KR102509112B1 - CaDIMK1 gene and Method for improving the resistance to the drought stress using CaDIMK1 in plants - Google Patents

CaDIMK1 gene and Method for improving the resistance to the drought stress using CaDIMK1 in plants Download PDF

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Abstract

본 발명은 고추 녹광 품종 유래 인산화효소 CaDIMK1 유전자 및 이를 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법에 관한 것으로, 본 발명은 건조 스트레스에 대한 저항성 증진 단백질을 암호화 하는 CaDIMK1 유전자를 동정하였으며, CaDIMK1 단백질은 ABA 신호전달의 양성 조절자로 기능하며 상기 단백질이 과발현된 형질전환 식물체에서 건조 스트레스 저항성 증진 효과를 확인하였는바, CaDIMK1 유전자의 발현 조절을 통해 인류가 이용할 수 있는 작물 등의 개량에 활용할 수 있으며, 특히 식물의 생산성을 향상시키는데 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.The present invention relates to a CaDIMK1 gene of a phosphorylation enzyme derived from a red pepper cultivar and a method for enhancing dry stress resistance of a plant using the same. It functions as a positive regulator of the above protein, and the drying stress resistance enhancing effect was confirmed in transgenic plants overexpressing the protein. Through the expression control of the CaDIMK1 gene, it can be used to improve crops usable by mankind, in particular, plant productivity It is expected that it can be usefully used to improve.

Description

CaDIMK1 유전자 및 이를 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법{CaDIMK1 gene and Method for improving the resistance to the drought stress using CaDIMK1 in plants}CaDIMK1 gene and method for improving dry stress resistance of plants using the same {CaDIMK1 gene and Method for improving the resistance to the drought stress using CaDIMK1 in plants}

본 발명은 고추 녹광 품종 유래 인산화효소 CaDIMK1(Capsicum annuum drought-induced MAP kinase 1) 유전자, 상기 유전자에 의해 코딩되는 아미노산으로 이루어진 단백질 및 상기 유전자 또는 단백질을 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법 등에 관한 것이다.The present invention relates to a capsicum annuum drought-induced MAP kinase 1 ( CaDIMK1 ) gene derived from red pepper green light variety, a protein composed of amino acids encoded by the gene, and a method for enhancing the drying stress resistance of plants using the gene or protein.

지구온난화는 극심한 기후 변화를 야기하여 식물들의 정상적인 생장 및 발달을 저해하는 환경적 스트레스를 유발하며, 이에 대하여 식물체는 추위, 고염, 및 가뭄과 같은 불리한 환경에서 생존하기 위한 정교한 방어기작을 진화시켜왔다. 예컨대, 가뭄(drought)은 수분 부족 환경에 의해 일어나며 식물의 정상적인 성장에 심각한 영향을 미쳐 결국 곡물의 수확량 감소를 초래하는데, 식물은 이러한 건조 스트레스에 적응하기 위해 기공폐쇄, 앱시스산(abscisic acid; 이하 ABA)의 합성 및 축적과 같은 다양한 방어 기작을 활성화한다.Global warming causes extreme climate change to induce environmental stress that inhibits the normal growth and development of plants. In response, plants have evolved sophisticated defense mechanisms to survive in adverse environments such as cold, high salinity, and drought. For example, drought is caused by a water shortage environment and seriously affects the normal growth of plants, eventually resulting in a decrease in crop yield. It activates various defense mechanisms such as the synthesis and accumulation of ABA).

ABA는 비생물적 스트레스 특히, 건조 스트레스에 대하여 식물을 보호하기 위한 조절 인자이며, 식물 생장 및 발달에 매우 중요한 역할을 한다고 알려졌다. 보고된 바에 의하면, ABA를 미리 처리하고 스트레스를 준 식물은 그렇지 않은 식물에 비해 스트레스에 잘 저항하는 반면 ABA를 생성하지 못하거나, ABA에 반응하지 못하는 돌연변이 식물들은 스트레스에 약한 것으로 알려졌다. 따라서 ABA의 반응에 관여하는 단백질들을 이용하면, 환경 스트레스에 대한 저항성이 향상된 식물을 개발할 수 있을 것으로 기대되고 있다.ABA is known to be a regulatory factor for protecting plants against abiotic stress, particularly dry stress, and plays a very important role in plant growth and development. Reportedly, plants treated with ABA in advance and subjected to stress are more resistant to stress than plants that are not, whereas mutant plants that do not produce ABA or do not respond to ABA are known to be weak against stress. Therefore, it is expected that plants with improved resistance to environmental stress can be developed by using proteins involved in the response of ABA.

ABA 신호는 삼투 적응 및 뿌리 수리 전도도(hydraulic conductivity)의 조절에 관여하는 전사인자와 E3 리가아제(E3 ligase)와 같은 다양한 스트레스 관련 유전자들의 발현을 조절한다고 알려졌으나, 완전한 ABA 신호전달경로는 아직 규명되지 않았다. 식물 세포에서 ABA 신호전달 개시를 위해서는 ABA 수용체가 존재해야 하고 신호를 하위 단백질로 전달해야 한다. 현재까지 ABA 수용체로써 PYR/PYL/RCARs가 ABA를 인식하는 역할을 한다고 알려졌다. 수용체가 ABA를 인식하면 표적 단백질의 인산화를 통해 특정 유전자들의 발현 및 이온 채널 활성화를 촉진시키며, 이는 식물체가 불리한 환경에 적응할 수 있도록 한다.ABA signals are known to regulate the expression of various stress-related genes, such as transcription factors and E3 ligase, which are involved in osmotic adaptation and regulation of root hydraulic conductivity, but the complete ABA signaling pathway has not yet been identified. It didn't work. Initiation of ABA signaling in plant cells requires the presence of ABA receptors and transmission of signals to downstream proteins. Until now, it has been known that PYR/PYL/RCARs as ABA receptors play a role in recognizing ABA. When the receptor recognizes ABA, it promotes the expression of specific genes and the activation of ion channels through phosphorylation of target proteins, which enables plants to adapt to unfavorable environments.

오늘날 사막화가 진행됨에 따라 물 부족이 농업과 환경에 큰 문제점을 초래하고 있으며, 이에 물을 적게 사용하여도 건조한 환경에서 견디고 살 수 있는 식물의 개발이 필요한 실정이다. 이러한 기술이 개발되어 작물에 적용되면 농업 생산량이 매우 증가할 것으로 기대되며, 특히 건조한 지역의 경우, 건조 저항성이 향상된 식물, 즉 증산 작용을 낮출 수 있는 식물들은 생존에 유리하므로, 농업 생산성 향상에 기여할 수 있을 뿐 아니라, 환경이 매우 건조한 지역에서 환경정화에도 유용할 수 있다.As desertification progresses today, water shortage is causing major problems in agriculture and the environment, and it is necessary to develop plants that can survive and live in a dry environment even with low water consumption. If this technology is developed and applied to crops, it is expected that agricultural production will greatly increase. Especially in arid regions, plants with improved drying resistance, that is, plants that can lower transpiration, will have an advantage in survival, contributing to the improvement of agricultural productivity. It can also be useful for environmental cleanup in areas where the environment is very dry.

이에, 식물체의 건조 스트레스에 대한 저항성을 증진시키기 위한 방법이 주요 연구 대상이 되고 있으며, 이와 관련하여 건조 스트레스 내성 및 생장 촉진 관련 유전자와 이에 따른 형질전환 식물체에 대한 연구가 이루어지고 있으나 아직 미비한 실정이다.Therefore, a method for enhancing the resistance of plants to dry stress has become a major research subject, and in this regard, studies on genes related to dry stress tolerance and growth promotion and transgenic plants are being conducted, but the situation is still incomplete. .

한국등록특허공보 제10-2020870호(2019.09.05)Korean Registered Patent Publication No. 10-2020870 (2019.09.05)

본 발명자들은 ABA 신호전달 경로 조절을 통한 건조 스트레스 반응간의 관련성을 알아보기 위해 연구하던 중, 고추에서 단백질 인산화효소(kinase)인 CaDIMK1(Capsicum annuum drought-induced MAP kinase 1) 유전자를 동정하였으며, 상기 유전자가 ABA 매개성 기공 폐쇄를 조절하고 종자 발아 및 묘목 성장 단계에서 ABA 과민성을 나타냄으로써, 이를 통해 식물의 건조 스트레스 저항성을 증진시키는 양성 조절자로서 기능함을 규명하여 본 발명을 완성하였다.The present inventors identified CaDIMK1 ( Capsicum annuum drought-induced MAP kinase 1) gene, a protein kinase in pepper, while studying to determine the relationship between drying stress responses through the regulation of the ABA signaling pathway, and the gene The present invention was completed by identifying that ABA controls stomatal closure mediated by ABA and exhibits ABA hypersensitivity in the seed germination and seedling growth stages, thereby functioning as a positive regulator that enhances the drying stress resistance of plants.

이에, 본 발명의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 건조 스트레스 저항성 CaDIMK1(Capsicum annuum drought-induced MAP kinase 1) 단백질을 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a drying stress resistant CaDIMK1 ( Capsicum annuum drought-induced MAP kinase 1) protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

본 발명의 다른 목적은 상기 CaDIMK1 단백질을 암호화하는 CaDIMK1 유전자를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a CaDIMK1 gene encoding the CaDIMK1 protein.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 CaDIMK1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a recombinant vector containing the CaDIMK1 gene.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a plant transformed with the recombinant vector.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질, 이를 암호화하는 CaDIMK1 유전자, 및 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for enhancing dry stress resistance of plants, comprising at least one selected from the group consisting of the protein, the CaDIMK1 gene encoding the same, and a recombinant vector containing the gene as an active ingredient. .

본 발명의 또 다른 목적은 CaDIMK1 유전자를 식물체에 형질전환하여 과발현시킴으로써 식물체의 건조 스트레스 저항성을 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for enhancing the drying stress resistance of plants by transforming and overexpressing the CaDIMK1 gene in plants.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a transgenic plant with enhanced drying stress resistance by the above method.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be achieved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other problems not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the description below. There will be.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 건조 스트레스 저항성 CaDIMK1(Capsicum annuum drought-induced MAP kinase 1) 단백질을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a drying stress resistant CaDIMK1 ( Capsicum annuum drought-induced MAP kinase 1) protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

또한, 본 발명은 상기 CaDIMK1 단백질을 암호화하는 CaDIMK1 유전자를 제공한다.In addition, the present invention provides a CaDIMK1 gene encoding the CaDIMK1 protein.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 CaDIMK1 유전자는 서열번호 2의 염기 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.As one embodiment of the present invention, the CaDIMK1 gene may consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 CaDIMK1 유전자는 고추로부터 분리될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.As another embodiment of the present invention, the CaDIMK1 gene may be isolated from pepper, but is not limited thereto.

또한, 본 발명은 상기 CaDIMK1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.In addition, the present invention provides a recombinant vector containing the CaDIMK1 gene.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 재조합 벡터는 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.As one embodiment of the present invention, the recombinant vector may be used to enhance dry stress resistance of plants, but is not limited thereto.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물을 제공한다.In addition, the present invention provides a plant transformed with the recombinant vector.

