KR102610435B1 - Method for preparing wilson's disease model based on liver organoid and use thereof - Google Patents

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Abstract

본 발명은 간 오가노이드를 기반으로 하는 윌슨병 모델의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 윌슨병 모델에 관한 것으로, 본 발명의 윌슨병의 돌연변이를 일으킨 간 오가노이드 모델에서 구리의 축적에 의해 세포 생존능이 감소하고, 윌슨병 치료 약물을 처리하는 경우 감소했던 세포 생존능이 증가하고, 혈장 내 세룰로플라스민이 감소함을 확인하였으므로, 윌슨병의 발병 기전 탐색 및 윌슨병 치료 약물 스크리닝 용도의 간 모델로 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to a method for producing a Wilson disease model based on liver organoids and a Wilson disease model produced by the above method. The present invention relates to a method for producing a Wilson disease model based on liver organoids, and to a method for producing a Wilson disease model based on the above method. The present invention relates to cell viability due to accumulation of copper in the liver organoid model that causes a mutation in Wilson disease of the present invention. It was confirmed that this decreases, cell viability, which had decreased when treated with Wilson's disease treatment drugs, increases, and ceruloplasmin in plasma decreases, making it useful as a liver model for exploring the pathogenesis of Wilson's disease and for screening drugs for treating Wilson's disease. It can be used effectively.

Description

간 오가노이드를 기반으로 하는 윌슨병 모델의 제조방법 및 이의 용도{Method for preparing wilson's disease model based on liver organoid and use thereof}Method for preparing Wilson's disease model based on liver organoid and use thereof}

본 발명은 간 오가노이드를 기반으로 하는 윌슨병 모델의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing a Wilson disease model based on liver organoids and its use.

간은 대사, 단백질 합성, 담즙 생성, 적혈구 제거와 같은 다양한 기능을 가진 대사 및 생리적 항상성의 중심 기관이다. 간 실질 세포인 간세포(hepatocyte)는 주로 간의 항상성을 유지하는 역할을 담당하므로 많은 질병의 표적이 된다. 간 부전의 질병 모델링에 대한 최근의 기술적인 발전에도 불구하고, 간 부전의 말기 단계로 이어질 수 있는 선천성 및 진행성 대사 질환의 모델이 필요한 실정이다. 더욱이, 간은 의약품의 해독에 특유한 기능을 가지고 있기 때문에, 약물 개발에서 약물 대사 및 독성 평가를 위한 도구로서 인간 간세포를 모사 하는 모델이 요구되고 있다. 현재의 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 간 모델은 간 질환의 발병 기전을 밝히고 약물 안전성을 평가하는 데 크게 기여했지만 여전히 인간의 간 생리를 완전히 반영하지 못하는 제한이 있다. 동물 모델은 종간 차이로 인해 약물 독성을 예측하는 데 한계가 있다. 또한, 초대 배양 인간 간세포(primary human hepatocyte, PHH)는 체외 간 모델의 표준이지만, 인간 간 조직에 대한 접근성이 제한되고 기능이 불안정하여 사용이 제한되고 있고, 간암 세포는 정상세포가 아니므로 약물 대사 효소가 완전하게 발현되지 않거나 기능이 감소되어 있어 약물 독성 평가에 적합하지 않다. 따라서, 인간의 간 대사를 모사할 수 있으면서도 약물 대사능을 보유한 간 모델을 만드는 것이 필요하다.The liver is a central organ of metabolic and physiological homeostasis with diverse functions such as metabolism, protein synthesis, bile production, and red blood cell elimination. Hepatocytes, parenchymal cells of the liver, are primarily responsible for maintaining liver homeostasis and are therefore the target of many diseases. Despite recent technological advances in disease modeling of liver failure, there is a need for models of congenital and progressive metabolic diseases that can lead to end-stage liver failure. Moreover, because the liver has a unique function in drug detoxification, a model that mimics human hepatocytes is required as a tool for drug metabolism and toxicity evaluation in drug development. Although current in vitro and in vivo liver models have contributed greatly to elucidating the pathogenesis of liver diseases and evaluating drug safety, they still have limitations that do not fully reflect human liver physiology. Animal models have limitations in predicting drug toxicity due to differences between species. In addition, primary human hepatocytes (PHH) are the standard for in vitro liver models, but their use is limited due to limited accessibility to human liver tissue and unstable function, and liver cancer cells are not normal cells and therefore metabolize drugs. It is not suitable for evaluating drug toxicity because the enzyme is not fully expressed or has a reduced function. Therefore, it is necessary to create a liver model that can simulate human liver metabolism and has the ability to metabolize drugs.

오가노이드란 줄기세포를 3차원적으로 배양하거나 응집 또는 재조합하여 만든 장기 특이적 세포 집합체로 자기 재생(self-renewal)이 가능하며 '미니 장기' 또는 '유사 장기'라고도 불린다. 오가노이드는 실제 장기와 유사한 형태로 분자 신호 조절 등과 같은 동물 모델에서는 구현하기 힘든 연구를 in vitro 상에서 구현할 수 있어 기초 연구에 매우 유용함은 물론, 인간의 발생과정, 질환 모델 확립, 의약품 유효성 평가 스크리닝, 의약품 독성 평가 플랫폼 개발, 세포치료제 개발 등 다양한 분야에 매우 유용하게 사용될 수 있는 기술이다.Organoids are organ-specific cell aggregates created by three-dimensionally cultivating, aggregating, or recombining stem cells. They are capable of self-renewal and are also called 'mini-organs' or 'pseudo-organs.' Organoids are similar to actual organs and can carry out studies in vitro that are difficult to implement in animal models, such as regulating molecular signals, so they are very useful in basic research, as well as in human developmental processes, establishment of disease models, screening for drug effectiveness evaluation, etc. It is a technology that can be very useful in a variety of fields, including the development of drug toxicity evaluation platforms and cell therapy development.

인간 간 오가노이드는 R-Spondin 1 함유 배양 배지를 사용하여 성인 인간 간 조직에서 처음 개발되었다. 초대 배양 인간 간세포(PHH)도 3D 오가노이드 배양에 적용되었고, 인간 전분화능 줄기세포(human pluripotent stem cell, hPSC)에서 간 씨앗(liver bud) 및 간 오가노이드의 생성을 보고했다. 인간 전분화능 줄기세포로부터 유래한 간 오가노이드(hHO)는 유전 및 대사 장애, 세포 치료 및 약물 독성 테스트와 같은 질병 모델링을 위한 시험관 내 모델로 제시되었다.Human liver organoids were first developed from adult human liver tissue using R-Spondin 1-containing culture medium. Primary cultured human hepatocytes (PHH) were also applied to 3D organoid culture, and the generation of liver buds and liver organoids from human pluripotent stem cells (hPSC) was reported. Liver organoids (hHO) derived from human pluripotent stem cells have been proposed as an in vitro model for disease modeling, such as genetic and metabolic disorders, cell therapy, and drug toxicity testing.

현재 다양한 오가노이드 확립을 위한 연구가 진행되어 오고 있으며, 간 오가노이드도 개발되어 있다. 간 오가노이드 제조 방법 관련 종래기술로는 최종 내배엽(definitive endoderm) 및 간 내배엽(hepatic endoderm)에서 파생된 확장 단계로 간 오가노이드를 생성하고, 생성한 간 오가노이드가 증식 능력이 있음을 입증하고, citrullinemia type 1 및 알코올성 간 손상 모델링 및 재생 능력을 가짐을 확인한 문헌(Akbari et al. (2019). Robust, Long-Term Culture of Endoderm-Derived Hepatic Organoids for Disease Modeling. Stem Cell Reports 13, 627-641., Wang et al. (2019). Human ESC-derived expandable hepatic organoids enable therapeutic liver repopulation and pathophysiological modeling of alcoholic liver injury. Cell Res 29, 1009-1026.) 및 3D 구형 hPSC 유래 성숙 Holocarboxylase synthetase(HLC)에서 파생된 확장 단계로 간 오가노이드를 생산하고 약물 유발성 간 지방증을 평가하기 위한 모델로 간 오가노이드를 제안한 문헌(Mun et al. (2019). Generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids. J Hepatol 71, 970-985.), 인간의 간세포를 채취하고 그로부터 줄기세포를 분리하여 오가노이드를 생성하는 방법을 개시하고 있는 미국 등록특허 US8642339B2가 있다.Currently, research is being conducted to establish various organoids, and liver organoids are also being developed. Conventional techniques related to liver organoid production methods include generating liver organoids through an expansion step derived from definitive endoderm and hepatic endoderm, and demonstrating that the generated liver organoids have the ability to proliferate, Literature confirmed that it has the ability to model and regenerate citrullinemia type 1 and alcoholic liver damage (Akbari et al. (2019). Robust, Long-Term Culture of Endoderm-Derived Hepatic Organoids for Disease Modeling. Stem Cell Reports 13, 627-641. , Wang et al. (2019). Human ESC-derived expandable hepatic organoids enable therapeutic liver repopulation and pathophysiological modeling of alcoholic liver injury. Cell Res 29, 1009-1026.) and 3D spherical hPSC derived mature Holocarboxylase synthetase (HLC) Generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids (Mun et al. (2019)) proposed liver organoids as a model for producing liver organoids in an advanced expansion stage and evaluating drug-induced liver steatosis. J Hepatol 71, 970-985.), there is a US registered patent US8642339B2, which discloses a method of generating organoids by collecting human liver cells and isolating stem cells therefrom.

윌슨병(Wilson's disease) 또는 간 렌즈핵 변성은 선천적 대사장애 질환의 하나로 간 세포 안으로 운반된 구리를 세룰로플라스민(ceruloplasmin)과 결합시켜 세포 밖으로 운반하거나 담도로 배출하는 역할을 하는 ATP7B의 돌연변이로 인해 구리가 정상적으로 대사되지 못하고 말초조직에 축적되어 뇌 기저핵의 진행성 변성, 각막 주위에 갈색 고리 형성, 간세포가 점점 섬유조직으로 대치되는 등의 증상을 초래한다. 따라서, 윌슨병을 진단하기 위해 주로 혈청 내 셀룰로플라스민 함량을 측정하며 윌슨 병 환자는 세포 밖으로 구리와 함께 세룰로플라스민이 운반되지 못하므로 혈청 내 세룰로플라스민이 감소 되어 있다. 이 병은 보통 10~20대에 처음 나타나는데 불수의적인 떨림, 협조 불능, 성격변화와도 관계가 있다. 치료를 위해서는 구리 섭취 제한, 고단백 식이요법과 페니실라민 같은 킬레이트 화합물 투여를 병행하여 조직 내의 구리를 소변으로 배설하게 한다. 간경변이 심화 되면 결과적으로 간 이식을 필요로 하게 된다.Wilson's disease, or liver lens nucleus degeneration, is one of the congenital metabolic disorders and is caused by a mutation in ATP7B, which plays a role in binding copper transported into liver cells to ceruloplasmin and transporting it out of the cells or excreting it into the biliary tract. As a result, copper cannot be metabolized normally and accumulates in peripheral tissues, resulting in symptoms such as progressive degeneration of the basal ganglia of the brain, the formation of brown rings around the cornea, and liver cells gradually being replaced by fibrous tissue. Therefore, to diagnose Wilson's disease, the celluloplasmin content in the serum is mainly measured, and in patients with Wilson's disease, ceruloplasmin is reduced in the serum because ceruloplasmin cannot be transported along with copper outside the cells. This disease usually first appears in people's teens and twenties and is also associated with involuntary tremors, inability to cooperate, and personality changes. Treatment involves limiting copper intake, a high-protein diet, and administering chelating compounds such as penicillamine to excrete copper in tissues through urine. As cirrhosis worsens, liver transplantation is eventually required.

윌슨 병 기존의 모델로는 ATP7B의 돌연변이를 일으킨 마우스 모델 또는 인간 배아 줄기세포로부터 분화시킨 간 세포 유사 세포 모델을 개시한 대한민국 등록특허 제10-2159877호가 있으나, 마우스 모델은 종간 차이로 인해 인간의 간을 완벽하게 재현할 수 없고, 간 세포 유사 세포 모델은 수급하는데에 한계가 있다.Existing models of Wilson's disease include a mouse model with an ATP7B mutation or Korean Patent No. 10-2159877, which discloses a liver cell-like cell model differentiated from human embryonic stem cells. However, the mouse model is similar to that of the human liver due to differences between species. cannot be perfectly reproduced, and there is a limit to the supply of liver cell-like cell models.

이에, 본 발명자들은 윌슨병의 돌연변이를 일으킨 간 오가노이드 모델에서 구리의 축적에 의해 세포 생존능이 감소하고, 윌슨병 치료 약물을 처리하는 경우 감소했던 세포 생존능이 증가하고, 혈장 내 세룰로플라스민이 감소함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors found that in a liver organoid model that caused a mutation in Wilson's disease, cell viability decreased due to the accumulation of copper, cell viability, which had decreased when treated with a Wilson's disease treatment drug, increased, and ceruloplasmin in the plasma decreased. By confirming this, the present invention was completed.

본 발명의 목적은 간 오가노이드를 기반으로 하는 윌슨병 모델의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 윌슨병 모델을 제공하는 것이다.The purpose of the present invention is to provide a method for producing a Wilson's disease model based on liver organoids and a Wilson's disease model produced by the method.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 In order to achieve the above object, the present invention

1) 인간 전분화능 줄기세포(human pluripotent stem cell, hPSC)의 ATP7B(ATPase Copper Transporting Beta)에 돌연변이를 일으키는 단계;1) A step of causing a mutation in ATP7B (ATPase Copper Transporting Beta) of human pluripotent stem cells (hPSC);

2) 상기 단계 1)의 ATP7B 돌연변이 인간 전분화능 줄기세포(human pluripotent stem cell, hPSC)를 완전 내배엽 세포(definitive endoderm, DE)로 분화시키는 단계;2) Differentiating the ATP7B mutant human pluripotent stem cells (hPSC) of step 1) into definitive endoderm (DE) cells;

3) 상기 단계 2)의 완전 내배엽 세포를 간 내배엽 세포(hepatic endoderm, HE)로 분화시키는 단계;3) Differentiating the complete endoderm cells of step 2) into liver endoderm cells (hepatic endoderm, HE);

4) 상기 단계 3)의 간 내배엽 세포를 간 내배엽 오가노이드(hepatic endoderm organoid, hHEO)로 분화시키는 단계;4) Differentiating the liver endoderm cells of step 3) into liver endoderm organoids (hHEO);

5) 상기 단계 4)의 간 내배엽 오가노이드를 간 오가노이드(hepatic organoid, hHO)로 분화시키는 단계; 를 포함하는, 윌슨병 모델의 제조방법을 제공한다.5) Differentiating the liver endoderm organoid of step 4) into liver organoid (hepatic organoid, hHO); Provides a method for manufacturing a Wilson disease model, including.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 간 오가노이드 기반 윌슨병 모델을 제공한다.Additionally, the present invention provides a liver organoid-based Wilson's disease model prepared by the above production method.

또한, 상기 윌슨병 모델에 피검 물질을 접촉시키는 단계; 및Additionally, contacting the Wilson disease model with a test substance; and

상기 피검 물질이 처리된 윌슨 병 모델에서 세룰로플라스민(ceruloplasmin, CP)의 발현 수준 또는 활성 수준, 또는 세포 생존능(cell viability)을 대조군 모델과 비교하는 단계를 포함하는, 윌슨 병의 예방 또는 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.Comprising the step of comparing the expression level or activity level of ceruloplasmin (CP), or cell viability in the Wilson disease model treated with the test substance with the control model, for the prevention or treatment of Wilson's disease Provides a method for screening.

본 발명은 간 오가노이드를 기반으로 하는 윌슨병 모델의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 윌슨병 모델에 관한 것으로, 본 발명의 윌슨병의 돌연변이를 일으킨 간 오가노이드 모델에서 구리의 축적에 의해 세포 생존능이 감소하고, 윌슨병 치료 약물을 처리하는 경우 감소했던 세포 생존능이 증가하고, 혈장 내 세룰로플라스민이 감소함을 확인하였으므로, 윌슨병의 발병 기전 탐색 및 윌슨병 치료 약물 스크리닝 용도의 간 모델로 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to a method for producing a Wilson disease model based on liver organoids and a Wilson disease model produced by the above method. The present invention relates to a method for producing a Wilson disease model based on liver organoids, and to a method for producing a Wilson disease model based on the above method. The present invention relates to cell viability due to accumulation of copper in the liver organoid model that causes a mutation in Wilson disease of the present invention. It was confirmed that this decreases, cell viability, which had decreased when treated with Wilson's disease treatment drugs, increases, and ceruloplasmin in plasma decreases, making it useful as a liver model for exploring the pathogenesis of Wilson's disease and for screening drugs for treating Wilson's disease. It can be used effectively.

