KR102099684B1

KR102099684B1 - 항암제에 대한 감수성 예측용 바이오 마커 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102099684B1
Application number: KR1020170057464A
Authority: KR
Inventors: 박도윤; 권채화; 박혜지; 원여진; 최유리
Original assignee: 부산대학교 산학협력단; 부산대학교병원
Priority date: 2017-05-08
Filing date: 2017-05-08
Publication date: 2020-04-10
Also published as: KR20180123360A

Abstract

본 발명은 항암제에 대한 감수성 예측용 바이오 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는, MAP3K10(Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase Kinase 10)의 돌연변이(Mutant)를 포함하는 항암제에 대한 감수성(susceptibility) 예측용 바이오 마커 조성물, MAP3K10 유전자의 돌연변이를 검출하는 제제를 포함하는 항암제에 대한 감수성 예측용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 항암제에 대한 감수성 예측용 키트; 및 항암제에 대한 감수성 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 항암제에 대한 감수성 예측 및 예측 효과가 우수하므로, 본 발명은 암 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

항암제에 대한 감수성 예측용 바이오 마커 및 이의 용도{Novel Biomarkers for Predicting Susceptibility to Anti-Cancer Drug and Uses Thereof}

본 발명은 항암제에 대한 감수성 예측용 바이오 마커 및 이의 용도에 관한 것이다.

위암은 우리나라에서 발생 빈도 1 위, 사망률은 폐암에 이어 2 위를 차지하지만 미국, 유럽 등의 서구에서는 발생률이 낮은 암이다. 오늘날 위암치료법으로 내시경으로 암 병변만 절제하는 내시경 점막절제술, 복강경을 이용한 복강경적 위절제술, 항암화학요법, 면역요법 등이 발전하여 위암 재발률을 줄여 환자의 생존율을 증가시키고 있다.

그러나, 수술은 초기 단계의 암에만 적용이 가능한 경우가 많아 대다수의 암 환자들은 생존기간 연장과 삶의 질 향상에 도움을 주는 항암화학요법을 사용하여 치료한다.

항암화학요법은 선행화학요법 (수술 전에 시행하는 경우), 보조 항암화학요법(수술 후 재발 방지)으로 나뉘는데 이 항암화학요법을 장기적으로 사용 할 경우 항암제 내성을 일으킬 가능성이 있으며 또한 이러한 사례가 여러 차례 보고가 되고 있다. 항암제의 내성 획득과정은 두 가지로 나뉘는데 첫째는 항암제가 암세포에 도달하지 못했을 경우이다. 즉, 환자의 신체내에서 항암제의 흡수, 재사, 약물 이동에 이상이 발생되는 경우이며. 두 번째는 암세포 자체의 유전적 또는 후생유전적변화로, 약제 내성을 보이는 암세포로의 과성장과 빠른 내성 획득이다.

처음에는 항암화학요법이 효과적이었으나 장기적인 항암제 사용으로 인해 점차 유전자 변이가 생겨 다른 변칙적인 경로로 세포 증식, 세포내부에 항암제 흡수방해와 능동적 배출, 손상된 암 세포 DNA의 복구, 세포사멸(Apoptosis)에 대한 저항성 획득 등이 발생하여 환자들의 치료가 어려워지는 동시에 암세포가 다른 장기에 전이가 되어 항암화학요법이 실패하여 환자들의 생명에 위험을 준다. 그 예로 Cisplatin으로 치료한 방광암 환자가 Cisplatin에 더 이상 반응하지 않아 확인해보니 유전자 변이가 발생하여 세포증식 및 세포사멸과 관련된 p-AKT가 활성화되어 세포증식은 증가되지만 세포사멸(Apoptosis)은 감소되어 유전자 변이가 일어나지 않은 환자들보다 생존율이 감소됨이 보고되어 있다. 이러한 항암제 내성으로 인한 암세포의 유전자변이에 대한 연구들이 진행 중이나 아직도 잘 정립되지 않았다. 그러므로 이 문제를 해결하는 것이 현재 암 치료의 당면한 주요 문제이다.

즉, 일반적으로 항암 요법에서, 항암제를 투여하였을 때의 생체의 반응성은 약제의 표적이 되는 암세포의 이 약제에 대한 감수성에 크게 의존한다. 이러한 암세포의 약제에 대한 감수성은, 암세포마다 크게 상이하다. 이러한 감수성의 차이는, 이 약제의 표적 분자 또는 이에 관련하는 인자의 양적 또는 질적 차이, 또는 약제 내성의 획득 등에 기인한다. 이러한 배경을 근거로, 표적이 되는 암세포가 약제에 대하여 감수성을 나타낼 경우에 특이적으로 나타나는 암세포의 유전적 변화를 확인할 수 있다면, 조기에 약제의 효과 판정, 치료법의 확립, 새로운 치료법의 선택 등이 가능해져 대단히 유익하다.

또한, 치료에 앞서 생체 조직편 등에 의해 취득된 암 조직에서, 통상의 방법에 따라 암세포를 분리한 후 약제 처리를 실시하여, 이 암세포가 약제 감수성인지 여부를 상기 변화에 의해 측정하면, 이 약제에 의한 치료가 유효한지 여부를 미리 예측할 수 있기 때문에 임상적으로 매우 유용하다.

상술한 바와 같이 항암제는 내성과 독성에 관해서 개인차가 크며 동일한 환자에서도 약 반수이상에서 내성을 보이는 문제가 있으므로 적합한 치료반응성 표식자를 이용한 선별은 항암제 치료의 획기적인 진보를 초래할 수 있다. 이에, 특정 유전자에 따른 개별 항암제의 치료반응성에 관한 연구가 최근 지속적으로 활발하게 전개되고 있다.

그러나 특정약제에 대한 생체반응 관련요소의 복합적 작용, 치료제 및 투여방식의 다양성과 방대한 시료확보의 어려움으로 아직 괄목할 만한 성과가 미약한 현실이다.

이러한 상황 하에서, 본 발명자들은 특정 항암제에 대한 감수성을 예측할 수 있는 바이오 마커를 개발하기 위하여 예의 노력하였다. 그 결과, 위암 재발 환자군에서의 감수성을 예측하는 바이오 마커로서 MAP3K10의 돌연변이를 분석하였고, 위암 세포에서 돌연변이의 발현 양상에 따라 특정 항암제에 대한 감수성으로 인해 암세포의 크기 및 무게 감소 정도가 상이한 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 항암제에 대한 감수성(susceptibility) 예측용 바이오 마커 조성물, 항암제에 대한 감수성 예측용 조성물, 키트 및 항암제에 대한 감수성 예측을 위한 정보제공 방법을 제공하는 데 있다.

이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 MAP3K10(Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase Kinase 10)의 돌연변이(Mutant)를 포함하는 항암제에 대한 감수성(susceptibility) 예측용 바이오 마커 조성물을 제공한다.

본 발명의 가장 큰 특징은 MAP3K10 유전자(GenBank numb. NM_002446.3) 또는 단백질(GenBank numb. NP_002437.2)의 돌연변이를 바이오 마커로 이용하여, 획득한 시료 내 상기 바이오 마커의 존재 여부를 확인함으로써 항암제에 대한 감수성을 예측하는 것이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 '바이오 마커'는 '정상적인 생물학적 과정, 질병 진행 상황, 및 치료방법에 대한 약물의 반응성을 객관적으로 측정하고 평가할 수 있는 지표'로 정의할 수 있다. 최근 유전자 분석기술의 발달로 특정 유전자의 변이와 특정 질병 사이의 관련성에 대한 연구가 증가하면서 바이오 마커는 유전자와 유전적 변이, 그로 인한 RNA, 단백질, 대사물질 발현의 차이를 모두 아우르는 분자적, 생물학적 지표로 재(再)정의되고 있다

본 발명의 바이오 마커는 항암제에 대한 감수성의 지표가 될 수 있으며, 항암제에 대한 감수성 마커로서의 정확성 및 신뢰도도 탁월하므로 암의 발생, 발전 및/또는 전이의 치료에 이용될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "감수성"은 개개의 환자의 암에 대하여 특정약물이 효과를 나타내는 지 여부를 의미한다.

예컨대, 상기 특정약물은 주로 항암제이며, 이들 항암제에는 암의 종류에 따라 효과를 나타내는 경우와 효과를 나타내지 않는 경우가 있다. 또한, 유효한 것으로 인정되고 있는 종류의 암이어도, 개개의 환자에 따라 효과를 나타내는 경우와 효과를 나타내지 않는 경우가 있는 것이 알려져 있다. 이와 같은 개개의 환자의 암에 대해 항암제가 효과를 나타내는 지 여부를 항암제 감수성이라고 한다. 따라서, 본 발명에 따라 치료 개시 전에 효과를 기대할 수 있는 환자(반응자)와, 효과를 기대할 수 없는 환자(무반응자)를 예측할 수 있으면, 유효성과 안전성이 높은 화학 요법이 실현될 수 있다.

