KR102099593B1 - 항-인간 인터루킨-2 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 인터루킨-2(human Interleukin-2, hIL-2)에 결합하는 항체에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 hIL-2의 특정 에피토프에 특이적으로 결합함으로써 hIL-2가 CD25에 결합하는 것을 저해하는 항-hIL-2 항체에 관한 것이다.
본 발명의 항-hIL-2 항체는 hIL-2의 특정 에피토프에 특이적으로 결합하여 hIL-2가 CD25에 결합하는 것을 저해함으로써, Treg 세포의 확장을 최소화 하고, 항종양 활성을 나타내는 CD8+ T 세포와 NK 세포를 자극시킨다. 따라서, 본 발명의 항-hIL-2 항체는 새로운 항암 치료제로 활용 가능하다.

Description

항-인간 인터루킨-2 항체 및 이의 용도{Anti-Human Interleukin-2 Antibodies and Uses thereof}
본 발명은 인간 인터루킨-2(human Interleukin-2, hIL-2)에 결합하는 항체에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 hIL-2의 특정 에피토프에 특이적으로 결합함으로써 hIL-2가 CD25에 결합하는 것을 저해하는 항-hIL-2 항체에 관한 것이다.
인터루킨-2(Interleukin-2, IL-2)는 Treg(Foxp3+ CD4+ 조절 T) 세포, 자연 살해세포(natural killer cell, NK 세포) 등 IL-2 수용체를 발현하는 T 세포를 포함하는 다양한 림프세포의 생존, 확장 및 기능에 필수적인 역할을 하는 다변발현(pleiotropic) 사이토카인(cytokine)이다. IL-2 수용체(Interleukin-2 receptor, IL-2R)는 친화도에 따라 고친화성 IL-2 수용체(high-affinity IL-2R)와 저친화성 IL-2 수용체(low-affinity IL-2R)로 존재한다. 고친화성 IL-2 수용체는 IL-2Rγc(CD132), IL-2Rβ(CD122) 및 IL-2Rα(CD25)의 3개의 사슬로 구성되어 있으며, 낮은 친화성 IL-2 수용체는 오직IL-2Rγc, IL-2Rβ 사슬로만 구성되어 있다(Boyman, O., et al., Nat Rev Immunol, 2012. 12(3): p. 180-90).
IL-2는 항종양 활성(anti-tumor activity)을 가진 CD8+ T 세포와 NK 세포를 자극하기 때문에 1990년대 미국과 유럽에서 전이성 흑색종과 전이성 신장암 치료를 위해 임상적으로 사용되었다(Rosenberg, S.A., J Immunol, 2014. 192(12): p. 5451-8). 그러나 IL-2 치료는 치료받는 암 환자의 10% 미만에서만 효과적일 뿐이었으며, 심각한 부작용을 동반하였다. 이는 투여된 IL-2가 생체 내(in vivo)에서 매우 짧은 반감기를 가지고 항종양 활성을 가진 CD8+ T 세포와 NK 세포는 저친화성 IL-2 수용체를 발현하기 때문에 다량의 IL-2 투여가 요구되고, 이로 인해 혈관 누출 증후군과 저혈압으로 인한 다기관의 심각한 질환을 유발하기 때문이다(Lotze, M.T., et al., J Immunol, 1985. 134(1): p. 157-66, Schwartz, R.N., et al., Oncology (Williston Park), 2002. 16(11 Suppl 13): p. 11-20). 다른 문제점은 IL-2 투여가 고친화성 IL-2 수용체를 발현하고 CD8+ T 세포 및 NK 세포에 의해 매개되는 항종양 면역을 억제하는 Treg 세포의 강력한 확장을 유도한다는 것이다(Brandenburg, S., et al., Eur J Immunol, 2008. 38(6): p. 1643-53; Facciabene, A., et al., Cancer Res, 2012. 72(9): p. 2162-71). IL-2 치료의 이러한 단점을 해결하는 방법은 IL-2의 생체 내 반감기를 연장시키면서 동시에 저친화성 IL-2 수용체를 발현하는 CD8+ T 세포 및 NK 세포를 선택적으로 활성화 시키는 것이고 이를 위한 많은 시도가 있었지만 약간의 성공이 있었을 뿐이었다(Arenas-Ramirez, N., et al., Sci Transl Med, 2016. 8(367): p. 367ra166).
최근 고친화성 IL-2 수용체에 결합하는 IL-2의 아미노산 잔기 변형이 해결방법으로 제안되었으나, 인위적으로 도입된 아미노산 서열을 분해하는 단백질 분해 효소에 대해 면역원성을 갖거나 또는 감수성을 갖는 변형된 IL-2를 제공할 수 있다는 한계점이 있다(Levin, A.M., et al., Nature, 2012. 484(7395): p. 529-33).
이에, 본 발명자들은 IL-2에 부자연스런 변형을 일으키지 않고, IL-2의 생체 내 반감기를 연장시키면서 동시에 저친화성 IL-2 수용체를 발현하는 CD8+ T 세포 및 NK 세포를 선택적으로 활성화 시키는 방법을 개발하고자 노력한 결과, IL-2에 특정 특이성을 갖는 항-IL-2 모노클로날 항체(monoclonal AB, mAb)를 결합시키면 IL-2가 고친화성 수용체에 결합하는 것을 선택적으로 저해한다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
Boyman, O., et al., Science, 2006. 311(5769): p. 1924-7 Letourneau, S., et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2010. 107(5): p. 2171-6
본 발명의 목적은 인간 인터루킨-2(human interleukin-2, hIL-2)에 특이적으로 결합하고, 상기 hIL-2가 CD25에 결합하는 것을 저해하는, 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 세포, 이를 이용한 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물 및 치료방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 이중특이 항체 또는 항체-약물 접합체, 이를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물 및 치료방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 면역관문억제제를 포함하는 암 치료용 병용 투여 조성물 및 치료방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1; 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1; 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포 및 이를 이용한 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 hIL-2가 결합된 복합체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물 및 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 이중특이 항체 또는 항체-약물 접합체, 이를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물 및 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 면역관문억제제를 포함하는 암 치료용 병용 투여 조성물 및 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 백신 효능 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 항-hIL-2 항체는 hIL-2의 특정 에피토프에 특이적으로 결합하여 hIL-2가 CD25에 결합하는 것을 저해함으로써, Treg 세포의 확장을 최소화 하고, 항종양 활성을 나타내는 CD8+ T 세포와 NK 세포를 자극시킨다. 따라서, 본 발명의 항-hIL-2 항체는 새로운 항암 치료제로 활용하는 데 유용하다.
도 1은 TCB2 모노클로날 항체의 hIL-2에 대한 결합 특이성 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 hIL-2/TCB2 복합체에 의한 생체 내(in vivo) 면역자극 효과를 나타낸 것이다. 도 2A는 면역세포 빈도 분석 결과, 도 2B는 CD4 및 CD8 T 세포에서 CD44 및 CD62L의 발현 분석 결과, 도 2C는 실험 통계 분석 결과, 도 2D는 hIL-2/MAB602 또는 hIL-2/TCB2 복합체에 의한 면역세포들의 확장효과에 대한 결과와 실험 통계 분석이다(**p <0.01, ***p <0.001 (unpaired t test)).
도 3은 항-hIL-2 mAbs의 hIL-2에 대한 친화도를 Biacore T100을 이용하여 표면 플라몬 공명 곡선으로 나타낸 것이다.
도 4는 고형종양에 대한 hIL-2/TCB2 복합체의 효과를 나타낸 것이다(***p <0.001 (Two way ANOVA for day 12, unpaired t test for day 14)).
도 5는 전이성 종양에 대한 TCB2 mAb의 효과를 나타낸 것이다(***p <0.001 (unpaired t test)).
도 6은 B6F10 흑색종 모델에서 hIL-2/TCB2 복합체 및 tumor peptide therapy 병용의 항종양 효과를 나타낸 것이다(***p <0.001 (Two way ANOVA)).
도 7은 CT26 종양 모델(Balb/C colon cancer)에서 hIL-2/TCB2 복합체 및 항-CTLA-4 항체 병용의 항종양 효과를 나타낸 것이다(**p <0.01 (Two way ANOVA for day 17, unpaired t test for day 24)).
도 8은 MC38 종양 모델(B6 colon cancer)에서 hIL-2/TCB2 복합체 및 항-PD-1 항체 병용의 항종양 효과를 나타낸 것이다(*p <0.05, **p <0.01 (Two way ANOVA for day 19, unpaired t test for day 21)).
도 9는 hIL-2/hnTCB2 복합체에 의한 생체 내(in vivo) 면역자극 효과에 대한 결과와 실험 통계 분석이다.
도 10은 MC38 종양 모델(B6 colon cancer)에서 hIL-2/hnTCB2 복합체 및 항-PD-1 항체 병용의 항종양 효과를 나타낸 것이다(*p <0.05, **p <0.01 (Two way ANOVA for day 19 and 22, unpaired t test for day 25)).
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 부자연스런 변형을 일으키지 않고, IL-2의 생체 내 반감기를 연장시키면서 동시에 저친화성 IL-2 수용체를 발현하는 CD8+ T 세포 및 NK 세포를 선택적으로 활성화 시키는 방법을 개발하고자 노력한 결과, IL-2에 특정 특이성을 갖는 항-IL-2 모노클로날 항체(monoclonal AB, mAb)를 결합시키면 IL-2가 고친화성 수용체에 결합하는 것을 선택적으로 저해한다는 것을 확인하고자 하였다.