도 1은 인간 유도 만능줄기세포로부터 분화 기간에 따른 간 오가노이드의 제조방법 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 물방울(Droplet) 모양의 간 내배엽 오가노이드(D-HEO)를 나타낸 도이다.
도 3은 현탁(Suspension) 상태의 간 내배엽 오가노이드(S-HEO)를 나타낸 도이다.
도 4는 간 내배엽 세포(hepatic endoderm, HE) 및 간 내배엽 세포로부터 분화시킨 물방울 모양의 간 내배엽 오가노이드(D-HEO)를 나타낸 도이다.
도 5는 간 내배엽 세포(HE) 및 물방울 모양의 간 내배엽 오가노이드(D-HEO)에서 간 전구세포(hepatic progenitor cell)/줄기세포(stem cell)의 마커인 EpCAM 및 R-spondin 1에 결합하는 Wnt의 표적 단백질인 LGR5을 발현하는 세포의 수를 유세포 분석으로 나타내고, 표적 유전자 AXIN2 및 EPHB2의 발현을 RT-qPCR로 측정한 것으로, 간 내배엽 세포에 비해 간 내배엽 오가노이드에서 Wnt 신호 전달 과정이 필요하지 않음을 나타낸 도이다.
도 6은 물방울 모양으로 간 내배엽 오가노이드를 분화시킨 경우 R-Spondin 1, Noggin 및 EGF(RNE)를 제외한 간 내배엽 오가노이드 생산 배지에서 제조된 오가노이드의 수는 RNE가 포함된 간 내배엽 오가노이드 생산 배지에서 제조된 오가노이드와 유사함을 나타낸 도이다.
도 7은 현탁 상태로 간 내배엽 오가노이드를 분화시킨 경우 R-Spondin 1, Noggin 및 EGF(RNE)를 제외한 간 내배엽 오가노이드 생산 배지에서 제조된 오가노이드의 수는 RNE가 포함된 간 내배엽 오가노이드 생산 배지에서 제조된 오가노이드에 비해 오가노이드 수가 현저하게 증가함을 나타낸 도이다.
도 8은 현탁 상태로 제조한 간 내배엽 오가노이드(S-HEO)의 형성 속도는 RNE가 있는 배지에서 배양한 경우에 비해 RNE가 없는 배지에서 배양한 경우의 3.5배 이상임을 나타낸 도이다.
도 9는 D(+)-HEO, D(-)-HEO, S(+)-HEO 및 S(-)-HEO의 네 가지 조건에서 배양한 간 내배엽 오가노이드의 구조를 bright-field 현미경 이미지 및 헤마톡실린&에오신(Hematoxlin&Eosin,H&E) 염색으로 확인한 도이다.
도 10은 D(+)-HEO, D(-)-HEO, S(+)-HEO 및 S(-)-HEO의 네 가지 조건에서 배양한 간 내배엽 오가노이드에서 간 전구 세포 마커인 SOX9, CK19 및 EpCAM이 발현하고 있는 것을 확인한 도이다.
도 11은 D(+)-HEO, D(-)-HEO, S(+)-HEO 및 S(-)-HEO의 네 가지 조건에서 배양한 간 내배엽 오가노이드에서 차등적으로 발현하는 유전자를 나타낸 도이다.
도 12는 간 내배엽 오가노이드로부터 간 오가노이드를 분화시키는 과정을 나타낸 개략도이다.
도 13은 간 오가노이드로의 분화 동안 EGF가 없는 배양 배지 조건에서 간 오가노이드를 분화시켰을 때, 주요 간 유전자의 발현이 증가함을 나타낸 도이다.
도 14는 D(+)-HO, D(-)-HO, S(+)-HO 및 S(-)-HO의 네 가지 조건에서 배양한 간 오가노이드의 구조를 bright-field 현미경 이미지 및 헤마톡실린&에오신(Hematoxlin&Eosin,H&E) 염색으로 확인한 도이다.
도 15는 D(+)-HO, D(-)-HO, S(+)-HO 및 S(-)-HO의 네 가지 조건에서 배양한 간 오가노이드에서 간 마커인 ALB, AAT, CYP3A4이 발현하고 있는 것을 확인한 도이다.
도 16은 D(+)-HO, D(-)-HO, S(+)-HO 및 S(-)-HO의 네 가지 조건에서 배양한 간 오가노이드에서 간 마커인 ALB, AAT, TDO2, HNF4A, G6P, CYP3A4의 발현 수준을 확인한 것으로, D(-)-HO 및 S(-)-HO에서 간 마커의 발현이 높음을 확인한 도이다.
도 17은 D(+)-HO, D(-)-HO, S(+)-HO 및 S(-)-HO의 네 가지 조건에서 배양한 간 오가노이드에서 ALB(알부민)을 발현하는 세포 수를 계수한 결과를 나타낸 도이다.
도 18은 D(-)-HO 및 S(-)-HO에서 D(+)-HO 및 S(+)-HO보다 ALB(알부민), AAT(Alpha 1-antitrypsin), 및 ApoA1(Apolipoprotein A1) 단백질의 발현이 증가함을 확인한 도이다.
도 19는 D(-)-HO 및 S(-)-HO 조건에서 배양한 간 오가노이드가 미세 융모 구조(MV)와 밀착 연접 구조(TJ)를 나타냄을 확인한 도이다.
도 20은 D(-)-HO, S(-)-HO, 초대 배양 인간 간세포(PHH), 간암 세포주(HepG2) 및 2D 간세포 유사 세포(2D HLC) 사이에서 약물 수송체 관련 유전자의 전사 발현 분석 결과, 2D HLC와 비교하여 D(-)-HO 및 S(-)-HO 모두 MRP2, BSEP, MDR1 및 BCRP와 같은 정단부 약물 수송체(apical transporter) 유전자의 발현이 높음을 확인한 도이다.
도 21은 D(-)-HO 및 S(-)-HO의 정단층 막에서 정단부 약물 수송체(apical drug transporter) 관련 유전자인 MRP2(CDFDA로 염색)의 발현의 확인과, MRP2 억제제인 프로베네시드를 처리한 결과 각 약물 수송체 특이적 형광은 간 오가노이드 내강에 축적됨을 확인한 도이다.
도 22는 D(-)-HO 및 S(-)-HO의 정단층 막에서 정단부 약물 수송체(apical drug transporter) 관련 유전자인 MDR1(로다민 123으로 염색)의 발현의 확인과, MDR1 억제제인 케토코나졸을 처리한 결과 각 약물 수송체 특이적 형광은 간 오가노이드 내강에 축적됨을 확인한 도이다.
도 23은 D(-)-HO 및 S(-)-HO의 정단층 막에서 정단부 약물 수송체(apical drug transporter) 관련 유전자인 BSEP(CLF로 염색)의 발현의 확인과, BSEP 억제제인 케토코나졸을 처리한 결과 각 약물 수송체 특이적 형광은 간 오가노이드 내강에 축적됨을 확인한 도이다.
도 24는 간 오가노이드에서 19개의 서로 다른 세포 클러스터가 존재하는 것을 확인한 도이다.
도 25는 간 오가노이드가 3개의 세포 그룹으로 구성되어 있으며, 첫 번째 그룹은 담도 유사 세포(biliary-like cell)가 포함되어 있고, 두 번째 그룹은 담낭 유사 세포(gallbladder-like cell)가 포함되어 있으며, 세 번째 그룹에는 간 세포 유사 세포(hepatocyte-like cell)가 포함되어 있음을 확인한 도이다.
도 26은 각 그룹의 대표적인 마커(간세포 계통의 경우 ALB, ASGR1 및 SERPINA1, 담즙 계통의 경우 KRT19, EPCAM 및 ITGB4, 담낭 계통의 경우 REG4, TFF3 및 FCGBP)가 발현되는 것을 확인한 도이다.
도 27은 각 그룹의 특정 마커는 각 클러스터에서 독점적으로 발현됨을 확인한 도이다.
도 28은 D(-)-HO 및 S(-)-HO에서 4개의 CYP450 유전자는 D(+)-HO 및 S(+)-HO보다 높은 발현 수준을 나타냄을 확인한 것으로, D(-)-HO 및 S(-)-HO 조건에서 배양된 간 오가노이드가 약물 대사 능력이 증진된 것을 나타낸 도이다.
도 29는 주요 CYP450의 활성도를 D(-)-HO, S(-)-HO, 초대 배양 인간 간세포(PHH), 간암 세포주(HepG2) 및 2D 간세포 유사 세포(2D HLC)에서 나타낸 도이다.
도 30은 간 내배엽 오가노이드를 20μM 구연산 철(FC)을 포함하는 간 오가노이드 분화 배지를 사용하여 간 오가노이드로 분화시킨 과정의 개략도이다.
도 31은 20μM 구연산 철(FC)을 포함하는 간 오가노이드 분화 배지를 사용하여 간 오가노이드로 분화시킨 경우 세포 독성이 없음을 나타낸 도이다.
도 32는 20μM 구연산 철(FC)을 포함하는 간 오가노이드 분화 배지를 사용하여 간 오가노이드로 분화시킨 경우 세포가 살아있음을 나타낸 도이다.
도 33은 24시간 동안 CYP450 효소의 활성을 측정한 것으로, 구연산 철을 포함하는 간 오가노이드 분화 배지를 사용하여 현탁 상태의 간 오가노이드로 분화시킨 경우 약물 대사 효소인 CYP450의 활성이 증가한 결과를 나타낸 도이다.
도 34는 7일 동안 CYP450 효소의 활성을 측정한 것으로, 구연산 철을 포함하는 간 오가노이드 분화 배지를 사용하여 현탁 상태의 간 오가노이드로 분화시킨 경우 약물 대사 효소인 CYP450의 활성이 유지되는 결과를 나타낸 도이다.
도 35는 대부분의 약물에서 D-HO FC는 다른 세포 모델보다 낮은 농도에서 세포 독성을 갖는 것을 나타낸 도이다.
도 36은 구연산 철을 포함하는 간 오가노이드 분화 배지를 사용하여 분화시킨 간 오가노이드는 아미트립틸린(CYP2D6 및 CYP2C19), 클로르프로마진(CYP2D6) 및 디클로페낙(CYP2C9 및 UGT2B7)을 포함한 약물의 대사 능력을 가짐을 나타낸 도이다.
도 37은 간에서의 아세트아미노펜의 대사 경로를 나타낸 도이다.
도 38은 간 오가노이드, 초대 배양 인간 간세포(PHH), 간암 세포주(HepG2) 및 2D 간 세포 유사 세포(hepatocyte like cell)에서 간에서의 아세트아미노펜의 CYP450 매개 되지 않은 대사 산물인 APAP-글루쿠로나이드(APAP-Glu) 및 APAP-설페이트(APAP-Sul)의 농도를 나타낸 도이다.
도 39는 간 오가노이드, 초대 배양 인간 간세포(PHH), 간암 세포주(HepG2) 및 2D 간 세포 유사 세포(hepatocyte like cell)에서 간에서의 아세트아미노펜의 CYP450 매개 대사 산물인 APAP-글루타치온(APAP-GSH) 및 APAP-시스테인(APAP-Cys)의 농도를 나타낸 도이다.
도 40은 간에서의 피마사르탄의 대사 경로를 나타낸 도이다.
도 41은 간 오가노이드, 초대 배양 인간 간세포(PHH), 간암 세포주(HepG2) 및 2D 간 세포 유사 세포(hepatocyte like cell)에서 간에서의 피마사르탄의 CYP3A4 매개 대사 산물인 FMS S-옥사이드, BR-A-557 및 BR-A-535의 농도를 나타낸 도이다.
도 42는 간 오가노이드, 초대 배양 인간 간세포(PHH), 간암 세포주(HepG2) 및 2D 간 세포 유사 세포(hepatocyte like cell)에서 간에서의 피마사르탄의 CYP2C9 매개 대사 산물인 1-OH 부틸 FMS, 2- 또는 3-OH 부틸 FMS 및 4-OH 부틸 FMS의 농도를 나타낸 도이다.
도 43은 사이클로포스파마이드(CP)가 간에서 대사되어 심장 독성을 미치는 대사 경로를 나타낸 도이다.
도 44는 24시간 및 72시간 동안 250 및 500μM의 농도로 사이클로포스파마이드를 처리한 후, 간 오가노이드를 포함하거나 포함하지 않은 hiPCS-CM의 박동률을 나타낸 도이다.
도 45는 24시간 및 72시간 동안 250 및 500μM의 농도로 사이클로포스파마이드를 처리한 후, 간 오가노이드를 포함하거나 포함하지 않은 hiPCS-CM의 정규화된 필드 전위 지속 시간을 나타낸 도이다.
도 46은 테르비나핀(Terfenadine, TER)이 심장 독성을 미치는 대사 경로를 나타낸 도이다.
도 47은 24시간 및 72시간 동안 1 및 10μM의 농도로 테르비나핀을 처리한 후, 간 오가노이드를 포함하거나 포함하지 않은 hiPCS-CM의 박동률을 나타낸 도이다.
도 48은 24시간 및 72시간 동안 1 및 10μM의 농도로 테르비나핀을 처리한 후, 간 오가노이드를 포함하거나 포함하지 않은 hiPCS-CM의 정규화된 필드 전위 지속 시간을 나타낸 도이다.
도 49는 인간 배아 줄기 세포로부터 분화시킨 간 내배엽 오가노이드(hHEO) 및 간 오가노이드(hHO)(대조군, con) 및 ATP7B 유전자에 R778L 돌연변이가 있는 인간 배아 줄기 세포로부터 분화시킨 간 내배엽 오가노이드(hHEO) 및 간 오가노이드(hHO)(WD, 윌슨병 모델)의 현미경 사진과 간 마커인 AAT(Alpha1-antitrypsin) 및 HNF4A(Hepatocyte nuclear factor 4 alpha)의 발현을 대조군 및 윌슨병 모델의 간 오가노이드에서 나타낸 도이다.
도 50은 대조군 인간 배아 줄기 세포(con ESC), 대조군 간 오가노이드(con HO), 윌슨병 돌연변이 인간 배아 줄기 세포(WD ESC) 및 윌슨병 돌연변이 간 오가노이드(WD HO)에서 간 마커(ALB, AAT, ASGR1, CYP2C9, CYP2C19, CYP3A4) mRNA 발현 수준을 나타낸 도이다.
도 51은 대조군 인간 배아 줄기 세포(con ESC), 대조군 간 오가노이드(con HO), 윌슨병 돌연변이 인간 배아 줄기 세포(WD ESC) 및 윌슨병 돌연변이 간 오가노이드(WD HO)에서 구리 수송에 관련된 유전자인 CTR1 및 구리 배출에 관련된 유전자인 ATP7B의 mRNA 발현 수준을 나타낸 도이다.
도 52는 농도별로 구리를 대조군 간 오가노이드 또는 윌슨병 돌연변이 간 오가노이드에 처리하였을 때, 세포 내에 축적된 구리의 농도를 나타낸 도이다.
도 53은 농도별로 구리를 대조군 간 오가노이드 또는 윌슨병 돌연변이 간 오가노이드에 처리하였을 때, 세포 생존능을 나타낸 도이다.
도 54는 대조군 간 오가노이드 또는 윌슨병 돌연변이 간 오가노이드에 윌슨병 치료 약물을 처리하였을 때, 세포 생존능을 나타낸 도이다.
도 55는 대조군 간 오가노이드, 윌슨병 돌연변이 간 오가노이드 및 초대 배양 인간 간세포(PHH)에서 세룰로플라스민 mRNA의 발현 수준을 나타낸 도이다.
도 56은 대조군 간 오가노이드, 윌슨병 돌연변이 간 오가노이드 및 초대 배양 인간 간세포(PHH)에서 세룰로플라스민 단백질의 활성 수준을 나타낸 도이다.Figure 1 shows a schematic diagram of a method for producing liver organoids according to the differentiation period from human induced pluripotent stem cells.
Figure 2 is a diagram showing a droplet-shaped liver endoderm organoid (D-HEO).
Figure 3 is a diagram showing liver endoderm organoids (S-HEO) in suspension.
Figure 4 is a diagram showing hepatic endoderm (HE) and drop-shaped liver endoderm organoids (D-HEO) differentiated from hepatic endoderm cells.
Figure 5 shows binding to EpCAM and R-spondin 1, markers of hepatic progenitor cells/stem cells in liver endoderm cells (HE) and droplet-shaped liver endoderm organoids (D-HEO). The number of cells expressing LGR5, a target protein of Wnt, was shown by flow cytometry, and the expression of target genes AXIN2 and EPHB2 was measured by RT-qPCR, indicating that the Wnt signaling process is required in liver endoderm organoids compared to liver endoderm cells. This shows that it is not done.
Figure 6 shows the number of organoids prepared in the liver endoderm organoid production medium excluding R-Spondin 1, Noggin, and EGF (RNE) when differentiating liver endoderm organoids in a droplet shape. Production of liver endoderm organoids containing RNE This diagram shows similarity to organoids prepared in medium.
Figure 7 shows the number of organoids prepared in liver endoderm organoid production medium excluding R-Spondin 1, Noggin, and EGF (RNE) when liver endoderm organoids were differentiated in suspension. Production of liver endoderm organoids containing RNE This diagram shows that the number of organoids increases significantly compared to organoids prepared in medium.
Figure 8 is a diagram showing that the formation rate of liver endoderm organoids (S-HEO) prepared in suspension is 3.5 times higher when cultured in a medium without RNE compared to when cultured in a medium with RNE.
Figure 9 shows bright-field microscopic images and structures of liver endoderm organoids cultured under four conditions: D(+)-HEO, D(-)-HEO, S(+)-HEO, and S(-)-HEO. This was confirmed by Hematoxylin&Eosin (H&E) staining.
Figure 10 shows liver progenitor cell markers SOX9 and CK19 in liver endoderm organoids cultured under four conditions: D(+)-HEO, D(-)-HEO, S(+)-HEO, and S(-)-HEO. and EpCAM are confirmed to be expressed.
Figure 11 shows genes differentially expressed in liver endoderm organoids cultured under four conditions: D(+)-HEO, D(-)-HEO, S(+)-HEO, and S(-)-HEO. It is also a degree.
Figure 12 is a schematic diagram showing the process of differentiating liver organoids from liver endoderm organoids.
Figure 13 is a diagram showing that the expression of major liver genes increases when liver organoids are differentiated in culture medium conditions without EGF during differentiation into liver organoids.
Figure 14 shows bright-field microscopy images and the structure of liver organoids cultured under four conditions: D(+)-HO, D(-)-HO, S(+)-HO, and S(-)-HO. This was confirmed by Hematoxlin & Eosin (H&E) staining.
Figure 15 shows liver markers ALB, AAT, and CYP3A4 in liver organoids cultured under four conditions: D(+)-HO, D(-)-HO, S(+)-HO, and S(-)-HO. This is the way that has been confirmed to be manifesting itself.
Figure 16 shows liver markers ALB, AAT, TDO2, and The expression levels of HNF4A, G6P, and CYP3A4 were confirmed, and it was confirmed that the expression of liver markers was high in D(-)-HO and S(-)-HO.
Figure 17 shows the number of cells expressing ALB (albumin) in liver organoids cultured under four conditions: D(+)-HO, D(-)-HO, S(+)-HO, and S(-)-HO. This diagram shows the results of counting.
Figure 18 shows that ALB (albumin), AAT (Alpha 1-antitrypsin), and ApoA1 (Apolipoprotein A1) are higher in D(-)-HO and S(-)-HO than in D(+)-HO and S(+)-HO. This is a diagram confirming that protein expression increases.
Figure 19 is a diagram confirming that liver organoids cultured under D(-)-HO and S(-)-HO conditions exhibit microvilli structure (MV) and tight junction structure (TJ).
Figure 20 Transcriptional expression analysis of drug transporter-related genes between D(-)-HO, S(-)-HO, primary cultured human hepatocytes (PHH), hepatoma cell line (HepG2), and 2D hepatocyte-like cells (2D HLC). As a result, it was confirmed that compared to 2D HLC, both D(-)-HO and S(-)-HO had high expression of apical drug transporter genes such as MRP2, BSEP, MDR1, and BCRP.
Figure 21 shows confirmation of the expression of MRP2 (stained with CDFDA), an apical drug transporter-related gene, in the apical monolayer membrane of D(-)-HO and S(-)-HO, and probenecid, an MRP2 inhibitor. As a result of the treatment, it was confirmed that each drug transporter-specific fluorescence accumulated in the lumen of the liver organoid.
Figure 22 shows confirmation of the expression of MDR1 (stained with rhodamine 123), an apical drug transporter-related gene, in the apical monolayer membrane of D(-)-HO and S(-)-HO, and ketoconazole, an MDR1 inhibitor. As a result of the treatment, it was confirmed that each drug transporter-specific fluorescence accumulated in the lumen of the liver organoid.
Figure 23 shows confirmation of the expression of BSEP (stained with CLF), an apical drug transporter-related gene, in the apical monolayer membrane of D(-)-HO and S(-)-HO, and treatment with ketoconazole, a BSEP inhibitor. As a result, it was confirmed that each drug transporter-specific fluorescence accumulated in the lumen of the liver organoid.
Figure 24 is a diagram confirming the presence of 19 different cell clusters in liver organoids.
Figure 25 shows that the liver organoid is composed of three cell groups, the first group contains biliary-like cells, and the second group contains gallbladder-like cells. It has been confirmed that the third group includes hepatocyte-like cells.
Figure 26 is a diagram confirming the expression of representative markers of each group (ALB, ASGR1, and SERPINA1 for the hepatocyte lineage, KRT19, EPCAM, and ITGB4 for the biliary lineage, and REG4, TFF3, and FCGBP for the gallbladder lineage).
Figure 27 is a diagram confirming that specific markers of each group are exclusively expressed in each cluster.
Figure 28 confirms that the four CYP450 genes in D(-)-HO and S(-)-HO show higher expression levels than D(+)-HO and S(+)-HO, and that D(-)- This diagram shows that liver organoids cultured under HO and S(-)-HO conditions have improved drug metabolism ability.
Figure 29 is a diagram showing the activities of major CYP450s in D(-)-HO, S(-)-HO, primary cultured human hepatocytes (PHH), hepatoma cell line (HepG2), and 2D hepatocyte-like cells (2D HLC).
Figure 30 is a schematic diagram of the process of differentiating liver endoderm organoids into liver organoids using liver organoid differentiation medium containing 20 μM iron citrate (FC).
Figure 31 is a diagram showing no cytotoxicity when differentiated into liver organoids using liver organoid differentiation medium containing 20 μM iron citrate (FC).
Figure 32 is a diagram showing that cells are alive when differentiated into liver organoids using liver organoid differentiation medium containing 20 μM iron citrate (FC).
Figure 33 is a measurement of the activity of the CYP450 enzyme for 24 hours. When differentiated into suspended liver organoids using liver organoid differentiation medium containing iron citrate, the activity of CYP450, a drug metabolizing enzyme, increased. It is also a degree.
Figure 34 shows the measurement of the activity of CYP450 enzyme for 7 days, showing that the activity of CYP450, a drug metabolizing enzyme, is maintained when differentiated into suspended liver organoids using liver organoid differentiation medium containing iron citrate. This is the diagram shown.
Figure 35 is a diagram showing that in most drugs, D-HO FC has cytotoxicity at lower concentrations than other cell models.
Figure 36 shows the ability of liver organoids differentiated using liver organoid differentiation medium containing iron citrate to metabolize drugs including amitriptyline (CYP2D6 and CYP2C19), chlorpromazine (CYP2D6), and diclofenac (CYP2C9 and UGT2B7). This is a diagram showing that it has a .
Figure 37 is a diagram showing the metabolic pathway of acetaminophen in the liver.
Figure 38 shows APAP-glucuronidase, a non-CYP450-mediated metabolite of acetaminophen in the liver, in liver organoids, primary cultured human hepatocytes (PHH), hepatoma cell line (HepG2), and 2D hepatocyte-like cells. This is a diagram showing the concentrations of nide (APAP-Glu) and APAP-sulfate (APAP-Sul).
39 shows APAP-glutathione (APAP-GSH), a CYP450-mediated metabolite of acetaminophen in the liver, in liver organoids, primary cultured human hepatocytes (PHH), hepatoma cell line (HepG2), and 2D hepatocyte like cells. ) and the concentration of APAP-cysteine (APAP-Cys).
Figure 40 is a diagram showing the metabolic pathway of fimasartan in the liver.
Figure 41 shows FMS S-oxide, BR, a CYP3A4-mediated metabolite of fimasartan in the liver in liver organoids, primary cultured human hepatocytes (PHH), hepatoma cell line (HepG2), and 2D hepatocyte like cells. This is a diagram showing the concentrations of -A-557 and BR-A-535.
42 shows 1-OH butyl FMS, a CYP2C9-mediated metabolite of fimasartan in the liver, in liver organoids, primary cultured human hepatocytes (PHH), hepatoma cell line (HepG2), and 2D hepatocyte like cells. This is a diagram showing the concentrations of 2- or 3-OH butyl FMS and 4-OH butyl FMS.
Figure 43 is a diagram showing the metabolic pathway where cyclophosphamide (CP) is metabolized in the liver and causes cardiac toxicity.
Figure 44 is a diagram showing the beating rate of hiPCS-CM with or without liver organoids after treatment with cyclophosphamide at concentrations of 250 and 500 μM for 24 hours and 72 hours.
Figure 45 shows the normalized field potential duration of hiPCS-CM with and without liver organoids after treatment with cyclophosphamide at concentrations of 250 and 500 μM for 24 hours and 72 hours.
Figure 46 is a diagram showing the metabolic pathway by which terbinafine ( TERfenadine, TER) exerts cardiac toxicity.
Figure 47 is a diagram showing the beating rate of hiPCS-CM with or without liver organoids after treatment with terbinafine at concentrations of 1 and 10 μM for 24 hours and 72 hours.
Figure 48 is a diagram showing the normalized field potential duration of hiPCS-CM with and without liver organoids after treatment with terbinafine at concentrations of 1 and 10 μM for 24 hours and 72 hours.
49 shows liver endoderm organoids (hHEO) and liver organoids (hHO) differentiated from human embryonic stem cells (control, con) and liver endoderm organoids differentiated from human embryonic stem cells with the R778L mutation in the ATP7B gene (hHEO) ) and micrographs of liver organoids (hHO) (WD, Wilson disease model) and the expression of liver markers Alpha1-antitrypsin (AAT) and Hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4A) in liver organoids from control and Wilson disease models. This is the diagram shown.
Figure 50 shows liver markers (ALB, This diagram shows the mRNA expression levels (AAT, ASGR1, CYP2C9, CYP2C19, CYP3A4).
51 shows genes involved in copper transport in control human embryonic stem cells (con ESC), control liver organoids (con HO), Wilson disease mutant human embryonic stem cells (WD ESC), and Wilson disease mutant liver organoids (WD HO). This diagram shows the mRNA expression levels of CTR1 and ATP7B, a gene related to copper excretion.
Figure 52 is a diagram showing the concentration of copper accumulated in cells when copper was treated at different concentrations to control liver organoids or Wilson disease mutant liver organoids.
Figure 53 is a diagram showing cell viability when copper was treated at different concentrations to control liver organoids or Wilson disease mutant liver organoids.
Figure 54 is a diagram showing cell viability when control liver organoids or Wilson disease mutant liver organoids were treated with a Wilson disease treatment drug.
Figure 55 is a diagram showing the expression level of ceruloplasmin mRNA in control liver organoids, Wilson's disease mutant liver organoids, and primary cultured human hepatocytes (PHH).
Figure 56 is a diagram showing the activity level of ceruloplasmin protein in control liver organoids, Wilson's disease mutant liver organoids, and primary cultured human hepatocytes (PHH).

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 1) 인간 전분화능 줄기세포(human pluripotent stem cell, hPSC)의 ATP7B(ATPase Copper Transporting Beta)에 돌연변이를 일으키는 단계;The present invention includes the steps of 1) causing a mutation in ATP7B (ATPase Copper Transporting Beta) of human pluripotent stem cells (hPSC);

2) 상기 단계 1)의 ATP7B 돌연변이 인간 전분화능 줄기세포(human pluripotent stem cell, hPSC)를 완전 내배엽 세포(definitive endoderm, DE)로 분화시키는 단계;2) Differentiating the ATP7B mutant human pluripotent stem cells (hPSC) of step 1) into definitive endoderm (DE) cells;

3) 상기 단계 2)의 완전 내배엽 세포를 간 내배엽 세포(hepatic endoderm, HE)로 분화시키는 단계;3) Differentiating the complete endoderm cells of step 2) into liver endoderm cells (hepatic endoderm, HE);

4) 상기 단계 3)의 간 내배엽 세포를 간 내배엽 오가노이드(hepatic endoderm organoid, hHEO)로 분화시키는 단계;4) Differentiating the liver endoderm cells of step 3) into liver endoderm organoids (hHEO);

5) 상기 단계 4)의 간 내배엽 오가노이드를 간 오가노이드(hepatic organoid, hHO)로 분화시키는 단계; 를 포함하는, 윌슨병 모델의 제조방법을 제공한다.5) Differentiating the liver endoderm organoid of step 4) into liver organoid (hepatic organoid, hHO); Provides a method for manufacturing a Wilson disease model, including.

상기 인간 전분화능 줄기세포는 인간 배아줄기세포(human embryonic stem cell, hESC) 또는 인간 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)일 수 있고, 인간 유래인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The human pluripotent stem cells may be human embryonic stem cells (hESC) or human induced pluripotent stem cells (iPSC), and may be of human origin, but are not limited thereto.

상기 ATP7B의 돌연변이에 의해 발생하는 질환인 윌슨병 이외에도, 상기 단계 1)의 인간 전분화능 줄기세포에 SERPINA1 유전자 돌연변이를 일으켜 알파-1-항트립신 결핍증(Alpha-1 AntiTrypsin Deficiency, AATD) 모델 및 SLC25A13 유전자 돌연변이를 일으켜 사이트린 결핍증(Citrin deficiency) 모델을 제조할 수 있다.In addition to Wilson's disease, which is a disease caused by the mutation of ATP7B, SERPINA1 gene mutation in human pluripotent stem cells in step 1) causes alpha-1 antitrypsin deficiency (AATD) model and SLC25A13 gene. It is possible to create a citrin deficiency model by causing mutations.

상기 알파-1-항트립신 결핍증(Alpha-1 AntiTrypsin Deficiency, AATD)은 SERPINA1 유전자의 변이로 알파-1 항트립신(Alpha-1 AntiTrypsin, A1AT) 단백질이 잘못 접히면서(misfolding) 나타나는 질환이다. 알파-1 항트립신(A1AT)은 감염이나 염증이 발생했을 때 면역반응에 의해 분비되는 단백질 분해 효소로부터 폐와 장기들을 보호한다. A1AT의 비정상적인 접힘은 A1AT가 생성되는 간을 떠나지 못하게 해 폐와 같은 장기들을 보호할 수 없게 한다.Alpha-1 AntiTrypsin Deficiency (AATD) is a disease that occurs when the Alpha-1 AntiTrypsin (A1AT) protein is misfolded due to a mutation in the SERPINA1 gene. Alpha-1 antitrypsin (A1AT) protects the lungs and organs from proteolytic enzymes secreted by the immune response when infection or inflammation occurs. Abnormal folding of A1AT prevents it from leaving the liver where it is produced, preventing it from protecting organs such as the lungs.

상기 사이트린 결핍증(Citrin deficiency)은 성인형 시투룰린혈증(citrullinemia type II, CTLN2)을 유발하거나, 담즙정체성 간염을 동반하는 신생아기의 NICCD(neonatal intrahepatic cholestasis caused by citrin deficiency)의 원인이 된다. 사이트린(aspartate-glutamate carrier protein)은 간의 사립체 막에 존재하며 aspartate를 세포질내로 이동시키는 작용을 한다. Aspartate는 시트룰린을 argininosuccinic acid로 변환하는데 필요하므로 이 과정에 문제가 생기면 시트룰린이 축적되게 된다.The citrin deficiency causes adult-type citrullinemia type II (CTLN2) or NICCD (neonatal intrahepatic cholestasis caused by citrin deficiency) in the neonatal period accompanied by cholestatic hepatitis. Cytrin (aspartate-glutamate carrier protein) exists in the liver mitochondrial membrane and acts to move aspartate into the cytoplasm. Aspartate is required to convert citrulline to argininosuccinic acid, so if there is a problem in this process, citrulline accumulates.

상기 단계 1)의 돌연변이는 ATP7B 단백질의 778번째 아미노산인 아르기닌(Arg, R)이 류신(leucine, L)로 치환된 R778L이다.The mutation in step 1) is R778L, in which arginine (Arg, R), the 778th amino acid of the ATP7B protein, is replaced with leucine (L).

상기 R778L 돌연변이는 CRISPR/Cas9 유전자 편집 기술을 이용하여 유도될 수 있다.The R778L mutation can be induced using CRISPR/Cas9 gene editing technology.

구체적으로, ATP7B의 엑손 8을 표적으로 하는 가이드 RNA(single guide RNA, sgRNA)를 pSpCas9(BB) 2APuro(PX459) V2.0 벡터에 클로닝하고, 가이드 RNA가 삽입된 벡터 및 돌연변이 된 서열을 포함하는 단일 가닥 DNA 올리고 뉴클레오티드를 리포펙타민을 사용하여 인간 배아 줄기 세포에 형질 감염시켜 제작될 수 있다.Specifically, a guide RNA (single guide RNA, sgRNA) targeting exon 8 of ATP7B was cloned into the pSpCas9(BB) 2APuro(PX459) V2.0 vector, and the guide RNA was inserted into the vector containing the mutated sequence. Single-stranded DNA oligonucleotides can be produced by transfecting human embryonic stem cells using lipofectamine.

