KR101883936B1 - 림프절 전이 예측용 마커 및 이를 이용한 림프절 전이 예측 방법 - Google Patents
림프절 전이 예측용 마커 및 이를 이용한 림프절 전이 예측 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101883936B1 KR101883936B1 KR1020160177839A KR20160177839A KR101883936B1 KR 101883936 B1 KR101883936 B1 KR 101883936B1 KR 1020160177839 A KR1020160177839 A KR 1020160177839A KR 20160177839 A KR20160177839 A KR 20160177839A KR 101883936 B1 KR101883936 B1 KR 101883936B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- leu
- padi2
- seq
- ser
- val
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57446—Specifically defined cancers of stomach or intestine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/52—Assays involving cytokines
- G01N2333/525—Tumor necrosis factor [TNF]
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/52—Assays involving cytokines
- G01N2333/54—Interleukins [IL]
- G01N2333/5412—IL-6
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/52—Assays involving cytokines
- G01N2333/54—Interleukins [IL]
- G01N2333/545—IL-1
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 이의 각각의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 항원 결합 단편, 또는 폴리펩티드, 또는 상기 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머 세트, 또는 뉴클레오티드를 포함하는 전이성 위암 진단용 조성물 및 이를 이용한 위암 초기에서 림프절 전이를 예측하는 방법에 관한 것이다.
Description
APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 초기 위암에서의 림프절 전이 예측용 조성물 및 키트, 이를 이용한 초기 위암에서의 림프절 전이를 예측하는 방법에 관한 것이다.
위암은 전 세계에서 다섯 번째로 흔한 암인 동시에 암으로 인한 사망률로는 두 번째 주요 원인이다 (Int J Cancer 2015; 136: E359-386). 국소 림프절전이는 위암에서 가장 중요한 예후 인자 중 하나로 알려져 있고, 림프절 절제 범위 또한 위암의 치료에 있어 매우 중요하다 (J Clin Oncol 2012; 30: 3834-3840, Ann Surg 2012; 255: 50-58, Br J Surg 1995; 82: 346-351). 최근에 본 연구팀의 후향적 임상 연구에서는 점막 위암에서도 림프절전이 치료가 중요함을 재평가한 바 있다 (Oh SY et al., Ann Surg 2016).
한편, 보통 TNM 병기(TNM staging system)에서 종양 침습 깊이가 깊을수록 국소 림프절 전이가 자주 나타난다 (Edge S et al., New York, NY: Springer 2009). 그러나 드물게는 T 병기와 N 병기가 상반되는 (T 병기가 높고 림프절전이가 없는 경우 또는 T 병기가 낮지만 림프절전이가 높은 경우) 위암이 발생하기도 하며 이러한 경우 림프절전이에 대한 독립적인 바이오마커를 찾는데 좋은 타겟이 될 수 있다. 본 연구팀의 이전 연구에서는 DNA 마이크로어레이 (DNA microarray) 기법을 통해 이러한 위암에서 plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1)의 과발현이 림프절 전이가 높은 진행위암과 관련이 있음을 보고하였으나 적은 샘플 숫자와 분석 깊이의 한계로 결과 검증에는 어려움이 있었다 (Cancer Res Treat 2015; 47: 718-726).
최근 차세대 염기서열 분석법 (Next-generation sequencing; NGS) 이 발달함에 따라 암 유전체 연구에서 희귀 변이들의 분자적 특성을 분석하는 것이 가능해졌다 (Nat Rev Genet 2013; 14: 681-691). 그러므로 본 연구는 NGS 기법을 이용하여 T 병기가 높고 림프절전이가 없는 위암과 T 병기가 낮지만 림프절전이가 극도로 높은 위암을 분석함으로써 림프절전이를 위한 독립적인 분자 바이오마커들을 찾고자 한다.
일 양상은 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 이의 각각의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 항원 결합 단편, 또는 폴리펩티드, 또는 상기 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머 세트, 또는 뉴클레오티드를 포함하는 전이성 위암 진단용 조성물을 제공한다.
다른 양상은 상기 전이성 위암 진단용 조성물 및 이를 검출하기 위한 시약을 포함하는 전이성 위암 진단용 키트를 제공한다.
또 다른 양상은 개체로부터 분리된 시료에 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 이의 각각의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합, 또는 상기 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머, 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 접촉시켜 복합체를 형성시키는 단계; 및 상기 복합체로부터 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 전이성 위암을 진단하는 방법을 제공한다.
일 양상은 APOBEC3A(Apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide-like 3A), FCGR3B(Fc fragment of IgG, low affinity IIIb, receptor), SERPINB5(serpin family B member 5), NMU(neuromedin-U) 및 PADI2(Protein-arginine deiminase type-2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 이의 각각의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 항원 결합 단편, 또는 폴리펩티드, 또는 상기 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머 세트, 또는 뉴클레오티드를 포함하는 전이성 위암 진단용 조성물을 제공한다.
상기 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 또는 PADI2 단백질은 인간(Homo sapiens) 또는 마우스(Mus musculus) 유래의 단백질이나, 원숭이, 소, 말 등의 다른 포유 동물에서도 동일한 단백질이 발현될 수 있으며, 인간 유래의 PADI2는 GenBank Accession No. NM_007365.2의 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 1) 또는 이 중 PADI2로 발현되는 코돈만을 갖는 것으로서 서열번호 2의 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 이를 포함하는 mRNA로부터 NP_031391.2의 아미노산 서열을 갖는 것으로서 서열번호 14를 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 것일 수 있다. 상기 서열번호 1 또는 2의 mRNA와 서열번호 14의 단백질이 일부 폴리뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열과 일치하지 않더라도, 생물학적으로 동등한 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열은 PADI2의 mRNA 또는 PADI2 단백질로 간주될 수 있다. APOBEC3A는 서열번호 3(NM_145699.3), 서열번호 3에서 171 내지 770번의 폴리뉴클레오티드 서열, 서열번호 4(NM_001270406.1) 및 서열번호 4에서 171 내지 716번의 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나, FCGR3B는 서열번호 5(NM_001244753.1), 서열번호 5에서 261 내지 1070번의 폴리뉴클레오티드 서열, 서열번호 6(NM_000570.4), 서열번호 6에서 123번 내지 824번의 폴리뉴클레오티드 서열, 서열번호 7(NM_001271035.1), 서열번호 7에서 261번 내지 1067번의 폴리뉴클레오티드 서열, 서열번호 8(NM_001271036.1), 서열번호 8에서 286번 내지 936번의 폴리뉴클레오티드 서열, 서열번호 9(NM_001271037.1) 및 서열번호 9에서 286번 내지 678번의 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나, SERPINB5는 서열번호 10(NM_002639.4) 또는 서열번호 10에서 143번 내지 1270번의 폴리뉴클레오티드 서열, 및 NMU는 서열번호 11(NM_006681.3), 서열번호 11에서 107번 내지 631번의 폴리뉴클레오티드 서열, 서열번호 12(NM_001292045.1), 서열번호 12에서 107번 내지 583번의 폴리뉴클레오티드 서열, 서열번호 13(NM_001292046.1), 및 서열번호 13에서 107번 내지 556번의 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 포함하는 mRNA로부터 번역된 것일 수 있으며, 이를 포함하는 mRNA로부터 번역되는 APOBEC3A는 NP_663745.1(서열번호 15), FCGR3B는 NP_001231682.1(서열번호 16), NP_000561.3(서열번호 17), NP_001257964.1(서열번호 18), NP_001257965.1(서열번호 19), 및 NP_001257966.1(서열번호 20) 중 어느 하나, SERPINB5는 NP_002630.2(서열번호 21), 및 NMU는 NP_006672.1(서열번호 22), NP_001278974.1(서열번호 23), 및 NP_001278975.1(서열번호 24) 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질일 수 있다. 또한 상기 각각의 단백질의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열과 일치하지 않더라도, 생물학적으로 동등한 활성을 갖는 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 그 단백질 또는 그 단백질의 mRNA로 간주될 수 있다.
상기 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2 각각을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 내지 13과 60% 이상, 예를 들면, 70%이상, 80%이상, 90%이상, 95%이상, 99%이상, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2 각각을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 서열번호 1 내지 13의 서열에서 1개 이상의 1개 이상의 뉴클레오티드, 2개 이상의 뉴클레오티드, 3개 이상의 뉴클레오티드, 4개 이상의 뉴클레오티드, 5개 이상의 뉴클레오티드, 6개 이상의 뉴클레오티드 또는 7개 이상의 뉴클레오티드가 상이한 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
상기 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 각각은 서열번호 14 내지 24와 60% 이상, 예를 들면, 70%이상, 80%이상, 90%이상, 95%이상, 99%이상, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한 상기 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 각각은 상기 서열번호 14 내지 24의 아미노산 서열에서 1개 이상의 아미노산, 2개 이상의 아미노산, 3개 이상의 아미노산, 4개 이상의 아미노산, 5개 이상의 아미노산, 6개 이상의 아미노산 또는 7개 이상의 아미노산이 변화된 서열을 갖는 아미노산 서열일 수 있다.
상기 전이성 위암 진단용 조성물은 상기 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2로 이루어진 군으로부터 선택된 각각의 단백질 또는 이의 각각의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 항원 결합 단편, 또는 폴리펩티드, 또는 상기 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2로 이루어진 군으로부터 선택된 각각의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머 세트, 또는 뉴클레오티드를 하나 이상의 조합으로 포함하는 것일 수 있다.
용어 '전이성'은 암이 발생한 장기 또는 위치에서 다른 장기 또는 다른 위치로 퍼지는 것을 의미하며, 주로 직접적으로 연결되지 않은 부위(또는 장기)로 옮겨가는 현상을 의미한다. 일부 암 세포는 림프관 또는 혈관 벽을 통과하여 다른 장기로 옮겨 갈 수 있는데, 이러한 프로세스 등을 통해 림프절로 전이되면 '림프절 전이'라 한다.
일 구체예에서, 본 발명의 조성물은 위암에서 전이성 여부를 진단 또는 전이 가능성을 예측하기 위한 것일 수 있고, 상기 전이는 구체적으로 림프절 전이를 의미하는 것일 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 위암 중 초기 위암에서 전이성 위암 여부를 진단 또는 전이 가능성을 예측하기 위한 것일 수 있다. 전이성 암은 TNM 병기(TNM staging system) 기준으로 평가할 수 있다. TNM 병기에서 T는 원(original) 조직에서의 종양 크기, N은 근처의 연관된 림프절, M은 원거리 전이를 의미하는 것으로서, T는 Tx(측정 불가), Tis(in situ 암종(carcinoma)), T0(종양 신호 없음), 및 크기에 따라 T1 내지 T4로 분류되고, N은 Nx(측정 불가), N0(종양 내 국소적 림프절 없음), N1(국소 림프절 전이가 존재하는 것으로서, 가까운 림프절 또는 소수의 국소 림프절에 전이), N2(N1 및 N3 사이의 림프절 전이 정도), 및 N3(원거리 림프절 전이 또는 다수의 국소 림프절 전이)로 분류되고, M은 M0(원거리 전이 없음) 및 M1(원거리 장기에 전이)으로 분류될 수 있다.
일 구체예에서 본 발명의 조성물은 상기 초기 위암 중에서도 TNM 병기(TNM staging system) 기준으로 T1 내지 T2에 해당하는 위암에서 전이성 여부를 진단 또는 전이 가능성을 예측할 수 있다. 또한 상기 초기 위암은 N 병기 중 N0 내지 N2, N0 내지 N1, 또는 N1 내지 N2에 해당하는 위암에서 전이성 여부를 진단 또는 전이 가능성을 예측할 수 있고, 바람직하게는 상기 N 병기는 N0 내지 N1이다.
일 구체예에서, 본 발명의 조성물은 진단 대상 시료로부터 세포핵을 단리하기 위한 시약을 더 포함할 수 있다. 조직 시료 또는 세포 시료로부터 세포핵을 단리하는 기술은 통상의 기술자에게 잘 알려진 방법에 따라 이루어질 수 있다.
일 구체예에서, 상기 단리된 세포핵 중에 검출 대상이 되는 PADI2 단백질은 절단된-PADI2(서열정보 BC009701.1)의 폴리뉴클레오티드로부터 번역된 폴리펩티드로서, 서열번호 14의 서열 중 1 내지 437번의 아미노산 서열을 포함하는 것으로서 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 25 또는 서열번호 25에서 65번 내지 1378번의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면 PADI2 단백질을 바이오마커로 하여 전이성 위암을 진단하는데 IL-1β, IL-6, 및 TNF-β의 발현량을 측정함으로써 그 정확성을 더 증진시킬 수 있다. 이에 따라 일 구체예에서 본 발명의 전이성 위암 진단용 조성물은, IL-1β, IL-6, 및 TNF-β 단백질 또는 이의 각각의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합, 또는 상기 IL-1β, IL-6, 및 TNF-β 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머, 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 발현량을 측정할 수 있는 물질은 상기 단백질 또는 이의 각각의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 항원 결합 단편, 폴리펩티드, 단백질 또는 이들의 조합일 수 있다.
용어 "항체"란 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미한다. 상기 항체는 전이성 위암 진단 바이오마커인 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 또는 PADI2 각각에 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 또는 PADI2 유전자를 발현 벡터에 클로닝하여 상기 유전자에 의해 코딩되는 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 또는 PADI2 단백질을 얻고, 얻어진 상기 단백질로부터 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 항체를 제조할 수 있다. 상기 항체의 형태는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 갖는 완전한 형태 온전한 항체의 구조를 갖지는 않지만, 항원성 부위에 대해 지시되는 특이적인 항원결합부위(결합 도메인)를 가져 항원 결합 기능을 보유하고 있는, 항체 분자의 기능적 단편 또한 포함한다.
상기 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 또는 PADI2의 발현량을 측정할 수 있는 물질은 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2를 코딩하는 각각의 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머, 뉴클레오티드 서열 또는 이들의 조합일 수 있다.
APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2 유전자의 뉴클레오티드 서열이 알려져 있으므로, 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 서열에 대해 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 당해 기술 분야의 통상적인 방법에 따라 디자인할 수 있다.
용어 "프로브"란 mRNA 등의 뉴클레오티드과 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 뉴클레오티드 단편을 의미하며, 방사성 원소 등으로 표지되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 함량(발현양)을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단일 가닥 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중 가닥 DNA(double strand DNA)프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면 전이성 위암의 바이오마커인 PADI2 유전자의 mRNA와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 정도를 통해 mRNA의 발현양을 측정함으로써 전이성 위암 진단 및 전이 가능성을 예측할 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.
용어 "프라이머"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 뉴클레오티드 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 뉴클레오티드 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라제/중합 효소 또는 역전사효소) 및 상이한 4가지의 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면 마커 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2 각각의 mRNA의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 단백질의 발현량의 측정을 통해 전이성 위암인지 여부 및 림프절 전이 가능성을 예측할 수 있다. PCR 조건, 및 프라이머 세트의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.
용어 "뉴클레오티드(nucleotide)"는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 나타내며, 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체 및 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체를 포함할 수 있다.
상기 프로브, 프라이머 또는 뉴클레오티드는 포스포르아미디트 (phosphoramidite) 고체 지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 서열은 또한 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법을 통해 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
상기 프로브, 프라이머 또는 뉴클레오티드는 길이가 10 내지 100 뉴클레오티드(이하, 'nt'라고함), 10 내지 90 nt, 10 내지 80 nt, 10 내지 70 nt, 10 내지 60 nt, 10 내지 50 nt, 10 내지 40 nt, 10 내지 30 nt, 10 내지 25 nt, 20 내지 100 nt, 30 내지 90 nt, 40 내지 80 nt, 50 내지 70 nt, 20 내지 60 nt, 20 내지 50 nt, 30 내지 40 nt, 20 내지 30 nt, 또는 20 내지 25 nt인 것일 수 있다.
상기 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2 단백질 또는 그 유전자의 mRNA 발현량은 전이성 위암, 특히 초기 위암에서 림프절 전이 위험성이 큰 경우 특이적으로 증가하므로, 상기 본 발명에 따른 전이성 위암 조성물은 위암 환자의 위암 세포에서 (또는 정상 세포와 함께 비교되어) APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2 단백질 각각의 발현량 또는 유전자 (mRNA 등) 발현량을 측정하여 전이성 위암인지 여부 진단 및 림프절로의 전이 가능성을 예측할 수 있다.
다른 양상은 본 발명의 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2의 발현량, 및 IL-1β, IL-6, 및 TNF-β의 발현량을 측정할 수 있는 상기 조성물 및 이를 검출하기 위한 시약을 포함하는 전이성 위암 진단용 키트를 제공한다.
상기 전이성 위암 진단용 키트는 전이성 위암 진단 마커인 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2 단백질의 발현량을 그 유전자의 mRNA 또는 그 단백질의 발현량을 측정함으로써 전이성 위암인지 여부를 진단 및 림프절로 전이 가능성을 예측할 수 있다. 상기 전이성 위암 진단용 키트는 앞서 설명한 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2 단백질 각각의 발현량을 측정할 수 있는 물질, 즉 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2 단백질 각각에 특이적으로 결합하는 항체, 항원 결합 단편, 폴리펩티드, 또는 단백질, APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2 단백질을 코딩하는 각각의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 뉴클레오티드, 또는 이들의 조합을 포함할 뿐만 아니라, 그 키트가 이용하는 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2 단백질 각각의 발현량을 측정하는 분석 방법에 적합한 하나 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다.
일 구체예에서 따르면, 본 발명의 전이성 위암 진단용 키트는 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2 단백질의 mRNA의 발현량을 측정하기 위한 키트일 경우, RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자의 mRNA에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 이외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시리보뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(dEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
다른 구체예에 따르면, 본 발명의 전이성 위암 진단용 키트는 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2 단백질 각각에 대해 특이적으로 결합하는 항체, 항원 결합 단편, 폴리펩티드, 단백질 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적합한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질을 포함할 수 있다. 상기 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색 기질은 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)(ABTS) 또는 o-페닐렌디아민(OPD), 테트라메틸 벤지딘(TMB) 등이 사용될 수 있다.