또한, 본 발명은 상기 단백질, 이를 암호화하는 CaDIMK1 유전자, 및 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for enhancing drying stress resistance of plants, comprising at least one selected from the group consisting of the protein, the CaDIMK1 gene encoding the same, and a recombinant vector containing the gene as an active ingredient.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진 방법을 제공한다:In addition, the present invention provides a method for enhancing the drying stress resistance of plants, comprising the following steps:

(a) CaDIMK1(Capsicum annuum drought-induced MAP kinase 1) 단백질을 암호화하는 유전자를 식물체에 형질전환 하는 단계; 및(a) CaDIMK1 ( Capsicum annuum drought-induced MAP kinase 1) transforming a gene encoding a protein into a plant; and

(b) 상기 형질전환된 식물체에서 CaDIMK1 단백질을 과발현시키는 단계.(b) overexpressing the CaDIMK1 protein in the transformed plant.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된, 형질전환 식물체를 제공한다.In addition, the present invention provides a transgenic plant with improved drying stress resistance by the above method.

또한, 본 발명은 상기 단백질, 이를 암호화하는 CaDIMK1 유전자, 및 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 조성물의 식물체 건조 스트레스 저항성 증진 용도를 제공한다.In addition, the present invention provides a use of a composition comprising at least one selected from the group consisting of the protein, the CaDIMK1 gene encoding the same, and a recombinant vector containing the gene as an active ingredient to enhance plant drying stress resistance.

또한, 본 발명은 상기 단백질, 이를 암호화하는 CaDIMK1 유전자, 및 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 조성물을 식물에 투여하는 단계를 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진 방법을 제공한다.In addition, the present invention includes the step of administering to the plant a composition comprising at least one selected from the group consisting of the protein, the CaDIMK1 gene encoding the same, and a recombinant vector containing the gene as an active ingredient, the drying stress of the plant Provides a method for enhancing resistance.

본 발명은 건조 스트레스에 대한 저항성 증진 단백질을 암호화 하는 CaDIMK1 유전자를 동정하였으며, CaDIMK1 단백질은 ABA 신호전달의 양성 조절자로 기능하며 상기 단백질이 과발현된 형질전환 식물체에서 건조 스트레스 저항성 증진 효과를 확인하였는바, CaDIMK1 유전자의 발현 조절을 통해 인류가 이용할 수 있는 작물 등의 개량에 활용할 수 있으며, 특히 식물의 생산성을 향상시키는데 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.The present invention identified the CaDIMK1 gene, which encodes a protein that promotes resistance to drying stress, and the CaDIMK1 protein functions as a positive regulator of ABA signaling, and the drying stress resistance enhancement effect was confirmed in transgenic plants in which the protein was overexpressed. Bar, Through the regulation of CaDIMK1 gene expression, it can be used to improve crops that can be used by mankind, and it is expected that it will be usefully used to improve plant productivity.

도 1a는 본 발명의 일 구현예에 따른 고추 MAP3K에서 추론된 아미노산의 도메인 구조를 나타낸 도면이다.
도 1b는 본 발명의 일 구현예에 따른 고추 잎에서 ABA 처리에 따른 MAP3K 유전자들의 발현 패턴을 나타낸 도면이다.
도 2a는 본 발명의 일 구현예에 따른 CaDIMK1 단백질의 추정된 아미노산 서열을 MAP3K 단백질과 함께 비교하여 나타낸 도면이다.
도 2b는 본 발명의 일 구현예에 따른 CaDIMK1 단백질의 계통 발생 분석(phylogenetic analysis) 결과를 나타낸 도면이다.
도 2c는 본 발명의 일 구현예에 따른 고추 잎에서 ABA, NaCl, 및 H2O2 처리에 따른 CaDIMK1 유전자의 발현 패턴을 나타낸 도면이다.
도 2d는 본 발명의 일 구현예에 따른 담배(Nicotiana benthamiana) 표피 세포에서 녹색 형광 단백질(GFP)-태그된 CaDIMK1 융합 단백질의 세포 내 국소화를 확인한 도면이다.
도 2e는 본 발명의 일 구현예에 따른 GST-CaDIMK1 및 GST-CaDIMK1K32N의 시험관 내 자동 키나아제 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 3a는 본 발명의 일 구현예에 따른 CaDIMK1-침묵 고추 식물에서 CaDIMK1의 발현을 확인한 도면이다.
도 3b는 본 발명의 일 구현예에 따른 가뭄 스트레스에 의한 CaDIMK1-침묵 고추 식물의 표현형을 확인한 도면이다.
도 3c는 본 발명의 일 구현예에 따른 가뭄 스트레스에 의한 CaDIMK1-침묵 고추 식물의 생중량(fresh weight) 비율을 확인한 도면이다.
도 3d는 본 발명의 일 구현예에 따른 CaDIMK1-침묵 고추 식물의 잎 온도를 확인한 도면이다.
도 3e는 본 발명의 일 구현예에 따른 CaDIMK1-침묵 고추 식물에서의 ABA 처리에 따른 기공 크기 변화를 확인한 도면이다.
도 4a는 본 발명의 일 구현예에 따른 CaDIMK1-OX 형질전환 애기장대에서 CaDIMK1의 발현을 확인한 도면이다.
도 4b는 본 발명의 일 구현예에 따른 CaDIMK1-OX 형질전환 애기장대에서 ABA 처리에 따른 발아율(germination rate)을 확인한 도면이다.
도 4c는 본 발명의 일 구현예에 따른 CaDIMK1-OX 형질전환 애기장대에서 ABA 처리에 따른 자엽 녹색화(greening)를 확인한 도면이다.
도 4d는 본 발명의 일 구현예에 따른 CaDIMK1-OX 형질전환 애기장대에서 ABA 처리에 따른 뿌리 길이를 확인한 도면이다.
도 5a는 본 발명의 일 구현예에 따른 가뭄 스트레스에 의한 CaDIMK1-OX 형질전환 애기장대 식물의 표현형을 확인한 도면이다.
도 5b는 본 발명의 일 구현예에 따른 가뭄 스트레스에 의한 CaDIMK1-OX 형질전환 애기장대 식물의 생중량(fresh weight) 비율을 확인한 도면이다.
도 5c는 본 발명의 일 구현예에 따른 CaDIMK1-OX 형질전환 애기장대 식물의 잎 온도를 확인한 도면이다.
도 5d는 본 발명의 일 구현예에 따른 CaDIMK1-OX 형질전환 애기장대 식물에서의 ABA 처리에 따른 기공 크기 변화를 확인한 도면이다.
도 5e는 본 발명의 일 구현예에 따른 CaDIMK1-OX 형질전환 애기장대 식물에서 스트레스 관련 유전자의 발현 수준을 확인한 도면이다.Figure 1a is a diagram showing the domain structure of amino acids deduced from pepper MAP3K according to one embodiment of the present invention.
Figure 1b is a diagram showing expression patterns of MAP3K genes according to ABA treatment in pepper leaves according to an embodiment of the present invention.
Figure 2a is a diagram showing a comparison of the estimated amino acid sequence of the CaDIMK1 protein according to one embodiment of the present invention with the MAP3K protein.
Figure 2b is a diagram showing the results of phylogenetic analysis of CaDIMK1 protein according to one embodiment of the present invention.
Figure 2c is a diagram showing the CaDIMK1 gene expression pattern according to ABA, NaCl, and H 2 O 2 treatment in pepper leaves according to an embodiment of the present invention.
Figure 2d is a diagram confirming the intracellular localization of green fluorescent protein (GFP)-tagged CaDIMK1 fusion protein in tobacco ( Nicotiana benthamiana ) epidermal cells according to one embodiment of the present invention.
Figure 2e is a diagram showing the results of in vitro autokinase analysis of GST-CaDIMK1 and GST-CaDIMK1 K32N according to an embodiment of the present invention.
Figure 3a is a diagram confirming the expression of CaDIMK1 in CaDIMK1- silenced pepper plants according to one embodiment of the present invention.
Figure 3b is a diagram confirming the phenotype of CaDIMK1- silenced pepper plants by drought stress according to one embodiment of the present invention.
Figure 3c is a diagram confirming the fresh weight ratio of CaDIMK1- silenced pepper plants by drought stress according to an embodiment of the present invention.
Figure 3d is a diagram confirming the leaf temperature of CaDIMK1- silenced pepper plants according to one embodiment of the present invention.
Figure 3e is a diagram confirming the pore size change according to ABA treatment in CaDIMK1- silenced pepper plants according to an embodiment of the present invention.
Figure 4a is a diagram confirming the expression of CaDIMK1 in CaDIMK1- OX transgenic Arabidopsis thaliana according to one embodiment of the present invention.
Figure 4b is a diagram confirming the germination rate (germination rate) according to ABA treatment in CaDIMK1- OX transgenic Arabidopsis thaliana according to one embodiment of the present invention.
4c is a diagram confirming cotyledon greening according to ABA treatment in CaDIMK1- OX transgenic Arabidopsis thaliana according to one embodiment of the present invention.
Figure 4d is a diagram confirming the root length according to ABA treatment in CaDIMK1- OX transgenic Arabidopsis thaliana according to one embodiment of the present invention.
Figure 5a is a view confirming the phenotype of CaDIMK1- OX transgenic Arabidopsis plants by drought stress according to one embodiment of the present invention.
Figure 5b is a view confirming the fresh weight (fresh weight) ratio of CaDIMK1- OX transgenic Arabidopsis thaliana plants by drought stress according to one embodiment of the present invention.
Figure 5c is a diagram confirming the leaf temperature of CaDIMK1- OX transgenic Arabidopsis plants according to one embodiment of the present invention.
Figure 5d is a view confirming the change in pore size according to ABA treatment in CaDIMK1- OX transgenic Arabidopsis thaliana plants according to one embodiment of the present invention.
Figure 5e is a diagram confirming the expression level of stress-related genes in CaDIMK1- OX transgenic Arabidopsis thaliana plants according to one embodiment of the present invention.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 건조 스트레스 저항성 CaDIMK1(Capsicum annuum drought-induced MAP kinase 1) 단백질을 제공한다.The present invention provides a drying stress resistant CaDIMK1 ( Capsicum annuum drought-induced MAP kinase 1) protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

본 발명의 유전자인 CaDIMK1은 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열로 이루어져 있으며, 상기 CaDIMK1 유전자에 의해 암호화되는 펩타이드는 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. CaDIMK1 , the gene of the present invention, preferably consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and the peptide encoded by the CaDIMK1 gene may preferably consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.

본 발명에 있어서, 상기 CaDIMK1 유전자는 고추로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the CaDIMK1 gene may be isolated from pepper, but is not limited thereto.

본 발명에 있어서 "양성 조절인자(positive regulator) 단백질"이란 생명현상 조절에서 증가방향으로 작용하는 단백질을 의미한다. 즉, 본 발명의 유전자인 CaDIMK1이 과발현되는 경우, ABA 민감도 증가, 및 건조 스트레스에 대한 저항성이 증가될 수 있다.In the present invention, "positive regulator protein" means a protein that acts in an increasing direction in regulating life phenomena. That is, when the CaDIMK1 gene of the present invention is overexpressed, ABA sensitivity may be increased and resistance to drying stress may be increased.

본 발명에 있어서, “키나아제(kinase)”란 단백질 잔기에 인산기의 첨가를 촉진하는 어떠한 효소를 뜻하며, 예를들면, 세린과 트레오닌 키나아제는 세린과 트레오닌 잔기에 인산기의 첨가를 촉진한다.In the present invention, "kinase" means any enzyme that catalyzes the addition of a phosphate group to a protein residue, for example, serine and threonine kinase catalyzes the addition of a phosphate group to serine and threonine residues.