본 발명은 일 관점에서, 인간 인터루킨-2(human interleukin-2, hIL-2)에 특이적으로 결합하고, 상기 hIL-2가 CD25에 결합하는 것을 저해하는, 항-hIL-2 항체(본 명세서 내에서 'TCB2'로 나타낸다) 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 인간 인터루킨-2(human interleukin-2, hIL-2)란, 어떤 다른 인자와도 실질적인 서열 상동성을 갖지 않는 133개의 아미노산으로 된 단백질(15.4 kDa)을 나타내는 것이다.
본 발명에 있어서, CD25란, IL-2 수용체의 IL-2Rα 사슬을 나타내는 것으로, IL-2 수용체는 친화도에 따라 고친화성 IL-2 수용체(high-affinity IL-2R)와 저친화성 IL-2 수용체(low-affinity IL-2R)로 존재하며, CD25는 낮은 친화성 IL-2 수용체에는 존재하지 않으며, 고친화성 IL-2 수용체에만 존재하는 사슬이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "항체"란, 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 물질을 의미하는 것으로서 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 항체는 최근에 질병 치료제의 용도로 많이 사용되고 있다. 항체는 생체 외뿐 아니라 생체 내에서도 매우 안정하고 반감기가 길기 때문에 대량 발현 및 생산에 유리하다. 또한, 항체는 본질적으로 다이머(dimer) 구조를 가지므로 접착능(avidity)이 매우 높다. 완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
본 발명에 있어서, 항체는 동물 유래 항체, 키메릭 항체, 인간화 항체 및 인간 항체를 모두 포함한다. 원하는 항원을 피면역 동물에게 면역시켜 생산하는 동물 유래 항체는 일반적으로 치료 목적으로 인간에 투여 시 면역거부반응이 일어날 수 있으며, 이러한 면역거부반응을 억제하고자 키메릭 항체(chimeric antibody)가 개발되었다. 키메릭 항체는 유전공학적 방법을 이용하여 항-아이소타입(anti-isotype) 반응의 원인이 되는 동물 유래 항체의 불변 영역을 인간 항체의 불변 영역으로 치환한 것이다. 키메릭 항체는 동물 유래 항체에 비하여 항-아이소타입 반응에 있어서 상당 부분 개선되었으나, 여전히 동물 유래 아미노산들이 가변 영역에 존재하고 있어 잠재적인 항-이디오타입(anti-idiotypic) 반응에 대한 부작용을 내포하고 있다. 이러한 부작용을 개선하고자 개발된 것이 인간화 항체(humanized antibody)이다. 이는 키메릭 항체의 가변 영역 중 항원의 결합에 중요한 역할을 하는 CDR(complementarity determining regions, 상보성 결정 영역) 부위를 인간 항체 골격(framework)에 이식하여 제작된다.
상기 "인간화 항체"는 인간화 경쇄 가변 도메인 면역 글로불린 및 인간화 중쇄 가변 도메인 면역글로불린을 포함한다. 인간화 항체는 하나 이상의 인간 유전자 서열에서 부분적으로 또는 전체로 유도된 일정 영역(합성 아날로그 포함)을 포함할 수 있다. 인간화 항체는 CDR을 제공하는 공여자 항체와 동일한 표적 항원에 결합할 것으로 기대된다. 통상, 인간화 항체 또는 면역글로불린의 모든 세그먼트 또는 부분은, CDR을 제외하고, 자연발생 또는 보존(consensus) 인간 면역글로불린 서열의 대응하는 세그먼트 또는 부분과 실질적으로 동일하거나 실질적으로 동종성이다. 인간화 항체를 제작하기 위한 CDR 이식(grafting) 기술에 있어서 가장 중요한 것은 동물 유래 항체의 CDR 부위를 가장 잘 받아들일 수 있는 최적화된 인간 항체를 선정하는 것이며, 이를 위하여 항체 데이터베이스의 활용, 결정구조(crystal structure)의 분석, 분자모델링 기술 등이 활용된다. 그러나, 최적화된 인간 항체 골격에 동물 유래 항체의 CDR 부위를 이식할지라도 동물 유래 항체의 골격에 위치하면서 항원 결합에 영향을 미치는 아미노산이 존재하는 경우가 있기 때문에, 항원 결합력이 보존되지 못하는 경우가 상당수 존재하므로, 항원 결합력을 복원하기 위한 추가적인 항체 공학 기술의 적용은 필수적이라고 할 수 있다.
본 발명의 용어 "모노클로날 항체(monoclonal Ab, mAb)"란, 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미로 사용된 것으로, 결합된 항원상의 단일 에피토프를 인식하는 항체를 의미하는 것이다. 이점이 동일한 항원에 결합하나 그 항원의 상이한 에피토프에 결합하는 구별되는 항체들의 집합을 뜻하는 폴리클로날 항체와 대비된다. 이러한 이유로 단일 항원 분자는 복수의 폴리클로날 항체들에 의해 동시에 결합될 수 있으나, 이 항원에 특이적인 특정 모노클로날 항체는 오직 한 분자만에 의해 결합될 수 있다. 단일 모노클로날 항체 분자에 의해 결합된 후, 결합된 에피토프는 차단되고 따라서 더 이상 다른 동일한 모노클로날 항체에 의해 결합될 수 없다. 항체의 모노클로날 성질은 치료제로서의 사용에 특히 적합하며, 이는 이러한 항체가 단일, 동종성 분자종이기 때문에 매우 잘 특성화될 수 있고 재현 가능하게 제조되고 정제가능하기 때문이다. 이러한 요인들은 생물학적 활성이 매우 높은 수준의 정밀성으로 예측될 수 있는 제품을 생산 가능하게 하고, 이러한 분자는 포유류, 특히 인간에서의 치료적 투여에 대해 관청에서의 허가를 얻어야 하기 때문에 상기 요인들은 특히 중요하다.
본 명세서에서 사용된 용어 "중쇄(heavy chain)"란, 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3과 힌지(hinge)를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 것이다. 본 명세서에서 사용된 용어 "경쇄(light chain)"란, 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 3, 서열번호 23, 서열번호 28, 서열번호 32 및 서열번호 34로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 4, 서열번호 24, 서열번호 26 및 서열번호 30으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는 서열번호 3의 중쇄 가변영역 및 서열번호 4의 경쇄 가변영역; 서열번호 23의 중쇄 가변영역 및 서열번호 24의 경쇄 가변영역; 서열번호 28의 중쇄 가변영역 및 서열번호 26의 경쇄 가변영역; 서열번호 32의 중쇄 가변영역 및 서열번호 30의 경쇄 가변영역; 또는 서열번호 34의 중쇄 가변영역 및 서열번호 30의 경쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)"이란, 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다(중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3 및 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2, 경쇄 CDR3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 5의 DNA 서열을 포함하는 중쇄 CDR1; 서열번호 6의 DNA 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및 서열번호 7의 DNA 서열을 포함하는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 8의 DNA 서열을 포함하는 경쇄 CDR1; 서열번호 9의 DNA 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 및 서열번호 10의 DNA 서열을 포함하는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1; 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1; 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2; 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어 "특이적으로 결합"이란, 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다. 본 발명에서는 인간 IL-2(hIL-2)가 수개의 hIL-2와 상이한 기타 잠재적 항원을 구별할 수 있는 인간 모노클로날 항체 또는 그 단편의 능력을 지칭하는 것이며, 상기 구별은 복수의 상이한 항원 풀에서 잠재적 결합 파트너로서 오직 hIL-2와 결합하거나 상당한 정도로 결합하는 정도로 이루어진다. 이 경우, hIL-2와 상당한 정도로 결합한다는 것은 복수의 동등하게 접근가능한 상이한 항원 풀에서 잠재적 결합 파트너로서 hIL-2가 hIL-2이 아닌 다른 항원보다 적어도 10배, 바람직하게는 50배, 가장 바람직하게는 100배 또는 그 이상으로 결합함을 의미한다.
본 발명의 용어 "항원 결합 단편"이란, 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩타이드의 일부를 의미한다. 예를 들어, scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 또는 F(ab')2일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 항원 결합 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변 영역및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 상기 링커는 1 내지 100개 또는 2 내지 50개의 임의의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있으며, 당업계에 적절한 서열이 알려져 있다. 상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다. 본 발명의 항체의 항원 결합 단편은 상기 CDR을 하나 이상 포함하는 단편일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 CD8+ T 세포와 NK 세포의 확장을 유도하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 본 발명에 따른 항-hIL-2 항체가 CD8+ T 세포 및 NK 세포 활성화를 유도하고, 적은 Treg 세포 확장을 유도하는 것을 확인하였다.
본 발명은 다른 관점에서, 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31 또는 서열번호 33의 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 1, 서열번호 27, 서열번호 31 또는 서열번호 33 및/또는 본 발명에 따른 항체의 경쇄를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 2, 서열번호 25 또는 서열번호 29이다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 분리하여 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 재조합적으로 생산할 수 있다. 핵산을 분리하고, 이를 복제 가능한 벡터 내로 삽입하여 추가로 클로닝하거나 (DNA의 증폭) 또는 추가로 발현시킨다.