또 다른 구체예에 따르면, 본 발명의 키트는 단백질 또는 그 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA 발현양을 측정할 수 있는 전이성 위암 진단용 마이크로어레이일 수 있다. 상기 전이성 위암 진단용 마이크로어레이는 상기 본 발명의 마커를 이용하여 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제조할 수 있으며, 일 구체예에 따르면 상기 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2 단백질을 코딩하는 각각의 유전자의 mRNA 또는 그의 단편에 해당하는 서열의 cDNA가 프로브로서 기판에 부착되어 있는 마이크로어레이일 수 있다.
또한 본 발명의 키트는 IL-1β, IL-6, 및 TNF-β에 대해서도 상기 기재된 바와 같으며, 진단 대상 시료로부터 세포핵을 단리하기 위한 시약 또는 상기 시약을 담은 용기를 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 키트에서 언급된 용어 또는 요소 중 청구된 조성물에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 청구된 조성물에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.
다른 양상은 개체로부터 분리된 시료에 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합, 또는 상기 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머, 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 접촉시켜 복합체를 형성시키는 단계; 및 상기 복합체로부터 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 각각의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 전이성 위암을 진단하는 방법을 제공한다.
상기 진단의 대상이 되는 개체는 포유동물일 수 있다. 상기 포유동물은 사람, 마우스(mouse), 쥐(rat), 소, 염소, 돼지, 말, 양, 개, 고양이, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 개체로부터 분리된 시료는 상기 개체의 위 조직으로부터 유래된 정상 조직 및 병변 조직일 수 있다. 또한 상기 시료는 상기 조직들로부터 유래된 세포 또는 주변 세포 외액을 포함하는 것일 수 있다.
용어 "병변 조직"이란 암의 징후를 보이는 조직을 의미한다. 정상 조직은 이러한 암의 징후를 보이지 않는 부분의 조직을 의미하는 것으로서, 본 발명에서 위(stomach)로부터 유래된 조직일 수 있고, 보다 구체적으로 위점막조직일 수 있다. 일 구체예에서 상기 정상 조직 및 병변 조직은 같은 개체로부터 유래된 것일 수 있다.
일 구체예에서 본 발명의 전이성 위암을 진단하는 방법은 상기 측정된 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2 각각의 발현량을 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2의 표준 발현량과 각각 비교하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 표준 발현량은 불특정 다수의 정상 조직에서의 특정 단백질의 평균적인 발현량을 의미하는 것으로서, 예를 들어 TCGA 빅데이터와 같은 것으로부터 수득된 값의 평균을 사용할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 전이성 위암을 진단하는 방법은 상기 개체의 위 조직으로부터 유래된 정상 조직 및 병변 조직 각각으로부터 측정된 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2 각각의 발현량을 비교하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 이 경우 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2 각각의 발현량에 있어 정상 상태에서의 발현량에 대한 개인차를 극복할 수 있는 장점이 있을 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 전이성 위암을 진단하는 방법은 개체로부터 분리된 시료에서 상기 시료로부터 세포핵을 단리시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 도 8C를 참조하면 세포 중 세포질 뿐만 아니라 세포핵에도 PADI2 발현량이 높으며, 상기 PADI2 중에서도 절단된-PADI2가 세포핵에서 높게 발현하고 세포 침습(invasion)에 크게 관여함을 알 수 있다(도 9D). 따라서 세포핵을 단리하는 단계를 더 포함하는 진단 방법을 이용하는 경우 세포핵에서의 PADI2 발현량을 측정함으로써 전이성 위암의 진단 및 전이 가능성 예측에서 정확도를 더 높일 수 있다.
일 구체예에서 본 발명의 전이성 위암을 진단하는 방법은 비교된 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2 각각의 발현량이 현저하게 높은 경우, 상기 개체의 위암은 전이될 확률이 높을 것으로 진단하는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 전이성 위암 조직에서의 PADI2 발현량은 표준 발현량에 비해 3배 내지 10배 이상일 수 있고, 정상 조직의 PADI2 발현량에 비해 동일한 개체로부터 수득된 위암 조직의 PADI2 발현량이 3배 내지 10배 이상인 것일 수 있다.
일 구체예에서 본 발명의 전이성 위암을 진단하는 방법은 초기 위암에 걸린 개체를 대상으로 하는 것일 수 있다. 상기 초기 위암은 TNM 단계 시스템 기준으로 T1 내지 T2에 해당하는 것일 수 있고, N 병기로서 N0 내지 N2, N0 내지 N1, 또는 N1 내지 N2에 해당하는 경우를 더 포함할 수 있고, 바람직하게는 상기 N병기는 N0 내지 N1 일 수 있다.
일 구체예에서 본 발명의 전이성 위암을 진단하는 방법은 상기 개체로부터 분리된 시료로부터 IL-1β, IL-6, 및 TNF-β의 발현량을 측정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 즉, IL-1β, IL-6, 및 TNF-β로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이의 각각의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합, 또는 상기 IL-1β, IL-6, 및 TNF-β로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머, 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 접촉시켜 복합체를 형성시키는 단계; 및 상기 복합체로부터 IL-1β, IL-6, 및 TNF-β로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 각각의 발현량을 측정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 진단 방법에서 상기 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2 단백질 각각의 발현량 측정은, 상기 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체, 항원 결합 단편, 폴리펩티드 또는 단백질을 이용하여 단백질의 발현양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석방법으로는 웨스턴블롯팅, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석(Radioimmunoassay: RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 및 단백질 칩(protein chip) 등이 있다. 이러한 분석방법은 당해 기술분야에 통상의 지식을 가진 자가 공지된 기술을 이용하여 적절히 수행할 수 있다.
상기 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2 각각의 mRNA의 발현량은 상기 mRNA에 대해 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머 또는 뉴클레오티드를 이용하여 측정할 수 있다. 이를 위한 분석방법으로는 RT-PCR, RNase 보호 분석법(RNase protection assay: RPA), 노던블롯팅(Northern blotting), 또는 DNA 칩 등이 있다. 이러한 분석방법은 당해 기술분야에 통상의 지식을 가진 자가 공지된 기술을 이용하여 적절히 수행할 수 있다.
상기 방법에서 언급된 용어 또는 요소 중 청구된 조성물 및 키트에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 청구된 조성물 및 키트에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.
일 양상에 따른 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이의 각각의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 항원 결합 단편, 또는 폴리펩티드, 또는 상기 PADI2 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머 세트, 또는 뉴클레오티드를 포함하는 전이성 위암 진단용 조성물에 의하여 위암 초기에 림프절 전이 가능성을 예측하고 전이를 미리 예방 조치할 수 있다.
다른 양상에 따른 상기 전이성 위암 진단용 조성물 및 이를 검출하기 위한 시약을 포함하는 전이성 위암 진단용 키트에 의하여, 신속하고 편리하게 전이성 위암을 진단 및 전이 가능성을 예측할 수 있다.
또 다른 양상에 따른 개체로부터 분리된 시료에 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이의 각각의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합, 또는 상기 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머, 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 접촉시켜 복합체를 형성시키는 단계; 및 상기 복합체로부터 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 전이성 위암을 진단하는 방법에 의하여, 위암 초기에 림프절 전이 가능성을 예측하고 전이를 미리 예방 조치할 수 있다.
도 1은 위암의 각 병기별로 분류된 환자의 정상 조직과 암 조직에서 추출된 RNA를 이용하여 T1/2N3-T(tumor)에서 2배 이상 증가하는 유전자를 분리하여 Heatmap을 나타낸 것이다. (붉은색이 진할수록 fold change가 높음)
도 2는 Cufflinks v2.1.1로 계산된 값으로부터 TNM 병기 T4N0인 환자(1031, 1101, 211, 220, 및 241)에 비해 T1/2N3인 환자(0107, 0160, 0399, 0486, 및 1027)에서 유의성 있게 과발현하는 5개 유전자(APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2)에 대한 결과를 나타낸 그래프이다. (N: 정상 조직, T: 암 조직)
도 3은 26쌍의 정상 조직 및 위암 조직에서 TNM 병기에 따른 mRNA 발현량 측정하여 나타낸 것으로서, 도 3A는 전체 26명 환자의 정상 조직 및 위암 조직에서의 PADI2 발현량, 도 3B는 T4N0 환자 21명 및 T1/2N3 환자 5명의 정상 조직에서의 PADI2 발현량, 도 3C는 T4N0 환자 21명 및 T1/2N3 환자 5명의 위암 조직에서의 PADI2 발현량, 도 3D는 T4N0 환자 21명 및 T1/2N3 환자 5명의 정상 조직 대비 위암 조직에서의 PADI2 발현량을 나타낸 것이다.
도 4는 Cufflinks v2.1.1로 계산된 값으로부터 TNM 병기 T4N0인 환자에 비해 T1/2N3인 환자에서 유의성 있게 과발현하는 5개 유전자에 대해 정상 조직 및 위암 조직에서의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 5는 다양한 암종에서 암 조직 및 정상 조직에서의 PADI2 발현 여부를 TCGA 데이터베이스에 의해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 위암에서 암 조직 및 정상 조직에서의 PADI2 패밀리의 발현 여부를 TCGA 데이터베이스에 의해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 TNM 병기 기준 각 병기에 따른 PADI2 발현량을 TCGA 데이터베이스에 의해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8A는 각 위암 세포에서의 PADI2 발현량을 나타낸 것이고, 도 8B는 전장-PADI2(full-length form) 및 절단된-PADI2(truncated form)를 도식화한 것이고, 도 8C는 선별된 각 위암 세포에서의 PADI2 발현량을 단백질 수준으로 나타낸 것이고, 도 8D는 SNU0638에서의 세포질 및 핵에서의 PADI2 발현량을 단백질 수준으로 나타낸 것이다.
도 9A는 SNU-638에서 siPADI2에 의한 세포 증식 정도를 나타낸 것이고, 도 9B는 PADI2 안정 세포에서 전장-PADI2 및 절단된-PADI2에 따른 세포 증식 정도를 나타낸 것이고, 도 9C는 PADI2 활성 억제제 처리에 따른 세포 생존률 변화를 나타낸 것이고, 도 9D는 PADI2 안정 세포에서 전장-PADI2 및 절단된-PADI2에 따른 세포 침습 정도를 나타낸 것이다.
도 10A는 PADI2가 과발현하는 SNU-638, 및 전장 및 절단된-PADI2를 과발현하는 AGS 안정 세포에서 PADI2에 의한 염증 시토킨 발현을 측정한 qRT-PCR 결과를 나타낸 것이다. 도 10B는 AGS 안정 세포에서의 전장-PADI2 및 절단된-PADI2의 과발현 처리에 의한 PADI2, 도 10C는 TNF-α, IL-1β, 및 IL-6의 발현량에 대한 RT-PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 시료를 제공한 환자의 정보를 나타낸 것이다.
도 2는 Cufflinks v2.1.1로 계산된 값으로부터 TNM 병기 T4N0인 환자(1031, 1101, 211, 220, 및 241)에 비해 T1/2N3인 환자(0107, 0160, 0399, 0486, 및 1027)에서 유의성 있게 과발현하는 5개 유전자(APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2)에 대한 결과를 나타낸 그래프이다. (N: 정상 조직, T: 암 조직)
도 3은 26쌍의 정상 조직 및 위암 조직에서 TNM 병기에 따른 mRNA 발현량 측정하여 나타낸 것으로서, 도 3A는 전체 26명 환자의 정상 조직 및 위암 조직에서의 PADI2 발현량, 도 3B는 T4N0 환자 21명 및 T1/2N3 환자 5명의 정상 조직에서의 PADI2 발현량, 도 3C는 T4N0 환자 21명 및 T1/2N3 환자 5명의 위암 조직에서의 PADI2 발현량, 도 3D는 T4N0 환자 21명 및 T1/2N3 환자 5명의 정상 조직 대비 위암 조직에서의 PADI2 발현량을 나타낸 것이다.
도 4는 Cufflinks v2.1.1로 계산된 값으로부터 TNM 병기 T4N0인 환자에 비해 T1/2N3인 환자에서 유의성 있게 과발현하는 5개 유전자에 대해 정상 조직 및 위암 조직에서의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 5는 다양한 암종에서 암 조직 및 정상 조직에서의 PADI2 발현 여부를 TCGA 데이터베이스에 의해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 위암에서 암 조직 및 정상 조직에서의 PADI2 패밀리의 발현 여부를 TCGA 데이터베이스에 의해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 TNM 병기 기준 각 병기에 따른 PADI2 발현량을 TCGA 데이터베이스에 의해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8A는 각 위암 세포에서의 PADI2 발현량을 나타낸 것이고, 도 8B는 전장-PADI2(full-length form) 및 절단된-PADI2(truncated form)를 도식화한 것이고, 도 8C는 선별된 각 위암 세포에서의 PADI2 발현량을 단백질 수준으로 나타낸 것이고, 도 8D는 SNU0638에서의 세포질 및 핵에서의 PADI2 발현량을 단백질 수준으로 나타낸 것이다.
도 9A는 SNU-638에서 siPADI2에 의한 세포 증식 정도를 나타낸 것이고, 도 9B는 PADI2 안정 세포에서 전장-PADI2 및 절단된-PADI2에 따른 세포 증식 정도를 나타낸 것이고, 도 9C는 PADI2 활성 억제제 처리에 따른 세포 생존률 변화를 나타낸 것이고, 도 9D는 PADI2 안정 세포에서 전장-PADI2 및 절단된-PADI2에 따른 세포 침습 정도를 나타낸 것이다.
도 10A는 PADI2가 과발현하는 SNU-638, 및 전장 및 절단된-PADI2를 과발현하는 AGS 안정 세포에서 PADI2에 의한 염증 시토킨 발현을 측정한 qRT-PCR 결과를 나타낸 것이다. 도 10B는 AGS 안정 세포에서의 전장-PADI2 및 절단된-PADI2의 과발현 처리에 의한 PADI2, 도 10C는 TNF-α, IL-1β, 및 IL-6의 발현량에 대한 RT-PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 시료를 제공한 환자의 정보를 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1: 림프절 전이를 예측할 수 있는
바이오마커로서
PADI2의
발굴
1-1. 환자 조직 시료의 수집 및 병기의 분류
위암 초기에 림프절 전이를 예측할 수 있는 바이오마커를 발굴하기 위해 각 병기에 따라 환자를 분류하고, 상기 환자로부터 조직 시료를 수득하였다.
시료를 얻기 위해 구체적으로, 서울대학교병원에서 원발성 위선암으로 위절제술을 받은 환자에서 위절제 직후 신선한 상태의 위암 조직 및 같은 환자의 정상 위점막조직을 일부 취득하여 즉시 액체질소통에 넣어 냉동시키고, 이후 80℃ 조직저장소에 장기 보관하였다. 상기 각 시료들은 서울대학교병원위암연구소에 IRB 승인을 받아 동의서와 함께 조직저장소자료(IRB No. H-0806-072-248)로 보관하였다.
시료를 선별하기 위해 후향적 문헌 리뷰에 대한 IRB의 승인을 받은 임상데이터베이스자료(IRB No:H-0603-072-170)와 상기 조직저장소 자료를 비교대조하여, 조직저장소에 저장된 모든 조직의 임상병리 결과를 후향적으로 리뷰하면서 AJCC/UICC 제7판 TNM병기 분류 정의상 T 병기가 4기인 진행성 위암 중 림프절 전이 없는 환자군과 T병기가 1기 또는 2기이면서 림프절 전이를 의미하는 N병기가 3기인 환자군을 선별하였다. 그 후 해당 환자군의 위암 조직과 정상 위점막조직의 신선 동결조직 (fresh frozen tissue)를 해동하여 실험을 진행하였다.
따라서 각 병기는 구체적으로, 악성 종양을 분류할 수 있는 TNM 병기(TNM staging system)에 따라, T병기와 N병기로 구분하면, 총 26명의 환자 중 T병기가 높으면서 림프절 전이가 없는 환자군(T4N0, n=21), T병기가 낮으면서 림프절 전이가 높은 환자군(T1N3과 T2N3, n=5)으로 하였다. 분석을 위한 조직 시료는 상기 총 26명의 환자로부터 정상 조직(N) 및 종양 조직(T) 각각을 분리한 후 조직 내 각 후보 바이오마커의 발현량 비교 분석을 수행하였다. 각 환자의 정보는 도 11에 나타낸 바와 같다.
1-2. 후보
바이오마커의
발현량 분석을 위한 라이브러리 생성
환자로부터 수집된 조직으로부터 전체 RNA를 추출한 다음 RNA 2㎍으로부터 oligo(dT)를 이용하여 mRNA를 분리하였다. 100bp Paired-end sequencing을 위해 라이브러리 제작을 진행하였으며, 상기 환자 시료를 혼합한 후 Illumina사의 TruSeq RNA Sample Prep Kit을 이용하여 최종 라이브러리를 생성하였다.
구체적으로, 상기 분리된 mRNA를 단편화(fragmentation)시키고 무작위 6량체 프라이밍(random hexamer priming)을 통해 단일-가닥 cDNA로 합성하였다. 이를 주형으로 하여 2차 가닥을 합성하고 이중-가닥 cDNA를 합성하였다. Blunt-end를 만들기 위해 End Repair를 하고, Adapter를 붙이기 위해 A-tailing 및 Adapter ligation 하였다. 그 후 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 이용하여 cDNA 라이브러리를 증폭시켰다. 2100 BioAnalyzer를 이용하여 최종 생성물의 농도와 사이즈를 확인하였다. 생성된 라이브러리는 KAPA library quantification kit를 이용하여 최종 정량한 후 Hiseq2500을 이용하여 서열을 해독하였다.
1-3. 후보
바이오마커의
발현량 분석
해독된 서열에서 낮은 품질의 서열을 제거하기 위해 필터링을 수행하였다. 구체적으로, 서열 정보 중 N으로 나타난 염기의 비율이 전체 서열의 10% 이상 포함되어 있거나, Q20 미만의 염기가 40%이상인 리드가 제거되었으며, 평균 품질이 Q20 이하인 리드 역시 제거하였다. 필터링 전 과정은 내부에서 제작된 프로그램에 의해서 수행되었다. 필터링된 서열은 STAR v2.4.0b (Dobin et al, 2013)를 이용하여 해당 종(species) 참조 유전체 서열 (hg19)에 정렬하였다.
