KR102095345B1

KR102095345B1 - Plants with Promoted Flowering Time Using FKF1 Mutant and Method for Producing the Same

Info

Publication number: KR102095345B1
Application number: KR1020180119011A
Authority: KR
Inventors: 송영훈; 조성원
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2018-10-05
Filing date: 2018-10-05
Publication date: 2020-03-31

Abstract

The present invention relates to a plant with a promoted flowering time using an FKF1 protein variant and a method for manufacturing the same, and more specifically, to a method for producing a plant with a promoted flowering time by replacing isoleucine (I), no. 160 amino acid of an FKF1 protein, with arginine (R), and thus promoting the flowering time, and a plant with a promoted flowering time. The plant with the promoted flowering time and the method for producing the same according to the present invention have an effect of increasing crop yield through promotion of the flowering time.

Description

FKF1 단백질 변이체를 이용한 개화시기가 촉진된 식물체 및 이의 제조방법 {Plants with Promoted Flowering Time Using FKF1 Mutant and Method for Producing the Same}Plants with accelerated flowering time using FKF1 protein variants and manufacturing method thereof {Plants with Promoted Flowering Time Using FKF1 Mutant and Method for Producing the Same}

본 발명은 FKF1 단백질 변이체를 이용한 개화시기가 촉진된 식물체 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 FKF1 단백질의 160번 아미노산 이소류신 (I)을 아르기닌 (R)으로 치환하여 개화시기가 촉진된 식물체를 제조하는 방법 및 개화시기가 촉진된 식물체에 관한 것이다.The present invention relates to a plant having an accelerated flowering time using the FKF1 protein variant and a method for producing the same, and more specifically, to replace an amino acid isoleucine (I) 160 of the FKF1 protein with arginine (R) to promote the flowering time It relates to a plant having a method of manufacturing and accelerated flowering time.

식물에 있어 개화시기는 식물체의 나이와 같은 유전적인 요인과 온도, 일장(photoperiod) 그리고 병충해의 침입과 같은 환경적인 요인에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있다. 일반적으로는 밤낮(일장)의 길이에 의해 조절되는 개화 경로 (photoperiod), 일정기간 동안 저온에 노출되었을 때 개화되는 경로 (vernalization)와 환경적인 스트레스, 즉 병충해의 침입 또는 UV (ultraviolet)와 같은 빛의 조사에 의해 생체방어 기작 (defense response)으로 유도되는 개화 등으로 구분되고 있으며, 이러한 개화 조절은 식물 생명주기의 전반에 걸쳐 조절되는 것으로 보고되어 있다 (Yarn Y.Levy & Caroline Dean, Plant Cell, 10:1973-1989, 1998; Martinez et al., Plant J. 37: 209-217, 2004).In plants, flowering time is known to be influenced by genetic factors such as plant age and environmental factors such as temperature, photoperiod and pest infestation. The photoperiod, which is usually controlled by the length of the day and night (sunset), the path that blooms when exposed to low temperatures for a period of time (vernalization) and environmental stress, such as the infestation of pests or light such as UV (ultraviolet) It is classified into flowering, etc. induced by a defense response by investigation by the researchers, and it has been reported that the regulation of flowering is controlled throughout the plant life cycle (Yarn Y.Levy & Caroline Dean, Plant Cell, 10: 1973-1989, 1998; Martinez et al., Plant J. 37: 209-217, 2004).

농작물에 있어서의 생체방어 기작과 개화시기는 수확량의 결정에 있어서 아주 중요한 역할을 하는데, 이는 농작물이 병충해에 잘 견뎌내지 못하거나 개화시기가 잘못 조절되면 수확물의 양과 질에 나쁜 영향을 미치게 되어 상당한 경제적 손실을 초래하기 때문이다. 특히 개화시기 조절은 농작물의 질적인 부분에 있어 중요한데, 그 예로서 봄철의 무 (radish)는 3-4월에 파종하여 5-6월에 수확하게 되는데 이 기간 동안에 기온이 10℃ 이하로 2주간 계속되면 꽃눈이 형성되어 꽃대가 올라오게 됨(춘화반응;vernalization)으로써 상품가치가 많이 떨어지게 된다. 그래서 많은 돈을 투자하여 난방 시설을 설치하는 등 농가에 많은 부담이 되고 있다.Bio-defense mechanisms and flowering time in crops play a very important role in determining yield, which can significantly affect crop yield and quality if crops do not tolerate disease or disease, and the flowering time is poorly controlled. Because it causes loss. In particular, regulation of flowering time is important for the quality of crops. For example, spring radish is sown in March-April and harvested in May-June. During this period, the temperature is below 10 ℃ for 2 weeks. If it continues, the flower eye is formed and the flower stand rises (vernalization), so the product value drops a lot. So, investing a lot of money to install heating facilities is putting a lot of pressure on farmers.

이에 최근에는 유전공학의 기술을 이용하여, 개화시기가 지연된 표현형을 보이는 개화 돌연변이체로부터 변이를 유발하는 유전자를 분리하고, 적합한 유전자 조작의 과정을 거쳐서 농작물 육종에 적용하려는 연구들이 활발히 진행되고 있으며, 특히 유전정보가 거의 해독되어 알려진 애기장대 ( Arabidopsis thaliana)를 통해 개화시기를 조절하는 유전자들이 알려져 있다 (대한민국 공개특허공보 제2001-0029127호, 제2003-0016892호).Accordingly, recently, studies using genetic engineering techniques to isolate genes causing mutations from flowering mutants with a phenotype with a delayed flowering time and to apply them to crop breeding through appropriate genetic manipulation are being actively conducted. In particular, the genetic information is known to a gene to control the flowering time through Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) are substantially known decryption (Republic of Korea Patent Application Publication No. 2001-0029127, 1 - No. 2003-0016892).

애기장대의 콘스탄스 ( CONSTANS ; CO) 유전자는 전사 조절 인자로서 빛에 의한 개화시기 조절에 있어서 아주 중요한 역할을 하는 것으로 보고가 되어 있으나 (Levy & Dean, Plant Cell, 10:1973-1989, 1998), 분자적 수준에서 그 메커니즘은 정확히 알려진 것이 없다. CO 단백질은 하위 유전자인 FT (FLOWERING LOCUS T)의 프로모터 부위에 직접 결합하여 전사를 조절할 수 있으나, 많은 경우 FT 프로모터에 직접 붙을 수 있는 다른 단백질과의 복합체 형성을 통해 전사를 조절하는 것으로 알려져 있다. 이와 같은 사실은, CO 단백질이 식물의 개화시기를 조절하는 데 있어서, 여러개의 단백질들이 CO와 결합하여 CO의 기능을 촉진 또는 저해시키는 복잡한 과정을 거쳐 관여하는 것을 시사한다 (Song et al., Annu . Rev. Plant Biol. 66:441-464, 2015). Arabidopsis Constance (CONSTANS; CO) gene has been reported to play an important role in flowering-time regulator by light as transcription factors, but (Levy & Dean, Plant Cell, 10: 1973-1989, 1998), The mechanism at the molecular level is not known exactly. CO protein can directly regulate the transcription by binding directly to the promoter region of the lower gene FT ( FLOWERING LOCUS T ), but in many cases, it is known to regulate transcription through complex formation with other proteins that can be directly attached to the FT promoter. This suggests that in regulating the flowering period of plants, CO proteins are involved through a complex process of promoting or inhibiting the function of CO by binding to CO (Song et al. , Annu Rev. Plant Biol. 66: 441-464, 2015).