본 발명의 용어 "핵산"이란, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
본 발명의 핵산은 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함한다. 실질적인 동일성은 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인 된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
상기 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 과정을 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄와 경쇄를 암호화하는 DNA와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 분리 또는 합성한다.
발명은 또 다른 관점에서 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.
많은 벡터가 입수 가능하다. 벡터 성분에는 일반적으로, 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 증강인자 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열이 가능하다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "벡터"는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다. 상기 벡터에서 항체를 코딩하는 핵산은 프로모터와 작동적으로 연결되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "작동적으로 연결"이란, 핵산 발현조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 또한, 예를 들어, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
경우에 따라서, 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은, 예컨대 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.
상기 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다. 본 발명의 항체를 생성시키기 위해 사용된 세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 형질전환된 세포는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주세포를 이용할 수 있다.
다만, 동물 세포에 대한 관심이 가장 크며, 유용한 숙주 세포주의 예는 COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S, 또는 HT1080일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 세포를 배양하여 본 발명에 따른 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 발현시키는 단계를 포함하는 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법에 관한 것이다.
상기 세포는 각종 배지에서 배양할 수 있다. 시판용 배지 중 제한 없이 배양 배지로서 사용할 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수 보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 숙주 세포와 함께 이미 사용되고 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다.
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 회수는 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 불순물을 제거하고, 그 결과물을 예를 들어 친화 크로마토그래피 등을 이용하여 정제할 수 있다. 추가의 기타 정제 기술 예를 들어 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 등이 사용될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 hIL-2가 결합된 복합체에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 약물이 접합된 항체-약물 접합체(Antibody-drug conjugate, ADC)에 관한 것이다.
항체-약물 접합체(Antibody-drug conjugate, ADC)는 타겟 암세포로 항암 약물을 전달하기 전까지 항암 약물이 항체에 안정적으로 결합되어 있어야 한다. 타겟으로 전달된 약물은 항체로부터 유리되어 타겟 세포의 사멸을 유도해야 한다. 이를 위해서는 약물이 항체에 안정적으로 결합함과 동시에 타겟 세포에서 유리될 때는 타겟 세포의 사멸을 유도할 충분한 세포독성을 가져야 한다.
본 발명에 있어서, 상기 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 항암제 등 약물을 포함하는 세포독성물질은 서로 결합(예컨대, 공유결합, 펩타이드 결합 등에 의함)되어 접합체(conjugate) 또는 융합 단백질(세포독성물질 및/또는 표지물질이 단백질인 경우)의 형태로 사용될 수 있다. 상기 세포독성물질은 암세포, 특히 고형암세포에 대하여 독성을 갖는 모든 물질일 수 있으며, 방사선동위원소, 세포 독소 화합물(small molecule), 세포 독성 단백질, 항암제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 세포 독소 단백질은 리신(ricin), 사포린(saporin), 젤로닌(gelonin), 모모딘(momordin), 데보가닌 (debouganin), 디프테리아독소, 녹농균독소(pseudomonas toxin) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 방사선동위원소로는 131I, 188Rh, 90Y 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 세포 독소 화합물은 듀오카마이신(duocarmycin), 모노메틸 아우리스타틴 E(monomethyl auristatin E; MMAE), 모노메틸 아우리스타틴 F(monomethyl auristatin F; MMAF), N2'-디아세틸-N2'-(3-머캅토-1-옥소프로필)메이탄신(N2'-deacetyl-N2'-(3-mercapto-1-oxopropyl)maytansine; DM1), PBD(Pyrrolobenzodiazepine) dimer 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 항체-약물 접합체는 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려진 기술에 따른 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항체-약물 접합체는 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 링커를 통하여 약물과 결합되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 링커는 절단성 링커 또는 비절단성 링커인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 링커는 항-hIL-2 항체와 약물 사이를 연결하는 부위로, 예를 들어 상기 링커는 세포 내 조건에서 절단 가능한 형태 즉, 세포 내 환경에서 항체에서 약물이 링커의 절단을 통해 방출될 수 있도록 한다.
상기 링커는 세포 내 환경 예를 들어 리소좀 또는 엔도좀에 존재하는 절단제에 의해 절단될 수 있으며, 세포 내 펩티다아제 또는 프로테아제 효소 예를 들어 리소좀 또는 엔도좀 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 펩타이드 링커일 수 있다. 일반적으로 펩타이드 링커는 적어도 2개 이상의 아미노산 길이를 가진다. 상기 절단제는 카텝신 B 및 카텝신 D, 플라스민을 포함할 수 있으며, 펩타이드를 가수분해 하여 약물을 표적 세포 내로 방출할 수 있도록 한다. 상기 펩타이드 링커는 티올 의존성 프로테아제 카텝신-B에 의해 절단될 수 있고, 이는 암 조직에서 고발현되며, 예를 들어 Phe-Leu 또는 Gly-Phe-Leu-Gly 링커가 사용될 수 있다. 또한, 상기 펩타이드 링커는 예를 들어 세포 내 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 것으로, Val-Cit 링커이거나 Phe-Lys 링커일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 절단성 링커는 pH 민감성으로, 특정 pH 값에서 가수분해에 민감할 수 있다. 일반적으로, pH 민감성 링커는 산성 조건에서 가수분해될 수 있음을 나타낸다. 예를 들어, 리소좀에서 가수분해될 수 있는 산성 불안정 링커 예를 들어, 하이드라존, 세미카바존, 티오세미카바존, 시스-아코니틱 아마이드(cis-aconitic amide), 오르쏘에스테르, 아세탈, 케탈 등일 수 있다.
상기 링커는 환원 조건에서 절단될 수도 있으며, 예를 들어 이황화 링커가 이에 해당할 수 있다. SATA(N-succinimidyl-S-acetylthioacetate), SPDP(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate), SPDB(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)butyrate) 및 SMPT(N-succinimidyl-oxycarbonyl-alpha-methyl-alpha-(2-pyridyl-dithio)toluene)를 사용하여 다양한 이황화 결합이 형성될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약물 및/또는 약물-링커는 항체의 라이신을 통해 무작위로 접합되거나, 이황화 결합 사슬을 환원하였을 때 노출되는 시스테인을 통해 접합될 수 있다. 경우에 따라서, 유전공학적으로 제작된 태그 예를 들어, 펩타이드 또는 단백질에 존재하는 시스테인을 통해 링커-약물이 결합될 수 있다. 상기 유전공학적으로 제작된 태그 예를 들어, 펩타이드 또는 단백질은 예를 들어, 이소프레노이드 트랜스퍼라제에 의하여 인식될 수 있는 아미노산 모티프를 포함할 수 있다. 상기 펩타이드 또는 단백질은 펩타이드 또는 단백질의 카복시 말단에서 결실(deletion)을 가지거나, 펩타이드 또는 단백질의 카복시(C) 말단에 스페이서 유닛의 공유결합을 통한 부가를 갖는다. 상기 펩타이드 또는 단백질은 아미노산 모티프와 바로 공유결합 되거나, 스페이서 유닛과 공유결합 되어 아미노산 모티프와 연결될 수 있다. 상기 아미노산 스페이서 유닛은 1 내지 20개의 아미노산으로 구성되며, 그 중에서 글리신(glycine) 유닛이 바람직하다.
상기 링커는 리소좀에서 다수 존재하거나, 또는 몇몇 종양세포에서 과발현되는 베타-글루쿠로니데이즈(β-glucuronidase)에 의해 인식되어 가수분해 되는 베타-글루쿠로나이드 링커를 포함할 수 있다. 펩타이드 링커와는 달리 친수성(hydrophilicity)이 커서 소수성의 성질이 높은 약물과 결합시 항체-약물 복합체의 용해도를 증가시킬 수 있는 장점을 지닌다.
또한, 상기 링커는 비절단성 링커일 수 있으며, 항체 가수분해 한 단계만을 통해 약물이 방출되어, 예를 들어 아미노산-링커-약물 복합체를 생산한다. 이러한 유형의 링커는 티오에테르기 또는 말레이미도카프로일기(maleimidocaproyl)일 수 있고, 혈액 내 안정성을 유지할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약물은 화학요법제, 독소, 마이크로 RNA(miRNA), siRNA, shRNA 또는 방사성 동위원소인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 약물은 약리학적 효과를 나타내는 제제로 항체에 결합될 수 있다.