발현량 측정은 Cufflinks v2.1.1 (Trapnell C. et al, 2010)를 이용하여 계산하였으며, 계산된 발현값을 FPKM (fragments read per kilobase of exon per million fragments mapped)으로 표현하였다. 유전자 정보 데이터베이스로 ensemble 72를 사용하였으며, non-coding 유전자 영역은 -mask 옵션을 이용하여 발현량 측정에서 제외하였다. 발현량 측정의 정확성을 높이기 위하여 multi-read-correction 과 frag-bias-correct 옵션을 추가로 사용하였으며, 다른 옵션은 기본값을 사용하였다.
림프절 위암의 전이에 관련된 유전자를 확인하고자 Cufflinks를 통해 얻어진 전체 52 샘플들의 발현값을 이용하였다. 환자들의 정상조직과 비전이성 위암 종양조직(T4N0-T)의 전체 발현값에 비해 림프절 전이군인 T1/2N3-T에서 2배 이상, P value < 0.01로 유의성 있는 유전자를 선택하였으며 선택된 유전자는 Clustvis (Tauno M., 2015)를 이용하여 heatmap으로 나타내었다.
도 1은 선택된 78개의 유전자들을 Clustvis를 이용하여 heatmap으로 나타낸 것이다 (T4N0-N: T병기 4이면서 림프절 전이(N병기)가 없는 샘플의 정상조직, T4N0-T: T병기 4이면서 림프절 전이가 없는 샘플의 종양조직, T1/2N3-N: T병기 1또는 2이면서 N병기 3으로 림프절 전이가 있는 샘플의 정상조직, 및 T1/2N3-T: T병기 1또는 2이면서 N병기 3으로 림프절 전이가 있는 샘플의 종양조직). 상기 heatmap에서 적색에 가까울수록 높은 발현량, 청색에 가까울수록 상대적으로 낮은 발현량을 나타내는데, 적색이 진할수록 fold change가 높다. 분석 결과 PADI2가 비전이성 위암 종양조직(T4N0-T)의 전체 발현값에 비해 림프절 전이군인 T1/2N3-T에서 2배 이상 발현하는 것으로 보였으며, heatmap 중 화살표가 PADI2를 나타낸다.
도 2는 상기 선택된 유전자들 중 위암의 초기 암인 T1/2기 임에도 림파선 전이가 나타난 환자 (N3) (0107, 0160, 0399, 0486, 및 1027로 나타냄)와 4기 위암 (T4)임에도 림파선 전이가 나타나지 않은 환자 (N0) (1031, 1101, 211, 220, 및 241로 나타냄)에서 유의성이 있는 5개의 유전자를 선정하여 발현값을 나타낸 것이다. APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2를 선정하여 정상 조직(N) 및 암 조직(T)을 비교한 결과, 선정된 유전자 모두 T1/2N3에서 거의 일관되게 높게 발현하였으며, 그 중 PADI2가 가장 유의하면서도 현저한 차이를 보이며 암 조직에서 높게 발현하는 것으로 나타났다.
또한 도 4를 참조하면, TNM 병기 T4N0인 환자에 비해 T1/2N3인 환자에서 유의성 있게 과발현하는 5개 유전자에 대해 정상 조직 및 위암 조직에서의 발현량을 비교해본 결과에서 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, NMU 및 PADI2 모두 T1/2N3인 환자에서 T4N0인 환자에 비해 과발현하였으며, 특히 각 병기 내 정상 조직 및 위암 조직을 비교한 경우 T1/2N3인 환자에서 현저한 차이를 보이는 것을 알 수 있다.
실시예
2: 림프절 전이
바이오마커로서
PADI2의
mRNA
분석
2-1.
mRNA
추출 및 cDNA 합성
PADI2가 림프절 전이 바이오마커로서 역할 할 수 있는지 알아보기 위해 26쌍의 정상 점막 조직 및 위암 조직에 대하여 qRT-PCR을 수행하였다. 먼저 각 조직으로부터 RNA를 추출하고 cDNA를 합성하였다.
구체적으로, 총 RNA를 추출하기 위해 액체질소에 동결 보관된 26쌍의 정상 점막 조직 및 위암 조직을 약 2mm3 취하여 막자사발로 분쇄한 후, Trizol 시약 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 1mL을 넣고 조직이 완전히 녹을 때까지 혼합하였다. 클로로포름 (Chloroform) 200㎕를 첨가하여 원심분리 후 상층액을 이소프로판 (Isopropan) 500㎕와 혼합하였고, 다시 원심분리하여 침전된 RNA 펠렛(pellet)을 확인하였다. 75% 에탄올(Ethanol) 1mL로 펠렛을 씻어준 뒤 다시 원심분리하여 RNA 펠렛을 건조시키고 RNase가 없는 증류수를 첨가하였다. RNA의 품질을 측정하기 위해 전기영동과 분광광도계 (Nanodrop 2000, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA)를 이용하여 흡광도 측정하였다. cDNA 합성에는 500ng의 RNA를 이용하였고 TOP script cDNA synthesis kit (Enzynomics, Daejeon, Korea)을 이용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 수행하였다.
2-2. 실시간
중합효소연쇄반응
(RT-
PCR
)
PADI2 유전자의 발현을 분석하기 위해 StepOne Plus Real-Time PCR system (Applied Biosystems, Carlsbad, CA)을 통해 상대정량법을 이용한 실시간 정량적 중합효소연쇄반응 (Quantitative real-time PCR)을 수행하였다. 이 반응은 10㎕의 2X SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Monza, Italy), 각 프라이머 2.5pmole/㎕ 및 1㎕의 cDNA를 첨가하여 총 20㎕로 반응시켰다. PCR 반응 조건은 95℃에서 10분간 초기 변성시킨 후 95℃에서 15초, 60℃ 15초, 및 72℃ 1분을 1회 반복으로 하여 40회 반복 시행하였다. 산출된 Ct값 (Threshold cycle)을 이용하여 유전자 발현을 정량화하였고, 각 샘플에서의 PADI2 발현은 GAPDH 발현 값으로 보정하였다. 사용된 프라이머 서열은 표 1과 같다.
Gene | Forward primer (5'→3') | Reverse primer (5'→3') |
GAPDH | TCTCAGGCCTGGTCTCCAT | AAGATGGGAGTCAGGGGAAT |
PADI2 | CATTTCCTGGTATGACAACGA | CTTCCTCTTGTGCTCTTGCT |
그 결과, 도 3에서 나타낸 바와 같이 PADI2 mRNA가 정상 점막 조직에 비해 위암 조직에서 유의하게 발현이 높았다 (p = 0.047, 도 3A). T 병기 및 N 병기를 보다 세부적으로 구분하여 환자를 두 군 (T4N0; n=21 및 T1/2N3; n=5)으로 분류하였다. 정상 점막 조직에서의 PADI2 발현은 두 군에서 차이를 보이지 않았지만 (p = 0.981, 도 3B), 위암 조직에서의 PADI2 발현은 T4N0 군에 비해 T1/2N3 군에서 통계적으로 유의하게 높은 발현(약 5배의 차이)을 보였다 (p < 0.001, 도 3C). 또한, 각 환자에서 정상 점막 조직에서의 PADI2 발현에 대해 위암 조직에서의 PADI2 발현을 비율로 계산했을 때도 마찬가지로 두 군 간에 유의한 차이(약 4배 내지 5배의 차이)를 보였다 (p = 0.022, 그림 3D). 따라서 PADI2의 mRNA 발현량으로 측정된 값이 PADI2의 과발현의 지표로서 이용될 수 있으며, 림프절 전이가 높은 조기 위암에서 PADI2가 바이오마커로 기능할 수 있음을 알 수 있다.
실시예
3: 빅 데이터 분석에 의한 림프절 전이
바이오마커로서
PADI2의
평가
3-1. The Cancer Genome Atlas (
TCGA
)
빅데이터
분석
PADI2가 림프절 전이 바이오마커로서 역할 할 수 있는지 알아보기 위해 The Cancer Genome Atlas (TCGA) 빅데이터 분석을 수행하였다. TCGA는 인간 게놈 프로젝트의 가장 중요한 연구로서, 미국 국립보건원 (National Institutes of Health) 주도로 대규모 암 환자의 유전체를 분석하여 빅데이터 형태로 전세계 연구자들에게 공개한 연구이다. TCGA 홈페이지 (https://cancergenome.nih.gov) 및 UCSC Cancer Browser 홈페이지 (https://genome-cancer.ucsc.edu)에는 10,000명 이상의 환자들의 임상정보와 함께, 유전자 돌연변이, 메틸레이션 프로파일 (methylation profile), 유전자 발현정보에 대해서 기초 데이터 (raw data)부터 정돈된 데이터 (processed data)까지 모든 자료를 다운로드 받을 수 있다. 본 발명자들은 RNA 발현이 공개된 모든 데이터를 다운로드 받았으며, 총 31개의 암종(도 5 하단 참조)에서 8,981개의 암조직 및 686개의 정상조직에서의 RNA 발현 자료를 분석하였다. 그 중 위암의 경우 401개의 암조직 및 35개의 정상조직을 분석하였다. 해당 조직의 암 병기 정보는 같이 공개되어 있는 임상정보 자료를 참고하였다. 두 군 간의 유전자 발현 정도의 차이는 Wilcoxon rank sum법을 이용하여 분석하였고, 여러 군에서 유전자 발현 정도의 차이는 ANOVA법으로 분석 후 Tukey법을 이용하여 각 군 간의 차이를 분석하였다. P value가 0.05보다 작을 경우 통계적으로 의미가 있는 것으로 간주하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 갑상선암(THCA; thyroid carcinoma), 담관암(CHOL; cholangiocarcinoma), 식도암(ESCA; esophageal carcinoma), 자궁경부암(CESC; cervical cancer), 및 위암(STAD; stomach adenocarcinoma)에서 이러한 현상이 확인되었으나, 위암에서 특히 PADI2의 발현이 정상 조직에 비해 암 조직에서 현저하게 높게 나타나는 것으로 확인되었다 (P < 0.001). 또한, PADI2 유전자와 같은 패밀리인 PADI1, PADI3, 및 PADI4의 발현을 위암 조직 및 위 정상조직과 비교한 결과 (도 6), PADI1 및 PADI3는 암 조직에서 정상조직보다 유의하게 발현이 증가하는 것으로 보였으나, PADI4의 경우는 반대로 암 조직에서 오히려 발현이 감소하였다.
상기 TCGA 데이터베이스에서 확인된 PADI2 발현의 증가 여부가 위암의 병기에 따라 차이가 있는지 확인하기 위하여, 임상정보와 연관지어 분석을 수행하였다 (도 7). 그 결과 T 병기에 따라서 PADI2의 발현이 차이가 있음을 확인하였다 (P < 0.001). 그 중에서도 특히 T1 과 T2 사이에서의 차이가 가장 유의하게 나타났다 (P = 0.007). N 병기에 따라서도 PADI2의 발현이 차이가 있었으나 (P < 0.001), 그 차이는 주로 정상 조직과 N1 병기 환자의 암 조직 (P = 0.036), 및 정상 조직과 N2 병기 환자의 암 조직 (P = 0.011)간에 나타났으며, 그 외에는 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다. 따라서, 위암에서 PADI2의 과발현 여부를 측정함으로써 위암 초기, 적어도 TNM 병기로 구분하는 경우 T1 내지 T2 병기의 환자에서 림프절 전이 여부를 예측할 수 있으며, PADI2가 림프절 전이 단계 중에서도 초기 (적어도, N0 내지 N1)에 림프절 전이 바이오마커로서 기능함으로써 림프절 전이 여부를 예측하는데 훌륭한 바이오마커로서 기능할 수 있음을 알 수 있다.
실시예
4.
PADI2
발현 위치 측정
4-1. 세포주 및 세포 배양
PADI2 발현 위치 분석을 위한 세포를 선별하기 위해, 실시예 1-3에서와 같이 유전자 데이터 베이스 상에서 분석하여 PADI2가 과발현하는 SNU-638, 및 PADI2가 거의 발현되지 않는 SNU-719 및 AGS를 선발하였다 (도 8A 참조)
추가 실험을 위해, 인간 위암세포 SNU-638 및 SNU-719는 Korean Cell Lline Bank (Seoul, Korea)로부터 구입하였고, AGS는 American Type Culture Collection (ATCC) (Virginia, USA)로부터 구입하였다. 모든 위암세포는 10% fetal bovine serum (FBS, WelGENE) 및 1% penicillin/streptomycin이 첨가된 RPMI1640 배지 (WelGENE)에 5% CO2 습윤배양기로 37℃에서 배양하였다.
4-2. 시약 및 항체
PADI2항체는 Proteintech (12110-1-AP)에서 구입하였고 α-tubulin (b-7) 그리고 Lamin B (c-20)의 항체는 Santa Cruz Technology에서 구입하였다. β-actin 항체는 Sigma-aldrich (A2228)에서 구입하였다.
4-3. 세포핵 및 세포질의 분획, 및
웨스턴
블롯
세포로부터 세포핵 및 세포질을 분획하기 위해 세포를 차가운 PBS로 두 번 세척한 뒤 M-PERTM Mammalian Protein Extract Reagent (ThermoFisher Scienctific, 78501)에 Phosphatase 와 protease 억제제를 첨가한 완충액으로 세포를 파쇄한다. 세포 파쇄액을 13,000 rpm/min으로, 4℃에서 20분간 원심분리하여 정화하였다. 그 상등액을 회수하여 BCA 단백질 정량 레포트 방법으로 전체 단백질의 농도를 측정하였다. 동량의 세포 단백질을 95℃에서 5분간 가열하고 SDS-PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리한 후, PVDF(polyvinylidene difluoride) 막으로 옮겼다. 그 막들을 0.05% (v/v) Tween 20 및 5% (w/v) 탈지분유를 함유한 Tris-버퍼 식염수로 1시간 블로킹한 후 적당한 항체들로 배양한 후, 1차 항체를 첨가하고 냉실에서 밤새 인큐베이션하였다. 1차 항체 결합을 Horseradish peroxidase-부착된 염소 항-마우스 또는 항-래빗 면역글로빈 G 2차 항체(Merck Millipore)를 사용하여, Chemiluminscent Substrate (GE, Visual Protein Biotechnology Corporation, LF08-500)로 시각화시켰다.
그 결과, 도 8C에 나타난 바와 같이 PADI2가 두 사이즈로 측정됨으로써 전장 형태(full-length form)와 절단된 형태(truncated form)가 존재하는 것을 알 수 있었다. 또한, 도 8D에 나타낸 바와 같이 세포질에서는 전장 형태가, 핵 내에서는 절단된 형태가 주로 존재하는 것으로 보였다.
실시예
5.
PADI2에
의한 세포 생존 평가 및 세포 침습 평가
5-1. 안정 세포주 (stable cell line) 제조
human PADI2 유전자 cDNA를 SNU-638 세포주의 cDNA로부터 PCR를 이용하여 증폭시킨 뒤 pFLAG-CMV-6c vector의 EcoRI과 SalI 제한 효소 부위에 도입하여 Flag-cPADI2(전장-형태)와 Flag-nPADI2(절단된-형태)로 발현 플라스미드를 제작하였다.
PADI2 유전자의 과잉발현을 유도하기 위하여 Lpcx vector의 XhoI과 ClaI 제한 효소 부위에 상기 Flag-cPADI2(전장-형태)와 Flag-nPADI2(절단된-형태)를 도입하여 레트로바이러스 플라스미드를 제작하였다.
상기 플라스미드에서 PADI2는 도 8B에 도시한 바와 같이 도메인에 따라 뉴클레오티드 서열 정보 NM_007365.2 (전장-PADI2) 및 절단된-PADI2(BC009701.1)에 따라, 전장-PADI2 (서열번호 14의 아미노산 서열 중 1 내지 625번)및 절단된-PADI2 (서열번호 14의 아미노산 서열 중 1 내지 437번)으로 하여 각각 LPCX-전장-PADI2(cPADI2) 및 LPCX-절단된-PADI2(nPADI2) 플라스미드로 제작하였다.
사용된 프라이머는 표 2 및 표 3에 기재된 바와 같다.
Flag-cPADI2 | Flag-nPADI2 | |
Forward Primer | AAAGAATTCATGCTGCGCGAGCGGACCGT | AAAGAATTCATGCTGCGCGAGCGGACCGT |
Reverse Primer | AAAGTCGACTCAGGGCACCATGTGCCACC | GATCGTCGACTGACAGAGGAAAGCTGCTCCCGAT |
Lpcx-flag-cPADI2 | Lpcx-flag-nPADI2 | |
Forward Primer | GATCCTCGAGATGGACTACAAAGACGATGACGAC | GATCCTCGAGATGGACTACAAAGACGATGACGAC |
Reverse Primer | GATCATCGATCTAGGGCACCATGTGCCACCACTT | GATCATCGATCTACAGAGGAAAGCTGCTCCCGAT |
바이러스 생산 숙주 세포로는 GP2-293 세포주를 사용하였다. 형질주입 24시간 전에 GP2-293 세포주를 100-mm 배양 접시에 접종하였다. 10㎍ DNA와 5㎍ VSV-G를 Polyethylenimine (PEI)를 이용하여 형질주입시켰다. 형질주입한 후 48시간 후에 세포 배양물로부터 virus soup을 수거하여 0.45-㎛ 필터를 사용하여 정제하였다. 정제한 바이러스의 3-3.5ml를 8mg/ml polybrene과 함께 AGS (1x105 cells/100-mm culture dish)에 처리하였고, 이를 8시간 간격으로 세 번 반복하였다. 상기 바이러스를 감염시킨 후, 새로운 배지로 갈아준 뒤 24시간 후에 2 ㎍/ml puromycin으로 감염된 세포를 선택하였다.
도 8E 및 8F와 같이 AGS 안정 세포를 실시예 4-3과 같이 세포 전체, 세포질 및 세포 핵에서의 PADI2 발현량을 측정해본 결과, 실시예 4에서의 결과와 일치하여, 전장-PADI2는 세포질, 절단된-PADI2는 세포핵에서 주로 발현되는 것을 나타났다.
반면 상기 안정 세포를 배양하며 6일간 이틀마다 카운팅한 결과, 도 9B와 같이 절단된-PADI2가 과발현되는 경우 세포 증식 속도가 현저하게 증가하는 것으로 보였다.
