KR102094929B1 - kidney spheroid and method of preparing the same - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규 신장 스페로이드 및 이의 제조 방법, 및 이를 포함하는 삼차원 신장 모사체에 관한 것이다.
본 발명에 따른 신규 신장 스페로이드 제조 방법은 세포 집합체의 응집을 개선시켜, 신장 스페로이드의 제작 성공률을 현저히 개선한다. 이에 따라 제조된 신장 스페로이드는 우수한 신장 세포 특이적 표현형을 나타내며, 정상 신장 특성을 잘 나타내는 신장 모사체로 활용될 수 있다.
특히, 본 발명의 신장 스페로이드는 신장 수송체와 관련된 약물 반응성에 변화를 감지할 수 있어, 신독성 약물 반응을 검사하는 데에 유용하게 활용될 수 있다.The present invention relates to a novel kidney spheroid and a method for manufacturing the same, and a three-dimensional kidney mimetic comprising the same.
The novel kidney spheroid production method according to the present invention improves the aggregation of cell aggregates, thereby significantly improving the production success rate of the kidney spheroid. The kidney spheroid thus prepared exhibits an excellent kidney cell specific phenotype and can be utilized as a kidney mimetic that exhibits normal kidney characteristics.
In particular, the renal spheroid of the present invention can detect a change in drug reactivity associated with a renal transporter, and thus can be usefully used to test a neotoxic drug response.

Description

신장 스페로이드 및 그의 제조 방법{kidney spheroid and method of preparing the same}Kidney spheroid and its manufacturing method {kidney spheroid and method of preparing the same}

본 발명은 신규 신장 스페로이드 및 이의 제조 방법, 및 이를 포함하는 삼차원 신장 모사체에 관한 것이다.The present invention relates to a novel kidney spheroid and a method for manufacturing the same, and a three-dimensional kidney mimetic comprising the same.

신약 개발 시 후보물질의 독성과 효능을 체외에서 평가할 수 있는 세포 배양 시스템의 중요성은 날로 증가하고 있다. 그러나 종래의 2D 세포주 배양법은 세포가 유래한 위치 고유의 성질과 조직 단위의 특성을 재현해내기 힘들다는 단점이 있다. 또한, 동물실험 모델은 인체와 유전적, 생물학적인 특성이 상이하기 때문에 약물 시험 반응의 신뢰성에 한계가 있다. 이에 대한 대안으로 암 환자 유래 이종 이식 모델이 활용되기도 하지만 대규모 약물 스크리닝에는 부적합하다는 단점이 있다.In the development of new drugs, the importance of cell culture systems capable of evaluating the toxicity and efficacy of candidate substances in vitro is increasing day by day. However, the conventional 2D cell line cultivation method has disadvantages in that it is difficult to reproduce the properties of tissue-derived location-specific properties and tissue units. In addition, the animal test model has limitations in the reliability of the drug test reaction because the genetic and biological characteristics are different from the human body. As an alternative, a xenograft model derived from a cancer patient may be used, but it has a disadvantage in that it is not suitable for large-scale drug screening.

문헌[Fatehullah et al., Nature cell biology 18.3 (2016): 246.]에 따르면 기존의 문제점을 보완할 새로운 약물 스크리닝 플랫폼으로서 오가노이드가 주목받고 있다. 오가노이드 기술은 환자 오가노이드 뱅킹, 다양한 질병 모델링, 유전체 교정 기술 융합을 통한 재생 치료, 환자 유전체 정보와 연계한 맞춤 치료 및 정밀 치료 등 다양한 잠재적 응용 가능성을 보여주고 있다.According to Fatehullah et al., Nature cell biology 18.3 (2016): 246., organoids are attracting attention as a new drug screening platform to complement the existing problems. Organoid technology shows a variety of potential applications, such as patient organoid banking, various disease modeling, regenerative treatment through fusion of genome correction technology, and customized and precise treatment in conjunction with patient genome information.

사람 생체 내 조직 구성을 정확히 재현하는 오가노이드를 형성하는 과정은 단순한 기초 연구 도구에서부터 응용 연구의 플랫폼까지 다양하게 적용할 수 있게 확장되었다. 유전적 변화 없이 대량으로 오가노이드를 배양할 수 있다면, 오가노이드는 초고속 스크리닝을 위한 좋은 모델이 될 수 있으며, 환자 맞춤형 표적 치료에 이용될 수 있고, 재생의학 분야에 적용될 수 있는 완벽한 조직을 제공할 수 있다.The process of forming organoids that accurately reproduce human tissue composition in vivo has been extended to be applied from simple basic research tools to platforms for applied research. If the organoids can be cultured in large quantities without genetic changes, the organoids can be a good model for ultra-fast screening, provide a complete tissue that can be used for patient-specific targeted therapy and applied in regenerative medicine. You can.

그러나 오가노이드 배양은 생존력, 크기 및 형태 측면에서 이질적인 세포가 한데 혼합되게 되므로, 배양 세포의 이질적 특성에 따라 약물 독성 및 효능 분석의 예측을 어렵게 만든다. 이러한 오가노이드의 제작의 한계를 극복하고 신약개발시 후보물질의 독성과 효능을 평가할 수 있는 인체모사 신장 오가노이드 시스템 개발이 요구되고 있다.However, since organoid cultures are mixed with heterogeneous cells in terms of viability, size and morphology, it is difficult to predict drug toxicity and efficacy analysis according to the heterogeneous characteristics of cultured cells. There is a need to develop a human-mimicking kidney organoid system that can overcome the limitations of the production of organoids and evaluate the toxicity and efficacy of candidate substances when developing new drugs.

한편, 신장은 대사 및 배설 과정에서 핵심적 역할을 수행하므로, Little 그룹에서 유도된 만능 줄기세포를 사용하여 사구체에서부터 집합관에 이르기까지 신장의 구조를 재현한 신장 오가노이드를 제조한 바 있다. 그러나 만능유도 줄기세포로부터 유래한 신장 오가노이드는 임신 3/4분기의 태아와 유사한 상태였고, 신독성 결과로는 시스플라틴 단일 약물에 대한 반응성만 확인할 수 있었다.On the other hand, since the kidney plays a key role in the metabolic and excretory processes, a kidney organoid that reproduces the structure of the kidney from the glomeruli to the gland is produced using pluripotent stem cells derived from the Little group. However, renal organoids derived from pluripotent stem cells were in a similar state to the fetus in the third quarter of pregnancy, and as a result of renal toxicity, only reactivity to cisplatin single drug was confirmed.

현재까지 체외 신장 독성 검증에 사용되고 있는 사람의 근위세뇨관 유래 세포들의 경우, 체외 증식 과정 및 불멸화 과정 동안 기존 신장의 특성을 잃어버리거나 특이적 수송체의 발현이 현저하게 떨어져 약물 흡수 및 대사를 검증하는데 어려움이 있다.In the case of human proximal tubule-derived cells that have been used for the verification of in vitro renal toxicity, it is difficult to verify drug absorption and metabolism due to loss of existing kidney characteristics during the in vitro proliferation process and immortalization process or the remarkable expression of specific transporters. There is this.

본 발명자들은 상기 종래기술의 문제점을 개선하고자, 생쥐의 신장으로부터 신장 특이적 마커의 발현을 유지하는 1차 세포를 획득하였고, 이를 3차원적 배양법을 통해 생체와 유사한 반응성을 가지는 신장 모사체를 제작 할 수 있는 배양 용기, 배양 세포 및 그의 조합, 배양 조건 및 배양 시간을 확인하고 본 발명을 완성하였다.In order to improve the problems of the prior art, the present inventors obtained primary cells that maintain the expression of kidney-specific markers from the kidneys of mice, and produced kidney mimetics having reactivity similar to living organisms through a three-dimensional culture method. The present invention was completed by confirming a culture vessel capable of being cultured, a cultured cell and a combination thereof, culture conditions, and a culture time.

본 발명의 목적은 신규 신장 스페로이드 제조 방법 및 이에 따라 생성된 신장 스페로이드, 및 이를 포함하는 삼차원 신장 세포체를 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a novel kidney spheroid production method and a kidney spheroid thus produced, and a three-dimensional kidney cell body comprising the same.

본 발명자들은 신독성 반응성이 우수한 신장 세포체를 제조하기 위해, 신장 유래 불멸화 신장 세포를 이용하여 신장 스페로이드를 제조하였고, 이의 신장 특이성 및 신독성 반응성의 우수함을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.The present inventors prepared kidney spheroids using kidney-derived immortalized kidney cells in order to prepare kidney cell bodies having excellent renal toxicity, and completed the present invention by discovering the renal specificity and superiority of renal toxicity.

본 발명은 (a) 스페로이드 형성 유닛(spheroid forming unit; SFU) 내 매트리겔(matrigel) 및 세포외기질(extracellular matrix; ECM)을 포함하는 3차원 배양 배지에 일차 신장 세포를 투여하는 단계; (b) 레티노이드산, 덱사메타손, ITS (insulin-transferrin-selenium), 비타민 D3, 및 표피생장인자(epidermal growth factor; EGF) 로 구성된 신장 세포 성숙 인자를 더 첨가하는 단계; 및 (c) 상기 배양 배지를 3차원 배양하는 단계를 포함하는 신장 스페로이드의 제조 방법을 제공한다.The present invention comprises the steps of: (a) administering primary kidney cells to a three-dimensional culture medium comprising a matrigel and extracellular matrix (ECM) in a spheroid forming unit (SFU); (b) further adding a renal cell maturation factor consisting of retinoid acid, dexamethasone, insulin-transferrin-selenium (ITS), vitamin D3, and epidermal growth factor (EGF); And (c) three-dimensional culture of the culture medium.

본 발명에서 스페로이드란 자가 조직화가 가능한 3차원 세포 집합체를 의미한다. 스페로이드는 실제 조직의 해부 구조를 모방하는 소형의 단순화된 형태의 생체 외 3 차원 기관으로, 다양한 약물 스크리닝 및 질환 모델로 사용될 수 있다.In the present invention, spheroid means a three-dimensional cell aggregate capable of self-organization. Spheroid is a small, simplified, ex vivo 3D organ that mimics the anatomical structure of a real tissue, and can be used for various drug screening and disease models.

본 발명에서, 신장 스페로이드 제조 방법은 스페로이드 형성 유닛 내 매트리겔 및 세포외기질을 포함하는 3차원 배양 배지에 일차 신장 세포를 투여하는 단계 (a)를 포함한다.In the present invention, the method for producing a kidney spheroid comprises the step (a) of administering primary kidney cells to a three-dimensional culture medium comprising a matrigel and an extracellular matrix in a spheroid forming unit.

스페로이드 형성 유닛은 코니칼 튜브일 수 있다. 상기 코니칼 튜브는 바닥이 둥근 형태, 반구 형태, 또는 V-자 형태일 수 있다. 본 발명에서, 바닥이 오목부로 형성된 배양 용기를 사용할 경우 바닥이 평평한 배양 용기를 사용한 방식에 비해 3차원 배양 세포의 세포 응집이 현저히 개선되어 효율적으로 스페로이드를 제조할 수 있다. 상기 코니칼 튜브는 예컨대 필터가 장착된 캡이 있는 코니칼 튜브 (cornical tube)이며, 대한민국 공개특허 제10-2017-0034241호에 개시된 것일 수 있다.The spheroid forming unit may be a conical tube. The conical tube may have a round bottom shape, a hemisphere shape, or a V-shaped shape. In the present invention, when using a culture vessel formed with a recessed bottom, cell aggregation of 3D cultured cells is significantly improved compared to the method using a culture vessel having a flat bottom, thereby effectively producing spheroids. The conical tube is, for example, a conical tube with a cap on which a filter is mounted, and may be disclosed in Korean Patent Publication No. 10-2017-0034241.