R778L 돌연변이 유전자좌의 인접 게놈 영역을 표적으로 하는 다양한 단일 가이드 RNA(sgRNA) 후보 중에서 두 개의 sgRNA(sgRNA-1: AGTGTTCCAGCCACCGGCCC(서열번호 1), sgRNA-2: CATTGCCCTGGGCCGGTGGC(서열번호 2))를 선택하고, Cas9 단백질 및 퓨로마이신 내성 유전자를 공동 발현하는 px459 플라스미드에 통합하였다. R778L에 대한 단일 염기 치환을 도입하기 위해, 표적 영역의 각 면에 돌연변이 서열(c.2333G> T)과 상동 서열을 포함하는 단일 가닥 올리고 데옥시뉴클레오티드(ssODNs, 서열번호 3)를 설계하였다.Among various single guide RNA (sgRNA) candidates targeting the adjacent genomic region of the R778L mutation locus, two sgRNAs (sgRNA-1: AGTGTTCCAGCCACCGGCCC (SEQ ID NO: 1), sgRNA-2: CATTGCCCTGGGCCGGTGGC (SEQ ID NO: 2)) were selected; It was integrated into the px459 plasmid, which co-expresses the Cas9 protein and the puromycin resistance gene. To introduce a single base substitution for R778L, single-stranded oligodeoxynucleotides (ssODNs, SEQ ID NO: 3) containing the mutant sequence (c.2333G>T) and the homologous sequence on each side of the target region were designed.

상기 단계 3)의 간 내배엽 세포는 전체 세포 중 95% 이상 함유되고, 유세포 분석을 통하여 간 내배엽 세포가 95% 이상 함유되는 것이 확인될 경우 단계 4)로 진행한다.In step 3), the liver contains more than 95% of the total cells, and if it is confirmed through flow cytometry that the liver contains more than 95% of the liver endoderm cells, proceed to step 4).

상기 분화는 세포의 미세환경 모사를 위해 마트리겔이 코팅된 배양용기에서 줄기세포를 분화시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 피브로넥틴(fibronectin) 또는 라미닌(laminin)이 코팅된 배양용기가 사용될 수 있다.The differentiation may be to differentiate stem cells in a culture vessel coated with Matrigel to simulate the microenvironment of cells, but is not limited to this, and a culture vessel coated with fibronectin or laminin may be used. .

상기 간 내배엽 오가노이드는 물방울 형태(droplet) 또는 현탁 상태(suspension)로 제조될 수 있다.The liver endoderm organoids can be prepared in droplet form or suspension.

상기 물방울 형태의 간 내배엽 오가노이드는 간 내배엽 세포와 Matrigel GFR(growth factor reduced) 원액을 혼합하여 웰 플라이트에 돔 구조로 분주하고 굳혀서 제조할 수 있다.The droplet-shaped liver endoderm organoids can be produced by mixing liver endoderm cells and Matrigel GFR (growth factor reduced) stock solution, dispensing into a dome structure in a well flight, and solidifying.

상기 현탁 상태의 간 내배엽 오가노이드는 Matrigel GFR(growth factor reduced)가 포함된 배지가 분주된 웰 플레이트에 간 내배엽 세포를 첨가하여 제조할 수 있다.The suspended liver endoderm organoids can be produced by adding liver endoderm cells to a well plate dispensed with medium containing Matrigel GFR (growth factor reduced).

상기 단계 4)의 분화는 발생 단계(generation stage) 및 확장 단계(expansion stage)로 이루어진다.The differentiation of stage 4) consists of a generation stage and an expansion stage.

발생 단계는 간 내배엽 오가노이드 생산 배지(GE medium, GM)에서 이루어진다.The developmental stage takes place in liver endoderm organoid production medium (GE medium, GM).

상기 간 내배엽 오가노이드 생산 배지는 섬유아세포 성장 인자 10(fibroblast growth factor, FGF10), 간 세포 성장 인자(hepatocyte growth factor, HGF), 니코틴아마이드(nicotinamide), [Leu15]-Gastrin I human, N-acetyl-L-cysteine, A83-01, Forskolin, CHIR 99021을 포함하고, 현탁 상태의 간 내배엽 오가노이드를 제조하고자 하는 경우 선택적으로 Matrigel GFR(growth factor reduced)를 포함할 수 있다.The liver endoderm organoid production medium contains fibroblast growth factor 10 (FGF10), hepatocyte growth factor (HGF), nicotinamide, [Leu 15 ]-Gastrin I human, N- It contains acetyl-L-cysteine, A83-01, Forskolin, and CHIR 99021, and may optionally contain Matrigel GFR (growth factor reduced) if it is desired to produce liver endoderm organoids in suspension.

상기 FGF10는 상기 배지에 30 내지 70ng/㎖, 바람직하게는 40 내지 60ng/㎖ 또는 더 바람직하게는 45 내지 55ng/㎖로 포함될 수 있다.The FGF10 may be included in the medium at 30 to 70 ng/ml, preferably 40 to 60 ng/ml, or more preferably 45 to 55 ng/ml.

상기 HGF는 상기 배지에 5 내지 45ng/㎖, 바람직하게는 15 내지 35ng/㎖ 또는 더 바람직하게는 20 내지 30ng/㎖로 포함될 수 있다.The HGF may be included in the medium at 5 to 45 ng/ml, preferably 15 to 35 ng/ml, or more preferably 20 to 30 ng/ml.

상기 니코틴아마이드는 상기 배지에 1 내지 20mM, 바람직하게는 5 내지 15mM 또는 더 바람직하게는 7 내지 13mM로 포함될 수 있다.The nicotinamide may be included in the medium at 1 to 20mM, preferably 5 to 15mM, or more preferably 7 to 13mM.

상기 [Leu15]-Gastrin I human는 상기 배지에 1 내지 20nM, 바람직하게는 5 내지 15nM 또는 더 바람직하게는 7 내지 13nM로 포함될 수 있다.The [Leu 15 ]-Gastrin I human may be included in the medium at 1 to 20 nM, preferably 5 to 15 nM, or more preferably 7 to 13 nM.

상기 N-acetyl-L-cysteine는 상기 배지에 0.25 내지 2.25mM, 바람직하게는 0.5 내지 2mM 또는 더 바람직하게는 1 내지 1.5mM로 포함될 수 있다.The N-acetyl-L-cysteine may be included in the medium at 0.25 to 2.25mM, preferably 0.5 to 2mM, or more preferably 1 to 1.5mM.

상기 A83-01는 상기 배지에 1 내지 9μM, 바람직하게는 3 내지 7μM 또는 더 바람직하게는 4 내지 6μM로 포함될 수 있다.The A83-01 may be included in the medium at 1 to 9 μM, preferably 3 to 7 μM, or more preferably 4 to 6 μM.

상기 Forskolin은 상기 배지에 5 내지 15μM, 바람직하게는 7 내지 13μM 또는 더 바람직하게는 8 내지 12μM로 포함될 수 있다.The Forskolin may be included in the medium at 5 to 15 μM, preferably 7 to 13 μM, or more preferably 8 to 12 μM.

상기 CHIR 99021은 상기 배지에 1 내지 5μM, 바람직하게는 2 내지 4μM 또는 더 바람직하게는 2.5 내지 3.5μM로 포함될 수 있다.The CHIR 99021 may be included in the medium at 1 to 5 μM, preferably 2 to 4 μM, or more preferably 2.5 to 3.5 μM.

상기 Matrigal GFR은 상기 배지에 0.2 내지 0.8mg/㎖, 바람직하게는 0.3 내지 0.7mg/㎖ 또는 더 바람직하게는 0.4 내지 0.6mg/㎖로 포함될 수 있다.The Matrigal GFR may be included in the medium at 0.2 to 0.8 mg/ml, preferably 0.3 to 0.7 mg/ml, or more preferably 0.4 to 0.6 mg/ml.

상기 발생 단계는 10일 내지 18일 동안 수행될 수 있고, 바람직하게는 12 내지 16일 동안 수행될 수 있으며 더 바람직하게는 13 내지 15일 동안 수행될 수 있다.The development step may be performed for 10 to 18 days, preferably 12 to 16 days, and more preferably 13 to 15 days.

상기 확장 단계는 상기 발생 단계에서 사용한 간 내배엽 오가노이드 생산 배지와 동일한 조성을 가진 배지에서 이루어진다.The expansion step takes place in a medium with the same composition as the liver endoderm organoid production medium used in the development step.

상기 확장 단계는 3일 내지 7일 동안 수행될 수 있고, 바람직하게는 4일 내지 6일 동안 수행될 수 있다.The expansion step may be performed for 3 to 7 days, preferably 4 to 6 days.

기존의 간 오가노이드 배양 방법에서의 배지 조성(Hugh et al., Long-Term Culture of Genome-Stable Bipotent Stem Cells from Adult Human Liver, Cell (2015))과 비교하여, 간 내배엽 세포를 간 내배엽 오가노이드로 분화시키는 단계 중 발생 단계(generation stage)에서 사용되는 배지에서 R spondin-1, Noggin 및 EGF가 없고, 확장 단계(expansion stage)에서 R spondin-1 및 EGF가 포함되지 않는다.Compared to the medium composition in the existing liver organoid culture method (Hugh et al., Long-Term Culture of Genome-Stable Bipotent Stem Cells from Adult Human Liver, Cell (2015)), liver endoderm cells were grown into liver endoderm organoids. The medium used in the generation stage of differentiation does not contain R spondin-1, Noggin, and EGF, and the expansion stage does not contain R spondin-1 and EGF.

상기 간 내배엽 세포를 간 내배엽 오가노이드로 분화시키는 단계는 13일 내지 25일 동안 수행될 수 있고, 바람직하게는 15일 내지 23일 동안 수행될 수 있으며, 더 바람직하게는 17일 내지 21일 동안 수행될 수 있다.The step of differentiating the liver endoderm cells into liver endoderm organoids may be performed for 13 to 25 days, preferably for 15 to 23 days, and more preferably for 17 to 21 days. It can be.

상기 단계 5)의 간 오가노이드는 물방울 형태(droplet) 또는 현탁 상태(suspension)로 제조될 수 있다.The liver organoids in step 5) may be prepared in droplet form or suspension.

상기 단계 5)의 분화는 간 내배엽 오가노이드를 계대 배양하는 단계 및 간 내배엽 오가노이드를 간 오가노이드로 분화시키는 단계로 구성된다.The differentiation in step 5) consists of subculturing the liver endoderm organoids and differentiating the liver endoderm organoids into liver organoids.

물방울 형태의 간 오가노이드는 물방울 형태의 간 내배엽 오가노이드를 계대 배양하는 단계 및 간 오가노이드로 분화시키는 단계를 수행하여 제조된다.The droplet-shaped liver organoids are prepared by subculturing the droplet-shaped liver endoderm organoids and differentiating them into liver organoids.

현탁 상태의 간 오가노이드는 현탁 상태의 간 내배엽 오가노이드를 계대 배양하는 단계 및 간 오가노이드로 분화시키는 단계를 수행하여 제조된다.Liver organoids in suspension are prepared by subculturing liver endoderm organoids in suspension and differentiating them into liver organoids.

상기 간 내배엽 오가노이드를 계대 배양하는 단계는 간 내배엽 오가노이드 유지 배지(EM)에서 수행된다.The step of subculturing the liver endoderm organoids is performed in liver endoderm organoid maintenance medium (EM).

상기 간 내배엽 오가노이드 유지 배지는 골형성 단백질(bone morphogenetic protein 7, BMP7), 섬유아세포 성장 인자 10(fibroblast growth factor, FGF10), 간 세포 성장 인자(hepatocyte growth factor, HGF), 니코틴아마이드(nicotinamide), [Leu15]-Gastrin I human, N-acetyl-L-cysteine, A83-01, Forskolin, CHIR 99021을 포함하고, 현탁 상태의 간 오가노이드를 제조하고자 하는 경우 선택적으로 Matrigel GFR(growth factor reduced)를 포함할 수 있다.The liver endoderm organoid maintenance medium contains bone morphogenetic protein 7 (BMP7), fibroblast growth factor 10 (FGF10), hepatocyte growth factor (HGF), and nicotinamide. , [Leu 15 ]-Gastrin I human, N-acetyl-L-cysteine, A83-01, Forskolin, CHIR 99021, and optionally Matrigel GFR (growth factor reduced) when producing liver organoids in suspension. may include.

상기 BMP7은 상기 배지에 5 내지 45ng/㎖, 바람직하게는 15 내지 35ng/㎖ 또는 더 바람직하게는 20 내지 30ng/㎖로 포함될 수 있다.The BMP7 may be included in the medium at 5 to 45 ng/ml, preferably 15 to 35 ng/ml, or more preferably 20 to 30 ng/ml.

상기 FGF10는 상기 배지에 30 내지 70ng/㎖, 바람직하게는 40 내지 60ng/㎖ 또는 더 바람직하게는 45 내지 55ng/㎖로 포함될 수 있다.The FGF10 may be included in the medium at 30 to 70 ng/ml, preferably 40 to 60 ng/ml, or more preferably 45 to 55 ng/ml.

상기 HGF는 상기 배지에 5 내지 45ng/㎖, 바람직하게는 15 내지 35ng/㎖ 또는 더 바람직하게는 20 내지 30ng/㎖로 포함될 수 있다.The HGF may be included in the medium at 5 to 45 ng/ml, preferably 15 to 35 ng/ml, or more preferably 20 to 30 ng/ml.

상기 니코틴아마이드는 상기 배지에 1 내지 20mM, 바람직하게는 5 내지 15mM 또는 더 바람직하게는 7 내지 13mM로 포함될 수 있다.The nicotinamide may be included in the medium at 1 to 20mM, preferably 5 to 15mM, or more preferably 7 to 13mM.

상기 [Leu15]-Gastrin I human는 상기 배지에 1 내지 20nM, 바람직하게는 5 내지 15nM 또는 더 바람직하게는 7 내지 13nM로 포함될 수 있다.The [Leu 15 ]-Gastrin I human may be included in the medium at 1 to 20 nM, preferably 5 to 15 nM, or more preferably 7 to 13 nM.

상기 N-acetyl-L-cysteine는 상기 배지에 0.25 내지 2.25mM, 바람직하게는 0.5 내지 2mM 또는 더 바람직하게는 1 내지 1.5mM로 포함될 수 있다.The N-acetyl-L-cysteine may be included in the medium at 0.25 to 2.25mM, preferably 0.5 to 2mM, or more preferably 1 to 1.5mM.

상기 A83-01는 상기 배지에 1 내지 9μM, 바람직하게는 3 내지 7μM 또는 더 바람직하게는 4 내지 6μM로 포함될 수 있다.The A83-01 may be included in the medium at 1 to 9 μM, preferably 3 to 7 μM, or more preferably 4 to 6 μM.

상기 Forskolin은 상기 배지에 5 내지 15μM, 바람직하게는 7 내지 13μM 또는 더 바람직하게는 8 내지 12μM로 포함될 수 있다.The Forskolin may be included in the medium at 5 to 15 μM, preferably 7 to 13 μM, or more preferably 8 to 12 μM.

상기 CHIR 99021은 상기 배지에 1 내지 5μM, 바람직하게는 2 내지 4μM 또는 더 바람직하게는 2.5 내지 3.5μM로 포함될 수 있다.The CHIR 99021 may be included in the medium at 1 to 5 μM, preferably 2 to 4 μM, or more preferably 2.5 to 3.5 μM.

상기 Matrigal GFR은 상기 배지에 0.2 내지 0.8mg/㎖, 바람직하게는 0.3 내지 0.7mg/㎖ 또는 더 바람직하게는 0.4 내지 0.6mg/㎖로 포함될 수 있다.The Matrigal GFR may be included in the medium at 0.2 to 0.8 mg/ml, preferably 0.3 to 0.7 mg/ml, or more preferably 0.4 to 0.6 mg/ml.

상기 간 내배엽 오가노이드를 계대 배양하는 단계는 2일 내지 8일 동안 수행될 수 있고, 바람직하게는 3 내지 7일 동안 수행될 수 있으며 더 바람직하게는 4 내지 6일 동안 수행될 수 있다.The step of subculturing the liver endoderm organoids may be performed for 2 to 8 days, preferably for 3 to 7 days, and more preferably for 4 to 6 days.

상기 간 내배엽 오가노이드를 간 오가노이드로 분화시키는 단계는 간 오가노이드 분화 배지(DM)에서 수행된다.The step of differentiating the liver endoderm organoids into liver organoids is performed in liver organoid differentiation medium (DM).

상기 간 오가노이드 분화 배지는 골형성단백질(bone morphogenetic protein 7, BMP7), 섬유아세포 성장 인자 19(fibroblast growth factor, FGF19), 간 세포 성장 인자(hepatocyte growth factor, HGF), [Leu15]-Gastrin I human, N-acetyl-L-cysteine, A83-01, DAPT, 덱사메타손(dexamethasone)을 포함하고, 현탁 상태의 간 오가노이드를 제조하고자 하는 경우 선택적으로 Matrigel GFR(growth factor reduced)를 포함할 수 있으며, 약물 대사 능력을 추가로 증진시키기 위하여 구연산 철(ferric citrate, FC)를 추가적으로 포함할 수 있다.The liver organoid differentiation medium contains bone morphogenetic protein 7 (BMP7), fibroblast growth factor 19 (FGF19), hepatocyte growth factor (HGF), and [Leu 15 ]-Gastrin. It contains I human, N-acetyl-L-cysteine, A83-01, DAPT, and dexamethasone, and can optionally contain Matrigel GFR (growth factor reduced) if you want to manufacture liver organoids in suspension. , ferric citrate (FC) may be additionally included to further enhance drug metabolism ability.

상기 BMP7은 상기 배지에 5 내지 45ng/㎖, 바람직하게는 15 내지 35ng/㎖ 또는 더 바람직하게는 20 내지 30ng/㎖로 포함될 수 있다.The BMP7 may be included in the medium at 5 to 45 ng/ml, preferably 15 to 35 ng/ml, or more preferably 20 to 30 ng/ml.

상기 FGF19는 상기 배지에 50 내지 150ng/㎖, 바람직하게는 70 내지 130ng/㎖ 또는 더 바람직하게는 90 내지 110ng/㎖로 포함될 수 있다.The FGF19 may be included in the medium at 50 to 150 ng/ml, preferably 70 to 130 ng/ml, or more preferably 90 to 110 ng/ml.

상기 HGF는 상기 배지에 5 내지 45ng/㎖, 바람직하게는 15 내지 35ng/㎖ 또는 더 바람직하게는 20 내지 30ng/㎖로 포함될 수 있다.The HGF may be included in the medium at 5 to 45 ng/ml, preferably 15 to 35 ng/ml, or more preferably 20 to 30 ng/ml.

상기 [Leu15]-Gastrin I human는 상기 배지에 1 내지 20nM, 바람직하게는 5 내지 15nM 또는 더 바람직하게는 7 내지 13nM로 포함될 수 있다.The [Leu 15 ]-Gastrin I human may be included in the medium at 1 to 20 nM, preferably 5 to 15 nM, or more preferably 7 to 13 nM.

상기 N-acetyl-L-cysteine는 상기 배지에 0.25 내지 2.25mM, 바람직하게는 0.5 내지 2mM 또는 더 바람직하게는 1 내지 1.5mM로 포함될 수 있다.The N-acetyl-L-cysteine may be included in the medium at 0.25 to 2.25mM, preferably 0.5 to 2mM, or more preferably 1 to 1.5mM.

상기 A83-01는 상기 배지에 0.1 내지 0.9μM, 바람직하게는 0.2 내지 0.8μM 또는 더 바람직하게는 0.4 내지 0.6μM로 포함될 수 있다.The A83-01 may be included in the medium at 0.1 to 0.9 μM, preferably 0.2 to 0.8 μM, or more preferably 0.4 to 0.6 μM.

상기 DAPT는 상기 배지에 0.2 내지 1.8㎕, 바람직하게는 0.5 내지 1.5㎕ 또는 더 바람직하게는 0.8 내지 1.2㎕로 포함될 수 있다.The DAPT may be included in the medium in an amount of 0.2 to 1.8 μl, preferably 0.5 to 1.5 μl, or more preferably 0.8 to 1.2 μl.

상기 덱사메타손은 상기 배지에 1 내지 5μM, 바람직하게는 2 내지 4μM 또는 더 바람직하게는 2.5 내지 3.5μM로 포함될 수 있다.The dexamethasone may be included in the medium at 1 to 5 μM, preferably 2 to 4 μM, or more preferably 2.5 to 3.5 μM.

상기 Matrigal GFR은 상기 배지에 0.2 내지 0.8mg/㎖, 바람직하게는 0.3 내지 0.7mg/㎖ 또는 더 바람직하게는 0.4 내지 0.6mg/㎖로 포함될 수 있다.The Matrigal GFR may be included in the medium at 0.2 to 0.8 mg/ml, preferably 0.3 to 0.7 mg/ml, or more preferably 0.4 to 0.6 mg/ml.

상기 구연산 철은 10 내지 30μM의 농도로 포함될 수 있고, 바람직하게는 15 내지 25μM의 농도로 포함될 수 있다.The iron citrate may be included at a concentration of 10 to 30 μM, preferably 15 to 25 μM.

상기 간 내배엽 오가노이드를 간 오가노이드로 분화시키는 단계는 10일 내지 20일 동안 수행될 수 있고, 바람직하게는 12 내지 18일 동안 수행될 수 있으며 더 바람직하게는 13 내지 17일 동안 수행될 수 있다.The step of differentiating the liver endoderm organoids into liver organoids may be performed for 10 to 20 days, preferably for 12 to 18 days, and more preferably for 13 to 17 days. .

또한, 간 내배엽 오가노이드를 간 오가노이드로 분화시키는 단계 중 간 내배엽 오가노이드를 계대 배양하는 단계에서 기존의 배양 방법과 비교하여 R spondin-1 및 EGF가 포함되지 않고, 간 내배엽 오가노이드를 간 오가노이드로 분화시키는 단계에서 EGF가 포함되지 않는다.In addition, compared to the conventional culture method in the step of subculturing the liver endoderm organoids during the step of differentiating liver endoderm organoids into liver organoids, R spondin-1 and EGF are not included, and the liver endoderm organoids are converted into liver organoids. EGF is not included in the stage of differentiation into noids.

결론적으로, 간 내배엽 오가노이드로의 분화 단계에서 R-spondin 1, Noggin 및 EGF를 포함하지 않는 배양 배지에서 배양하는 것이 오가노이드 성숙 단계에서 영향을 미치며, 간 오가노이드로의 분화 단계에서 배양 배지에서 R-spondin 1, EGF의 제거가 간 및 약물 대사에 관련된 유전자의 발현 수준을 증가시켜 간 오가노이드의 성숙을 촉진시킨다.In conclusion, culturing in culture medium without R-spondin 1, Noggin and EGF influences organoid maturation at the stage of differentiation into liver endoderm organoids. Removal of R-spondin 1 and EGF promotes the maturation of liver organoids by increasing the expression levels of genes involved in liver and drug metabolism.

상기 단계 5)의 분화는 10일 내지 30일 동안 수행될 수 있고, 바람직하게는 13일 내지 27일 동안 수행될 수 있으며 더 바람직하게는 15 내지 25일 동안 수행될 수 있다.The differentiation in step 5) may be performed for 10 to 30 days, preferably for 13 to 27 days, and more preferably for 15 to 25 days.

또한, 본 발명은 상기 윌슨병 모델의 제조방법에 의해 제조된 간 오가노이드 기반 윌슨병 모델을 제공한다.Additionally, the present invention provides a liver organoid-based Wilson's disease model prepared by the method for producing the Wilson's disease model.

상기 윌슨병 모델은 세룰로플라스민(ceruloplasmin, CP)의 발현 감소를 특징으로 한다.The Wilson disease model is characterized by decreased expression of ceruloplasmin (CP).

상기 윌슨병 모델은 세포 내 구리 축적을 특징으로 한다.The Wilson disease model is characterized by intracellular copper accumulation.

또한, 본 발명은 윌슨병 모델에 피검 물질을 접촉시키는 단계; 및In addition, the present invention includes the steps of contacting a test substance with a Wilson's disease model; and

상기 피검 물질이 처리된 윌슨 병 모델에서 세룰로플라스민(ceruloplasmin, CP)의 발현 수준 또는 활성 수준, 또는 세포 생존능(cell viability)을 대조군 모델과 비교하는 단계를 포함하는, 윌슨 병의 예방 또는 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.Comprising the step of comparing the expression level or activity level of ceruloplasmin (CP), or cell viability in the Wilson disease model treated with the test substance with the control model, for the prevention or treatment of Wilson's disease Provides a method for screening.

상기 방법에 있어서, 상기 피검물질은 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액 또는 동물 조직 추출액으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.In the above method, the test substance may be any one selected from the group consisting of peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, or animal tissue extracts, but is not limited thereto.