본 발명자들은 건조 스트레스 반응에 관여하는 유전자에 대해 연구하던 중, 단백질 인산화효소(kinase)인 CaDIMK1(Capsicum annuum drought-induced MAP kinase 1)을 동정하였고, 앱시스산(ABA)의 민감도가 증가할수록 기공폐쇄를 촉진하여, 건조 저항성을 증진시킬 수 있다는 사실에 기반하여, 앱시스산 또는 건조 스트레스와 CaDIMK1 유전자간의 연관성을 규명하고자 하였다.While studying genes involved in the dry stress response, the present inventors identified CaDIMK1 ( Capsicum annuum drought-induced MAP kinase 1), a protein kinase, and as the sensitivity of abscisic acid (ABA) increases, stomatal closure Based on the fact that it can promote drying resistance, it was attempted to identify the association between abscisic acid or drying stress and the CaDIMK1 gene.

본 발명의 일 실험예에서는, 고추 식물에 ABA, 고염도(NaCl), 및 H2O2 처리하였을 때 CaDIMK1의 발현이 증가하여 CaDIMK1이 ABA 신호 및 비생물적 스트레스 반응에서 작동할 수 있음을 확인하였고, CaDIMK1 단백질이 핵과 세포질에서 발현되는 것을 GFP 형광을 통해 확인하였으며, CaDIMK1이 키나아제 활성을 갖는 것을 확인하였다(실험예 2-2 참조).In one experimental example of the present invention, when ABA, high salinity (NaCl), and H 2 O 2 were treated with pepper plants, the expression of CaDIMK1 increased, confirming that CaDIMK1 can operate in ABA signals and abiotic stress responses. It was confirmed through GFP fluorescence that CaDIMK1 protein was expressed in the nucleus and cytoplasm, and it was confirmed that CaDIMK1 has kinase activity (see Experimental Example 2-2).

본 발명의 다른 실험예에서는, CaDIMK1-침묵 고추(TRV:CaDIMK1)에서 CaDIMK1의 발현 수준, 건조 스트레스 후의 표현형, 생존율, 잎 온도, 잎의 생중량 비율 확인을 통한 수분 보유 능력, 기공 크기 확인을 통한 기공 폐쇄 작용 등을 확인함으로써 CaDIMK1 유전자 침묵 식물에서 건조 스트레스 저항성이 감소되는 것을 확인하였다(실험예 3 참조).In another experimental example of the present invention, the expression level of CaDIMK1 in CaDIMK1- silenced pepper (TRV: CaDIMK1 ), phenotype after drying stress, survival rate, leaf temperature, water holding capacity through confirmation of fresh weight ratio of leaves, through confirmation of pore size It was confirmed that drying stress resistance was reduced in CaDIMK1 gene silenced plants by confirming stomatal closure, etc. (see Experimental Example 3).

본 발명의 또 다른 실험예에서는, CaDIMK1을 과발현하는 형질전환 애기장대 식물체를 제작하여 ABA를 처리한 조건에서 야생형 식물체와 CaDIMK1 과발현 식물체의 발아율, 자엽 녹색화, 뿌리 길이 측정을 통해 CaDIMK1이 식물체의 건조 스트레스 저항성을 증진시키는 양성 조절자로 작용함을 확인하였으며(실험예 4 참조), 실제로 애기장대 식물에서 CaDIMK1 유전자 과발현시 ABA 과민성에 의해 건조 저항성이 증가됨을 건조 스트레스 후의 표현형, 생존율, 잎 온도, 잎의 생중량 비율, 기공 개도 등의 측정을 통해 확인하였다(실험예 5 참조).In another experimental example of the present invention, a transgenic Arabidopsis thaliana plant overexpressing CaDIMK1 was prepared, and the germination rate, cotyledon greening, and root length of wild-type plants and CaDIMK1 overexpressing plants under ABA-treated conditions were measured. It was confirmed that it acts as a positive regulator that enhances resistance (see Experimental Example 4), and in fact, when CaDIMK1 gene is overexpressed in Arabidopsis plants, drying resistance is increased by ABA hypersensitivity. Phenotype, survival rate, leaf temperature, leaf growth after drying stress It was confirmed through measurement of weight ratio, pore opening degree, etc. (see Experimental Example 5).

본 발명의 다른 양태로서, 상기 CaDIMK1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.As another aspect of the present invention, a recombinant vector containing the CaDIMK1 gene is provided.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.The term “recombinant” refers to a cell that replicates, expresses a heterologous nucleic acid, or expresses a peptide, a protein encoded by a heterologous peptide, or a heterologous nucleic acid. Recombinant cells can express genes or gene segments not found in the cell's native form, either in sense or antisense form. A recombinant cell may also express a gene found in the cell in its natural state, but the gene has been reintroduced into the cell by artificial means as a modified one.

용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.The term “recombinant expression vector” refers to a bacterial plasmid, phage, yeast plasmid, plant cell virus, mammalian cell virus, or other vector. In general, any plasmid and vector may be used provided that it is capable of replicating and stabilizing in the host. An important characteristic of the expression vector is that it has an origin of replication, a promoter, a marker gene and a translation control element.

상기 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.An expression vector comprising the gene sequence and suitable transcriptional/translational control signals can be constructed by methods well known to those skilled in the art. The method includes in vitro recombinant DNA technology, DNA synthesis technology, in vivo recombinant technology, and the like. The DNA sequence can be effectively linked to a suitable promoter in an expression vector to direct mRNA synthesis. In addition, the expression vector may include a ribosome binding site and a transcription terminator as a translation initiation site.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.A preferred example of the recombinant vector of the present invention is the Ti-plasmid vector, which is capable of transferring a part of itself, the so-called T-region, into plant cells when present in a suitable host such as Agrobacterium tumefaciens. Another type of Ti-plasmid vector (see EP 0 116 718 B1) is currently used to transfer hybrid DNA sequences into plant cells, or protoplasts, from which new plants can be produced that properly integrate the hybrid DNA into the plant's genome. there is. A particularly preferred form of the Ti-plasmid vector is the so-called binary vector as claimed in EP 0 120 516 B1 and US Pat. No. 4,940,838. Other suitable vectors that can be used to introduce DNA according to the present invention into plant hosts include viral vectors, such as those that can be derived from double-stranded plant viruses (eg, CaMV) and single-stranded viruses, gemini viruses, and the like. For example, it may be selected from incomplete plant viral vectors. The use of such vectors can be particularly advantageous when properly transforming a plant host is difficult.

발현 벡터는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.Expression vectors may contain one or more selectable markers. The marker is a nucleic acid sequence having a characteristic that can be selected by a conventional chemical method, and includes all genes capable of distinguishing transformed cells from non-transformed cells. Examples include herbicide resistance genes such as glyphosate or phosphinothricin, antibiotics such as kanamycin, G418, bleomycin, hygromycin, and chloramphenicol. There is a resistance gene, but is not limited thereto.

본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "지속적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화 하에서 활성이 있는 프로모터이다.In the recombinant vector of the present invention, the promoter may be a CaMV 35S, actin, ubiquitin, pEMU, MAS or histone promoter, but is not limited thereto. The term "promoter" refers to a region of DNA upstream from a structural gene and refers to a DNA molecule to which RNA polymerase binds to initiate transcription. A "plant promoter" is a promoter capable of initiating transcription in a plant cell. A "constitutive promoter" is a promoter that is active under most environmental conditions and states of development or cell differentiation.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. In the recombinant vector of the present invention, it is possible to use a conventional terminator, for example, nopaline synthase (NOS), rice α-amylase RAmy1 A terminator, phaseoline terminator, Agrobacterium tumefaciens ) of octopine (Octopine) gene terminator, etc., but is not limited thereto. Regarding the need for terminators, it is generally known that such regions increase the certainty and efficiency of transcription in plant cells.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및 (또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다.Plant transformation refers to any method of transferring DNA into a plant. Such transformation methods need not necessarily have a period of regeneration and/or tissue culture. Transformation of plant species is now common for plant species including dicotyledonous as well as monocotyledonous plants. In principle, any transformation method can be used to introduce the hybrid DNA according to the present invention into suitable progenitor cells. Methods include the calcium/polyethylene glycol method for protoplasts (Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), protoplasts of electroporation (Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), microinjection into plant elements (Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185 ), particle bombardment of various plant elements (DNA or RNA-coated) (Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), Agrobacterium tumefacies by infiltration of plants or transformation of mature pollen or microspores infection by a (incomplete) virus in ens-mediated gene transfer (EP 0 301 316) and the like. Preferred methods according to the present invention include Agrobacterium mediated DNA delivery.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 재조합 식물 발현 벡터이다. In the present invention, the recombinant vector is a recombinant plant expression vector.

본 발명의 다른 양태로서, 상기 재조합 벡터로 형질 전환된 식물을 제공한다.As another aspect of the present invention, a plant transformed with the recombinant vector is provided.

본 발명의 다른 양태로서, CaDIMK1 단백질, 이를 암호화하는 CaDIMK1 유전자, 및 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공한다.As another aspect of the present invention, there is provided a composition for enhancing drying stress resistance of a plant comprising at least one selected from the group consisting of a CaDIMK1 protein, a CaDIMK1 gene encoding the same, and a recombinant vector containing the gene as an active ingredient.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진 방법을 제공한다. As another aspect of the present invention, the present invention provides a method for enhancing dry stress resistance of plants, comprising the following steps.

(a) CaDIMK1(Capsicum annuum drought-induced MAP kinase 1) 단백질을 암호화하는 유전자를 식물체에 형질전환 하는 단계; 및(a) CaDIMK1 ( Capsicum annuum drought-induced MAP kinase 1) transforming a gene encoding a protein into a plant; and

(b) 상기 형질전환된 식물체에서 CaDIMK1 단백질을 과발현시키는 단계.(b) overexpressing the CaDIMK1 protein in the transformed plant.

본 발명의 또 다른 양태로서, 상기 방법에 의해 건조 스트레스 저항성이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.As another aspect of the present invention, a transgenic plant with improved drying stress resistance is provided by the above method.

본 발명에서 상기 식물(체)는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료 물류 등일 수 있으며, 가장 바람직하게는 애기장대 또는 고추이나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the plant (sieve) is a food crop including rice, wheat, barley, corn, soybean, potato, red bean, oat, and sorghum; vegetable crops including Arabidopsis, Chinese cabbage, radish, red pepper, strawberry, tomato, watermelon, cucumber, cabbage, melon, pumpkin, green onion, onion, and carrot; Specialty crops including ginseng, tobacco, cotton, sesame, sugar cane, sugar beet, perilla, peanut, and rapeseed; fruit trees including apple trees, pear trees, jujube trees, peaches, kiwi trees, grapes, tangerines, persimmons, plums, apricots, and bananas; flowers including roses, gladioluses, gerberas, carnations, chrysanthemums, lilies and tulips; and feed distribution including ryegrass, red clover, orchard grass, alfalfa, tall fescue, and perennial ryegrass, most preferably Arabidopsis or red pepper, but is not limited thereto.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, a preferred embodiment is presented to aid understanding of the present invention. However, the following examples are provided to more easily understand the present invention, and the content of the present invention is not limited by the following examples.