상기 (a) 단계에서 일차 신장 세포는 SV40 및 hTERT 유전자로 불멸화된 신장 유래 세포일 수 있다.In step (a), the primary kidney cells may be kidney-derived cells immortalized with the SV40 and hTERT genes.

본 발명에 따른 신장 스페로이드 제조 방법은 상기 단계 (a)를 수행하기 전에 2차원 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 2차원 배양은 약 7일 내지 약 150일까지 수행할 수 있다. 일 실시양태에서 상기 2차원 배양은 약 12일 내지 약 50일 동안 수행할 수 있다. 상기 2차원 배양을 수행할 경우, 단계 (a)를 수행하기 약 10일 전에 배양액에 신장 세포 분화인자를 첨가할 수 있다. 일 실시양태에서, 단계 (a)를 수행하기 약 7일 전에 신장 세포 분화인자를 첨가할 수 있다.The method for preparing a kidney spheroid according to the present invention may further include a two-dimensional culture step before performing step (a). The two-dimensional culture can be performed from about 7 days to about 150 days. In one embodiment, the two-dimensional culture may be performed for about 12 days to about 50 days. When performing the two-dimensional culture, kidney cell differentiation factor may be added to the culture medium about 10 days before performing step (a). In one embodiment, kidney cell differentiation factors may be added about 7 days prior to performing step (a).

상기 (a) 단계의 3차원 배양 배지에서 세포외기질:매트리겔의 중량비는 1:1 내지 3:1일 수 있고, 바람직하게는 약 2:1일 수 있다.In the three-dimensional culture medium of the step (a), the weight ratio of the extracellular matrix: matrigel may be 1: 1 to 3: 1, and preferably about 2: 1.

본 발명의 신장 스페로이드 제조 방법은 배양 배지에 신장 세포 성숙인자를 더 첨가하는 단계 (b)를 포함한다. 상기 단계 (b)에서 신장 세포 성숙인자는 불멸화된 신장 세포를 분화 상태로 유도할 수 있는 성분을 의미한다. 본 발명에서, 상기 신장 세포 성숙인자는 레티노이드산, 덱사메타손, 0.5 내지 2X ITS (구체적으로, 5 내지 20 ug/ml의 insulin, 2.75 내지 11 ug/ml의 transferrin, 33.5 내지 134 ng/ml 의 selenium), 비타민 D3, EGF, 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 신장 세포 성숙인자는 1 내지 10 μM 농도의 레티노이드산, 10 내지 1,000 nM 농도의 덱사메타손, ITS, 1 내지 100 nM 농도의 비타민 D3, 1 내지 100 ng/ml 농도의 EGF, 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택될 수 있다. The method for preparing a kidney spheroid of the present invention includes the step (b) of further adding kidney cell maturation factor to the culture medium. In step (b), the renal cell maturation factor refers to a component capable of inducing immortalized renal cells to a differentiated state. In the present invention, the renal cell maturation factor is retinoid acid, dexamethasone, 0.5 to 2X ITS (specifically, 5 to 20 ug / ml insulin, 2.75 to 11 ug / ml transferrin, 33.5 to 134 ng / ml selenium) , Vitamin D3, EGF, and combinations thereof. More specifically, the renal cell maturation factor is retinoid acid at a concentration of 1 to 10 μM, dexamethasone at a concentration of 10 to 1,000 nM, ITS, vitamin D3 at a concentration of 1 to 100 nM, EGF at a concentration of 1 to 100 ng / ml, and these It can be selected from the group consisting of.

상기 단계 (b)는 단계 (a)와 동시에 수행되거나, 또는 단계 (a) 이후, 예컨대 약 1일 내지 약 7일 후에 수행될 수 있다. 일 실시양태에서, 단계 (b)는 단계 (a) 수행 약 1일 또는 2일 후에 수행된다.The step (b) may be performed simultaneously with step (a), or after step (a), for example, about 1 day to about 7 days. In one embodiment, step (b) is performed about 1 or 2 days after step (a) is performed.

본 발명의 신장 스페로이드 제조 방법은 배양 용기에서 3차원 배양을 수행하여 세포 집합체를 형성하는 단계 (c)를 포함한다.The kidney spheroid production method of the present invention comprises the step (c) of performing a three-dimensional culture in a culture vessel to form a cell aggregate.

상기 단계 (c)에 따라, 3차원 배양은 5일 내지 20일 동안 수행될 수 있다. 예컨대, 상기 3차원 배양은 약 7일, 10일, 또는 14일 동안 수행될 수 있다.According to the step (c), the three-dimensional culture can be performed for 5 to 20 days. For example, the three-dimensional culture may be performed for about 7 days, 10 days, or 14 days.

본 발명은 또한, 상기 신장 스페로이드 제조 방법에 따라 생성된 신장 스페로이드 및 이를 포함하는 신장 세포체를 제공하며, 신독성 약물 반응에 활용 될 수 있다.The present invention also provides a renal spheroid produced according to the method for preparing a renal spheroid and a renal cell body comprising the same, and can be utilized in a nephrotoxic drug reaction.

본 발명에 따른 신장 스페로이드 제조 방법에 따라 생성된 신장 스페로이드는 기존의 2차원 배양법에 의해 제조된 신장 세포에 비해 신장 특이적 유전자 발현 수준이 현저히 상승됨을 확인하였다. Kidney spheroids produced according to the method for producing kidney spheroids according to the present invention confirmed that the kidney-specific gene expression level is significantly increased compared to the kidney cells prepared by the conventional two-dimensional culture method.

또한, 상기 스페로이드는 신장 특이적 단백질이 발현되었으며, 전자 현미경 상에서 신장의 구조가 확인되었으며, 신장 특이적 수송체가 발현되고, 단백질 흡수가 확인되었다. In addition, the spheroid, a kidney-specific protein was expressed, the structure of the kidney was confirmed on an electron microscope, a kidney-specific transporter was expressed, and protein absorption was confirmed.

상기 신장 스페로이드는 약물 흡수에 관여하는 OCT2 저해제인 시메티딘(cimetidine) 및 약물 배출에 관여하는 P-glycoprotein(P-gp) 억제제인 베라파밀(verapamil)을 처리함에 따라 신독성 반응성이 변화함이 관찰되었다.The renal spheroids were observed to change in nephrotoxic reactivity with treatment with citricidine, an OCT2 inhibitor involved in drug absorption, and verapamil, a P-glycoprotein (P-gp) inhibitor involved in drug release. .

따라서, 본 발명에 따른 신장 스페로이드 제조 방법에 따라 생성된 신장 스페로이드는 신독성 약물에 반응하는 수송체가 잘 발현되어 있으며, 신독성 약물 반응에 활용될 수 있다.Therefore, the renal spheroid produced according to the method for preparing a renal spheroid according to the present invention is well expressed in a transporter that responds to a nephrotoxic drug, and can be utilized for a renal drug reaction.

본 발명에 따른 신규 신장 스페로이드 제조 방법은 세포 집합체의 응집을 개선시켜, 신장 스페로이드의 제작 성공률을 현저히 개선한다. 이에 따라 제조된 신장 스페로이드는 우수한 신장 세포 특이적 표현형을 나타내며, 정상 신장 특성을 잘 나타내는 신장 모사체로 활용될 수 있다.The novel kidney spheroid production method according to the present invention improves the aggregation of cell aggregates, thereby significantly improving the production success rate of the kidney spheroid. The kidney spheroid thus prepared exhibits an excellent kidney cell specific phenotype and can be utilized as a kidney mimetic that exhibits normal kidney characteristics.

특히, 본 발명의 신장 스페로이드는 신장 수송체와 관련된 약물 반응성에 변화를 감지할 수 있어, 신독성 약물 반응을 검사하는 데에 유용하게 활용될 수 있다.In particular, the renal spheroid of the present invention can detect a change in drug reactivity associated with a renal transporter, and thus can be usefully used to test a neotoxic drug response.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 생쥐 유래의 불멸화 신장 세포를 형태학적으로 분석한 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 불멸화 신장 세포의 체외 증식을 분석한 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 불멸화 신장 세포의 신장 특이적 유전자 발현을 분석한 도이다.
도 4 및 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 불멸화 신장 세포의 신장 특이적 단백질 발현을 분석한 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 불멸화 신장 세포의 단백질 흡수능을 분석한 도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 불멸화 신장 세포의 신독성 약물에 대한 반응성을 분석한 도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 불멸화 신장 세포의 gamma-GT 활성도를 분석한 도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 불멸화 신장 세포를 2D 배양 및 회전 배양하여 제조된 신장 세포의 신장 특이적 유전자 발현을 분석한 도이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예 따른 스페로이드 제조 단계(A), 형성된 스페로이드의 현미경 사진(B) 및 배양 방법(C)에 관한 도이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신장 스페로이드의 구조 및 신장 특이적 단백질 발현을 분석한 도이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신장 스페로이드의 신장 특이적 유전자 발현을 분석한 도이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신장 스페로이드의 신장 특이적 수송체 유전자의 발현을 분석한 도이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신장 스페로이드의 신장 관련 호르몬에 대한 반응성을 분석한 도이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신장 스페로이드의 gamma-GT 활성도를 분석한 도이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신장 스페로이드의 단백질 흡수능을 분석한 도이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신장 스페로이드의 신독성 약물에 대한 세포 사멸을 비교한 도이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 신장 스페로이드의 신독성을 나타내는 도이다.
도 19는 일 실시예에 따라 제조된 신장 스페로이드의 신독성 약물에 대한 관련 유전자 발현을 분석한 도이다.
도 20은 일 실시예에 따라 제조된 신장 스페로이드의 신독성 약물에 대한 관련 단백질 발현을 분석한 도이다.
도 21은 일 실시예에 따라 제조된 생쥐 유래의 신장 스페로이드의 신독성 약물과 신장 특이적 수송체 기능의 연관성을 분석한 도이다.1 is a diagram morphologically analyzing immortalized kidney cells derived from mice prepared according to an embodiment of the present invention.
2 is an in vitro proliferation analysis of immortalized kidney cells prepared according to an embodiment of the present invention.
Figure 3 is a diagram analyzing the expression of kidney-specific genes in immortalized kidney cells prepared according to an embodiment of the present invention.
4 and 5 are diagrams for analyzing the expression of kidney-specific proteins in immortalized kidney cells prepared according to an embodiment of the present invention.
6 is a diagram for analyzing the protein uptake capacity of immortalized kidney cells prepared according to an embodiment of the present invention.
7 is a diagram analyzing the reactivity of immortalized kidney cells prepared according to an embodiment of the present invention to a neotoxic drug.
8 is a diagram analyzing the gamma-GT activity of immortalized kidney cells prepared according to an embodiment of the present invention.
9 is a diagram showing the analysis of kidney-specific gene expression of kidney cells prepared by 2D culture and rotational culture of immortalized kidney cells prepared according to an embodiment of the present invention.
10 is a view of the spheroid production step (A), micrograph (B) and culture method (C) of the formed spheroid according to an embodiment of the present invention.
11 is a diagram analyzing the structure and kidney-specific protein expression of kidney spheroids prepared according to an embodiment of the present invention.
12 is a diagram analyzing the renal specific gene expression of renal spheroids prepared according to an embodiment of the present invention.
13 is a diagram analyzing the expression of a kidney-specific transporter gene of a kidney spheroid prepared according to an embodiment of the present invention.
14 is a diagram analyzing the reactivity of renal spheroids prepared according to an embodiment of the present invention to renal-related hormones.
15 is a diagram analyzing the gamma-GT activity of renal spheroids prepared according to an embodiment of the present invention.
16 is a diagram for analyzing the protein absorption capacity of kidney spheroids prepared according to an embodiment of the present invention.
17 is a diagram comparing cell death of nephrotoxic drugs of renal spheroids prepared according to an embodiment of the present invention.
18 is a diagram showing nephrotoxicity of renal spheroids prepared according to an embodiment of the present invention.
19 is a diagram showing the analysis of related gene expression for a nephrotoxic drug of renal spheroids prepared according to one embodiment.
20 is a diagram showing the analysis of related protein expression for a nephrotoxic drug of renal spheroids prepared according to an embodiment.
FIG. 21 is a diagram for analyzing the relationship between renal spheroid renal toxicity drug and kidney-specific transporter function of a mouse-derived mouse prepared according to an embodiment.