본 발명에서 상기 감수성과 관련하여, 약제(예컨대, 항암제)에 대하여 효과가 나타나지 않는 경우 내성 또는 저항성으로 표현할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "예측"은 본원에서 대상 환자가 약물 또는 약물 세트에 대해 유리하게 또는 불리하게 반응할 가능성을 지칭하는데 사용된다. 한 실시양태에서, 예측은 이러한 반응의 정도에 관한 것이다. 예컨대, 예측은 환자가 처치 후, 예를 들어 특정한 치료제의 처치 및/또는 원발성 종양의 수술적 제거 및/또는 특정 기간 동안의 화학요법 후에 암 재발 없이 생존할 지의 여부 및/또는 그러할 확률에 관한 것이다.

본 발명의 예측은 암, 특히 위암 환자에 대한 가장 적절한 치료 방식을 선택함으로써 치료를 결정하는데 임상적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 예측은 환자가 치료 처치, 예컨대 주어진 치료적 처치, 예를 들어 주어진 치료제 또는 조합물의 투여, 수술적 개입, 화학요법 등에 유리하게 반응할 것인지 또는 치료적 처치 후에 환자의 장기 생존이 가능한 지의 여부를 예측하는데 있어서 유용한 도구이다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "돌연변이(mutant)"는 해당 유전자의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 염기 치환, 결실, 삽입, 증폭 및 재배열된 것을 포함한다. 뉴클레오티드 변이는 참조 서열(예를 들어, 야생형 서열)에 대한 뉴클레오티드 서열의 변화(예를 들어, 1개 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 역위 또는 치환, 예컨대 단일 뉴클레오티드다형성 (SNP))를 지칭한다. 이 용어는 또한 달리 나타내지 않는다면, 뉴클레오티드 서열의 보체에서의 상응하는 변화도 포함한다. 뉴클레오티드 변이는 체세포 돌연변이 또는 배선 다형성일 수 있다.

또한, 아미노산 변이는 참조 서열(예를 들어, 야생형 서열)에 비해 아미노산 서열의 변화 (예를 들어, 1개 이상의 아미노산의 삽입, 치환 또는 결실, 예컨대 내부 결실 또는 N- 또는 C-말단의 말단절단(truncation))를 지칭한다.

본 발명의 돌연변이는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 내의 1 개의 뉴클레오티드가 치환, 결실 또는 삽입된 점 돌연변이이며, 바람직하게는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 내의 1 개의 뉴클레오티드가 치환된 점 돌연변이이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 돌연변이는 서열번호 1에 기재된 정상형 MAP3K10 유전자의 910 번째 염기인 시토신(Cytosine)이 티민(Thymine)으로 치환(substitution); 632 번째 염기인 아데닌(Adenine)이 구아닌(Guanine)으로 치환; 및 89 번째 염기인 시토신(Cytosine)이 아데닌(Adenine)으로 치환되는 경우로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 경우이다.

또한, 본 발명의 돌연변이는 서열번호 2의 폴리펩타이드 내의 아미노산이 치환, 결실 또는 삽입된 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 돌연변이는 서열번호 2에 기재된 정상형 MAP3K10 단백질의 304 번째 아미노산인 아르기닌(arginine)이 시스테인(cysteine)으로 치환된 MAP3K10^Arg304Cys, 211 번째 아미노산인 히스티딘(histidine)이 아르기닌(arginine)으로 치환된 MAP3K10^His211Arg 및 30 번째 아미노산인 알라닌(alanine)이 글루탐산(glutamic acid)으로 치환된 MAP3K10^Ala30Glu로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 경우이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 항암제는 5-플루오로우라실 (5-Fluorouracil, 5-FU); 시스플라틴 (cisplatin); 아바렐릭스 (abarelix); 알데스류킨 (aldesleukin); 아자시티딘 (azacitidine); 베바쿠지맙 (bevacuzimab); 세툭시맙 (cetuximab); 게피티닙 (gefitinib); 겜시타빈 (gemcitabine); 파클리탁셀 (paclitaxel); 및 타목시펜 (tamoxifen)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상이며, 가장 바람직하게는 5-플루오로우라실 [5-Fluorouracil, 5-FU (Adrucil)] 또는 시스플라틴 [cisplatin (Platinol)이다.

본 발명에서, 상기 항암제는 위암(gastric cancer), 유방암(breast cancer), 대장암(colon cancer), 폐암(lung cancer), 간암(liver cancer), 혈액암(blood cancer), 뼈암(bone cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 피부암(skin cancer), 머리 또는 목암(head or neck cancer), 피부 또는 안구 흑색종(cutaneous or intraocular melanoma), 자궁육종(uterine sarcoma), 난소암(ovarian cancer), 직장암(rectal cancer), 항문암(anal cancer), 난관암(fallopian tube carcinoma), 자궁내막암(endometrial carcinoma), 자궁경부암(cervical cancer), 소장암(small intestine cancer), 내분비암(endocrine cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 부갑상선암(parathyroid cancer), 신장암(adrenal cancer), 연조직종양(soft tissue tumor), 요도암(urethral cancer), 전립선암(prostate cancer), 기관지암(bronchogenic cancer) 및 골수암(bone marrow tumor)으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 암에 대한 치료제이며, 가장 바람직하게는 위암이다.

또한, 상기 용어 암은, "종양" 또는 "악성"과 혼용되며, 일반적으로 비조절된 세포 성장의 특징을 갖는 포유동물의 생리학적 상태를 나타내거나 설명한다.

본 발명에서, 상기 암은 진행성(progression), 재발성(Recurrence) 및 전이성(metastasis)으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 가장 바람직하게는 재발성 암이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 MAP3K10(Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase Kinase 10)의 돌연변이(Mutant)를 검출하는 제제를 포함하는, 항암제에 대한 감수성 예측용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, 본 명세서에서 사용되는 표현 " MAP3K10의 돌연변이(Mutant)의 검출"은 해당 시료 내에서 검출하고자 하는 타겟으로서 돌연변이를 검출하는 것을 의미한다. 본 발명에서는, 그 검출하고자 하는 타겟은 시료 내 해당 유전자의 돌연변이의 DNA(또는 mRNA) 및/또는 단백질이다.

즉, 유전자 돌연변이의 산물인 DNA 또는 유전자 산물인 단백질을 검출함으로써 상기 유전자의 발현 여부를 확인할 수 있다.

상기 검출은 통상적으로는 시료부터 DNA 또는 단백질을 추출하여, 추출물 중의 DNA 또는 단백질의 특정 부분을 검출함으로써 실시할 수 있다. 이러한 DNA 또는 단백질의 검출은 면역분석학적 방법, 하이브리드화 반응 및 증폭반응에 의해 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 공지된 다양한 기술을 이용하여 용이하게 실시될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 돌연변이(Mutant)를 검출하는 제제는 상기 돌연변이(Mutant) 부위에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍, 프로브, 항체, 펩타이드 또는 뉴클레오티드를 포함한다.

상기 검출 제제는 상기 돌연변이 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍, 프로브 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다. 즉, 핵산의 검출은 유전자를 암호화하는 핵산 분자 또는 상기 핵산 분자의 상보물에 하이브리드화되는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 증폭반응에 의해 수행될 수 있다.

예컨대, 프라이머를 이용한 핵산의 검출은 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 유전자 서열을 증폭한 다음 당 분야에 공지된 방법으로 유전자의 증폭 여부를 확인함으로써 수행될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 프라이머 쌍은 서열번호 9로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 10로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 쌍; 서열번호 11로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 12로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 쌍; 및 서열번호 13로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 14로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 쌍;으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또한, 상기 검출 제제는 상기 돌연변이의 아미노산 부위에 대하여 특이적으로 결합하는 항체일 수 있고, 다클론 항체, 단클론 항체, 재조합 항체 및 이들의 조합을 모두 포함한다.

상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체, 재조합 항체 및 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 및 항체 분자의 기능적인 단편, 예를 들어, Fab, F(ab'), F(ab')2및 Fv를 모두 포함한다. 항체 생산은 본 발명이 속하는 분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있고, 제조되어 상업적으로 판매되는 항체를 이용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 상술한 돌연변이의 존재 또는 발현 여부를 측정하는 제제뿐만 아니라, 항원-항체 복합체의 형성을 정량 또는 정성적으로 측정 가능하게 하는 라벨, 면역학적 분석에 사용되는 통상적인 도구, 시약 등을 더 포함할 수 있다.