5-2.
siRNA를
이용한
PADI2
발현 억제시 세포 증식 속도 평가
실시예 4-1에 따른 SNU-638 세포를 준비하고, siRNA를 이용하여 PADI2의 발현을 억제한 후 세포 증식 속도를 평가하였다.
구체적으로, SNU-638 세포를 배양 접시의 60 내지 80% 밀도가 되도록 접종하였다. 다음날, Opti-MEM medium (Gibco, 31985070)에 siRNA 형질주입 시약과 siRNA(를 1:3 비율로 넣고 5분간 인큐베이션 하였다. 상기 혼합물을 세포 배지에 넣고 1 내지 3일 정도 37℃에서 인큐베이션 하였다. PADI2 siRNA는 Thermo Fisher Scientific (4392420)에서 구입하였고 이의 형질주입 시약은 invitrogen (13778-075)에서 구입하였다.
그 결과, 실시예 5-1의 결과와 일치하여 도 9A와 같이 PADI2 발현을 억제하는 경우 대조군에 비하여 세포 증식 속도가 감소함을 알 수 있다.
5-3.
PADI2
활성 억제시 세포
생존률
평가
실시예 4-1에 따라 PADI2를 과발현하는 SNU-638 및 PADI2를 거의 발현하지 않는 SNU-719를 준비한 후, PAD 저해제인 Cl-amidine은 Merck Millipore (506282-10MGCN)로부터 구입하여 세포에 도 9C에 표시된 농도대로 처리하였다.
구체적으로, PADI2 저해제인 Cl-amidine에 의한 세포 독성을 측정하기 위해 노란색의 수용성 기질인 MTT tetrazolium을 탈수소 효소작용에 의하여 보라색을 띄는 비수용성의 MTT formazan으로 환원시키는 미토콘드리아의 능력을 측정함으로써 세포 생존율을 분석할 수 있는 MTT 분석을 수행하였다. SNU-638 (high PADI2) 세포주 및 SNU-719 (low PADI2) 세포주 각각을 96well plate에 2 X 105 cell로 접종하여 인큐베이션하고, Cl-amidine을 각각 정해진 농도(도 9C에 나타낸)로 처리 후 96시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후 상기 세포 배양물에 1/10의 MTT용액을 첨가하여 4시간 동안 인큐베이션 하였다. 상기 세포 배양물로부터 배양액을 조심스럽게 제거하고 각 well에 200㎕ DMSO를 첨가하여 30분 동안 인큐베이션한 후, microplate reader에서 540nm 파장을 이용하여 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 9C와 같이, PADI2를 과발현하는 SNU-638 및 PADI2를 거의 발현하지 않는 SNU-719의 경우, 모두 Cl-amidine 처리에 의해 세포 생존률이 감소하였다. 그러나, 실시예 5-1 및 5-2의 결과와 일치하여, PADI2를 과발현하는 SNU-638이 그렇지 않은 SNU-719보다 PADI2 저해제에 민감하게 반응하여 세포 생존률이 감소하는 것으로 나타났다.
5-4. 세포 침습 분석
세포 침습 분석을 위해 BioCoat Matrigel invasion chamber (Corning, 354578)을 이용하였다. 실시예 5-1의 PADI2 과발현 안정 세포를 FBS 세럼이 없는 배지에 24시간 배양한 뒤 상기 세포를 Traswell의 위쪽 부분에 1×105 cell로 넣어준다. Transwell 아래쪽 부분은 세럼(serum)이 존재하는 배지를 넣고, 세포가 존재하는 위쪽 부분은 세럼이 없는 배지 조건으로 세포를 배양하였다. 24시간 후 chamber 안에 남아있는 세포들을 면봉으로 닦아 주었다. Trasnwell 아래 부분으로 이동한 세포를 염색하기 위해서 먼저 70% 에탄알로 10분간 고정시킨 후, 에탄알을 제거하고 말린 뒤 0.05% crystal violet을 이용하여 이동한 세포를 염색시켰다. 그 후, 이동한 세포의 수를 현미경으로 관찰한 후 무작위로 4부분의 사진 이미지를 수득하여 이동한 세포의 수를 측정하였다.
그 결과, 도 9D와 같이 침습이 PADI2를 과발현하는 경우 세포 침습률이 대조군에 비해 급격히 증가하는데, 특히 절단된-PADI2를 과발현한 경우 침습률이 현저하게 증가함을 알 수 있다.
따라서, 위암 세포에서 PADI2가 과발현하는 경우 세포 증식률이 증가하고, 세포 침습이 증가하므로 전이성 위암을 진단 및 전이 가능성을 예측하는데, PADI2가 훌륭한 마커가 될 수 있음을 알 수 있다.
특히, 세포핵에서의 PADI2 과발현 또는 절단된-PADI2의 과발현 여부는 전이성 위암을 진단 및 전이 가능성을 예측하는 정확도를 더 높일 수 있는 마커가 될 수 있음을 알 수 있다.
실시예
6. 전이성 위암
바이오마커로서
PADI2
측정시
보조인자
발굴
6-1. 세포주 및
siRNA
처리
실시예 5-1의 AGS 안정 세포 및 실시예 5-2의 siRNA를 처리한 SNU-638을 준비하였다.
6-2. RNA의 추출 및
qRT
-
PCR
(quantitative Reverse
Transcriptase
PCR
)
실시예 6-1의 세포로부터 제조자의 지침에 따라 RNA를 추출하였다. 총 RNA는 easy-BLUE total RNA extreactio kit (promega, 17061)를 사용하여 추출하였다. 2㎍의 추출한 RNA를 올리고 dT 프라이머, 연전사효소 (promega, M1705) 및 효소의 버퍼를 이용하여 cDNA를 제조하였다. 상기 cDNA를 주형으로 이용하여 보고자하는 유전자 특이적 프라이머 쌍을 이용하여 AccuPowerTM PCR PreMix kit (Bioneer Co., Daejon, S. Korea)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 그런 다음, PCR 증폭 산물을 전기영동하고, 밴드를 분석하여 타겟 유전자의 발현량 변화를 측정하였다. 상기 qRT-PCR에 사용된 프라이머 쌍은 표 4와 같다.
Target gene | Forward Primer | Reverse Primer |
PADI2 | TGAGAGCCTCGTGCAAGAGAACC | CGTGAGCCCCAACTCCTTCTTG |
IL-6 | GTAGCCGCCCCACACAGA | CATGTCTCCTTTCTCAGGGCTG |
IL- 1β | AATCTGTACCTGTCCTGCGTGTT | TGGGTAATTTTTGGGATCTACACTCT |
TNF -α | TCTTCTCGAACCCCGAGTGA | CCTCTGATGGCACCACCAG |
18S | CCCAACTTCTTAGAGGGACA | TAGTCAAGTTCGACCGTCTT |
qRT-PCR 결과는 도 10A에 나타낸 바와 같다. PADI2 과발현에 따라서 염증 시토킨인 TNF-α, IL-1β, 및 IL-6의 발현량이 증가하였다.
6-3.
PADI2
과발현에 따른 염증
시토킨의
mRNA
발현량 측정
PADI2가 과발현함에 따라 염증 시토킨의 발현량을 mRNA 수준에서 평가하기 위해 RT-PCR을 수행하였다.
구체적으로, 정량적 실시간 PCR (quantitative real-time PCR)은 ViiATM7 Real-time PCR systems (Applied Biosystems) 상에서 SYBR Premix Ex Taq II(TAKARA, RR820A)를 사용하여 수행하였다. 앞서 제조된 cDNA를 1/5로 희석한 뒤, 타겟 유전자 특이적 프라이머 쌍과 2x SYBR premix와 함께 혼합하여 인큐베이션 시켰다. 이때 다양한 유전자의 mRNA 수준은 3배수로 측정하고, GAPDH RNA로 보정하였다. 본 실시예의 RT-PCR에 사용된 프라이머 쌍은 표 5와 같다.
Target gene | Forward Primer | Reverse Primer |
cPADI2 | ATGGAGAGGCCATCATGTTC | TGTCAGTCCCAGCTCCTTCT |
nPADI2 | ACTCTCCCCGAGATGGAAAC | GAATAATTCCCCCAGCCACT |
IL-6 | CTCTGGGAAATCGTGGAAAT | CCAGTTTGGTAGCATCCATC |
IL- 1β | GGACAAGCTGAGGAAGATGC | TCTTTCAACACGCAGGACAG |
TNF -α | TGCTTGTTCCTCAGCCTCTT | TGAGGTACAGGCCCTCTGAT |
GAPDH | CCATCTTCCAGGAGCGAGAT | GTGTCAGGTACGGTAGTGAC |
RT-PCR 결과는 도 10B 및 도 10C에 나타낸 바와 같다. 전장-PADI2 및 절단된-PADI2의 과발현에 따라 상기 실시예 6-2에서와 같이 염증 시토킨인 TNF-α, IL-1β, 및 IL-6의 발현량이 증가하는 것을 알 수 있다. 따라서 림프절 전이성 위암을 예측하기 위한 바이오마커로서 PADI2를 측정시 그 보조 인자로서 TNF-α, IL-1β, 및 IL-6가 좋은 후보가 될 수 있음을 알 수 있다.
<110> AICT (ADVANCED INSTITUTES OF CONVERGENCE TECHNOLOGY)
<120> Marker for predicting lymph node metastasis and method for
predicting lymph node metastasis using same
<130> PN116685
<160> 26
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 4363
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
gcaggctgct ggagaaggcg cacctgctgc aggtgctccc ggccgccccg gaccagcgag 60
cgcgggcact gcggcgggga ggatgctgcg cgagcggacc gtgcggctgc agtacgggag 120
ccgcgtggag gcggtgtacg tgctgggcac ctacctctgg accgatgtct acagcgcggc 180
cccagccggg gcccaaacct tcagcctgaa gcactcggaa cacgtgtggg tggaggtggt 240
gcgtgatggg gaggctgagg aggtggccac caatggcaag cagcgctggc ttctctcgcc 300
cagcaccacc ctgcgggtca ccatgagcca ggcgagcacc gaggccagca gtgacaaggt 360
caccgtcaac tactatgacg aggaagggag cattcccatc gaccaggcgg ggctcttcct 420
cacagccatt gagatctccc tggatgtgga cgcagaccgg gatggtgtgg tggagaagaa 480
caacccaaag aaggcatcct ggacctgggg ccccgagggc cagggggcca tcctgctggt 540
gaactgtgac cgagagacac cctggttgcc caaggaggac tgccgtgatg agaaggtcta 600
cagcaaggaa gatctcaagg acatgtccca gatgatcctg cggaccaaag gccccgaccg 660
cctccccgcc ggatacgaga tagttctgta catttccatg tcagactcag acaaagtggg 720
cgtgttctac gtggagaacc cgttcttcgg ccaacgctat atccacatcc tgggccggcg 780
gaagctctac catgtggtca agtacacggg tggctccgcg gagctgctgt tcttcgtgga 840
aggcctctgt ttccccgacg agggcttctc aggcctggtc tccatccatg tcagcctgct 900
ggagtacatg gcccaggaca ttcccctgac tcccatcttc acggacaccg tgatattccg 960
gattgctccg tggatcatga cccccaacat cctgcctccc gtgtcggtgt ttgtgtgctg 1020
catgaaggat aattacctgt tcctgaaaga ggtgaagaac cttgtggaga aaaccaactg 1080
tgagctgaag gtctgcttcc agtacctaaa ccgaggcgat cgctggatcc aggatgaaat 1140
tgagtttggc tacatcgagg ccccccataa aggcttcccc gtggtgctgg actctccccg 1200
agatggaaac ctaaaggact tccctgtgaa ggagctcctg ggcccagatt ttggctacgt 1260
gacccgggag cccctctttg agtctgtcac cagccttgac tcatttggaa acctggaggt 1320
cagtccccca gtgaccgtga acggcaagac atacccgctt ggccgcatcc tcatcgggag 1380
cagctttcct ctgtctggtg gtcggaggat gaccaaggtg gtgcgtgact tcctgaaggc 1440
ccagcaggtg caggcgcccg tggagctcta ctcagactgg ctgactgtgg gccacgtgga 1500
tgagttcatg tcctttgtcc ccatccccgg cacaaagaaa ttcctgctac tcatggccag 1560
cacctcggcc tgctacaagc tcttccgaga gaagcagaag gacggccatg gagaggccat 1620
catgttcaaa ggcttgggtg ggatgagcag caagcgaatc accatcaaca agattctgtc 1680
caacgagagc cttgtgcagg agaacctgta cttccagcgc tgcctagact ggaaccgtga 1740
catcctcaag aaggagctgg gactgacaga gcaggacatc attgacctgc ccgctctgtt 1800
caagatggac gaggaccacc gtgccagagc cttcttccca aacatggtga acatgatcgt 1860
gctggacaag gacctgggca tccccaagcc attcgggcca caggttgagg aggaatgctg 1920
cctggagatg cacgtgcgtg gcctcctgga gcccctgggc ctcgaatgca ccttcatcga 1980
cgacatttct gcctaccaca aatttctggg ggaagtccac tgtggcacca acgtccgcag 2040
gaagcccttc accttcaagt ggtggcacat ggtgccctga cctgccaggg gccctggcgt 2100
ttgcctcctt cgcttagttc tccagaccct ccctcacacg cccagagcct tctgctgaca 2160
tggactggac agccccgctg ggagaccttt gggacgtggg gtggaatttg gggtatctgt 2220
gccttgccct ccctgagagg ggcctcagtg tcctctgaag ccatccccag tgagcctcga 2280
ctctgtccct gctgaaaata gctgggccag tgtctctgta gccctgacat aaggaacaga 2340
acacaacaaa acacagcaaa ccatgtgccc aaactgctcc ccaaagaatt ttgagtctct 2400
aatctgacac tgaatgaggg gagaagggaa ggagattctg ggattgccag ttcttccagc 2460
agccatgctc tgaaaatcaa ggtagaatcc atggaaaggg accccaggac cccgggaccc 2520
tagacgtatc ttgaactgcc atcgtcattt caaatacatc tccctcaggg tttccaggtg 2580
gccaccccca attattcatt ccttaccaac ctctcaaatc ctcttggctt tctctctgca 2640
gtgtggacac tgttggctag tcctccccac tccctgaggg tccagtaagt tagcttagaa 2700
ccttcctgga aacatttcat ctgagcaggt ttccccacgt gtgggatgct ccttttgcct 2760
catctgtctc agggatgcag gctcccccgc atgcatgggg atttctcccc agaccagcat 2820
acttgtgacc tgagagttca atgcgtaaag atgcccctgg tcagccatat ccatcttctc 2880
ttgcctggtc cttgattctc tggccgctcc ctgaccttcc tccttccact gccttgactt 2940
tcttcctttt tattcctggt gccatctgtc caggcagcta gacaagaact tgttcgccag 3000
cagccagatt caggccttcc caggggcata ataagtgacc agcccctcct ctccggacat 3060
cagatccaac acataaggac cctggcctac cctccagccc aacagccagt tctgggtcag 3120
ctgccaactt aggggtggtt tgattatccc attgaaattc accagtgcct ttgccaaaga 3180
ccctctcatt tggacatacc cagattcatt ccctggctcc aactgaaaag actcagtttc 3240
aatcgttaaa agttccttta gggccagaag aataaatgaa ttataatccc attttgaaga 3300
accgatttat aaccaatgaa aaggttataa tgtaatttat attcttggag gaacaagatt 3360
ttcatttggg attatttcct tcaaccattc aacaaacatt tgttgtatgc cactaagcgc 3420
caggcacggc gttgggctct gcaaacacag tggttagtag cagtctggac ctggtcccta 3480
ctggcatgga acccatcact ccccaacatg caaagcccac atttaaaggc cagcctctgc 3540
cccttcagtg atgcgctctt tagaaatgcc agtccactat attcagaaat ccgcagggca 3600
caaaacttcc agcaagtcac tgttgtggtg aaatgggcag tgggggtggg gggtcttctt 3660
taaacaggcc cccttcccat ctacctagcc agtacccatc caatgagtcc ccagagcctc 3720
cagaagctgt tgtctcctct ctggggacag cagctcctgc ctttggaggc caaagcccca 3780
gatctctcca gccccagagc tgaaaacacc aagtgcctat ttgagggtgt ctgtctggag 3840
acttagagtt tgtcatgtgt gtgtgtgtgt ttggttaatg tgggtttatg ggttttcttt 3900
cttttttttc tttttttttt tagtctacat tagggggaag tgagcgcctc ccatgtgcag 3960
acagtgtgtc tttatagatt tttctaaggc tttccccaat gatgtcggta atttctgatg 4020
tttctgaagt tcccaggact cacacacccg ttcccatctc acttgcccac ccagtgtgac 4080
aaccctcggt gtggatatac ccccgtggac tcatggctct tccccacccc cactttctat 4140
aaatgtaggc ctagaatacg cttctctgtt gcaaaactca gctaagttcc tgcttccacc 4200
ttgatgttga aatatcttat gtaagagggc aggggatgtc gtgaagatgg caagaagaac 4260
acagtttcaa atttctggaa aagagcctgt ggtggagatc taaagatgtt tagggaagag 4320
ctcgactaaa gaacaatgaa ataaatggtc caaggggaag tca 4363
<210> 2
<211> 1998
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
atgctgcgcg agcggaccgt gcggctgcag tacgggagcc gcgtggaggc ggtgtacgtg 60
ctgggcacct acctctggac cgatgtctac agcgcggccc cagccggggc ccaaaccttc 120
agcctgaagc actcggaaca cgtgtgggtg gaggtggtgc gtgatgggga ggctgaggag 180
gtggccacca atggcaagca gcgctggctt ctctcgccca gcaccaccct gcgggtcacc 240
atgagccagg cgagcaccga ggccagcagt gacaaggtca ccgtcaacta ctatgacgag 300
gaagggagca ttcccatcga ccaggcgggg ctcttcctca cagccattga gatctccctg 360
gatgtggacg cagaccggga tggtgtggtg gagaagaaca acccaaagaa ggcatcctgg 420
acctggggcc ccgagggcca gggggccatc ctgctggtga actgtgaccg agagacaccc 480
tggttgccca aggaggactg ccgtgatgag aaggtctaca gcaaggaaga tctcaaggac 540
atgtcccaga tgatcctgcg gaccaaaggc cccgaccgcc tccccgccgg atacgagata 600
gttctgtaca tttccatgtc agactcagac aaagtgggcg tgttctacgt ggagaacccg 660
ttcttcggcc aacgctatat ccacatcctg ggccggcgga agctctacca tgtggtcaag 720
tacacgggtg gctccgcgga gctgctgttc ttcgtggaag gcctctgttt ccccgacgag 780
ggcttctcag gcctggtctc catccatgtc agcctgctgg agtacatggc ccaggacatt 840
cccctgactc ccatcttcac ggacaccgtg atattccgga ttgctccgtg gatcatgacc 900
cccaacatcc tgcctcccgt gtcggtgttt gtgtgctgca tgaaggataa ttacctgttc 960
ctgaaagagg tgaagaacct tgtggagaaa accaactgtg agctgaaggt ctgcttccag 1020
tacctaaacc gaggcgatcg ctggatccag gatgaaattg agtttggcta catcgaggcc 1080
ccccataaag gcttccccgt ggtgctggac tctccccgag atggaaacct aaaggacttc 1140
cctgtgaagg agctcctggg cccagatttt ggctacgtga cccgggagcc cctctttgag 1200
tctgtcacca gccttgactc atttggaaac ctggaggtca gtcccccagt gaccgtgaac 1260
ggcaagacat acccgcttgg ccgcatcctc atcgggagca gctttcctct gtctggtggt 1320
cggaggatga ccaaggtggt gcgtgacttc ctgaaggccc agcaggtgca ggcgcccgtg 1380
gagctctact cagactggct gactgtgggc cacgtggatg agttcatgtc ctttgtcccc 1440
atccccggca caaagaaatt cctgctactc atggccagca cctcggcctg ctacaagctc 1500
ttccgagaga agcagaagga cggccatgga gaggccatca tgttcaaagg cttgggtggg 1560
atgagcagca agcgaatcac catcaacaag attctgtcca acgagagcct tgtgcaggag 1620
aacctgtact tccagcgctg cctagactgg aaccgtgaca tcctcaagaa ggagctggga 1680
ctgacagagc aggacatcat tgacctgccc gctctgttca agatggacga ggaccaccgt 1740
gccagagcct tcttcccaaa catggtgaac atgatcgtgc tggacaagga cctgggcatc 1800
cccaagccat tcgggccaca ggttgaggag gaatgctgcc tggagatgca cgtgcgtggc 1860
ctcctggagc ccctgggcct cgaatgcacc ttcatcgacg acatttctgc ctaccacaaa 1920
tttctggggg aagtccactg tggcaccaac gtccgcagga agcccttcac cttcaagtgg 1980
tggcacatgg tgccctga 1998
<210> 3
<211> 1444
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
ggagaagggg tggggcaggg tatcgctgac tcagcagctt ccaggttgct ctgatgatat 60
attaaggctc ctgaatccta agagaatgtt ggtgaagatc ttaacaccac gccttgagca 120
agtcgcaaga gcgggaggac acagaccagg aaccgagaag ggacaagcac atggaagcca 180