이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 예시적으로 제공되었을 뿐, 본 발명의 범위가 실시예의 기재에 한정되지 않는다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through the following examples. However, the examples are provided by way of example only to illustrate the present invention, and the scope of the present invention is not limited to the description of the examples.

<실시예 1> 신장 유래 불멸화 신장 세포 제조<Example 1> Preparation of kidney-derived immortalized kidney cells

3 내지 5 주령 생쥐에서 분리한 신장을 잘게 잘라 2 mg/ml collagenase Ⅰ 용액에 넣어 37℃에서 30분 동안 혼합하였다.The kidneys isolated from 3 to 5 week old mice were cut finely and put into 2 mg / ml collagenase I solution and mixed at 37 ° C for 30 minutes.

상기 혼합액을 40 μM strainer (100 μm)에 여과하여 조직을 제외한 단일 세포(일차세포, primary cells)만을 분리하였다. 분리된 신장 세포를 10%(v/v) 우태아 혈청(FBS, RMBIO, Missoula, MT, USA) 및 20 ng/ml 표피생장인자(epidermal growth factor; EGF)가 첨가된 DMEM/F-12(Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)에 5% CO2 및 37℃에서 배양하였다.The mixed solution was filtered on a 40 μM strainer (100 μm) to isolate only single cells (primary cells) excluding tissue. The isolated kidney cells were supplemented with 10% (v / v) fetal bovine serum (FBS, RMBIO, Missoula, MT, USA) and DMEM / F-12 with 20 ng / ml epidermal growth factor (EGF). Dulbecco's Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12) was cultured at 5% CO 2 and 37 ° C.

배양 2 내지 6 시간 후에 배양액에 hTERT 및 SV40 lentivirus를 4μg/ml 농도의 polybrene과 함께 배양액에 첨가하여, 불멸화 신장 세포(immortalized cells)를 제조하였다. 제조된 볼멸화 신장 세포는 80% 컨플루언스(confluence)에서 0.1% 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산을 사용하여 분리 계대 배양하였다.After 2 to 6 hours of culture, hTERT and SV40 lentivirus were added to the culture solution together with polybrene at a concentration of 4 μg / ml to prepare immortalized cells. The prepared apoptotic kidney cells were cultured in a separate passage using 0.1% trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid at 80% confluence.

각각의 계대 배양으로 배가되는 세포수는 2X=NH/NI에 의해 계산되었다. NI는 접종된 세포의 수이고, NH는 합류점(> 80 %)에서 수확된 세포의 수이고, X는 세포의 배증이다. 계산된 모 집단의 배증을 이전 모집단 배증에 더하여 누적 모집단 배증 수준을 계산하였다. The number of cells doubling with each passage culture was calculated by 2X = NH / NI. NI is the number of inoculated cells, NH is the number of cells harvested at the confluence (> 80%), and X is the doubling of the cells. The cumulative population doubling level was calculated by adding the calculated parent population doubling to the previous population doubling.

모든 실험 프로토콜은 한국 생명공학연구원(KRIBB)의 기관 윤리위원회의 승인을 받았다.All experimental protocols were approved by the Institutional Ethics Committee of the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB).

<실험예 1> 불멸화 신장 세포의 형태학적 특징<Experimental Example 1> Morphological characteristics of immortalized kidney cells

1-1. 불멸화 신장 세포의 형태1-1. Morphology of immortalized kidney cells

상기 실시예 1에서 제조된 생쥐 유래의 불멸화 신장 세포를 체외에서 계대배양하면서 그 형태를 현미경으로 관찰하였다. 또한, 크리스탈 바이올렛으로 세포를 염색하여 증식된 세포의 수를 일차 세포와 비교하였다.The morphology was observed under a microscope while passivating immortalized kidney cells derived from mice prepared in Example 1 in vitro. In addition, the number of cells proliferated by staining the cells with crystal violet was compared with the primary cells.

일차 및 불멸화 세포(1×103)를 6-well 배양 접시에 있는 커버슬립에 배양하였다. 세포 배양 7 일째, 세포를 메탄올로 고정시키고 실온에서 5 분 동안 0.005 % 크리스탈 바이올렛 염색 용액으로 염색하였다.Primary and immortalized cells (1 × 10 3 ) were cultured on coverslips in a 6-well culture dish. On day 7 of cell culture, cells were fixed with methanol and stained with 0.005% crystal violet staining solution for 5 min at room temperature.

도 1 및 도 2를 참고하면, 일차세포, 생쥐 유래의 불멸화 신장 세포는 체외에서도 신장 상피세포와 유사한 모양을 유지하며 증식하는 것을 확인하였다.1 and 2, it was confirmed that primary cells and mouse-derived immortalized kidney cells proliferate while maintaining a similar shape to renal epithelial cells in vitro.

상기의 결과는 불멸화된 신장 세포가 세대를 거듭나도 체외 증식이 가능하다는 것을 보여주며, 상기 불멸화된 신장 세포를 이용한 스페로이드 제조 가능성을 시사한다.The above results show that the immortalized kidney cells can proliferate in vitro even after generation, suggesting the possibility of spheroid production using the immortalized kidney cells.

<실험예 2> 불멸화 신장 세포의 신장 특이성 및 기능성 확인<Experimental Example 2> Confirmation of kidney specificity and functionality of immortalized kidney cells

불멸화 신장 세포의 신장 특이성을 평가하기 위해 신장 특이 유전자 및 단백질의 발현을 확인하였다.To evaluate the renal specificity of immortalized renal cells, expression of renal specific genes and proteins was confirmed.

또한, 불멸화 신장 세포의 신장 기능성을 평가하기 위해 신장 특이적 기능인 단백질(Dextran-488) 흡수, 신독성 약물인 시스플라틴에 대한 반응 및 gamma-GT의 활성도를 확인하였다. In addition, in order to evaluate renal function of immortalized renal cells, absorption of a protein (Dextran-488), which is a kidney-specific function, response to cisplatin, a neotoxic drug, and activity of gamma-GT were confirmed.

2-1. 불멸화 신장 세포의 신장 특이적 유전자 발현2-1. Kidney-specific gene expression in immortalized kidney cells

신장 세포 특이적으로 발현하는 유전자인 NCC, NKCC2, SGLT1, AQP1, AQP2, Podocin 및 Nephrin을 발현 정도를 qRT-PCR을 이용하여 측정하였다(도 3).The expression levels of NCC, NKCC2, SGLT1, AQP1, AQP2, Podocin, and Nephrin, genes specifically expressed in kidney cells, were measured using qRT-PCR (FIG. 3).

구체적으로, RNAeasy Mini kit를 사용하여 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA을 이용하여 cDNA 보관 키트(Life Technologies, Gaithersburg, MD)를 사용하여 1 μg을 역전사하였다. qPCR을 제조사의 지침(Applied Biosystems, Waltham, MA, USA) 및 Agilent Technologies)에 따라 SYBRGreen Master Mix를 사용하여 각 cDNA의 양을 측정하였다. 데이터를 표준화하였고, ΔΔCT 방법을 사용하여 각 유전자의 발현량을 분석하였다. 사용된 프라이머 서열은 표 1과 같다.Specifically, RNA was isolated using an RNAeasy Mini kit. Using isolated RNA, 1 μg was reverse transcribed using the cDNA storage kit (Life Technologies, Gaithersburg, MD). qPCR was measured for the amount of each cDNA using SYBRGreen Master Mix according to the manufacturer's instructions (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA) and Agilent Technologies). Data were normalized and the expression level of each gene was analyzed using the ΔΔCT method. The primer sequences used are shown in Table 1.

유전자gene 프라이머 서열 (정방향)Primer sequence (forward) 프라이머 서열 (역방향)Primer sequence (reverse) NCCNCC CCTCAAGCAGGAAGGTAGCC
(서열번호 1)CCTCAAGCAGGAAGGTAGCC
(SEQ ID NO: 1) TCACTGTTGGTGCCTGTCTC
(서열번호 2)TCACTGTTGGTGCCTGTCTC
(SEQ ID NO: 2) NKCC2NKCC2 GAGAAGCGGGAATTGGTCTTG
(서열번호 3)GAGAAGCGGGAATTGGTCTTG
(SEQ ID NO: 3) CTCCACCTCCACGAACAAAC
(서열번호 4)CTCCACCTCCACGAACAAAC
(SEQ ID NO: 4) SGLT1SGLT1 CTGCAGACATCTTCTCCGGG
(서열번호 5)CTGCAGACATCTTCTCCGGG
(SEQ ID NO: 5) GGCAGTGATTGCTAGCAGGA (서열번호 6)GGCAGTGATTGCTAGCAGGA (SEQ ID NO: 6) AQP1AQP1 GGCCTTTGGTTTGAGCATCG
(서열번호 7)GGCCTTTGGTTTGAGCATCG
(SEQ ID NO: 7) CCGGAGGATGCTGATCTGAC
(서열번호 8)CCGGAGGATGCTGATCTGAC
(SEQ ID NO: 8) AQP2AQP2 TTCGAGCTGCCTTCTACGTG
(서열번호 9)TTCGAGCTGCCTTCTACGTG
(SEQ ID NO: 9) GGCTGTTGCATTGTTGTGGA
(서열번호 10)GGCTGTTGCATTGTTGTGGA
(SEQ ID NO: 10) PodocinPodocin CCGCTGCATTGAGAATGGAC
(서열번호 11)CCGCTGCATTGAGAATGGAC
(SEQ ID NO: 11) CGGCCTTTGCCTTCTTGTCA
(서열번호 12)CGGCCTTTGCCTTCTTGTCA
(SEQ ID NO: 12) NephrinNephrin CGAACTGATGCATGCAAGAAGG
(서열번호 13)CGAACTGATGCATGCAAGAAGG
(SEQ ID NO: 13) TACACTAGTGCGTGGTCTCT
(서열번호 14)TACACTAGTGCGTGGTCTCT
(SEQ ID NO: 14)

도 3을 참고하면, 생쥐 유래의 불멸화 신장 세포에서 신장 세포 특이적으로 발현하는 유전자인 NCC, NKCC2, SGLT1, AQP1, AQP2, Podocin 및 Nephrin의 발현을 확인하였다.Referring to FIG. 3, expression of NCC, NKCC2, SGLT1, AQP1, AQP2, Podocin, and Nephrin, genes specifically expressed in kidney cells in immortalized kidney cells derived from mice, was confirmed.