[실시예][Example]

실시예 1. 식물 재료 및 성장 조건Example 1. Plant materials and growth conditions

애기장대(Arabidopsis thaliana: ecotype Col-0)의 종자는 4℃에서 2일 동안 춘화처리(vernalization) 후, 수크로스(sucrose)(Biopure, Cambridge, MA, USA) 1% 및 마이크로 한천(micro agar)(Duchefa biochemie) 8%가 포함된 MS 배지(Murashige and Skoog medium, Duchefa biochemie, Haarlem, The Netherlands)에서 발아시켰다. 고추(Capsicum annuum L. cv. NocKwang) 종자는 29℃의 어두운 곳에서 5일간 발아시켰다. 담배(Nicotiana benthamiana) 종자, 애기장대 및 고추 묘목은 증기 소독된 배합토[피트모스(peat moss):펄라이트(perlite):질석(vermiculite)=5:3:2, v/v/v], 사토(sand), 및 양토(loam soil) 1:1:1(v/v/v)에서, 24℃, 상대 습도 60% 조건의 백색 형광(130 μmol photons m-2S-1)하에서 성장시켰다.Seeds of Arabidopsis thaliana (ecotype Col-0) were treated with vernalization at 4 ° C for 2 days, then sucrose (Biopure, Cambridge, MA, USA) 1% and micro agar (Duchefa biochemie) MS medium (Murashige and Skoog medium, Duchefa biochemie, Haarlem, The Netherlands) containing 8%. Red pepper ( Capsicum annuum L. cv. NocKwang) seeds were germinated in a dark place at 29°C for 5 days. Tobacco ( Nicotiana benthamiana ) seeds, Arabidopsis thaliana and pepper seedlings were mixed with steam sterilized soil [peat moss: perlite: vermiculite = 5:3:2, v / v / v], sand ), and loam soil 1: 1: 1 (v / v / v), grown under white fluorescence (130 μmol photons m-2S-1) at 24 ° C. and 60% relative humidity.

실시예 2. CaDIMK1 유전자가 과발현된 형질전환 애기장대 제조Example 2. Preparation of transgenic Arabidopsis thaliana overexpressing the CaDIMK1 gene

CaDIMK1 및 CaDIMK1 K32N이 과발현된 형질전환 애기장대 식물을 생산하기 위해, CaDIMK1 및 CaDIMK1 K32N의 cDNA 전장 서열을 pENTR/D-TOPO 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 클로닝하였다. Pro35S:CaDIMK1-GFP 및 CaDIMK1 K32N-GFP 구조체는 LR 반응에 의해 생성되었다. 꽃가루 딥 방법(floral dip method)을 통하여 아그로박테리움 매개 형질전환을 사용하였다. 형질전환된 애기장대를 선택하기 위해, 종자를 25 μg·ml-1 포스피노트리신(phosphinothricin)을 함유하는 MS 고체 배지에서 성장시켰다.To produce transgenic Arabidopsis plants overexpressing CaDIMK1 and CaDIMK1 K32N , the full-length cDNA sequences of CaDIMK1 and CaDIMK1 K32N were cloned into the pENTR/D-TOPO vector (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Pro35S: CaDIMK1 -GFP and CaDIMK1 K32N -GFP constructs were generated by LR reaction. Agrobacterium-mediated transformation was used through the floral dip method. To select transformed Arabidopsis thaliana, seeds were grown on MS solid medium containing 25 μg·ml −1 phosphinothricin.

실시예 3. Virus-induced gene silencing (VIGS)Example 3. Virus-induced gene silencing (VIGS)

CaDIMK1의 기능 상실 분석(loss-of function analysis)을 위해, 고추 식물에서 바이러스 유도 유전자 침묵(virus-induced gene silencing: VIGS)이 수행 되었다. 간략하게 음성대조군으로서 pTRV2:CaDIMK1 또는 pTRV2:00을 운반하는 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens) 균주 GV3101을 고추의 완전히 자란 자엽(fully expanded cotyledons)에 침투시켰다(각 균주별 OD600=0.2). 식물체들은 생장 및 바이러스가 증식할 수 있도록 16시간 낮/8시간 밤으로 광주기를 설정한 24℃의 생육실에 두었다.For CaDIMK1 loss-of-function analysis, virus-induced gene silencing (VIGS) was performed in pepper plants. Briefly, as a negative control, Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 carrying pTRV2: CaDIMK1 or pTRV2:00 was infiltrated into fully expanded cotyledons of pepper (OD600=0.2 for each strain). The plants were placed in a growth chamber at 24°C with a photoperiod of 16 hours day/8 hours night to allow growth and virus propagation.

실시예 4. ABA, 건조 스트레스, NaCl, HExample 4. ABA, drying stress, NaCl, H 22 OO 22 처리 process

고추 식물에서 CaDIMK1 발현 수준을 관찰하기 위하여, 탈수를 위해 1차 잎을 떼어내고, 6엽 단계(six-leaf stage)의 고추 식물에 ABA 100 μM, NaCl 200 mM 및 H2O2 100 mM을 처리하였다. 잎은 각각 0, 6, 12 및 24시간 처리 후에 수확되었다. 스트레스 관련 유전자의 발현 패턴을 확인하기 위해, 3주령의 Col-0 및 CaDIMK1 과발현 애기장대 식물을 뿌리로부터 분리하고, 분리 후 0 및 4시간에 잎을 수확하였다.To observe the CaDIMK1 expression level in pepper plants, the primary leaves were removed for dehydration, and ABA 100 μM, NaCl 200 mM, and H 2 O 2 100 mM were treated on six-leaf stage pepper plants. did Leaves were harvested after 0, 6, 12 and 24 hours of treatment, respectively. To confirm the expression pattern of stress-related genes, 3-week-old Col-0 and CaDIMK1 overexpressing Arabidopsis thaliana plants were separated from the roots, and the leaves were harvested at 0 and 4 hours after separation.

실시예 5. RNA 추출, 실시간 역전사 중합 효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 및 역전사 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR)Example 5. RNA extraction, real-time reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)

총 RNA는 고추 및 애기장대 잎으로부터 추출하였다. 모든 시료는 TRI-Reagent®-RNA/DNA/Protein 시약(Molecular Research Center, USA)을 처리하여 DNA와 단백질을 제거한 후, 2-propanol을 처리하여 RNA를 침전시켰다. 주형을 위한 1 μg 총 RNA는 Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader를 사용하여 정량화 되었다. cDNA는 iScript™ cDNA synthesis kit(Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 및 Transcriptor first strand cDNA synthesis kit(Roche)을 사용하여 합성하였다. qRT-PCR 분석을 위해, 상기 방법으로 합성한 cDNA를 iQ™SYBR Green Supermix(Bio-Rad) 및 하기 표 1에 기재한 특이적 프라이머와 함께 FX96 Touch™ Real-Time PCR detection system (Bio-Rad)을 이용하여 증폭시켰다. 고추 Actin1(CaACT1) 및 애기장대 Actin8(AtACT8) 유전자를 표준화를 위한 대조군으로 사용하여 각 유전자의 상대적 발현 수준(△△CT)을 표준화하였다. Total RNA was extracted from pepper and Arabidopsis leaves. All samples were treated with TRI-Reagent ® -RNA/DNA/Protein reagent (Molecular Research Center, USA) to remove DNA and proteins, and then treated with 2-propanol to precipitate RNA. 1 μg total RNA for the template was quantified using a Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader. cDNA was synthesized using iScript™ cDNA synthesis kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) and Transcriptor first strand cDNA synthesis kit (Roche). For qRT-PCR analysis, the cDNA synthesized by the above method was mixed with the iQ™SYBR Green Supermix (Bio-Rad) and the specific primers listed in Table 1 below using the FX96 Touch™ Real-Time PCR detection system (Bio-Rad) was amplified using Pepper Actin1 (CaACT1) and Arabidopsis Actin8 (AtACT8) genes were used as controls for normalization, and the relative expression level (ΔΔCT) of each gene was normalized.

RT-PCR 분석을 위해, 상기 방법으로 합성한 cDNA를 Takara Taq polymerase를 이용하여 증폭시켰으며, 고추 Actin1(CaACT1) 및 애기장대 Actin8(AtACT8) 유전자를 정량표준화를 이용하여 사용하였다.For RT-PCR analysis, cDNA synthesized by the above method was amplified using Takara Taq polymerase, and pepper Actin1 (CaACT1) and Arabidopsis Actin8 (AtACT8) genes were used for quantitative standardization.

UsageUsage NameName Primer sequences (5’-3’)Primer sequences (5’-3’) 서열번호sequence number For cloningFor cloning CaDIMK1CaDIMK1 ForwardForward ATGGATTGGACTAGAGGCCAATGGATTGGACTAGAGGCCA 33 ReverseReverse TTATTCACTACTACTTCTAACTGTGATTTATTCACTACTACTTCTAACTGTGAT 44 VIGS(TRV:CaDIMK1)VIGS(TRV:CaDIMK1) ForwardForward ATGGATTGGACTAGAGGCCAATGGATTGGACTAGAGGCCA 55 ReverseReverse TTATTCACTACTACTTCTAACTGTGATTTATTCACTACTACTTCTAACTGTGAT 66 CaDIMK1K32N CaDIMK1 K32N ForwardForward CTTGGATAGCTCAACTGAGTTGACAGCAAAAACCTCATCCTTGGATAGCTCAACTGAGTTGACAGCAAAAACCTCATC 77 ReverseReverse GATGAGGTTTTTGCTGTCAACTCAGTTGAGCTATCCAAGGATGAGGTTTTTGCTGTCAACTCAGTTGAGCTATCCAAG 88 OST1OST1 ForwardForward CCAAAGCATAGAAGAAATTATGCAGCCAAAGCATAGAAGAAATTATGCAG 99 ReverseReverse TTTTGTTTGACATTTTTGTAGCAGATTTTGTTTGACATTTTTGTAGCAGA 1010 For RT-PCRFor RT-PCR CaDIMK1CaDIMK1 ForwardForward ATTCAGAAACTATGGATCATTATTCAATATTCAGAAACTATGGATCATTATTCAAT 1111 ReverseReverse TGTATAGTACAAAATTTACAGCAACGTGTGTATAGTACAAAATTTACAGCAACGTG 1212 CaACT1CaACT1 ForwardForward GACGTGACCTAACTGATAACCTGATGACGTGACCTAACTGATAACCTGAT 1313 ReverseReverse CTCTCAGCA CCAATGGTAATAACTTCTCTCAGCA CCAATGGTAATAACTT 1414 RAB18RAB18 ForwardForward GGAAGAAGGGAATAACACAAAAGATGGAAGAAGGGAATAACACAAAAAGAT 1515 ReverseReverse GCGTTACAAACCCTCATTATTTTTAGCGTTACAAACCCTCATTATTTTTA 1616 RD29BRD29B ForwardForward GTTGAAGAGTCTCCACAATCACTTGGTTGAAGAGTCTCCACAATCACTTG 1717 ReverseReverse ATACAAATCCCCAAACTGAATAACAATACAAATCCCCAAACTGAATAACA 1818 DREB2ADREB2A ForwardForward CTACAAAGCCTCAACTACGGAATACCTACAAAGCCTCAACTACGGAATAC 1919 ReverseReverse AAACTCGGATAGAGAATCAACAGTCAAACTCGGATAGAGAATCAACAGTC 2020 AHG1AHG1 ForwardForward TCATTGATCTCAAGAATAGCTCTCATCATTGATTCTCAAGAATAGCTCTCA 2121 ReverseReverse TAAATAACCTTGTAGCCCATATCCATAAATAACCTTGTAGCCCATATCCA 2222 PP2CAPP2CA ForwardForward ACTTGAGGAAGAGGAGGAATAATCAACTTGAGGAAGAGGAGGAATAATCA 2323 ReverseReverse CCAGCCTGAATTAAGAGCTAACTAACCAGCCTGAATTAAGAGCTAACTAA 2424 HAB1HAB1 ForwardForward GACTACCTCTCAATGCTTGCTCTACGACTACCTCTCAATGCTTGCTCTAC 2525 ReverseReverse AAAAACCTGTCGAAATTAGATCCTTAAAAACCTGTCGAAATTAGATCCTT 2626 AtActin8AtActin8 ForwardForward CAACTATGTTCTCAGGTATTGCAGACAACTATGTTCTCAGGTATTGCAGA 2727 ReverseReverse GTCATGGAAACGATGTCTCTTTAGTGTCATGGAAACGATGTCTCTTTAGT 2828 CA07g11510CA07g11510 ForwardForward TCAGTAGAGGAATCAGAAACAATGGATTCAGTAGAGGAATCAGAAACAATGGAT 2929 ReverseReverse AGACGTCATCGATCGATGTATTCACTAGACGTCATCGATCGATGTATTCACT 3030 CA07g11530CA07g11530 ForwardForward AAGATATATGGAATTCAGTAGAGGAATCAAGATATATGGAATTCAGTAGAGGAATC 3131 ReverseReverse ATTAGCTACTTATTGACTGATGGTGCTATTAGCTACTTATTGACTGATGGTGCT 3232 CA07g11550CA07g11550 ForwardForward AGATGGGCGGCTAAACAACTCAGATGGGCGGCTAAACAACTC 3333 ReverseReverse TCTTCTAACAGTAACCCATCGATGATTCTTCTAACAGTAACCCATCGATGAT 3434 CA07g11570CA07g11570 ForwardForward AAGAATCAGACACCATTGATCCTACAAAAGAATCAGACACCATTGATCCTACAA 3535 ReverseReverse ATAAGTCAAATGCCTCGGAAAATCATAAGTCAAATGCCTCGGAAAATC 3636 CA02g14340CA02g14340 ForwardForward CATCCCTTTGTTGCTGATCAAGATCATCCCTTTGTTGCTGATCAAGAT 3737 ReverseReverse ATTCAGAATCAGGTCTACATTCACCCATTCAGAATCAGGTCTACATTCACCC 3838 CA02g14350CA02g14350 ForwardForward GCTACTAAAACATGAATTTGTTGCTGGCTACTAAAACATGAATTTGTTGCTG 3939 ReverseReverse CTGGTCTGTTTTCATCACCCACTAACTGGTCTGTTTTCATCACCCACTAA 4040 CA02g14360CA02g14360 ForwardForward CATGCTACAGTAACACCCCTTCAATACATGCTACAGTAACACCCCTTCAATA 4141 ReverseReverse TCACCGAATGCTGACCCAATCATTCACCGAATGCTGACCCAATCAT 4242