상기 화학요법제는 세포독성 제제 또는 면역억제제일 수 있다. 구체적으로 마이크로투불린 억제제, 유사분열 억제제, 토포이소머라아제 억제제, 또는 DNA 인터컬레이터로서 기능할 수 있는 화학요법제를 포함할 수 있다. 또한, 면역조절 화합물, 항암제, 항바이러스제, 항박테리아제, 항진균제, 구충제 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
상기 약물에는 예를 들어, 마이탄시노이드, 오리스타틴, 아미노프테린, 악티노마이신, 블레오마이신, 탈리소마이신, 캄프토쎄신, N8-아세틸 스퍼미딘, 1-(2 클로로에틸)-1,2-다이메틸 술포닐 하이드라자이드, 에스퍼라마이신, 에토포사이드, 6-머캅토퓨린, 돌라스타틴, 트리코테센, 칼리케아미신, 탁솔(taxol), 탁산, 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 메토트렉세이트, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 A, 미토마이신 C, 클로람부실, 듀오카마이신, L-아스파라기나제(L-asparaginase), 머캡토퓨린(mercaptopurine), 티오구아닌(thioguanine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 시타라빈(cytarabine), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 니트로소우레아(nitrosourea), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 미토마이신(mitomycin), 다카바진(dacarbazine), 프로카바진(procarbazine), 토포테칸(topotecan), 질소 머스터드(nitrogen mustard), 사이톡산(cytoxan), 에토포시드(etoposide), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), CNU(bischloroethylnitrosourea), 이리노테칸(irinotecan), 캄포토테신(camptothecin), 블레오마이신(bleomycin), 이다루비신(idarubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 닥티노마이신(dactinomycin), 플리카마이신(plicamycin), 미톡산트론(mitoxantrone), 아스파라기나제(asparaginase), 비노렐빈(vinorelbine), 클로로람부실(chlorambucil), 멜파란(melphalan), 카르무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine), 부설판(busuLfan), 트레오설판(treosulfan), 데카바진(decarbazine), 에토포시드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 토포테칸(topotecan), 9-아미노캠프토테신(9-aminocamptothecin), 크리스나톨(crisnatol), 미토마이신 C(mitomycin C), 트리메트렉세이트(trimetrexate), 마이코페놀산(mycophenolic acid), 티아조퓨린(tiazofurin), 리바비린(ribavirin), EICAR(5-ethynyl-1-beta-Dribofuranosylimidazole-4-carboxamide), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 데프록사민(deferoxamine), 플룩수리딘(floxuridine), 독시플루리딘(doxifluridine), 랄티트렉세드(raltitrexed), 시타라빈(cytarabine(ara C)), 시토신 아라비노시드(cytosine arabinoside), 플루다라빈(fludarabine), 타목시펜(tamoxifen), 라록시펜(raloxifene), 메게스트롤(megestrol), 고세렐린(goserelin), 류프롤리드 아세 테이트(leuprolide acetate), 플루타미드(flutamide), 바이칼루타마이드(bicalutamide), EB1089, CB1093, KH1060, 베르테포르핀(verteporfin), 프탈로시아닌(phthalocyanine), 광감작제 Pe4(photosensitizer Pe4), 데메톡시-하이포크레린 A(demethoxy-hypocrellin A), 인터페론-α(Interferon-α), 인터페론-γ(Interferon-γ), 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor), 겜사이타빈(Gemcitabine), 벨케이드(velcade), 레발미드(revamid), 탈라미드(thalamid), 로바스타틴(lovastatin), 1-메틸-4-페닐피리디늄 이온(1-methyl-4-phenylpyridiniumion), 스타우로스포린(staurosporine), 악티노마이신 D(actinomycin D), 닥티노마이신(dactinomycin), 블레오마이신 A2(bleomycin A2), 블레오마이신 B2(bleomycinB2), 페플로마이신(peplomycin), 에피루비신(epirubicin), 피라루비신(pirarubicin), 조루비신(zorubicin), 마이토산트론(mitoxantrone), 베라파밀(verapamil) 및 탑시가르긴(thapsigargin), 핵산 분해 효소 및 세균이나 동식물 유래의 독소로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 약물은 링커 및 링커 시약 상의 친전자성 기와 공유결합을 형성하기 위해 반응할 수 있는 아민, 티올, 히드록실, 히드라지드, 옥심, 히드라진, 티오세미카바존, 히드라진 카르복실레이트, 및 아릴히드라지드기로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 친핵기를 포함할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 이중특이 항체(Bispecific antibody)에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 이중특이 항체는 항체의 2개의 암(arm) 중에서, 하나의 암(arm)은 본 발명에 따른 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하고, 나머지 다른 암(arm)은 hIL-2 이외의 다른 항원, 바람직하게는 암 관련 항원 또는 면역관문 단백질 항원에 특이적인 항체, 또는 면역효능세포 관련 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 형태를 의미한다.
상기 이중항체에 포함되는 항-hIL-2 항체 이외의 항체가 결합하는 항원은, 바람직하게는 암 관련 항원 또는 면역관문 단백질 항원으로 Her2, EGFR, VEGF, VEGF-R, CD-20, MUC16, CD30, CD33, CD52, PD-1, PD-L1, CTLA4, BTLA4, EphB2, E-셀렉틴(selectin), EpCam, CEA, PSMA, PSA, ERB3, c-MET 등에서 선택될 수 있고, 면역효능세포 관련 항원으로는 TCR/CD3, CD16(FcγRIIIa) CD44, CD56, CD69, CD64(FcγRI), CD89 및 CD11b/CD18(CR3) 등이 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 이중특이 항체 또는 항체-약물 접합체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
"암"이란, 세포의 정상적인 분열, 분화 및 사멸의 조절 기능에 문제가 발생하여 비정상적으로 과다 증식하여 주위 조직 및 장기에 침윤하여 덩어리를 형성하고 기존의 구조를 파괴하거나 변형시키는 상태를 의미하는 것이다. "고형암(solid cancer)"은 혈액암과는 구별되는 특징을 지니고, 방광, 유방, 장, 신장, 폐, 간, 뇌, 식도, 쓸개, 난소, 췌장, 위, 자궁경부, 갑상선, 전립선 및 피부 등의 여러 고형 장기(solid organ)에서 비정상적으로 세포가 성장하여 발생한 덩어리로 이루어진 암을 의미하는 것이다. "전이암"은 암이 최초 발생된 부위에서 분리된 암세포가 혈액, 림프관 등을 통해 다른 부위에 전이되어 증식함으로써 발생한다. 본 발명의 조성물은 고형암 및/또는 전이암의 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있으며, 예를 들어, 피부암, 유방암, 대장암, 신장암, 폐암, 간암, 뇌암, 식도암, 쓸개암, 난소암, 췌장암, 위암, 자궁경부암, 갑상선암, 전립선암, 방광암의 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어 "예방"이란, 조성물의 투여에 의해 암의 전이, 성장 등을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하는 것이며, "치료"란 조성물의 투여에 의해 암에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미하는 것이다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 담체는 약물의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 조성물은 또한 약학 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.
상기 조성물, 또는 상기 항체의 약학적 유효량은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
상기 조성물 내의 항-hIL-2 항체(TCB2 mAb)의 함유량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 예컨대, 상기 항-hIL-2 항체(TCB2 mAb)의 1일 투여량은 0.001 내지 1000㎎/kg, 구체적으로 0.01 내지 100㎎/kg, 보다 구체적으로 0.1 내지 50㎎/kg범위일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 1일 투여량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나, 적절하게 분량하여 제제화되거나, 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 상기 "약학적 유효량"은 소망하는 약리적 효과를 나타낼 수 있는 유효 성분의 함량 또는 투여량을 의미하는 것일 수 있으며, 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 정해질 수 있다.
본 발명의 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
특히, 상기 항-hIL-2 항체(TCB2 mAb)를 포함하는 조성물은 항체를 포함하므로, 면역 리포좀으로 제형화될 수 있다. 항체를 포함하는 리포좀은 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 면역 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 폴리에틸렌글리콜-유도체화된 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 지질 조성물로서 역상 증발법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fab' 단편은 디설파이드-교체 반응을 통해 리포좀에 접합될 수 있다.
본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.
임의의 항암제, 예를 들면 시스플라스틴은 악액질, 근육감소증, 근육 소모, 뼈 소모 또는 비자발적인 체중 소실과 같이 부작용을 가진다. 따라서, 본 발명은 악액질, 근육감소증, 근육 소모, 뼈 소모 또는 비자발적인 체중의 소실의 중증도, 빈도 또는 발생을 예방하거나 최소화하거나 낮추면서 암을 치료하기 위한 조성물 또는 암 치료방법을 포함할 수 있다.
하나 이상의 항암제와 조합하여 본 발명의 항-hIL-2 항체의 유효량을 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구현예들에서, 본 발명은 악액질, 근육감소증 또는 근육 소모 뼈 소모 또는 비자발적 체중 소실의 중증도, 빈도 또는 발생을 예방하거나 최소화하거나 낮추면서 암을 치료하는 방법을 포함하되, 방법은 악액질, 근육감소증 또는 근육 소모, 뼈 소모 또는 비자발적인 체중의 소실의 중증도, 빈도 또는 발생을 유발하거나 증가시키는 것으로 알려진 하나 이상의 항암제와 조합하여 본 발명의 항-hIL-2 항체의 유효량을 포함하는 약학적 조성물을 환자에 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 면역관문억제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 치료용 병용 투여 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 면역관문억제제는 immune checkpoint inhibitor 또는 checkpoint inhibitor를 의미하고, 항-CTLA-4 항체 또는 항-PD-1 항체인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
"병용"은 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 면역관문억제제 각각이 동시, 순차적, 또는 역순으로 투여될 수 있음을 의미하는 것으로, 당업자의 범위 내 적절한 유효량의 조합으로 투여될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 항-CTLA-4 항체 또는 항-PD-1 항체와 본 발명에 따른 항-hIL-2 항체를 순차적으로 처리한 경우, 종양의 성장을 더욱 억제하는 것을 확인하였다.