항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정 가능하게 하는 라벨에는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 산화환원 분자 및 방사선 동위원소 등이 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈옥시다제와루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트카복실라제, 아스파르테이트아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 산화환원 분자에는 페로센, 루테늄착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K₄ W(CN)⁸, [Os(bpy)₃]²⁺, [RU(bpy)₃]²⁺, [MO(CN)₈]^4-등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³1I, ¹⁸⁶Re 등이 있으며 이로 제한되지 않는다.

상기 도구 또는 시약의 일 예로, 적합한 담체, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 표지물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 담체는가용성 담체, 불용성 담체가 있고, 가용성 담체의 일 예로 당 분야에서 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS가 있고, 불용성 담체의 일 예로 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.

본 발명의 조성물은 상술한 바이오 마커로서 돌연변이를 포함하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 항암제에 대한 감수성 예측용 키트를 제공한다.

상기 키트에는 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제뿐만 아니라, 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함될 수 있다.

상기 도구 또는 시약의 일 예로, 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 발색단(chromophores), 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 표지물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 담체는 가용성 담체, 불용성 담체가 있고, 가용성 담체의 일 예로 당 분야에서 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS가 있고, 불용성 담체의 일 예로 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.

본 발명의 키트는 상술한 바이오 마커로서 돌연변이를 구성으로 포함하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 대상으로부터 수득된 생물학적 시료 내 MAP3K10(Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase Kinase 10)의 돌연변이(Mutant)를 검출하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 검출 결과에 기초하여 상기 대상의 항암제에 대한 감수성을 예측하는 단계;를 포함하는 항암제에 대한 감수성(susceptibility) 예측을 위한 정보제공 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 (a) 단계의 상기 돌연변이의 존재(또는 발현)가 확인(또는 검출)된 경우, 상기 대상은 항암제에 대한 감수성(내성)이 있는 것으로 판정한다.

본 발명의 예측 방법은, 대상 암 재발 환자로부터 생물학적 시료를 획득하고, 상기 시료 내에서 상술한 유전자 또는 이의 단백질의 돌연변이로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1개 또는 복수개의 존재를 검출한 후, 해당 발현(존재)이 확인되면, 당해 시료가 항암제에 대하여 감수성(내성)이 있다라고 판정하는 공정을 포함하여 이루어진다.

즉, 본 발명의 예측 방법은 시료 내에서의 특정 돌연변이의 존재 여부를 암세포의 항암제에 대한 감수성의 지표로 하는 점을 특징으로 한다.

본 발명에서 상기 돌연변이의 존재 및 발현은 상술한 바와 같이 항암제에 대한 감수성에 영향을 미칠 수 있다.

상기 돌연변이의 검출은 당업계에 널리 공지되어 있는 기술을 이용하여 표적 분자 클로닝 및 서열 분석에 의해 수행될 수 있다. 예컨대, DNA 서열분석; 대립유전자-특이적 뉴클레오티드 혼입 검정 및 대립유전자-특이적 프라이머 연장 검정 (예를 들어, 대립유전자-특이적 PCR, 대립유전자-특이적 라이게이션 연쇄 반응 (LCR) 및 갭-LCR)을 비롯한 프라이머 연장 검정; 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 혼성화 검정 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드라이게이션검정); 절단제로부터의 보호를 이용하여 핵산 이중나선 내의 미스매치된 염기를 검출하는 절단 보호 검정; MutS단백질 결합 분석; 변이체 및 야생형 핵산 분자의 이동성을 비교하는 전기영동 분석; 변성-구배 겔 전기영동(DGGE, 예를 들어 문헌 [Myers et al. (1985) Nature 313:495]에서와 같음); 미스매치된 염기 쌍에서의 RNase절단의 분석; 헤테로 이중나선 DNA의 화학적 또는 효소적 절단의 분석; 질량 분광측정법 (예를 들어, MALDITOF); 유전적 비트 분석 (GBA); 5' 뉴클레아제 검정 (예를 들어, 택맨(TaqMan); 및 분자 비콘을 사용하는 검정을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "생물학적 시료"란 본 발명의 바이오 마커의 발현이 검출될 수 있는 개체로부터 얻어지는 모든 시료를 의미한다.

상기 생물학적 시료는 타액(saliva), 생검(biopsy), 혈액, 피부 조직, 액체 배양물, 분변 및 소변으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며, 특별히 이에 제한되지 않고, 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법으로 처리하여 준비될 수 있다.

본 발명의 방법은 상술한 바이오 마커인 돌연변이를 이용하여 감수성이 있는 것으로 판정하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 항암제에 대한 감수성 예측용 바이오 마커로서 돌연변이를 이용하면, 개개의 환자의 상기 감수성을 치료 개시 전에 확실하게 판정할 수 있어, 치료 효과가 높은 항암제의 선택이 가능해진다. 또한, 효과가 얻어지지 않는 항암제의 사용을 회피할 수 있기 때문에 불필요한 부작용을 회피할 수 있다.

도 1은 MAP3K10 플라스미드 벡터맵을 보여준다.
도 2는 WES(Whole Exome Sequencing) 결과를 보여준다.
도 3은 MAP3K10^Arg304Cys이 야생형 MAP3K10의 코돈 304 부위의 시토신(C, Cytosine)이 티민(T, Thymine)으로 치환된 것임을 보여준다.
도 4는 MAP3K10^His211Arg이 야생형 MAP3K10의 코돈 211 부위의 아데닌(A, Adenine)이 구아닌(G, Guanine)으로 치환된 것임을 보여준다.
도 5는 MAP3K10^Ala30Glu이 야생형 MAP3K10의 코돈 30 부위의 시토신(C, Cytosine)이 아데닌(A, Adenine)으로 치환된 것임을 보여준다.
도 6은 위암세포주(MKN-28, MKN-45, SNU-484, AGS)에서의 야생형 MAP3K10과 MAP3K10 돌연변이(MAP3K10^Arg304Cys, MAP3K10^His211Arg 및 MAP3K10^Ala30Glu)의 5-FU(500 μM)에 대한 저항성을 측정한 결과를 보여준다.
도 7은 위암세포주(MKN-28, MKN-45, SNU-484, AGS)에서의 야생형 MAP3K10과 MAP3K10 돌연변이(MAP3K10^Arg304Cys, MAP3K10^His211Arg 및 MAP3K10^Ala30Glu)의 시스플라틴(50 μM)에 대한 저항성을 측정한 결과를 보여준다.
도 8은 위암세포주(MKN-28, MKN-45, SNU-484, AGS)에서의 야생형 MAP3K10과 MAP3K10 돌연변이(MAP3K10^Arg304Cys, MAP3K10^His211Arg, MAP3K10^Ala30Glu)의 5-FU(1000 μM)에 대한 세포사멸 정도를 측정한 결과를 보여준다.
도 9는 위암세포주(MKN-28, MKN-45, SNU-484, AGS)에서의 야생형 MAP3K10과 MAP3K10 돌연변이(MAP3K10^Arg304Cys, MAP3K10^His211Arg, MAP3K10^Ala30Glu)의 시스플라틴(100 μM)에 대한 세포사멸 정도를 측정한 결과를 보여준다.
도 10은 위암세포주(MKN-28, MKN-45, SNU-484, AGS)에서의 야생형 MAP3K10과 MAP3K10 돌연변이(MAP3K10^Arg304Cys, MAP3K10^His211Arg, MAP3K10^Ala30Glu)의 항생제 처리(5-FU; 500 μM, Cisplatin; 50 μM) 후 웨스턴 블롯팅 결과를 보여준다. (레인 1; Empty vector, 레인 2; MAP3K10^WT, 레인 3; MAP3K10^Arg304Cys, 4 레인; MAP3K10^His211Arg, 5 레인; MAP3K10^Ala30Glu)

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실험방법 및 조건

1. WES (Whole Exome Sequencing)

항암보조치료 후 위암이 재발하지 않은 환자 그룹과 위암이 재발한 환자 그룹의 위암 조직을 환자 동의 하에 얻어 Life Technology사의 Ion Proton^TM System을 이용하여 Mutation gene을 확인할 수 있는 WES(Whole Exome Sequencing)을 실시하였다.

2. Mutagenic Plasmid Vector 제작

2.1. Plasmid Vector 구입

인간 위암 세포(Human gastric cancer cell)에서 돌연변이(Mutation)된 MAP3K10 유전자를 단백질로 발현시키기 위해 발현 플라스미드 벡터(Expression plasmid vector)인 pCMV6-Entry(Origene, RC218669)을 구입하였다.