따라서, CO 유전자를 식물의 개화시기 조절에 이용하자면 원하는 시기에 개화를 유도하거나 또는 정확한 꽃의 발달을 조절하는 것과 같은 문제들을 해결하는 데에는 많은 어려움이 있다. 또한 CO의 발현 억제를 통한 개화시기의 억제는 과도한 개화 억제를 유발할 수가 있어 적절한 개화시기의 조절을 위해서는 새로운 유전자 발굴 및 그 기능에 대한 연구가 필요하다.Therefore, if the CO gene is used to control the flowering time of a plant, there are many difficulties in solving problems such as inducing flowering at a desired time or controlling the correct flower development. In addition, the suppression of flowering time through the suppression of CO expression may cause excessive flowering suppression, and therefore, new gene discovery and research on its function are necessary to control the proper flowering time.

한편, FKF1 단백질은 청색광 수용체로 개화조절자로서 기능을 한다. 장일조건에서 FKF1은 개화유도에 핵심적인 역할을 하는 CO ( CONSTANS ) 및 FT (FLOWERING LOCUS T) 유전자들의 발현을 직접 조절할 뿐만 아니라 CO 단백질과 직접 결합하여 안정화시키는 것으로 알려져 있다. 특히, CO 단백질은 직접 FT 전사를 활성화시켜 개화를 유도하기 때문에 FKF1의 기능은 개화유도에 필수적이다.Meanwhile, the FKF1 protein is a blue light receptor and functions as a flowering regulator. FKF1 in long-day conditions is known to directly regulate the expression of CO ( CONSTANS ) and FT (FLOWERING LOCUS T) genes, which play a key role in flowering induction, as well as to stabilize by directly binding to CO proteins. In particular, the function of FKF1 is essential for induction of flowering because CO protein directly induces flowering by activating FT transcription.

이에, 본 발명자들은 유전자 또는 단백질의 기능 조절을 통해 식물의 개화시기를 조절하고자 예의 노력한 결과, FKF1 단백질의 160번째 아미노산 이소류신 (I)을 아르기닌 (R)으로 치환하면 식물의 개화시기가 촉진되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.Accordingly, the present inventors tried to control the flowering time of plants through the regulation of the function of genes or proteins. As a result, when the 160th amino acid isoleucine (I) of FKF1 protein is substituted with arginine (R), the flowering time of plants is promoted. Upon confirmation, the present invention has been completed.

본 발명의 목적은 식물의 개화시기를 촉진시키기 위하여, FKF1 I160R 단백질 변이체를 암호화하는 유전자 또는 상기 유전자가 도입된 재조합 벡터로 식물체를 형질전환시킨 형질전환 식물체의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 형질전환 식물체를 제공하는데 있다.An object of the present invention is to produce a plant transformed with a gene encoding a FKF1 I160R protein variant or a recombinant vector into which the gene has been introduced, in order to accelerate the flowering time of the plant, and the transformation produced by the method It is to provide plants.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 FKF1 I160R 단백질 변이체를 암호화하는 유전자 또는 상기 유전자가 도입된 재조합 벡터로 식물을 형진전환시키는 단계를 포함하는 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a method for producing a transgenic plant comprising transforming a plant with a gene encoding a FKF1 I160R protein variant or a recombinant vector into which the gene has been introduced.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 형질전환 식물체를 제공한다.The present invention also provides a transformed plant produced by the above method.

본 발명에 따른 FKF1 단백질의 160번째 아미노산 이소류신 (I)을 아르기닌 (R)으로 치환된 개화시기가 촉진된 식물체 및 이의 제조방법은 개화시기 촉진을 통해 작물 생산량을 증대시킬 수 있는 효과가 있다.A plant in which the flowering time in which the 160th amino acid isoleucine (I) of the FKF1 protein according to the present invention is replaced with arginine (R) is promoted, and a method for manufacturing the same have an effect of increasing crop yield through promotion of the flowering time.

도 1은 야생형 FKF1과 160번 아미노산 이소류신 (I)이 아르기닌 (R)으로 치환된 FKF1 단백질 변이체의 서열을 비교한 것이다.
도 2는 단일 아미노산이 치환된 FKF1 I160R 단백질 변이체의 개화시기 표현형을 보여주는 것이다.
도 3은 단일 아미노산이 치환된 FKF1 I160R 단백질 변이체의 잎의 숫자로 개화시기 표현형을 정량화한 것이다.
도 4는 FKF1 I160R 단백질 변이체에서 FKF1 유전자 발현양 및 단백질 안정성을 나타낸 것이다.
도 5는 FKF1 I160R 단백질 변이체에서 CO 및 FT 유전자의 발현양을 나타낸 것이다.
도 6은 FKF1 I160R 단백질 변이체에서 동형이량체화 (homodimerization)의 변화를 분석한 것이다.
도 7은 FKF1 I160R 단백질 변이체에서 FKF1-CO 복합체 형성을 비교한 것이다.
도 8은 FKF1 I160R 단백질 변이체에서 COP1 결합력 변화를 분석한 것이다.1 is a comparison of the sequence of the wild-type FKF1 protein variant FKF1 with amino acid isoleucine (I) substituted with arginine (R).
Figure 2 shows the flowering time phenotype of a single amino acid FKF1 I160R protein variants substituted.
Figure 3 quantifies the phenotype of flowering time by the number of leaves of the FKF1 I160R protein variant substituted with a single amino acid.
Figure 4 shows the FKF1 gene expression level and protein stability in FKF1 I160R mutant protein.
5 shows the expression levels of CO and FT genes in the FKF1 I160R protein variant.
Figure 6 is an analysis of changes in homodimerization (homodimerization) in the FKF1 I160R protein variant.
Figure 7 compares FKF1-CO complex formation in FKF1 I160R protein variants.
8 is an analysis of changes in COP1 binding capacity in the FKF1 I160R protein variant.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by a person skilled in the art to which the present invention pertains. In general, the nomenclature used herein is well known in the art and commonly used.

일반적으로 개화는 식물체의 일생 통틀어 가장 중요한 일 중의 하나로, 기온과 빛 등의 환경적인 인자와 식물체의 나이에 의해 좌우된다. 이는 식물체가 태어날 때부터 가지고 있는 유전적인 특성 등에 따라 매우 많은 단백질들의 상호 결합과 신호의 전달로 이루어진다. 개화가 잘못 조절되게 되면 식물체에는 좋지 못한 많은 변화들이 생기게 되는데 예를 들면, 개화가 빨리 되면 작물의 경우 씨앗이 적게 열리게 되고 과실의 경우 크기가 줄어들게 되고 그 맛도 또한 떨어지게 된다. 따라서, 특히 작물의 생산량에는 개화시기가 매우 큰 영향을 미친다.In general, flowering is one of the most important things in the life of a plant, and is influenced by environmental factors such as temperature and light and the age of the plant. It is composed of a large number of proteins that are linked to each other and signal transmission depending on the genetic characteristics of the plant. If the flowering is improperly regulated, there are many unfavorable changes in the plant. For example, if the flowering is fast, the seeds are less open in the case of crops, the size is reduced in the case of fruits, and the taste is also deteriorated. Therefore, the timing of flowering has a great influence on the production of crops.

애기장대 유래의 콘스탄스(CONSTANS; CO) 단백질은 광주기성 개화조절에 있어 핵심 인자로 작용하며, 빛의 영향을 받아 개화시기를 조절하는 아주 중요한 핵심 유전자로 알려져 있다 (Levy & Dean, Plant Cell, 10:1973-1989, 1998). 하지만, 많은 노력에도 불구하고 어떤 작용 원리에 의하여 개화시기를 조절하는지는 거의 연구되어 있지 않다.CONSTANS (CO) protein derived from Arabidopsis thaliana acts as a key factor in regulating photoperiod flowering, and is known as a very important key gene that regulates flowering time under the influence of light (Levy & Dean, Plant Cell, 10 : 1973-1989, 1998). However, despite a lot of effort, it is hardly studied how the principle of flowering is controlled by the principle of action.

