크로 옮겨서 보관하였다.As in the above freezing method, 0.05% Typsin-EDTA was used to separate fetal-derived amniotic stem cells from the basal surface, and the action of Trypsin-EDTA was stopped with a culture solution containing 5% FBS, and the cells separated from the cell culture dish. Was mixed in the medium of each example to a concentration of 2.5 × 10 6 / mL. The cells mixed in the freezing medium are placed in a 2 ml freezing tube (NUNC), and then used at an isopropanol freezing box for 1 hour at -20 ° C at -1 ° C / min, and then rapidly at about -18 ° C / min. After freezing, it was transferred to a nitrogen tank at -196 ° C and stored.
동결 건조 과정은 2일 이상의 동결된 세포를 이용하여 이루어졌으며, 동결건조기 (HyperCOOLTM-HS3110, labogene, South Korea)를 이용하여 건조과정을 수행하였다 동결 건조기의 ice condeser의 온도 범위는 -55℃ 내지 -110℃에서 동결 된 샘플들은 48시간 이내에서 동결 건조된 후 진공상태로 실온 및 -4℃에서 보관 하였다.The freeze drying process was performed using frozen cells for 2 days or more, and the drying process was performed using a freeze dryer (HyperCOOLTM-HS3110, labogene, South Korea). The temperature range of the ice condeser of the freeze dryer was -55 ° C to- Samples frozen at 110 ° C were freeze-dried within 48 hours and stored at room temperature and -4 ° C in vacuum.
세포 재수화 과정은 0.9 % 염화나트륨 (NaCl) 을 녹인 DPBS를 이용하였으며, 동결 건조된 샘플에 재수화 용액을 넣은 후, 각 실시예의 배지를 이용하여 0.1 % 젤라틴으로 코팅된 배양 접시를 통해 38 ℃에서 5 % CO2 환경의 인큐베이터에 넣고 배양하였다.In the cell rehydration process, DPBS in which 0.9% sodium chloride (NaCl) was dissolved was used, and after adding the rehydration solution to the lyophilized sample, the medium of each example was used at a temperature of 38 ° C. through a culture dish coated with 0.1% gelatin. Incubated in a 5% CO 2 environment.
1-3. 줄기세포의 생존율 평가1-3. Evaluation of stem cell viability
상기 시험예 1-1 및 1-2에서 해동 또는 재수화된 줄기세포를 Trypan blue로 염색하고, automatic cell counter LUNAⅡ (Logos, South Korea)를 사용하여 생존한 세포를 측정하였다. 생존하는 세포는 염색이 되지 않는다. 세포 생존율은 하기의 식으로 계산하여 평가하였다. 그 결과를 도 1 내지 도 4에 나타내었다.In Test Examples 1-1 and 1-2, thawed or rehydrated stem cells were stained with Trypan blue, and the surviving cells were measured using an automatic cell counter LUNAII (Logos, South Korea). Surviving cells are not stained. Cell viability was evaluated by calculating by the following equation. The results are shown in FIGS. 1 to 4.
세포 생존율(%) = (동결 또는 건조 직후 살아있는 세포 / 동결 전 살아있는 세포) X 100Cell viability (%) = (live cells immediately after freezing or drying / live cells before freezing)
시험예 2: 줄기세포의 형태 보존 평가Test Example 2: Evaluation of stem cell morphology preservation
상기 시험예 1의 결과에 기반하여, 하기의 표 2와 같은 조성으로 실시예 5의 배지를 제조하고, 동결되거나 동결건조된 줄기세포를 다시 해동하거나 재수화하여 형태가 보존되는지 확인하였다.Based on the results of Test Example 1, the medium of Example 5 was prepared with the composition shown in Table 2 below, and the frozen or lyophilized stem cells were thawed or rehydrated to confirm that the form was preserved.
동결보존 및 동결건조 방법과 해동 및 재수화 방법은 상기 시험예 1과 동일하게 수행하였다.The cryopreservation and lyophilization methods and the thawing and rehydration methods were performed in the same manner as in Test Example 1.
구체적으로, 동결된 줄기세포를 37℃ 항온 수도에서 1 내지 2분 동안 인큐베이션하여 해동하였고, 동결건조된 줄기세포 배양물에 200-400 ㎕ DPBS를 첨가하여 재수화하였다. 상기 해동 및 재수화 과정을 마친 줄기세포 배양물은 원심분리나 세척을 하지 않고 15 v/v% FBS 및 1 w/v% 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 DMEM (Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium) 배지에 첨가하여 38℃, 5% CO2 인큐베이터에 배양하였다. 그 후, 세포 형태의 자세한 관찰을 위해 Diff-quick 염색 하였다.Specifically, the frozen stem cells were thawed by incubation for 1 to 2 minutes in a constant temperature water at 37 ° C., and rehydrated by adding 200-400 μl DPBS to the lyophilized stem cell culture. DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) containing 15 v / v% FBS and 1 w / v% penicillin / streptomycin, without centrifugation or washing, the stem cell culture after completing the thawing and rehydration process It was added to the medium and incubated in a 38 ° C, 5% CO 2 incubator. Then, Diff-quick staining was performed for detailed observation of cell morphology.