상기 병용 투여 조성물은 항-hIL-2 항체를 포함하고, 이와 관련된 구성은 앞서 설명한 암의 예방 또는 치료용 조성물에 포함된 구성과 동일하므로 각 구성에 대한 설명은 병용 투여용 조성물에서도 동일하게 적용된다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 백신 효능 증진용 조성물에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "백신"이란, 생체에 면역을 주는 항원을 함유한 생물학적인 제제로서, 감염증 예방을 위하여 사람이나 동물에 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원 또는 항원성 물질을 의미하는 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: TCB2 모노클로날 항체의 hIL - 2에 대한 결합 특이성 실험
hIL-2/TCB2 mAb 복합체의 치료 효능을 평가하기 위해 생체 내(in vivo) 마우스 모델을 이용하였기 때문에, TCB2 mAb가 마우스 IL-2(mIL-2)에 대한 교차 반응성(cross-reactivity)을 보이는지 TCB2 mAb의 hIL-2에 대한 결합 특이성 실험을 하였다. 우선, 수 주에 걸쳐 hIL-2로 3~4회 면역시킨 BALB/c 마우스의 비장세포를 SP/2 골수종 세포주와 융합시켰다. 하이브리도마의 콜로니(colony)가 가시화(visualization)되면, 배양 상등액(supernatant)으로 ELISA 하였다. 5㎍/ml의 hIL-2 또는 mIL-2를 각각 PBS에 넣어 혼합한 후, 총 50㎕의 혼합액을 ELISA 플레이트에 코팅하였다. 그 후 비특이적 결합(non-specific binding)을 방지하기 위하여, 200㎕의 10% FBS를 PBS에 혼합하여 상온에서 30분 인큐베이트 하였고, titrated dose 모노클로날 항체를 30분 인큐베이트 하였다. 코팅된 hIL-2 또는 mIL-2와 모노클로날 항체의 결합 정도는 항-마우스 IgG HRP 또는 항-랫(anti-rat) IgG HRP로 검출하였다. 각 단계마다 플레이트는 200㎕ PBS로 3~5회 워싱하였다. 양성 대조군은 시판되는 모노클로날 항체를 사용하였으며, hIL-2에 대한 양성 대조군은 Mab602, mIL-2에 대한 양성 대조군은 Jes6-1 및 S4B6을 사용하였다.
그 결과, hIL-2에 대한 양성 대조군으로 사용된 Mab602는 mIL-2에 대한 낮은 교차 반응성을 보인 반면, TCB2 mAb는 mIL-2에 대한 교차 반응성을 보이지 않았다(도 1). 따라서, TCB2 mAb는 hIL-2에 대하여만 특이적으로 결합한다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2: hIL -2/ TCB2 복합체에 의한 생체 내( in vivo ) 면역자극 효과
기존에 보고된 마우스 항-hIL-2 mAb인 MAB602는 인간화된 마우스에서 인간 CD8+ T 세포를 자극하여 임상에서 암 면역 치료를 위한 hIL-2/mAb 복합체의 효능을 입증하였지만, CDR region Sequence가 공개되어 있지 않았으며, hIL-2/항-hIL-2 mAb 복합체로서 최대의 항암 효과를 보일 수 있는 항체인지 불명확하다. 따라서, 최대한의 CD8+ T 세포 및 NK 세포 활성화와 최소한의 Treg 확장을 유도하는 우수한 항 hIL-2 mAb를 개발하고자 하였다.
0일, 1일, 2일, 3일에 매일 B6 마우스에 hIL-2/TCB2 mAb(0.8㎍/8㎍) 복합체를 주입하고 5일째에 Splenic CD8+ T 세포와 Treg 세포의 세포 확장(cell expansion) 정도를 분석하였다. hIL-2/TCB2 복합체는 Treg 세포와 CD4 T 세포의 확장은 최소화 하였으나, CD8+ T 세포와 NK 세포의 강력한 확장을 유도하였다(도 2). 구체적으로 hIL-2/TCB2 mAb 복합체를 주입하면 memory phenotype(MP) CD8+ T 세포가 59배 정도 확장되며, 확장된 MP CD8+ T는 CD8+ T 세포의 대부분이 되었다. NK 세포도 18배 확장되었으나, Treg 세포는 CD8+ T 세포와 NK 세포보다 낮은 수준인 5배 정도만 확장되었음을 확인하였다. hIL-2/TCB2 mAb 복합체에 대한 Treg 세포 확장에 대한 MP CD8+ T 세포의 유효 비율은 970 %였다. 따라서, TCB2 mAb는 Treg 세포가 아닌 CD8+ T 세포와 NK 세포를 선택적으로 자극하는 모노클로날 항체임을 확인할 수 있다.
또한, hIL-2/TCB2 복합체에 대한 Treg 세포 확장에 대한 MP CD8+ T 세포의 유효 비율은 970%인 반면, hIL-2/Mab602 복합체에 대해서는 530%였다(도 2D). 따라서 TCB2는 Mab602보다 우수한 모노클로날 항체이다.
실시예 3: hIL -2에 대한 TCB2의 친화도( affinity ) 분석
TCB2 항체에 의한 CD8+ T 세포 및 NK 세포의 선택적 자극은 항체가 hIL-2의 에피토프에 결합될 것이 필요하다. hIL-2의 에피토프는 고친화성 IL-2R(CD25)에 의해서도 인식되므로, TCB2는 IL-2Rα 사슬이 결합하는 부위 근처의 hIL-2에 결합할 가능성이 있다. Mab602도 IL-2Rα 사슬이 결합하는 부위 근처의 hIL-2에 결합할 가능성이 있으므로, 항-hIL-2 mAb인 TCB2의 특이성을 관찰하기 위해, Mab602와 경쟁 분석하였다. 상업적으로 시판 중이며, Mab602와는 상이한 에피토프에 결합하는 것으로 알려진 또 다른 항-hIL-2 mAb(5344.111)를 대조군으로 사용하였다.
hIL-2 탐지를 위한 sandwich ELISA를 이용하였다. 항-hIL-2 클론들의 900 RU(Rmax=90)를 아민 반응을 통해 CM5 칩 상에 고정시켰다. hIL-2의 2배 희석액(100nM에서)을 10㎕/min으로 3분간 흘려 보낸 후 hIL-2의 해리를 10분간 추적하였다.
경쟁 분석으로부터 TCB2가 Mab602와 경쟁하는 것을 확인하였다. 그 특이성으로 인하여, TCB2 mAb는 5344.111와 경쟁하지 않지만, Mab602와는 경쟁하는 것을 확인하였다. 결과적으로, 다른 항-hIL-2 mAb보다 TCB2가 human IL-2에 대해 높은 친화도를 갖는 것을 확인하였다(도 3).
실시예 4: hIL -2/ TCB2 복합체에 의한 항종양 효과( anti - tumor effect )
실시예 4-1: 고형종양에 대한 TCB2 mAb의 효과
TCB2 mAb의 고형 종양 거부 반응에 대한 임상적 유용성을 입증하기 위해, B6 마우스에 1 x 106 B16F10 흑색종을 피하로(subcutaneous) 주사한 후, PBS, hIL-2(0.8㎍) 단독 또는 hIL-2/TCB2(0.8㎍/8㎍) 복합체를 4~7일에 주사하였다. 그 다음 7일 동안 종양진행(tumor progression)을 모니터링 하였다.
그 결과, 고형 종양 성장의 억제는 사이토카인에 의해 유도된 CD8+ T 세포 및 NK 세포 확장의 크기와 상관 관계가 있었다(도 4). hIL-2/TCB2 mAb 복합체는 hIL-2 단독 처리한 경우보다 종양의 성장을 우수하게 억제하였다.
실시예 4-2: 전이성 종양에 대한 TCB2 mAb의 효과
TCB2 mAb의 전이성 종양에 대한 임상적 유용성을 입증하기 위해, B6 마우스에 3 x 105 B16F10 흑색종 세포를 정맥으로(intravenously) 주사하였다. 종양 주입 7일 후, 7~10일까지 hIL-2 단독(0.8㎍) 또는 hIL-2/TCB2(0.8㎍/8㎍)복합체를 주입하였고, 18일 후에 폐 종양 결절의 수를 측정하였다.
그 결과, hIL-2는 그러하지 않았으나, hIL-2/TCB2 복합체를 주입한 경우에는 폐 종양 결절의 성장을 우수하게 억제하였다(도 5). 따라서, TCB2 mAb는 hIL-2/TCB2 mAb 복합체로 사용될 때 강력한 항암효과가 있음을 확인할 수 있다.
실시예 5: hIL -2/ TCB2 복합체와 다른 항암 치료법의 병용 효과분석
현재 전세계적으로 개발되고 있는 항암 치료방법들로 tumor neo-antigen으로 환자를 immunization하는 방법과 항-CTLA-4 항체 또는 항-PD-1 항체와 같은 checkpoint inhibitor를 사용하는 방법이 있다. 본 실시예에서는 hIL-2/TCB2 복합체가 이러한 항암 치료요법들과 함께 사용될 수 있는지 분석하였다.
실시예 5-1: Neo - antigen을 이용한 항암 치료법과 hIL -2/ TCB2 복합체의 병용 효과
Neo-antigen을 이용한 치료법과 hIL-2/TCB2 복합체의 적합성을 시험하기 위해 1 x 106 of B16F10 cells을 0일에 B6 마우스에 피하로(subcutaneous) 주사한 후, PBS 또는 TRP2 peptide(100㎍)와 Poly I:C(100㎍)의 혼합물을 3일, 7일에 주사하였다. hIL-2/TCB2 복합체(0.8㎍/8㎍)는 4-7일 및 11-14일에 two rounds of four daily injections으로 주사했다. 그 다음 5일 동안 종양진행을 모니터링하였다.