이에, 본 발명에서는 개화조절의 핵심인자인 CO 및 FT 유전자들의 발현을 조절하고, CO 단백질을 안정화시키는 것으로 알려진 FKF1 단백질의 기능을 연구하던 중, FKF1 단백질의 160번 아미노산 이소류신 (I)을 아르기닌 (R)으로 치환한 FKF1 I160R 변이체를 암호화하는 유전자가 도입된 식물에서 개화시기가 촉진되는 것을 확인하였다.Accordingly, in the present invention, while studying the function of the FKF1 protein, which is known to regulate the expression of CO and FT genes, which are key factors in flowering regulation, and stabilize the CO protein, the amino acid isoleucine (I) 160 of the FKF1 protein is arginine ( It was confirmed that the flowering time is accelerated in plants in which the gene encoding the FKF1 I160R variant substituted with R) was introduced.

따라서, 본 발명은 일관점에서, FKF1 I160R 단백질 변이체를 암호화하는 유전자 또는 상기 유전자가 도입된 재조합 벡터로 식물을 형진전환시키는 단계를 포함하는 형질전환 식물체의 제조방법에 관한 것이다.Accordingly, the present invention, in a consistent manner, relates to a method for producing a transgenic plant comprising transforming a plant with a gene encoding a FKF1 I160R protein variant or a recombinant vector into which the gene is introduced.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 방법으로 제조되고, 개화시기가 촉진된 형질전환 식물체에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a transgenic plant produced by the above method and accelerated flowering time.

본 발명에 있어서, 상기 FKF1 I160R 단백질 변이체는 FKF1 단백질 아미노산 서열 (NP_564919.1)의 160번째 이소류신 (I)이 아르기닌 (R)으로 치환된 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 FKF1 I160R 단백질 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the FKF1 I160R protein variant may be characterized in that the 160th isoleucine (I) of the FKF1 protein amino acid sequence (NP_564919.1) is substituted with arginine (R), and the FKF1 I160R protein variant has SEQ ID NO. It is preferred to be represented by the amino acid sequence of 1, but is not limited thereto.

본 발명의 유전자는 상기 FKF1 I160R 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. The gene of the present invention includes both genomic DNA and cDNA encoding the FKF1 I160R protein.

본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 재조합 식물 발현 벡터이다. 여기에서 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 것을 지칭하는 것이다. 상기 벡터로 형질전환된 재조합 세포는 상기 세포의 자연 형태에서는 발현되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 자연 상태의 세포에서 발현되는 유전자를 발현할 수 있으나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다. The recombinant vector of the present invention is preferably a recombinant plant expression vector. “Recombinant” as used herein refers to a cell replicating a heterologous nucleic acid, expressing the nucleic acid, or expressing a peptide, a heterologous peptide, or a protein encoded by a heterologous nucleic acid. Recombinant cells transformed with the vector may express a gene or a gene fragment that is not expressed in the natural form of the cell, either in sense or antisense form. In addition, a recombinant cell can express a gene expressed in a cell in its natural state, but the gene is modified and reintroduced into the cell by artificial means.

여기에서 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭한다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용될 수 있다. "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다. “Vector” herein refers to the DNA fragment (s), nucleic acid molecules that are delivered into the cell. Vectors replicate DNA and can be independently reproduced in host cells. The "carrier" can often be used interchangeably with "vector". “Expression vector” means a recombinant DNA molecule comprising a desired coding sequence and a suitable nucleic acid sequence essential for expressing a coding sequence operably linked in a particular host organism. Promoters, enhancers, termination signals and polyadenylation signals available in eukaryotic cells are known.

"벡터"란 적당한 숙주세포로 외래 유전자를 도입하여 그것이 발현될 수 있게 하는 수단으로서, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함하며, 바람직하게는 플라스미드 벡터이다. 현재 식물세포를 형질전환시키기 위하여 개발된 벡터 중에서 가장 많이 쓰이는 벡터는 이원체 벡터(binary vector)다. 당업계에는 다양한 이원체 벡터가 공지되어 있다. A "vector" is a means for introducing a foreign gene into an appropriate host cell and allowing it to be expressed, such as a plasmid vector, a cosmid vector, a bacteriophage vector and an adenovirus vector, a retrovirus vector, a viral vector such as an adeno-associated virus vector, etc. It is preferably a plasmid vector. Currently, among the vectors developed to transform plant cells, the most commonly used vector is a binary vector. Various binary vectors are known in the art.

"발현 벡터"는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The "expression vector" will preferably include one or more selectable markers. The marker is a nucleic acid sequence having a property that can be selected by a chemical method, and all genes capable of distinguishing transformed cells from non-transformed cells are included. Examples include herbicide resistance genes such as glyphosate or phosphinothricin, antibiotic resistance genes such as Kanamycin, G418, Bleomycin, hygromycin, chloramphenicol, etc. , But is not limited thereto.

본 발명의 일실시예에 있어서, 식물 발현 벡터의 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적 (constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다. 또한 상기 벡터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린신타아제 (NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린 (phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스 (agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인 (Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the promoter of the plant expression vector may be a CaMV 35S, actin, ubiquitin, pEMU, MAS or histone promoter, but is not limited thereto. The term "promoter" refers to the region of the DNA upstream from the structural gene and refers to a DNA molecule to which RNA polymerase binds to initiate transcription. "Plant promoter" is a promoter capable of initiating transcription in plant cells. A "constitutive promoter" is a promoter that is active under most environmental conditions and developmental conditions or cell differentiation. Constitutive promoters are preferred in the present invention because selection of transformants can be made by various tissues at various stages. can do. Thus, constitutive promoters do not limit the possibility of selection. In addition, the vector may be used a conventional terminator, for example, nopallin synthase (NOS), rice α-amylase RAmy1 A terminator, phaseoline terminator, agrobacterium tumefaciens (ocrobacterium tumefaciens) Terminator of the Pine (Octopine) gene, and the like, but is not limited thereto. With regard to the need for terminators, it is generally known that such regions increase the certainty and efficiency of transcription in plant cells. Therefore, the use of terminators can be very desirable in the context of the present invention.

본 발명에 있어서, 상기 형질전환 식물체는 개화시기가 촉진된 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the transgenic plant may be characterized in that the flowering time is accelerated.

본 발명에 있어서, 개화시기 조절은 FKF1 I160R 단백질 변이체를 암호화하는 유전자의 발현을 유도할 수 있는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환시켜 식물의 개화시기를 촉진시키는 것일 수 있다.In the present invention, the regulation of flowering time may be to promote the flowering time of plants by transforming plants with a recombinant vector capable of inducing expression of a gene encoding FKF1 I160R protein variant.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및 (또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. Plant transformation refers to any method of transferring DNA to a plant. Such transformation methods do not necessarily have periods of regeneration and / or tissue culture. Transformation of plant species is now common for plant species, including dicotyledonous plants as well as monocotyledonous plants. In principle, any transformation method can be used to introduce the hybrid DNA according to the invention into suitable progenitor cells.