실시예 6. 세포 내 국소화(Subcellular localization)Example 6. Subcellular localization

세포 내 국소화를 위해, 균주 p19와 함께 녹색 형광 단백질(GFP)-CaDIMK1의 구조를 운반하는 아그로박테리움(A. tumefaciens) 균주 GV3101을 사용하였다(각 균주; OD600=0.5, 1:1 비율). 아그로침투법(agroinfiltration) 2일 후, 공초점 현미경(510 UV/Vis Meta; Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 GFP 신호를 관찰하였다.For intracellular localization, A. tumefaciens strain GV3101 carrying the construct of green fluorescent protein (GFP) -CaDIMK1 together with strain p19 was used (each strain; OD600=0.5, 1:1 ratio). After 2 days of agroinfiltration, GFP signals were observed with a confocal microscope (510 UV/Vis Meta; Zeiss, Oberkochen, Germany).

실시예 7. 시험관 내(In vitro) 키나아제 분석Example 7. In vitro kinase assay

CaDIMK1의 키나아제 활성을 조사하기 위해, 1 mM CaCl2, 2.5 mM MgCl2, 2.5 mM MnCl2, 20 mM Tris-HCl(pH 7.5), 1 mM DTT 및 7.5 Ci [γ-32P]-ATP가 포함된 단백질 혼합물에 대해 총 용량 40 μl를 30℃에서 반응시켰다. 3시간 동안 배양한 후, 10μl의 5x SDS 샘플 버퍼와 함께 97℃에서 끓여 반응을 중단하고, 혼합물은 10% SDS-PAGE 겔로 분리하였다. 겔 건조기(Bio-Rad)를 사용하여 분리된 겔을 건조하고, Personal Molecular Imager(Bio-Rad)를 사용하여 32P 방사선 사진을 도출하였다. GST-OST1은 양성 대조군으로 사용되었다.To investigate the kinase activity of CaDIMK1 , 1 mM CaCl 2 , 2.5 mM MgCl 2 , 2.5 mM MnCl 2 , 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM DTT and 7.5 Ci [γ- 32 P]-ATP were included. A total volume of 40 μl was reacted at 30 °C for the protein mixture. After incubation for 3 hours, the reaction was stopped by boiling at 97° C. with 10 μl of 5x SDS sample buffer, and the mixture was separated by a 10% SDS-PAGE gel. The separated gel was dried using a gel dryer (Bio-Rad), and a 32 P radiograph was obtained using a Personal Molecular Imager (Bio-Rad). GST-OST1 was used as a positive control.

실시예 8. 식물 표현형 분석Example 8. Plant phenotype analysis

가뭄 스트레스 분석을 위해, 3주령의 4엽 단계(four-leaf-stage) 고추와 애기장대를 사용하였으며, 고추에서 13일 및 애기장대 16일 동안 물주기를 중단한 후, 다시 1일 및 2일 동안 물을 주고, 재수화 된 잎(rehydrated leaves)을 가진 식물의 수를 세어 생존율을 계산하였다. 수분손실을 측정하기 위해, 1차 잎과 2차 잎을 분리하여 플라스틱 계량 접시에 넣었다. 잎은 상대습도가 40%인 좋은 온도 조건에서 보관되었다. 그 후, 1 시간을 기준으로 0 내지 10시간에 생중량(fresh weight)의 손실을 측정하였다.For the drought stress analysis, 3-week-old four-leaf-stage peppers and Arabidopsis thaliana were used. After stopping watering for 13 days in peppers and 16 days in Arabidopsis thaliana, again on the 1st and 2nd days. During watering, the survival rate was calculated by counting the number of plants with rehydrated leaves. To measure water loss, primary and secondary leaves were separated and placed in a plastic weighing dish. The leaves were stored under favorable temperature conditions with a relative humidity of 40%. Then, the loss of fresh weight was measured from 0 to 10 hours based on 1 hour.

잎의 온도를 측정하기 위해, 50 μM 및 100 μM ABA를 고추와 애기장대에 뿌렸다. 열 영상은 infrared camera(FLIR systems; T420)을 이용하여 얻었으며, 식물의 잎 온도는 FLIR Tools+ ver 5.13 software를 이용해 측정하였다.To measure the leaf temperature, 50 μM and 100 μM ABA were sprayed on pepper and Arabidopsis thaliana. Thermal images were obtained using an infrared camera (FLIR systems; T420), and plant leaf temperature was measured using FLIR Tools+ ver 5.13 software.

기공개도(stomata apertures)의 측정을 위해 고추와 애기장대 잎의 축상 표피를 분리하고, 24℃에서 2.5시간 동안 기공 개구 용액(stomatal opening solution, SOS; 50 mM KCl, 10 mM MES-KOH, 10 mM CaCl2, pH 6.15) 위에 띄웠다. 기공 개구된 표피는 24℃에서 2.5시간 동안 ABA(10 및 20 μM)가 없거나 또는 포함된 SOS로 옮겨졌다. 기공은 임의로 선택되어 Nikon Eclipse 80i 현미경으로 사진을 찍었다. For measurement of stomata apertures, the axial epidermis of pepper and Arabidopsis leaves were separated and incubated in stomatal opening solution (SOS; 50 mM KCl, 10 mM MES-KOH, 10 mM) for 2.5 hours at 24°C. mM CaCl 2 , pH 6.15). The pore-opened epidermis was transferred to SOS without or with ABA (10 and 20 μM) for 2.5 h at 24°C. Stomata were randomly selected and photographed with a Nikon Eclipse 80i microscope.

실시예 9. 발아 및 묘목 성장 확인 Example 9. Confirmation of germination and seedling growth

다양한 농도의 ABA가 보충된 0.5X Murashige 및 Skoog(MS) 배지에서 CaDIMK1-OX 형질전환 애기장대 및 야생형 식물의 발아율을 측정하였으며, 종자 분주 후 7일 동안 기근이 나오는 종자의 수를 세어 측정하였다. The germination rates of CaDIMK1 -OX transgenic Arabidopsis and wild-type plants were measured in 0.5X Murashige and Skoog (MS) medium supplemented with various concentrations of ABA, and the number of seeds that were famined for 7 days after seeding was measured.

다양한 농도의 ABA가 보충된 0.5X MS 배지에서 CaDIMK1-OX 및 야생형 식물의 묘목 성장 단계를 종자 분주 후 5 일째에 대표 사진을 촬영하여 확인하였으며, 형질전환 및 야생형 식물에서 녹색화(greening)된 자엽의 정량화를 수행하였다.Seedling growth stages of CaDIMK1 -OX and wild-type plants in 0.5X MS medium supplemented with various concentrations of ABA were confirmed by taking representative pictures 5 days after seeding, and the greening of cotyledons in transgenic and wild-type plants. Quantification was performed.

뿌리 길이는 0.0, 0.5 및 0.75 μM ABA를 포함하는 0.5X MS 배지에서 CaDIMK1-OX 애기장대 및 야생형 식물의 1 차 뿌리 길이를 확인하였으며, 분주 후 7 일째에 대표 사진을 촬영하고 이를 정량화하였다.The root length was confirmed by the primary root length of CaDIMK1 -OX Arabidopsis thaliana and wild-type plants in 0.5X MS medium containing 0.0, 0.5 and 0.75 μM ABA, and representative pictures were taken on day 7 after division and quantified.

실시예 10. 통계적 분석Example 10. Statistical Analysis

통계적 분석은 유전형 사이의 유의한 차이를 결정하기 위해서 student's t-test를 이용하여 수행되었다. 데이터는 3회의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 오차를 나타내며, P value가 0.05 이하일 때 유의한 수준의 차이로 판단하였다(*P<0.05, ***P<0.001).Statistical analysis was performed using student's t-test to determine significant differences between genotypes. Data represent the mean ± standard error of 3 independent experiments, and a P value of 0.05 or less was considered a significant difference (* P < 0.05, *** P < 0.001).

[실험예][Experimental Example]

실험예 1. 가뭄 스트레스 유도된 고추 MAP3K 유전자 분석Experimental Example 1. Analysis of drought stress-induced pepper MAP3K gene

가뭄 스트레스로 인해 유도된 고추 MAP(Mitogen Activated Protein) 키나아제 키나아제 키나아제(MAP3K)에서 추론된 아미노산의 도메인 구조를 도 1a에 나타내었다. 보존된 도메인은 SMART 웹사이트(http://smart.embl-heidelberg.de/)를 사용하여 검출되었다. The amino acid domain structure deduced from pepper mitogen activated protein (MAP) kinase kinase kinase (MAP3K) induced by drought stress is shown in FIG. 1A. Conserved domains were detected using the SMART website (http://smart.embl-heidelberg.de/).

또한, ABA 처리에 대한 반응으로 고추 잎에서 MAP3K 유전자들의 발현 패턴을 확인한 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이 CaDIMK1 유전자의 발현이 유의적으로 높은 것을 확인하였다. In addition, as a result of confirming the expression pattern of MAP3K genes in pepper leaves in response to ABA treatment, it was confirmed that CaDIMK1 gene expression was significantly high, as shown in FIG. 1B.

이 때, 고추 Actin1(CaACT1) 유전자가 내부 대조군으로 사용되고, 0 시간에 각 유전자의 발현 수준은 1.0으로 설정되었다. At this time, the pepper Actin1 ( CaACT1 ) gene was used as an internal control, and the expression level of each gene at 0 h was set to 1.0.