상기 결과는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 불멸화 신장 세포가 신장 특이적 표현형을 유지하고 있음을 보여준다.The above results show that the immortalized kidney cells prepared according to one embodiment of the present invention maintain a kidney specific phenotype.

2-2.2-2. 불멸화 신장 세포의 신장 특이적 단백질 발현Kidney-specific protein expression in immortalized kidney cells

신장 세포 특이적으로 발현하는 단백질인 LTL, PNA, AQP2 및 Nephrin의 발현 정도를 확인하기 위해 슬라이드를 제작하여 각각의 단백질을 염색하여 발현 정도를 확인하고, 정량하였다(도 4 및 도 5).A slide was prepared to confirm the expression level of LTL, PNA, AQP2 and Nephrin, proteins specifically expressed in kidney cells, and each protein was stained to confirm the expression level and quantified (FIGS. 4 and 5).

구체적으로, 세포를 8-well slide chamber 에서 배양한 후 4% 파라포름알데히드 가 함유된 PBS 용액을 이용하여 4 ℃에서 2 시간 동안 고정하였다. 고정 후 PBS로 5분간 3번 세척하였다. 그리고 실온에서 10분 동안 0.5% Triton X-100가 함유된 PBS를 처리 후 세척한 다음 endogenous peroxidase 의 활성을 제거하기 위하여 3% hydrogen peroxide로 15분간 반응시킨 후 세척하였다. 2% 염소 혈청을 함유한 PBS에서 실온으로 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 LTL, PNA, AQP2, Nephrin 항체를 4℃에서 17시간 동안 처리 후, 세척하였다. 이후 biotinylated goat anti-mouse IgG와 anti-rabbit IgG를 실온에서 30분간 처리하였다. 3번 세척한 다음, horseradish peroxidaseconjugated streptavidin을 30분간 처리하였다. 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB) 용액으로 발색하였다. 발색된 세포는 PBS로 세척하고 Mayer's Haematoxylin으로 대조 염색한 후 광학 현미경 하에서 관찰하였다. Specifically, the cells were cultured in an 8-well slide chamber and fixed at 4 ° C for 2 hours using a PBS solution containing 4% paraformaldehyde. After fixation, it was washed 3 times with PBS for 5 minutes. Then, PBS containing 0.5% Triton X-100 was treated for 10 minutes at room temperature, washed, and then reacted with 3% hydrogen peroxide for 15 minutes to remove the activity of endogenous peroxidase, followed by washing. The mixture was reacted for 1 hour at room temperature in PBS containing 2% goat serum. Then, LTL, PNA, AQP2, and Nephrin antibodies were treated at 4 ° C. for 17 hours, and then washed. Subsequently, biotinylated goat anti-mouse IgG and anti-rabbit IgG were treated for 30 minutes at room temperature. After washing 3 times, horseradish peroxidaseconjugated streptavidin was treated for 30 minutes. It was developed with 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) solution. The developed cells were washed with PBS, control stained with Mayer's Haematoxylin, and observed under an optical microscope.

도 4 및 5를 참고하면, 불멸화 신장 세포를 체외 계대배양한 후에도 신장 특이적 단백질의 발현이 유지되는 것을 보여준다.Referring to Figures 4 and 5, it shows that the expression of kidney-specific protein is maintained even after passage of immortalized kidney cells in vitro.

2-3.2-3. 불멸화 신장 세포의 단백질 흡수능Protein absorption capacity of immortalized kidney cells

불멸화 신장 세포의 단백질 흡수능 측정을 위해 알부민 흡수능을 측정하였다. Fluorescein으로 표지된 알부민을 4 또는 37℃에서 6시간 동안 세포와 함께 배양하였다. 세포를 빙냉 링거 용액(ice cold Ringers Solution)(pH 7.3)으로 8회 세척하고 1x MOPS 중 0.1 % Triton X-100로 용해시켰다. 형광은 485/520 nm에서 측정되었다(도 6).Albumin absorption capacity was measured to measure protein absorption capacity of immortalized kidney cells. Albumin labeled with fluorescein was incubated with cells at 4 or 37 ° C. for 6 hours. Cells were washed 8 times with ice cold Ringers Solution (pH 7.3) and lysed with 0.1% Triton X-100 in 1x MOPS. Fluorescence was measured at 485/520 nm (Figure 6).

2-4. 불멸화 신장 세포의 신독성 약물에 대한 반응2-4. Reaction of immortalized kidney cells to nephrotoxic drugs

불멸화 신장 세포의 신독성 약물에 대한 반응성 측정을 위해, 시스플라틴 또는 시클로스포린(cyclosporine) A를 신장 스페로이드에 처리한 후, 사멸 세포의 수를 비교하였다.To measure the reactivity of immortalized renal cells to the nephrotoxic drug, cisplatin or cyclosporine A was treated with renal spheroids, and the number of dead cells was compared.

세포에 각각의 약물을 처리한 후, two-color live/dead cell assay kit(Invitrogen, Waltham, MA, USA)를 이용하여 세포 생존력을 측정하였다. After treating each drug with cells, cell viability was measured using a two-color live / dead cell assay kit (Invitrogen, Waltham, MA, USA).

Calcein-AM(2 μM)과 ethdium homodimer-1(4 μM)을 세포에 첨가하고 37℃에서 10% CO2로 15 분간 배양하였다. PBS로 세척한 후, 형광 현미경(Panasonic, Kadoma, Osaka, Japan) 하에서 세포를 시각화하였다. Calcein과 ethidium homodimer-1은 각각 녹색(485±10 nm) 및 적색(530±12.5 nm) 형광 필터를 사용하여 나타냈다(도 7).Calcein-AM (2 μM) and ethdium homodimer-1 (4 μM) were added to the cells and incubated at 37 ° C. with 10% CO 2 for 15 minutes. After washing with PBS, cells were visualized under a fluorescence microscope (Panasonic, Kadoma, Osaka, Japan). Calcein and ethidium homodimer-1 were expressed using green (485 ± 10 nm) and red (530 ± 12.5 nm) fluorescence filters, respectively (FIG. 7).

2-5. 불멸화 신장 세포의 gamma-GT 활성도2-5. Gamma-GT activity of immortalized kidney cells

불멸화 신장 세포의 GGT(gamma-GT) 활성 측정을 위해, GGT 활성 발색 분석 키트(BioVision, Milpitas, CA, USA)를 사용하여 gamma glutamyl-p-nitroanilide로부터 para-nitroanilide의 방출을 측정함으로써 측정하였다.For the measurement of GGT (gamma-GT) activity of immortalized kidney cells, it was measured by measuring the release of para-nitroanilide from gamma glutamyl-p-nitroanilide using a GGT activity chromogenic assay kit (BioVision, Milpitas, CA, USA).

세포를 200 μL의 빙냉 GGT 분석 완충액에서 균질화하고 10 μL 분취액을 90 μL의 GGT 기질 용액과 합하고 5 시간 배양을 위해 분석 플레이트에 첨가하였다. 418 nm에서의 흡광도 변화는 37 ℃에서 30 분마다 측정되었다(도 8).Cells were homogenized in 200 μL of ice cold GGT assay buffer and 10 μL aliquots were combined with 90 μL of GGT substrate solution and added to assay plates for 5 hour incubation. The change in absorbance at 418 nm was measured every 30 minutes at 37 ° C (Figure 8).

상기 결과는 실시예 1에서 제조된 불멸화 신장 세포에 화학적 및 기능적으로 신장 특이성이 있음을 보여주는 것으로, 상기 불멸화 신장 세포를 이용한 신독성 측정용 신장 스페로이드 제조가 가능함을 시사한다.The results show that the immortalized kidney cells prepared in Example 1 have chemical and functional renal specificity, suggesting that renal spheroids for renal toxicity measurement using the immortalized kidney cells can be prepared.

<실시예 2> 불멸화 신장 세포의 3D 세포 배양<Example 2> 3D cell culture of immortalized kidney cells

상기 실시예 1에서 제조된 불멸화 신장 세포 1 X 104 개를 세포외기질 및 매트리겔(2:1 중량비)로 혼합한 겔 매트릭스에 혼합한 후, 50 μl씩 현적 배양(hanging-drop culture)을 수행하여 겔을 굳혔다.After mixing 1 x 10 4 immortalized kidney cells prepared in Example 1 into a gel matrix mixed with an extracellular matrix and a matrigel (2: 1 weight ratio), 50 μl of the incubation culture (hanging-drop culture) was performed. Performed to harden the gel.

현적 후, 겔을 PBS가 채워진 접시에 놓고 3 내지 6시간 동안 굳힌 후, 세포를 10 % FBS, 1X가 보충된 DMEM/F12로 채워진 스페로이드 형성 유닛(spheroid forming unit; SFU)으로 계대하였다. SFU는 대한민국 공개특허 제10-2017-0034241호에 따라 제조된, 필터가 장착된 캡이 있는 코니칼 튜브(cornical tube)이다. 1x의 ITS(10ug/mL insulin-5.5ug/mL transferrin-67ng/mL selenium), 20ng/mL 표피생장인자(epidermal growth factor; EGF), 100nM dexamethasone, 5μM all-trans retinoic acid를 6 시간 동안 처리 하고, 2 내지 5 일 동안 배양하였다(도 9).After incubation, the gel was placed on a plate filled with PBS and allowed to harden for 3 to 6 hours, and then the cells were passaged with a spheroid forming unit (SFU) filled with DMEM / F12 supplemented with 10% FBS, 1X. SFU is a conical tube with a cap equipped with a filter, manufactured according to Korean Patent Publication No. 10-2017-0034241. 1x ITS (10ug / mL insulin-5.5ug / mL transferrin-67ng / mL selenium), 20ng / mL epidermal growth factor (EGF), 100nM dexamethasone, 5μM all-trans retinoic acid was treated for 6 hours , Incubated for 2 to 5 days (Fig. 9).

3D 배양에 따른 불멸화 신장 세포의 신장 특징을 평가하기 위해, 신장 특이적 유전자의 발현량을 2D 배양한 불멸화 신장세포와 비교하였다.To evaluate the kidney characteristics of the immortalized kidney cells according to 3D culture, the expression level of the kidney-specific gene was compared with the immortalized kidney cells cultured in 2D.

하기 표 2의 프라이머를 이용하여, 실험예 1과 동일한 방법으로 신장 세포 특이적으로 발현하는 유전자인 NCC, NKCC2, SGLT1, AQP1, AQP2, Podocin, Nephrin 등의 발현을 확인하였다(도 9). Using the primers of Table 2 below, expressions of NCC, NKCC2, SGLT1, AQP1, AQP2, Podocin, Nephrin, etc., genes specifically expressed in kidney cells were confirmed in the same manner as in Experimental Example 1 (FIG. 9).