그 결과, hIL-2/TCB2 복합체를 주사한 것과 neo-antigen을 이용한 요법에서 B16F10 종양의 성장은 비슷한 정도로 억제되었다. 하지만 마우스에 neo-antigen을 이용한 요법과 hIL-2/TCB2 복합체를 동시에 처리한 경우, 종양의 성장이 더욱 억제되었다(도 6). 따라서, hIL-2/TCB2 복합체는 neo antigen을 이용한 항암 치료법과 같이 사용할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 5-2: checkpoint inhibitor와 hIL -2/ TCB2 복합체의 병용 효과
hIL-2/TCB2 복합체가 checkpoint inhibitor들과 사용될 수 있는지 시험하기 위해 CT26(Balb/C colon cancer) 및 MC38(B6 colon cancer) 모델을 이용하였다. hIL-2/TCB2 복합체를 항-CTLA-4 항체 또는 항-PD-1 항체와 같이, 또는 각각 처리한 후 종양의 생장을 관찰했다.
hIL-2/TCB2 복합체와 항-CTLA-4 항체를 같이 처리하는 실험을 위해 5 x 105 CT26 cells을 balb/C 마우스에 피하로 주사하고(0일), 항-CTLA-4 항체(100㎍)를 7일째부터 3일 간격으로 3번 주사했다. hIL-2/TCB2 복합체(0.8㎍/8㎍)는 8일째부터 하루에 한번 11일째까지 4번 주사했다. 그 결과, CT26 종양의 성장은 항-CTLA-4 항체에 의해 강하게 억제되었으며, 33%의 쥐에서 종양이 제거되었다. hIL-2/TCB2 복합체를 주사한 쥐에서는 종양 성장이 항-CTLA-4 항체에 비해 적게 억제 되었으나, 항-CTLA-4 항체와 hIL-2/TCB2 복합체를 같이 처리한 경우 항-CTLA-4 항체를 단독 처리한 경우보다 더욱 종양의 성장을 억제하여 63%의 쥐에서 종양이 제거되었다(도 7).
hIL-2/TCB2 복합체와 항-PD-1 항체를 같이 처리하는 실험을 위해 5 x 105 MC38 cells을 B6 마우스에 피하로 주사한 후(0일) 항-PD-1 항체(100㎍)를 7일째부터 3일 간격으로 3번 주사했고, hIL-2/TCB2 복합체(1.5㎍/15㎍)는 8일째부터 11일째까지 하루에 한번씩 4번 주사했다. 그 결과, 항-PD-1 항체 처리는 종양의 성장을 지연시키는데 효과적이지 못했으나(항-PD-1 항체는 최적 이하의 용량으로 사용되었다), hIL-2/TCB2 복합체의 처리에 의해 MC38 종양의 성장은 강하게 억제되었으며, 37%의 마우스에서 종양이 rejection 되었다. hIL-2/TCB2 복합체 및 항-PD-1 항체를 같이 주사한 경우, 100%의 마우스에서 종양이 rejection 되었다(도 8).
실시예 5-3: hIL -2/ TCB2 복합체를 이용한 면역항암치료의 memory response 획득 효과
종양을 rejection한 마우스가 같은 종양에 대하여 memory response를 획득하였는지 확인하기 위하여, 5 x 105 MC38 cell을 naive B6(종양이 이식된 적 없는 쥐) 또는 상기 실시예 5-2에서 hIL-2/TCB2에 의해 종양이 제거된 쥐(25일 째)에 주사하였다. MC38 종양은 naive B6 마우스에 주사된 경우 빠른 성장을 보였으나, 종양을 rejection 했던 마우스에서는 성장하지 못하였다(도 8). 이는 hIL-2/TCB2 복합체를 이용한 면역항암치료가 환자의 암 재발을 예방하는 데 특히 도움이 될 수 있음을 시사한다.
이러한 결과들을 종합하면, hIL-2/TCB2 복합체가 항-CTLA-4 항체 또는 항-PD-1 항체와 같은 checkpoint inhibitor들과 같이 사용될 수 있으며, 함께 사용하는 경우 더 효과적임을 확인할 수 있다.
실시예 6: TCB2 모노클로날 항체 시퀀싱
TCB2 mAb의 상보성 결정 영역(CDR)을 서열화하였다(표 1 내지 표3).
TCB2 항체의 가변영역 DNA 서열 및 아미노산 서열
중쇄(Heavy chain) 경쇄(Light chain)
TCB2 가변영역 DNA 서열 GAGGTGCAACTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGCAAGACCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACTACCTACTGGATTCAGTGGGTGAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGGGCTATTTATCCTGGAGATGGTGATACTAGGTACATTCAGAATTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGCAGATAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCTTGGCATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATCCCTGGCAACTCGGGGCTTCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(서열번호 1) GACATTGTGATGACCCAGTCTCCAGCATCCCTGTCCATGGCTATAGGAGAAAAAGTCACCATCAGATGCATAACCAGCACTGATATTGATGATGATATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGGAACCTCCTAAGCTCCTTATTTCAGAAGGCAATACTCTTCGTCCTGGAGTCCCATCCCGATTCTCCAGCAGTGGCTATGGTACAGATTTTGTTTTTACAATTGAAAACATGCTCTCAGAAGATGTTGCAGATTACTACTGTTTGCAAAGTGATAACTTGCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
(서열번호 2)
TCB2 가변영역 아미노산 서열 EVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTTYWIQWVKQRPGQGEWIGAIYPGDGDTRYIQNFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCARSLATRGFYAMDYWGQGTSVTVSS(서열번호 3) DIVMTQSPASLSMAIGEKVTIRCITSTDIDDDMNWYQQKPGEPPKLLISEGNTLRPGVPSRFSSSGYGTDFVFTIENMLSEDVADYYCLQSDNLPYTFGGGTKLEIK
(서열번호 4)
TCB2 항체의 CDR DNA 서열
가변영역 CDR DNA 서열 서열번호
중쇄(Heavy chain) CDR1 ACCTACTGGATTCAG 5
CDR2 GCTATTTATCCTGGAGATGGTGATACTAGGTACATTCAGAATTTCAAGGGC 6
CDR3 TCCCTGGCAACTCGGGGCTTCTATGCTATGGACTAC 7
경쇄(Light chain) CDR1 ATAACCAGCACTGATATTGATGATGATATGAAC 8
CDR2 GAAGGCAATACTCTTCGTCCT 9
CDR3 TTGCAAAGTGATAACTTGCCGTACACG 10
TCB2 항체의 CDR 아미노산 서열
가변영역 CDR 아미노산 서열 서열번호
중쇄(Heavy chain) CDR1 TYWIQ 11
CDR2 AIYPGDGDTRYIQNFKG 12
CDR3 SLATRGFYAMDY 13
경쇄(Light chain) CDR1 ITSTDIDDDMN 14
CDR2 EGNTLRP 15
CDR3 LQSDNLPYT 16
TCB2의 아미노산 서열은 Onur Boyman과 Natalia Ramirez(WO 2016005950 A1)에 의해 최근 개발된 항-hIL-2 mAb인 Nara1(표 4)과 구별되는 다른 항체임을 알 수 있다. TCB2와 Nara1의 CDR 유사도는 중쇄 CDR 1-3의 경우 각각 40%, 52.94%, 8.33% 이고, 경쇄 CDR 1-3의 경우 각각 33.33%, 14.28%, 55.55% 이다(표 5).
Nara1 항체의 CDR 아미노산 서열
가변영역 CDR 아미노산 서열 서열번호
중쇄(Heavy chain) CDR1 NYLIE 17
CDR2 VINPGSGGTNYNEKFKG 18
CDR3 WRGDGYYAYFDV 19
경쇄(Light chain) CDR1 KASQSVDYDGDSYMN 20
CDR2 AASNLES 21
CDR3 QQSNEDPYT 22
TCB2 및 Nara1 항체의 CDR 아미노산 서열 비교
가변영역 CDR Nara1와 TCB2의 동일한 잔기의 수 Nara1의 아미노산 길이 유사도(%)
TCB2 중쇄(Heavy chain) CDR1 2 5 40
CDR2 9 17 52.94
CDR3 1 12 8.33
TCB2 경쇄(Light chain) CDR1 5 15 33.33
CDR2 1 7 14.28
CDR3 5 9 55.55
서열 분석 데이터에 기초하여, TCB2 mAb의 Fab 영역을 인간 IgG2 발현 벡터에 클로닝하고, 클로닝된 벡터의 아미노산 서열을 표 6에 나타내었다.
인간 키메릭 TCB2(human chimeric TCB2)의 아미노산 서열
아미노산 서열
중쇄 EVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTTYWIQWVKQRPGQGLEWIGAIYPGDGDTRYIQNFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCARSLATRGFYAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 23)
경쇄 DIVMTQSPASLSMAIGEKVTIRCITSTDIDDDMNWYQQKPGEPPKLLISEGNTLRPGVPSRFSSSGYGTDFVFTIENMLSEDVADYYCLQSDNLPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열번호 24)
실시예 7: TCB2 인간화( humanization ) 항체
마우스 IgG에 대한 숙주 면역 반응을 감소시키기 위해 TCB2 mAb를 인간화(humanization) 하였고, human IgG1 FC와 함께 발현시켰다(표 7). 마우스 TCB2(mTCB2)의 CDR을 인간 IgG 가변영역에 도입한 다음, in vivo 시험을 위하여 가장 친화도(affinity)가 높은 3개의 인간화된 TCB2(hnTCB2) mAb clone(VH1 + VL2, VH2 + VL2, AH03463(VL03463 + VH03463))을 선별하였다(표 8).