실험예 2. CaDIMK1 단백질의 서열 분석, 계통 발생 분석 및 분자 특성Experimental Example 2. Sequence Analysis, Phylogenetic Analysis and Molecular Characteristics of CaDIMK1 Protein

2-1. CaDIMK1 단백질의 서열 분석 및 계통 발생 분석2-1. Sequence analysis and phylogenetic analysis of CaDIMK1 protein

Solanum tuberosum(accession no. XP_006364160.1), Nicotiana attenuata(accession no. XP_019249654.1), Solanum pennellii(accession no. XP_015081664.1), Nicotiana tometosiformis(accession no. XP_009607835.1) 및 Arabidopsis thaliana(accession no. NP_200320.1)의 MAP3K 단백질과 함께 CaDIMK1 단백질의 추정된 아미노산 서열을 비교하여 도 2a에 나타내었다. 이 때 동일한 아미노산 잔기를 검은색으로 하이라이트 표시하였으며, 빨간색 박스는 세린/트레오닌 단백질 키나아제(S_TKc) 도메인을 나타낸다. Solanum tuberosum (accession no. XP_006364160.1), Nicotiana attenuata (accession no. XP_019249654.1), Solanum pennellii (accession no. XP_015081664.1), Nicotiana tometosiformis (accession no. XP_009607835.1) and Arabidopsis thaliana (accession no. NP_200320.1) and the estimated amino acid sequence of the CaDIMK1 protein together with the MAP3K protein are shown in FIG. 2a. At this time, the same amino acid residue is highlighted in black, and the red box represents the serine/threonine protein kinase (S_TKc) domain.

도 2a에 나타낸 바와 같이 CaDIMK1의 cDNA는 분자량 38.1kDa 및 336 아미노산 잔기에 대한 1,011bp 핵산을 포함하고 있으며, 또한 단백질 BLAST 검색(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 다중 서열 정렬 분석(Multiple sequence alignment analysis) 결과, CaDIMK1은 다른 단백질 종에 대해서 높은 아미노산 서열 동일성(46.74-81.85%)이 나타났다. 이러한 단백질들은 모두 12 개의 모티프와 활성화 루프를 포함하는 보존된 세린/트레오닌 키나아제 도메인을 가지고 있는 것을 확인하였다. As shown in Figure 2a, the cDNA of CaDIMK1 contains a molecular weight of 38.1 kDa and 1,011 bp nucleic acid for 336 amino acid residues, and also protein BLAST search (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) As a result of multiple sequence alignment analysis, CaDIMK1 showed high amino acid sequence identity (46.74-81.85%) to other protein species. All of these proteins were confirmed to have a conserved serine/threonine kinase domain containing 12 motifs and an activation loop.

또한, CaDIMK1 단백질의 계통 발생 분석은 이의 동종(homologous) 애기장대 및 고추와 함께 MEGA 소프트웨어(버전 10.1)에서 수행되었으며, CaDIMK1의 blast 검색을 이용하여 각 식물 종의 최상위 단백질을 분석하였다. 이에, CaDIMK1은 도 2b에 나타낸 바와 같이 추정상 고추 세린/트레오닌 MAP3 키나아제 단백질로 분류되었다.In addition, phylogenetic analysis of CaDIMK1 protein was performed in MEGA software (version 10.1) with its homologous Arabidopsis and pepper, and the top protein of each plant species was analyzed using blast search of CaDIMK1. Accordingly, CaDIMK1 was putatively classified as a capsicum serine/threonine MAP3 kinase protein, as shown in FIG. 2B.

2-2.2-2. CaDIMK1 단백질의 분자 특성Molecular characterization of the CaDIMK1 protein

비생물적 스트레스에 대한 CaDIMK1의 발현을 분석하기 위해, ABA, 고염도(NaCl), 및 H2O2 처리된 6엽 단계(six-leaf stage)의 고추 식물을 사용하여 qRT-PCR 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 2c에 나타낸 바와 같이, CaDIMK1의 유도는 ABA 처리 6, 12, 및 24시간 후에 모두 유의하게 증가되었고, NaCl 처리 6시간 후에 감소하였다가 12시간 및 24시간 후 다시 처리 전과 유사한 수준으로 증가하였으며, H2O2 처리 시 2시간 후부터 CaDIMK1의 유도가 감소하는 것을 확인하였다. 도 2c에서 * 표시는 0시간 및 다른 시간 사이의 유의한 차이를 나타낸다(Student’s t-테스트, P<0.05). 이러한 결과는 CaDIMK1이 ABA 신호 및 비생물적 스트레스 반응에서 작동할 수 있음을 의미한다.To analyze the expression of CaDIMK1 in response to abiotic stress, qRT-PCR analysis was performed using ABA, high salinity (NaCl), and H 2 O 2 -treated pepper plants at the six-leaf stage. did As a result, as shown in Figure 2c, the induction of CaDIMK1 was significantly increased after 6, 12, and 24 hours of ABA treatment, decreased after 6 hours of NaCl treatment, and then returned to a level similar to that before treatment after 12 and 24 hours. It was confirmed that the induction of CaDIMK1 decreased after 2 hours of treatment with H 2 O 2 . In Fig. 2c, * indicates a significant difference between time 0 and other times (Student's t-test, P<0.05). These results imply that CaDIMK1 can act in ABA signaling and abiotic stress responses.

또한, 담배(Nicotiana benthamiana) 표피 세포에서 녹색 형광 단백질(GFP)-태그된 CaDIMK1융합 단백질의 세포 내 국소화를 확인한 결과, 도 2d에 나타난 바와 같이, 형광 신호는 핵과 세포질에서 강하게 관찰되어, CaDIMK1-GFP는 핵 및 세포질에서 기능할 수 있음을 확인하였다.In addition, as a result of confirming the intracellular localization of the green fluorescent protein (GFP)-tagged CaDIMK1 fusion protein in tobacco ( Nicotiana benthamiana ) epidermal cells, as shown in FIG. 2d, fluorescent signals were strongly observed in the nucleus and cytoplasm, CaDIMK1-GFP confirmed that it can function in the nucleus and cytoplasm.

CaDIMK1이 키나아제 활성을 갖는지 확인하기 위해, 대장균에서 발현함으로써 키나아제 활성을 상실하는 GST-CaDIMK1 및 GST-CaDIMK1K32N(32번째 라이신이 아스파라긴으로 치환됨)을 정제하였다. 그 결과, 도 2e에 나타낸 바와 같이 GST-CaDIMK1은 자동 키나아제 활성을 보였지만 GST-CaDIMK1K32N 은 나타내지 않았다.To confirm whether CaDIMK1 has kinase activity, GST-CaDIMK1 and GST-CaDIMK1 K32N (32nd lysine substituted with asparagine), which lose kinase activity by expression in E. coli, were purified. As a result, as shown in Fig. 2e, GST-CaDIMK1 showed autokinase activity, but GST-CaDIMK1 K32N did not.

실험예 3. CaDIMK1-침묵 고추에서 가뭄 저항성 감소 및 ABA 민감성 감소 확인Experimental Example 3 Confirmation of reduced drought resistance and reduced ABA sensitivity in CaDIMK1-silenced pepper

애기장대 식물에서의 과발현 및 고추 식물에서의 바이러스 유도 유전자 침묵 (virus-induced gene silencing: VIGS)을 이용하여 CaDIMK1의 표현형을 분석하였다. 먼저, 역전사 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR) 분석을 통해 CaDIMK1의 발현을 확인한 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이 CaDIMK1의 발현 수준은 대조군 고추(TRV:00) 식물보다 CaDIMK1-침묵 고추(TRV:CaDIMK1)에서 더 낮았다. CaDIMK1 phenotype was analyzed using overexpression in Arabidopsis plants and virus-induced gene silencing (VIGS) in pepper plants. First, as a result of confirming the expression of CaDIMK1 through reverse transcription polymerase chain reaction (RT- PCR ) analysis, as shown in FIG . ) was lower.

또한, 가뭄 스트레스에 대한 CaDIMK1-침묵 고추의 저항성 변화를 조사하기 위해 CaDIMK1-침묵 및 대조군 고추 식물에서 13일의 가뭄 스트레스 동안 물을 주지 않고 1일 동안 다시 물을 주었다. 그 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이 13일 동안 물을 주지 않은 조건(drought) 하에서는 대조군과 CaDIMK1-침묵 고추 식물 사이에 표현형의 차이가 없었다. 그러나 1일 후 다시 물을 주었을 때(re-watering), CaDIMK1-침묵 고추 식물은 대조군 고추 식물보다 더 시든 표현형을 나타내었다. 이 때, CaDIMK1-침묵 및 대조군 고추 식물의 생존율은 47.9% 및 60.4%였다. In addition, to investigate the change in the resistance of CaDIMK1 -silenced peppers to drought stress, CaDIMK1 -silenced and control pepper plants were not watered during 13 days of drought stress and re-watered for 1 day. As a result, as shown in Figure 3b, there was no difference in phenotype between the control and CaDIMK1 -silenced pepper plants under the condition (drought) that no water was given for 13 days. However, when re-watered after 1 day, the CaDIMK1 -silenced pepper plants displayed a more wilted phenotype than the control pepper plants. At this time, the survival rates of the CaDIMK1 -silenced and control pepper plants were 47.9% and 60.4%.

다음으로, 가뭄 저항성을 확인하기 위해, 잎의 생중량(fresh weight) 비율을 측정하여 CaDIMK1-침묵 및 대조군 고추 식물의 수분 보유 능력을 조사한 결과, 도 3c에 나타낸 바와 같이 분리 후 1 시간 이후부터 CaDIMK1-침묵 고추 식물이 대조군 고추 식물보다 잎의 생중량 비율이 감소하여 증산에 의한 수분 손실이 높았다. Next, in order to confirm drought resistance, the fresh weight ratio of the leaves was measured to examine the water holding capacity of CaDIMK1 - silenced and control pepper plants. As a result, as shown in FIG. -Silent pepper plants showed a higher loss of water by transpiration than the control pepper plants because the fresh weight ratio of leaves decreased.

ABA 의존성 기공 폐쇄에서 CaDIMK1의 효과를 연구하기 위해, CaDIMK1-침묵 및 대조군 고추 식물 사이의 잎 온도 및 기공 구멍의 차이를 평가한 결과, 도 3d에 나타낸 바와 같이 잎 온도는 대조군 고추 식물에서 보다 CaDIMK1-침묵 고추 식물에서 적게 증가하였다. 식물에서 기공 폐쇄는 증가된 잎 온도만큼 증발에 의한 냉각에 영향을 미친다. 이에, CaDIMK1-침묵 고추 식물이 향상된 기공 개방으로 인해 낮은 잎 온도를 나타냄을 확인하였다. 또한, CaDIMK1-침묵 고추 및 대조군 고추 식물에서 ABA 농도에 따라 기공 구멍을 측정한 결과, 도 3e에 나타낸 바와 같이 CaDIMK1-침묵 고추 및 대조군 고추 식물의 모든 기공은 ABA를 처리하지 않은 경우 유사하게 개방되었지만, 10 μM 및 20 μM ABA 처리 시 CaDIMK1-침묵 고추 및 대조군 고추 식물의 모든 기공은 기공 구멍이 감소하였다. 그러나 CaDIMK1-침묵 고추 식물의 기공 폐쇄는 대조군 고추 식물보다 유의적으로 낮았다. 즉, 이러한 결과는 CaDIMK1이 ABA 신호 및 가뭄 스트레스에 반응하여 작동함을 나타낸다.To study the effect of CaDIMK1 on ABA-dependent stomatal closure, differences in leaf temperature and stomatal opening between CaDIMK1 - silenced and control pepper plants were evaluated. Small increase in silent pepper plants. In plants, stomatal closure affects evaporative cooling as much as increased leaf temperature. Accordingly, it was confirmed that the CaDIMK1 -silenced pepper plants exhibited lower leaf temperatures due to improved stomatal opening. In addition, as a result of measuring stomatal openings according to ABA concentrations in CaDIMK1 -silenced pepper plants and control pepper plants, as shown in Figure 3e, all stomata of CaDIMK1 -silenced pepper plants and control pepper plants were similarly opened when ABA was not treated, but , All stomata of CaDIMK1 -silenced pepper and control pepper plants were reduced in stomatal opening upon treatment with 10 μM and 20 μM ABA. However, stomatal closure of CaDIMK1 -silenced pepper plants was significantly lower than that of control pepper plants. In other words, these results indicate that CaDIMK1 works in response to ABA signaling and drought stress.