2.2. 점돌연변이(Point Mutation) 부분이 포함된 프라이머 디자인 및 PCR 증폭과정

돌연변이화된 플라스미드 벡터(Mutagenic plasmid vector)의 제작을 위해, Quickchange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Aglient, #200522)의 방법을 참고하여 점 돌연변이 염기 부분이 포함된 돌연변이 프라이머(Mutagenic primer, 표 1)를 이용하고, MAP3K10 플라스미드 벡터 DNA를 주형으로 하여 PCR(Polymerase Chain Reaction)(조성; 표 2, 및 조건; 표 3)을 실시하였다.

유전자	아미노산 변화(Amino Acid Change)	프라이머	서열(5'-3')
MAP3K10	p.Arg304Cys	F	GAGGTCCCCTACTGTGAGATCGACGCC(서열번호 3)
	p.Arg304Cys	R	GGCGTCGATCTCACAGTAGGGGACCTC(서열번호 4)
	p.His211Arg	F	CGGGGCATGAACTACCTACGCAATGATGCCCCTGTGCCC(서열번호 5)
	p.His211Arg	R	GGGCACAGGGGCATCATTGCGTAGGTAGTTCATGCCCCG(서열번호 6)
	p.Ala30Glu	F	GTGTTCGACTACGAGGCGGAGGGCGACGAGGAGCTGACC(서열번호 7)
	p.Ala30Glu	R	GGTCAGCTCCTCGTCGCCCTCCGCCTCGTAGTCGAACAC(서열번호 8)

밑줄 친 염기는 치환변이된 염기이다.

PCR 조성

5 ㎕ 10X 반응 버퍼

10 ng dsDNA 주형 (MAP3K10 플라스미드 벡터 DNA)

125 ng 올리고뉴클레오티드 정방향 프라이머(Oligonucleotide Forward Primer)

125 ng 올리고뉴클레오티드 역방향 프라이머 (Oligonucleotide Reverse Primer)

1 ㎕ dNTP Mix

3 ㎕ QuikSolution

ddH2O로 총 부피 50 ㎕

1 ㎕ pfuUltra HF DNA Polymerase (2.5 U/㎕) 첨가

세그먼트(Segment)	사이클	온도	시간
1	1	95℃	1 분
2	18	95℃	50 초
		60℃	50 초
		68℃	1 분/kb 플라스미드 길이(plasmid length)
3	1	68℃	7 분

2.3. 절단(Digestion) 및 형질전환

Parental supercoiled dsDNA를 제거하기 위해, PCR로 증폭된 반응물에 1 ㎕ 의 Dpn I Restriction enzyme (10 U/㎕) (Aglient, #20522)을 첨가하여 1 시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 그 후 Digestion 반응을 통해 얻은 Mutagenic supercoiled dsDNA (2 ㎕)와 XL10-Gold Ultracompetent Cells (45 ㎕) (Aglient Technologies, #20522)을 pipeting으로 잘 섞어준 후 얼음에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 이 후 42℃ 수욕상에서 Heat shock(30 sec)을 가하고 바로 이어서 얼음에서 2 분 동안 인큐베이션하였다. 그 후 항생제가 들어있지 않은 LB 액체배지(500 ㎕)를 첨가한 후 진탕기(shaking incubator, 230 rpm, 37℃)에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후 미리 37℃로 데워놓은 Kanamycin 함유 (25 ㎍/㎖) LB 고체 배지에 blue-white screening을 위해 X-gal을 도말하였다. 그 후 오염되지 않도록 조심히 고체 배지에 spreading하여 37℃ 인큐베이터에서 밤새 배양하였다. 이후, 흰색의 콜로니(colony)만을 취해 하기 실시예에 이용하였다.

2.4. 액상 배양(Liquid Culture)

50 ㎖ 튜브에 LB 액체 배지 10 ㎖와 Kanamycin (25 ㎍/㎖)을 넣고 화염 멸균한 흰색 팁을 이용하여 흰색 콜로니만을 한 개씩 취해, 상기 튜브에 넣어준 후 진탕기 (230rpm, 37℃)에서 밤새 인큐베이션시켜 E. coli가 충분히 자랄 수 있도록 하였다.

2.5. 플라스미드 DNA 추출(Mini Prep)

충분히 자란 E. coli로부터 복제된 플라스미드 DNA를 얻기 위해, mini prep을 실시하였다.

이 과정은 LaboPass^TM plasmid mini kit (Cosmogenetech, Cat No. CMP0112)를 사용하여 공지된 방법에 따라 실시하였다.

2.6. 시퀀싱(Sequencing)

Mini prep을 통해 얻은 플라스미드 DNA가 목표로 한 Mutagenic Plasmid Vector로 제작이 되었는지 확인하기 위해, 시퀀스 분석을 실시하였으며, 이를 분석을 하기 위해 시퀀싱 프라이머(sequencing primer)(표 4)를 제작하였다.

돌연변이화된 유전자(Mutagenic gene)	프라이머	서열 5'-3'
MAP3K10^Arg304Cys	F	CTCCCTCTTCTCCAAAAGCA(서열번호 9)
MAP3K10^Arg304Cys	R	AAGCCGCTTCAAGATGCTAC(서열번호 10)
MAP3K10^His211Arg	F	CCCCACACCTCTGCCTAGT(서열번호 11)
MAP3K10^His211Arg	R	GTCTGCGAGGTTGTGGTTCT(서열번호 12)
MAP3K10^Ala30Glu	F	GACCGCGGTGTTCGACTA(서열번호 13)
MAP3K10^Ala30Glu	R	ACGTAGTTGCTGGGGAAGAC(서열번호 14)

3. In Vitro 상에서 돌연변이화된 유전자( Mutagenic Gene)의 존재가 항암제 감수성에 미치는 영향 검증

3.1. 세포 배양 및 재료

FBS (Fetal Bonvine Serum, Gibco by Life technology, Cat No. 10099-141)와 penicillin/streptomycin (Gibco by Life technology, Cat No. 15140-122)가 함유된 RPMI-1640 (Gibco by Life technology, Cat No. 11875-093)을 사용하였다. Transfection reagent는 Lipofectamine^TM 3000 (Invitrogen, Cat No. L3000150)을 사용하였다.

본 실시예에 사용된 인간 위암 세포주(Human gastric cancer cell line)인 MKN-28 (KCLB, No. 80102), MKN-45 (KCLB, No. 80103), SNU-484 (KCLB, No. 00484), AGS (KCLB, No. 21739) 세포주들은 불활성화된 10% FBS와 1%의 penicillin/streptomycin를 첨가한 RPMI-1640 배지로 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하며 2-3일에 한 번씩 계대하였다.

또한, 돌연변이가 발생된 유전자(Mutagenic gene)와 항암제 감수성과의 관련성을 In Vitro 상에서 확인하기 위해, 항암제는 5-FU(5-fluorouracil) (SIGMA, Cat No.F6627), 시스플라틴(Cisplatin, Cis-platium (II) diamine dichloride)(Cisplatin, SIGMA, Cat No. P4394)을 구입하여 사용하였다.

3.2. 세포 생존율 측정

먼저 인간 위암 세포주는 10% FBS와 1% penicillin/streptomycin이 포함된 RPMI-1640 배지에서 유지한 후, 24-웰 멀티디쉬(Thermo Scientific, Cat No. 142475)에 2.5x10⁴ 세포/웰이 되도록 넣고, 5% CO₂ 인큐베이터(37℃)에서 24 시간 동안 부착시켰다. 부착된 인간 위암 세포주에서 상층액을 제거시킨 후 각 웰 당 OPTI-MEM (Gibco by Life Technology, Cat No. 31985-070) 300 ㎕ 씩 넣어주었다. 각 웰 당 들어가는 DNA의 양은 3 ㎍으로 총 부피가 100 ㎕가 되게끔 OPTI-MEM을 넣어주었다. 형질전환(Transfection)은 Lipofectamine^TM 3000을 사용하여 공지된 방법에 따라 48 시간 인큐베이션(5% CO₂, 37℃)하였다. 그 후에 상층액을 제거하여 일정한 농도로 희석된 항암제(5-FU, Cisplatin)들을 첨가하여 CO₂ 인큐베이터(37℃)에서 24시간 배양시킨 후 생육된 세포의 수는 MTT 방법으로 측정하였다.

또한, 세포 생존율은 항암제들이 함유되지 않은 대조군의 인간 위암 세포주의 생육과 비교하여 세포의 생존율(%)을 다음과 같이 산출하였다.

세포 생존율(Cell Viability)(%) = (시료₅₇₀/대조군₅₇₀) x 100

3.3. 세포자멸사( Apoptosis )

인간 위암 세포주인 MKN-28, MKN-45, SNU-484, AGS를 6-웰 멀티디쉬에 1.5x10⁵ 세포/웰이 되도록 넣고, 5% CO₂ 인큐베이터(37℃)에서 24 시간동안 부착시켰다.