본 발명에서 식물체를 형질전환시키는 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법 (Krens, FA et al, 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I et al, June 1987, Plant Mol Biol 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법 (Shillito RD et al, 1985 Bio/Technol 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법 (Crossway A et al, 1986, Mol Gen Genet 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자충격법 (Klein TM et al, 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염 (EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다. The method for transforming a plant in the present invention is a calcium / polyethylene glycol method for protoplasts (Krens, FA et al, 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I et al, June 1987, Plant Mol Biol 8, 363-373 ), Electroporation of protoplasts (Shillito RD et al, 1985 Bio / Technol 3, 1099-1102), microscopic injection into plant elements (Crossway A et al, 1986, Mol Gen Genet 202, 179-185), various plants Agrobacterium tumerfaciens mediated gene transfer by urea (DNA or RNA-coated) particle bombardment (Klein TM et al, 1987, Nature 327, 70), infiltration of plants or transformation of mature pollen or vesicles In (incomplete) infection with a virus (EP 0 301 316) and the like can be suitably selected. A preferred method according to the invention comprises Agrobacterium mediated DNA delivery. Particularly preferred is the use of so-called binary vector technology as described in EP A 120 516 and US Pat. No. 4,940,838.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체 (protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.Any "plant cell" used for plant transformation may be any plant cell. The plant cell can be any form of cultured cells, cultured tissue, cultured organs or whole plants, preferably cultured cells, cultured tissue or cultured organs, and more preferably cultured cells. "Plant tissue" refers to tissues of differentiated or undifferentiated plants, including, but not limited to, roots, stems, leaves, pollen, seeds, various types of cells used for cancer tissue and culture, ie single cells, protoplasts (protoplast), shoots and callus tissue. The plant tissue may be in planta or organ culture, tissue culture or cell culture.

본 발명의 용어 식물(체)는 성숙한 식물뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 수 있는 식물세포, 식물조직 및 식물의 종자 등을 모두 포함하는 의미로서 이해된다. 본 발명의 방법이 적용될 수 있는 식물체는 쌍자엽 또는 단자엽 식물일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 쌍자엽 식물은 애기장대인 것이 바람직하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 방법에 의해 개화가 조절될 수 있는 식물체로는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류; 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스 등을 포함하는 사료작물류가 포함된다.The term plant (body) of the present invention is understood to mean not only a mature plant but also a plant cell, a plant tissue and a plant seed capable of developing into a mature plant. The plant to which the method of the present invention can be applied may be a dicotyledonous or monocotyledonous plant, but is not limited thereto, and the dicotyledonous plant is preferably Arabidopsis thaliana, but is not limited thereto. Plants whose flowering can be controlled by the method of the present invention include rice, wheat, barley, corn, soybeans, potatoes, red beans, oats, food crops including sorghum; Vegetable crops including cabbage, radish, pepper, strawberry, tomato, watermelon, cucumber, cabbage, melon, pumpkin, green onion, onion, and carrot; Special crops including ginseng, tobacco, cotton, sesame, sugar cane, beet, perilla, peanut, and rapeseed; Fruit trees including apple trees, pear trees, date palms, peaches, spears, grapes, tangerines, persimmons, plums, apricots, and bananas; Flowers including roses, gladiolus, gerbera, carnation, chrysanthemum, lily, tulip; And fodder crops including ryegrass, red clover, orchardgrass, alpha alpha, tolpescu, perennial lyegrass, and the like.

[실시예][Example]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not to be construed as limited by these examples.

실시예 1: FKF1 I160R 변이체를 발현시킨 형질전환체의 제작Example 1: Construction of transformants expressing FKF1 I160R variant

1-1: FKF1 I160R 변이체 제작1-1: FKF1 I160R variant production

본 발명의 실시예에서는 Arabidopsis thaliana ecotype Columbia (Col-0)를 실험 식물로 사용하였다.In the embodiment of the present invention, Arabidopsis thaliana ecotype Columbia (Col-0) was used as an experimental plant.

FKF1 I160R 단백질 변이를 만들기 위해 FKF1을 암호화하는 유전자의 478-480 번째 염기들인 ATT (Isoleucine)를 CGT (Arginine)로 치환시킨 후 hemagglutinin (HA) epitope tag을 암호화하는 유전자 서열을 FKF1 유전자 앞 부위에 결합시켰다. HA-FKF1 I160R 단백질을 암호화하는 유전자 서열을 FKF1 자체 프로모터와 함께 식물형질전환용 벡터에 옮겨 (pFKF1:HA - FKF1 I160R construct), 실제 FKF1 발현 양상과 비슷하게 조작하였다. 그 후, Agrobacterium tumefaciens에 벡터를 형질도입한 후 FKF1 유전자가 결손된 fkf1 돌연변이에 floral dipping 방식을 이용하여 형질전환 하였다 (Clough and Bent, Plnat Journal, 16(6):735,743, 1998). Hygromycin 항생제 저항성 및 fkf1 돌연변이가 보이는 늦은 개화시기 표현형 (Nelson et al,. 2000, Cell 3:101, 331-340)을 회복하는 정도를 통해 pFKF1:HA - FKF1 I160R 형질전환체들을 선별하였다. To make the FKF1 I160R protein mutation, replace the 478-480th base of the gene encoding FKF1, ATT (Isoleucine) with CGT (Arginine), and then bind the gene sequence encoding the hemagglutinin (HA) epitope tag to the front of the FKF1 gene Ordered. The gene sequence encoding the HA-FKF1 I160R protein is transferred to a vector for plant transformation with the FKF1 own promoter ( pFKF1: HA - FKF1 I160R construct), and manipulated similar to the actual FKF1 expression pattern. Then, after vector transduction into Agrobacterium tumefaciens, FKF1 gene-deficient fkf1 mutants were transformed using a floral dipping method (Clough and Bent, Plnat Journal, 16 (6): 735,743, 1998). PFKF1: HA - FKF1 through hygromycin antibiotic resistance and degree of recovery of late flowering time phenotypes showing fkf1 mutations (Nelson et al., 2000, Cell 3: 101, 331-340) I160R transformants were selected.

1-2: FKF1 I160R 변이체의 개화시기 표현형1-2: Flowering time phenotype of FKF1 I160R variant

야생형 (WT)에 비해 fkf1 돌연변이체는 개화시기가 늦다 (Nelson et al,. Cell 3(101): 331-340, 2000). Compared to wild type (WT), the fkf1 mutant has a slow flowering time (Nelson et al., Cell 3 (101): 331-340, 2000).

Arabidopsis thaliana ecotype Columbia (Col-0), fkf1 돌연변이에 정상 FKF1을 자체 프로모터로 발현 유도시킨 형질전환체 (pFKF1:HA-FKF1), fkf1 돌연변이에 FKF1 I160R을 자체 프로모터로 발현 유도시킨 두 독립적인 형질전환체 (pFKF1:HA-FKF1 I160R #2-3, #11-3), 그리고 fkf1 돌연변이체 씨앗들을 흙에 심고 4℃에서 3일간 저온 및 암 처리를 통해 휴면을 타파한 후, 낮 길이 16시간/밤 길이 8시간 및 온도가 22℃로 일정한 장일조건의 생장상에서 생육하여 개화시기를 측정하였다. 개화시기는 씨앗들의 발아시기가 조금씩 다름을 감안하여 각 개체의 첫 번째 꽃대가 3-5cm만큼 자랐을 때의 총 잎 개수를 조사하였으며, 잎의 숫자가 적을수록 개화시기가 빠른 것을 의미한다. 개화시기 측정은 비슷한 환경에서 독립적으로 3번 반복 실험하였으며, 각 식물체당 적어도 12개 이상의 개체들이 독립적인 실험에서 사용되었다.Arabidopsis thaliana ecotype Columbia (Col-0), a transformant that induced expression of normal FKF1 in its own promoter in the fkf1 mutant ( pFKF1: HA-FKF1 ), and two independent transformations that induced FKF1 I160R in its own promoter in the fkf1 mutant. Sieve ( pFKF1: HA-FKF1 I160R # 2-3, # 11-3), and fkf1 mutant seeds were planted in soil, and then dormant through low temperature and dark treatment at 4 ° C for 3 days, followed by daytime length of 16 hours / The length of night was 8 hours and the temperature was 22 ° C. The growth time was measured by growing on a growing day under constant daily conditions. Considering that the seed germination time is slightly different from each other, the total number of leaves when the first flower stalk of each individual is grown by 3-5 cm was investigated. The smaller the number of leaves, the faster the flowering time. Measurement of flowering time was repeated three times independently in a similar environment, and at least 12 individuals per plant were used in independent experiments.