실험예 4. CaDIMK1-OX 형질전환 애기장대의 ABA 민감성 증가 확인Experimental Example 4. Confirmation of increased ABA sensitivity of CaDIMK1-OX transgenic Arabidopsis

CaDIMK1의 더 많은 유전자 분석을 위해, CaDIMK1을 지속적으로 과발현(over-expressed)하는 CaDIMK1-OX 형질전환 애기장대 식물을 사용하였으며, 두 가지 형질전환 애기장대 계통(CaDIMK1-OX #1 및 CaDIMK1-OX #2)을 선택하여 표현형 분석에 사용하였다. For further genetic analysis of CaDIMK1, CaDIMK1 -OX transgenic Arabidopsis plants consistently over-expressing CaDIMK1 were used, and two transgenic Arabidopsis lines ( CaDIMK1 -OX #1 and CaDIMK1 -OX # 2) was selected and used for phenotypic analysis.

먼저, 반-정량적(semi-quantitative) RT-PCR 분석을 이용하여 CaDIMK1의 발현 수준을 측정하였다. 그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이 CaDIMK1-OX 애기장대가 CaDIMK1 전사체를 발현하지만 야생형 식물에서는 발현하지 않음을 확인하였다. First, the expression level of CaDIMK1 was measured using semi-quantitative RT-PCR analysis. As a result, as shown in Figure 4a, it was confirmed that CaDIMK1 -OX Arabidopsis thaliana expressed the CaDIMK1 transcript, but not in wild-type plants.

고추 식물에서는, CaDIMK1 발현이 ABA에 의해 가장 많이 유도되었으며(도 2c 참조), 이에 ABA가 발아 및 묘목 단계에서 CaDIMK1-OX 식물에 얼마나 많은 영향을 미치는지 확인하였다. 그 결과, 도 4b에 나타낸 발아율(germination rate) 및 도 4c에 나타낸 녹색 자엽(green cotyledon)의 비율은 ABA를 처리하지 않은 경우 CaDIMK1-OX 및 야생형 식물 사이에 차이가 없었으나, CaDIMK1-OX 식물은 ABA 처리에 따라 야생형 식물보다 발아 및 자엽 녹색화(greening) 속도가 현저히 낮은 것을 확인하였다. 또한, 도 4d에 나타낸 바와 같이 CaDIMK1-OX 식물은 ABA-과민성 1차 뿌리 길이를 나타내었다. 이러한 결과는 애기장대의 CaDIMK1이 ABA 존재 하에서 발아 및 묘목 단계 동안 과민성을 나타냄을 시사한다.In pepper plants, CaDIMK1 expression was most induced by ABA (see Fig. 2c), and it was confirmed how much ABA affects CaDIMK1 -OX plants at the germination and seedling stages. As a result, the germination rate shown in FIG. 4b and the ratio of green cotyledons shown in FIG. 4c were not different between CaDIMK1 -OX and wild-type plants when ABA was not treated, but CaDIMK1 -OX plants It was confirmed that the germination and cotyledon greening rates were significantly lower than wild-type plants according to the ABA treatment. In addition, as shown in Fig. 4d, CaDIMK1 -OX plants exhibited ABA-sensitive primary root length. These results suggest that CaDIMK1 in Arabidopsis is hypersensitive during germination and seedling stages in the presence of ABA.

실험예 5. CaDIMK1-OX 형질전환 애기장대의 가뭄 스트레스 저항성 확인Experimental Example 5. Confirmation of drought stress resistance of CaDIMK1-OX transgenic Arabidopsis

CaDIMK1 과발현이 가뭄 스트레스 반응에서 애기장대에 미치는 영향을 추가로 조사하기 위해 CaDIMK1-OX 및 야생형 식물을 가뭄 스트레스에 노출시켰다. To further investigate the effect of CaDIMK1 overexpression on Arabidopsis thaliana in drought stress response, CaDIMK1 -OX and wild-type plants were exposed to drought stress.

3주 동안 애기장대 식물은 물이 잘 뿌려진 조건에서 재배되었으며, 이 때 CaDIMK1-OX 및 야생형 식물 사이에서는 도 5a에 나타낸 바와 같이 다른 표현형은 관찰되지 않았다. 반면, 16일 동안 식물에 물을 주지 않고 식물을 가뭄 스트레스에 노출시킨 후 2일 동안 다시 물을 주었을 때, CaDIMK1-OX 식물은 야생형 식물에 비해 덜 시드는 것을 확인하였으며, CaDIMK1-OX 식물(33.33-73.19%)의 생존율은 야생형 식물(11.11%)보다 높았다. Arabidopsis thaliana plants were grown under well-watered conditions for 3 weeks, and at this time, no other phenotype was observed between CaDIMK1 -OX and wild-type plants, as shown in FIG. 5a. On the other hand, when the plants were exposed to drought stress without watering for 16 days and then watered again for 2 days, it was confirmed that CaDIMK1 -OX plants withered less than wild-type plants, and CaDIMK1 -OX plants (33.33- 73.19%) was higher than wild-type plants (11.11%).

또한, 가뭄 스트레스 저항성을 확인하기 위해, 잎의 생중량(fresh weight) 비율을 측정하여 CaDIMK1-OX 및 야생형 식물의 수분 보유 능력을 조사한 결과, 도 5b에 나타낸 바와 같이 분리 후 1 시간 이후부터 CaDIMK1-OX 애기장대 식물이 야생형 식물보다 잎의 생중량 비율이 증가하여 증산에 의한 수분 손실이 낮았다. In addition, in order to confirm drought stress resistance, the fresh weight ratio of the leaves was measured to examine the water holding capacity of CaDIMK1 -OX and wild-type plants. As a result, as shown in FIG . OX Arabidopsis thaliana plants had higher leaf fresh weight ratio than wild-type plants, resulting in lower water loss due to transpiration.

다음으로, ABA 민감도를 조사하기 위해 잎 온도를 측정한 결과, 도 5c에 나타낸 바와 같이 모든 식물은 ABA를 처리하지 않은 경우 유의한 차이를 나타내지 않았으나, ABA 처리 시 CaDIMK1-OX 식물은 야생형 식물에 비해 잎 온도가 더 높았다. 더욱이, CaDIMK1-OX 식물은 도 5d에 나타낸 바와 같이 10 μM 및 20 μM ABA의 처리 시 현저하게 더 작은 기공 구멍을 나타내었으나, ABA를 처리하지 않은 모든 식물은 그 차이를 나타내지 않았다. 이러한 결과는 CaDIMK1-OX 식물이 ABA 과민성에 의해 수분 보유 능력이 증가되어 가뭄 스트레스에 대한 저항성을 나타낸다는 것을 시사한다.Next, as a result of measuring leaf temperature to investigate ABA sensitivity, as shown in Fig. 5c, all plants did not show a significant difference when not treated with ABA, but CaDIMK1 -OX plants with ABA treatment compared to wild-type plants. The leaf temperature was higher. Moreover, CaDIMK1 -OX plants showed significantly smaller stomatal pores upon treatment with 10 μM and 20 μM ABA, as shown in Figure 5d, but all plants not treated with ABA showed no difference. These results suggest that CaDIMK1 -OX plants show resistance to drought stress because their water retention capacity is increased by ABA hypersensitivity.

이에 더하여, qRT-PCR 분석을 통해 스트레스 관련 유전자의 발현 수준을 조사한 결과, 도 5e에 나타낸 바와 같이 스트레스 관련 유전자의 발현 수준은 가뭄 스트레스 처리 전 CaDIMK1-OX 및 야생형 식물 간에 차이가 없었으나, 가뭄 스트레스 처리 4시간 후에 두 식물 모두에서 스트레스 관련 유전자의 발현이 유도되었다. 또한 모든 스트레스 관련 유전자의 발현 수준은 야생형 식물보다 CaDIMK1-OX 식물에서 높게 유도되었다. 이러한 결과로부터 CaDIMK1-OX 식물은 스트레스 관련 유전자가 관여함으로써 가뭄 저항성을 가지는 것을 알 수 있었다.In addition, as a result of examining the expression levels of stress-related genes through qRT-PCR analysis, as shown in Fig. 5e, the expression levels of stress-related genes did not differ between CaDIMK1 -OX and wild-type plants before drought stress treatment, but under drought stress. Expression of stress-related genes was induced in both plants after 4 hours of treatment. In addition, expression levels of all stress-related genes were induced higher in CaDIMK1 -OX plants than in wild-type plants. From these results, it was found that CaDIMK1 -OX plants have drought resistance due to the involvement of stress-related genes.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.The above description of the present invention is for illustrative purposes, and those skilled in the art can understand that it can be easily modified into other specific forms without changing the technical spirit or essential features of the present invention. will be. Therefore, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and not restrictive.