상기 피검 물질은 단일 화합물, 화합물들의 혼합물(예컨대, 천연 추출물 또는 세포 또는 조직 배양물), 항체 또는 펩티드 이거나, 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA), Microsource(USA) 및 SigmaAldrich(USA)에서 상업적으로 구입 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(USA) 및 MycoSearch(USA)에서 상업적으로 구입 가능하다.The test substance may be a single compound, a mixture of compounds (e.g., natural extract or cell or tissue culture), an antibody or peptide, or may be obtained from a library of synthetic or natural compounds. Methods for obtaining libraries of such compounds are known in the art. Libraries of synthetic compounds are commercially available from Maybridge Chemical Co. (UK), Comgenex (USA), Brandon Associates (USA), Microsource (USA), and SigmaAldrich (USA), and libraries of natural compounds are available from Pan Laboratories (USA) and It is commercially available from MycoSearch (USA).

상기 세룰로플라스민 발현 수준 또는 활성 수준, 또는 세포 생존능이 대조군에 비해 증가한 경우, 윌슨 병의 예방 또는 치료제인 것으로 판단한다.If the ceruloplasmin expression level or activity level, or cell viability is increased compared to the control group, it is judged to be a preventive or therapeutic agent for Wilson's disease.

상기 세룰로플라스민 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계는 당업계에서 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있으며, 예를 들어, 웨스턴 블롯팅(western blotting), 닷 블롯팅(dot blotting), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay), 방사능 면역분석법(RIA), 방사면역확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역 전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전법(immunoprecipitation), 보체 고정 분석법, 유세포 분석법(FACS) 또는 단백질 칩 방법 등이 사용될 수 있다.The step of measuring the expression level of the ceruloplasmin gene can be performed through various methods known in the art, for example, western blotting, dot blotting, enzyme immunohistochemistry. Enzyme-linked immunosorbent assay, radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Ouchteroni immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, immunohistochemical staining, immunoprecipitation, complement fixation assay, flow cytometry. (FACS) or protein chip methods may be used.

상기 세룰로플라스민 단백질의 활성 수준을 측정하는 단계는 당업계에서 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있으며, 웨스턴 블랏팅(Western blotting), 면역침강법(immunoprecipitation assay), 이중 루시퍼라제 측정법(dual luciferase reporter assay), 효소면역분석법(ELISA) 및 면역조직화학법으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법으로 측정하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.The step of measuring the activity level of the ceruloplasmin protein can be performed through various methods known in the art, including Western blotting, immunoprecipitation assay, and dual luciferase assay. It may be measured by any one method selected from the group consisting of luciferase reporter assay), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and immunohistochemistry, but is not limited to this.

스크리닝 방법을 통해 얻은, 윌슨병 모델에서의 세룰로플라스민의 발현 수준을 증가시키고 및/또는 세룰로플라스민 단백질의 활성 수준을 증가시키는 시험 물질은 윌슨병의 치료를 위한 유효 물질이 될 수 있다. 이와 같은 윌슨병의 치료를 위한 후보 물질은 이후 윌슨병 치료제의 개발 과정에서 선도물질 (leading compound)로서 작용하게 되며, 상기 선도물질이 보다 유효한 윌슨병의 치료 효과를 나타낼 수 있도록 그 구조를 변형시키고 최적화함으로써, 새로운 윌슨병의 치료제를 개발할 수 있다.A test substance that increases the expression level of ceruloplasmin and/or increases the activity level of ceruloplasmin protein in a Wilson's disease model, obtained through a screening method, can be an effective substance for the treatment of Wilson's disease. Such a candidate substance for the treatment of Wilson's disease will later act as a leading compound in the development process of a treatment for Wilson's disease, and its structure will be modified so that the leading compound can exhibit a more effective treatment effect for Wilson's disease. By optimizing it, a new treatment for Wilson's disease can be developed.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 간 내배엽 세포로부터 간 내배엽 오가노이드를 분화시키는 단계에서 Wnt 신호 전달과정이 필요하지 않음을 확인하고(도 5), 간 내배엽 세포로부터 간 내배엽 오가노이드를 분화시키는 단계의 배지 조성 중 R-Spondin 1, Noggin 및 EGF(RNE)를 제외한 배지에서 배양한 경우에 RNE를 포함하는 배지에서 배양한 경우에 비해 오가노이드의 수가 동등 또는 그 이상이고(도 6 및 도 7), 오가노이드 형성 속도가 증가하며(도 8), 간 전구 세포 마커인 SOX9, CK19 및 EpCAM이 잘 발현하고 있음을 확인하였다(도 10). 또한, EGF가 없는 배양 배지 조건에서 간 내배엽 오가노이드로부터 간 오가노이드를 분화시켰을 때, 주요 간 유전자의 발현이 증가하였으며(도 13), 간 마커인 ALB, AAT, CYP3A4이 발현되며(도 15), D(-)-HO 및 S(-)-HO에서 간 마커의 발현 수준이 높고(도 16), D(-)-HO 및 S(-)-HO에서 D(+)-HO 및 S(+)-HO보다 간 마커인 ALB(알부민), AAT(Alpha 1-antitrypsin), 및 ApoA1(Apolipoprotein A1) 단백질의 발현이 증가함을 확인하였다(도 18). 또한, 간 오가노이드에서 정단부 약물 수송체(apical transporter)의 발현이 높으며(도 20), 담도 유사 세포(biliary-like cell), 담낭 유사 세포(gallbladder-like cell), 간 세포 유사 세포(hepatocyte-like cell)가 포함되어 있고(도 25 내지 도 27), 약물 대사 효소인 CYP450 유전자의 발현 수준이 D(-)-HO 및 S(-)-HO에서 D(+)-HO 및 S(+)-HO보다 높음을 확인하였다(도 28 및 도 29). 또한, 표 8 또는 표 9의 조성을 가지는 간 오가노이드 분화 배지에 구연산 철을 첨가하여 간 오가노이드를 분화시키는 경우(도 30), CYP450 활성이 크게 증가하였고(도 33), 장기간 동안 효소 활성이 유지되었다(도 34). 또한, 구연산 철을 첨가하여 분화시킨 간 오가노이드는 8종의 약물에서 세포 독성을 나타냈고(도 35), CYP450 매개 약물 대사 능력을 나타냈으며(도 36), 아세트아미노펜 및 피마사르탄 대사 능력이 있음과(도 37 내지 도 42), 사이클로포스파마이드 및 테르비나핀에 의한 심장 독성을 나타냄을 확인하였다(도 43 내지 도 48). 또한, 윌슨병 유발 돌연변이(R778L)가 있는 인간 배아 줄기 세포로부터 윌슨병 간 오가노이드 모델을 제조하고, 제조한 윌슨병 간 오가노이드 모델에서 간 마커인 AAT및 HNF4A가 발현되는 것을 확인하였으며(도 49), mRNA 및 단백질 수준에서 다양한 간 마커가 발현됨을 확인하였따(도 50). 또한, 대조군 및 윌슨병 간 오가노이드 모델에서 구리 수송에 관련된 유전자인 CRT1 및 구리 배출에 관련된 유전자인 ATP7B가 높게 발현되는 것을 확인하였다(도 51). 또한, 윌슨병 간 오가노이드 모델에서 구리의 처리 농도가 증가함에 따라 세포 내 구리 축적 농도가 대조군에 비해 증가하고, 세포 생존능은 감소하는 것을 확인하여 구리 배출이 되지 않는 윌슨병의 표현형을 재현하는 것을 확인하고(도 52), 윌슨병 치료 약물을 처리하였을 때, 세포 생존능이 증가하는 것을 확인하였다(도 54). 또한, 윌슨병 간 오가노이드 모델에서 세룰로플라스민 mRNA발현 수준과 단백질 활성 수준이 감소한 것을 확인하였다(도 55 및 도 56).In a specific embodiment of the present invention, it was confirmed that the Wnt signaling process is not required in the step of differentiating liver endoderm organoids from liver endoderm cells (FIG. 5), and the step of differentiating liver endoderm organoids from liver endoderm cells was confirmed. When cultured in a medium excluding R-Spondin 1, Noggin, and EGF (RNE), the number of organoids was equal to or greater than when cultured in a medium containing RNE (FIGS. 6 and 7); The organoid formation rate increased (Figure 8), and liver progenitor cell markers SOX9, CK19, and EpCAM were confirmed to be well expressed (Figure 10). In addition, when liver organoids were differentiated from liver endodermal organoids in EGF-free culture medium conditions, the expression of major liver genes increased (Figure 13), and liver markers ALB, AAT, and CYP3A4 were expressed (Figure 15). , the expression levels of liver markers were high in D(-)-HO and S(-)-HO (Figure 16), and in D(-)-HO and S(-)-HO, D(+)-HO and S( It was confirmed that the expression of liver markers ALB (albumin), AAT (Alpha 1-antitrypsin), and ApoA1 (Apolipoprotein A1) protein was increased compared to +)-HO (FIG. 18). In addition, the expression of apical drug transporters is high in liver organoids (FIG. 20), and biliary-like cells, gallbladder-like cells, and hepatocyte-like cells are present in liver organoids. like cell) (Figures 25 to 27), and the expression level of the drug metabolizing enzyme CYP450 gene ranges from D(-)-HO and S(-)-HO to D(+)-HO and S(+). It was confirmed that it was higher than -HO (Figures 28 and 29). In addition, when liver organoids were differentiated by adding iron citrate to the liver organoid differentiation medium having the composition of Table 8 or Table 9 (Figure 30), CYP450 activity significantly increased (Figure 33), and the enzyme activity was maintained for a long period of time. (Figure 34). In addition, liver organoids differentiated by adding iron citrate showed cytotoxicity for eight types of drugs (Figure 35), showed CYP450-mediated drug metabolism (Figure 36), and had the ability to metabolize acetaminophen and pimasartan. It was confirmed that there was (Figures 37 to 42) and cardiac toxicity caused by cyclophosphamide and terbinafine (Figures 43 to 48). In addition, a Wilson disease liver organoid model was prepared from human embryonic stem cells with a Wilson disease-causing mutation (R778L), and liver markers AAT and HNF4A were confirmed to be expressed in the produced Wilson disease liver organoid model (Figure 49 ), it was confirmed that various liver markers were expressed at the mRNA and protein levels (Figure 50). In addition, it was confirmed that CRT1, a gene related to copper transport, and ATP7B, a gene related to copper excretion, were highly expressed in the control group and Wilson's disease liver organoid model (FIG. 51). In addition, in the Wilson disease liver organoid model, as the copper treatment concentration increased, the intracellular copper accumulation concentration increased and cell viability decreased compared to the control group, confirming that the phenotype of Wilson disease in which copper is not excreted was reproduced. It was confirmed (Figure 52) that cell viability increased when treated with a treatment drug for Wilson's disease (Figure 54). In addition, it was confirmed that the level of ceruloplasmin mRNA expression and protein activity level was decreased in the Wilson disease liver organoid model (Figures 55 and 56).

따라서, 본 발명의 방법으로 제조된 윌슨병 모델은 윌슨병의 발병 기전 탐색 및 윌슨병 치료 약물 스크리닝 용도의 간 모델로 유용하게 사용될 수 있다.Therefore, the Wilson's disease model produced by the method of the present invention can be usefully used as a liver model for exploring the pathogenesis of Wilson's disease and screening drugs for treating Wilson's disease.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail through the following examples and experimental examples.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.However, the following examples and experimental examples are merely illustrative of the present invention, and the content of the present invention is not limited by the following examples and experimental examples.

<< 실시예Example 1> 인간 유도 만능줄기세포(human induced 1> Human induced pluripotent stem cells pluripotentpluripotent stem cells, iPSCs)로부터 stem cells, iPSCs) 유래된derived from 간 내배엽 liver endoderm 오가노이드organoid (human hepatic endoderm (human hepatic endoderm organoidsorganoids , hHEOs)의 제조, hHEOs) preparation

<1-1> 플레이트의 코팅 및 인간 <1-1> Coating of plates and humans 전분화능pluripotency 줄기세포의 배양(- Culture of stem cells (- 10일차Day 10 ))

먼저, 세포 배양용 플레이트에 비트로넥틴 XF(Vitronectin XF, Cat#.07180, Stem cell technologies)를 첨가하여, 플레이트의 웰을 코팅하였다. 코팅된 플레이트에 OCT4, SOX2, KLF4 및 c-MYC의 이소성 발현을 통해 인간 진피 섬유 아세포에서 유래한 인간 유도 만능 줄기세포(iPSCs)(한용만 박사 제공, KAIST)를 mTeSR™-E8™ 배지(Cat#.05940, Stem cell technologies)를 이용하여 37℃, 5% CO2 조건하에서 Dulbecco's phosphate-buffered saline(DPBS)에서 0.5mM EDTA를 사용하여 3일 또는 4일마다 계대 배양하여 준비하였다. 이때, 계대 배양 기간 동안에 배지를 매일 교체하였다.First, Vitronectin XF (Cat#.07180, Stem cell technologies) was added to the cell culture plate to coat the wells of the plate. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) derived from human dermal fibroblasts (provided by Dr. Yongman Han, KAIST) through ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4, and c-MYC were grown on coated plates in mTeSR™-E8™ medium (Cat# .05940, Stem cell technologies) was prepared by subculturing every 3 or 4 days using 0.5mM EDTA in Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) under 37°C and 5% CO 2 conditions. At this time, the medium was changed every day during the subculture period.

12 웰 플레이트에 웰 당 희석한 Matrigel(hESC qualified Matrigel, Corning, Cat No. 354277) 0.5㎖를 첨가하여 37℃에서 30분간 플레이트를 마트리겔로 코팅하였다. 그 후 배양된 인간 유도 만능 줄기세포를 꺼내 배지를 제거한 후, 0.5 mM EDTA가 첨가된 Ca2 + 및 Mg2 +가 없는 DPBS 1㎖를 첨가하고 37℃에서 4 내지 5분간 배양하였다. 배양한 세포를 배양기에서 꺼내 플레이트를 기울여 EDTA를 제거하고 2μM의 Y27632가 함유된 mTeSR™-E8™ 배지 12㎖ 중 1㎖를 이용하여 세포를 회수하였다. 회수한 세포는 11㎖의 2μM Y27632가 함유된 mTeSR™-E8™ 배지가 포함된 코니컬 튜브에 넣고 부드럽게 피펫팅하여 섞어준 후, 마트리겔이 코팅된 플레이트에 회수한 세포를 웰 당 1㎖ 씩 분주하고 37℃, 5% CO2 환경에서 하루 동안 배양하여 인간 유도 만능 줄기세포를 마트리겔이 코팅된 플레이트에 씨딩(seeding) 하였다.0.5 ml of diluted Matrigel (hESC qualified Matrigel, Corning, Cat No. 354277) was added per well to a 12-well plate, and the plate was coated with Matrigel for 30 minutes at 37°C. Afterwards, the cultured human induced pluripotent stem cells were taken out, the medium was removed, 1 ml of DPBS without Ca 2+ and Mg 2+ containing 0.5 mM EDTA was added, and the cells were incubated at 37° C for 4 to 5 minutes. The cultured cells were taken out of the incubator, the plate was tilted to remove EDTA, and the cells were recovered using 1 ml of 12 ml of mTeSR™-E8™ medium containing 2 μM Y27632. The recovered cells were placed in a conical tube containing 11 ml of mTeSR™-E8™ medium containing 2 μM Y27632, mixed by gently pipetting, and then the recovered cells were added to Matrigel-coated plates at a rate of 1 ml per well. The human induced pluripotent stem cells were seeded on Matrigel-coated plates by dispensing and culturing for one day in a 37°C, 5% CO 2 environment.

<1-2> 인간 <1-2> Human 전분화능pluripotency 줄기세포를 완전 내배엽 세포(definitive endoderm, DE)로 분화(- Differentiation of stem cells into definitive endoderm (DE) cells (- 9일차Day 9 내지 - Inner paper - 4일차Day 4 ))

상기 실시예 1-1에서 배양한 인간 유도 만능 줄기세포를 완전 내배엽 세포로 분화시키기 위해 하기 과정을 수행하였다.The following process was performed to differentiate the human induced pluripotent stem cells cultured in Example 1-1 into complete endoderm cells.

구체적으로, 하기 표 1의 조성을 가진 내배엽 분화 배지 1(DE medium 1) 12㎖를 37℃로 만든 후, 배지를 제거한 상기 실시예 1-1에서 배양한 인간 유도 만능 줄기세포에 준비된 내배엽 분화 배지 1를 웰 당 1㎖씩 첨가 후 24시간 동안 37℃, 5% CO2 환경에서 배양하였다. 그 후, 하기 표 2의 조성을 가진 내배엽 분화 배지 2(DE medium 2)로 교체하여 4일 동안 37℃, 5% CO2 환경에서 배양하였다. 배양 기간 동안 매일 24시간 간격으로 배지를 교체하였다.Specifically, 12 ml of endoderm differentiation medium 1 (DE medium 1) having the composition shown in Table 1 below was brought to 37°C, and then the medium was removed. Endoderm differentiation medium 1 prepared for the human induced pluripotent stem cells cultured in Example 1-1. 1 ml per well was added and cultured at 37°C in a 5% CO 2 environment for 24 hours. Afterwards, it was replaced with endoderm differentiation medium 2 (DE medium 2) having the composition shown in Table 2 below and cultured in an environment of 37°C and 5% CO 2 for 4 days. The medium was changed every 24 hours every day during the culture period.

내배엽 endoderm 분화배지Differentiation medium 1(DE medium 1)의 조성(12㎖) Composition of 1 (DE medium 1) (12 ml) 0.1% BSA 및 1% B27 supplement를 함유한 RPMI-1640 RPMI-1640 containing 0.1% BSA and 1% B27 supplement 50ng/㎖ Activin A(ActA)50ng/ml Activin A (ActA) 0.5mM sodium butyrate0.5mM sodium butyrate 3μM CHIR990213μM CHIR99021

내배엽 endoderm 분화배지Differentiation medium 2(DE medium 2)의 조성 Composition of 2 (DE medium 2) 0.1% BSA 및 1% B27 supplement를 함유한 RPMI-1640 RPMI-1640 containing 0.1% BSA and 1% B27 supplement 50ng/㎖ Activin A(ActA)50ng/ml Activin A (ActA) 0.1M sodium butyrate0.1M sodium butyrate

<1-3> 완전 내배엽 세포(definitive endoderm, DE)를 간 내배엽 세포(hepatic endoderm, HE)로 분화(-<1-3> Differentiation of definitive endoderm cells (DE) into hepatic endoderm cells (HE) (- 4일차Day 4 내지 inside 0일차Day 0 ))

상기 실시예 1-2에서 분화시킨 완전 내배엽 세포를 간 내배엽 세포로 분화시키기 위해 하기 과정을 수행하였다.The following process was performed to differentiate the complete endoderm cells differentiated in Example 1-2 into liver endoderm cells.

구체적으로, 하기 표 3의 조성을 가진 간 내배엽 분화 배지(HE medium) 12㎖를 37℃로 만든 후, 배지를 제거한 상기 실시예 1-2에서 분화시킨 완전 내배엽 세포에 준비된 간 내배엽 분화 배지를 웰 당 1㎖씩 첨가 후 4일 동안 37℃, 5% CO2 환경에서 배양하였다. 배양 기간 동안 매일 24시간 간격으로 배지를 교체하였다. 분화 완료 후 일부 세포에서 EpCAM 양성 세포를 하기 실험예 1에 개시된 유세포 분석 방법과 동일한 조건 및 방법으로 분석하여 EpCAM 양성 세포가 95% 이상이면 다음 단계인 간 내배엽 오가노이드 생산 단계로 진행했다.Specifically, 12 ml of hepatic endoderm differentiation medium (HE medium) with the composition shown in Table 3 below was brought to 37°C, and then the medium was removed and the hepatic endoderm differentiation medium prepared in the complete endoderm cells differentiated in Example 1-2 was added to each well. After adding 1 ml each, the mixture was cultured at 37°C and 5% CO 2 environment for 4 days. The medium was changed every 24 hours every day during the culture period. After completion of differentiation, EpCAM positive cells were identified in some cells by flow cytometry as disclosed in Experimental Example 1 below. It was analyzed using the same conditions and methods as in the method, and if EpCAM positive cells were more than 95%, it proceeded to the next step, the production of liver endoderm organoids.

간 내배엽 liver endoderm 분화배지(HE medium)의Differentiation medium (HE medium) 조성(12㎖) Composition (12ml) 0.1% BSA 및 1% B27 supplement를 함유한 RPMI-1640 RPMI-1640 containing 0.1% BSA and 1% B27 supplement 50ng/㎖ BMP450ng/ml BMP4 10μM SB43154210μM SB431542

<1-4> 간 내배엽 세포로부터 간 내배엽 <1-4> Liver endoderm from liver endoderm cells 오가노이드의of organoids 생산( production( 0일차Day 0 내지 inside 14일차Day 14 ))

분화가 완료된 상기 실시예 1-3에서 제조한 간 내배엽 세포에서 배지를 제거하고 Ca2 + 및 Mg2 +가 없는 DPBS로 1회 세척하고, 웰 당 500㎕의 Accutase를 첨가하여 37℃에서 10분간 배양하였다. 단일 세포 단위로 분리된 세포를 10㎖ organoid basal medium(10 mM HEPES, 1% GlutaMAX, 100 U/㎖ 페니실린-스트렙토마이신, 0.1% BSA를 함유한 Advanced DMEM/F12)이 첨가된 15㎖ 코니컬 튜브로 옮겨 1200 rpm에서 3분간 원심분리를 수행하고 상등액을 제거하였다. 1㎖의 차가운 D-HEO 또는 S-HEO용 간 내배엽 생산 배지(하기 표 4 또는 표 5)로 세포 펠렛을 재현탁 하여 1.5㎖ 튜브에 옮겨 세포 계수를 하고, 하기와 같이 물방울 모양 또는 현탁 상태로 간 내배엽 오가노이드를 생산하였다.After differentiation was completed, the medium was removed from the liver endoderm cells prepared in Example 1-3, washed once with DPBS without Ca 2+ and Mg 2+ , and 500 μl of Accutase per well was added and incubated at 37°C for 10 minutes. Cultured. Cells separated into single cells were placed in a 15 ml conical tube containing 10 ml organoid basal medium (Advanced DMEM/F12 containing 10 mM HEPES, 1% GlutaMAX, 100 U/ml penicillin-streptomycin, and 0.1% BSA). Transferred to , centrifugation was performed at 1200 rpm for 3 minutes, and the supernatant was removed. For 1 ml cold D-HEO or S-HEO The cell pellet was resuspended in liver endoderm production medium (Table 4 or Table 5 below) and transferred to a 1.5 ml tube for cell counting, and liver endoderm organoids were produced in droplet shape or suspension as shown below.

<1-4-1> 물방울(Droplet) 모양의 간 내배엽 <1-4-1> Droplet-shaped liver endoderm 오가노이드(D-HEO)의Organoid (D-HEO) 생산(발생 단계, generation stage) Production (generation stage)

100㎕의 차가운 하기 표 4의 조성을 가진 간 내배엽 오가노이드 생산 배지에 15,000개의 간 내배엽 세포를 1.5㎖ 튜브에 준비하여 얼음에 꽂아 두었다. 준비된 세포에 200㎕ Matrigel GFR(growth factor reduced) 원액을 넣고 거품이 생기지 않도록 피펫팅으로 혼합하였다. 24 웰 또는 4 웰 플레이트에 100㎕의 마트리겔과 간 내배엽 세포를 섞은 혼합액을 5000 세포/droplet의 세포 밀도로 만들고 정중앙에 분주하여 돔 구조로 만들어 굳힌 후, 37℃에서 10분간 굳혔다. 그 후 37℃의 간 내배엽 오가노이드 생산 배지를 웰 당 700 내지 1000㎕씩 넣고 37℃, 5% CO2의 환경에서 14일간 배양하였다. 배지는 배양 3일 간격으로 교체하였다.15,000 liver endoderm cells were prepared in 100 μl of cold liver endoderm organoid production medium with the composition shown in Table 4 below in a 1.5 ml tube and placed on ice. 200㎕ Matrigel GFR (growth factor reduced) stock solution was added to the prepared cells and mixed by pipetting to prevent bubbles from forming. A mixture of 100 ㎕ of Matrigel and liver endoderm cells in a 24-well or 4-well plate was made to a cell density of 5000 cells/droplet, dispensed in the center, formed into a dome structure, and hardened at 37°C for 10 minutes. Afterwards, 700 to 1000 ㎕ of liver endoderm organoid production medium at 37°C was added per well and cultured for 14 days in an environment of 37°C and 5% CO 2 . The medium was changed every 3 days of culture.