그 결과, fkf1 돌연변이에 정상 FKF1을 자체 프로모터에 의해 발현 유도시킨 형질전환체 (pFKF1:HA-FKF1)는 개화시기가 야생형과 유사하지만, FKF1 I160R이 fkf1 돌연변이에 형질전환된 두 독립적인 개체들 (pFKF1:HA-FKF1 I160R #2-3, #11-3)은 개화시기가 오히려 더 빨라졌다 (도 2).As a result, the transformant ( pFKF1: HA-FKF1 ) in which normal expression of FKF1 in fkf1 mutants was induced by its own promoter was similar to the wild type, but FKF1 I160R of the transformed two independent objects in fkf1 mutation (pFKF1: HA-FKF1 I160R # 2-3, # 11-3) was the flowering time rather faster (Fig. 2).

그 다음, 야생형, fkf1 변이체 및 FKF1 I160R 변이체의 잎의 갯수를 조사하여 개화시기 표현형을 정량화하였다 (도 3). 잎의 숫자가 적을수록 개화시기가 빠른 것이다.Then, wild type, fkf1 variant and FKF1 The number of leaves of the I160R variant was investigated to quantify the flowering time phenotype (FIG. 3). The smaller the number of leaves, the faster the flowering time.

실시예 2: FKF1 I160R 변이체 단백질Example 2: FKF1 I160R variant protein

2-1: FKF1 I160R 변이체 단백질의 안정성 분석2-1: Stability analysis of FKF1 I160R variant protein

pFKF1:HA-FKF1과 pFKF1:HA-FKF1 I160R #2-3, #11-3 형질전환체를 사용하여 정상 FKF1과 FKF1 I160R 변이체 단백질의 안정성을 비교 분석하였다. The stability of normal FKF1 and FKF1 I160R variant proteins was compared and analyzed using pFKF1: HA-FKF1 and pFKF1: HA-FKF1 I160R # 2-3 and # 11-3 transformants.

각 형질전환체의 종자를 식물배양용 0.5x MS salt (with vitamins)/ with 1% sucrose/ 0.75% bacto agar 고체배지에 심은 후, 4℃에서 3일간 저온 및 암 처리를 통해 휴면을 타파한 후, 낮 길이 16시간/밤 길이 8시간 및 온도가 22℃로 일정한 장일조건의 생장상에서 생육하였다. 10일간 생육된 식물체들을 생장상에 빛이 처리되는 시점 (ZT0)부터 4시간 간격으로 총 6번 샘플링하여 하루 동안의 단백질 발현 양상을 분석하고자 하였다. 샘플링 된 모든 식물 시료는 채취 즉시 액체질소에 담가 급속 냉동시켰다. 동결된 샘플을 파쇄 후 단백질 추출 버퍼 (Protein extraction buffer)를 이용해 전체 단백질을 분리하였다. 각 샘플당 비슷한 양의 단백질을 이용하여 Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) 및 Western Blot 실험기법들을 이용하여 하루 주기의 정상 FKF1과 FKF1 I160R 변이체 단백질의 발현 양상을 비교하였다. 정상 FKF1과 FKF1 I160R 변이체 단백질의 발현양은 HA 항체를 이용하여 측정하였고, 상대적인 발현양 비교를 위해 항상 일정한 양으로 발현되는 Actin 단백질의 항체를 이용하여 보정하였다.After planting the seeds of each transformant in a 0.5x MS salt (with vitamins) / with 1% sucrose / 0.75% bacto agar solid medium for plant culture, break the dormancy through low temperature and cancer treatment at 4 ℃ for 3 days. , 16 hours in the day length / 8 hours in the night, and the temperature was 22 ° C., and grown on constant growth conditions. Plants grown for 10 days were sampled 6 times at 4 hour intervals from the point of time when light was processed on growth (ZT0) to analyze the protein expression pattern during the day. All sampled plant samples were immediately immersed in liquid nitrogen and rapidly frozen. After crushing the frozen sample, whole protein was separated using a protein extraction buffer. The expression patterns of normal FKF1 and FKF1 I160R variant proteins in one day cycle were compared using Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) and Western Blot test techniques using similar amounts of protein for each sample. The expression levels of the normal FKF1 and FKF1 I160R variant proteins were measured using HA antibodies, and corrected using antibodies of Actin protein that are always expressed in constant amounts for comparison of relative expression levels.

정상 FKF1과 FKF1 I160R 변이체 유전자의 발현량을 비교한 결과, FKF1 I160R 유전자의 발현량이 더 높은 것을 확인할 수 있었다 (도 4). 그러나, 단백질의 안정성은 FKF1 I160R 변이체가 더 낮은 것을 알 수 있었다 (도 4).Normal FKF1 and FKF1 As a result of comparing the expression levels of the I160R variant gene, FKF1 It was confirmed that the expression level of the I160R gene was higher (FIG. 4). However, it was found that the stability of the protein was lower in the FKF1 I160R variant (FIG. 4).

2-2: 2-2: COCO 및 And FT FT 유전자의 발현양 비교 Comparison of gene expression levels

FKF1 단백질은 개화촉진자로써 CO 및 FT 유전자들의 전사를 직접 조절하며, 뿐만 아니라 CO 단백질의 안정화를 조절함으로써 FT 유전자의 발현을 유도한다. 따라서, 정상 FKF1과 FKF1 I160R 변이체에서 CO 및 FT 유전자의 발현양을 비교하였다.The FKF1 protein is a flowering promoter that directly regulates the transcription of CO and FT genes, as well as regulates the stabilization of the CO protein, thereby inducing the expression of the FT gene. Therefore, normal FKF1 and FKF1 The expression levels of CO and FT genes in I160R variants were compared.

Col-0, pFKF1:HA - FKF1, pFKF1:HA - FKF1 I160R #2-3, #11-3 식물체를 사용하여 정상 FKF1과 FKF1 I160R 변이체 단백질의 안정성을 비교 분석하였다. Col-0, pFKF1: HA - FKF1 , pFKF1: HA - FKF1 The stability of normal FKF1 and FKF1 I160R variant proteins was compared and analyzed using I160R # 2-3 and # 11-3 plants.