부착된 인간 위암 세포주에서 상층액을 제거시킨 후 한 웰 당 OPTI-MEM 800 ㎕ 씩 넣어주었다. 각 웰 당 들어가는 DNA의 양은 3 ㎍으로 총 부피 200 ㎕가 되게끔 OPTI-MEM을 넣어주었다. 형질전환(Transfection)은 Lipofectamine^TM 3000을 사용하여 공지된 방법에 따라 48시간 인큐베이션(5% CO₂, 37℃)하였다. 그 후에 상층액을 제거하고 일정한 농도로 희석된 항암제 (5FU, Cisplatin)들을 첨가하여 CO₂ 인큐베이터(37℃)에서 24 시간 배양시킨 후 DPBS(Gibco, Cat No. 14190-144)로 한번 세척하여 Annexin V Apoptosis Detection Kit FITC (Affymetrix eBioscience, Cat No. 88-8005-74)를 사용하여 공지된 방법대로 실험을 실시하였다.

3.4. 웨스턴 블롯팅 (Western Blotting)

본 발명에서 제작한 Mutagenic plasmid vector가 도입된 인간 위암 세포주에서 어떤 경로를 통해 야생형인 MAP3K10^WT에 비해 세포 생존율(%)이 증가되는지 확인하기 위해, 인간 위암 세포주인 MKN-28, MKN-45, SNU-484, AGS를 6-웰 멀티디쉬(Thermo Scientific, Cat No. 140675)에 1.5x10⁵ 세포/웰이 되도록 넣고, 5% CO₂인큐베이터(37℃)에서 24 시간 동안 부착시켰다. 부착된 인간 위암 세포주에서 상층액을 제거시킨 후 각 웰 당 OPTI-MEM 800 ㎕씩 넣어주었다. 각 웰 당 들어가는 DNA의 양은 3 ㎍으로 총 부피 200 ㎕ 가 되게끔 OPTI-MEM을 넣어주었다. 형질전환(Transfection)은 Lipofectamine^TM3000을 사용하여 공지된 방법에 따라 48시간 인큐베이션(5% CO₂, 37℃)하였다. 그 후에 상층액을 제거하여 일정한 농도로 희석된 항암제(5FU, Cisplatin)들을 첨가하여 CO₂ 인큐베이터(37℃)에서 24시간 배양시킨 후 세포들을 수집하였다. 세포 펠렛은 1mM PMSF가 포함된 1X lysis buffer (Cell Signaling, #9803)로 용해하였으며 그 후 원심분리(4℃ 15,000 rpm, 15 min)하여 상층액만을 취했으며 단백질은 BCA 어세이로 정량하였다. Running buffer (Tris base 25 mM, Glycine 192 mM, 0.1% SDS)로 100V에서 running을 하였으며 Trans buffer (Tris base 25 mM, Glycine 192 mM, 20% Methanol)로 100V에서 90분 동안 트랜스퍼하였다. 1X TTBS buffer(10% Triton X-100) 에 5% skim milk (BD, Cat No. 232100)를 녹인 후, 상온에서 한 시간 동안 블록킹시켰다. 1 차 항체로서 MAP3K10 (Abcam, Cat No. ab172873), p-MEK1/2 (phospho-MEK1/2, Cell Signaling, #9121), p-p38 (phospho-p38 MAP Kinase, Cell Signaling, #9211), Gapdh (Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase, Millipore, Cat No. MAB374)는 1:1000의 비율로 희석하여 사용하였으며, 4℃에서 밤새 또는 상온에서 5 시간 동안 반응시켰다. 1X TTBS buffer로 15분씩 세 번 세척한 후 고트 항-마우스 IgA+igG+IgM (KPL, Cat No. 074-1807), 고트 항-래빗 IgG (H+L) (Thermo Fisher Scientific, Cat No. 31460)를 2 차 항체로 사용하여 5% skim milk를 녹인 1X TTBS buffer에 1:5000의 비율로 희석한 후, 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 1X TTBS buffer로 15분 씩 세 번 세척 후, ECL (Advansta, Cat No. K-12045-D50) 로 반응한 후 검출하였다.

실시예 1. WES (Whole Exome Sequencing)를 이용한 바이오 마커의 선별

본 발명에서는 항암보조치료 후 위암이 재발한 환자들을 대상으로 하여 유전자 변이 발생 유무 및 발견된 변이의 특성을 규명하고자 하였다.

이에, 항암보조치료를 받은 환자 14 명의 냉동 조직(frozen fresh tissues)(정상, 종양조직)에 대하여 WES(Whole Exome Sequencing)를 실시하였다.

그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, 다른 유전자(TP53, MUC16, MUC6, ADGB 등)들의 경우, 위암이 재발하지 않은 환자 및 재발한 환자 모두에게서 돌연변이가 발생하였다.

반면, MAP3K10(Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase Kinase 10)의 경우, 돌연변이가 항암보조치료 후 위암이 재발하지 않은 환자에게서 발견되지 않았으나, 위암이 재발한 환자에게서만 변이가 발생한 것을 확인하였다.

도 2b 및 도 2c에 나타낸 바와 같이, 상기 변이는 총 3 종으로써, (1) p.Arg304Cys는 Tyrosine Kinase Domain에 존재하며 이 부위가 시토신(C, Cytosine)에서 티민(T, Thymine)으로 치환된 것; (2) p.His211Arg는 Tyrosine Kinase Domain에 존재하며 이 부위가 아데닌(A, Adenine)에서 구아닌(G, Guanine)으로 치환된 것; 및 (3) p.Ala30Glu는 SH3 Domain에 존재하며 시토신(C, Cytosine)에서 아데닌(A, Adenine)으로 치환된 것임을 확인하였다.

실시예 2. Mutagenic Plasmid Vector 제작

본 발명자들은 위암 세포주의 MAP3K10 돌연변이(mutation)가 항암제에 감수성(저항성 또는 내성)을 나타내는지 검증하기 위해, MAP3K10 플라스미드 벡터 DNA를 제작하여 원하는 부위의 염기가 변했는지 확인하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, MAP3K10^Arg304Cys은 야생형 MAP3K10의 코돈 304에 해당하는 910 번째 뉴클레오티드인 시토신(C, Cytosine)이 티민(T, Thymine)으로 치환된 것임을 확인하였다.

또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, MAP3K10^His211Arg은 야생형 MAP3K10의 코돈 211에 해당하는 632 번째 뉴클레오티드인 아데닌(A, Adenine)이 구아닌(G, Guanine)으로 치환된 것임을 확인하였다.

또한, 도 5에 나타낸 바와 같이, MAP3K10^Ala30Glu은 야생형 MAP3K10의 코돈 30에 해당하는 89 번째 뉴클레오티드인 시토신(C, Cytosine)이 아데닌(A, Adenine)으로 치환된 것임을 확인하였다.

즉, 본원발명의 돌연변이는 서열번호 1에 기재된 정상형 MAP3K10 유전자의 910 번째 염기인 시토신(Cytosine)이 티민(Thymine)으로 치환(substitution)된 것으로서, 이는 서열번호 2에 기재된 정상형 MAP3K10 단백질의 304 번째 아미노산인 아르기닌(arginine)이 시스테인(cysteine)으로 치환된 MAP3K10^Arg304Cys이고; 서열번호 1에 기재된 정상형 MAP3K10 유전자의 632 번째 염기인 아데닌(Adenine)이 구아닌(Guanine)으로 치환된 것으로서, 이는 서열번호 2에 기재된 정상형 MAP3K10 단백질의 211 번째 아미노산인 히스티딘(histidine)이 아르기닌(arginine)으로 치환된 MAP3K10^His211Arg이며; 서열번호 1에 기재된 정상형 MAP3K10 유전자의 89 번째 염기인 시토신(Cytosine)이 아데닌(Adenine)으로 치환된 것으로서, 이는 서열번호 2에 기재된 정상형 MAP3K10 단백질의 30 번째 아미노산인 알라닌(alanine)이 글루탐산(glutamic acid)으로 치환된 MAP3K10^Ala30Glu이다.

실시예 3. 위암세포주에서 MAP3K10 돌연변이( MAP3K10 ^Arg304Cys , MAP3K10 ^His211Arg 및 MAP3K10 ^Ala30Glu )의 존재 여부에 따른 반응성 확인

3-1. 위암세포주에서 MAP3K10 돌연변이( MAP3K10 ^Arg304Cys , MAP3K10 ^His211Arg 및 MAP3K10 ^Ala30Glu )의 항암제에 대한 내성효과

본 발명자들은 MAP3K10 돌연변이 플라스미드 벡터(mutation Plasmid Vector) DNA를 위암세포주에 형질전환시킨 후 항암제로서 5-플루오로우라실[5-Fluorouracil, 5-FU (Adrucil)] 및 시스플라틴[cisplatin (Platinol)]을 각각 처리하여 MTT 방법으로 항암제 내성을 확인하였다.