D-D- HEOHEO 용 간 내배엽 liver endoderm 오가노이드organoid 생산 배지(GE medium)의 조성 Composition of production medium (GE medium) 10 mM HEPES, 1% GlutaMAX, 100 U/㎖ 페니실린-스트렙토마이신, 0.1% BSA, 1% B27 supplement minus vitamin A, 1% N2 supplement를 함유한 Advanced DMEM/F12Advanced DMEM/F12 containing 10 mM HEPES, 1% GlutaMAX, 100 U/mL penicillin-streptomycin, 0.1% BSA, 1% B27 supplement minus vitamin A, 1% N2 supplement. 50ng/㎖ FGF 10(fibroblast growth factor 10)50ng/ml FGF 10 (fibroblast growth factor 10) 25ng/㎖ HGF(hepatocyte growth factor)25ng/ml HGF(hepatocyte growth factor) 10 mM Nicotinamide10mM Nicotinamide 10 nM [Leu15]-Gastrin I human10 nM [Leu 15 ]-Gastrin I human 1.25 mM N-acetyl-L-cysteine1.25mM N-acetyl-L-cysteine 5 μM A83-015 μM A83-01 10 μM Forskolin10 μM Forskolin 3 μM CHIR990213 μM CHIR99021

<1-4-2> <1-4-2> 현탁suspension (Suspension) 상태의 간 내배엽 (Suspension) liver endoderm 오가노이드(S-HEO)의Organoid (S-HEO) 생산(발생 단계, generation stage) Production (generation stage)

하기 표 5의 조성을 가진 간 내배엽 오가노이드 생산 배지를 24-웰 ultra low attachment 플레이트에 웰 당 0.5㎖씩 미리 분주하고, 배지는 마트리겔이 굳는 것을 방지하기 위해 항상 얼음에 보관하였다. 웰 당 10,000개의 간 내배엽 세포를 첨가한 후, 37℃, 5% CO2의 환경에서 14일간 배양하였다. 이때 오가노이드가 뭉쳐서 자라지 않도록 조각들을 골고루 퍼트린 후 배양하였다. 배지는 배양 3일 간격으로 교체하였다. 배지 교체는 1000P 파이펫을 이용하여 현탁 상태로 배양 중인 오가노이드가 포함된 배지를 모두 1.5㎖ 튜브에 회수하여 1200 rpm의 최고 속도로 3분 동안 원심 분리기에 넣어 상등액을 제거하고, 새로운 하기 표 5의 조성을 가진 간 내배엽 유지 배지 0.5㎖에 재현탁 후 다시 플레이트에 뿌려주고 3일 동안 37℃, 5% CO2의 환경에서 배양하였다.Liver endoderm organoid production medium with the composition shown in Table 5 below was dispensed in advance at 0.5 mL per well in a 24-well ultra low attachment plate, and the medium was always kept on ice to prevent Matrigel from hardening. After adding 10,000 liver endoderm cells per well, the cells were cultured for 14 days at 37°C in an environment of 5% CO 2 . At this time, the pieces were spread evenly and cultured to prevent the organoids from clumping and growing. The medium was changed every 3 days of culture. To replace the medium, use a 1000P pipette to collect all the medium containing the organoids being cultured in suspension into a 1.5 ml tube, centrifuge for 3 minutes at a maximum speed of 1200 rpm, remove the supernatant, and replace the new medium as shown in Table 5 below. It was resuspended in 0.5 ml of liver endoderm maintenance medium containing the following composition, then spread on the plate again and cultured in an environment of 37°C and 5% CO 2 for 3 days.

S-S- HEOHEO 용간Yonggan 내배엽 endoderm 오가노이드organoid 생산 배지(GE medium)의 조성 Composition of production medium (GE medium) 10 mM HEPES, 1% GlutaMAX, 100 U/㎖ 페니실린-스트렙토마이신, 0.1% BSA, 1% B27 supplement minus vitamin A, 1% N2 supplement를 함유한 Advanced DMEM/F12Advanced DMEM/F12 containing 10 mM HEPES, 1% GlutaMAX, 100 U/mL penicillin-streptomycin, 0.1% BSA, 1% B27 supplement minus vitamin A, 1% N2 supplement. 50ng/㎖ FGF 10(fibroblast growth factor 10)50ng/ml FGF 10 (fibroblast growth factor 10) 25ng/㎖ HGF(hepatocyte growth factor)25ng/ml HGF(hepatocyte growth factor) 10 mM Nicotinamide10mM Nicotinamide 10 nM [Leu15]-Gastrin I human10 nM [Leu 15 ]-Gastrin I human 1.25 mM N-acetyl-L-cysteine1.25mM N-acetyl-L-cysteine 5 μM A83-015 μM A83-01 10 μM Forskolin10 μM Forskolin 3 μM CHIR990213 μM CHIR99021 *0.5 mg/㎖ Matrigel GFR (growth factor reduced)*0.5 mg/㎖ Matrigel GFR (growth factor reduced)

*: *: 현탁suspension 배양으로 제조되는 간 내배엽 Liver endoderm produced in culture 오가노이드organoid (S-(S- HEOHEO ) 생산시 추가됨) added during production

<1-5> 간 내배엽 <1-5> Liver endoderm 오가노이드의of organoids 확장 단계(expansion stage)( expansion stage ( 14일차Day 14 내지 inside 19일차Day 19 ))

상기 실시예 1-4-1 및 1-4-2에서 제조한 간 내배엽 오가노이드를 각각 상기 표 4 또는 표 5의 조성을 가진 배지에서 5일 동안 추가 배양하여, 최종적으로 물방울(Droplet) 모양의 간 내배엽 오가노이드(D-HEO)(도 2) 및 현탁(Suspension) 상태의 간 내배엽 오가노이드(S-HEO)(도 3)를 제조하였다.The liver endoderm organoids prepared in Examples 1-4-1 and 1-4-2 were further cultured for 5 days in a medium having the composition of Table 4 or Table 5, respectively, to finally produce a droplet-shaped liver. Endoderm organoids (D-HEO) (Figure 2) and liver endoderm organoids in suspension (S-HEO) (Figure 3) were prepared.

<1-6> 간 내배엽 <1-6> Liver endoderm 오가노이드의of organoids 동결 및 해동 Freeze and Thaw

<1-6-1> 간 내배엽 <1-6-1> Liver endoderm 오가노이드의of organoids 동결 freezing

물방울(Droplet) 모양의 간 내배엽 오가노이드(D-HEO)의 경우, 배양기에서 D-HEO를 꺼내어 1000P의 파이펫으로 피펫팅하여 오가노이드가 들어있는 돔 형태의 마트리겔을 파괴시킨 후, 1.5㎖ 튜브에 회수하였다. In the case of droplet-shaped liver endoderm organoids (D-HEO), remove D-HEO from the incubator and pipet it with a 1000P pipette to destroy the dome-shaped Matrigel containing the organoids, then pour 1.5 ml It was recovered in a tube.

현탁(Suspension) 상태의 간 내배엽 오가노이드(S-HEO)의 경우, 배양기에서 S-HEO를 꺼내어 1000P의 파이펫으로 피펫팅하여 웰 안의 배지를 포함한 오가노이드를 모두 1.5㎖ 튜브에 회수하였다.In the case of liver endoderm organoids (S-HEO) in suspension, S-HEO was taken out of the incubator and pipetted with a 1000P pipette, and all organoids including the medium in the well were recovered in a 1.5 ml tube.

간 내배엽 오가노이드와 마트리겔을 분리하기 위해 얼음에 30분간 방치하고, 최고 속도 5000rpm으로 원심분리를 수행하여 상등액을 제거하였다. 200㎕의 차가운 D-HEO 또는 S-HEO 용간 내배엽 오가노이드 유지 배지를 넣고 200P의 파이펫으로 피펫팅하여 오가노이드를 조각내었다. 그 후 최고 속도 5000rpm으로 원심분리를 수행하여 상등액을 제거하고, Ca2 + 및 Mg2 +가 없는 차가운 DPBS 1㎖ 첨가 후 최고 속도 5000 rpm으로 원심분리를 수행하여 상등액을 제거하였다. 동결보존액인 CryoStor CS10(Stem cell Technologies) 1 내지 1.5㎖를 넣어 재현탁 시킨 후 0.5㎖씩 cryotube에 분주하여 freezing container에 넣어 deep freezer에 하루 동안 보관하고 다음날 LN2 탱크(질소 탱크)에 옮겨 보관하였다.To separate the liver endoderm organoids and Matrigel, they were left on ice for 30 minutes and centrifuged at a maximum speed of 5000 rpm to remove the supernatant. 200 μl of cold D-HEO or S-HEO long liver endoderm organoid maintenance medium was added and the organoids were fragmented by pipetting with a 200P pipette. Afterwards, centrifugation was performed at a maximum speed of 5000 rpm to remove the supernatant. After adding 1 ml of cold DPBS without Ca 2+ and Mg 2+ , centrifugation was performed at a maximum speed of 5000 rpm to remove the supernatant. After resuspending 1 to 1.5 ml of CryoStor CS10 (Stem cell Technologies), a cryopreservation solution, 0.5 ml each was dispensed into cryotubes, placed in a freezing container, stored in a deep freezer for one day, and transferred to a LN 2 tank (nitrogen tank) the next day for storage. .

<1-6-2> 간 내배엽 <1-6-2> Liver endoderm 오가노이드의of organoids 해동 thaw

LN2 탱크에서 cryotube 1개를 꺼내어 37℃의 수조에서 녹인 후, 반 정도 녹았을 때 수조에서 꺼내어 미리 준비해둔 10㎖의 organoid basal medium(10 mM HEPES, 1% GlutaMAX, 100 U/㎖ 페니실린-스트렙토마이신, 0.1% BSA를 함유한 Advanced DMEM/F12) 이 담긴 15㎖의 코니컬 튜브로 옮겨 1000 rpm에서 3분 동안 원심 분리하여 상등액을 제거하였다.Take one cryotube from the LN 2 tank and melt it in a water bath at 37°C. When it is half melted, take it out of the water bath and add 10 ml of previously prepared organoid basal medium (10 mM HEPES, 1% GlutaMAX, 100 U/ml penicillin-streptocyst). Advanced DMEM/F12 containing mycin, 0.1% BSA) This was transferred to a 15 ml conical tube and centrifuged at 1000 rpm for 3 minutes to remove the supernatant.

물방울(Droplet) 모양의 간 내배엽 오가노이드(D-HEO)의 경우, 오가노이드 펠렛을 100㎕의 차가운 간 내배엽 오가노이드 유지 배지(하기 표 6의 배지)에 재현탁 시킨 후, 200㎕의 Matrigel GFR 원액을 넣어 혼합하였다. 그 후 새로운 24 웰 플레이트에 간 내배엽 오가노이드와 Matrigel의 혼합액 100㎕를 웰 정중앙에 분주하여 돔 형태를 만들고 37℃에서 10분간 굳혔다. 37℃의 20μM Y27632를 함유한 간 내배엽 오가노이드 유지 배지(하기 표 6의 배지)를 웰 당 700 내지 1000㎕ 넣고 37℃, 5% CO2에서 3 내지 4일간 배양하였다.In the case of droplet-shaped liver endoderm organoids (D-HEO), the organoid pellet was resuspended in 100㎕ of cold liver endoderm organoid maintenance medium (medium in Table 6 below), and then added to 200㎕ of Matrigel GFR. The stock solution was added and mixed. Afterwards, 100㎕ of the mixture of liver endoderm organoids and Matrigel was dispensed into a new 24-well plate in the center of the well to form a dome shape and hardened at 37°C for 10 minutes. 700 to 1000 μl of liver endoderm organoid maintenance medium (medium in Table 6 below) containing 20 μM Y27632 at 37°C was added per well and cultured at 37°C and 5% CO 2 for 3 to 4 days.

현탁(Suspension) 상태의 간 내배엽 오가노이드(S-HEO)의 경우, 오가노이드 펠렛에 1 내지 1.5㎖의 차가운 간 내배엽 오가노이드 유지 배지(하기 표 7의 배지)에 재현탁 시킨 후, 새로운 24-웰 ultra-low attachment 플레이트에 웰 당 0.5㎖ 씩 분주하고, 37℃, 5% CO2에서 3 내지 4일간 배양하였다. 이때 오가노이드가 뭉쳐서 자라지 않도록 조각들을 골고루 퍼트린 후 배양하였다. 배지는 배양 3일 간격으로 교체하였다.In the case of liver endoderm organoids (S-HEO) in suspension, the organoid pellet was resuspended in 1 to 1.5 ml of cold liver endoderm organoid maintenance medium (medium in Table 7 below), and then added to a new 24-HEO. 0.5 ml per well was dispensed into an ultra-low attachment plate, and cultured at 37°C and 5% CO 2 for 3 to 4 days. At this time, the pieces were spread evenly and cultured to prevent the organoids from clumping and growing. The medium was changed every 3 days of culture.

<< 비교예Comparative example 1> 시험관 내(in vitro) 간 세포 모델의 제조 1> Preparation of in vitro liver cell model

초대 배양 인간 간세포(primary human hepatocyte, PHH), HepG2(간암 세포주) 및 2D 간 유사 세포(hepatocyte like cell, HLC)를 하기와 같이 배양하였다.Primary human hepatocytes (PHH), HepG2 (liver cancer cell line), and 2D liver-like cells (HLC) were cultured as follows.

초대 배양 인간 간세포(primary human hepatocyte, PHH)는 BD Gentest ™ Cryo Human Hepatocytes(BD Biosciences, Donor No. HFC 476)를 제조업체의 지침에 따라 BD ™ 간세포 배양 배지에서 배양하고 24시간 후에 실험을 수행했다.Primary human hepatocytes (PHH) were cultured using BD Gentest™ Cryo Human Hepatocytes (BD Biosciences, Donor No. HFC 476) in BD™ hepatocyte culture medium according to the manufacturer's instructions, and experiments were performed 24 hours later.

인간 간세포 암 세포주 HepG2는 10% 소 태아 혈청(Lonza), 100 U/㎖ 페니실린-스트렙토마이신(Gibco)이 보충된 MEM(HyClone)에서 유지되었다.The human hepatocellular carcinoma cell line HepG2 was maintained in MEM (HyClone) supplemented with 10% fetal bovine serum (Lonza) and 100 U/ml penicillin-streptomycin (Gibco).

2D 간 유사 세포(hepatocyte-like cell, HLC)의 경우, 인간 배아줄기세포(hepatocyte embryonic cell, HE)를 0.5 mg/㎖ BSA, 1X B27, 10ng/㎖ FGF4, 10 ng/㎖ HGF, 10ng/㎖ OSM 및 0.1μM 덱사메타손이 보충된 RPMI-1640으로 7일 동안 추가로 배양하여 실험을 수행하였다.For 2D liver-like cells (HLC), human embryonic stem cells (HE) were used at 0.5 mg/ml BSA, 1X B27, 10ng/ml FGF4, 10 ng/ml HGF, 10ng/ml Experiments were performed by further culturing for 7 days with RPMI-1640 supplemented with OSM and 0.1 μM dexamethasone.

<< 실시예Example 2> 간 2> Liver 오가노이드organoid (human hepatic (human hepatic organoidsorganoids , , hHOhHO )의 제조)Manufacture of

상기 실시예 1-5에서 제조한 간 내배엽 오가노이드를 계대 배양하고 분화 배지에서 분화시켜 간 오가노이드(human hepatic organoids, hHOs)를 하기와 같은 방법으로 제조하였다.The liver endoderm organoids prepared in Examples 1-5 above were subcultured and differentiated in differentiation medium to prepare liver organoids (human hepatic organoids, hHOs) in the following manner.

<2-1> 간 내배엽 <2-1> Liver endoderm 오가노이드의of organoids 계대Passage 배양( culture( 19일차Day 19 내지 inside 24일차Day 24 ))

<2-1-1> 물방울(Droplet) 모양의 간 내배엽 <2-1-1> Droplet-shaped liver endoderm 오가노이드(D-HEO)의Organoid (D-HEO) 계대Passage 배양 culture

상기 실시예 1-5에서 제조한 물방울 모양의 간 내배엽 오가노이드(D-HEO)를 1000P 파이펫을 이용하여 오가노이드가 들어있는 돔 형태의 마트리겔을 파괴시킨 후 1.5㎖ 튜브에 회수하고, 마트리겔과 간 내배엽 오가노이드를 분리하기 위해 튜브를 얼음에 30분간 방치하였다. 튜브를 5000 rpm의 최고 속도로 원심 분리기에 넣어 상등액을 제거하고, 200㎕의 차가운 하기 표 6의 조성을 가진 간 내배엽 오가노이드 유지 배지(hepatic endodermal organoid expansion mediun, EM)을 넣고 200P의 파이펫으로 여러번 피펫팅을 수행하여 오가노이드를 조각내었다. 그 후 튜브를 5000 rpm의 최고 속도로 원심 분리기에 넣어 상등액을 제거하고, 140㎕의 차가운 간 내배엽 오가노이드 유지 배지를 첨가하고 280㎕의 Matrigel GFR 원액을 넣어 혼합하였다. 새로운 24 웰 플레이트에 마트리겔과 오가노이드의 혼합액 100㎕를 정중앙에 분주하여 돔 형태를 만들고 37℃에서 10분간 굳힌 후 37℃의 간 내배엽 오가노이드 유지 배지를 웰 당 700 내지 1000㎕씩 넣고 37℃, 5% CO2의 배양기에서 5일간 배양하였다. The drop-shaped liver endoderm organoid (D-HEO) prepared in Example 1-5 was recovered in a 1.5 ml tube after destroying the dome-shaped Matrigel containing the organoid using a 1000P pipette, and then stored in a 1.5 ml tube. To separate Rigel and liver endoderm organoids, the tube was left on ice for 30 minutes. Place the tube in a centrifuge at a maximum speed of 5000 rpm to remove the supernatant, add 200 ㎕ of cold hepatic endodermal organoid expansion mediun (EM) with the composition shown in Table 6 below, and pipette several times with a 200P pipette. Pipetting was performed to fragment the organoids. Afterwards, the tube was placed in a centrifuge at a maximum speed of 5000 rpm to remove the supernatant, 140 μl of cold liver endoderm organoid maintenance medium was added, and 280 μl of Matrigel GFR stock solution was added and mixed. In a new 24-well plate, dispense 100㎕ of Matrigel and organoid mixture in the center to form a dome, harden at 37℃ for 10 minutes, then add 700 to 1000㎕ of liver endoderm organoid maintenance medium at 37℃ per well and incubate at 37℃. , and cultured for 5 days in an incubator with 5% CO 2 .

D-D- HEOHEO 용 간 내배엽 liver endoderm 오가노이드organoid 유지 배지( Maintenance badge ( EMEM )의 조성) Composition of 10 mM HEPES, 1% GlutaMAX, 100 U/㎖ 페니실린-스트렙토마이신, 0.1% BSA, 1% B27 supplement minus vitamin A, 1% N2 supplement를 함유한 Advanced DMEM/F12Advanced DMEM/F12 containing 10 mM HEPES, 1% GlutaMAX, 100 U/mL penicillin-streptomycin, 0.1% BSA, 1% B27 supplement minus vitamin A, 1% N2 supplement. 25ng/㎖ BMP725ng/ml BMP7 50ng/㎖ FGF 10(fibroblast growth factor 10)50ng/ml FGF 10 (fibroblast growth factor 10) 25ng/㎖ HGF(hepatocyte growth factor)25ng/ml HGF (hepatocyte growth factor) 10 mM Nicotinamide10mM Nicotinamide 10 nM [Leu15]-Gastrin I human10 nM [Leu 15 ]-Gastrin I human 1.25 mM N-acetyl-L-cysteine1.25mM N-acetyl-L-cysteine 5 μM A83-015 μM A83-01 10 μM Forskolin10 μM Forskolin 3 μM CHIR990213 μM CHIR99021

<2-1-2> <2-1-2> 현탁suspension (Suspension) 상태의 간 내배엽 (Suspension) liver endoderm 오가노이드(S-HEO)의Organoid (S-HEO) 계대Passage 배양 culture

상기 실시예 1-5에서 제조한 현탁(Suspension) 상태의 간 내배엽 오가노이드(S-HEO)를 25ng/㎖의 BMP7이 첨가된 하기 표 7의 조성을 가진 간 내배엽 오가노이드 생산 배지에 5일간 배양하였다. 이때 배양 3일 후에 배지를 1회 교체하였다.Suspension liver endoderm organoids (S-HEO) prepared in Examples 1-5 were cultured for 5 days in liver endoderm organoid production medium with the composition shown in Table 7 below and supplemented with 25 ng/ml of BMP7. . At this time, the medium was changed once after 3 days of culture.

상기 실시예 1-5에서 제조한 현탁(Suspension) 상태의 간 내배엽 오가노이드(S-HEO)를 1000P 파이펫을 이용하여 1.5㎖ 튜브에 회수하고, 마트리겔과 간 내배엽 오가노이드를 분리하기 위해 튜브를 얼음에 30분간 방치하였다. 튜브를 5000rpm의 최고 속도로 원심 분리기에 넣어 상등액을 제거하고, 200㎕의 차가운 하기 표 7의 조성을 가진 간 내배엽 오가노이드 유지 배지(hepatic endodermal organoid expansion mediun, EM)을 넣고 200P의 파이펫으로 여러 번 피펫팅을 수행하여 오가노이드를 조각내었다. 새로운 24-웰의 ultra-low attatchment 플레이트에 하기 표 7의 간 내배엽 유지 배지 0.5㎖를 미리 분주하고, 웰 당 조각낸 현탁 상태의 간 내배엽 오가노이드(S-HEO)를 66㎕를 분주하고 37℃, 5% CO2의 환경에서 5일간 배양하였다. 이때 오가노이드가 뭉쳐서 자라지 않도록 조각들을 골고루 퍼트린 후 배양하였다. 배지는 배양 3일 간격으로 교체하였다. 배지 교체는 1000P 파이펫을 이용하여 현탁 상태로 배양 중인 오가노이드가 포함된 배지를 모두 1.5㎖ 튜브에 회수하여 5000 rpm의 최고 속도로 원심 분리기에 넣어 상등액을 제거하고, 간 내배엽 유지 배지 0.5㎖에 재현탁 후 다시 플레이트에 뿌려주었다.The suspended liver endoderm organoids (S-HEO) prepared in Example 1-5 were collected in a 1.5 ml tube using a 1000P pipette, and the tube was used to separate Matrigel and liver endoderm organoids. was left on ice for 30 minutes. Place the tube in a centrifuge at the highest speed of 5000 rpm to remove the supernatant, add 200 ㎕ of cold hepatic endodermal organoid expansion mediun (EM) with the composition in Table 7 below, and pipet at 200P several times. Pipetting was performed to fragment the organoids. Into a new 24-well ultra-low attachment plate, 0.5 ml of the liver endoderm maintenance medium shown in Table 7 was dispensed in advance, and 66 ㎕ of fragmented suspended liver endoderm organoids (S-HEO) were dispensed per well at 37°C. , cultured for 5 days in an environment of 5% CO 2 . At this time, the pieces were spread evenly and cultured to prevent the organoids from clumping and growing. The medium was changed every 3 days of culture. To replace the medium, use a 1000P pipette to collect all medium containing organoids in suspension into a 1.5 ml tube, place in a centrifuge at a maximum speed of 5000 rpm to remove the supernatant, and add 0.5 ml of liver endoderm maintenance medium. After resuspension, it was spread on the plate again.

S-S- HEOHEO 용 간 내배엽 liver endoderm 오가노이드organoid 유지 배지( Maintenance badge ( EMEM )의 조성) Composition of 10 mM HEPES, 1% GlutaMAX, 100 U/㎖ 페니실린-스트렙토마이신, 0.1% BSA, 1% B27 supplement minus vitamin A, 1% N2 supplement를 함유한 Advanced DMEM/F12Advanced DMEM/F12 containing 10 mM HEPES, 1% GlutaMAX, 100 U/mL penicillin-streptomycin, 0.1% BSA, 1% B27 supplement minus vitamin A, 1% N2 supplement. 25ng/㎖ BMP725ng/ml BMP7 50ng/㎖ FGF 10(fibroblast growth factor 10)50ng/ml FGF 10 (fibroblast growth factor 10) 25ng/㎖ HGF(hepatocyte growth factor)25ng/ml HGF(hepatocyte growth factor) 10 mM Nicotinamide10mM Nicotinamide 10 nM [Leu15]-Gastrin I human10 nM [Leu 15 ]-Gastrin I human 1.25 mM N-acetyl-L-cysteine1.25mM N-acetyl-L-cysteine 5 μM A83-015 μM A83-01 10 μM Forskolin10 μM Forskolin 3 μM CHIR990213 μM CHIR99021 *0.5 mg/㎖ Matrigel GFR (growth factor reduced)*0.5 mg/㎖ Matrigel GFR (growth factor reduced)

*: *: 현탁suspension 배양으로 제조되는 간 내배엽 Liver endoderm produced in culture 오가노이드organoid (S-(S- HEOHEO ) 생산시 추가됨) added during production

<2-2> 간 내배엽 <2-2> Liver endoderm 오가노이드로부터From organoids 간 liver 오가노이드로의to organoids 분화( differentiation( 24일차Day 24 내지 inside 39일차Day 39 ))

<2-2-1> 물방울(Droplet) 모양의 간 <2-2-1> Droplet-shaped liver 오가노이드(D-HO)의Organoid (D-HO) 제조 manufacturing

상기 실시예 2-1-1의 계대 배양한 물방울 모양의 간 내배엽 오가노이드를 하기 표 8의 조성을 가진 간 오가노이드 분화 배지를 사용하여 3일 간격으로 배지를 교체하며 15일 동안 배양하였다. The drop-shaped liver endoderm organoids subcultured in Example 2-1-1 were cultured for 15 days using liver organoid differentiation medium with the composition shown in Table 8 below, with the medium being replaced every 3 days.