각 형질전환체의 종자를 식물배양용 0.5x MS salt (with vitamins)/ with 1% sucrose/ 0.75% bacto agar 고체배지에 심은 후, 4℃에서 3일간 저온 및 암 처리를 통해 휴면을 타파한 후, 낮 길이 16시간/밤 길이 8시간 및 온도가 22℃로 일정한 장일조건의 생장상에서 생육하였다. 10일간 생육된 식물체들은 생장상에 빛이 켜지고 1시간 후 (ZT1) 부터 3시간 간격으로 총 8번 샘플링하여 하루 동안의 유전자 발현 양상을 분석하고자 하였다. 식물 샘플들은 채취 즉시 액체질소에 담가 급속 냉동한 후 분쇄하여 RNA isolation kit를 이용하여 전체 RNA를 추출하였다. 전체 RNA 중 mRNA만을 이용하여 cDNA를 합성하였고 CO 및 FT 유전자 특이적인 프라이머들을 이용한 real-time RT-PCR을 통해 상대적인 CO 및 FT 유전자의 상대적인 발현양을 정량화하였다. 정량화를 위해 일정하게 발현되는 유전자인 IPP2 특이적인 프라이머를 이용하여 각 샘플에서 상대적인 IPP2 발현양을 결정하고 CO 및 FT 유전자의 발현을 보정하는데 이용하였다.After planting the seeds of each transformant in a 0.5x MS salt (with vitamins) / with 1% sucrose / 0.75% bacto agar solid medium for plant culture, break the dormancy through low temperature and cancer treatment at 4 ℃ for 3 days. , 16 hours in the day length / 8 hours in the night, and the temperature was 22 ° C., and grown on constant growth conditions. Plants grown for 10 days turned on the light on growth, and after 1 hour (ZT1), samples were sampled 8 times at intervals of 3 hours to analyze the gene expression pattern during the day. Plant samples were immersed in liquid nitrogen immediately after collection, and then rapidly frozen and then pulverized to extract total RNA using an RNA isolation kit. Through the real-time RT-PCR using only the total RNA mRNA it was synthesized using the cDNA CO and FT gene-specific primers to quantify the relative expression level of relative CO and FT genes. IPP2 , a gene that is constantly expressed for quantification Specific primers were used to determine the relative amount of IPP2 expression in each sample and to correct the expression of CO and FT genes.

그 결과, CO 유전자의 발현은 FKF1 I160R 변이체에서 야생형과 차이가 없으나, FT 유전자의 발현은 야생형에 비해 FKF1 I160R 변이체에서 크게 증가하였다 (도 5). 이는 FKF1 I160R 변이체의 빠른 개화시기 표현이 CO 단백질의 안정화를 통해 FT 유전자의 발현이 증가시킨 것임을 알 수 있었다. 따라서, FKF1 I160R 변이체 단백질은 CO 단백질을 안정화시키는 역할이 증대된 것으로 볼 수 있다.As a result, the expression of the CO gene is FKF1 In the I160R variant, there was no difference from the wild type, but the expression of the FT gene was FKF1 compared to the wild type. There was a significant increase in the I160R variant (Figure 5). This is FKF1 It was found that the expression of the fast flowering time of the I160R variant increased expression of the FT gene through stabilization of the CO protein. Therefore, it can be seen that the FKF1 I160R variant protein has an increased role of stabilizing CO protein.

실시예 3: FKF1 I160R 변이체 단백질의 동종이량체화 (homodimerization)Example 3: Homomerization of FKF1 I160R variant protein

Tobacco transient expression system을 이용하여 정상 FKF1과 FKF1 I160R 변이체 단백질의 발현양을 비슷하게 유도하였다. 항체가 인식할 수 있는 epitope (TAP 및 HA)이 결합된 정상 FKF1과 FKF1 I160R 변이체 단백질들을 과발현할 수 있는 벡터를 제작한 후 Agrobacterium tumefaciens에 형질도입시켰다. 35S:HA-FKF1, 35S:HA - FKF1 I160R, 35S:FKF1 -TAP construct를 각각 포함하고 있는 Agrobacterium을 배양 후 3주간 생육된 Nicotiana benthamiana의 잎 뒷면 기공을 통해 infiltration 시켰는데, 이때 한 종류의 단백질 발현 또는 두 종류의 단백질 동시발현 등의 목적에 맞게 한 종류의 Agrobacterium이 infiltration 되거나 또는 단백질들 사이의 결합을 확인하기 위해 두 종류의 Agrobacterium이 동시에 infiltration되었다. 3일 후 infiltration된 잎을 채취하여 액체질소에 급속 냉동 및 파쇄하여 단백질-단백질 결합 분석용 시료를 준비하였다. 항체를 이용한 co-immunoprecipitation (co-IP)실험기법을 통해 단백질 복합체를 분리하고, SDS-PAGE 및 Western Blot을 통해 FKF1-FKF1 및 FKF1-FKF1 I160R의 동종이량체 형성을 비교 분석하였다. 독립적인 3번의 반복 실험을 통해 동종이량체양을 정량화하였다. The expression levels of normal FKF1 and FKF1 I160R mutant proteins were similarly derived using the Tobacco transient expression system. After constructing a vector capable of overexpressing normal FKF1 and FKF1 I160R mutant proteins to which the antibody recognizes epitope (TAP and HA), it was transduced into Agrobacterium tumefaciens. 35S: HA-FKF1 , 35S: HA - FKF1 Nicotiana grown for 3 weeks after cultivation of Agrobacterium containing I160R and 35S: FKF1 -TAP constructs Infiltration was performed through the pores on the back of the leaf of benthamiana . At this time, one type of Agrobacterium was infiltration or two types of Agrobacterium to confirm the binding between proteins for purposes such as expression of one type of protein or simultaneous expression of two types of proteins. This was infiltration at the same time. After 3 days, the infiltered leaves were collected and rapidly frozen and crushed in liquid nitrogen to prepare a sample for protein-protein binding analysis. Protein complexes were separated through co-immunoprecipitation (co-IP) experimental techniques using antibodies, and homodimer formation of FKF1-FKF1 and FKF1-FKF1 I160R was compared and analyzed by SDS-PAGE and Western Blot. Homodimer amount was quantified through 3 independent experiments.

그 결과, FKF1 I160R 변이체 단백질의 동종이량체화는 정상 FKF1에 비해 25% 정도 감소하였으나, 유의미한 결과는 아니였다 (도 6).As a result, the homodimerization of the FKF1 I160R variant protein was reduced by about 25% compared to the normal FKF1, but was not a significant result (Fig. 6).

실시예 4: FKF1 I160R 변이체의 복합체 형성 및 결합력 분석Example 4: Complex formation and binding analysis of FKF1 I160R variants

4-1: FKF1 I160R-CO 복합체 형성4-1: FKF1 I160R-CO complex formation

FKF1은 CO와 결합해서 CO를 안정화시키는 것으로 알려져 있으며 (Song et al,. SCIENCE 336: 1045-1049, 2012), 도 5에 나타난 것과 같이, CO 유전자의 발현 변화없이 FT 유전자의 발현이 증가된 것은 FKF1 I160R에 의해 CO 단백질이 안정화됨 것이 원임임을 알 수 있다.FKF1 is known to stabilize CO by binding to CO (Song et al., SCIENCE 336: 1045-1049, 2012), and as shown in FIG. 5, the expression of the FT gene is increased without changing the expression of the CO gene. It can be seen that the CO protein is stabilized by FKF1 I160R.

이에, Tobacco transient expression system을 이용하여 정상 FKF1 I160R 변이체 단백질 및 CO 단백질을 과발현 시킨 후 단백질을 추출하였다. 이를 위해 35S:CO -TAP, 35S:HA - FKF1, 35S:HA - FKF1 I160R construct를 각각 포함하고 있는 Agrobacterium을 배양 후 목적에 맞는 조합으로 Nicotiana benthamiana에 infiltration하였다. 항체를 이용한 co-immunoprecipitation (co-IP)실험기법을 통해 단백질 복합체를 분리하고, SDS-PAGE 및 Western Blot을 통해 CO-FKF1 및 CO-FKF1 I160R 복합체양을 비교 분석하였다. 독립적인 3번의 반복 실험을 통해 정량화하였다. Thus, the normal FKF1 I160R variant protein and CO protein were overexpressed using the Tobacco transient expression system, and then the protein was extracted. For this, 35S: CO -TAP , 35S: HA - FKF1 , 35S: HA - FKF1 After culturing Agrobacterium containing I160R construct, Nicotiana Infiltration was performed on benthamiana . Protein complexes were separated through a co-immunoprecipitation (co-IP) experiment method using antibodies, and the amounts of CO-FKF1 and CO-FKF1 I160R complexes were compared and analyzed through SDS-PAGE and Western Blot. Quantification was achieved through three independent experiments.