gcccagcatc cgggcccaga cacttgatgg atccacacat attcacttcc aactttaaca 240
atggcattgg aaggcataag acctacctgt gctacgaagt ggagcgcctg gacaatggca 300
cctcggtcaa gatggaccag cacaggggct ttctacacaa ccaggctaag aatcttctct 360
gtggctttta cggccgccat gcggagctgc gcttcttgga cctggttcct tctttgcagt 420
tggacccggc ccagatctac agggtcactt ggttcatctc ctggagcccc tgcttctcct 480
ggggctgtgc cggggaagtg cgtgcgttcc ttcaggagaa cacacacgtg agactgcgta 540
tcttcgctgc ccgcatctat gattacgacc ccctatataa ggaggcactg caaatgctgc 600
gggatgctgg ggcccaagtc tccatcatga cctacgatga atttaagcac tgctgggaca 660
cctttgtgga ccaccaggga tgtcccttcc agccctggga tggactagat gagcacagcc 720
aagccctgag tgggaggctg cgggccattc tccagaatca gggaaactga aggatgggcc 780
tcagtctcta aggaaggcag agacctgggt tgagcagcag aataaaagat cttcttccaa 840
gaaatgcaaa cagaccgttc accaccatct ccagctgctc acagacgcca gcaaagcagt 900
atgctcccga tcaagtagat ttttaaaaaa tcagagtggg ccgggcgcgg tggctcacgc 960
ctgtaatccc agcactttgg aggccaaggc gggtggatca cgaggtcagg agatcgagac 1020
catcctggct aacacggtga aaccctgtct ctactaaaaa tacaaaaaat tagccaggcg 1080
tggtggcggg cgcctgtagt cccagctact ctggaggctg aggcaggaga gtagcgtgaa 1140
cccgggaggc agagcttgcg gtgagccgag attgcgctac tgcactccag cctgggcgac 1200
agtaccagac tccatctcaa aaaaaaaaaa accagactga attaatttta actgaaaatt 1260
tctcttatgt tccaagtaca caatagtaag attatgctca atattctcag aataattttc 1320
aatgtattaa tgaaatgaaa tgataatttg gcttcatatc tagactaaca caaaattaag 1380
aatcttccat aattgctttt gctcagtaac tgtgtcatga attgcaagag tttccacaaa 1440
cact 1444
<210> 4
<211> 1390
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
ggagaagggg tggggcaggg tatcgctgac tcagcagctt ccaggttgct ctgatgatat 60
attaaggctc ctgaatccta agagaatgtt ggtgaagatc ttaacaccac gccttgagca 120
agtcgcaaga gcgggaggac acagaccagg aaccgagaag ggacaagcac atggaagcca 180
gcccagcatc cgggcccagg cataagacct acctgtgcta cgaagtggag cgcctggaca 240
atggcacctc ggtcaagatg gaccagcaca ggggctttct acacaaccag gctaagaatc 300
ttctctgtgg cttttacggc cgccatgcgg agctgcgctt cttggacctg gttccttctt 360
tgcagttgga cccggcccag atctacaggg tcacttggtt catctcctgg agcccctgct 420
tctcctgggg ctgtgccggg gaagtgcgtg cgttccttca ggagaacaca cacgtgagac 480
tgcgtatctt cgctgcccgc atctatgatt acgaccccct atataaggag gcactgcaaa 540
tgctgcggga tgctggggcc caagtctcca tcatgaccta cgatgaattt aagcactgct 600
gggacacctt tgtggaccac cagggatgtc ccttccagcc ctgggatgga ctagatgagc 660
acagccaagc cctgagtggg aggctgcggg ccattctcca gaatcaggga aactgaagga 720
tgggcctcag tctctaagga aggcagagac ctgggttgag cagcagaata aaagatcttc 780
ttccaagaaa tgcaaacaga ccgttcacca ccatctccag ctgctcacag acgccagcaa 840
agcagtatgc tcccgatcaa gtagattttt aaaaaatcag agtgggccgg gcgcggtggc 900
tcacgcctgt aatcccagca ctttggaggc caaggcgggt ggatcacgag gtcaggagat 960
cgagaccatc ctggctaaca cggtgaaacc ctgtctctac taaaaataca aaaaattagc 1020
caggcgtggt ggcgggcgcc tgtagtccca gctactctgg aggctgaggc aggagagtag 1080
cgtgaacccg ggaggcagag cttgcggtga gccgagattg cgctactgca ctccagcctg 1140
ggcgacagta ccagactcca tctcaaaaaa aaaaaaacca gactgaatta attttaactg 1200
aaaatttctc ttatgttcca agtacacaat agtaagatta tgctcaatat tctcagaata 1260
attttcaatg tattaatgaa atgaaatgat aatttggctt catatctaga ctaacacaaa 1320
attaagaatc ttccataatt gcttttgctc agtaactgtg tcatgaattg caagagtttc 1380
cacaaacact 1390
<210> 5
<211> 2394
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
attcttggtg ctgggtggat ctaaatccag gagatggggg caagcatcct gggaaagctg 60
agggcacact ctggcagatt ctgtgtgtgt cctcagatgc tcagccgcag acctttggga 120
gagtaaaggg ggcacaccca cccaccttgc ctccaggctc tttccttcct attcctgttc 180
tatggtgggg ctccattgcg agacttcaga ttgagaaatc agatgaagtt tcaagaaaag 240
gaaactggca ggtgacagag atgggtggag ggactgggga aaggctgttt actccctcct 300
gtctagtcgg cttggtccct ttagggctcc ggatatcttt ggtgacttgt ccactccagt 360
gtggcatcat gtggcagctg ctcctcccaa ctgctctgct acttctagtt tcagctggca 420
tgcggactga agatctccca aaggctgtgg tgttcctgga gcctcaatgg tacagcgtgc 480
ttgagaagga cagtgtgact ctgaagtgcc agggagccta ctcccctgag gacaattcca 540
cacagtggtt tcacaatgag aacctcatct caagccaggc ctcgagctac ttcattgacg 600
ctgccacagt caacgacagt ggagagtaca ggtgccagac aaacctctcc accctcagtg 660
acccggtgca gctagaagtc catatcggct ggctgttgct ccaggcccct cggtgggtgt 720
tcaaggagga agaccctatt cacctgaggt gtcacagctg gaagaacact gctctgcata 780
aggtcacata tttacagaat ggcaaagaca ggaagtattt tcatcataat tctgacttcc 840
acattccaaa agccacactc aaagatagcg gctcctactt ctgcaggggg cttgttggga 900
gtaaaaatgt gtcttcagag actgtgaaca tcaccatcac tcaaggtttg gcagtgtcaa 960
ccatctcatc attctctcca cctgggtacc aagtctcttt ctgcttggtg atggtactcc 1020
tttttgcagt ggacacagga ctatatttct ctgtgaagac aaacatttga agctcaacaa 1080
gagactggaa ggaccataaa cttaaatgga gaaaggaccc tcaagacaaa tgacccccat 1140
cccatggggg taataagagc agtggcagca gcatctctga acatttctct ggatttgcaa 1200
ccccatcatc ctcaggcctc tctacaagca gcaggaaaca tagaactcag agccagatcc 1260
tttatccaac tctcgatttt tccttggtct ccagtggaag ggaaaagccc atgatcttca 1320
agcagggaag ccccagtgag tagctgcatt cctagaaatt gaagtttcag agctacacaa 1380
acactttttc tgtcccaacc attccctcac agcaaagcaa caatacaggc tagggatggt 1440
aatcctttaa acatacaaaa attgctcgta ttataaatta cccagtttag agggaaaaaa 1500
agaaaataat tattcctaaa caaatggata agtagaatta atggttgagg caggacccta 1560
cagagtgtgg gaactgctgg ggatctagag aattcagtgg gaccaatgaa agcatggctg 1620
agaaatagca gggtagtcca ggatagtcta agggaggtgt tcccatctga gcccagagat 1680
aagggtgtct tcctagaaca ttagccgtag tggaattaac aggaaatcat gagggtgacg 1740
tagaattgag tcttccaggg gactctatca gaactggacc atttccaagt atataacgat 1800
gagtcctcta atgctaggag tagaaaatgg tcctaggaag gggactgagg attggggtgg 1860
gggtggggtg gaaaagaaag tacagaacaa accctgtgtc actgtctcaa gttaagctaa 1920
gtgaacagaa ctatctcagc atcagaatga gaaagcctga gaagaaagaa ccaaccagaa 1980
gcacacagga aggaaagcgc aggaggtgaa aatgctttct tggccggggt agtaagaatt 2040
agaggttaat gcagggactg taaaaccacc ttttctgctt caatgtctag ttcctgtata 2100
gctttgttca ttgcatttat taaacaaatg ttgtataacc aatactaaat gtactactga 2160
gcttcactga gttacgctgt gaaactttca aatccttctt catgtcagtt ccaatgaggt 2220
ggggatggag aagacaattg ttgcttatga aagaaagctt tagctgtctc tgttttgtaa 2280
gctttcagtg caacatttct tggttccaat aaagcatttt acaagatctt gcatgctact 2340
cttagataga agatggcaaa accatggtaa taaaatatga atgataaaaa aaaa 2394
<210> 6
<211> 2148
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
aggctgacag accagcccag atccagtggc ccggaggggc ctgagctaaa tccgcaggac 60
ctgggtaaca cgaggaaggg ctccggatat ctttggtgac ttgtccactc cagtgtggca 120
tcatgtggca gctgctcctc ccaactgctc tgctacttct agtttcagct ggcatgcgga 180
ctgaagatct cccaaaggct gtggtgttcc tggagcctca atggtacagc gtgcttgaga 240
aggacagtgt gactctgaag tgccagggag cctactcccc tgaggacaat tccacacagt 300
ggtttcacaa tgagaacctc atctcaagcc aggcctcgag ctacttcatt gacgctgcca 360
cagtcaacga cagtggagag tacaggtgcc agacaaacct ctccaccctc agtgacccgg 420
tgcagctaga agtccatatc ggctggctgt tgctccaggc ccctcggtgg gtgttcaagg 480
aggaagaccc tattcacctg aggtgtcaca gctggaagaa cactgctctg cataaggtca 540
catatttaca gaatggcaaa gacaggaagt attttcatca taattctgac ttccacattc 600
caaaagccac actcaaagat agcggctcct acttctgcag ggggcttgtt gggagtaaaa 660
atgtgtcttc agagactgtg aacatcacca tcactcaagg tttggcagtg tcaaccatct 720
catcattctc tccacctggg taccaagtct ctttctgctt ggtgatggta ctcctttttg 780
cagtggacac aggactatat ttctctgtga agacaaacat ttgaagctca acaagagact 840
ggaaggacca taaacttaaa tggagaaagg accctcaaga caaatgaccc ccatcccatg 900
ggggtaataa gagcagtggc agcagcatct ctgaacattt ctctggattt gcaaccccat 960
catcctcagg cctctctaca agcagcagga aacatagaac tcagagccag atcctttatc 1020
caactctcga tttttccttg gtctccagtg gaagggaaaa gcccatgatc ttcaagcagg 1080
gaagccccag tgagtagctg cattcctaga aattgaagtt tcagagctac acaaacactt 1140
tttctgtccc aaccattccc tcacagcaaa gcaacaatac aggctaggga tggtaatcct 1200
ttaaacatac aaaaattgct cgtattataa attacccagt ttagagggaa aaaaagaaaa 1260
taattattcc taaacaaatg gataagtaga attaatggtt gaggcaggac cctacagagt 1320
gtgggaactg ctggggatct agagaattca gtgggaccaa tgaaagcatg gctgagaaat 1380
agcagggtag tccaggatag tctaagggag gtgttcccat ctgagcccag agataagggt 1440
gtcttcctag aacattagcc gtagtggaat taacaggaaa tcatgagggt gacgtagaat 1500
tgagtcttcc aggggactct atcagaactg gaccatttcc aagtatataa cgatgagtcc 1560
tctaatgcta ggagtagaaa atggtcctag gaaggggact gaggattggg gtgggggtgg 1620
ggtggaaaag aaagtacaga acaaaccctg tgtcactgtc tcaagttaag ctaagtgaac 1680
agaactatct cagcatcaga atgagaaagc ctgagaagaa agaaccaacc agaagcacac 1740
aggaaggaaa gcgcaggagg tgaaaatgct ttcttggccg gggtagtaag aattagaggt 1800
taatgcaggg actgtaaaac caccttttct gcttcaatgt ctagttcctg tatagctttg 1860
ttcattgcat ttattaaaca aatgttgtat aaccaatact aaatgtacta ctgagcttca 1920
ctgagttacg ctgtgaaact ttcaaatcct tcttcatgtc agttccaatg aggtggggat 1980
ggagaagaca attgttgctt atgaaagaaa gctttagctg tctctgtttt gtaagctttc 2040
agtgcaacat ttcttggttc caataaagca ttttacaaga tcttgcatgc tactcttaga 2100
tagaagatgg caaaaccatg gtaataaaat atgaatgata aaaaaaaa 2148
<210> 7
<211> 2391
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
attcttggtg ctgggtggat ctaaatccag gagatggggg caagcatcct gggaaagctg 60
agggcacact ctggcagatt ctgtgtgtgt cctcagatgc tcagccgcag acctttggga 120
gagtaaaggg ggcacaccca cccaccttgc ctccaggctc tttccttcct attcctgttc 180
tatggtgggg ctccattgcg agacttcaga ttgagaaatc agatgaagtt tcaagaaaag 240
gaaactggca ggtgacagag atgggtggag ggactgggga aaggctgttt actccctcct 300
gtctagtcgg cttggtccct ttagggctcc ggatatcttt ggtgacttgt ccactccagt 360
gtggcatcat gtggcagctg ctcctcccaa ctgctctgct acttctagtt tcagctggca 420
tgcggactga tctcccaaag gctgtggtgt tcctggagcc tcaatggtac agcgtgcttg 480
agaaggacag tgtgactctg aagtgccagg gagcctactc ccctgaggac aattccacac 540
agtggtttca caatgagaac ctcatctcaa gccaggcctc gagctacttc attgacgctg 600
ccacagtcaa cgacagtgga gagtacaggt gccagacaaa cctctccacc ctcagtgacc 660
cggtgcagct agaagtccat atcggctggc tgttgctcca ggcccctcgg tgggtgttca 720
aggaggaaga ccctattcac ctgaggtgtc acagctggaa gaacactgct ctgcataagg 780
tcacatattt acagaatggc aaagacagga agtattttca tcataattct gacttccaca 840
ttccaaaagc cacactcaaa gatagcggct cctacttctg cagggggctt gttgggagta 900
aaaatgtgtc ttcagagact gtgaacatca ccatcactca aggtttggca gtgtcaacca 960
tctcatcatt ctctccacct gggtaccaag tctctttctg cttggtgatg gtactccttt 1020
ttgcagtgga cacaggacta tatttctctg tgaagacaaa catttgaagc tcaacaagag 1080
actggaagga ccataaactt aaatggagaa aggaccctca agacaaatga cccccatccc 1140
atgggggtaa taagagcagt ggcagcagca tctctgaaca tttctctgga tttgcaaccc 1200
catcatcctc aggcctctct acaagcagca ggaaacatag aactcagagc cagatccttt 1260
atccaactct cgatttttcc ttggtctcca gtggaaggga aaagcccatg atcttcaagc 1320
agggaagccc cagtgagtag ctgcattcct agaaattgaa gtttcagagc tacacaaaca 1380
ctttttctgt cccaaccatt ccctcacagc aaagcaacaa tacaggctag ggatggtaat 1440
cctttaaaca tacaaaaatt gctcgtatta taaattaccc agtttagagg gaaaaaaaga 1500
aaataattat tcctaaacaa atggataagt agaattaatg gttgaggcag gaccctacag 1560
agtgtgggaa ctgctgggga tctagagaat tcagtgggac caatgaaagc atggctgaga 1620
aatagcaggg tagtccagga tagtctaagg gaggtgttcc catctgagcc cagagataag 1680
ggtgtcttcc tagaacatta gccgtagtgg aattaacagg aaatcatgag ggtgacgtag 1740
aattgagtct tccaggggac tctatcagaa ctggaccatt tccaagtata taacgatgag 1800
tcctctaatg ctaggagtag aaaatggtcc taggaagggg actgaggatt ggggtggggg 1860
tggggtggaa aagaaagtac agaacaaacc ctgtgtcact gtctcaagtt aagctaagtg 1920
aacagaacta tctcagcatc agaatgagaa agcctgagaa gaaagaacca accagaagca 1980
cacaggaagg aaagcgcagg aggtgaaaat gctttcttgg ccggggtagt aagaattaga 2040
ggttaatgca gggactgtaa aaccaccttt tctgcttcaa tgtctagttc ctgtatagct 2100
ttgttcattg catttattaa acaaatgttg tataaccaat actaaatgta ctactgagct 2160
tcactgagtt acgctgtgaa actttcaaat ccttcttcat gtcagttcca atgaggtggg 2220
gatggagaag acaattgttg cttatgaaag aaagctttag ctgtctctgt tttgtaagct 2280
ttcagtgcaa catttcttgg ttccaataaa gcattttaca agatcttgca tgctactctt 2340
agatagaaga tggcaaaacc atggtaataa aatatgaatg ataaaaaaaa a 2391
<210> 8
<211> 2260
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 8
aggatctccc tggttgaggg agaagtttga gatgccttgg gttcatcaga cacccctttt 60
caggctacga atgagactcc cacaaaggga tgggacccct caccacatct atagctgtgg 120
attgagctac caggacaagc caagatgggg ctagaaatga ggagaatgct ggttccaatt 180
gggtcatagt catgagtgag gccagtcact tcacccctct gggtcccaga atcactatgt 240
ggaaccaaag agcttcgact agatggtccc taggtttcag ctggcatgcg gactgaagat 300
ctcccaaagg ctgtggtgtt cctggagcct caatggtaca gcgtgcttga gaaggacagt 360
gtgactctga agtgccaggg agcctactcc cctgaggaca attccacaca gtggtttcac 420
aatgagaacc tcatctcaag ccaggcctcg agctacttca ttgacgctgc cacagtcaac 480
gacagtggag agtacaggtg ccagacaaac ctctccaccc tcagtgaccc ggtgcagcta 540
gaagtccata tcggctggct gttgctccag gcccctcggt gggtgttcaa ggaggaagac 600
cctattcacc tgaggtgtca cagctggaag aacactgctc tgcataaggt cacatattta 660
cagaatggca aagacaggaa gtattttcat cataattctg acttccacat tccaaaagcc 720
acactcaaag atagcggctc ctacttctgc agggggcttg ttgggagtaa aaatgtgtct 780