프라이머의 발현량은 2D 배양한 불멸화 신장 세포의 발현량을 1로 설정하고 그에 비해 3D 배양한 불멸화 신장 세포의 mRNA의 양을 측정하였다.For the expression level of the primer, the expression level of the immortalized kidney cells cultured in 2D was set to 1, and the amount of mRNA of the immortalized kidney cells cultured in 3D was measured.

유전자gene 프라이머 서열 (정방향)Primer sequence (forward) 프라이머 서열 (역방향)Primer sequence (reverse) Oct1Oct1 GACGCCTGGAAAGTGGACC
(서열번호 15)GACGCCTGGAAAGTGGACC
(SEQ ID NO: 15) GCAACATGGATGTATAGTCTGG
(서열번호 16)GCAACATGGATGTATAGTCTGG
(SEQ ID NO: 16) Oct2Oct2 CCAGTGCATGAGGTATGAGGT
(서열번호 17)CCAGTGCATGAGGTATGAGGT
(SEQ ID NO: 17) CTGAAACAGGTCCAGCATCCA
(서열번호 18)CTGAAACAGGTCCAGCATCCA
(SEQ ID NO: 18) Oat1Oat1
CTGATGGCTTCCCACAACAC
(서열번호 19)CTGATGGCTTCCCACAACAC
(SEQ ID NO: 19) GTCCTTGCTTGTCCAGGGG
(서열번호 20)GTCCTTGCTTGTCCAGGGG
(SEQ ID NO: 20) Oat2Oat2
CAACTGCGGAATCTGGTGCT
(서열번호 21)CAACTGCGGAATCTGGTGCT
(SEQ ID NO: 21) ATCAGGCAGGGCACAATGATG
(서열번호 22)ATCAGGCAGGGCACAATGATG
(SEQ ID NO: 22) Oat3Oat3 ATGACCTTCTCCGAGATTCTGG
(서열번호 23)ATGACCTTCTCCGAGATTCTGG
(SEQ ID NO: 23) GTGGTTGGCTATTCCGAGGAT
(서열번호 24)GTGGTTGGCTATTCCGAGGAT
(SEQ ID NO: 24) Ent2Ent2 TCTCAGGCTCCAACTCAGGA
(서열번호 25)TCTCAGGCTCCAACTCAGGA
(SEQ ID NO: 25) CCGTCAGCCAGATCTTCCG
(서열번호 26)CCGTCAGCCAGATCTTCCG
(SEQ ID NO: 26) Oatp4c1Oatp4c1 AATCAGAATGGGGGTTCGCA
(서열번호 27)AATCAGAATGGGGGTTCGCA
(SEQ ID NO: 27) GAGACACTGGGGGTGAAAGC
(서열번호 28)GAGACACTGGGGGTGAAAGC
(SEQ ID NO: 28) Mrp1Mrp1 GCACCTATGCCAACGCTGAG
(서열번호 29)GCACCTATGCCAACGCTGAG
(SEQ ID NO: 29) AGACGAGTTGCTGAGATGCC
(서열번호 30)AGACGAGTTGCTGAGATGCC
(SEQ ID NO: 30) Pept1Pept1 CCGGCACACCCTTCTAGTG
(서열번호 31)CCGGCACACCCTTCTAGTG
(SEQ ID NO: 31) TGGCGTTGTGACTGGTGAC
(서열번호 32)TGGCGTTGTGACTGGTGAC
(SEQ ID NO: 32) Pept2Pept2 AAAGCGACAACATTGGCTAGA
(서열번호 33)AAAGCGACAACATTGGCTAGA
(SEQ ID NO: 33) AAATCCCAAATCGCCATCCAT
(서열번호 34)AAATCCCAAATCGCCATCCAT
(SEQ ID NO: 34) Urat1Urat1 CGATGTTCTTCTGGCCGTCT
(서열번호 35)CGATGTTCTTCTGGCCGTCT
(SEQ ID NO: 35) TGGTCGTAAACCCAGCCATC
(서열번호 36)TGGTCGTAAACCCAGCCATC
(SEQ ID NO: 36) Ent1Ent1 CGGGTTTGAAAGCGCTCG
(서열번호 37)CGGGTTTGAAAGCGCTCG
(SEQ ID NO: 37) GGTGACTGGTTGTCATGGCT
(서열번호 38)GGTGACTGGTTGTCATGGCT
(SEQ ID NO: 38) Mate1Mate1 CATGGAACGCACGGAGGAGT
(서열번호 39)CATGGAACGCACGGAGGAGT
(SEQ ID NO: 39) CATCATCAGCTGGGCCAAGAA
(서열번호 40)CATCATCAGCTGGGCCAAGAA
(SEQ ID NO: 40) p-Gpp-Gp GGACTTTGCAGAGGAAACCG
(서열번호 41)GGACTTTGCAGAGGAAACCG
(SEQ ID NO: 41) TGTCCAGCCAACCTGCATAA
(서열번호 42)TGTCCAGCCAACCTGCATAA
(SEQ ID NO: 42) Mrp2Mrp2 CTGGAAATCACGATGGACGA
(서열번호 43)CTGGAAATCACGATGGACGA
(SEQ ID NO: 43) GAAAGCCCAAGGGAATCCACA
(서열번호 44)GAAAGCCCAAGGGAATCCACA
(SEQ ID NO: 44)

도 9를 참고하면, 현적 배양 후 회전 배양에 따라 제조된 3D 신장 세포의 신장 특이적 유전자 발현량은 2D 배양된 신장 세포에 비해 현저히 우수함을 알 수 있다.Referring to FIG. 9, it can be seen that the kidney-specific gene expression level of 3D kidney cells prepared according to rotational culture after culturing is significantly superior to that of 2D cultured kidney cells.

다만, 단순히 현적 배양 후 회전 배양을 실시한 신장 세포는 신장 특이적 유전자의 발현량은 증가하였으나, 신장의 약물 대사에서 중요한 역할을 수행하는 수송체 유전자의 발현은 증가하지 않았다. 이는 단순히 현적 배양후 회전배양으로 제조된 불멸화 신장 세포로는 신장 특이성이 나타나더라도 신독성 검사에 이용하기엔 부족하다는 것을 의미한다.However, the expression level of the kidney-specific gene was increased in the kidney cells that were simply cultured after the cultivation, but the expression of the transporter gene, which plays an important role in drug metabolism of the kidney, was not increased. This means that the immortalized kidney cells prepared by rotational culture after culturing in culture are insufficient to be used for the nephrotoxicity test even if renal specificity is exhibited.

<실시예 3> 신장 스페로이드 제작<Example 3> kidney spheroid production

신독성 검사에 이용할 수 있는 신장 스페로이드를 제조하기 위해, 본 발명의 발명자들은 실시예 2의 배양 방법을 변형하여 신장 스페로이드를 제작하였다(도 10).In order to prepare a renal spheroid that can be used for the nephrotoxicity test, the inventors of the present invention modified the culture method of Example 2 to produce a renal spheroid (FIG. 10).

상기 실시예 1의 불멸화 신장 세포 1 X 106 개를 세포외기질 및 매트리겔(2:1 중량비)로 혼합한 겔 매트릭스에 혼합한 후 50 μl씩 현적 배양(hanging-drop culture)을 수행하여 gel을 굳혔다.After mixing 1 x 10 6 immortalized kidney cells of Example 1 into a gel matrix mixed with an extracellular matrix and a matrigel (2: 1 weight ratio), gel was performed by performing 50 μl of hanging-drop culture. Hardened.

현적 후, 겔을 PBS가 채워진 접시에 놓고 3 내지 6시간 동안 굳힌 후, 세포를 10 % FBS, 1X가 보충된 DMEM/F12로 채워진 스페로이드 형성 유닛(spheroid forming unit; SFU)으로 배양하였다. SFU는 대한민국 공개특허 제10-2017-0034241호에 따라 제조된, 필터가 장착된 캡이 있는 코니칼 튜브(cornical tube)이다. 배양 2일 째에 10% FBS가 첨가된 DMEM/F12 배양액에 1X ITS(10ug/mL insulin-5.5ug/mL transferrin-67ng/mL selenium), 20ng/mL 표피생장인자(epidermal growth factor; EGF), 100nM 덱사메타손(dexamethasone), 20nM 비타민 D3, 5μM all-trans retinoic acid를 6 시간 동안 처리 한 후, all-trans retinoic acid를 제거한 동 배지에서 2 내지 5 일 동안 배양하였다.After suspension, the gel was placed on a plate filled with PBS and allowed to harden for 3 to 6 hours, and then the cells were cultured with a spheroid forming unit (SFU) filled with DMEM / F12 supplemented with 10% FBS, 1X. SFU is a conical tube with a cap equipped with a filter, manufactured according to Korean Patent Publication No. 10-2017-0034241. 1X ITS (10ug / mL insulin-5.5ug / mL transferrin-67ng / mL selenium), 20ng / mL epidermal growth factor (EGF) in DMEM / F12 culture with 10% FBS added on the second day of culture 100 nM dexamethasone (dexamethasone), 20 nM vitamin D3, 5 μM all-trans retinoic acid was treated for 6 hours, and then cultured for 2 to 5 days in the same medium from which all-trans retinoic acid was removed.

레티노이드산은 배양 2일째에 배양액에 추가하였다. 레티노이드산 처리 시간은 2시간에서 5일일 수 있으며, 배양 2일째부터 5일재까지 각각 또는 지속적으로 처리할 수 있다. 배양 2일째에 6시간 처리하고 제외하는 조건이 가장 좋은 구조적 성숙 및 유전자와 단백질의 발현 양상을 보였으며 배양 2일째부터 지속적으로 처리하는 경우 세포의 생장이 감소하고 세포의 사멸이 증가하는 것으로 보였다. Retinoid acid was added to the culture on the second day of culture. The retinoid acid treatment time can be from 2 hours to 5 days, and can be treated individually or continuously from the second day to the fifth day of culture. On the second day of culture, treatment and exclusion for 6 hours showed the best structural maturation and expression patterns of genes and proteins, and when continuously treated from the second day of culture, cell growth decreased and cell death increased.

3 내지 5일 회전 배양한 후, 제조된 신장 스페로이드의 기능성을 분석하였다.After incubation for 3 to 5 days, the functionality of the prepared kidney spheroid was analyzed.

상기 실시예 3의 스페로이드 제조 방법은 도 10의 A에 도식화되었으며, 도 10을 참고하면, 실시예 3에 의해 제조된 스페로이드는 신장 오가노이드와 유사한 형태로 제조되었다.The spheroid manufacturing method of Example 3 is schematically illustrated in A of FIG. 10, and referring to FIG. 10, the spheroid prepared by Example 3 was prepared in a form similar to that of kidney organoids.

<실험예 3> 신장 스페로이드의 신장 특이성 및 기능성 확인<Experimental Example 3> Confirmation of renal specificity and functionality of renal spheroid

상기 제조된 신장 스페로이드의 신장 특이성을 평가하기 위해 신장 특이적인 단백질, 유전자 및 수송체 단백질의 발현을 확인하였다In order to evaluate the renal specificity of the prepared renal spheroid, the expression of renal specific proteins, genes and transporter proteins was confirmed.