그 결과, CO와의 결합력은 오히려 FKF1 I160R이 정상 FKF1에 비해 감소되어 있는 것을 확인하였다 (도 7). 이로써, FKF1 I160R는 CO와의 직접 결합이 아닌 간접적으로 안정화시키고 있는 것을 알 수 있었다.As a result, it was confirmed that FKF1 I160R has a reduced binding capacity with CO compared to normal FKF1 (FIG. 7). As a result, it was found that the FKF1 I160R was stabilized indirectly rather than direct binding with CO.

4-2: FKF1 I160R과 COP1의 결합력4-2: Coupling force of FKF1 I160R and COP1

COP1은 직접적으로 CO 단백질을 분해하는데, FKF1이 COP1과 결합하여 COP1에 의한 CO 분해를 막고 있음이 알려져 있다 (Lee et al., Nature communications 8:2259, 1-10, 2017). 실시예 4-1에서 설펴본 바와 같이, FKF1 I160R은 간접적으로 CO를 안정화시키는 것으로 보이므로, FKF1 I160R과 COP1과의 결합력을 정상 FKF1과 비교하였다.COP1 directly decomposes CO proteins, and it is known that FKF1 binds to COP1 and prevents CO degradation by COP1 (Lee et al., Nature communications 8: 2259, 1-10, 2017). As described in Example 4-1, FKF1 I160R seems to indirectly stabilize CO, so the binding force between FKF1 I160R and COP1 was compared to normal FKF1.

pCO:HA -CO/ cop1 및 pFKF1:HA - FKF1과 pFKF1:HA - FKF1 I160R #2-3 형질전환체를 사용하여 COP1에 대한 정상 FKF1과 FKF1 I160R 변이체 단백질 사이의 결합력 차이을 비교하였다. COP1 단백질이 결손된 cop1 돌연변이체에 도입된 HA-CO 형질전환체 (pCO:HA -CO/cop1 -4), pFKF1:HA - FKF1, pFKF1:HA - FKF1 I160R #2-3 씨앗들을 0.5x MS 고체배지에 심은 후 장일조건에서 10일간 생육시켰다. 10일 째 되는 날, 단백질-단백질 결합 분석용 시료를 얻기 위해 빛을 조사된 후 13시간째 (ZT13)에 식물을 샘플링하여 즉시 액체질소에 담가 급속 냉동하였다. 총 단백질을 추출 후 co-immunoprecipitation, SDS-PAGE 및 Western Blot 실험을 통해 단백질-단백질 결합을 조사하였다. COP1 단백질을 확인하기 위해 COP1 특이적인 항체 (Lee et al., Nature communications 8:2259, 1-10, 2017)를 이용하였고, FKF1 및 FKF1 I160R 단백질들을 확인하기 위해 HA 항체가 이용되었다. pCO: HA -CO / cop1 and pFKF1: HA - FKF1 pFKF1: HA - FKF1 The I160R # 2-3 transformant was used to compare the difference in binding force between normal FKF1 and FKF1 I160R variant proteins for COP1. HA-CO transformants ( pCO: HA -CO / cop1 -4 ) introduced into cop1 mutants with COP1 protein deletion, pFKF1: HA - FKF1 , pFKF1: HA - FKF1 I160R # 2-3 seeds were planted in 0.5x MS solid medium and grown for 10 days under long-day conditions. On the 10th day, light was irradiated to obtain a sample for protein-protein binding analysis, and then the plant was sampled at 13 hours (ZT13) and immediately immersed in liquid nitrogen and rapidly frozen. After extraction of total protein, protein-protein binding was examined through co-immunoprecipitation, SDS-PAGE, and Western Blot experiments. COP1 specific antibodies (Lee et al., Nature communications 8: 2259, 1-10, 2017) were used to identify COP1 proteins, and HA antibodies were used to identify FKF1 and FKF1 I160R proteins.