그 결과, 도 6 및 7에 나타낸 바와 같이, 각 위암 세포주의 세포 생존율에 있어, 각 항암제를 처리하지 않은 MAP3K10 야생형(Wild Type)과 MAP3K10 돌연변이(MAP3K10^Arg304Cys,MAP3K10^His211Arg 및 MAP3K10^Ala30Glu)간에는 유의한 차이가 없는 반면, 각 항암제를 처리한 MAP3K10 돌연변이(MAP3K10^Arg304Cys, MAP3K10^His211Arg, MAP3K10^Ala30Glu)는 MAP3K10 야생형보다 세포 증식이 최소 5%에서 최대 20%까지 증가된 것을 확인하였다.

따라서, MAP3K10 돌연변이(MAP3K10^Arg304Cys, MAP3K10^His211Arg 및 MAP3K10^Ala30Glu)는 MAP3K10 야생형에 비해 항암제(5-Fluorouracil, Cisplatin)에 대한 내성 현상이 있는 것을 확인하였다.

3-2. MAP3K10 돌연변이( MAP3K10 ^Arg304Cys , MAP3K10 ^His211Arg 및 MAP3K10 ^Ala30Glu ) 의 위암세포주에서 항암제에 대한 세포사멸 ( Apoptosis ) 효과

공지된 항암제인 5-FU 및 시스플라틴은 암세포에서 세포사멸(Apoptosis)를 야기시킨다. 이에, 본 발명자들은 MAP3K10 야생형과 MAP3K10 돌연변이(MAP3K10^Arg304Cys, MAP3K10^His211Arg 및 MAP3K10^Ala30Glu)의 위암세포들에 항암제로서 5-플루오로우라실[5-Fluorouracil, 5-FU (Adrucil)] 및 시스플라틴[cisplatin (Platinol)]을 각각 처리하여 세포사멸을 측정하였다.

그 결과, 도 8 및 도 9에 나타낸 바와 같이, 항암제 (5-fluorouracil, Cisplatin)를 미처리한 MAP3K10 야생형과 MAP3K10 돌연변이(MAP3K10^Arg304Cys, MAP3K10^His211Arg, MAP3K10^Ala30Glu)의 세포사멸은 차이점이 없었다.

그러나, 항암제를 처리한 MAP3K10 돌연변이(MAP3K10^Arg304Cys, MAP3K10^His211Arg, MAP3K10^Ala30Glu)의 세포사멸이 MAP3K10 야생형보다 최소 5%에서 최대 10%까지 감소하였다.

따라서 MAP3K10 돌연변이(MAP3K10^Arg304Cys, MAP3K10^His211Arg, MAP3K10^Ala30Glu) 가 MAP3K10 야생형보다 항암제에 대한 저항성이 있는 것을 확인하였다.

3-3. MAP3K10 돌연변이( MAP3K10 ^Arg304Cys , MAP3K10 ^His211Arg , MAP3K10 ^Ala30Glu ) 신호전달 경로 확인

본 발명자들은 상기 실시예 3-2에서 항암제를 처리한 MAP3K10 야생형에 비해 MAP3K10 돌연변이(MAP3K10^Arg304Cys, MAP3K10^His211Arg, MAP3K10^Ala30Glu)가 세포증식(Cell viability)(%)의 증가와 세포사멸(Apoptosis)의 감소를 관찰하였다.

이에, MAP3K10 돌연변이(MAP3K10^Arg304Cys, MAP3K10^His211Arg, MAP3K10^Ala30Glu) 가 어떤 경로를 통해 세포증식 및 사멸에 영향을 주는지 확인하기 위해 다운스트림에 존재하는 MEK1/2와 p38 MAPK의 단백질 발현의 변화를 확인하였다.

그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 항암제(5-fluorouracil, Cisplatin)를 처리한 MAP3K10 돌연변이(MAP3K10^Arg304Cys, MAP3K10^His211Arg, MAP3K10^Ala30Glu)가 MAP3K10 야생형에 비해 세포 성장과 분화에 관련되어있는 p-MEK1/2의 발현이 증가된 것을 확인하였으며 또한 암세포의 전이와 관련 있는 p-38MAPK도 증가된 것을 관찰하였다.

따라서, 이들 돌연변이는 p-MEK1/2와 p-p38MAPK 신호 전달 경로(signaling pathway)를 통해 항암제에 대한 내성을 나타내는 것으로 사료된다.

요약하자면, MAP3K10(Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase Kinase 10) 변이는 항암보조치료 후 위암이 재발하지 않은 환자에게서는 발견되지 않았으나, 위암이 재발한 환자에게서는 발생하였다.

이에, MAP3K10 돌연변이 (MAP3K10^Arg304Cys, MAP3K10^His211Arg, MAP3K10^Ala30Glu)이 발생한 위암세포주에 항암제를 처리하면 어떤 영향을 미치는지 확인해보았다.

그 결과, 항암제 (5-Fluorouracil, Cisplatin) 를 처리한 MAP3K10 돌연변이(MAP3K10^Arg304Cys, MAP3K10^His211Arg, MAP3K10^Ala30Glu)가 MAP3K10 야생형보다 세포 증식 증가 및 세포사멸(Apoptosis)이 감소됨을 확인하였다.

또한, 어떤 경로를 통해 항암제 내성이 발생하는지 단백질의 발현여부를 확인해 본 결과, 항암제를 처리한 MAP3K10 돌연변이(MAP3K10^Arg304Cys, MAP3K10^His211Arg, MAP3K10^Ala30Glu)가, 항암제(5-Fluorouracil, Cisplatin)를 처리한 MAP3K10 야생형에 비해, MAP3Ks 다운스트림에 존재하는 세포성장 및 전이와 관련있는 p-MEK1/2 및 p-p38MAPK의 활성화가 증가되어있음을 확인하였다.

결론적으로, 항암보조치료 후 위암이 재발한 환자의 시료에서는 항암제의 내성으로 인해 MAP3K10 돌연변이(MAP3K10^Arg304Cys, MAP3K10^His211Arg, MAP3K10^Ala30Glu) 이 발생하였으며, 이 변이가 발생한 환자들에게 항암제(5-Fluorouracil, Cisplatin)로 치료하면 다운스트림에 존재하는 p-MEK1/2와 p-p38MAPK의 활성이 증가하여 내성이 증가됨을 확인하였다.

따라서, MAP3K10 돌연변이(MAP3K10^Arg304Cys, MAP3K10^His211Arg, MAP3K10^Ala30Glu)는 위암 세포에서 항암제에 내성을 일으키는 원인 중에 하나이며 궁극적으로 암의 치료 효과를 높이기 위해 매우 중요한 역할을 할 것으로 예상된다.

즉, 암세포 내에 MAP3K10 돌연변이가 존재하는 경우, 항암제에 대한 내성이 높다는 것을 보여준다.

따라서, MAP3K10 돌연변이가 특정 항암제에 대한 감수성 예측용 바이오 마커로서의 이용가능성이 있음을 확인할 수 있다.