tcagagactg tgaacatcac catcactcaa ggtttggcag tgtcaaccat ctcatcattc 840
tctccacctg ggtaccaagt ctctttctgc ttggtgatgg tactcctttt tgcagtggac 900
acaggactat atttctctgt gaagacaaac atttgaagct caacaagaga ctggaaggac 960
cataaactta aatggagaaa ggaccctcaa gacaaatgac ccccatccca tgggggtaat 1020
aagagcagtg gcagcagcat ctctgaacat ttctctggat ttgcaacccc atcatcctca 1080
ggcctctcta caagcagcag gaaacataga actcagagcc agatccttta tccaactctc 1140
gatttttcct tggtctccag tggaagggaa aagcccatga tcttcaagca gggaagcccc 1200
agtgagtagc tgcattccta gaaattgaag tttcagagct acacaaacac tttttctgtc 1260
ccaaccattc cctcacagca aagcaacaat acaggctagg gatggtaatc ctttaaacat 1320
acaaaaattg ctcgtattat aaattaccca gtttagaggg aaaaaaagaa aataattatt 1380
cctaaacaaa tggataagta gaattaatgg ttgaggcagg accctacaga gtgtgggaac 1440
tgctggggat ctagagaatt cagtgggacc aatgaaagca tggctgagaa atagcagggt 1500
agtccaggat agtctaaggg aggtgttccc atctgagccc agagataagg gtgtcttcct 1560
agaacattag ccgtagtgga attaacagga aatcatgagg gtgacgtaga attgagtctt 1620
ccaggggact ctatcagaac tggaccattt ccaagtatat aacgatgagt cctctaatgc 1680
taggagtaga aaatggtcct aggaagggga ctgaggattg gggtgggggt ggggtggaaa 1740
agaaagtaca gaacaaaccc tgtgtcactg tctcaagtta agctaagtga acagaactat 1800
ctcagcatca gaatgagaaa gcctgagaag aaagaaccaa ccagaagcac acaggaagga 1860
aagcgcagga ggtgaaaatg ctttcttggc cggggtagta agaattagag gttaatgcag 1920
ggactgtaaa accacctttt ctgcttcaat gtctagttcc tgtatagctt tgttcattgc 1980
atttattaaa caaatgttgt ataaccaata ctaaatgtac tactgagctt cactgagtta 2040
cgctgtgaaa ctttcaaatc cttcttcatg tcagttccaa tgaggtgggg atggagaaga 2100
caattgttgc ttatgaaaga aagctttagc tgtctctgtt ttgtaagctt tcagtgcaac 2160
atttcttggt tccaataaag cattttacaa gatcttgcat gctactctta gatagaagat 2220
ggcaaaacca tggtaataaa atatgaatga taaaaaaaaa 2260
<210> 9
<211> 2002
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 9
aggatctccc tggttgaggg agaagtttga gatgccttgg gttcatcaga cacccctttt 60
caggctacga atgagactcc cacaaaggga tgggacccct caccacatct atagctgtgg 120
attgagctac caggacaagc caagatgggg ctagaaatga ggagaatgct ggttccaatt 180
gggtcatagt catgagtgag gccagtcact tcacccctct gggtcccaga atcactatgt 240
ggaaccaaag agcttcgact agatggtccc taggtttcag ctggcatgcg gactgaagat 300
ctcccaaagg ctgtggtgtt cctggagcct caatggtaca gcgtgcttga gaaggacagt 360
gtgactctga agtgccaggg agcctactcc cctgaggaca attccacaca gtggtttcac 420
aatgagaacc tcatctcaag ccaggcctcg agctacttca ttgacgctgc cacagtcaac 480
gacagtggag agtacaggtg ccagacaaac ctctccaccc tcagtgaccc ggtgcagcta 540
gaagtccata tcggtttggc agtgtcaacc atctcatcat tctctccacc tgggtaccaa 600
gtctctttct gcttggtgat ggtactcctt tttgcagtgg acacaggact atatttctct 660
gtgaagacaa acatttgaag ctcaacaaga gactggaagg accataaact taaatggaga 720
aaggaccctc aagacaaatg acccccatcc catgggggta ataagagcag tggcagcagc 780
atctctgaac atttctctgg atttgcaacc ccatcatcct caggcctctc tacaagcagc 840
aggaaacata gaactcagag ccagatcctt tatccaactc tcgatttttc cttggtctcc 900
agtggaaggg aaaagcccat gatcttcaag cagggaagcc ccagtgagta gctgcattcc 960
tagaaattga agtttcagag ctacacaaac actttttctg tcccaaccat tccctcacag 1020
caaagcaaca atacaggcta gggatggtaa tcctttaaac atacaaaaat tgctcgtatt 1080
ataaattacc cagtttagag ggaaaaaaag aaaataatta ttcctaaaca aatggataag 1140
tagaattaat ggttgaggca ggaccctaca gagtgtggga actgctgggg atctagagaa 1200
ttcagtggga ccaatgaaag catggctgag aaatagcagg gtagtccagg atagtctaag 1260
ggaggtgttc ccatctgagc ccagagataa gggtgtcttc ctagaacatt agccgtagtg 1320
gaattaacag gaaatcatga gggtgacgta gaattgagtc ttccagggga ctctatcaga 1380
actggaccat ttccaagtat ataacgatga gtcctctaat gctaggagta gaaaatggtc 1440
ctaggaaggg gactgaggat tggggtgggg gtggggtgga aaagaaagta cagaacaaac 1500
cctgtgtcac tgtctcaagt taagctaagt gaacagaact atctcagcat cagaatgaga 1560
aagcctgaga agaaagaacc aaccagaagc acacaggaag gaaagcgcag gaggtgaaaa 1620
tgctttcttg gccggggtag taagaattag aggttaatgc agggactgta aaaccacctt 1680
ttctgcttca atgtctagtt cctgtatagc tttgttcatt gcatttatta aacaaatgtt 1740
gtataaccaa tactaaatgt actactgagc ttcactgagt tacgctgtga aactttcaaa 1800
tccttcttca tgtcagttcc aatgaggtgg ggatggagaa gacaattgtt gcttatgaaa 1860
gaaagcttta gctgtctctg ttttgtaagc tttcagtgca acatttcttg gttccaataa 1920
agcattttac aagatcttgc atgctactct tagatagaag atggcaaaac catggtaata 1980
aaatatgaat gataaaaaaa aa 2002
<210> 10
<211> 2633
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 10
agtgggcgtg gcggtgctgc ccaggtgagc caccgctgct tctgcccaga cacggtcgcc 60
tccacatcca ggtctttgtg ctcctcgctt gcctgttcct tttccacgca ttttccagga 120
taactgtgac tccaggcccg caatggatgc cctgcaacta gcaaattcgg cttttgccgt 180
tgatctgttc aaacaactat gtgaaaagga gccactgggc aatgtcctct tctctccaat 240
ctgtctctcc acctctctgt cacttgctca agtgggtgct aaaggtgaca ctgcaaatga 300
aattggacag gttcttcatt ttgaaaatgt caaagatgta ccctttggat ttcaaacagt 360
aacatcggat gtaaacaaac ttagttcctt ttactcactg aaactaatca agcggctcta 420
cgtagacaaa tctctgaatc tttctacaga gttcatcagc tctacgaaga gaccgtatgc 480
aaaggaattg gaaactgttg acttcaaaga taaattggaa gaaacgaaag gtcagatcaa 540
caactcaatt aaggatctca cagatggcca ctttgagaac attttagctg acaacagtgt 600
gaacgaccag accaaaatcc ttgtggttaa tgctgcctac tttgttggca agtggatgaa 660
gaaattttct gaatcagaaa caaaagaatg tcctttcaga gtcaacaaga cagacaccaa 720
accagtgcag atgatgaaca tggaggccac gttctgtatg ggaaacattg acagtatcaa 780
ttgtaagatc atagagcttc cttttcaaaa taagcatctc agcatgttca tcctactacc 840
caaggatgtg gaggatgagt ccacaggctt ggagaagatt gaaaaacaac tcaactcaga 900
gtcactgtca cagtggacta atcccagcac catggccaat gccaaggtca aactctccat 960
tccaaaattt aaggtggaaa agatgattga tcccaaggct tgtctggaaa atctagggct 1020
gaaacatatc ttcagtgaag acacatctga tttctctgga atgtcagaga ccaagggagt 1080
ggccctatca aatgttatcc acaaagtgtg cttagaaata actgaagatg gtggggattc 1140
catagaggtg ccaggagcac ggatcctgca gcacaaggat gaattgaatg ctgaccatcc 1200
ctttatttac atcatcaggc acaacaaaac tcgaaacatc attttctttg gcaaattctg 1260
ttctccttaa gtggcatagc ccatgttaag tcctccctga cttttctgtg gatgccgatt 1320
tctgtaaact ctgcatccag agattcattt tctagataca ataaattgct aatgttgctg 1380
gatcaggaag ccgccagtac ttgtcatatg tagccttcac acagatagac cttttttttt 1440
tttccaattc tatcttttgt ttcctttttt cccataagac aatgacatac gcttttaatg 1500
aaaaggaatc acgttagagg aaaaatattt attcattatt tgtcaaattg tccggggtag 1560
ttggcagaaa tacagtcttc cacaaagaaa attcctataa ggaagatttg gaagctcttc 1620
ttcccagcac tatgctttcc ttctttggga tagagaatgt tccagacatt ctcgcttccc 1680
tgaaagactg aagaaagtgt agtgcatggg acccacgaaa ctgccctggc tccagtgaaa 1740
cttgggcaca tgctcaggct actataggtc cagaagtcct tatgttaagc cctggcaggc 1800
aggtgtttat taaaattctg aattttgggg attttcaaaa gataatattt tacatacact 1860
gtatgttata gaacttcatg gatcagatct ggggcagcac cctataaatc aacaccttaa 1920
tatgctgcaa caaaatgtag aatattcaga caaaatggat acataaagac taagtagccc 1980
ataaggggtc aaaatttgct gccaaatgcg tatgccacca acttacaaaa acacttcgtt 2040
cgcagagctt ttcagattgt ggaatgttgg ataaggaatt atagacctct agtagctgaa 2100
atgcaagacc ccaagaggaa gttcagatct taatataaat tcactttcat ttttgatagc 2160
tgtcccatct ggtcatttgg ttggcactag actggtggca ggggcttcta gctgacttgc 2220
acagggattc tcacaatagc cgatatcaga atttgtgttg aaggaacttg tctcttcatc 2280
taatatgata gcgggaaaag gagaggaaac tactgccttt agaaaatata agtaaagtga 2340
ttaaagtgct cacgttacct tgacacatag tttttcagtc tatgggttta gttactttag 2400
atggcaagca tgtaacttat attaatagta atttgtaaag ttggttggat aagctatccg 2460
tgttgcaggt tcatggatta cttctctata aaaaatatgt atttaccaaa aattttgtga 2520
cattccttct cccatctctt ccttgacctg cattgtaaat aggttcttct tgttctgaga 2580
ttcaatattg aatttttcct atgctattga caataaaata ttattgaact aca 2633
<210> 11
<211> 834
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 11
agtcctgtgt ccgggccccg aggcacagcc agggcaccag gtggagcacc agctacgcgt 60
ggcgcagcgc agcgtcccta gcaccgagcc tcccgcagcc gccgagatgc tgcgaacaga 120
gagctgccgc cccaggtcgc ccgccggaca ggtggccgcg gcgtccccgc tcctgctgct 180
gctgctgctg ctcgcctggt gcgcgggcgc ctgccgaggt gctccaatat tacctcaagg 240
attacagcct gaacaacagc tacagttgtg gaatgagata gatgatactt gttcgtcttt 300
tctgtccatt gattctcagc ctcaggcatc caacgcactg gaggagcttt gctttatgat 360
tatgggaatg ctaccaaagc ctcaggaaca agatgaaaaa gataatacta aaaggttctt 420
atttcattat tcgaagacac agaagttggg caagtcaaat gttgtgtcgt cagttgtgca 480
tccgttgctg cagctcgttc ctcacctgca tgagagaaga atgaagagat tcagagtgga 540
cgaagaattc caaagtccct ttgcaagtca aagtcgagga tattttttat tcaggccacg 600
gaatggaaga aggtcagcag ggttcattta aaatggatgc cagctaattt tccacagagc 660
aatgctatgg aatacaaaat gtactgacat tttgttttct tctgaaaaaa atccttgcta 720
aatgtactct gttgaaaatc cctgtgttgt caatgttctc agttgtaaca atgttgtaaa 780
tgttcaattt gttgaaaatt aaaaaatcta aaaatattaa aaaaaaaaaa aaaa 834
<210> 12
<211> 786
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 12
agtcctgtgt ccgggccccg aggcacagcc agggcaccag gtggagcacc agctacgcgt 60
ggcgcagcgc agcgtcccta gcaccgagcc tcccgcagcc gccgagatgc tgcgaacaga 120
gagctgccgc cccaggtcgc ccgccggaca ggtggccgcg gcgtccccgc tcctgctgct 180
gctgctgctg ctcgcctggt gcgcgggcgc ctgccgaggt gctccaatat tacctcaagg 240
attacagcct gaacaacagc tacagttgtg gaatgaggca tccaacgcac tggaggagct 300
ttgctttatg attatgggaa tgctaccaaa gcctcaggaa caagatgaaa aagataatac 360
taaaaggttc ttatttcatt attcgaagac acagaagttg ggcaagtcaa atgttgtgtc 420
gtcagttgtg catccgttgc tgcagctcgt tcctcacctg catgagagaa gaatgaagag 480
attcagagtg gacgaagaat tccaaagtcc ctttgcaagt caaagtcgag gatatttttt 540
attcaggcca cggaatggaa gaaggtcagc agggttcatt taaaatggat gccagctaat 600
tttccacaga gcaatgctat ggaatacaaa atgtactgac attttgtttt cttctgaaaa 660
aaatccttgc taaatgtact ctgttgaaaa tccctgtgtt gtcaatgttc tcagttgtaa 720
caatgttgta aatgttcaat ttgttgaaaa ttaaaaaatc taaaaatatt aaaaaaaaaa 780
aaaaaa 786
<210> 13
<211> 759
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 13
agtcctgtgt ccgggccccg aggcacagcc agggcaccag gtggagcacc agctacgcgt 60
ggcgcagcgc agcgtcccta gcaccgagcc tcccgcagcc gccgagatgc tgcgaacaga 120
gagctgccgc cccaggtcgc ccgccggaca ggtggccgcg gcgtccccgc tcctgctgct 180
gctgctgctg ctcgcctggt gcgcgggcgc ctgccgaggt gctccaatat tacctcaagg 240
attacagcct gaacaacagc tacagttgtg gaatgagata gatgatactt gttcgtcttt 300
tctgtccatt gattctcagc ctcaggcatc caacgcactg gaggagcttt gctttatgat 360
tatgggaatg ctaccaaagc ctcaggaaca agatgaaaaa gataatacta aaaggttctt 420
atttcattat tcgaagacac agaagttggg caagtcaaat gttgtggaag aattccaaag 480
tccctttgca agtcaaagtc gaggatattt tttattcagg ccacggaatg gaagaaggtc 540
agcagggttc atttaaaatg gatgccagct aattttccac agagcaatgc tatggaatac 600
aaaatgtact gacattttgt tttcttctga aaaaaatcct tgctaaatgt actctgttga 660
aaatccctgt gttgtcaatg ttctcagttg taacaatgtt gtaaatgttc aatttgttga 720
aaattaaaaa atctaaaaat attaaaaaaa aaaaaaaaa 759
<210> 14
<211> 665
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Met Leu Arg Glu Arg Thr Val Arg Leu Gln Tyr Gly Ser Arg Val Glu
1 5 10 15
Ala Val Tyr Val Leu Gly Thr Tyr Leu Trp Thr Asp Val Tyr Ser Ala
20 25 30
Ala Pro Ala Gly Ala Gln Thr Phe Ser Leu Lys His Ser Glu His Val
35 40 45
Trp Val Glu Val Val Arg Asp Gly Glu Ala Glu Glu Val Ala Thr Asn
50 55 60
Gly Lys Gln Arg Trp Leu Leu Ser Pro Ser Thr Thr Leu Arg Val Thr
65 70 75 80
Met Ser Gln Ala Ser Thr Glu Ala Ser Ser Asp Lys Val Thr Val Asn
85 90 95
Tyr Tyr Asp Glu Glu Gly Ser Ile Pro Ile Asp Gln Ala Gly Leu Phe
100 105 110
Leu Thr Ala Ile Glu Ile Ser Leu Asp Val Asp Ala Asp Arg Asp Gly
115 120 125
Val Val Glu Lys Asn Asn Pro Lys Lys Ala Ser Trp Thr Trp Gly Pro
130 135 140
Glu Gly Gln Gly Ala Ile Leu Leu Val Asn Cys Asp Arg Glu Thr Pro
145 150 155 160
Trp Leu Pro Lys Glu Asp Cys Arg Asp Glu Lys Val Tyr Ser Lys Glu
165 170 175
Asp Leu Lys Asp Met Ser Gln Met Ile Leu Arg Thr Lys Gly Pro Asp
180 185 190
Arg Leu Pro Ala Gly Tyr Glu Ile Val Leu Tyr Ile Ser Met Ser Asp
195 200 205
Ser Asp Lys Val Gly Val Phe Tyr Val Glu Asn Pro Phe Phe Gly Gln
210 215 220
Arg Tyr Ile His Ile Leu Gly Arg Arg Lys Leu Tyr His Val Val Lys
225 230 235 240
Tyr Thr Gly Gly Ser Ala Glu Leu Leu Phe Phe Val Glu Gly Leu Cys
245 250 255
Phe Pro Asp Glu Gly Phe Ser Gly Leu Val Ser Ile His Val Ser Leu
260 265 270
Leu Glu Tyr Met Ala Gln Asp Ile Pro Leu Thr Pro Ile Phe Thr Asp
275 280 285
Thr Val Ile Phe Arg Ile Ala Pro Trp Ile Met Thr Pro Asn Ile Leu
290 295 300
Pro Pro Val Ser Val Phe Val Cys Cys Met Lys Asp Asn Tyr Leu Phe
305 310 315 320
Leu Lys Glu Val Lys Asn Leu Val Glu Lys Thr Asn Cys Glu Leu Lys
325 330 335
Val Cys Phe Gln Tyr Leu Asn Arg Gly Asp Arg Trp Ile Gln Asp Glu
340 345 350
Ile Glu Phe Gly Tyr Ile Glu Ala Pro His Lys Gly Phe Pro Val Val
355 360 365
Leu Asp Ser Pro Arg Asp Gly Asn Leu Lys Asp Phe Pro Val Lys Glu
370 375 380
Leu Leu Gly Pro Asp Phe Gly Tyr Val Thr Arg Glu Pro Leu Phe Glu
385 390 395 400
Ser Val Thr Ser Leu Asp Ser Phe Gly Asn Leu Glu Val Ser Pro Pro
405 410 415
Val Thr Val Asn Gly Lys Thr Tyr Pro Leu Gly Arg Ile Leu Ile Gly
420 425 430