그 결과, 정상 FKF1과 COP1과의 결합에 비해 FKF1 I160R과 COP1과의 결합력이 증가한 것을 확인할 수 있었다 (도 8). 따라서, FKF1 I160R은 COP1과의 결합에 의해 CO 분해를 억제할 수 있음을 할 수 있었다. 즉, FKF1 I160R과 COP1이 결합하여 CO의 분해가 억제되므로, CO 단백질의 안정화가 증가하는 것으로 볼 수 있다. As a result, it was confirmed that the binding force between FKF1 I160R and COP1 increased compared to the binding between normal FKF1 and COP1 (FIG. 8). Therefore, FKF1 I160R was able to suppress CO degradation by binding with COP1. That is, since the decomposition of CO is suppressed by FKF1 I160R and COP1 binding, it can be seen that stabilization of the CO protein is increased.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.Since the specific parts of the present invention have been described in detail above, it will be apparent to those of ordinary skill in the art that these specific techniques are only preferred embodiments, and the scope of the present invention is not limited thereby. will be. Therefore, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Plants with Promoted Flowering Time Using FKF1 Mutant and Method for Producing the Same <130> P18-B158 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 619 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 Met Ala Arg Glu His Ala Ile Gly Glu Ala Thr Gly Lys Arg Lys Lys 1 5 10 15 Arg Gly Arg Val Glu Glu Ala Glu Glu Tyr Cys Asn Asp Gly Ile Glu 20 25 30 Glu Gln Val Glu Asp Glu Lys Leu Pro Leu Glu Val Gly Met Phe Tyr 35 40 45 Tyr Pro Met Thr Pro Pro Ser Phe Ile Val Ser Asp Ala Leu Glu Pro 50 55 60 Asp Phe Pro Leu Ile Tyr Val Asn Arg Val Phe Glu Val Phe Thr Gly 65 70 75 80 Tyr Arg Ala Asp Glu Val Leu Gly Arg Asn Cys Arg Phe Leu Gln Tyr 85 90 95 Arg Asp Pro Arg Ala Gln Arg Arg His Pro Leu Val Asp Pro Val Val 100 105 110 Val Ser Glu Ile Arg Arg Cys Leu Glu Glu Gly Ile Glu Phe Gln Gly 115 120 125 Glu Leu Leu Asn Phe Arg Lys Asp Gly Thr Pro Leu Val Asn Arg Leu 130 135 140 Arg Leu Ala Pro Ile Arg Asp Asp Asp Gly Thr Ile Thr His Val Arg 145 150 155 160 Gly Ile Gln Val Phe Ser Glu Thr Thr Ile Asp Leu Asp Arg Val Ser 165 170 175 Tyr Pro Val Phe Lys His Lys Gln Gln Leu Asp Gln Thr Ser Glu Cys 180 185 190 Leu Phe Pro Ser Gly Ser Pro Arg Phe Lys Glu His His Glu Asp Phe 195 200 205 Cys Gly Ile Leu Gln Leu Ser Asp Glu Val Leu Ala His Asn Ile Leu 210 215 220 Ser Arg Leu Thr Pro Arg Asp Val Ala Ser Ile Gly Ser Ala Cys Arg 225 230 235 240 Arg Leu Arg Gln Leu Thr Lys Asn Glu Ser Val Arg Lys Met Val Cys 245 250 255 Gln Asn Ala Trp Gly Lys Glu Ile Thr Gly Thr Leu Glu Ile Met Thr 260 265 270 Lys Lys Leu Arg Trp Gly Arg Leu Ala Arg Glu Leu Thr Thr Leu Glu 275 280 285 Ala Val Cys Trp Arg Lys Phe Thr Val Gly Gly Ile Val Gln Pro Ser 290 295 300 Arg Cys Asn Phe Ser Ala Cys Ala Val Gly Asn Arg Leu Val Leu Phe 305 310 315 320 Gly Gly Glu Gly Val Asn Met Gln Pro Leu Asp Asp Thr Phe Val Leu 325 330 335 Asn Leu Asp Ala Glu Cys Pro Glu Trp Gln Arg Val Arg Val Thr Ser 340 345 350 Ser Pro Pro Gly Arg Trp Gly His Thr Leu Ser Cys Leu Asn Gly Ser 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565 570 575 Ala Trp Gly His Ser Thr Cys Val Val Gly Gly Thr Arg Val Leu Val 580 585 590 Leu Gly Gly His Thr Gly Glu Glu Trp Ile Leu Asn Glu Leu His Glu 595 600 605 Leu Cys Leu Ala Ser Arg Gln Asp Ser Asp Leu 610 615 <110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Plants with Promoted Flowering Time Using FKF1 Mutant and Method for Producing the Same <130> P18-B158 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 619 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 Met Ala Arg Glu His Ala Ile Gly Glu Ala Thr Gly Lys Arg Lys Lys 1 5 10 15 Arg Gly Arg Val Glu Glu Ala Glu Glu Tyr Cys Asn Asp Gly Ile Glu 20 25 30 Glu Gln Val Glu Asp Glu Lys Leu Pro Leu Glu Val Gly Met Phe Tyr 35 40 45 Tyr Pro Met Thr Pro Pro Ser Phe Ile Val Ser Asp Ala Leu Glu Pro 50 55 60 Asp Phe Pro Leu Ile Tyr Val Asn Arg Val Phe Glu Val Phe Thr Gly 65 70 75 80 Tyr Arg Ala Asp Glu Val Leu Gly Arg Asn Cys Arg Phe Leu Gln Tyr 85 90 95 Arg Asp Pro Arg Ala Gln Arg Arg His Pro Leu Val Asp Pro Val Val 100 105 110 Val Ser Glu Ile Arg Arg Cys Leu Glu Glu Gly Ile Glu Phe Gln Gly 115 120 125 Glu Leu Leu Asn Phe Arg Lys Asp Gly Thr Pro Leu Val Asn Arg Leu 130 135 140 Arg Leu Ala Pro Ile Arg Asp Asp Asp Gly Thr Ile Thr His Val Arg 145 150 155 160 Gly Ile Gln Val Phe Ser Glu Thr Thr Ile Asp Leu Asp Arg Val Ser 165 170 175 Tyr Pro Val Phe Lys His Lys Gln Gln Leu Asp Gln Thr Ser Glu Cys 180 185 190 Leu Phe Pro Ser Gly Ser Pro Arg Phe Lys Glu His His Glu Asp Phe 195 200 205 Cys Gly Ile Leu Gln Leu Ser Asp Glu Val Leu Ala His Asn Ile Leu 210 215 220 Ser Arg Leu Thr Pro Arg Asp Val Ala Ser Ile Gly Ser Ala Cys Arg 225 230 235 240 Arg Leu Arg Gln Leu Thr Lys Asn Glu Ser Val Arg Lys Met Val Cys 245 250 255 Gln Asn Ala Trp Gly Lys Glu Ile Thr Gly Thr Leu Glu Ile Met Thr 260 265 270 Lys Lys Leu Arg Trp Gly Arg Leu Ala Arg Glu Leu Thr Thr Leu Glu 275 280 285 Ala Val Cys Trp Arg Lys Phe Thr Val Gly Gly Ile Val Gln Pro Ser 290 295 300 Arg Cys Asn Phe Ser Ala Cys Ala Val Gly Asn Arg Leu Val Leu Phe 305 310 315 320 Gly Gly Glu Gly Val Asn Met Gln Pro Leu Asp Asp Thr Phe Val Leu 325 330 335 Asn Leu Asp Ala Glu Cys Pro Glu Trp Gln Arg Val Arg Val Thr Ser 340 345 350 Ser Pro Pro Gly Arg Trp Gly His Thr Leu Ser Cys Leu Asn Gly Ser 355 360 365 Trp Leu Val Val Phe Gly Gly Cys Gly Arg Gln Gly Leu Leu Asn Asp 370 375 380 Val Phe Val Leu Asp Leu Asp Ala Lys His Pro Thr Trp Lys Glu Val 385 390 395 400 Ala Gly Gly Thr Pro Pro Leu Pro Arg Ser Trp His Ser Ser Cys Thr 405 410 415 Ile Glu Gly Ser Lys Leu Val Val Ser Gly Gly Cys Thr Asp Ala Gly 420 425 430 Val Leu Leu Ser Asp Thr Phe Leu Leu Asp Leu Thr Thr Asp Lys Pro 435 440 445 Thr Trp Lys Glu Ile Pro Thr Ser Trp Ala Pro Pro Ser Arg Leu Gly 450 455 460 His Ser Leu Ser Val Phe Gly Arg Thr Lys Ile Leu Met Phe Gly Gly 465 470 475 480 Leu Ala Asn Ser Gly His Leu Lys Leu Arg Ser Gly Glu Ala Tyr Thr 485 490 495 Ile Asp Leu Glu Asp Glu Glu Pro Arg Trp Arg Glu Leu Glu Cys Ser 500 505 510 Ala Phe Pro Gly Val Val Val Pro Pro Pro Arg Leu Asp His Val Ala 515 520 525 Val Ser Met Pro Cys Gly Arg Val Ile Ile Phe Gly Gly Ser Ile Ala 530 535 540 Gly Leu His Ser Pro Ser Gln Leu Phe Leu Ile Asp Pro Ala Glu Glu 545 550 555 560 Lys Pro Ser Trp Arg Ile Leu Asn Val Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu 565 570 575 Ala Trp Gly His Ser Thr Cys Val Val Gly Gly Thr Arg Val Leu Val 580 585 590 Leu Gly Gly His Thr Gly Glu Glu Trp Ile Leu Asn Glu Leu His Glu 595 600 605 Leu Cys Leu Ala Ser Arg Gln Asp Ser Asp Leu 610 615

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 FKF1 I160R 단백질 변이체를 암호화하는 유전자 또는 상기 유전자가 도입된 재조합 벡터로 식물을 형질전환시키는 단계를 포함하는 개화시기가 촉진된 형질전환 식물체의 제조방법.
A method for producing a transgenic plant with accelerated flowering time, comprising transforming a plant with a gene encoding the FKF1 I160R protein variant represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a recombinant vector into which the gene is introduced.

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제1항에 있어서, 상기 식물은 쌍자엽 식물 또는 단자엽 식물인 것을 특징으로 하는 제조방법.
The method of claim 1, wherein the plant is a dicotyledonous plant or a monocotyledonous plant.

제5항에 있어서, 상기 쌍자엽 식물은 애기장대인 것을 특징으로 하는 제조방법.
The method of claim 5, wherein the dicotyledonous plant is Arabidopsis thaliana.

제1항의 방법으로 제조된 개화시기가 촉진된 형질전환 식물체.
A transgenic plant with accelerated flowering time produced by the method of claim 1.

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제7항에 있어서, 상기 식물은 쌍자엽 식물 또는 단자엽 식물인 것을 특징으로 하는 식물체.
The plant according to claim 7, wherein the plant is a dicotyledonous plant or a monocotyledonous plant.

제9항에 있어서, 상기 쌍자엽 식물은 애기장대인 것을 특징으로 하는 식물체.
10. The plant according to claim 9, wherein the dicotyledonous plant is Arabidopsis thaliana.