<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> CaDIMK1 gene and Method for improving the resistance to the drought stress using CaDIMK1 in plants <130> MP20-150 <160> 42 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 336 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CaDIMK1(Capsicum annuum drought-induced MAP kinase 1) <400> 1 Met Asp Trp Thr Arg Gly His Thr Ile Gly His Gly Ser Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Val Ala Lys Ser Arg Phe Ser Asp Asp Val Phe Ala Val Lys 20 25 30 Ser Val Glu Leu Ser Lys Ser Glu Leu Leu Gln Lys Glu Gln Lys Thr 35 40 45 Leu Ser Gln Leu Ser Ser Pro Tyr Val Val Ser Tyr Lys Gly Cys Asp 50 55 60 Val Thr Lys Glu Lys Asp Lys Leu Met Phe Asn Leu Met Met Glu Tyr 65 70 75 80 Met Ser Glu Gly Thr Leu Val Asp Glu Asn Arg Lys His Gly Gly Arg 85 90 95 Ile Asn Glu Pro Leu Ile Gly Tyr Tyr Ala Lys Gln Ile Ala Gln Gly 100 105 110 Leu Glu Tyr Leu His Ser Arg Gly Ile Ala His Cys Asp Ile Lys Gly 115 120 125 Gln Asn Ile Leu Leu Gly Lys Thr Gly Ala Lys Ile Ala Asp Phe 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gaattcagta gaggaatc 28 <210> 32 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CA07g11530 reverse primer <400> 32 attagctact tattgactga tggtgct 27 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CA07g11550 forward primer <400> 33 agatgggcgg ctaaacaact c 21 <210> 34 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CA07g11550 reverse primer <400> 34 tcttctaaca gtaacccatc gatgat 26 <210> 35 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CA07g11570 forward primer <400> 35 aagaatcaga caccattgat cctacaa 27 <210> 36 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CA07g11570 reverse primer <400> 36 ataagtcaaa tgcctcggaa aatc 24 <210> 37 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CA02g14340 forward primer <400> 37 catccctttg ttgctgatca agat 24 <210> 38 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CA02g14340 reverse primer <400> 38 attcagaatc aggtctacat tcaccc 26 <210> 39 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CA02g14350 forward primer <400> 39 gctactaaaa catgaatttg ttgctg 26 <210> 40 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CA02g14350 reverse primer <400> 40 ctggtctgtt ttcatcaccc actaa 25 <210> 41 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CA02g14360 forward primer <400> 41 catgctacag taacacccct tcaata 26 <210> 42 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CA02g14360 reverse primer <400> 42 tcaccgaatg ctgacccaat cat 23 <110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> CaDIMK1 gene and Method for improving the resistance to the drought stress using CaDIMK1 in plants <130> MP20-150 <160> 42 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 336 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CaDIMK1 (Capsicum annuum drought-induced MAP kinase 1) <400> 1 Met Asp Trp Thr Arg Gly His Thr Ile Gly His Gly Ser Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Val Ala Lys Ser Arg Phe Ser Asp Asp Val Phe Ala Val Lys 20 25 30 Ser Val Glu Leu Ser Lys Ser Glu Leu Leu Gln Lys Glu Gln Lys Thr 35 40 45 Leu Ser Gln Leu Ser Ser Pro Tyr Val Val Ser Tyr Lys Gly Cys Asp 50 55 60 Val Thr Lys Glu Lys Asp Lys Leu Met Phe Asn Leu Met Met Glu Tyr 65 70 75 80 Met Ser Glu Gly Thr Leu Val Asp Glu Asn Arg Lys His Gly Gly Arg 85 90 95 Ile Asn Glu Pro Leu Ile Gly Tyr Tyr Ala Lys Gln Ile Ala Gln Gly 100 105 110 Leu Glu Tyr Leu His Ser Arg Gly Ile Ala His Cys Asp Ile Lys Gly 115 120 125 Gln Asn Ile Leu Leu Gly Lys Thr Gly Ala Lys Ile Ala Asp Phe Gly 130 135 140 Cys Ala Arg Trp Ile Asp Pro Ala Asp Arg Asp Val Gly Ala Thr Glu 145 150 155 160 Pro Ile Gly Gly Thr Pro Met Phe Met Ala Pro Glu Val Ala Arg Gly 165 170 175 Gly Glu Gln Gly Arg Pro Gly Asp Ile Trp Ser Leu Gly Cys Thr Ile 180 185 190 Ile Glu Met Ala Thr Gly Arg Ser Ala Trp Thr Asn Ala Thr Asn Ala 195 200 205 Ala Ser Leu Leu Tyr Gln Ile Ala Phe Ser Gly Glu Ser Pro Glu Ile 210 215 220 Pro Lys Phe Leu Ser Leu Glu Ala Arg Asp Phe Leu Ser Lys Cys Leu 225 230 235 240 Arg Arg Asp Pro Lys Glu Arg Trp Thr Ala Lys Gln Leu Leu Lys His 245 250 255 Pro Phe Leu Glu Asp Phe Asn Ser Asn Ser Thr Thr Asp Gln Asp Phe 260 265 270 Val Thr Ser Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Gln Asp Ile Trp Asn Ser 275 280 285 Glu Thr Met Asp His Tyr Ser Ile Leu Thr Ala Ser Ser Val Glu Ser 290 295 300 Pro Leu Gln Arg Val Arg Lys Leu Gly Ser Asp Ser Glu Leu Asn Trp 305 310 315 320 Arg Arg Asn Asp Asp Glu Arg Trp Ile Thr Val Arg Ser Ser Ser Glu 325 330 335 <210> 2 <211> 1011 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> CaDIMK1 (Capsicum annuum drought-induced MAP kinase 1) <400> 2 atggattgga ctagaggcca taccataggc cacggctcct ctgcctccgt ctccgttgct 60 aagtcacgtt tctccgatga ggtttttgct gtcaagtcag ttgagctatc caagtcagag 120 ttgctacaaa aggagcagaa aactctctcc caattgagct caccttatgt agttagctac 180 aaggggtgcg atgttactaa agagaaggac aaactcatgt ttaatcttat gatggaatac 240 atgtcggaag gtacactcgt cgatgaaaat cggaaacatg gtggtcggat caacgagcct 300 ttgatagggt attatgccaa gcaaattgca caaggactag agtacctgca ttcaaggggc 360 atagcacact gtgacattaa ggggcagaac attttgttag ctaaaaccgg tgccaaaatt 420 gccgattttg gttgtgccag gtggattgat ccagcagaca gggacgttgg ttccacggag 480 ccaattggtg ggaccccgat gttcatggca ccagaggtgg cgcgtggggg agaacagggg 540 cgtccgggtg atatttggtc attgggatgt acgattattg aaatggccac tggtagatcg 600 gcatggacta atgccacaaa cgcagcttca ttgctctacc aaattgcatt ttctggggaa 660 tccccagaaa ttccaaaatt cttgtcttta gaagcaaggg atttcttaag caaatgcttg 720 agaagagatc cgaaagaaag atggacagct aaacaactcc tcaaacatcc gtttcttgaa 780 gaatccaatt cgaattctat gtcaactcaa gattttgtga caagttcgcc gacaagcatt 840 cttgatcaag acatatggaa ttcagaaact atggatcatt attcaatact aacagcaagc 900 tcagtggagt ctcctctgca aagggtaaga aaattaggtt cagattcaga actgaattgg 960 agaaggaatg atgctgagag atggatcaca gttagaagta gtagtgaata a 1011 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> CaDIMK1 forward primer <400> 3 atggattgga ctagaggcca 20 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> CaDIMK1 reverse primer <400> 4 ttattcacta ctacttctaa ctgtgat 27 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> VIGS (TRV: CaDIMK1) forward primer <400> 5 atggattgga ctagaggcca 20 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> VIGS(TRV:CaDIMK1) reverse primer <400> 6 ttattcacta ctacttctaa ctgtgat 27 <210> 7 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> CaDIMK1K32N forward primer <400> 7 cttggatagc tcaactgagt tgacagcaaa aacctcatc 39 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> CaDIMK1K32N reverse primer <400> 8 gatgaggttt ttgctgtcaa ctcagttgag ctatccaag 39 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OST1 forward primer <400> 9 ccaaagcata gaagaaatta tgcag 25 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OST1 reverse primer <400> 10 ttttgtttga catttttgta gcaga 25 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> CaDIMK1 forward primer <400> 11 attcagaaac tatggatcat tattcaat 28 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> CaDIMK1 reverse primer <400> 12 tgtatagtac aaaatttaca gcaacgtg 28 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> CaACT1 forward primer <400> 13 gacgtgacct aactgataac ctgat 25 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> CaACT1 reverse primer <400> 14 ctctcagcac caatggtaat aactt 25 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> RAB18 forward primer <400> 15 ggaagaaggg aataacacaa aagat 25 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> RAB18 reverse primer <400> 16 gcgttacaaa ccctcattat tttta 25 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> RD29B forward primer <400> 17 gttgaagagt ctccacaatc acttg 25 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> RD29B reverse primer <400> 18 atacaaatcc ccaaactgaa taaca 25 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> DREB2A forward primer <400> 19 ctacaaagcc tcaactacgg aatac 25 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> DREB2A reverse primer <400> 20 aaactcggat agagaatcaa cagtc 25 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> AHG1 forward primer <400> 21 tcattgatct caagaatagc tctca 25 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> AHG1 reverse primer <400> 22 taaataacct tgtagcccat atcca 25 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PP2CA forward primer <400> 23 acttgagggaa gaggaggaat aatca 25 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PP2CA reverse primer <400> 24 ccagcctgaa ttaagagcta actaa 25 <210> 25 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> HAB1 forward primer <400> 25 gactacctct caatgcttgc tctac 25 <210> 26 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> HAB1 reverse primer <400> 26 aaaaacctgt cgaaattaga tcctt 25 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> AtActin8 forward primer <400> 27 caactatgtt ctcaggtatt gcaga 25 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> AtActin8 reverse primer <400> 28 gtcatggaaa cgatgtctct ttagt 25 <210> 29 <211> 27 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> CA07g11510 forward primer <400> 29 tcagtagagg aatcagaaac aatggat 27 <210> 30 <211> 26 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> CA07g11510 reverse primer <400> 30 agacgtcatc gatcgatgta ttcact 26 <210> 31 <211> 28 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> CA07g11530 forward primer <400> 31 aagatatatg gaattcagta gaggaatc 28 <210> 32 <211> 27 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> CA07g11530 reverse primer <400> 32 attagctact tattgactga tggtgct 27 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> CA07g11550 forward primer <400> 33 agatgggcgg ctaaacaact c 21 <210> 34 <211> 26 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> CA07g11550 reverse primer <400> 34 tcttctaaca gtaacccatc gatgat 26 <210> 35 <211> 27 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> CA07g11570 forward primer <400> 35 aagaatcaga caccattgat cctacaa 27 <210> 36 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> CA07g11570 reverse primer <400> 36 ataagtcaaa tgcctcggaa aatc 24 <210> 37 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> CA02g14340 forward primer <400> 37 catccctttg ttgctgatca agat 24 <210> 38 <211> 26 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> CA02g14340 reverse primer <400> 38 attcagaatc aggtctacat tcaccc 26 <210> 39 <211> 26 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> CA02g14350 forward primer <400> 39 gctactaaaa catgaatttg ttgctg 26 <210> 40 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> CA02g14350 reverse primer <400> 40 ctggtctgtt ttcatcaccc actaa 25 <210> 41 <211> 26 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> CA02g14360 forward primer <400> 41 catgctacag taacaccct tcaata 26 <210> 42 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> CA02g14360 reverse primer <400> 42 tcaccgaatg ctgacccaat cat 23

Claims (10)

삭제delete 삭제delete 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 건조 스트레스 저항성 CaDIMK1(Capsicum annuum drought-induced MAP kinase 1) 단백질을 암호화하는 CaDIMK1 유전자로서,
상기 CaDIMK1 유전자는 서열번호 2의 염기 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, CaDIMK1 유전자.
 A CaDIMK1 gene encoding a dry stress resistant CaDIMK1 ( Capsicum annuum drought-induced MAP kinase 1) protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1,
The CaDIMK1 gene is characterized in that consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, CaDIMK1 gene.
 제3항에 있어서,
상기 CaDIMK1 유전자는 고추로부터 분리된 것을 특징으로 하는, CaDIMK1 유전자.
According to claim 3,
The CaDIMK1 gene is characterized in that isolated from pepper, CaDIMK1 gene.
 제3항의 CaDIMK1 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
A recombinant vector containing the CaDIMK1 gene of claim 3.
 제5항에 있어서,
상기 재조합 벡터는 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용인 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
According to claim 5,
The recombinant vector is a recombinant vector, characterized in that for enhancing the drying stress resistance of plants.
 제5항의 재조합 벡터로 형질전환된 식물.
A plant transformed with the recombinant vector of claim 5.
 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CaDIMK1(Capsicum annuum drought-induced MAP kinase 1) 단백질, 이를 암호화하는 CaDIMK1 유전자, 및 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진용 조성물.
A plant comprising at least one selected from the group consisting of a CaDIMK1 ( Capsicum annuum drought-induced MAP kinase 1) protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a CaDIMK1 gene encoding the same, and a recombinant vector containing the gene as an active ingredient. A composition for enhancing dry stress resistance.
 하기의 단계를 포함하는, 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진 방법:
(a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CaDIMK1(Capsicum annuum drought-induced MAP kinase 1) 단백질을 암호화하는 유전자를 식물체에 형질전환 하는 단계; 및
(b) 상기 형질전환된 식물체에서 CaDIMK1 단백질을 과발현시키는 단계.A method for enhancing dry stress resistance of a plant, comprising the following steps:
(a) transforming a gene encoding CaDIMK1 ( Capsicum annuum drought-induced MAP kinase 1) protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 into a plant; and
(b) overexpressing the CaDIMK1 protein in the transformed plant. 삭제delete
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