<110> Pusan National University Industry-University Cooperation Foundation PUSAN NATIONAL UNIVERSITY HOSPITAL <120> Novel Biomarkers for Predicting Susceptibility to Anti-Cancer Drug and Uses Thereof <130> PNU1-326p <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2865 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggaggagg aggagggggc ggtggccaag gagtggggca cgacccccgc ggggcccgtc 60 tggaccgcgg tgttcgacta cgaggcggcg ggcgacgagg agctgaccct gcggaggggc 120 gatcgcgtcc aggtgctttc ccaagactgt gcggtgtccg gcgacgaggg ctggtggacc 180 gggcagctcc ccagcggccg cgtgggcgtc ttccccagca actacgtggc ccccggcgcc 240 cccgctgcac ccgcgggcct ccagctgccc caggagatcc ccttccacga gctgcagcta 300 gaggagatca tcggtgtggg gggctttggc aaggtctatc gggccctgtg gcgtggcgag 360 gaggtggcag tcaaggccgc ccggctggac cctgagaagg acccggcagt gacagcggag 420 caggtgtgcc aggaagcccg gctctttgga gccctgcagc accccaacat aattgccctt 480 aggggcgcct gcctcaaccc cccacacctc tgcctagtga tggagtatgc ccggggtggt 540 gcactgagca gggtgctggc aggtcgccgg gtgccacctc acgtgctggt caactgggct 600 gtgcaggtgg cccggggcat gaactaccta cacaatgatg cccctgtgcc catcatccac 660 cgggacctca agtccatcaa catcctgatc ctggaggcca tcgagaacca caacctcgca 720 gacacggtgc tcaagatcac ggacttcggc ctcgcccgcg agtggcacaa gaccaccaag 780 atgagcgctg cggggaccta cgcctggatg gcgccggagg ttatccgtct ctccctcttc 840 tccaaaagca gtgatgtctg gagcttcggg gtgctgctgt gggagctgct gacgggggag 900 gtcccctacc gtgagatcga cgccttggcc gtggcgtatg gcgtggctat gaataagctg 960 acgctgccca ttccctccac gtgccccgag ccctttgccc gcctcctgga ggaatgctgg 1020 gacccagacc cccacgggcg gccagatttc ggtagcatct tgaagcggct tgaagtcatc 1080 gaacagtcag ccctgttcca gatgccactg gagtccttcc actcgctgca ggaagactgg 1140 aagctggaga ttcagcacat gtttgatgac cttcggacca aggagaagga gcttcggagc 1200 cgtgaggagg agctgctgcg ggcggcacag gagcagcgct tccaggagga gcagctgcgg 1260 cggcgggagc aggagctggc agaacgtgag atggacatcg tggaacggga gctgcacctg 1320 ctcatgtgcc agctgagcca ggagaagccc cgggtccgca agcgcaaggg caacttcaag 1380 cgcagccgcc tgctcaagct gcgggaaggc ggcagccaca tcagcctgcc ctctggcttt 1440 gagcataaga tcacagtcca ggcctctcca actctggata agcggaaagg atccgatggg 1500 gccagccccc ctgcaagccc cagcatcatc ccccggctga gggccattcg cctgactccc 1560 gtggactgtg gtggcagcag cagtggcagc agcagtggag gaagtgggac atggagccgc 1620 ggtgggcccc caaagaagga agaactggtc gggggcaaga agaagggacg aacgtggggg 1680 cccagctcca ccctgcagaa ggagcgggtg ggaggagagg agaggctgaa ggggctgggg 1740 gaaggaagca aacagtggtc atcaagtgcc cccaacctgg gcaagtcccc caaacacaca 1800 cccatcgccc ctggctttgc cagcctcaat gagatggagg agttcgcgga ggcagaggat 1860 ggaggcagca gcgtgccccc ttccccctac tcgaccccgt cctacctctc agtgccactg 1920 cctgccgagc cctccccggg ggcgcgggcg ccgtgggagc cgacgccgtc cgcgcccccc 1980 gctcggtggg gacacggcgc ccggcggcgc tgcgacctgg cgctgctagg ctgcgccacg 2040 ctgctggggg ctgtgggcct gggcgccgac gtggccgagg cgcgcgcggc cgacggtgag 2100 gagcagcggc gctggctcga cggcctcttc tttccccgcg ccggccgctt cccgcggggc 2160 ctcagcccac ccgcgcgtcc ccacggccgc cgcgaagacg tgggccccgg cctgggcctg 2220 gcgccctcgg ccaccctcgt gtcgctgtcg tccgtgtccg actgcaactc cacgcgttca 2280 ctgctgcgct ctgacagtga cgaggccgca ccggccgcgc cctccccacc accctccccg 2340 cccgcgccca cacccacgcc ctcgcccagc accaaccccc tggtggacct ggagctggag 2400 agcttcaaga aggacccccg ccagtcgctc acgcccaccc acgtcacggc tgcatgcgct 2460 gtgagccgcg ggcaccggcg gacgccatcg gacggggcgc tggggcagcg ggggccgccc 2520 gagcccgcgg gccatggccc tggccctcgt gaccttctgg acttcccccg cctgcccgac 2580 ccccaggccc tgttcccagc ccgccgccgg ccccctgagt tcccaggccg ccccaccacc 2640 ctgacctttg ccccgagacc tcggccggct gccagtcgcc cccgcttgga cccctggaaa 2700 ctggtctcct tcggccggac actcaccatc tcgcctccca gcaggccaga cactccggag 2760 agccctgggc cccccagcgt gcagcccaca ctgctggaca tggacatgga ggggcagaac 2820 caagacagca cagtgcccct gtgcggggcc cacggctccc actaa 2865 <210> 2 <211> 954 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Glu Glu Glu Glu Gly Ala Val Ala Lys Glu Trp Gly Thr Thr Pro 1 5 10 15 Ala Gly Pro Val Trp Thr Ala Val Phe Asp Tyr Glu Ala Ala Gly Asp 20 25 30 Glu Glu Leu Thr Leu Arg Arg Gly Asp Arg Val Gln Val Leu Ser Gln 35 40 45 Asp Cys Ala Val Ser Gly Asp Glu Gly Trp Trp Thr Gly Gln Leu Pro 50 55 60 Ser Gly Arg Val Gly Val Phe Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Gly Ala 65 70 75 80 Pro Ala Ala Pro Ala Gly Leu Gln Leu Pro Gln Glu Ile Pro Phe His 85 90 95 Glu Leu Gln Leu Glu Glu Ile Ile Gly Val Gly Gly Phe Gly Lys Val 100 105 110 Tyr Arg Ala Leu Trp Arg Gly Glu Glu Val Ala Val Lys Ala Ala Arg 115 120 125 Leu Asp Pro Glu Lys Asp Pro Ala Val Thr Ala Glu Gln Val Cys Gln 130 135 140 Glu Ala Arg Leu Phe Gly Ala Leu Gln His Pro Asn Ile Ile Ala Leu 145 150 155 160 Arg Gly Ala Cys Leu Asn Pro Pro His Leu Cys Leu Val Met Glu Tyr 165 170 175 Ala Arg Gly Gly Ala Leu Ser Arg Val Leu Ala Gly Arg Arg Val Pro 180 185 190 Pro His Val Leu Val Asn Trp Ala Val Gln Val Ala Arg Gly Met Asn 195 200 205 Tyr Leu His Asn Asp Ala Pro Val Pro Ile Ile His Arg Asp Leu Lys 210 215 220 Ser Ile Asn Ile Leu Ile Leu Glu Ala Ile Glu Asn His Asn Leu Ala 225 230 235 240 Asp Thr Val Leu Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Arg Glu Trp His 245 250 255 Lys Thr Thr Lys Met Ser Ala Ala Gly Thr Tyr Ala Trp Met Ala Pro 260 265 270 Glu Val Ile Arg Leu Ser Leu Phe Ser Lys Ser Ser Asp Val Trp Ser 275 280 285 Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Leu Leu Thr Gly Glu Val Pro Tyr Arg 290 295 300 Glu Ile Asp Ala Leu Ala Val Ala Tyr Gly Val Ala Met Asn Lys Leu 305 310 315 320 Thr Leu Pro Ile Pro Ser Thr Cys Pro Glu Pro Phe Ala Arg Leu Leu 325 330 335 Glu Glu Cys Trp Asp Pro Asp Pro His Gly Arg Pro Asp Phe Gly Ser 340 345 350 Ile Leu Lys Arg Leu Glu Val Ile Glu Gln Ser Ala Leu Phe Gln Met 355 360 365 Pro Leu Glu Ser Phe His Ser Leu Gln Glu Asp Trp Lys Leu Glu Ile 370 375 380 Gln His Met Phe Asp Asp Leu Arg Thr Lys Glu Lys Glu Leu Arg Ser 385 390 395 400 Arg Glu Glu Glu Leu Leu Arg Ala Ala Gln Glu Gln Arg Phe Gln Glu 405 410 415 Glu Gln Leu Arg Arg Arg Glu Gln Glu Leu Ala Glu Arg Glu Met Asp 420 425 430 Ile Val Glu Arg Glu Leu His Leu Leu Met Cys Gln Leu Ser Gln Glu 435 440 445 Lys Pro Arg Val Arg Lys Arg Lys Gly Asn Phe Lys Arg Ser Arg Leu 450 455 460 Leu Lys Leu Arg Glu Gly Gly Ser His Ile Ser Leu Pro Ser Gly Phe 465 470 475 480 Glu His Lys Ile Thr Val Gln Ala Ser Pro Thr Leu Asp Lys Arg Lys 485 490 495 Gly Ser Asp Gly Ala Ser Pro Pro Ala Ser Pro Ser Ile Ile Pro Arg 500 505 510 Leu Arg Ala Ile Arg Leu Thr Pro Val Asp Cys Gly Gly Ser Ser Ser 515 520 525 Gly Ser Ser Ser Gly Gly Ser Gly Thr Trp Ser Arg Gly Gly Pro Pro 530 535 540 Lys Lys Glu Glu Leu Val Gly Gly Lys Lys Lys Gly Arg Thr Trp Gly 545 550 555 560 Pro Ser Ser Thr Leu Gln Lys Glu Arg Val Gly Gly Glu Glu Arg Leu 565 570 575 Lys Gly Leu Gly Glu Gly Ser Lys Gln Trp Ser Ser Ser Ala Pro Asn 580 585 590 Leu Gly Lys Ser Pro Lys His Thr Pro Ile Ala Pro Gly Phe Ala Ser 595 600 605 Leu Asn Glu Met Glu Glu Phe Ala Glu Ala Glu Asp Gly Gly Ser Ser 610 615 620 Val Pro Pro Ser Pro Tyr Ser Thr Pro Ser Tyr Leu Ser Val Pro Leu 625 630 635 640 Pro Ala Glu Pro Ser Pro Gly Ala Arg Ala Pro Trp Glu Pro Thr Pro 645 650 655 Ser Ala Pro Pro Ala Arg Trp Gly His Gly Ala Arg Arg Arg Cys Asp 660 665 670 Leu Ala Leu Leu Gly Cys Ala Thr Leu Leu Gly Ala Val Gly Leu Gly 675 680 685 Ala Asp Val Ala Glu Ala Arg Ala Ala Asp Gly Glu Glu Gln Arg Arg 690 695 700 Trp Leu Asp Gly Leu Phe Phe Pro Arg Ala Gly Arg Phe Pro Arg Gly 705 710 715 720 Leu Ser Pro Pro Ala Arg Pro His Gly Arg Arg Glu Asp Val Gly Pro 725 730 735 Gly Leu Gly Leu Ala Pro Ser Ala Thr Leu Val Ser Leu Ser Ser Val 740 745 750 Ser Asp Cys Asn Ser Thr Arg Ser Leu Leu Arg Ser Asp Ser Asp Glu 755 760 765 Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ser Pro Pro Pro Ser Pro Pro Ala Pro Thr 770 775 780 Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Asn Pro Leu Val Asp Leu Glu Leu Glu 785 790 795 800 Ser Phe Lys Lys Asp Pro Arg Gln Ser Leu Thr Pro Thr His Val Thr 805 810 815 Ala Ala Cys Ala Val Ser Arg Gly His Arg Arg Thr Pro Ser Asp Gly 820 825 830 Ala Leu Gly Gln Arg Gly Pro Pro Glu Pro Ala Gly His Gly Pro Gly 835 840 845 Pro Arg Asp Leu Leu Asp Phe Pro Arg Leu Pro Asp Pro Gln Ala Leu 850 855 860 Phe Pro Ala Arg Arg Arg Pro Pro Glu Phe Pro Gly Arg Pro Thr Thr 865 870 875 880 Leu Thr Phe Ala Pro Arg Pro Arg Pro Ala Ala Ser Arg Pro Arg Leu 885 890 895 Asp Pro Trp Lys Leu Val Ser Phe Gly Arg Thr Leu Thr Ile Ser Pro 900 905 910 Pro Ser Arg Pro Asp Thr Pro Glu Ser Pro Gly Pro Pro Ser Val Gln 915 920 925 Pro Thr Leu Leu Asp Met Asp Met Glu Gly Gln Asn Gln Asp Ser Thr 930 935 940 Val Pro Leu Cys Gly Ala His Gly Ser His 945 950 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer F <400> 3 gaggtcccct actgtgagat cgacgcc 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer R <400> 4 ggcgtcgatc tcacagtagg ggacctc 27 <210> 5 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer F <400> 5 cggggcatga actacctacg caatgatgcc cctgtgccc 39 <210> 6 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer R <400> 6 gggcacaggg gcatcattgc gtaggtagtt catgccccg 39 <210> 7 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer F <400> 7 gtgttcgact acgaggcgga gggcgacgag gagctgacc 39 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer R <400> 8 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Claims