또한, 신장 스페로이드의 기능성을 확인하기 평가하기 위해, 신장 특이적 수송체 유전자의 발현, 신장 관련 호르몬에 대한 반응성, gamma-GT 활성도 및 신독성 약물인 시스플라틴 및 시클로스포린 A에 대한 반응을 확인하였다.In addition, in order to evaluate the functionality of renal spheroids, expression of renal specific transporter genes, reactivity to renal-related hormones, gamma-GT activity, and reactions to the neotoxic drugs cisplatin and cyclosporin A were confirmed. .

3-1. 신장 스페로이드의 신장 특이적 단백질 발현3-1. Kidney-specific protein expression in kidney spheroids

신장 스페로이드의 신장 특이적 단백질의 발현을 확인하기 위해, LTL, PNA, AQP2, Podocin 및 Nephrin을 염색한 후, 전자 현미경으로 확인하였고, H&E 염색을 통해 신장 특이적 구조를 확인하였다(도 11).In order to confirm the expression of the kidney-specific protein of the kidney spheroid, LTL, PNA, AQP2, Podocin and Nephrin were stained and confirmed by electron microscopy, and kidney-specific structure was confirmed through H & E staining (FIG. 11). .

도 11을 참고하면, 신장 스페로이드에서 신장 특이적 성숙된 구조가 확인되었으며, LTL, PNA, AQP2, Podocin 및 Nephrin의 발현이 확인되었다.Referring to FIG. 11, a kidney-specific matured structure was confirmed in a kidney spheroid, and expression of LTL, PNA, AQP2, Podocin, and Nephrin was confirmed.

상기 결과는 본 발명에 따라 제조된 신장 스페로이드가 구조적/기능적으로 성숙되었음을 시사한다.The above results suggest that the renal spheroids prepared according to the present invention are structurally / functionally mature.

3-2. 신장 스페로이드의 신장 특이적 유전자 발현3-2. Kidney-specific gene expression in kidney spheroids

신장 스페로이드의 신장 특이적 유전자의 발현을 확인하기 위해, 신장 세포 특이적으로 발현하는 유전자인 NCC, NKCC2, SGLT1, AQP1, AQP2, Podocin 및 Nephrin의 발현을 확인하였다(도 12).In order to confirm the expression of the renal spheroid renal specific gene, the expression of renal cell specific expressing genes NCC, NKCC2, SGLT1, AQP1, AQP2, Podocin and Nephrin was confirmed (FIG. 12).

도 12을 참고하면, 신장 스페로이드에서 신장 특이적 유전자인 NCC, NKCC2, SGLT1, AQP1, AQP2, Podocin 및 Nephrin의 발현이 2D 배양한 신장 세포에 비해 높은 수준으로 발현되었다.Referring to FIG. 12, the expression of the kidney specific genes NCC, NKCC2, SGLT1, AQP1, AQP2, Podocin, and Nephrin in the kidney spheroid was expressed at a higher level than 2D cultured kidney cells.

상기 결과는 본 발명에 따라 제조된 신장 스페로이드는 2D 배양한 신장 세포에 비해 신장 특이성이 우수하다는 것을 시사한다.The above results suggest that kidney spheroids prepared according to the present invention have superior kidney specificity compared to 2D cultured kidney cells.

3-3. 신장 스페로이드의 신장 특이적 수송체 유전자 발현3-3. Kidney-specific transporter gene expression in kidney spheroids

신장 스페로이드의 신장 특이적 수송체 유전자의 발현을 확인하기 위해, 상기의 프라이머 세트를 이용하여 수송체 유전자의 발현을 측정하였다(도 13).To confirm the expression of the kidney-specific transporter gene of the renal spheroid, the expression of the transporter gene was measured using the primer set described above (FIG. 13).

도 13을 참고하면, 신장 스페로이드에서 신장 특이적 수송체 유전자의 발현이 2D 배양한 신장 세포에 비해 높은 수준으로 발현되었다.Referring to FIG. 13, the expression of the kidney-specific transporter gene in the kidney spheroid was expressed at a higher level than the kidney cells cultured in 2D.

상기 결과는 본 발명에 따라 제조된 신장 스페로이드는 2D 배양한 신장 세포에 비해 신장 수송체 단백질의 발현이 우수함을 의미하며, 신장 기능성이 향상되었다는 것을 시사한다.The above results indicate that the renal spheroids prepared according to the present invention have superior renal transporter protein expression compared to 2D cultured kidney cells, and suggest that renal function is improved.

3-4. 신장 스페로이드의 신장 관련 호르몬에 대한 반응성 및 Gamma-GT 활성도3-4. Kidney Spheroid Reactivity to Kidney-Related Hormones and Gamma-GT Activity

신장 스페로이드의 신장 관련 호르몬에 대한 반응성 측정을 위해, 부갑상선 호르몬(PTH)에 대한 반응을 측정하였다. PTH는 Prospec(New Brunswick, NJ, USA)에서 입수하였다. 포스포디에스테라아제 억제제인 3-이소부틸-1-메틸잔틴 0.1 mM과 함께 밤새 인큐베이션 한 후, 세포를 100 nM PTH로 30분 동안 처리하였다. 세포 내 cAMP는 cAMP 직접 EIA 키트를 사용하여 측정하였다.To measure reactivity of renal spheroids to renal-related hormones, responses to parathyroid hormone (PTH) were measured. PTH was obtained from Prospec (New Brunswick, NJ, USA). After overnight incubation with 0.1 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine, a phosphodiesterase inhibitor, cells were treated with 100 nM PTH for 30 minutes. Intracellular cAMP was measured using the cAMP direct EIA kit.

Gamma-GT의 활성은 GGT 활성 발색 분석 키트(BioVision, Milpitas, CA, USA)를 사용하여 gamma glutamyl-p-nitroanilide로부터 para-nitroanilide의 방출을 측정함으로써 측정하였다.The activity of Gamma-GT was measured by measuring the release of para-nitroanilide from gamma glutamyl-p-nitroanilide using a GGT activity colorimetric assay kit (BioVision, Milpitas, CA, USA).

스페로이드를 200 μL의 빙냉 GGT 분석 완충액에서 균질화하고 10 μL 분취 액을 90 μL의 GGT 기질 용액과 합하고 5 시간 배양을 위해 분석 플레이트에 첨가하였다. 418 nm에서의 흡광도 변화는 37 ℃에서 30 분마다 측정되었다Spheroids were homogenized in 200 μL of ice cold GGT assay buffer, 10 μL aliquots were combined with 90 μL of GGT substrate solution and added to assay plates for 5 hour incubation. The change in absorbance at 418 nm was measured every 30 minutes at 37 ° C.

도 14 및 15를 참고하면, 신장 스페로이드에서 신장 관련 호르몬인 부갑상샘호르몬(parathyroid hormone; PTH)에 대한 반응성 및 gamma-GT 활성 2D 배양한 신장 세포에 비해 높은 수준이 확인되었다.Referring to FIGS. 14 and 15, renal stimulating hormone reactivity to parathyroid hormone (PTH) and gamma-GT activity in kidney spheroids was confirmed to be higher than 2D cultured kidney cells.

상기 결과는 본 발명에 따라 제조된 신장 스페로이드는 2D 배양한 신장 세포에 비해 부갑상샘호르몬에 대한 반응성이 현저히 우수함을 보여준다.The above results show that the renal spheroids prepared according to the present invention have remarkably superior reactivity to parathyroid hormone compared to 2D cultured kidney cells.

3-5. 신장 스페로이드의 단백질 흡수능3-5. Kidney spheroid protein absorption

신장 스페로이드의 단백질 흡수능 측정을 위해, 알부민 흡수능을 측정하였다. Fluorescein으로 표지된 알부민을 4 또는 37℃에서 6시간 동안 세포와 함께 배양하였다. 세포를 빙냉 링거 용액(ice cold Ringers Solution)(pH 7.3)으로 8회 세척하고 1x MOPS 중 0.1 % Triton X-100로 용해시켰다. 형광은 485/520 nm에서 측정되었다.To measure the protein absorption capacity of the kidney spheroid, albumin absorption capacity was measured. Albumin labeled with fluorescein was incubated with cells at 4 or 37 ° C. for 6 hours. Cells were washed 8 times with ice cold Ringers Solution (pH 7.3) and lysed with 0.1% Triton X-100 in 1x MOPS. Fluorescence was measured at 485/520 nm.

도 16를 참고하면, 신장 스페로이드에서 Dextran 및 Albumin 단백질의 흡수가 2D 배양한 신장 세포에 비해 현저히 우수함을 알 수 있다.Referring to Figure 16, it can be seen that the absorption of Dextran and Albumin protein in the renal spheroid is significantly superior to 2D cultured kidney cells.

상기 결과는 본 발명에 따라 제조된 신장 스페로이드는 2D 배양한 신장 세포에 비해 단백질 흡수능이 우수함을 의미하며, 이는 신장 기능성이 향상되었다는 것을 시사한다.The above results indicate that the kidney spheroid prepared according to the present invention has superior protein absorption ability compared to 2D cultured kidney cells, which suggests that the kidney function is improved.

<실험예 4> 신장 스페로이드의 신독성 약물 반응성<Experiment 4> renal spheroid renal toxicity drug reactivity

신장 스페로이드의 신독성 약물 반응성을 평가하기 위해, 실시예 3에서 제조된 신장 스페로이드에 시스플라틴 및 시클로스포린 A를 처리하고, 세포 사멸 정도, 관련 유전자 및 단백질의 발현 정도를 확인하였다.In order to evaluate renal spheroid renal toxicity drug reactivity, cisplatin and cyclosporin A were treated with the renal spheroid prepared in Example 3, and the degree of cell death and expression of related genes and proteins were confirmed.

4-1. 신독성 약물에 대한 사멸 신장 세포 계수4-1. Killing kidney cell count for nephrotoxic drugs

신독성 약물에 대한 신장 세포 사멸 정도를 비교하기 위해, 시스플라틴 및 시클로스포린 A 를 신장 스페로이드에 처리한 후, 사멸 세포의 수를 비교하였다.To compare the degree of renal cell death for the nephrotoxic drug, cisplatin and cyclosporin A were treated with renal spheroids, and then the number of dead cells was compared.

세포에 각각의 약물을 처리한 후, two-color live/dead cell assay kit(Invitrogen, Waltham, MA, USA)를 이용하여 세포 생존력을 측정하였다. After treating each drug with cells, cell viability was measured using a two-color live / dead cell assay kit (Invitrogen, Waltham, MA, USA).

Calcein-AM(2 μM)과 ethdium homodimer-1(4 μM)을 세포에 첨가하고 37℃에서 10% CO2로 15 분간 배양하였다. PBS로 세척한 후, 형광 현미경(Panasonic, Kadoma, Osaka, Japan) 하에서 세포를 시각화하였다. Calcein과 ethdium homodimer-1은 각각 녹색(485±10 nm) 및 적색(530±12.5 nm) 형광 필터를 사용하여 나타냈다.Calcein-AM (2 μM) and ethdium homodimer-1 (4 μM) were added to the cells and incubated at 37 ° C. with 10% CO 2 for 15 minutes. After washing with PBS, cells were visualized under a fluorescence microscope (Panasonic, Kadoma, Osaka, Japan). Calcein and ethdium homodimer-1 were expressed using green (485 ± 10 nm) and red (530 ± 12.5 nm) fluorescence filters, respectively.