간 liver 오가노이드organoid 분화 배지(DM)의 조성 Composition of differentiation medium (DM) 10 mM HEPES, 1% GlutaMAX, 100 U/㎖ 페니실린-스트렙토마이신, 0.1% BSA, 1% B27 supplement minus vitamin t를 함유한 Advanced DMEM/F12Advanced DMEM/F12 containing 10 mM HEPES, 1% GlutaMAX, 100 U/mL penicillin-streptomycin, 0.1% BSA, 1% B27 supplement minus vitamin t. 25 ng/㎖ BMP725 ng/ml BMP7 100 ng/㎖ FGF19100 ng/ml FGF19 25 ng/㎖ HGF25 ng/ml HGF 10 nM [Leu15]-G astrin I human10 nM [Leu 15 ]-G astrin I human 1.25 mM N-acetyl-L-cysteine1.25mM N-acetyl-L-cysteine 0.5 μM A83-010.5 μM A83-01 1㎕ DAPT1㎕ DAPT 3 μM Dexamethasone3 μM Dexamethasone

<2-2-2> <2-2-2> 현탁suspension (Suspension) 상태의 간 Liver in (Suspension) state 오가노이드(S-HO)의Organoid (S-HO) 제조 manufacturing

상기 실시예 2-1-2의 계대 배양한 현탁 상태의 간 내배엽 오가노이드를 하기 표 9의 조성을 가진 간 오가노이드 분화 배지를 사용하여 3일 간격으로 배지를 교체하며 15일 동안 배양하였다.The subcultured suspended liver endoderm organoids of Example 2-1-2 were cultured for 15 days, replacing the medium every 3 days using liver organoid differentiation medium with the composition shown in Table 9 below.

배지 교체는 1000P 파이펫을 이용하여 현탁 상태로 배양 중인 간 오가노이드가 포함된 배지를 모두 1.5㎖ 튜브에 회수하여 5000rpm의 최고 속도로 원심 분리기에 넣어 상등액을 제거하고, 간 오가노이드 분화 배지 0.5㎖에 재현탁 후 다시 플레이트에 뿌려주었다.To replace the medium, use a 1000P pipette to collect all medium containing liver organoids cultured in suspension into a 1.5 ml tube, place it in a centrifuge at a maximum speed of 5000 rpm to remove the supernatant, and add 0.5 ml of liver organoid differentiation medium. After resuspending it, it was spread on the plate again.

간 liver 오가노이드organoid 분화 배지(DM)의 조성 Composition of differentiation medium (DM) 10 mM HEPES, 1% GlutaMAX, 100 U/㎖ 페니실린-스트렙토마이신, 0.1% BSA, 1% B27 supplement minus vitamin t를 함유한 Advanced DMEM/F12Advanced DMEM/F12 containing 10 mM HEPES, 1% GlutaMAX, 100 U/mL penicillin-streptomycin, 0.1% BSA, 1% B27 supplement minus vitamin t. 25 ng/㎖ BMP725 ng/ml BMP7 100 ng/㎖ FGF19100 ng/ml FGF19 25 ng/㎖ HGF25 ng/ml HGF 10 nM [Leu15]-G astrin I human10 nM [Leu 15 ]-G astrin I human 1.25 mM N-acetyl-L-cysteine1.25mM N-acetyl-L-cysteine 0.5 μM A83-010.5 μM A83-01 1㎕ DAPT1㎕ DAPT 3 μM Dexamethasone3 μM Dexamethasone *0.5 mg/㎖ Matrigel GFR (growth factor reduced)*0.5 mg/㎖ Matrigel GFR (growth factor reduced)

*: *: 현탁suspension 배양으로 제조되는 간 내배엽 Liver endoderm produced in culture 오가노이드organoid (S-(S- HEOHEO ) 생산시 추가됨) added during production

<< 실험예Experiment example 1> 배지 조성의 결정 1> Determination of medium composition

간 내배엽 오가노이드 생산 배지의 조성을 결정하기 위해, 하기의 실험을 수행하였다.To determine the composition of the liver endoderm organoid production medium, the following experiment was performed.

구체적으로, 표 4의 배지 조성에서 R-Spondin 1, EGF, Noggin을 더 포함한 배지에서 배양한 것을 제외하고는 상기 실시예 1-4-1과 동일한 방법 및 조건으로 간 내배엽 오가노이드로 분화시키고, 표 6의 조성을 가진 간 내배엽 오가노이드 유지 배지(EM)로 간 내배엽 오가노이드를 발생시켰다. 간 내배엽 세포 및 간 내배엽 오가노이드에서 EpCAM을 발현하는 세포의 수를 유세포 분석(Flow cytometry)로 분석하고, Wnt의 표적 단백질인 LGR5 및 표적 유전자인 AXIN2 및 EPHB2의 발현 정도를 RT-qPCR로 측정하였다.Specifically, the liver endoderm organoids were differentiated using the same method and conditions as in Example 1-4-1, except that the cells were cultured in a medium further containing R-Spondin 1, EGF, and Noggin in the medium composition shown in Table 4, Liver endoderm organoids were generated with liver endoderm organoid maintenance medium (EM) with the composition in Table 6. The number of cells expressing EpCAM in liver endoderm cells and liver endoderm organoids was analyzed by flow cytometry, and the expression levels of Wnt target protein LGR5 and target genes AXIN2 and EPHB2 were measured by RT-qPCR. .

유세포 분석은 세포 또는 오가노이드를 TypLETM Express Enzyme (Thermo)에 의해 해리, 4% 포름알데히드로 고정되고 DPBS (HyCloneTM)에서 0.1% Triton X-100으로 투과시키는 과정을 통해 수행되었다. 샘플을 형광 표지된 1차 항체와 함께 얼음에서 10분 동안 배양하고 DPBS에서 0.5% BSA (Sigma)로 두 번 세척했다. CytoFLEX (Beckman Coulter)를 사용하여 유세포 분석을 수행하고 Kaluza 분석 소프트웨어 (Beckman Coulter)를 사용하여 데이터를 처리했다. Flow cytometry was performed by dissociating cells or organoids with TypLETM Express Enzyme (Thermo), fixing them with 4% formaldehyde, and permeabilizing them with 0.1% Triton X-100 in DPBS (HyCloneTM). Samples were incubated with fluorescently labeled primary antibodies for 10 min on ice and washed twice with 0.5% BSA (Sigma) in DPBS. Flow cytometry was performed using CytoFLEX (Beckman Coulter) and data were processed using Kaluza analysis software (Beckman Coulter).

정량적 역전사 효소 중합효소 연쇄반응(RT-qPCR)은 NucleoZOL Reagent (Macherey-Nagel, Duren, Germany)를 사용하여 각 샘플에서 총 RNA를 분리하고 GoScript ™ Reverse Transcription Mix(Promega)를 사용하여 역전사 시켰다. qPCR은 StepOnePlus Real-Time PCR 시스템 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)에서 GoTaq® qPCR Master Mix (Promega)를 이용하고, 각 샘플에 대해 삼중 PCR 증폭을 수행했다. PCR 결과는 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소 효소 (GAPDH)로 정규화한 후 대조군 세포에 비해 상대적인 배수 변화로 표현했다. △Ct (S△Ct) 값은 GAPDH에 대해 얻은 Ct 값과 표적 유전자의 차이로 계산되었다. 제어 셀의 △Ct 값은 제어 △Ct (S△Ct) 값으로 사용되었다. 상대 유전자 발현 수준은 공식 2-(S△Ct-C△Ct)를 사용하여 결정되었다.For quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-qPCR), total RNA was isolated from each sample using NucleoZOL Reagent (Macherey-Nagel, Duren, Germany) and reverse transcribed using GoScript™ Reverse Transcription Mix (Promega). qPCR was performed using GoTaq® qPCR Master Mix (Promega) on a StepOnePlus Real-Time PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), and triplicate PCR amplification was performed for each sample. PCR results were normalized to glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and expressed as fold change relative to control cells. ΔCt (SΔCt) values were calculated as the difference between the Ct values obtained for GAPDH and the target gene. The ΔCt value of the control cell was used as the control ΔCt (SΔCt) value. Relative gene expression levels were determined using the formula 2-(SΔCt-CΔCt).

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 간 내배엽 오가노이드는 14일 후 형성되어 35일 이상 유지되는 것을 확인하였다. 또한, 도 5에 나타난 바와 같이, 간 전구세포(hepatic progenitor cell)/줄기세포(stem cell)의 마커인 EpCAM은 간 내배엽 세포 및 물방울 모양의 간 내배엽 오가노이드에서 높은 수준으로 발현되었다. 반면에, R-spondin 1에 결합하는 Wnt의 표적 단백질인 LGR5는 세포 표면에서 검출되지 않았고, Wnt 표적 유전자 AXIN2 및 EPHB2는 간 내배엽 세포에 비해 물방울 모양의 간 내배엽 오가노이드에서 유의하게 감소하였다.As a result, as shown in Figure 4, it was confirmed that liver endodermal organoids were formed after 14 days and maintained for more than 35 days. Additionally, as shown in Figure 5, EpCAM, a marker of hepatic progenitor cells/stem cells, was expressed at high levels in liver endoderm cells and drop-shaped liver endoderm organoids. On the other hand, LGR5, a target protein of Wnt that binds to R-spondin 1, was not detected on the cell surface, and Wnt target genes AXIN2 and EPHB2 were significantly reduced in drop-shaped liver endoderm organoids compared to liver endoderm cells.

상기 결과는 Wnt 신호 전달 과정은 간 내배엽 오가노이드 발생에 필요하지 않음을 제시한다. 또한, R-Spondin 1, EGF 및 Noggin은 장관 오가노이드 생산 및 확장에 주요한 요소로 알려져 있고, BMP 길항제인 Noggin은 간 사양을 억제한다고 알려져 있으므로, R-Spondin 1, EGF 및 Noggin을 제외한 배지 조성으로 간 내배엽 오가노이드를 분화시켰다.The above results suggest that the Wnt signaling process is not required for liver endodermal organoid development. In addition, R-Spondin 1, EGF, and Noggin are known to be key factors in intestinal organoid production and expansion, and Noggin, a BMP antagonist, is known to inhibit liver specification, so the medium composition excluding R-Spondin 1, EGF, and Noggin was used. Liver endoderm organoids were differentiated.

<< 실험예Experiment example 2> R- 2>R- SpondinSpondin 1, One, EGFEGF 및 Noggin을 제외한 배지 조성으로 간 내배엽 오가노이드를 분화시킨 경우의 and when liver endodermal organoids were differentiated with medium composition excluding Noggin. 간 내배엽 liver endoderm 오가노이드의of organoids 특성 characteristic

<2-1> 간 내배엽 세포를 R-<2-1> Liver endoderm cells are R- SpondinSpondin 1, One, EGFEGF 및 Noggin을 제외한 배지 조성으로 간 내배엽 and liver endoderm with medium composition excluding Noggin. 오가노이드로With organoids 분화시킨 경우 In case of differentiation 오가노이드의of organoids 수 및 number and 오가노이드organoid 형성 속도 측정 Formation rate measurement

상기 표 4의 배지 조성에서 R-Spondin 1, EGF, Noggin을 더 포함한 배지에서 배양하여 간 내배엽 오가노이드로 분화시킨 경우 및 상기 실시예 1-4-1과 동일한 방법 및 조건으로 간 내배엽 오가노이드로 분화시킨 경우에, 오가노이드의 수 및 오가노이드 형성 속도를 측정하였다.In the case of differentiation into liver endoderm organoids by culturing in a medium further containing R-Spondin 1, EGF, and Noggin in the medium composition of Table 4, and liver endoderm organoids using the same method and conditions as in Example 1-4-1. When differentiated, the number of organoids and the rate of organoid formation were measured.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 물방울 모양으로 간 내배엽 오가노이드를 분화시킨 경우 R-Spondin 1, Noggin 및 EGF(RNE)를 제외한 간 내배엽 오가노이드 생산 배지에서 제조된 오가노이드의 수는 RNE가 포함된 간 내배엽 오가노이드 생산 배지에서 제조된 오가노이드와 유사했고, 도 7에 나타난 바와 같이, 현탁 상태로 간 내배엽 오가노이드를 분화시킨 경우 R-Spondin 1, Noggin 및 EGF(RNE)를 제외한 간 내배엽 오가노이드 생산 배지에서 제조된 오가노이드의 수는 RNE가 포함된 간 내배엽 오가노이드 생산 배지에서 제조된 오가노이드에 비해 오가노이드 수가 현저하게 증가하였다. 또한, 도 8에 나타난 바와 같이, 현탁 상태로 제조한 간 내배엽 오가노이드(S-HEO)의 형성 속도는 RNE가 있는 배지에서 배양한 경우에 비해 RNE가 없는 배지에서 배양한 경우의 3.5배 이상이었다.As a result, as shown in Figure 6, when liver endoderm organoids were differentiated in a droplet shape, the number of organoids prepared in the liver endoderm organoid production medium excluding R-Spondin 1, Noggin, and EGF (RNE) was It was similar to the organoids prepared in the containing liver endoderm organoid production medium, and as shown in Figure 7, when liver endoderm organoids were differentiated in suspension, liver endoderm except for R-Spondin 1, Noggin, and EGF (RNE) The number of organoids prepared in organoid production medium was significantly increased compared to organoids prepared in liver endoderm organoid production medium containing RNE. In addition, as shown in Figure 8, the formation rate of liver endoderm organoids (S-HEO) prepared in suspension was more than 3.5 times higher when cultured in medium without RNE compared to when cultured in medium with RNE. .

<2-2> 분화한 간 내배엽 <2-2> Differentiated liver endoderm 오가노이드를Organoids 확장 단계에서In the expansion phase R-R- SpondinSpondin 1 및 1 and EGF를EGF 제외한 배지 조성으로 간 내배엽 Media composition excluding liver endoderm 오가노이드를Organoids 배양한 경우 If cultured

R-Spondin 1 및 EGF(RE)가 포함된 간 내배엽 오가노이드 생산 배지에서 간 내배엽 오가노이드를 물방울 형태로 배양한 경우(D(+)-HEO), R-Spondin 1 및 EGF(RE)가 포함되지 않은 간 내배엽 오가노이드 생산 배지에서 간 내배엽 오가노이드를 물방울 형태로 배양한 경우(D(-)-HEO), R-Spondin 1 및 EGF(RE)가 포함된 간 내배엽 오가노이드 생산 배지에서 간 내배엽 오가노이드를 현탁 상태로 배양한 경우(S(+)-HEO), R-Spondin 1 및 EGF(RNE)가 포함되지 않은 간 내배엽 오가노이드 생산 배지에서 간 내배엽 오가노이드를 현탁 상태로 배양한 경우(S(-)-HEO)에서 간 내배엽 오가노이드의 증식능, 간 전구 세포 마커 발현 정도를 측정하고 전사체 분석을 하였다.Liver endoderm organoids were cultured in droplet form in liver endoderm organoid production medium containing R-Spondin 1 and EGF(RE) (D(+)-HEO), containing R-Spondin 1 and EGF(RE). When liver endoderm organoids were cultured in the form of droplets in liver endoderm organoid production medium without (D(-)-HEO), liver endoderm organoids were cultured in liver endoderm organoid production medium containing R-Spondin 1 and EGF (RE). When organoids were cultured in suspension (S(+)-HEO), when liver endoderm organoids were cultured in suspension in liver endoderm organoid production medium without R-Spondin 1 and EGF (RNE) ( In S(-)-HEO), the proliferative capacity of liver endoderm organoids and the expression level of liver progenitor cell markers were measured and transcriptome analysis was performed.

<2-3> 다양한 조건에서 분화시킨 간 내배엽 <2-3> Liver endoderm differentiated under various conditions 오가노이드의of organoids 증식능Proliferative ability 및 간 and liver 전구세포progenitor cells 마커의marker's 발현 정도 확인 Check the level of expression

D(+)-HEO, D(-)-HEO, S(+)-HEO 및 S(-)-HEO의 네 가지 조건에서 배양한 간 내배엽 오가노이드의 구조, 증식 세포 포함 여부 및 간 내배엽 세포의 마커인 SOX9, EpCAM를 발현 하는지 여부를 하기와 같이 측정하였다.Structure of liver endoderm organoids cultured under four conditions: D(+)-HEO, D(-)-HEO, S(+)-HEO, and S(-)-HEO, whether they contain proliferating cells, and the number of liver endoderm cells. Expression of the markers SOX9 and EpCAM was measured as follows.

구체적으로, 네 가지 조건에서 분화시킨 간 내배엽 오가노이드를 bright-field 현미경 이미지로 촬영하고, 각 조건에서 분화시킨 간 내배엽 오가노이드의 파라핀 포매된 절편을 헤마톡실린&에오신(Hematoxlin&Eosin,H&E) 염색하였다.Specifically, liver endoderm organoids differentiated under four conditions were taken as bright-field microscopy images, and paraffin-embedded sections of liver endoderm organoids differentiated under each condition were stained with Hematoxylin & Eosin (H&E). .

BradU 염색을 위해 간 내배엽 오가노이드(hHEO)를 10μM BrdU(브로모-데옥시 우리딘) 라벨링 용액 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA)으로 처리하고 37℃에서 5% CO2에서 48시간 동안 배양했다. hHEO를 분리, 고정, 투과, 1.2M HCl로 변성시키고 BrdU 단일 클론 항체, Alexa Flour 488(Invitrogen)로 염색한 다음 DAPI 염색을 수행했다. Olympus FV3000 공초점 현미경을 사용하여 이미지를 관찰했다.For BradU staining, liver endoderm organoids (hHEO) were treated with 10 μM bromo-deoxyuridine (BrdU) labeling solution (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) and incubated for 48 h at 37°C in 5% CO 2 . did. hHEO was isolated, fixed, permeabilized, denatured with 1.2 M HCl, and stained with BrdU monoclonal antibody, Alexa Flour 488 (Invitrogen), followed by DAPI staining. Images were observed using an Olympus FV3000 confocal microscope.

면역 염색은 파라핀이 포매된 절편의 면역 형광을 위해 마트리겔에서 제거하기 위해 세포 회수 용액 (Corning)을 사용하여 오가노이드를 분리하고, 4℃에서 밤새 4% 포름알데히드에 고정한 후 파라핀 블록에 포매시켰다. 절편을 절단 및 수화하고, 항원 회수를 위해 구연산 나트륨 완충액 pH 6.0으로 끓였다. 샘플을 투과시키고 5% 정상 혈청(Jackson ImmunoResearch)으로 차단하고 각 1차 항체로 4℃에서 밤새 배양하고 플루오레세인 결합 2차 항체로 1시간 동안 표지했다. 핵은 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; Sigma-Aldrich)로 염색한 다음 ProLongTM Glass Antifade Mountant (Thermo)로 장착했다. Zeiss LSM 800 및 Olympus FV3000 공초점 현미경으로 이미지를 촬영했다.For immunostaining, organoids were separated using cell recovery solution (Corning) to remove them from Matrigel for immunofluorescence of paraffin-embedded sections, fixed in 4% formaldehyde overnight at 4°C, and then embedded in paraffin blocks. . Sections were cut, hydrated, and boiled in sodium citrate buffer pH 6.0 for antigen retrieval. Samples were permeabilized, blocked with 5% normal serum (Jackson ImmunoResearch), incubated overnight at 4°C with each primary antibody, and labeled with fluorescein-conjugated secondary antibodies for 1 hour. Nuclei were stained with 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; Sigma-Aldrich) and then mounted with ProLongTM Glass Antifade Mountant (Thermo). Images were taken with Zeiss LSM 800 and Olympus FV3000 confocal microscopes.

그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, D(+)-HEO 및 S(+)-HEO는 다중-층 낭성 구조(multi-layer cystic structure)을 가지고 있었고, D(-)-HEO 및 S(-)-HEO에서는 단일 층의 낭성 구조(single-layer cystic structure)가 관찰되었다. 또한, 도 10에 나타난 바와 같이, BradU 염색 사진에서 모든 조건의 간 내배엽 오가노이드에서 증식하고 있는 세포 집단이 관찰되었고, 간 전구 세포 마커인 SOX9, CK19 및 EpCAM도 발현되는 것을 확인하였다.As a result, as shown in Figure 9, D(+)-HEO and S(+)-HEO had a multi-layer cystic structure, and D(-)-HEO and S(- )-HEO, a single-layer cystic structure was observed. In addition, as shown in Figure 10, a proliferating cell population was observed in the liver endoderm organoids in all conditions in the BradU staining photos, and liver progenitor cell markers SOX9, CK19, and EpCAM were also confirmed to be expressed.

<2-4> 다양한 조건에서 분화시킨 간 내배엽 <2-4> Liver endoderm differentiated under various conditions 오가노이드의of organoids 전사체transcriptome 분석 analyze

D(+)-HEO, D(-)-HEO, S(+)-HEO 및 S(-)-HEO의 네 가지 조건에서 배양한 간 내배엽 오가노이드의 전사체 분석을 하기와 같이 수행하였다.Transcriptome analysis of liver endoderm organoids cultured under four conditions: D(+)-HEO, D(-)-HEO, S(+)-HEO, and S(-)-HEO was performed as follows.

구체적으로, TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit를 사용하여 mRNA 라이브러리를 생성한 다음 Illumina NovaSeq 6000 플랫폼을 사용하여 시퀀싱했다. 읽기(Read)는 HISAT2 (v2.1.0) (Kim et al., 2019)를 사용하여 정렬되고 StringTie (v1.3.4)를 사용하여 어셈블 되었다. 읽기 수는 edgeR (v3.26.8) R 패키지를 사용하여 M- 값(TMM)의 트림된 평균으로 정규화되었다. stats (v3.6.1) R 패키지에서 각각 var 및 prcomp 함수를 사용하여 차별적으로 발현된 유전자(highly variable genes)와 주요 성분을 계산했다. 유전자 온톨로지 및 KEGG 경로 분석은 DAVID를 사용하여 수행되었다 (Huang da et al., 2009a, b). Gene set enrichment analysis(GSEA)는 MSigDB(v7.0)의 특징 유전자 세트와 함께 GSEA 소프트웨어(v4.0.3)를 사용하여 수행되었다(Mootha et al., 2003).Specifically, mRNA libraries were generated using the TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit and then sequenced using the Illumina NovaSeq 6000 platform. Reads were aligned using HISAT2 (v2.1.0) (Kim et al., 2019) and assembled using StringTie (v1.3.4). Read counts were normalized to the trimmed mean of M-values (TMM) using the edgeR (v3.26.8) R package. Differentially expressed genes (highly variable genes) and principal components were calculated using the var and prcomp functions, respectively, in the stats (v3.6.1) R package. Gene ontology and KEGG pathway analysis were performed using DAVID (Huang da et al., 2009a, b). Gene set enrichment analysis (GSEA) was performed using GSEA software (v4.0.3) with feature gene sets from MSigDB (v7.0) ( Mootha et al., 2003 ).

그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 배양 조건(물방울 형태 또는 현탁 상태)의 차이가 R-spondin 1 및 EGF의 처리 여부보다 차등적으로 발현하는 유전자에서 더 큰 차이를 보이는 조건이었다. 물방울 형태의 간 내배엽 오가노이드를 배양하는 경우에는 오가노이드의 증식에 관여하는 유전자의 발현이 높게 나타나고, 현탁 상태의 간 내배엽 오가노이드를 배양하는 경우에는 오가노이드의 분화에 관여하는 유전자의 발현이 높게 나타남을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in Figure 11, the difference in culture conditions (droplet form or suspension state) was a condition that showed a greater difference in differentially expressed genes than the treatment with R-spondin 1 and EGF. When culturing liver endoderm organoids in the form of droplets, the expression of genes involved in organoid proliferation is high, and when culturing liver endoderm organoids in suspension, the expression of genes involved in organoid differentiation is high. I was able to confirm its appearance.

상기 결과를 종합하면, 인간 유도 만능 줄기세포로부터 분화된 간 내배엽 세포는 RNE가 포함되지 않은 배지에서 배양하여 간 내배엽 오가노이드를 생산할 수 있고, 간 내배엽 오가노이드는 R-Spondin 1 및 EGF 없이 확장 단계에서 간 내배엽 세포로 유지될 수 있음을 제시한다.Taken together, the above results show that liver endoderm cells differentiated from human induced pluripotent stem cells can produce liver endoderm organoids by culturing them in medium without RNE, and liver endoderm organoids can be produced in the expansion stage without R-Spondin 1 and EGF. suggests that it can be maintained as liver endoderm cells.