인간화된(humanized) TCB2의 가변영역 DNA 서열 및 아미노산 서열
DNA 서열 아미노산 서열
VL03463 Light Chain GACATTCAGATGACCCAGAGCCCTTCCAGCCTGAGCGCCAGCGTCGGGGACAGAGTGACCATTACCTGCATTACCTCCACAGACATTGACGATGACATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCCAAGCTGCTGATCTATGAGGGAAATACTCTGCGGCCCGGCGTGCCTAGCAGATTCAGCTCCTCTGGCTCTGGGACCGATTTCACCTTTACAATCAGTTCACTGCAGCCCGAAGACATTGCTACATACTATTGCCTGCAGAGCGACAACCTGCCTTACACCTTCGGGGGAGGGACCAAACTGGAAATCAAA(서열번호 25) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCITSTDIDDDMNWYQQKPGKAPKLLIYEGNTLRPGVPSRFSSSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCLQSDNLPYTFGGGTKLEIK
(서열번호 26)
VH03463 Heavy Chain GAAGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCAGAAGTGAAAAAGCCTGGGGCAAGCGTGAAGGTGTCCTGTAAAGCAAGCGGATATACATTCACCACATACTGGATCCAGTGGGTGAAGCAGGCACCAGGACAGGGACTGGAGTGGATGGGAGCAATCTACCCTGGAGACGGCGATACACGATATATTCAGAACTTCAAAGGCCGGGTGACTATGACCAGAGACACATCTACTAGTACCGTCTATATGGAGCTGAGCTCCCTGAGGAGCGAAGATACCGCTGTCTACTATTGCGCCCGCTCTCTGGCTACAAGAGGGTTCTACGCTATGGATTATTGGGGACAGGGGACACTGGTCACCGTCAGCAGC(서열번호 27) EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWIQWVKQAPGQGLEWMGAIYPGDGDTRYIQNFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSLATRGFYAMDYWGQGTLVTVSS
(서열번호 28)
VL2 Light Chain GACATCGTGATGACCCAGAGCCCCAGTTCCCTGAGCGCCAGCGTCGGAGACAGAGTGACTATTAGGTGTATTACTTCCACAGATATTGACGATGACATGAACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCAAAGCCCCCAAGCTGCTGATCAGCGAGGGAAATACTCTGCGACCAGGAGTGCCTTCTAGATTCTCTGGCAGTGGGTATGGAACCGATTTCACCTTTACAATCAGCTCCCTGCAGCCCGAAGATATTGCTGACTACTATTGCCTGCAGAGCGATAACCTGCCATACACCTTCGGCGGGGGGACCAAACTGGAAATCAAA(서열번호 29) DIVMTQSPSSLSASVGDRVTIRCITSTDIDDDMNWYQQKPGKAPKLLISEGNTLRPGVPSRFSGSGYGTDFTFTISSLQPEDIADYYCLQSDNLPYTFGGGTKLEIK
(서열번호 30)
VH1 Heavy Chain CAGGTGCAGCTGGTCCAGTCAGGAGCAGAAGTCAAGAAGCCCGGAGCAAGCGTCAAAGTGTCATGCAAAGCAAGCGGATATACATTTACCACATACTGGATCCAGTGGGTGCGACAGGCACCAGGACAGGGACTGGAGTGGATGGGAGCAATCTACCCTGGAGACGGCGATACAAGATATATTCAGAACTTCAAGGGCCGGGTGACTATGACCAGAGACACATCTACTAGTACCGTCTATATGGAGCTGAGCTCCCTGAGGAGCGAAGATACCGCTGTCTACTATTGCGCCCGCTCTCTGGCTACAAGGGGGTTCTACGCAATGGATTACTGGGGGCAGGGGACACTGGTCACCGTCTCATCA(서열번호 31) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWIQWVRQAPGQGLEWMGAIYPGDGDTRYIQNFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSLATRGFYAMDYWGQGTLVTVSS
(서열번호 32)
VH2 Heavy Chain CAGGTCCAGCTGGTCCAGAGCGGAGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGAGCAAGCGTCAAACTGTCATGCAAGGCAAGCGGATACACTTTCACCACATACTGGATCCAGTGGGTGAAGCAGGCACCAGGACAGGGACTGGAGTGGATCGGAGCAATCTACCCTGGAGACGGCGATACACGGTATATTCAGAACTTCAAAGGCAGAGTGACTATGACCGCTGACACATCTACTAGTACCGTCTATATGGAGCTGAGCTCCCTGAGGAGCGAAGATACCGCCGTCTACTATTGCGCCCGGTCTCTGGCTACAAGGGGCTTTTATGCTATGGATTATTGGGGACAGGGCACACTGGTCACCGTCTCATCT(서열번호 33) QVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYTFTTYWIQWVKQAPGQGLEWIGAIYPGDGDTRYIQNFKGRVTMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSLATRGFYAMDYWGQGTLVTVSS
(서열번호 34)
VL03463 아미노산 서열에서 VL2와 다른 부분은 밑줄로 표시하였다. 중쇄 가변영역 서열 비교를 위하여, VH2 및 VH03463에서 VH1과 다른 부분은 밑줄로 표시하였다. VL2는 두 개의 상이한 인간화 TCB2(VL2 + VH1 또는 VL2 + VH2)를 발현시키기 위하여 VH1 또는 VH2와 함께 사용되었다.
인간화된 TCB2의 hIL-2에 대한 친화도
mAbs Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M) Chimeric TCB2에 대한 humanized TCB2의 상대적 친화도
Set 1 Chimeric 2.27E+07 1.63E-03 7.17E-11
VH1 + VL2 1.89E+07 1.97E-03 1.04E-10 68.9%
VH2 + VL2 1.68E+07 4.63E-03 2.75E-10 26%
Set 2 Chimeric 2.29E+07 1.41E-03 6.16E-11
AH03463 2.11E+07 4.18E-03 1.98E-10 31%
원래의 마우스 TCB2, 인간 키메라 TCB2(hcTCB2)와 인간화된 TCB2(hnTCB2)의 면역 활성 기능을 비교하기 위해, hIL-2를 각각 다른 형태의 TCB2s(마우스 TCB2(mTCB2), hcTCB2, hnTCB2)와 복합체를 형성시켜 B6 마우스에 하루에 한번 0일부터 3일째까지 4회 주사한 후 5일째에 비장의 면역세포들을 유세포 분석하였다. 그 결과 hnTCB2의 친화도가 mTCB2나 hcTCB2 보다 약간 감소하였으나(표 8), 면역세포를 활성화시키는 기능은 mTCB2와 유사한 것을 확인하였다(도 9, VL2+VH2는 낮은 기능성으로 인해 표시하지 않았다). 따라서, mTCB2는 성공적으로 humanization 되었음이 입증되었다.