도 17을 참고하면, 신장 스페로이드에 신독성 약물을 처리한 결과 신장 스페로이드의 세포가 사멸하였다. 또한, 도 18을 참고하면, 근위세뇨관의 마커인 LTL의 발현이 시스플라틴 농도 의존적으로 감소함을 알 수 있다.Referring to FIG. 17, as a result of treatment of the renal spheroid with a neotoxic drug, cells of the kidney spheroid were killed. In addition, referring to FIG. 18, it can be seen that the expression of LTL, a marker of the proximal tubule, is dependently decreased in cisplatin concentration.

상기 결과는 본 발명에 따라 제조된 신장 스페로이드는 신독성 약물에 대한 민감도가 우수함을 의미하며, 이는 본 발명의 신장 스페로이드가 신독성 약물 반응에 이용 가능함을 시사한다.The above results indicate that the renal spheroids prepared according to the present invention have excellent sensitivity to nephrotoxic drugs, which suggests that the renal spheroids of the present invention can be used for nephrotoxic drug reactions.

4-2. 신독성 약물 관련 유전자 발현4-2. Gene expression related to nephrotoxic drugs

신장 스페로이드의 신독성 약물 관련 유전자의 발현을 확인하기 위해, 하기 표 3의 프라이머 세트를 이용하여 유전자 발현량을 측정하였다.In order to confirm the expression of the renal spheroid renal toxicity drug-related gene, gene expression was measured using the primer set of Table 3 below.

유전자gene 프라이머 서열 (정방향)Primer sequence (forward) 프라이머 서열 (역방향)Primer sequence (reverse) Havcr1Havcr1 GCTGCTACTGCTCCTTGTGA
(서열번호 45)GCTGCTACTGCTCCTTGTGA
(SEQ ID NO: 45) TCTTCAGCTCGGGAATGCAC
(서열번호 46)TCTTCAGCTCGGGAATGCAC
(SEQ ID NO: 46) Lcn2Lcn2 GCTGTCGCTACTGGATCAGA
(서열번호 47)GCTGTCGCTACTGGATCAGA
(SEQ ID NO: 47) TGGCGAACTGGTTGTAGTCC
(서열번호 48)TGGCGAACTGGTTGTAGTCC
(SEQ ID NO: 48) ClusterinClusterin CCCAAAGGGGGTGTACTTGA
(서열번호 49)CCCAAAGGGGGTGTACTTGA
(SEQ ID NO: 49) GAATCTTCATGGCGTGGCCT
(서열번호 50)GAATCTTCATGGCGTGGCCT
(SEQ ID NO: 50)

도 19를 참고하면, 신장 스페로이드에 신독성 약물을 농도별로 처리함에 따라 신독성 관련 유전자의 발현이 증가됨을 확인하였다.Referring to FIG. 19, it was confirmed that the renal spheroid is treated with nephrotoxic drugs by concentration, thereby increasing the expression of renal toxicity-related genes.

상기 결과는 본 발명에 따라 제조된 신장 스페로이드는 신독성 약물에 대한 민감도가 우수함을 의미하며, 이는 본 발명의 신장 스페로이드가 신독성 약물 반응에 이용 가능함을 시사한다.The above results indicate that the renal spheroids prepared according to the present invention have excellent sensitivity to nephrotoxic drugs, which suggests that the renal spheroids of the present invention can be used for nephrotoxic drug reactions.

4-3. 신독성 약물 관련 단백질4-3. Nephrotoxic drug-related protein

신장 스페로이드의 신독성 약물 반응을 평가하기 위해, 신장 손상의 바이오마커로 알려진 KIM-1 및 NGAL 발현 양상을 면역조직화학 및 웨스턴블롯팅을 통해 확인하였다.To evaluate the nephrotoxic drug response of renal spheroids, KIM-1 and NGAL expression patterns, known as biomarkers of kidney damage, were confirmed by immunohistochemistry and western blotting.

면역조직화학은 다음 기술된 방법으로 실시하였다. 2 % 한천 배지에 내장된 유기체를 10% 포르말린으로 고정시키고 파라핀에 끼우고 두께 5μm로 절편하였다. 절편을 비특이적 결합을 차단하기 위해 실온에서 0.2%의 fish skin gelatin을 함유 한 2% bovine serum albumin에서 비특이적 결합을 차단하기 위해 1시간 동안 항온 배양하고, 4 ℃에서 일차 항체로 밤새 항온 처리 한 다음, 2차 항체로 실온에서 1시간 동안 처리하였다. 핵은 4',6'-diamidino-2-phenylindole으로 대조 염색하였다.Immunohistochemistry was carried out in the following manner. Organisms embedded in 2% agar medium were fixed with 10% formalin, embedded in paraffin and sectioned to a thickness of 5 μm. Sections were incubated for 1 hour to block non-specific binding in 2% bovine serum albumin containing 0.2% fish skin gelatin at room temperature to block non-specific binding, incubated overnight with primary antibody at 4 ° C., The secondary antibody was treated for 1 hour at room temperature. Nuclei were stained with 4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole.

웨스턴블롯팅은 다음 기술된 방법으로 실시하였다. 세포를 방사 면역 침전 분석 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 5 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 및 0.1 % 소듐 도데실 설페이트)에서 용해시키고 15,000 xg에서 10분 동안 원심 분리하여 세포 파편을 제거하였다. 소듐 도데실 설페이트에 5분간 가열하고, 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 젤 전기영동으로 단백질을 분해하고, polyvinylidene difluoride membranes(Millipore, Billerica, MA, USA)로 옮겼다. 막을 0.5 % Tween-20을 함유하는 PBS 중의 5 % 탈지유 중에서 실온에서 1 시간 동안 블로킹시켰다. 막을 적절한 1 차 항체와 함께 실온에서 1 시간 동안 또는 4 ℃에서 밤새 배양 한 다음, 실온에서 1 시간 동안 2 차 항체와 함께 배양하였다. 화학 발광 키트(Intron Biotech, Seoul, Korea, Millipore)로 단백질을 검출하였다.Western blotting was carried out in the following manner. Cells were lysed in radioimmunoprecipitation assay buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 5 mM ethylenediaminetetraacetic acid and 0.1% sodium dodecyl sulfate) and centrifuged at 15,000 xg for 10 minutes to separate cell debris. Removed. Heated in sodium dodecyl sulfate for 5 minutes, protein was digested by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, and transferred to polyvinylidene difluoride membranes (Millipore, Billerica, MA, USA). The membrane was blocked for 1 hour at room temperature in 5% skim milk in PBS containing 0.5% Tween-20. Membranes were incubated with the appropriate primary antibody for 1 hour at room temperature or overnight at 4 ° C., then incubated with secondary antibody for 1 hour at room temperature. Protein was detected with a chemiluminescence kit (Intron Biotech, Seoul, Korea, Millipore).

도 20을 참고하면, 신장 스페로이드에 신독성 약물을 농도별로 처리함에 따라 신장 손상 바이오 마커의 발현이 비처리군에 비해 증가됨을 확인하였다. Referring to FIG. 20, it was confirmed that the renal damage biomarker expression was increased compared to the untreated group as the kidney spheroid was treated with the nephrotoxic drug by concentration.

상기 결과는 본 발명의 신장 스페로이드에 신독성 약물을 처리함에 따라 세포 사멸, 관련 유전자 및 단백질이 증가됨을 확인하였으며, 이는 본 발명의 신장 스페로이드가 신독성 약물에 대한 반응성이 우수함을 시사한다.The above results confirmed that cell death, related genes and proteins were increased as the nephrotoxic drug was treated with the renal spheroid of the present invention, suggesting that the renal spheroid of the present invention has excellent reactivity to the nephrotoxic drug.

<실험예 5> 신장 스페로이드의 수송체 매개 반응성<Experimental Example 5> Transport mediator reactivity of renal spheroid

본 발명에 따라 제조된 신장 스페로이드의 신독성 약물 반응성이 신장 특이적 수송체와 관련이 있는지 평가하기 위해, 실시예 2에서 제조된 신장 스페로이드에 신장 세포내 흡수 및 배출에 관여하는 수송체 억제제인 시메티딘 및 베라파밀 을 처리하고, 시스플라틴 및 디곡신(digoxin)에 대한 반응성을 확인하였다.In order to evaluate whether the renal toxic drug reactivity of the renal spheroid prepared according to the present invention is related to the renal specific transporter, a transporter inhibitor involved in renal intracellular absorption and excretion of the renal spheroid prepared in Example 2 Phosphorus cymetidine and verapamil were treated, and reactivity to cisplatin and digoxin was confirmed.

시메티딘(cimetidine)은 흡수에 관여하는 대표적인 수송체인 OCT2의 저해제이고, 베라파밀(verapamil)은 배출에 관여하는 대표적인 수송체인 p-gp의 저해제이다.Cimetidine is an inhibitor of OCT2, a representative transporter involved in absorption, and verapamil is an inhibitor of p-gp, a representative transporter involved in excretion.

수송체 억제제를 처리하는 것을 제외하고 신장 스페로이드의 약물 반응성은 실험예 3과 동일한 방법을 실시하였다.The drug reactivity of renal spheroids was performed in the same manner as in Experimental Example 3 except that the transporter inhibitor was treated.

도 21를 참고하면, 생쥐 유래의 신장 스페로이드의 흡수를 저해하면, 신독성 약물을 고농도로 처리하여도, 관련 유전자의 발현이 증가함에도 불구하고 세포 사멸이 크게 감소하였음을 알 수 있다.Referring to Figure 21, it can be seen that inhibiting the absorption of the mouse-derived renal spheroid, the cell death was significantly reduced despite the increased expression of the related gene even when the nephrotoxic drug was treated at a high concentration.

또한, 신장 스페로이드의 배출을 저해하면, 신독성 약물을 저농도로 처리하여도 세포 사멸이 크게 증가하였다.In addition, when the discharge of renal spheroids was inhibited, cell death was significantly increased even when the neotoxic drug was treated at a low concentration.

상기 결과는 본 발명의 신장 스페로이드는 신독성 약물에 반응하는 수송체의 발현을 증가할 뿐 아니라 수송체를 매개로 인한 약물 독성 반응을 보이는 것으로 사료된다. 이는 본 발명의 신장 스페로이드가 신독성 약물 반응을 보다 정확하게 예측할 수 있음을 시사한다.The above results suggest that the renal spheroid of the present invention not only increases the expression of a transporter that responds to a neotoxic drug, but also exhibits a drug-toxic reaction caused by the transporter. This suggests that the kidney spheroid of the present invention can more accurately predict the nephrotoxic drug response.

상기 결과는, 본 발명에 따라 제조된 신장 스페로이드에서 신독성 약물에 반응하는 수송체가 잘 발현될 뿐만 아니라, 상기 수송체에 매개로 인한 약물 독성 반응이 잘 나타나는 것을 보여준다. The above results show that in the renal spheroid prepared according to the present invention, not only the transporter that responds to the neotoxic drug is well expressed, but also the drug-toxic reaction caused by the transporter is mediated.

따라서, 본 발명에 따른 신장 스페로이드의 제조 방법을 통해 보다 정확한 신독성 약물 반응 예측이 가능한 신장 유사체의 생성이 가능하다.Accordingly, it is possible to generate a kidney analog capable of predicting a more accurate nephrotoxic drug response through the method for preparing a kidney spheroid according to the present invention.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 관련 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 있어 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다.The specific parts of the present invention have been described in detail above, and it is obvious that for those skilled in the art, this specific technology is only a preferred embodiment, and the scope of the present invention is not limited thereto.