MAP3K10(Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase Kinase 10)의 돌연변이(Mutant)를 포함하는 위암에 대한 항암제의 감수성(susceptibility) 예측용 바이오 마커 조성물로서,
상기 돌연변이는 서열번호 2에 기재된 정상형 MAP3K10 단백질의 304 번째 아미노산인 아르기닌(arginine)이 시스테인(cysteine)으로 치환, 211 번째 아미노산인 히스티딘(histidine)이 아르기닌(arginine)으로 치환 및 30 번째 아미노산인 알라닌(alanine)이 글루탐산(glutamic acid)으로 치환되는 경우로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 경우이고;
상기 항암제는 5-플루오로우라실 (5-Fluorouracil, 5-FU) 또는 시스플라틴 (cisplatin)인 것을 특징으로 하는, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 돌연변이는 서열번호 1에 기재된 정상형 MAP3K10 유전자의 910 번째 염기인 시토신(Cytosine)이 티민(Thymine)으로 치환(substitution), 632 번째 염기인 아데닌(Adenine)이 구아닌(Guanine)으로 치환 및 89 번째 염기인 시토신(Cytosine)이 아데닌(Adenine)으로 치환되는 경우로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 경우인 것을 특징으로 하는, 조성물.
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제1항에 있어서, 상기 위암은 진행성(progression), 재발성(Recurrence) 및 전이성(metastasis)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
MAP3K10(Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase Kinase 10)의 돌연변이(Mutant)를 검출하는 제제를 포함하는, 위암에 대한 항암제의 감수성 예측용 조성물로서,
상기 돌연변이는 서열번호 2에 기재된 정상형 MAP3K10 단백질의 304 번째 아미노산인 아르기닌(arginine)이 시스테인(cysteine)으로 치환, 211 번째 아미노산인 히스티딘(histidine)이 아르기닌(arginine)으로 치환 및 30 번째 아미노산인 알라닌(alanine)이 글루탐산(glutamic acid)으로 치환되는 경우로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 경우이고;
상기 항암제는 5-플루오로우라실 (5-Fluorouracil, 5-FU) 또는 시스플라틴 (cisplatin)인 것을 특징으로 하는, 조성물.
제7항에 있어서,
상기 돌연변이를 검출하는 제제는 상기 돌연변이에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍, 프로브, 항체, 펩타이드 또는 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제8항에 있어서,
상기 프라이머 쌍은 서열번호 9로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 10로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 쌍; 서열번호 11로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 12로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 쌍; 및 서열번호 13로 표시되는 정방향 프라이머 및 서열번호 14로 표시되는 역방향 프라이머로 이루어진 쌍;으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제7항에 있어서,
상기 돌연변이는 서열번호 1에 기재된 정상형 MAP3K10 유전자의 910 번째 염기인 시토신(Cytosine)이 티민(Thymine)으로 치환(substitution), 632 번째 염기인 아데닌(Adenine)이 구아닌(Guanine)으로 치환 및 89 번째 염기인 시토신(Cytosine)이 아데닌(Adenine)으로 치환되는 경우로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 경우인 것을 특징으로 하는, 조성물.
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제7항의 조성물을 포함하는, 위암에 대한 항암제의 감수성 예측용 키트.
다음 단계를 포함하는 위암에 대한 항암제의 감수성(susceptibility) 예측을 위한 정보제공 방법:
(a) 위암 환자로부터 수득된 생물학적 시료 내 MAP3K10(Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase Kinase 10)의 돌연변이(Mutant)를 검출하는 단계로서,
상기 돌연변이는 서열번호 2에 기재된 정상형 MAP3K10 단백질의 304 번째 아미노산인 아르기닌(arginine)이 시스테인(cysteine)으로 치환, 211 번째 아미노산인 히스티딘(histidine)이 아르기닌(arginine)으로 치환 및 30 번째 아미노산인 알라닌(alanine)이 글루탐산(glutamic acid)으로 치환되는 경우로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 경우이고; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 검출 결과에 기초하여 상기 위암 환자의 항암제에 대한 감수성을 예측하는 단계로서,
상기 항암제는 5-플루오로우라실 (5-Fluorouracil, 5-FU) 또는 시스플라틴 (cisplatin)인 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서,
상기 (a) 단계의 돌연변이(Mutant)가 검출되는 경우, 상기 위암 환자는 항암제에 대한 감수성이 있는 것으로 예측하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제13항에 있어서,
상기 돌연변이는 서열번호 1에 기재된 정상형 MAP3K10 유전자의 910 번째 염기인 시토신(Cytosine)이 티민(Thymine)으로 치환(substitution), 632 번째 염기인 아데닌(Adenine)이 구아닌(Guanine)으로 치환 및 89 번째 염기인 시토신(Cytosine)이 아데닌(Adenine)으로 치환되는 경우로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 경우인 것을 특징으로 하는, 방법.
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