hnTCB2가 면역세포를 활성화 시키는 기능 외에 항암 능력을 보유하고 있는지 시험하기 위해, 5x105 MC38을 B6 마우스에 0일째에 피하로 주사하고, 항-PD-1 항체(200㎍)를 7일째부터 3일 간격으로 3회 주사한 다음, hIL-2/hnTCB2(VL2+ VH1, 1.5㎍/15㎍) 복합체를 8일째부터 11일째까지 하루에 한번 4회 주사한 뒤에 MC38 종양의 성장을 관찰하였다. 그 결과, 높은 농도의 항-PD-1 항체 단독 처리에 의해서도 종양의 성장이 지연되었으나, hIL-2/hnTCB2 복합체를 처리한 경우, hIL-2/mTCB2 복합체 처리와 유사한 수준으로 MC38 종양의 성장이 강하게 억제되었으며, 40%의 마우스에서 종양이 rejection 되었다. hIL-2/hnTCB2 또는 hIL-2/mTCB2 복합체를 항-PD-1 항체와 같이 주사한 경우, 85%의 마우스에서 종양이 rejection 되었다(도 10). 따라서, 인간화 TCB2에서 원래의 mTCB2가 가지던 기능이 보존되었음을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea Basic Science Institute <120> Anti-Human Interleukin-2 Antibodies and Uses thereof <130> P18-B039 <150> KR 10-2017-0064815 <151> 2017-05-25 <160> 34 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TCB2 Heavy chain Variable region <400> 1 gaggtgcaac tgcagcagtc tggggctgag ctggcaagac ctggggcttc agtgaagttg 60 tcctgcaagg cttctggcta cacctttact acctactgga ttcagtgggt gaaacagagg 120 cctggacagg gtctggaatg gattggggct atttatcctg gagatggtga tactaggtac 180 attcagaatt tcaagggcaa ggccacattg actgcagata aatcctccag cacagcctac 240 atgcaactca gcagcttggc atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagatccctg 300 gcaactcggg gcttctatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 2 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TCB2 Light chain Variable region <400> 2 gacattgtga tgacccagtc tccagcatcc ctgtccatgg ctataggaga aaaagtcacc 60 atcagatgca taaccagcac tgatattgat gatgatatga actggtacca gcagaagcca 120 ggggaacctc ctaagctcct tatttcagaa ggcaatactc ttcgtcctgg agtcccatcc 180 cgattctcca gcagtggcta tggtacagat tttgttttta caattgaaaa catgctctca 240 gaagatgttg cagattacta ctgtttgcaa agtgataact tgccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaagc tggaaataaa a 321 <210> 3 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TCB2 Heavy chain Variable region <400> 3 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Ile Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ile Gln Asn Phe Lys 50 55 60 Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met 65 70 75 80 Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ser Leu Ala Thr Arg Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 4 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TCB2 Light chain Variable region <400> 4 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Met Ala Ile Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Ile Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp 20 25 30 Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Val Phe Thr Ile Glu Asn Met Leu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp Asn Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TCB2 Heavy chain CDR1 <400> 5 acctactgga ttcag 15 <210> 6 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TCB2 Heavy chain CDR2 <400> 6 gctatttatc ctggagatgg tgatactagg tacattcaga atttcaaggg c 51 <210> 7 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TCB2 Heavy chain CDR3 <400> 7 tccctggcaa ctcggggctt ctatgctatg gactac 36 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TCB2 Light chain CDR1 <400> 8 ataaccagca ctgatattga tgatgatatg aac 33 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TCB2 Light chain CDR2 <400> 9 gaaggcaata ctcttcgtcc t 21 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TCB2 Light chain CDR3 <400> 10 ttgcaaagtg ataacttgcc gtacacg 27 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TCB2 Heavy chain CDR1 <400> 11 Thr Tyr Trp Ile Gln 1 5 <210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TCB2 Heavy chain CDR2 <400> 12 Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ile Gln Asn Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 13 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TCB2 Heavy chain CDR3 <400> 13 Ser Leu Ala Thr Arg Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TCB2 Light chain CDR1 <400> 14 Ile Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp Met Asn 1 5 10 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TCB2 Light chain CDR2 <400> 15 Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TCB2 Light chain CDR3 <400> 16 Leu Gln Ser Asp Asn Leu Pro Tyr Thr 1 5 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nara1 Heavy chain CDR1 <400> 17 Asn Tyr Leu Ile Glu 1 5 <210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nara1 Heavy chain CDR2 <400> 18 Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 19 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nara1 Heavy chain CDR3 <400> 19 Trp Arg Gly Asp Gly Tyr Tyr Ala Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 20 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nara1 Light chain CDR1 <400> 20 Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn 1 5 10 15 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nara1 Light chain CDR2 <400> 21 Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nara1 Light chain CDR3 <400> 22 Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Tyr Thr 1 5 <210> 23 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human chimeric TCB2 Heavy chain Variable region <400> 23 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Ile Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ile Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Leu Ala Thr Arg Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys 210 215 220 Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 24 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human chimeric TCB2 Light chain Variable region <400> 24 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Met Ala Ile Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Ile Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp 20 25 30 Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Val Phe Thr Ile Glu Asn Met Leu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp Asn Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 25 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized TCB2_VL03463 <400> 25 gacattcaga tgacccagag cccttccagc ctgagcgcca gcgtcgggga cagagtgacc 60 attacctgca ttacctccac agacattgac gatgacatga actggtacca gcagaagcca 120 gggaaagccc ccaagctgct gatctatgag ggaaatactc tgcggcccgg cgtgcctagc 180 agattcagct cctctggctc tgggaccgat ttcaccttta caatcagttc actgcagccc 240 gaagacattg ctacatacta ttgcctgcag agcgacaacc tgccttacac cttcggggga 300 gggaccaaac tggaaatcaa a 321 <210> 26 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized TCB2_VL03463 <400> 26 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ile Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp 20 25 30 Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp Asn Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 27 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized TCB2_VH03463 <400> 27 gaagtgcagc tggtgcagag cggagcagaa gtgaaaaagc ctggggcaag cgtgaaggtg 60 tcctgtaaag caagcggata tacattcacc acatactgga tccagtgggt gaagcaggca 120 ccaggacagg gactggagtg gatgggagca atctaccctg gagacggcga tacacgatat 180 attcagaact tcaaaggccg ggtgactatg accagagaca catctactag taccgtctat 240 atggagctga gctccctgag gagcgaagat accgctgtct actattgcgc ccgctctctg 300 gctacaagag ggttctacgc tatggattat tggggacagg ggacactggt caccgtcagc 360 agc 363 <210> 28 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized TCB2_VH03463 <400> 28 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Ile Gln Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ile Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Leu Ala Thr Arg Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 29 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized TCB2_VL2 <400> 29 gacatcgtga tgacccagag ccccagttcc ctgagcgcca gcgtcggaga cagagtgact 60 attaggtgta ttacttccac agatattgac gatgacatga actggtacca gcagaagcca 120 ggcaaagccc ccaagctgct gatcagcgag ggaaatactc tgcgaccagg agtgccttct 180 agattctctg gcagtgggta tggaaccgat ttcaccttta caatcagctc cctgcagccc 240 gaagatattg ctgactacta ttgcctgcag agcgataacc tgccatacac cttcggcggg 300 gggaccaaac tggaaatcaa a 321 <210> 30 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized TCB2_VL2 <400> 30 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Arg Cys Ile Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp 20 25 30 Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp Asn Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 31 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized TCB2_VH1 <400> 31 caggtgcagc tggtccagtc aggagcagaa gtcaagaagc ccggagcaag cgtcaaagtg 60 tcatgcaaag caagcggata tacatttacc acatactgga tccagtgggt gcgacaggca 120 ccaggacagg gactggagtg gatgggagca atctaccctg gagacggcga tacaagatat 180 attcagaact tcaagggccg ggtgactatg accagagaca catctactag taccgtctat 240 atggagctga gctccctgag gagcgaagat accgctgtct actattgcgc ccgctctctg 300 gctacaaggg ggttctacgc aatggattac tgggggcagg ggacactggt caccgtctca 360 tca 363 <210> 32 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized TCB2_VH1 <400> 32 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ile Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Leu Ala Thr Arg Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 33 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized TCB2_VH2 <400> 33 caggtccagc tggtccagag cggagccgag gtgaagaagc ccggagcaag cgtcaaactg 60 tcatgcaagg caagcggata cactttcacc acatactgga tccagtgggt gaagcaggca 120 ccaggacagg gactggagtg gatcggagca atctaccctg gagacggcga tacacggtat 180 attcagaact tcaaaggcag agtgactatg accgctgaca catctactag taccgtctat 240 atggagctga gctccctgag gagcgaagat accgccgtct actattgcgc ccggtctctg 300 gctacaaggg gcttttatgc tatggattat tggggacagg gcacactggt caccgtctca 360 tct 363 <210> 34 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized TCB2_VH2 <400> 34 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Ile Gln Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ile Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Leu Ala Thr Arg Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

Claims (21)

  1. 삭제
  2. 인간 인터루킨-2(human interleukin-2, hIL-2)에 특이적으로 결합하고, 상기 hIL-2가 CD25에 결합하는 것을 저해하는 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서,
    상기 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR1, 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR2 및 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR1, 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR2 및 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  3. 제2항에 있어서,
    서열번호 3, 서열번호 23, 서열번호 28, 서열번호 32 및 서열번호 34로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 및
    서열번호 4, 서열번호 24, 서열번호 26 및 서열번호 30으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  4. 제2항에 있어서,
    서열번호 3의 중쇄 가변영역 및 서열번호 4의 경쇄 가변영역;
    서열번호 23의 중쇄 가변영역 및 서열번호 24의 경쇄 가변영역;
    서열번호 28의 중쇄 가변영역 및 서열번호 26의 경쇄 가변영역;
    서열번호 32의 중쇄 가변영역 및 서열번호 30의 경쇄 가변영역; 또는
    서열번호 34의 중쇄 가변영역 및 서열번호 30의 경쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  5. 제2항에 있어서, CD8+ T 세포와 NK 세포의 확장을 유도하는 것을 특징으로 하는 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산.
  7. 제6항의 핵산을 포함하는 재조합 벡터.
  8. 제7항의 재조합 벡터로 형질전환된 세포.
  9. 제8항의 세포를 배양하는 단계를 포함하는 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법.
  10. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 hIL-2가 결합된 복합체.
  11. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 암은 피부암, 유방암, 대장암, 신장암, 폐암, 간암, 뇌암, 식도암, 쓸개암, 난소암, 췌장암, 위암, 자궁경부암, 갑상선암, 전립선암 및 방광암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 이중특이 항체(bispecific antibody).
  14. 제13항의 이중특이 항체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 암은 피부암, 유방암, 대장암, 신장암, 폐암, 간암, 뇌암, 식도암, 쓸개암, 난소암, 췌장암, 위암, 자궁경부암, 갑상선암, 전립선암 및 방광암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 면역관문억제제를 포함하는 암 치료용 병용 투여 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 면역관문억제제는 항-CTLA-4 항체 또는 항-PD-1 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  18. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 백신 효능 증진용 조성물.
  19. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항-hIL-2 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체(antibody-drug conjugate).
  20. 제19항의 항체-약물 접합체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 암은 피부암, 유방암, 대장암, 신장암, 폐암, 간암, 뇌암, 식도암, 쓸개암, 난소암, 췌장암, 위암, 자궁경부암, 갑상선암, 전립선암 및 방광암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
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