따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구범위와 그의 등가물에 의하여 정의될 것이다.Accordingly, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> kidney spheroid and method of preparing the same <130> P18-053-KRI <160> 50 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCC-F <400> 1 cctcaagcag gaaggtagcc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCC-R <400> 2 tcactgttgg tgcctgtctc 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NKCC2-F <400> 3 gagaagcggg aattggtctt g 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NKCC2-R <400> 4 ctccacctcc acgaacaaac 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SGLT1-F <400> 5 ctgcagacat cttctccggg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SGLT1-R <400> 6 ggcagtgatt gctagcagga 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AQP1-F <400> 7 ggcctttggt ttgagcatcg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AQP1-R <400> 8 ccggaggatg 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18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct2-R <400> 18 ctgaaacagg tccagcatcc a 21 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oat1-F <400> 19 ctgatggctt cccacaacac 20 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oat1-R <400> 20 gtccttgctt gtccagggg 19 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oat2-F <400> 21 caactgcgga atctggtgct 20 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oat2-R <400> 22 atcaggcagg gcacaatgat g 21 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oat3-F <400> 23 atgaccttct ccgagattct gg 22 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oat3-R <400> 24 gtggttggct attccgagga t 21 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ent2-F <400> 25 tctcaggctc caactcagga 20 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ent2-R <400> 26 ccgtcagcca gatcttccg 19 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oatp4c1-F <400> 27 aatcagaatg ggggttcgca 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oatp4c1-R <400> 28 gagacactgg gggtgaaagc 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mrp1-F <400> 29 gcacctatgc caacgctgag 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mrp1-R <400> 30 agacgagttg ctgagatgcc 20 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pept1-F <400> 31 ccggcacacc cttctagtg 19 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pept1-R <400> 32 tggcgttgtg actggtgac 19 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pept2-F <400> 33 aaagcgacaa cattggctag a 21 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pept2-R <400> 34 aaatcccaaa tcgccatcca t 21 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Urat1-F <400> 35 cgatgttctt ctggccgtct 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Urat1-R <400> 36 tggtcgtaaa cccagccatc 20 <210> 37 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ent1-F <400> 37 cgggtttgaa agcgctcg 18 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ent1-R <400> 38 ggtgactggt tgtcatggct 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mate1-F <400> 39 catggaacgc acggaggagt 20 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mate1-R <400> 40 catcatcagc tgggccaaga a 21 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p-Gp-F <400> 41 ggactttgca gaggaaaccg 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p-Gp-R <400> 42 tgtccagcca acctgcataa 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mrp2-F <400> 43 ctggaaatca cgatggacga 20 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mrp2-R <400> 44 gaaagcccaa gggaatccac a 21 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Havcr1-F <400> 45 gctgctactg ctccttgtga 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Havcr1-R <400> 46 tcttcagctc gggaatgcac 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lcn2-F <400> 47 gctgtcgcta ctggatcaga 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lcn2-R <400> 48 tggcgaactg gttgtagtcc 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Clusterin-F <400> 49 cccaaagggg gtgtacttga 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Clusterin-R <400> 50 gaatcttcat ggcgtggcct 20 <110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> kidney spheroid and method of preparing the same <130> P18-053-KRI <160> 50 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCC-F <400> 1 cctcaagcag gaaggtagcc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCC-R <400> 2 tcactgttgg tgcctgtctc 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NKCC2-F <400> 3 gagaagcggg aattggtctt g 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NKCC2-R <400> 4 ctccacctcc acgaacaaac 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SGLT1-F <400> 5 ctgcagacat cttctccggg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SGLT1-R <400> 6 ggcagtgatt gctagcagga 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AQP1-F <400> 7 ggcctttggt ttgagcatcg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AQP1-R <400> 8 ccggaggatg ctgatctgac 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AQP2-F <400> 9 ttcgagctgc cttctacgtg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AQP2-R <400> 10 ggctgttgca ttgttgtgga 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Podocin-F <400> 11 ccgctgcatt gagaatggac 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Podocin-R <400> 12 cggcctttgc cttcttgtca 20 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nephrin-F <400> 13 cgaactgatg catgcaagaa gg 22 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nephrin-R <400> 14 tacactagtg cgtggtctct 20 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct1-F <400> 15 gacgcctgga aagtggacc 19 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct1-R <400> 16 gcaacatgga tgtatagtct gg 22 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct2-F <400> 17 ccagtgcatg aggtatgagg t 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct2-R <400> 18 ctgaaacagg tccagcatcc a 21 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oat1-F <400> 19 ctgatggctt cccacaacac 20 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oat1-R <400> 20 gtccttgctt gtccagggg 19 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oat2-F <400> 21 caactgcgga atctggtgct 20 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oat2-R <400> 22 atcaggcagg gcacaatgat g 21 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oat3-F <400> 23 atgaccttct ccgagattct gg 22 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oat3-R <400> 24 gtggttggct attccgagga t 21 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ent2-F <400> 25 tctcaggctc caactcagga 20 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ent2-R <400> 26 ccgtcagcca gatcttccg 19 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oatp4c1-F <400> 27 aatcagaatg ggggttcgca 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oatp4c1-R <400> 28 gagacactgg gggtgaaagc 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mrp1-F <400> 29 gcacctatgc caacgctgag 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mrp1-R <400> 30 agacgagttg ctgagatgcc 20 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pept1-F <400> 31 ccggcacacc cttctagtg 19 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pept1-R <400> 32 tggcgttgtg actggtgac 19 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pept2-F <400> 33 aaagcgacaa cattggctag a 21 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pept2-R <400> 34 aaatcccaaa tcgccatcca t 21 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Urat1-F <400> 35 cgatgttctt ctggccgtct 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Urat1-R <400> 36 tggtcgtaaa cccagccatc 20 <210> 37 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ent1-F <400> 37 cgggtttgaa agcgctcg 18 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ent1-R <400> 38 ggtgactggt tgtcatggct 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mate1-F <400> 39 catggaacgc acggaggagt 20 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mate1-R <400> 40 catcatcagc tgggccaaga a 21 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p-Gp-F <400> 41 ggactttgca gaggaaaccg 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p-Gp-R <400> 42 tgtccagcca acctgcataa 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mrp2-F <400> 43 ctggaaatca cgatggacga 20 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mrp2-R <400> 44 gaaagcccaa gggaatccac a 21 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Havcr1-F <400> 45 gctgctactg ctccttgtga 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Havcr1-R <400> 46 tcttcagctc gggaatgcac 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lcn2-F <400> 47 gctgtcgcta ctggatcaga 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lcn2-R <400> 48 tggcgaactg gttgtagtcc 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Clusterin-F <400> 49 cccaaagggg gtgtacttga 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Clusterin-R <400> 50 gaatcttcat ggcgtggcct 20

Claims (9)

(a) 스페로이드 형성 유닛(spheroid forming unit; SFU) 내 매트리겔(matrigel) 및 세포외기질(extracellular matrix; ECM)을 포함하는 3차원 배양 배지에 일차 신장 세포를 투여하는 단계;
(b) 상기 배양 배지에 레티노이드산, 덱사메타손, ITS(insulin-transferrin-selenium), 비타민 D3, 및 표피생장인자(epidermal growth factor; EGF)로 구성된 신장 세포 성숙 인자를 더 첨가하는 단계; 및
(c) 상기 배양 배지를 3차원 배양하는 단계를 포함하는, 신장 스페로이드의 제조 방법에 있어서,
(b) 단계의 레티노이드산은 배양 2일째에 첨가되는 것이고,
(c) 단계는 현적 배양(hanging-drop culture)을 수행한 후 회전 배양을 수행하는 것인, 신장 스페로이드의 제조 방법.(a) administering primary kidney cells to a three-dimensional culture medium comprising a matrigel and extracellular matrix (ECM) in a spheroid forming unit (SFU);
(b) adding renal cell maturation factor comprising retinoid acid, dexamethasone, insulin-transferrin-selenium (ITS), vitamin D3, and epidermal growth factor (EGF) to the culture medium; And
(c) In the method for producing a kidney spheroid, comprising the step of culturing the culture medium in three dimensions,
Retinoid acid of step (b) is added on the second day of culture,
Step (c) is to perform a culturing culture (hanging-drop culture) and then performing rotational culture, a method for producing a kidney spheroid. 제 1 항에 있어서, (a) 단계의 일차 신장 세포는 SV40 및 hTERT 유전자로 불멸화된 신장 유래 세포인 신장 스페로이드의 제조 방법.The method of claim 1, wherein the primary kidney cells of step (a) are kidney-derived cells immortalized with the SV40 and hTERT genes. 제 1 항에 있어서, (a) 단계의 3차원 배양 배지에서 세포외기질:매트리겔의 중량비는 2:1인 신장 스페로이드의 제조 방법.The method of claim 1, wherein the weight ratio of extracellular matrix: matrigel in the three-dimensional culture medium of step (a) is 2: 1. 제 1 항에 있어서, (b) 단계의 레티노이드산은 배양 2일째에 2시간 내지 5일 동안 처리되고 제외되는 것인 신장 스페로이드의 제조 방법.The method of claim 1, wherein the retinoid acid of step (b) is treated and excluded for 2 hours to 5 days on the second day of culture. (a) 스페로이드 형성 유닛(spheroid forming unit; SFU) 내 매트리겔(matrigel) 및 세포외기질(extracellular matrix; ECM)을 포함하는 3차원 배양 배지에 일차 신장 세포를 투여하는 단계;
(b) 상기 배양 배지에 레티노이드산, 덱사메타손, ITS(insulin-transferrin-selenium), 비타민 D3, 및 표피생장인자(epidermal growth factor; EGF)로 구성된 신장 세포 성숙 인자를 더 첨가하는 단계; 및
(c) 상기 배양 배지를 3차원 배양하는 단계를 포함하는, 신장 스페로이드의 제조 방법에 있어서,
(b) 단계의 레티노이드산은 배양 2일째에 첨가되는 것인, 신장 스페로이드의 제조 방법.(a) administering primary kidney cells to a three-dimensional culture medium comprising a matrigel and extracellular matrix (ECM) in a spheroid forming unit (SFU);
(b) adding renal cell maturation factor comprising retinoid acid, dexamethasone, insulin-transferrin-selenium (ITS), vitamin D3, and epidermal growth factor (EGF) to the culture medium; And
(c) In the method for producing a kidney spheroid, comprising the step of culturing the culture medium in three dimensions,
The retinoid acid of step (b) is to be added on the second day of culture, a method for producing a kidney spheroid. 제 1 항에 있어서, (c) 단계의 3차원 배양은 2 내지 5 일 동안 수행되는 것인 신장 스페로이드의 제조 방법.The method of claim 1, wherein the three-dimensional culture of step (c) is performed for 2 to 5 days. 제 1 항 또는 제 5 항의 방법에 따라 제조된 신장 스페로이드.A renal spheroid prepared according to the method of claim 1 or 5. 제 7 항의 신장 스페로이드를 포함하는 체외 신독성 검증용 조성물.A composition for verifying in vitro nephrotoxicity comprising the renal spheroid of claim 7. 제 7 항의 신장 스페로이드를 포함하는 신장 유사체.A kidney analog comprising the kidney spheroid of claim 7.
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