Ser Ser Phe Pro Leu Ser Gly Gly Arg Arg Met Thr Lys Val Val Arg
435 440 445
Asp Phe Leu Lys Ala Gln Gln Val Gln Ala Pro Val Glu Leu Tyr Ser
450 455 460
Asp Trp Leu Thr Val Gly His Val Asp Glu Phe Met Ser Phe Val Pro
465 470 475 480
Ile Pro Gly Thr Lys Lys Phe Leu Leu Leu Met Ala Ser Thr Ser Ala
485 490 495
Cys Tyr Lys Leu Phe Arg Glu Lys Gln Lys Asp Gly His Gly Glu Ala
500 505 510
Ile Met Phe Lys Gly Leu Gly Gly Met Ser Ser Lys Arg Ile Thr Ile
515 520 525
Asn Lys Ile Leu Ser Asn Glu Ser Leu Val Gln Glu Asn Leu Tyr Phe
530 535 540
Gln Arg Cys Leu Asp Trp Asn Arg Asp Ile Leu Lys Lys Glu Leu Gly
545 550 555 560
Leu Thr Glu Gln Asp Ile Ile Asp Leu Pro Ala Leu Phe Lys Met Asp
565 570 575
Glu Asp His Arg Ala Arg Ala Phe Phe Pro Asn Met Val Asn Met Ile
580 585 590
Val Leu Asp Lys Asp Leu Gly Ile Pro Lys Pro Phe Gly Pro Gln Val
595 600 605
Glu Glu Glu Cys Cys Leu Glu Met His Val Arg Gly Leu Leu Glu Pro
610 615 620
Leu Gly Leu Glu Cys Thr Phe Ile Asp Asp Ile Ser Ala Tyr His Lys
625 630 635 640
Phe Leu Gly Glu Val His Cys Gly Thr Asn Val Arg Arg Lys Pro Phe
645 650 655
Thr Phe Lys Trp Trp His Met Val Pro
660 665
<210> 15
<211> 199
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Met Glu Ala Ser Pro Ala Ser Gly Pro Arg His Leu Met Asp Pro His
1 5 10 15
Ile Phe Thr Ser Asn Phe Asn Asn Gly Ile Gly Arg His Lys Thr Tyr
20 25 30
Leu Cys Tyr Glu Val Glu Arg Leu Asp Asn Gly Thr Ser Val Lys Met
35 40 45
Asp Gln His Arg Gly Phe Leu His Asn Gln Ala Lys Asn Leu Leu Cys
50 55 60
Gly Phe Tyr Gly Arg His Ala Glu Leu Arg Phe Leu Asp Leu Val Pro
65 70 75 80
Ser Leu Gln Leu Asp Pro Ala Gln Ile Tyr Arg Val Thr Trp Phe Ile
85 90 95
Ser Trp Ser Pro Cys Phe Ser Trp Gly Cys Ala Gly Glu Val Arg Ala
100 105 110
Phe Leu Gln Glu Asn Thr His Val Arg Leu Arg Ile Phe Ala Ala Arg
115 120 125
Ile Tyr Asp Tyr Asp Pro Leu Tyr Lys Glu Ala Leu Gln Met Leu Arg
130 135 140
Asp Ala Gly Ala Gln Val Ser Ile Met Thr Tyr Asp Glu Phe Lys His
145 150 155 160
Cys Trp Asp Thr Phe Val Asp His Gln Gly Cys Pro Phe Gln Pro Trp
165 170 175
Asp Gly Leu Asp Glu His Ser Gln Ala Leu Ser Gly Arg Leu Arg Ala
180 185 190
Ile Leu Gln Asn Gln Gly Asn
195
<210> 16
<211> 269
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Met Gly Gly Gly Thr Gly Glu Arg Leu Phe Thr Pro Ser Cys Leu Val
1 5 10 15
Gly Leu Val Pro Leu Gly Leu Arg Ile Ser Leu Val Thr Cys Pro Leu
20 25 30
Gln Cys Gly Ile Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu
35 40 45
Leu Val Ser Ala Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val
50 55 60
Phe Leu Glu Pro Gln Trp Tyr Ser Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr
65 70 75 80
Leu Lys Cys Gln Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp
85 90 95
Phe His Asn Glu Asn Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile
100 105 110
Asp Ala Ala Thr Val Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn
115 120 125
Leu Ser Thr Leu Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp
130 135 140
Leu Leu Leu Gln Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile
145 150 155 160
His Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr
165 170 175
Tyr Leu Gln Asn Gly Lys Asp Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp
180 185 190
Phe His Ile Pro Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys
195 200 205
Arg Gly Leu Val Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile
210 215 220
Thr Ile Thr Gln Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Ser Pro
225 230 235 240
Pro Gly Tyr Gln Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala
245 250 255
Val Asp Thr Gly Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile
260 265
<210> 17
<211> 233
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala
1 5 10 15
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
20 25 30
Gln Trp Tyr Ser Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
35 40 45
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
50 55 60
Asn Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
65 70 75 80
Val Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
85 90 95
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
100 105 110
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
115 120 125
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
130 135 140
Gly Lys Asp Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe His Ile Pro
145 150 155 160
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val
165 170 175
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
180 185 190
Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Ser Pro Pro Gly Tyr Gln
195 200 205
Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly
210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile
225 230
<210> 18
<211> 268
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
Met Gly Gly Gly Thr Gly Glu Arg Leu Phe Thr Pro Ser Cys Leu Val
1 5 10 15
Gly Leu Val Pro Leu Gly Leu Arg Ile Ser Leu Val Thr Cys Pro Leu
20 25 30
Gln Cys Gly Ile Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu
35 40 45
Leu Val Ser Ala Gly Met Arg Thr Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe
50 55 60
Leu Glu Pro Gln Trp Tyr Ser Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu
65 70 75 80
Lys Cys Gln Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe
85 90 95
His Asn Glu Asn Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp
100 105 110
Ala Ala Thr Val Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu
115 120 125
Ser Thr Leu Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu
130 135 140
Leu Leu Gln Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His
145 150 155 160
Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr
165 170 175
Leu Gln Asn Gly Lys Asp Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe
180 185 190
His Ile Pro Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg
195 200 205
Gly Leu Val Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr
210 215 220
Ile Thr Gln Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Ser Pro Pro
225 230 235 240
Gly Tyr Gln Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val
245 250 255
Asp Thr Gly Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile
260 265
<210> 19
<211> 216
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro Gln
1 5 10 15
Trp Tyr Ser Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln Gly
20 25 30
Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu Asn
35 40 45
Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr Val
50 55 60
Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu Ser
65 70 75 80
Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln Ala
85 90 95
Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys His
100 105 110
Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn Gly
115 120 125
Lys Asp Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe His Ile Pro Lys
130 135 140
Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val Gly
145 150 155 160
Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln Gly
165 170 175
Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Ser Pro Pro Gly Tyr Gln Val
180 185 190
Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly Leu
195 200 205
Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile
210 215
<210> 20
<211> 130
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro Gln
1 5 10 15
Trp Tyr Ser Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln Gly
20 25 30
Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu Asn
35 40 45
Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr Val
50 55 60
Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu Ser
65 70 75 80
Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile
85 90 95
Ser Ser Phe Ser Pro Pro Gly Tyr Gln Val Ser Phe Cys Leu Val Met
100 105 110
Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr
115 120 125
Asn Ile
130
<210> 21
<211> 375
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
Met Asp Ala Leu Gln Leu Ala Asn Ser Ala Phe Ala Val Asp Leu Phe
1 5 10 15
Lys Gln Leu Cys Glu Lys Glu Pro Leu Gly Asn Val Leu Phe Ser Pro
20 25 30
Ile Cys Leu Ser Thr Ser Leu Ser Leu Ala Gln Val Gly Ala Lys Gly
35 40 45
Asp Thr Ala Asn Glu Ile Gly Gln Val Leu His Phe Glu Asn Val Lys
50 55 60
Asp Val Pro Phe Gly Phe Gln Thr Val Thr Ser Asp Val Asn Lys Leu
65 70 75 80
Ser Ser Phe Tyr Ser Leu Lys Leu Ile Lys Arg Leu Tyr Val Asp Lys
85 90 95
Ser Leu Asn Leu Ser Thr Glu Phe Ile Ser Ser Thr Lys Arg Pro Tyr
100 105 110
Ala Lys Glu Leu Glu Thr Val Asp Phe Lys Asp Lys Leu Glu Glu Thr
115 120 125
Lys Gly Gln Ile Asn Asn Ser Ile Lys Asp Leu Thr Asp Gly His Phe
130 135 140
Glu Asn Ile Leu Ala Asp Asn Ser Val Asn Asp Gln Thr Lys Ile Leu
145 150 155 160
Val Val Asn Ala Ala Tyr Phe Val Gly Lys Trp Met Lys Lys Phe Ser
165 170 175
Glu Ser Glu Thr Lys Glu Cys Pro Phe Arg Val Asn Lys Thr Asp Thr
180 185 190
Lys Pro Val Gln Met Met Asn Met Glu Ala Thr Phe Cys Met Gly Asn
195 200 205
Ile Asp Ser Ile Asn Cys Lys Ile Ile Glu Leu Pro Phe Gln Asn Lys
210 215 220
His Leu Ser Met Phe Ile Leu Leu Pro Lys Asp Val Glu Asp Glu Ser
225 230 235 240
Thr Gly Leu Glu Lys Ile Glu Lys Gln Leu Asn Ser Glu Ser Leu Ser
245 250 255
Gln Trp Thr Asn Pro Ser Thr Met Ala Asn Ala Lys Val Lys Leu Ser
260 265 270
Ile Pro Lys Phe Lys Val Glu Lys Met Ile Asp Pro Lys Ala Cys Leu
275 280 285
Glu Asn Leu Gly Leu Lys His Ile Phe Ser Glu Asp Thr Ser Asp Phe
290 295 300
Ser Gly Met Ser Glu Thr Lys Gly Val Ala Leu Ser Asn Val Ile His
305 310 315 320
Lys Val Cys Leu Glu Ile Thr Glu Asp Gly Gly Asp Ser Ile Glu Val
325 330 335
Pro Gly Ala Arg Ile Leu Gln His Lys Asp Glu Leu Asn Ala Asp His
340 345 350
Pro Phe Ile Tyr Ile Ile Arg His Asn Lys Thr Arg Asn Ile Ile Phe
355 360 365
Phe Gly Lys Phe Cys Ser Pro
370 375
<210> 22
<211> 174
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Met Leu Arg Thr Glu Ser Cys Arg Pro Arg Ser Pro Ala Gly Gln Val
1 5 10 15
Ala Ala Ala Ser Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Trp Cys
20 25 30
Ala Gly Ala Cys Arg Gly Ala Pro Ile Leu Pro Gln Gly Leu Gln Pro
35 40 45
Glu Gln Gln Leu Gln Leu Trp Asn Glu Ile Asp Asp Thr Cys Ser Ser
50 55 60
Phe Leu Ser Ile Asp Ser Gln Pro Gln Ala Ser Asn Ala Leu Glu Glu
65 70 75 80
Leu Cys Phe Met Ile Met Gly Met Leu Pro Lys Pro Gln Glu Gln Asp
85 90 95
Glu Lys Asp Asn Thr Lys Arg Phe Leu Phe His Tyr Ser Lys Thr Gln
100 105 110
Lys Leu Gly Lys Ser Asn Val Val Ser Ser Val Val His Pro Leu Leu
115 120 125
Gln Leu Val Pro His Leu His Glu Arg Arg Met Lys Arg Phe Arg Val
130 135 140
Asp Glu Glu Phe Gln Ser Pro Phe Ala Ser Gln Ser Arg Gly Tyr Phe
145 150 155 160
Leu Phe Arg Pro Arg Asn Gly Arg Arg Ser Ala Gly Phe Ile
165 170
<210> 23
<211> 158
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
Met Leu Arg Thr Glu Ser Cys Arg Pro Arg Ser Pro Ala Gly Gln Val
1 5 10 15
Ala Ala Ala Ser Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Trp Cys
20 25 30
Ala Gly Ala Cys Arg Gly Ala Pro Ile Leu Pro Gln Gly Leu Gln Pro
35 40 45
Glu Gln Gln Leu Gln Leu Trp Asn Glu Ala Ser Asn Ala Leu Glu Glu
50 55 60
Leu Cys Phe Met Ile Met Gly Met Leu Pro Lys Pro Gln Glu Gln Asp
65 70 75 80
Glu Lys Asp Asn Thr Lys Arg Phe Leu Phe His Tyr Ser Lys Thr Gln
85 90 95
Lys Leu Gly Lys Ser Asn Val Val Ser Ser Val Val His Pro Leu Leu
100 105 110
Gln Leu Val Pro His Leu His Glu Arg Arg Met Lys Arg Phe Arg Val
115 120 125
Asp Glu Glu Phe Gln Ser Pro Phe Ala Ser Gln Ser Arg Gly Tyr Phe
130 135 140
Leu Phe Arg Pro Arg Asn Gly Arg Arg Ser Ala Gly Phe Ile
145 150 155
<210> 24
<211> 149
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
Met Leu Arg Thr Glu Ser Cys Arg Pro Arg Ser Pro Ala Gly Gln Val
1 5 10 15
Ala Ala Ala Ser Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Trp Cys
20 25 30
Ala Gly Ala Cys Arg Gly Ala Pro Ile Leu Pro Gln Gly Leu Gln Pro
35 40 45
Glu Gln Gln Leu Gln Leu Trp Asn Glu Ile Asp Asp Thr Cys Ser Ser
50 55 60
Phe Leu Ser Ile Asp Ser Gln Pro Gln Ala Ser Asn Ala Leu Glu Glu
65 70 75 80
Leu Cys Phe Met Ile Met Gly Met Leu Pro Lys Pro Gln Glu Gln Asp
85 90 95
Glu Lys Asp Asn Thr Lys Arg Phe Leu Phe His Tyr Ser Lys Thr Gln
100 105 110
Lys Leu Gly Lys Ser Asn Val Val Glu Glu Phe Gln Ser Pro Phe Ala
115 120 125
Ser Gln Ser Arg Gly Tyr Phe Leu Phe Arg Pro Arg Asn Gly Arg Arg
130 135 140
Ser Ala Gly Phe Ile
145
<210> 25
<211> 1626
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 25
cgcacctgct gcaggtgctc ccggccgccc cggaccagcg agcgcgggca ctgcggcggg 60
gaggatgctg cgcgagcgga ccgtgcggct gcagtacggg agccgcgtgg aggcggtgta 120
cgtgctgggc acctacctct ggaccgatgt ctacagcgcg gccccagccg gggcccaaac 180
cttcagcctg aagcactcgg aacacgtgtg ggtggaggtg gtgcgtgatg gggaggctga 240
ggaggtggcc accaatggca agcagcgctg gcttctctcg cccagcacca ccctgcgggt 300