<< 실험예Experiment example 3> 다양한 조건에서 간 3> Liver under various conditions 오가노이드의of organoids 분화 후 간 Liver after differentiation 마커marker 유전자의 발현 확인 Confirmation of gene expression

<3-1> <3-1> EGF이EGF 포함되거나 포함되지 않은 배양 배지에서 간 내배엽 Liver endoderm in culture media with and without inclusions 오가노이Organoi 드를 간 오가노이드로 분화시켰을 경우의 주요 간 유전자의 발현 변화 확인Confirmation of changes in expression of major liver genes when cells are differentiated into liver organoids

D(+)-HEO, D(-)-HEO, S(+)-HEO 및 S(-)-HEO의 네 가지 조건에서 배양한 간 내배엽 오가노이드를 상기 표 8 또는 표 9의 배지에서 EGF를 포함하거나 포함하지 않는 두 가지의 배양 배지 조성 조건에서 상기 실시예 2-2와 동일한 방법 및 조건으로 간 오가노이드로 분화시킨 후(도 12), 주요 간 유전자의 발현을 측정하였다.Liver endoderm organoids cultured under four conditions, D(+)-HEO, D(-)-HEO, S(+)-HEO, and S(-)-HEO, were grown with EGF in the medium of Table 8 or Table 9 above. After differentiation into liver organoids using the same method and conditions as in Example 2-2 in two different culture medium composition conditions with and without inclusion (FIG. 12), the expression of major liver genes was measured.

구체적으로, 상기 실험예 1에 개시된 RT-qPCR과 동일한 방법 및 조건으로, ALB, AAT, HNF4A, TDO2, G6P, CYP2C9, CYP2C19, CYP3A4 및 FXR을 포함한 주요 간 유전자, 핵 수용체 및 CYP450 유전자의 발현 변화를 확인하였다.Specifically, changes in the expression of major liver genes, nuclear receptors, and CYP450 genes, including ALB, AAT, HNF4A, TDO2, G6P, CYP2C9, CYP2C19, CYP3A4, and FXR, using the same method and conditions as RT-qPCR disclosed in Experimental Example 1 above. was confirmed.

그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, 간 오가노이드로의 분화 동안 EGF가 없는 배양 배지 조건에서 간 오가노이드를 분화시켰을 때, 주요 간 유전자의 발현이 증가하였다. 따라서, EGF가 포함되지 않은 간 오가노이드 분화 배지를 사용하여 각 배양 조건에서 간 내배엽 오가노이드를 간 오가노이드로 분화시켰다.As a result, as shown in Figure 13, when liver organoids were differentiated in culture medium conditions without EGF during differentiation into liver organoids, the expression of major liver genes increased. Therefore, liver organoid differentiation medium without EGF was used to differentiate liver endoderm organoids into liver organoids under each culture condition.

<3-2> 다양한 조건에서 분화시킨 간 <3-2> Liver differentiated under various conditions 오가노이드의of organoids 구조 확인 및 간 Structure confirmation and liver 마커marker 유전자 발현 정도 확인 Check gene expression level

네 가지 조건에서 분화시킨 간 오가노이드를 상기 실험예 2-3에 기재된 방법과 동일한 방법 및 조건으로 bright-field 이미지, H&E 염색, 면역 염색을 수행하여 간 오가노이드의 구조를 확인하고, 상기 실험예 1에 기재된 방법과 동일한 방법과 조건으로 간 마커의 유전자 발현 정도를 전사 수준에서 RT-qPCR을 수행하고, 유세포 분석을 수행하여 ALB(알부민)의 발현 세포 수를 확인하였다.Liver organoids differentiated under four conditions were subjected to bright-field imaging, H&E staining, and immunostaining using the same methods and conditions as those described in Experimental Example 2-3 to confirm the structure of the liver organoids, and the experimental examples RT-qPCR was performed at the transcription level to determine the gene expression level of liver markers using the same method and conditions as described in 1, and flow cytometry was performed to confirm the number of cells expressing ALB (albumin).

그 결과, 도 14에 나타난 바와 같이, 간 내배엽 오가노이드는 분화 후 수축된 구형 형태로 자가 조직화되었으며 네 조건 모두 오가노이드 내부에 내강(lumen)을 나타냈다. S(+)-HO 및 S(-)-HO는 D(+)-HO 및 D(-)-HO보다 더 균일하게 간 오가노이드를 형성하였다. D(-)-HO 및 S(-)-HO가 단백질 수준(도 15) 및 전사 수준(도 16)에서 D(+)- 및 S(+)-HO에 비해 간 마커 수준의 발현보다 우수하다는 것을 확인했다.As a result, as shown in Figure 14, the liver endoderm organoids self-organized into a shrunken spherical shape after differentiation, and all four conditions showed a lumen inside the organoids. S(+)-HO and S(-)-HO formed liver organoids more uniformly than D(+)-HO and D(-)-HO. D(-)-HO and S(-)-HO have superior expression of liver marker levels compared to D(+)- and S(+)-HO at the protein level (Figure 15) and transcription level (Figure 16). confirmed that

또한, 도 17에 나타난 바와 같이, 유세포 분석을 수행하여 ALB(알부민)을 발현하는 세포 수를 계수한 결과, R-Spondin 1과 Noggin이 ALB 발현에 부정적인 영향을 미친다는 것을 확인했고, 도 18에 나타난 바와 같이, D(-)-HO 및 S(-)-HO에서 D(+)-HO 및 S(+)-HO보다 ALB(알부민), AAT(Alpha 1-antitrypsin), 및 ApoA1(Apolipoprotein A1) 단백질의 발현이 증가함을 확인하였다.In addition, as shown in Figure 17, flow cytometry was performed to count the number of cells expressing ALB (albumin), and it was confirmed that R-Spondin 1 and Noggin had a negative effect on ALB expression, and in Figure 18 As shown, albumin (ALB), alpha 1-antitrypsin (AAT), and apolipoprotein A1 (ApoA1) were higher in D(-)-HO and S(-)-HO than in D(+)-HO and S(+)-HO. ) It was confirmed that protein expression increased.

따라서, 이러한 결과는 확장 단계에서 R-Spondin 1과 EGF의 부재가 간 내배엽 오가노이드로의 분화 과정에서 간 성숙에 영향을 미쳤음과 간 오가노이드로의 분화 중 배양 배지에서 EGF를 제거한 경우 간 및 약물 대사 관련 유전자의 발현 수준이 증가하여 간 오가노이드의 성숙 과정이 증가되었음을 제시한다.Therefore, these results suggest that the absence of R-Spondin 1 and EGF during the expansion phase affected liver maturation during differentiation into liver endoderm organoids and that removal of EGF from the culture medium during differentiation into liver organoids affected the liver and drugs. The expression levels of metabolism-related genes increased, suggesting an increased maturation process of liver organoids.

<< 실험예Experiment example 4> 간 4> Liver 오가노이드에서In organoids 약물 대사 효소와 약물 Drug Metabolizing Enzymes and Drugs 수송체의transporter 발현 확인 Expression confirmation

<4-1> 간 <4-1> Liver 오가노이드의of organoids 구조 확인 및 약물 Structure confirmation and drug 수송체transporter 관련 유전자의 발현 확인 Confirmation of expression of related genes

간에서 ATP-결합 카세트 트랜스포터(ABC 트랜스포터)는 CYP450 효소와 phase II 접합에 의한 내인성 및 외인성 물질의 유출에 중요한 역할을 한다. 따라서, 간 내배엽 오가노이드로부터 분화시킨 간 오가노이드의 구조를 투과 전자 현미경으로 관찰하고, 상기 실시예 2에서 제조한 물방울 형태로 분화시킨 간 오가노이드(D-HOs), 현탁 상태로 분화시킨 간 오가노이드(S-HO), 상기 비교예 1에서 제조한 초대 배양 인간 간세포(primary human hepatocyte, PHH), HepG2(간암 세포주) 및 2D 간 유사 세포(hepatocyte like cell, 2D HLC)에서 정단부 및 기저측부(apical and basolateral) 약물 수송체(drug transporter)와 관련된 유전자 발현을 상기 실험예 1에 기재된 방법과 동일한 방법과 조건으로 확인하였다.In the liver, the ATP-binding cassette transporter (ABC transporter) plays an important role in the efflux of endogenous and exogenous substances by phase II conjugation with CYP450 enzymes. Therefore, the structure of liver organoids differentiated from liver endoderm organoids was observed using a transmission electron microscope, and liver organoids differentiated in the form of water droplets (D-HOs) prepared in Example 2 above, liver organoids differentiated in suspension, and liver organoids differentiated in suspension were observed using a transmission electron microscope. Apical and basolateral regions (S-HO), primary human hepatocyte (PHH), HepG2 (liver cancer cell line), and 2D liver-like cell (2D HLC) prepared in Comparative Example 1 ( Expression of genes related to apical and basolateral drug transporters was confirmed using the same method and conditions as those described in Experimental Example 1.

구체적으로, 투과 전자 현미경 관찰 과정은 하기와 같다. 간 오가노이드를 0.1M 인산염 완충액(PB), pH 7.4의 2% 글루타르 알데히드-파라 포름알데히드에서 12시간 동안 고정하고 0.1M 인산염 완충액에서 세척하였다. 0.1M PB에 용해된 1% OsO4로 2시간 동안 후 고정한 후 농도 구배 에탄올(50 내지 100%)로 탈수하고 프로필렌 옥사이드로 침투시켰다. 표본은 Poly/Bed 812 키트(Polysciences)에 내장되었다. 순수한 신선한 레진에 포매 및 65℃ 전자 현미경 오븐(TD-700, DOSAKA, 일본)에서 24시간 동안 중합시켰다. 약 200 내지 250nm 두께의 단면을 처음에 절단하고 광학 현미경을 위해 톨루이딘 블루(Sigma-Aldrich)로 염색했다. 70nm 얇은 섹션은 대조 염색을 위해 6% 우라닐 아세테이트(EMS, 22400, 20분) 및 납 시트레이트(피셔, 10분)로 이중 염색되었다. 다이아몬드 나이프(Diatome)를 사용하여 LEICA EM UC-7 (오스트리아 라이카 마이크로 시스템즈)에 의해 절단된 섹션을 구리 및 니켈 그리드에 옮기고, 모든 얇은 부분은 80kV의 가속 전압에서 투과 전자 현미경 (JEM-1011, JEOL, Japan)으로 관찰되었다.Specifically, the transmission electron microscopy observation process is as follows. Liver organoids were fixed for 12 h in 2% glutaraldehyde-paraformaldehyde in 0.1 M phosphate buffer (PB), pH 7.4, and washed in 0.1 M phosphate buffer. After fixation with 1% OsO 4 dissolved in 0.1 M PB for 2 hours, it was dehydrated with gradient ethanol (50 to 100%) and permeated with propylene oxide. Specimens were embedded in the Poly/Bed 812 kit (Polysciences). Embedded in pure fresh resin and polymerized for 24 h in an electron microscope oven (TD-700, DOSAKA, Japan) at 65°C. Sections approximately 200 to 250 nm thick were initially cut and stained with toluidine blue (Sigma-Aldrich) for light microscopy. 70 nm thin sections were double stained with 6% uranyl acetate (EMS, 22400, 20 min) and lead citrate (Fischer, 10 min) for counterstaining. Sections cut by a LEICA EM UC-7 (Leica Microsystems, Austria) were transferred onto copper and nickel grids using a diamond knife (Diatome), and all thin sections were subjected to transmission electron microscopy (JEM-1011, JEOL) at an accelerating voltage of 80 kV. , Japan).

그 결과, 도 19에 나타난 바와 같이, 간 오가노이드에서 내강 측 막의 미세 융모 구조와 밀착 연접 구조를 관찰할 수 있었다. 또한, 도 20에 나타난 바와 같이, D(-)-HO, S(-)-HO, PHH, HepG2 및 2D HLC 사이에서 약물 수송체 관련 유전자의 전사 발현 분석 결과, 2D HLC와 비교하여 D(-)-HO 및 S(-)-HO 모두 MRP2, BSEP, MDR1 및 BCRP와 같은 정단부 약물 수송체(apical transporter) 유전자의 발현이 높았다. 한편, D(-)-HO 및 S(-)-HO는 각각의 기저측 부 약물 수송체 유전자인 MRP3 및 NTCP 각각의 발현이 유의하게 높았다.As a result, as shown in Figure 19, the microvilli structure and tight junction structure of the luminal side membrane were observed in the liver organoid. In addition, as shown in Figure 20, as a result of transcriptional expression analysis of drug transporter-related genes between D(-)-HO, S(-)-HO, PHH, HepG2, and 2D HLC, compared to 2D HLC, D(-) )-HO and S(-)-HO both had high expression of apical drug transporter genes such as MRP2, BSEP, MDR1, and BCRP. Meanwhile, D(-)-HO and S(-)-HO showed significantly higher expression of the basolateral drug transporter genes MRP3 and NTCP, respectively.

상기 결과는 미세 융모를 가진 정단부 측 막은 내강 측막에 위치한 간 오가노이드에서 집중적으로 발달한다는 것을 제시한다.The above results suggest that the apical side membrane with microvilli is intensively developed in liver organoids located in the luminal side membrane.

<4-2> <4-2> 정단부apex 약물 drug 수송체transporter 유전자가 간 genes have gone 오가노이드에서In organoids 발현하는지 여부 확인 Check whether it is expressed or not

정단부 약물 수송체(apical drug transporter) 관련 유전자인 MRP2, BSEP 및 MDR1이 간 오가노이드에서 발현하는지와, 각 유전자의 억제제를 투여하였을 때의 발현 변화를 형광염색으로 확인하였다.Whether the apical drug transporter-related genes MRP2, BSEP, and MDR1 were expressed in liver organoids, and the expression changes when inhibitors of each gene were administered were confirmed using fluorescent staining.

구체적으로, 간 오가노이드는 Matrigel에서 회수되었고 DPBS로 3회 세척되었다. CDFDA((5(6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein diacetate) 염색의 경우, 3 시간 동안 2mM 프로베네시드(probenecid)를 처리하거나 처리하지 않은 간 오가노이드를 37℃, 5% CO2에서 15분 동안 10μM CDFDA(Sigma-Aldrich)로 염색했다. CLF(Choyl-Lysyl-Fluorescein) 및 로다민 123 염색의 경우, 10μM 케토코나졸ketokonazole)을 사용하거나 사용하지 않고 24시간 동안 4μM CLF(Corning) 또는 10μM 로다민 123(Invitrogen)으로 각각 15분 동안 처리한 간 오가노이드를 1시간 동안 배양하고, 모든 샘플을 DPBS로 3회 세척하고 Hoechst 33342로 염색하고 Olympus FV3000 공초점 현미경으로 관찰하였다.Specifically, liver organoids were recovered from Matrigel and washed three times with DPBS. For CDFDA ((5(6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein diacetate) staining, liver organoids were treated or not with 2mM probenecid for 3 hours at 37°C in 5% CO 2. For 15 min, staining was performed with 10 μM CDFDA (Sigma-Aldrich). For Choyl-Lysyl-Fluorescein (CLF) and rhodamine 123 staining, 4 μM CLF (Corning) was used with or without 10 μM ketokonazole) for 24 h. Liver organoids treated with 10 μM rhodamine 123 (Invitrogen) for 15 minutes each were incubated for 1 hour, and all samples were washed three times with DPBS, stained with Hoechst 33342, and observed under an Olympus FV3000 confocal microscope.

그 결과, 도 21에 나타난 바와 같이, D(-)-HO 및 S(-)-HO의 정단층 막에서 MRP2(CDFDA로 염색)의 발현이 확인되었고, 도 22에 나타난 바와 같이, MDR1(로다민 123으로 염색)의 발현이 확인되었으며, 도 23에 나타난 바와 같이, BSEP(CLF로 염색)가 간 오가노이드의 정단층 막에서 특이적으로 검출되었음을 확인하였다(초록색 형광). 흡수된 각 형광의 방출은 정상 상태에서 관찰되었으며, D(-)-HO 및 S(-)-HO에서 수송체의 활동을 확인하는 각 수송체의 억제제(MRP2의 억제제는 프로베네시드, MDR1 및 BSEP의 억제제는 케토코나졸)에 의해 차단되었을 때, 각 약물 수송체 특이적 형광은 간 오가노이드 내강에 축적되었다. 도 23에 나타난 바와 같이, 로다민 123은 MDR1 억제에 의한 세포질 축적으로 인해 세포 밖으로 방출되지 않았다.As a result, as shown in Figure 21, the expression of MRP2 (stained with CDFDA) was confirmed in the apical monolayer membrane of D(-)-HO and S(-)-HO, and as shown in Figure 22, MDR1 (rhodamine The expression of (stained with 123) was confirmed, and as shown in Figure 23, it was confirmed that BSEP (stained with CLF) was specifically detected in the apical monolayer membrane of liver organoids (green fluorescence). The emission of each absorbed fluorescence was observed at steady state and inhibitors of each transporter (inhibitors of MRP2 were probenecid, MDR1 and When blocked by ketoconazole, an inhibitor of BSEP, each drug transporter-specific fluorescence accumulated in the liver organoid lumen. As shown in Figure 23, rhodamine 123 was not released out of the cell due to cytoplasmic accumulation due to MDR1 inhibition.

상기 결과는 간 오가노이드가 기저측이 아닌 내강에 존재하는 정단부 막의 발달로 인해 정단부 유출 약물 수송체의 높은 발현으로 인해 제조한 간 오가노이드가 약물 방출 기능을 가지고 있음을 제시한다.The above results suggest that the prepared liver organoids have a drug release function due to the high expression of apical efflux drug transporters due to the development of the apical membrane present in the lumen rather than the basolateral side.

<< 실험예Experiment example 5> 간 5> Liver 오가노이드의of organoids 세포 구성 및 간 세포 특이적 Cell composition and liver cell specific 마커marker 발현 확인 Expression confirmation

간 오가노이드의 세포 구성을 조사하기 위해 단일 세포 RNA 시퀀싱에 의해 S (-)-HO의 단일 세포 전사체 분석을 수행하였다.To investigate the cellular composition of liver organoids, single-cell transcriptome analysis of S(-)-HO was performed by single-cell RNA sequencing.

구체적으로, scRNA-seq용 라이브러리는 Chromium Single Cell 3’Reagent Kit v3, Chromium Chip B Single Cell Kit 및 Chromium i7 Multiplex Kit (10X Genomics)를 사용하였다. 간 오가노이드는 Embryoid body dissociation kit (Miltenyi Biotec)를 사용하여 분리한 다음 35㎛ 스트레이너를 통해 여과하고 Chromium microfluidic 플랫폼에 로드하여 7,000개의 개별 세포를 포획했다. 라이브러리는 Illumina HiSeq X Ten 플랫폼에서 paired-end로 시퀀싱되었다. Single Cell 3’라이브러리를 시퀀싱하면 paired-end Read 1 (16bp 10x ™ 바코드 및 12bp UMI 포함) 및 Read 2, i7 인덱스 읽기의 샘플 인덱스가 포함된 FASTQ 파일이 생성되었다. 이러한 파일은 기본 인수를 사용하여 Cell Ranger ™ (v3.1.0)로 처리되었다. 판독은 인간 참조 게놈 (GRCh38)에 맞춰 정렬되었다. Seurat (v3.0.4) R 패키지를 사용하여 검출된 유전자가 2,000개 미만이고 UMI가 10% 이상인 세포를 Seurat (v3.0.4) R 패키지를 사용하여 추가로 필터링하고 최종적으로 20,125 × 1,859 유전자 별 매트릭스를 얻었다. 표현식 매트릭스는 scanpy (v1.4.5.1) Python 패키지를 사용하여 가져오고 분석되었다. 세포는 tl.draw_graph 함수를 사용하여 2차원 ForceAtlas2 플롯으로 시각화한 다음 PAGA-초기화로 재계산했다. 클러스터링은"n_neighbors = 4", "n_pcs = 20" 및 "resolution = 1"과 함께 tl.leiden 함수를 사용하여 수행되었다. Wilcoxon rank-sum 테스트 옵션 및 tl.rank_genes_groups 함수를 사용하여 클러스터 및 셀 그룹의 마커 유전자를 발견했다. 간세포 유사, 담도 유사, 담낭 유사 및 세포주기를 포함한 유전자 세트 발현 점수는 tl.score_genes 함수를 사용하여 계산되었다. 유전자 온톨로지 및 KEGG 경로 분석은 DAVID를 사용하여 수행되었다.Specifically, the libraries for scRNA-seq used Chromium Single Cell 3’Reagent Kit v3, Chromium Chip B Single Cell Kit, and Chromium i7 Multiplex Kit (10X Genomics). Liver organoids were isolated using the Embryoid body dissociation kit (Miltenyi Biotec), then filtered through a 35 μm strainer and loaded onto the Chromium microfluidic platform to capture 7,000 individual cells. Libraries were sequenced paired-end on the Illumina HiSeq X Ten platform. Sequencing the Single Cell 3' library generated a FASTQ file containing sample indices of paired-end Read 1 (including 16bp 10x™ barcode and 12bp UMI) and Read 2, i7 indexed reads. These files were processed with Cell Ranger™ (v3.1.0) using default arguments. Reads were aligned to the human reference genome (GRCh38). Cells with less than 2,000 genes and a UMI of 10% or more were further filtered using the Seurat (v3.0.4) R package and finally a 20,125 × 1,859 gene-specific matrix was generated. got it Expression matrices were imported and analyzed using the scanpy (v1.4.5.1) Python package. Cells were visualized as two-dimensional ForceAtlas2 plots using the tl.draw_graph function and then recalculated with PAGA-initialization. Clustering was performed using the tl.leiden function with "n_neighbors = 4", "n_pcs = 20" and "resolution = 1". Marker genes for clusters and cell groups were discovered using the Wilcoxon rank-sum test option and the tl.rank_genes_groups function. Gene set expression scores, including hepatocyte-like, biliary-like, gallbladder-like, and cell cycle, were calculated using the tl.score_genes function. Gene ontology and KEGG pathway analysis were performed using DAVID.

그 결과, 도 24에 나타난 바와 같이, 간 오가노이드에서 19개의 서로 다른 세포 클러스터가 존재하는 것을 확인하였다.As a result, as shown in Figure 24, it was confirmed that 19 different cell clusters existed in the liver organoid.

또한, 도 25에 나타난 바와 같이, 유전자 발현 패턴과 GO-term 분석을 기반으로 세포를 3개의 그룹으로 분류하여, 첫 번째 그룹은 클러스터 2와 15로 구성되고 담도 유사 세포(biliary-like cell)가 포함되어 있고, 두 번째 그룹은 클러스터 18로 구성되고 담낭 유사 세포(gallbladder-like cell)가 포함되어 있으며, 세 번째 그룹에는 나머지 클러스터가 포함되어 있고 간 세포 유사 세포(hepatocyte-like cell)가 포함되어 있음을 확인하였다.Additionally, as shown in Figure 25, cells were classified into three groups based on gene expression patterns and GO-term analysis, with the first group consisting of clusters 2 and 15 and biliary-like cells. The second group consists of cluster 18 and contains gallbladder-like cells, and the third group contains the remaining clusters and contains hepatocyte-like cells. It was confirmed that it exists.

또한, 도 26에 나타난 바와 같이, 각 그룹의 대표적인 마커(간세포 계통의 경우 ALB, ASGR1 및 SERPINA1, 담즙 계통의 경우 KRT19, EPCAM 및 ITGB4, 담낭 계통의 경우 REG4, TFF3 및 FCGBP)가 발현되는 것을 확인하고, 도 27에 나타난 바와같이, 각 그룹의 특정 마커는 각 클러스터에서 독점적으로 발현되었다. 간 오가노이드가 88.44%의 간세포 유사 세포를 포함하고 있으며 이는 ALB-발현 세포와 유사한 비율이고, 담도 유사 세포는 10.38% 및 담낭 유사 세포는 1.18%의 비율을 차지하는 것을 확인하였다.In addition, as shown in Figure 26, representative markers of each group (ALB, ASGR1, and SERPINA1 for the hepatocyte lineage, KRT19, EPCAM, and ITGB4 for the biliary lineage, and REG4, TFF3, and FCGBP for the gallbladder lineage) were confirmed to be expressed. And, as shown in Figure 27, specific markers of each group were exclusively expressed in each cluster. It was confirmed that the liver organoids contained 88.44% of hepatocyte-like cells, which is a similar proportion to ALB-expressing cells, and that biliary-like cells accounted for 10.38% and gallbladder-like cells for 1.18%.

상기 결과는 간 오가노이드가 세포 특이적인 마커를 발현하는 전구 세포 유사 세포를 포함하는 간 유사 세포, 담낭 유사 세포 및 담도 유사 세포로 구성되어,간을 유사하게 모사할 수 있음을 제시한다.The above results suggest that liver organoids are composed of liver-like cells, gallbladder-like cells, and biliary-like cells, including progenitor-like cells expressing cell-specific markers, and can closely mimic the liver.