Diff-quick 염색은, 배양접시 내의 배지를 제거하고 PBS로 세척 후, 적당량의 Diff-Quik Fixative 용액 10초, Diff-Quik Solution I 용액 5초, Diff-Quik Solution II 용액 5초 처리한다. 각각의 염색 용액은 섞이지 않으며, 마지막 과정 후 정제수로 배양 접시를 세척 해 준 뒤, 건조 후 현미경으로 세포의 형태를 확인하였다.For Diff-quick staining, the medium in the culture dish is removed and washed with PBS, followed by an appropriate amount of Diff-Quik Fixative solution 10 seconds, Diff-Quik Solution I solution 5 seconds, and Diff-Quik Solution II solution 5 seconds. Each dyeing solution does not mix, and after the last process, the culture dish is washed with purified water, and after drying, the shape of the cells is checked under a microscope.
그 결과를 도 5에 나타내었다. 섬유아세포와 같은 방추형으로 바닥에 부착되어 있는 형태를 관찰함으로써, 줄기세포의 외형적 특징을 그대로 유지하고 있음을 확인하였다.The results are shown in FIG. 5. By observing the form attached to the bottom in the form of a spindle like a fibroblast, it was confirmed that the external features of the stem cells were maintained.
시험예 3: 줄기세포의 손상 여부 평가Test Example 3: Evaluation of stem cell damage
동결 건조한 세포의 표면을 자세히 관찰하기 위하여 주사전자 현미경 분석을 실시 하였다. Scanning electron microscopy analysis was performed to closely observe the surface of the lyophilized cells.
시험예 2에서 해동되거나 재수화된 염색 전의 줄기세포 배양물을 2.5 w/v% 파라포름알데히드-글루타르알데히드 (paraformaldehyde-glutaraldehyde)(4℃, 인산 완충액, pH 7.2) 고정액에서 2시간 동안 전고정하고, 완충액(0.1M 인산 완충액, pH 7.2)으로 10분씩 3회 세척한 후, 1% OsO4(25℃, 0.1M 인산 완충액, pH 7.2)에서 2시간 동안 후고정하였다. 고정이 끝난 후, 동일한 완충액으로 수회 세척한 후, 에탄올 농도를 증가시키면서 탈수시켜 이소아밀 아세테이트로 치환하고 임계점 건조기(critical point dryer)(Leica, cpd300)로 건조한 후 현미경 분석 하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.Stem cell culture before staining thawed or rehydrated in Test Example 2 was pre-fixed in 2.5 w / v% paraformaldehyde-glutaraldehyde (4 ° C., phosphate buffer, pH 7.2) fixation solution for 2 hours. After washing with buffer (0.1M phosphate buffer, pH 7.2) three times for 10 minutes, it was post-fixed for 2 hours in 1% OsO 4 (25 ° C, 0.1M phosphate buffer, pH 7.2). After the fixation was completed, after washing with the same buffer several times, dehydration while increasing the ethanol concentration was substituted with isoamyl acetate, dried with a critical point dryer (Leica, cpd300) and analyzed under a microscope. The results are shown in FIG. 6.
Claims (18)
헤타스타치 및 트레할로스;
2 내지 8 w/v%의 폴리비닐피롤리돈; 및
10 내지 80 nM의 셀레늄염을 포함하는, 줄기세포의 동결보존 또는 동결건조용 보조제 조성물.3 to 15 w / v% albumin;
Hetastarch and trehalose;
2 to 8 w / v% polyvinylpyrrolidone; And
An adjuvant composition for cryopreservation or lyophilization of stem cells, comprising 10 to 80 nM of selenium salt.
상기 조성물은 DMEM (Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium), DPBS (Dulbecco's phosphate Buffered Saline), RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 배지, MEM(Minimum Essential Media) 배지, 또는 이의 조합을 더 포함하는 것인,
조성물.According to claim 1,
The composition further comprises DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), DPBS (Dulbecco's phosphate Buffered Saline), RPMI (Roswell Park Memorial Institute) medium, MEM (Minimum Essential Media) medium, or a combination thereof,
Composition.
상기 알부민류는 인간혈청알부민, 소혈청알부민, α-락트알부민, 난알부민 또는 이들의 조합인 것인,
조성물. According to claim 1,
The albumin is human serum albumin, bovine serum albumin, α-lactalbumin, egg albumin or a combination thereof,
Composition.
상기 조성물은 배양배지로 사용가능한 것인,
조성물.According to claim 1,
The composition is to be usable as a culture medium,
Composition.
상기 트레할로스는 0.01 내지 0.5M이고, 상기 헤타스타치는 1 내지 30w/v%인,
조성물.According to claim 1,
The trehalose is 0.01 to 0.5M, the heta starch is 1 to 30w / v%,
Composition.
줄기세포의 동결보존 및 동결건조에 사용하기 위한 세포 보존용인 것인,
조성물.According to claim 1,
It is intended for cell preservation for use in cryopreservation and lyophilization of stem cells.
Composition.
세포치료제.A composition comprising a stem cell and a cryopreservation or lyophilization adjuvant according to claim 1,
Cell therapy.
상기 세포치료제는 동결물 또는 동결건조물인,
세포치료제.The method of claim 15,
The cell therapy product is a frozen material or a lyophilized material,
Cell therapy.
줄기세포 보관 방법.Comprising the step of adding a composition for cryopreservation or lyophilization aid according to claim 1 to the stem cell culture,
How to store stem cells.
상기 줄기세포는 영하의 온도에서 보관되는 것인 방법.The method of claim 17,
The method in which the stem cells are stored at sub-zero temperatures.
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