caccatgagc caggcgagca ccgaggccag cagtgacaag gtcaccgtca actactatga 360
cgaggaaggg agcattccca tcgaccaggc ggggctcttc ctcacagcca ttgagatctc 420
cctggatgtg gacgcagacc gggatggtgt ggtggagaag aacaacccaa agaaggcatc 480
ctggacctgg ggccccgagg gccagggggc catcctgctg gtgaactgtg accgagagac 540
accctggttg cccaaggagg actgccgtga tgagaaggtc tacagcaagg aagatctcaa 600
ggacatgtcc cagatgatcc tgcggaccaa aggccccgac cgcctccccg ccggatacga 660
gatagttctg tacatttcca tgtcagactc agacaaagtg ggcgtgttct acgtggagaa 720
cccgttcttc ggccaacgct atatccacat cctgggccgg cggaagctct accatgtggt 780
caagtacacg ggtggctccg cggagctgct gttcttcgtg gaaggcctct gtttccccga 840
cgagggcttc tcaggcctgg tctccatcca tgtcagcctg ctggagtaca tggcccagga 900
cattcccctg actcccatct tcacggacac cgtgatattc cggattgctc cgtggatcat 960
gacccccaac atcctgcctc ccgtgtcggt gtttgtgtgc tgcatgaagg ataattacct 1020
gttcctgaaa gaggtgaaga accttgtgga gaaaaccaac tgtgagctga aggtctgctt 1080
ccagtaccta aaccgaggcg atcgctggat ccaggatgaa attgagtttg gctacatcga 1140
ggccccccat aaaggcttcc ccgtggtgct ggactctccc cgagatggaa acctaaagga 1200
cttccctgtg aaggagctcc tgggcccaga ttttggctac gtgacccggg agcccctctt 1260
tgagtctgtc accagccttg actcatttgg aaacctggag gtcagtcccc cagtgaccgt 1320
gaatggcaag acatacccgc ttggccgcat cctcatcggg agcagctttc ctctgtaaga 1380
gaagccaggc tggggctagg ggctgtggga gtggggaagt cactgtttct cttttggggt 1440
ggcctgggtt gctcacacat ggagcaagtg gctgggggaa ttattccctc ccacgacttc 1500
ctgttaagag gccgacactc ttggaaagaa aatcaagcta gcctttatat ctttgtgtga 1560
tttaggatct aatatataac taaataaaca actcttttcc ccaagtgaaa aaaaaaaaaa 1620
aaaaaa 1626
<210> 26
<211> 437
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
Met Leu Arg Glu Arg Thr Val Arg Leu Gln Tyr Gly Ser Arg Val Glu
1 5 10 15
Ala Val Tyr Val Leu Gly Thr Tyr Leu Trp Thr Asp Val Tyr Ser Ala
20 25 30
Ala Pro Ala Gly Ala Gln Thr Phe Ser Leu Lys His Ser Glu His Val
35 40 45
Trp Val Glu Val Val Arg Asp Gly Glu Ala Glu Glu Val Ala Thr Asn
50 55 60
Gly Lys Gln Arg Trp Leu Leu Ser Pro Ser Thr Thr Leu Arg Val Thr
65 70 75 80
Met Ser Gln Ala Ser Thr Glu Ala Ser Ser Asp Lys Val Thr Val Asn
85 90 95
Tyr Tyr Asp Glu Glu Gly Ser Ile Pro Ile Asp Gln Ala Gly Leu Phe
100 105 110
Leu Thr Ala Ile Glu Ile Ser Leu Asp Val Asp Ala Asp Arg Asp Gly
115 120 125
Val Val Glu Lys Asn Asn Pro Lys Lys Ala Ser Trp Thr Trp Gly Pro
130 135 140
Glu Gly Gln Gly Ala Ile Leu Leu Val Asn Cys Asp Arg Glu Thr Pro
145 150 155 160
Trp Leu Pro Lys Glu Asp Cys Arg Asp Glu Lys Val Tyr Ser Lys Glu
165 170 175
Asp Leu Lys Asp Met Ser Gln Met Ile Leu Arg Thr Lys Gly Pro Asp
180 185 190
Arg Leu Pro Ala Gly Tyr Glu Ile Val Leu Tyr Ile Ser Met Ser Asp
195 200 205
Ser Asp Lys Val Gly Val Phe Tyr Val Glu Asn Pro Phe Phe Gly Gln
210 215 220
Arg Tyr Ile His Ile Leu Gly Arg Arg Lys Leu Tyr His Val Val Lys
225 230 235 240
Tyr Thr Gly Gly Ser Ala Glu Leu Leu Phe Phe Val Glu Gly Leu Cys
245 250 255
Phe Pro Asp Glu Gly Phe Ser Gly Leu Val Ser Ile His Val Ser Leu
260 265 270
Leu Glu Tyr Met Ala Gln Asp Ile Pro Leu Thr Pro Ile Phe Thr Asp
275 280 285
Thr Val Ile Phe Arg Ile Ala Pro Trp Ile Met Thr Pro Asn Ile Leu
290 295 300
Pro Pro Val Ser Val Phe Val Cys Cys Met Lys Asp Asn Tyr Leu Phe
305 310 315 320
Leu Lys Glu Val Lys Asn Leu Val Glu Lys Thr Asn Cys Glu Leu Lys
325 330 335
Val Cys Phe Gln Tyr Leu Asn Arg Gly Asp Arg Trp Ile Gln Asp Glu
340 345 350
Ile Glu Phe Gly Tyr Ile Glu Ala Pro His Lys Gly Phe Pro Val Val
355 360 365
Leu Asp Ser Pro Arg Asp Gly Asn Leu Lys Asp Phe Pro Val Lys Glu
370 375 380
Leu Leu Gly Pro Asp Phe Gly Tyr Val Thr Arg Glu Pro Leu Phe Glu
385 390 395 400
Ser Val Thr Ser Leu Asp Ser Phe Gly Asn Leu Glu Val Ser Pro Pro
405 410 415
Val Thr Val Asn Gly Lys Thr Tyr Pro Leu Gly Arg Ile Leu Ile Gly
420 425 430
Ser Ser Phe Pro Leu
435
Claims (21)
- PADI2 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 항원 결합 단편, 또는 폴리펩티드, 또는 상기 PADI2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머 세트, 또는 뉴클레오티드를 포함하는 전이성 위암 진단용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, 및 NMU로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 이의 각각의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 항원 결합 단편, 또는 폴리펩티드, 또는 상기 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, 및 NMU 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머 세트, 또는 뉴클레오티드를 더 포함하는 것인 전이성 위암 진단용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 위암은 초기 위암인 것인 전이성 위암 진단용 조성물.
- 청구항 3에 있어서, 상기 초기 위암은 TNM 병기(TNM staging system) 기준으로 T1 내지 T2에 해당하는 것인 전이성 위암 진단용 조성물.
- 청구항 2에 있어서, 상기 PADI2 단백질은 서열번호 14의 서열을 포함하는 것이고, 상기 PADI2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 1 또는 2의 서열을 포함하는 것이고,
상기 APOBEC3A 단백질은 서열번호 15의 서열을 포함하는 것이고, 상기 APOBEC3A 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 3, 서열번호 3에서 171 내지 770번의 서열, 서열번호 4 및 서열번호 4에서 171 내지 716번의 서열 중 어느 하나의 서열을 포함하는 것이고,
상기 FCGR3B 단백질은 서열번호 16 내지 20 중 어느 하나의 서열을 포함하는 것이고, 상기 FCGR3B 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 5, 서열번호 5에서 261 내지 1070번의 서열, 서열번호 6, 서열번호 6에서 123번 내지 824번의 서열, 서열번호 7, 서열번호 7에서 261번 내지 1067번의 서열, 서열번호 8, 서열번호 8에서 286번 내지 936번의 서열, 서열번호 9 및 서열번호 9에서 286번 내지 678번의 서열 중 어느 하나의 서열을 포함하는 것이고,
상기 SERPINB5 단백질은 서열번호 21의 서열을 포함하는 것이고, 상기 SERPINB5 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 10 또는 서열번호 10에서 143번 내지 1270번의 서열을 포함하는 것이고,
상기 NMU 단백질은 서열번호 22 내지 24 중 어느 하나의 서열을 포함하는 것이고, 상기 NMU 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 11, 서열번호 11에서 107번 내지 631번의 서열, 서열번호 12, 서열번호 12에서 107번 내지 583번의 서열, 서열번호 13 및 서열번호 13에서 107번 내지 556번의 서열 중 어느 하나의 서열을 포함하는 것인 전이성 위암 진단용 조성물. - 청구항 1에 있어서, 진단 대상 시료로부터 세포핵을 단리하기 위한 시약을 더 포함하는 것인 전이성 위암 진단용 조성물.
- 청구항 6에 있어서, 상기 단리된 세포핵에 포함된 PADI2 단백질은 서열번호 14의 서열 중 1 내지 437번의 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 상기 단리된 세포핵에 포함된 PADI2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 25 또는 서열번호 25에서 65번 내지 1378번의 서열을 포함하는 것인 전이성 위암 진단용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, IL-1β, IL-6, 및 TNF-β로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이의 각각의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합, 또는 상기 IL-1β, IL-6, 및 TNF-β로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머, 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 더 포함하는 것인 전이성 위암 진단용 조성물.
- 청구항 1의 조성물 및 이를 검출하기 위한 시약을 포함하는 전이성 위암 진단용 키트.
- 전이성 위암 진단의 정보를 제공하기 위하여,
개체로부터 분리된 시료에 PADI2 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합, 또는 상기 PADI2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머, 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 접촉시켜 복합체를 형성시키는 단계; 및
상기 복합체로부터 PADI2 유전자의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 PADI2 유전자의 발현량을 측정하는 방법. - 청구항 10에 있어서, 상기 측정된 PADI2 유전자의 발현량을 PADI2 유전자의 표준 발현량과 각각 비교하는 단계를 더 포함하는 PADI2 유전자의 발현량을 측정하는 방법.
- 청구항 10에 있어서, 상기 개체로부터 분리된 시료는 상기 개체의 위 조직으로부터 유래된 정상 조직 및 병변 조직인 것인 PADI2 유전자의 발현량을 측정하는 방법.
- 청구항 12에 있어서, 상기 개체의 위 조직으로부터 유래된 정상 조직 및 병변 조직 각각으로부터 측정된 PADI2 유전자의 발현량을 비교하는 단계를 더 포함하는 PADI2 유전자의 발현량을 측정하는 방법.
- 청구항 10에 있어서, 상기 개체로부터 분리된 시료에서 상기 시료로부터 세포 핵을 단리시키는 단계를 더 포함하는 PADI2 유전자의 발현량을 측정하는 방법.
- 청구항 12에 있어서, PADI2 유전자 발현량의 경우, 비교된 PADI2의 발현량이 3배 이상 높은 경우, 상기 개체의 위암은 전이될 확률이 높을 것으로 결정하는 것인 PADI2 유전자의 발현량을 측정하는 방법.
- 청구항 10에 있어서, 상기 개체는 초기 위암에 걸린 것인 PADI2 유전자의 발현량을 측정하는 방법.
- 청구항 16에 있어서, 상기 초기 위암은 TNM 단계 시스템 기준으로 T1 내지 T2에 해당하는 것인 PADI2 유전자의 발현량을 측정하는 방법.
- 청구항 10에 있어서, IL-1β, IL-6, 및 TNF-β로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이의 각각의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합, 또는 상기 IL-1β, IL-6, 및 TNF-β로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머, 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 접촉시켜 복합체를 형성시키는 단계; 및
상기 복합체로부터 IL-1β, IL-6, 및 TNF-β로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 각각의 발현량을 측정하는 단계를 더 포함하는 PADI2 유전자의 발현량을 측정하는 방법. - 청구항 10에 있어서, 상기 발현량 측정은 RT-PCR, RNase 보호 분석법(RNase protection assay: RPA), 노던 블롯팅, 및 DNA 칩으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의한 것인 PADI2 유전자의 발현량을 측정하는 방법.
- 청구항 10에 있어서, 상기 발현량 측정은 웨스턴 블롯팅, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 또는 단백질 칩으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의한 것인 PADI2 유전자의 발현량을 측정하는 방법.
- 청구항 10에 있어서, APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, 및 NMU로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이의 각각의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합, 또는 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, 및 NMU로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 프로브, 프라이머, 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 접촉시켜 복합체를 형성시키는 단계; 및
상기 복합체로부터 APOBEC3A, FCGR3B, SERPINB5, 및 NMU로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 각각의 발현량을 측정하는 단계를 더 포함하는 PADI2 유전자의 발현량을 측정하는 방법.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020160177839A KR101883936B1 (ko) | 2016-12-23 | 2016-12-23 | 림프절 전이 예측용 마커 및 이를 이용한 림프절 전이 예측 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020160177839A KR101883936B1 (ko) | 2016-12-23 | 2016-12-23 | 림프절 전이 예측용 마커 및 이를 이용한 림프절 전이 예측 방법 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20180074109A KR20180074109A (ko) | 2018-07-03 |
KR101883936B1 true KR101883936B1 (ko) | 2018-07-31 |
Family
ID=62918218
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020160177839A KR101883936B1 (ko) | 2016-12-23 | 2016-12-23 | 림프절 전이 예측용 마커 및 이를 이용한 림프절 전이 예측 방법 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
KR (1) | KR101883936B1 (ko) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2686689C1 (ru) * | 2018-11-14 | 2019-04-30 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ростовский научно-исследовательский онкологический институт" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ прогнозирования перитонеальных метастазов рака желудка |
-
2016
- 2016-12-23 KR KR1020160177839A patent/KR101883936B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
Biotechnol Lett. 2009 Sep;31(9):1381-8. doi: 10.1007/s10529-009-0035-0. Epub 2009 May 30 |
BMC Cancer. 2016 Mar 16;16:225. doi: 10.1186/s12885-016-2247-8. |
Br. J. Cancer, Vol. 92, No. 6, pp. 1130-1136 (2005.03.28.)* |
Exp Ther Med. 2012 Jan; 3(1): 109-116. |
Gastric Cancer, Vol. 13, No. 4, pp. 212-221 (2010.12.03.)* |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2686689C1 (ru) * | 2018-11-14 | 2019-04-30 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ростовский научно-исследовательский онкологический институт" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ прогнозирования перитонеальных метастазов рака желудка |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20180074109A (ko) | 2018-07-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR102301464B1 (ko) | 종양 세포에 의한 면역 억제를 감소시키기 위한 방법 및 조성물 | |
AU2012340393B2 (en) | Methods and compositions for the treatment and diagnosis of bladder cancer | |
DK2681333T3 (en) | EVALUATION OF RESPONSE TO GASTROENTEROPANCREATIC NEUROENDOCRINE NEOPLASIS (GEP-NENE) THERAPY | |
US11674188B2 (en) | Biomarkers and combinations thereof for diagnosing tuberculosis | |
US20030175736A1 (en) | Expression profile of prostate cancer | |
KR20120047334A (ko) | 자궁내막암 마커 | |
KR20110015409A (ko) | 염증성 장 질환에 대한 유전자 발현 마커 | |
KR20140140069A (ko) | 전반적 발달장애의 진단 및 치료용 조성물 및 그 진단 및 치료 방법 | |
US20040219579A1 (en) | Methods of diagnosis of cancer, compositions and methods of screening for modulators of cancer | |
WO2018132369A1 (en) | Biomarkers predictive of anti-immune checkpoint response | |
KR101873249B1 (ko) | 혈액기반 유전자 발현패턴을 이용한 치매 진단 방법 | |
US8741868B2 (en) | Pharmaceutical composition including an HIF-2 alpha inhibitor as an active ingredient for preventing or treating arthritis | |
CN115209923A (zh) | 治疗肝病的组合物和方法 | |
KR101883936B1 (ko) | 림프절 전이 예측용 마커 및 이를 이용한 림프절 전이 예측 방법 | |
KR20190016302A (ko) | 치주질환 진단용 바이오마커 | |
WO2015013233A2 (en) | Methods and compositions for the treatment and diagnosis of bladder cancer | |
KR101270761B1 (ko) | 방사선 피폭 진단용 마커 트랜스알돌라아제, 그 마커의 발현수준을 측정하는 방사선 피폭 진단용 조성물, 그 조성물을 포함하는 방사선 피폭 진단용 키트, 및 그 마커를 이용한 방사선 피폭을 진단하는 방법 | |
KR20170124683A (ko) | 담도암 진단용 신규 바이오마커로서의 융합 유전자 및 융합 단백질 | |
KR102099684B1 (ko) | 항암제에 대한 감수성 예측용 바이오 마커 및 이의 용도 | |
KR101496745B1 (ko) | 인간 암세포의 불사화에 관련되는 유전자 및 그 용도 | |
KR101683961B1 (ko) | 방광암 재발 진단 마커 | |
KR102043802B1 (ko) | 갑상선 여포암 특이적 단백질분해조절 효소 유전자를 포함하는 갑상선 여포암 바이오마커 및 이를 이용한 갑상선 여포암 진단정보제공방법 | |
KR20180099123A (ko) | 항암제에 대한 저항성 예측용 바이오마커 | |
RU2813996C2 (ru) | Слитый белок из белка dctn1 с белком ret | |
CN101300348A (zh) | 肾癌诊断、肾癌患者预后预测用的组合物及方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A201 | Request for examination | ||
N231 | Notification of change of applicant | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
GRNT | Written decision to grant |