<< 실험예Experiment example 6> 간 6> Liver 오가노이드의of organoids 약물 대사 능력 측정 Measurement of drug metabolism ability

약물의 대사 제거는 간 조직의 주요 기능 중 하나이므로, 간 오가노이드 모델에서 약물 효능 및 독성 테스트에서 재현 가능한 고 기능성 약물 대사 능력이 필요하다. 따라서 간 오가노이드가 적절한 약물 대사 능력을 나타내는지 여부를 확인하기 위해 CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 및 CYP3A4를 포함한 주요 CYP450의 발현 정도를 상기 실험예 1에 기재된 방법과 동일한 방법과 조건으로 RT-qPCR을 수행하여 다른 시험관 내(in vitro) 모델(간암 세포주(HepG2), 초대 배양 인간 간세포(PHH), 간 세포 유사 세포(2D HLC))과 비교했다. 주요 CYP450의 활성은 LC-MS/MS 분석을 통하여 측정하였다.Since metabolic elimination of drugs is one of the main functions of liver tissue, a highly functional drug metabolic capacity that is reproducible in drug efficacy and toxicity tests in liver organoid models is required. Therefore, to determine whether liver organoids exhibit appropriate drug metabolism ability, the expression levels of major CYP450s, including CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, and CYP3A4, were measured by RT-qPCR using the same method and conditions as described in Experimental Example 1 above. was performed and compared with other in vitro models (liver cancer cell line (HepG2), primary cultured human hepatocytes (PHH), and hepatocyte-like cells (2D HLC)). The activity of major CYP450s was measured through LC-MS/MS analysis.

구체적으로, 기초 CYP450 활성을 측정하기 위해, 기질 반응은 5% CO2, 37℃에서 24시간 동안 물방울 형태의 간 오가노이드(D(-)HO), 현탁 상태에서 배양한 간 오가노이드(S(-)HO), 초대 배양 인간 간세포(PHH), 간암 세포주(HepG2) 및 2D 간 세포 유사 세포(2D HLC)에서 수행되었다. CYP450 이소폼 특정 기질 칵테일 세트 (세트 A, CYP1A2에 대해 50μM phenacetin, CYP2A6에 5μM coumarin, CYP2C8에 5μM amodiaquine, CYP2C19에 100μM S-mephenytoin, CYP2D6에 대해 5μM midazolamthorphan, CYP3A4에 대해 20μM dextromethorphan을 사용했다. ; 세트 B, CYP2B6의 경우 50μM bupropion, CYP2C9의 경우 90μM diclofenac, CYP2E1의 경우 90μM chlorzoxazone). 각 CYP450 이소폼 특이적 기질 칵테일 세트는 웰 당 최종 부피가 0.6㎖인 24 웰 배양 플레이트에서 배양되었다. 80㎕의 배지를 2, 4, 6 및 24시간에 각각 회수하고, 100nM carbamazepine(CBZ) 및 300 nM 4-methylumbelliferone(4-MUF)을 포함하는 80㎕의 빙냉 아세토니트릴(ACN)을 첨가하여 반응을 켄칭했다. 샘플을 4℃에서 10분 동안 16,000g에서 원심 분리하고 상청액을 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법 (LC-MS/MS)에 적용했다. 데이터는 단백질 농도로 정규화되었다.Specifically, to measure basal CYP450 activity, substrate reactions were performed using liver organoids in droplet form (D(-)HO), liver organoids cultured in suspension (S( -)HO), primary cultured human hepatocytes (PHH), hepatoma cell line (HepG2), and 2D liver cell-like cells (2D HLC). A CYP450 isoform-specific substrate cocktail set (Set A, 50 μM phenacetin for CYP1A2, 5 μM coumarin for CYP2A6, 5 μM amodiaquine for CYP2C8, 100 μM S-mephenytoin for CYP2C19, 5 μM midazolamthorphan for CYP2D6, and 20 μM dextromethorphan for CYP3A4; set B, 50 μM bupropion for CYP2B6, 90 μM diclofenac for CYP2C9, and 90 μM chlorzoxazone for CYP2E1). Each CYP450 isoform-specific substrate cocktail set was cultured in a 24-well culture plate with a final volume of 0.6 ml per well. 80 ㎕ of medium was collected at 2, 4, 6, and 24 hours, and 80 ㎕ of ice-cold acetonitrile (ACN) containing 100 nM carbamazepine (CBZ) and 300 nM 4-methylumbelliferone (4-MUF) was added for reaction. quenched. Samples were centrifuged at 16,000 g for 10 min at 4°C and the supernatant was subjected to liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Data were normalized to protein concentration.

그 결과, 도 28에 나타난 바와 같이, CYP1A2 유전자를 제외하고 D(-)-HO 및 S(-)-HO의 4개의 CYP450 유전자는 D(+)-HO 및 S(+)-HO보다 높은 발현 수준을 나타냈다. 또한, 도 29에 나타난 바와 같이, 주요 CYP450의 활성도는 물방울(droplet) 형태의 배양에서만 R Spondin-1 및 EGF 첨가에 따라 대사 산물 생산량이 다르지만 현탁 배양에는 차이가 없음을 확인하였고, D(-)-HO 및 S(-)-HO에서 CYP2C9 및 CYP2C19 활성은 초대 배양 인간 간세포(PHH)와 유사했다. 간 오가노이드는 HepG2 및 2D HLC보다 높은 수준의 CYP450 발현 및 활성을 가진 반면, CYP1A2, CYP2D6 및 CYP3A4에 의해 매개 되는 대사 산물 생산은 PHH에 비해 낮았다. As a result, as shown in Figure 28, except for the CYP1A2 gene, the four CYP450 genes of D(-)-HO and S(-)-HO had higher expression than D(+)-HO and S(+)-HO. level was indicated. In addition, as shown in Figure 29, the activity of major CYP450 was confirmed to vary in metabolite production depending on the addition of R Spondin-1 and EGF only in droplet-type culture, but there was no difference in suspension culture, D(-) CYP2C9 and CYP2C19 activities in -HO and S(-)-HO were similar to primary cultured human hepatocytes (PHH). Liver organoids had higher levels of CYP450 expression and activity than HepG2 and 2D HLC, whereas metabolite production mediated by CYP1A2, CYP2D6 and CYP3A4 was lower compared to PHH.

상기 결과는 확장 단계에서 R-Spondin 1 및 EGF가 포함되지 않는 배지에서 간 오가노이드를 분화 시키는 경우 약물 대사 효소인 CYP450의 발현 및 활성이 증가하는 것을 나타낸다.The above results indicate that the expression and activity of CYP450, a drug metabolizing enzyme, increase when liver organoids are differentiated in a medium that does not contain R-Spondin 1 and EGF in the expansion stage.

<< 실험예Experiment example 7> 구연산 철(Ferric Citrate, 7> Ferric Citrate, FCF.C. )이 첨가된 배지에서 간 ) Liver in a medium supplemented with 오가노이Organoi 드를 분화시키는 경우의 CYP450의 활성에 미치는 영향 확인Determination of the effect on CYP450 activity when differentiating

헴(철(III) 프로토포르피린-IX)는 CYP450에 결합할 때 산소 활성화에 중요한 보조 인자이다. 구연산 철(Ferric Citrate, FC)은 대식세포와 간세포에서 간 철분 축적을 증가시킨다(Chang et al., 2018; Lim et al., 2019). 따라서 간 오가노이드의 분화 단계 중 철(III) 보충제가 CYP450 활성을 향상시킬 수 있는지 여부를 확인하였다(도 30).Heme (iron(III) protoporphyrin-IX) is an important cofactor for oxygen activation when binding to CYP450. Ferric citrate (FC) increases hepatic iron accumulation in macrophages and hepatocytes (Chang et al., 2018; Lim et al., 2019). Therefore, we examined whether iron(III) supplementation could improve CYP450 activity during the differentiation stage of liver organoids (FIG. 30).

구체적으로, 간 내배엽 오가노이드는 20 또는 50μM 구연산 철(FC)을 포함하는 간 오가노이드 분화 배지를 사용하여 상기 실시예 2와 동일한 방법 및 조건으로 15일 동안 간 오가노이드로 분화되었다. live and dead cell 분석의 경우 FC를 사용하거나 사용하지 않고 처리한 간 오가노이드를 live/dead Viability/ Cytotoxicity 키트(Thermo)로 염색했다. Olympus FV3000 공초점 현미경을 사용하여 이미지를 관찰했다. 간 오가노이드의 생존율은 CCK-8(Dojindo) 분석을 사용하여 측정되었다. 이러한 값은 CellTiter-Glo® 3D 세포 생존력 분석(Promega)에서 얻은 값으로 정규화되었다. 대조군 간 오가노이드의 생존율(%)은 100%로 정규화하였다.Specifically, liver endoderm organoids were differentiated into liver organoids for 15 days in the same manner and conditions as Example 2 above using liver organoid differentiation medium containing 20 or 50 μM iron citrate (FC). For live and dead cell analysis, liver organoids treated with or without FC were stained with the live/dead Viability/Cytotoxicity kit (Thermo). Images were observed using an Olympus FV3000 confocal microscope. The survival rate of liver organoids was measured using the CCK-8 (Dojindo) assay. These values were normalized to those obtained from the CellTiter-Glo® 3D Cell Viability Assay (Promega). The survival rate (%) of control liver organoids was normalized to 100%.

CYP450의 대사 산물 검출 및 정량화를 위해 병렬 LC-20ADXR 펌프, 자동 시료 주입기 및 컬럼 오븐(Shimadzu)이 있는 Prominence UFLC 시스템을 사용하여 시료를 분석했다. 시료 주입량은 10㎕이었고, 30℃에서 유지된 SecurityGuard C18 가드 컬럼(2.0mm×4.0mm id; Phenomenex, Torrence, CA)이 있는 Atlantis dC18 컬럼(2.1mm x 50mm id, 3μm, Waters, Milford, MA)에서 분리를 수행했다. HPLC 유속은 0.4 ㎖/분으로 설정되었다. HPLC 이동상은 A[0.1%(v/v) 포름산을 포함하는 탈 이온수] 및 B [0.1%(v/v) 포름산을 포함하는 아세토니트릴)]로 구성되었다. LC-MS/MS 데이터는 포지티브 또는 네거티브(CYP2E1의 경우) ESI 모드에서 작동하는 TurboIonSpray 인터페이스가 장착된 Applied Biosystems SCIEX 3200 QTRAP 하이브리드 삼중 사중 극자-선형 이온 트랩 질량 분석기로 수집되었다. 또한, 4- 하이드록시 디클로페낙은 양성 모드에서 m/z 312 → 230으로 설정되었다. 데이터 수집 및 분석은 AnalystTM 소프트웨어(ver. 1.6.2; Applied Biosystems, Foster city, CA)로 수행되었다.For detection and quantification of metabolites of CYP450, samples were analyzed using a Prominence UFLC system with a parallel LC-20ADXR pump, autosampler, and column oven (Shimadzu). The sample injection volume was 10 μl, using an Atlantis dC18 column (2.1 mm × 50 mm id, 3 μm, Waters, Milford, MA) with a SecurityGuard C18 guard column (2.0 mm × 4.0 mm id; Phenomenex, Torrence, CA) maintained at 30°C. Separation was performed in The HPLC flow rate was set at 0.4 mL/min. The HPLC mobile phase consisted of A [deionized water containing 0.1% (v/v) formic acid] and B [acetonitrile containing 0.1% (v/v) formic acid]. LC-MS/MS data were collected on an Applied Biosystems SCIEX 3200 QTRAP hybrid triple quadrupole-linear ion trap mass spectrometer equipped with a TurboIonSpray interface operating in positive or negative (for CYP2E1) ESI mode. Additionally, 4-hydroxy diclofenac was set to m/z 312 → 230 in positive mode. Data collection and analysis were performed with AnalystTM software (ver. 1.6.2; Applied Biosystems, Foster city, CA).

그 결과, 도 31에 나타난 바와 같이, 구연산 철(FC)은 상기 표 8 및 표 9의 배지의 조성에서 20μM 용량으로 처리되는 경우 세포 독성을 나타내지 않았다. 또한, 도 32에 나타난 바와 같이, 50μM의 구연산 철을 배지에 포함시킨 경우 죽은 세포에서 나타나는 EthD-1의 붉은 형광만 나타났으나, 20μM의 구연산 철을 배지에 포함시킨 경우 살아 있는 세포에서 나타나는 Calcein AM의 녹색 형광이 나타나, 구연산 철의 처리 용량을 20μM로 결정하였다.As a result, as shown in Figure 31, iron citrate (FC) did not show cytotoxicity when treated at a dose of 20 μM in the medium composition of Tables 8 and 9 above. In addition, as shown in Figure 32, when 50 μM iron citrate was included in the medium, only the red fluorescence of EthD-1 appeared in dead cells, but when 20 μM iron citrate was included in the medium, Calcein appeared in living cells. Green fluorescence of AM appeared, and the treatment dose of iron citrate was determined to be 20 μM.

또한, 도 33에 나타난 바와 같이, CYP450 활성은 현탁 상태로 배양한 간 오가노이드(S-HO FC)에서 CYP1A2를 제외하고 구연산 철의 처리에 의해 크게 증가했다. 장기간 동안 CYP450 효소 활성의 유지를 관찰하기 위해 7일 동안 D-HO 및 S-HO FC의 CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 및 CYP3A4의 활성을 측정한 결과, 도 34에 나타난 바와 같이 CYP1A2, CYP2C9, CYP2D6의 활성은 7일 동안 유지되었으나, CYP2C19 및 CYP3A4는 4일부터 감소하는 경향을 나타냈다.Additionally, as shown in Figure 33, CYP450 activity was significantly increased by treatment with iron citrate, except for CYP1A2, in liver organoids (S-HO FC) cultured in suspension. To observe the maintenance of CYP450 enzyme activity over a long period of time, the activities of CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, and CYP3A4 of D-HO and S-HO FC were measured for 7 days. As shown in Figure 34, CYP1A2, CYP2C9, and CYP2D6 The activity was maintained for 7 days, but CYP2C19 and CYP3A4 tended to decrease from day 4.

상기 결과는 간 오가노이드에서 CYP450 활성을 증가시키기 위해 철이 필요하다는 것을 제시한다.The above results suggest that iron is required to increase CYP450 activity in liver organoids.

<< 실험예Experiment example 8> 간 8> Liver 오가노이드의of organoids 약물 독성 실험 drug toxicity test

<8-1> 간 <8-1> Liver 오가노이드의of organoids 약물 독성 평가 Drug toxicity assessment

약물 독성 평가를 위한 세포 모델로서 간 오가노이드의 유용성을 확인하기 위해 간 오가노이드, 간암 세포주(HepG2) 및 2D 간 세포 유사 세포(hepatocyte-like cell)에서 약물 독성 평가를 수행하였다.To confirm the usefulness of liver organoids as a cell model for drug toxicity evaluation, drug toxicity evaluation was performed on liver organoids, a liver cancer cell line (HepG2), and 2D hepatocyte-like cells.

구체적으로, 구연산 철이 있는 배양 배지에서 배양되어 제조된 D-HO, S-HO, HepG2 및 2D HLC를 96 웰 플레이트에서 배양했다. 1-, 5-, 10-, 20-, 40-fold Cmax 농도의 화합물(티클로피딘, 플루타마이드, 을 각 기본 배지에서 준비했으며 최종 DMSO 농도는 0.1 %이다. 간 오가노이드 또는 세포를 화합물로 24시간 동안 처리하고, CellTiter-Glo® 3D Cell Viability Assay(Promega)를 사용하여 생존력을 측정했다. 얻은 값은 대조군에 대해 정규화되었다. 정규화된 값은 선량-반응 관계를 비선형 회귀 곡선으로 시각화하고 IC50 값을 계산하는 데 사용되었다(GraphPad Prism, GraphPad Software, San Diego, CA). 또한 테스트 된 각 화합물에 대한 다양한 세포 유형의 민감도는 IC50 값 (GraphPad Prism)의 히트맵으로 표시되었다.Specifically, D-HO, S-HO, HepG2, and 2D HLC prepared by culturing in culture medium with iron citrate were cultured in 96 well plates. Compounds (ticlopidine, flutamide, etc.) at 1-, 5-, 10-, 20-, and 40-fold Cmax concentrations were prepared in each basal medium, and the final DMSO concentration was 0.1%. Liver organoids or cells were treated with compounds 24 Treatment time, and viability was measured using the CellTiter-Glo® 3D Cell Viability Assay (Promega).The values obtained were normalized to the control.The normalized values visualize the dose-response relationship as a non-linear regression curve and represent the IC50 value. (GraphPad Prism, GraphPad Software, San Diego, CA). Additionally, the sensitivity of different cell types to each compound tested was displayed as a heatmap of IC50 values (GraphPad Prism).

그 결과, 도 35에 나타난 바와 같이, 대부분의 약물에서 D-HO FC는 다른 세포 모델보다 낮은 농도에서 세포 독성을 갖는 것으로 관찰되었다As a result, as shown in Figure 35, for most drugs, D-HO FC was observed to have cytotoxicity at lower concentrations than other cell models.

<8-2> 간 <8-2> Liver 오가노이드의of organoids CYP450CYP450 매개 medium 약물 대사 능력 평가Evaluation of drug metabolism ability

약물 대사 능력 평가를 위한 세포 모델로서 간 오가노이드의 유용성을 확인하기 위해 간 오가노이드(D-HO FC 및 S-HO FC), 초대 배양 인간 간 세포(PHH)에서 CYP450 매개 약물 대사 능력을 비교하였다.To confirm the usefulness of liver organoids as a cell model for evaluating drug metabolism capacity, CYP450-mediated drug metabolism capacity was compared in liver organoids (D-HO FC and S-HO FC) and primary cultured human liver cells (PHH). .

구체적으로, 간 오가노이드와 PHH의 배지에서 전구 약물의 양을 측정하기 위해 CYP2D6 및 CYP2C19의 경우 아미트립틸린(amitriptyline), CYP2D6의 경우 클로르프로마진(chlorpromazine), CYP2C9 및 UGT2B7의 경우 디클로페낙(diclofenac)을 포함한 화합물을 사용했다. 화합물은 5% CO2에서 37℃에서 24시간 동안 1μM의 농도로 처리되었다. 이들은 각각의 24 웰 배양 플레이트에서 웰 당 0.7㎖의 최종 부피로 배양되었다. 60㎕의 배지를 각각 1.5, 3, 6, 12 및 24시간에 회수하고, 100nM CBZ 및 300nM 4-MUF를 포함하는 빙냉 ACN 60㎕를 첨가하여 반응을 급랭시켰다. 샘플을 4℃에서 10분 동안 16,000g에서 원심 분리하고 상청액을 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법 (LC-MS / MS)에 적용했다. 화합물만(유기농 또는 무 세포)의 값을 대조군으로 사용했다. 데이터는 단백질 농도로 정규화되었다.Specifically, to measure the amount of prodrugs in the media of liver organoids and PHHs, amitriptyline for CYP2D6 and CYP2C19, chlorpromazine for CYP2D6, and diclofenac for CYP2C9 and UGT2B7. Compounds containing were used. Compounds were treated at a concentration of 1 μM for 24 hours at 37°C in 5% CO 2 . They were cultured in a final volume of 0.7 ml per well in each 24 well culture plate. 60 μl of medium was withdrawn at 1.5, 3, 6, 12, and 24 h, respectively, and the reaction was quenched by adding 60 μl of ice-cold ACN containing 100 nM CBZ and 300 nM 4-MUF. Samples were centrifuged at 16,000 g for 10 min at 4°C and the supernatant was subjected to liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Values for compound alone (organic or cell-free) were used as controls. Data were normalized to protein concentration.

그 결과, 도 36에 나타난 바와 같이, CYP450 매개 약물 대사 능력은 D-HO FC 및 S-HO FC에서 아미트립틸린(CYP2D6 및 CYP2C19), 클로르프로마진(CYP2D6) 및 디클로페낙(CYP2C9 및 UGT2B7)을 포함한 약물의 소실을 사용하여 결정되었고, 간 오가노이드에서 PHH와 유사한 간 오가노이드에서 약물 대사 기능을 나타내었다.As a result, as shown in Figure 36, the CYP450-mediated drug metabolism ability was increased in D-HO FC and S-HO FC, including amitriptyline (CYP2D6 and CYP2C19), chlorpromazine (CYP2D6), and diclofenac (CYP2C9 and UGT2B7). The disappearance of the drug was determined using and indicated a drug metabolic function in liver organoids similar to PHH in liver organoids.

<8-3> 간 <8-3> Liver 오가노이드의of organoids 아세트아미노펜Acetaminophen (Acetaminophen) 대사 능력 평가(Acetaminophen) Metabolic Ability Assessment

안전하고 효과적인 진통제 및 해열제인 아세트아미노펜(Acetaminophen, APAP)은 해독(glucuronidation 및 sulfation과 같은 접합)과 bioactivation (CYP450 매개 산화)과 같은 두 가지 경로를 통해 광범위한 간 대사를 겪는 것으로 알려져 있다(Hodgman and Garrard, 2012). D-HO, S-HO, PHH, HepG2 및 2D HLC에서 비 세포 독성 농도하에서 아세트아미노펜 대사를 테스트했다. UGT(UDP-글루쿠로 노실 트랜스퍼라제) 및 SULT(설포트랜스퍼라제)에 의한 접합체 반응은 APAP 대사를 위한 주요 대사 경로이다(도 37).Acetaminophen (APAP), a safe and effective analgesic and antipyretic, is known to undergo extensive hepatic metabolism through two pathways: detoxification (conjugation such as glucuronidation and sulfation) and bioactivation (CYP450-mediated oxidation) (Hodgman and Garrard , 2012). Acetaminophen metabolism was tested under non-cytotoxic concentrations in D-HO, S-HO, PHH, HepG2 and 2D HLC. Conjugate reactions by UGT (UDP-glucuronosyltransferase) and SULT (sulfotransferase) are the main metabolic pathways for APAP metabolism (Figure 37).

구체적으로, APAP의 대사 산물을 측정하기 위해 5% CO2에서 37℃에서 24시간 동안 10mM APAP로 처리된 PHH, D-HO, S-HO, HepG2 및 2D HLC에서 반응을 수행했다. APAP는 각 24 웰 배양 플레이트에서 최종 부피가 웰당 0.7㎖가 되도록 처리되었다. 70㎕의 배지를 각각 3, 6, 12 및 24시간에 회수하고 내부 표준 물질로 100 nM BR-A-563을 포함하는 얼음처럼 차가운 ACN 70㎕를 첨가하여 반응을 켄칭했다. 샘플을 4℃에서 10분 동안 16,000g에서 원심 분리하고 상청액을 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법 (LC-MS/MS)에 적용했다. 데이터는 단백질 농도로 정규화되었다.Specifically, to measure the metabolites of APAP, reactions were performed on PHH, D-HO, S-HO, HepG2, and 2D HLC treated with 10mM APAP for 24 h at 37°C in 5% CO 2 . APAP was processed to a final volume of 0.7 ml per well in each 24-well culture plate. 70 μl of medium was withdrawn at 3, 6, 12, and 24 h, respectively, and the reaction was quenched by adding 70 μl of ice-cold ACN containing 100 nM BR-A-563 as an internal standard. Samples were centrifuged at 16,000 g for 10 min at 4°C and the supernatant was subjected to liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Data were normalized to protein concentration.

그 결과, 도 38에 나타난 바와 같이, APAP-글루쿠로나이드(APAP-Glu)는 HepG2 및 2D HLC보다 D-HO, S-HO 및 PHH에서 더 많은 양으로 생성되었다. 또한, 도 39에 나타난 바와 같이, APAP-GSH의 경우, 대사 산물의 양은 D-HO, S-HO 및 PHH에서 12시간 후에 감소하는 경향이 있는 반면 HepG2 및 2D HLC에서는 대사 산물이 검출되지 않았다. 상기 결과는 간 오가노이드가 아세트아미노펜의 대사 능력이 있음을 제시한다.As a result, as shown in Figure 38, APAP-glucuronide (APAP-Glu) was produced in greater amounts in D-HO, S-HO, and PHH than in HepG2 and 2D HLC. Additionally, as shown in Figure 39, for APAP-GSH, the amount of metabolites tended to decrease after 12 hours in D-HO, S-HO and PHH, while no metabolites were detected in HepG2 and 2D HLC. These results suggest that liver organoids are capable of metabolizing acetaminophen.

<8-4> 간 <8-4> Liver 오가노이드의of organoids 피마사르탄Fimasartan (( fimasartanfimasartan ) 대사 능력 평가) Metabolic capacity assessment

안지오텐신 II 수용체 차단제인 피마사르탄(FMS)은 고혈압 치료에 사용되며 CYP2C9, CYP3A4 및 CYP3A5에 의해 대사되는 것으로 알려져 있다. 세포 독성을 나타내지 않는 농도에서 D-HO, S-HO, PHH, HepG2 및 2D HLC를 사용하여 FMS 대사를 테스트했다. CYP3A4/5에 의해 BR-A-557로, CYP3A4에 의해 BR-A-535로 추가 대사되어 CYP2C9, CYP3A4 및 CYP3A5는 FMS S-옥사이드의 형성에 관여한다(도 40).Pimasartan (FMS), an angiotensin II receptor blocker, is used to treat hypertension and is known to be metabolized by CYP2C9, CYP3A4, and CYP3A5. FMS metabolism was tested using D-HO, S-HO, PHH, HepG2 and 2D HLC at non-cytotoxic concentrations. It is further metabolized by CYP3A4/5 to BR-A-557 and by CYP3A4 to BR-A-535, and CYP2C9, CYP3A4, and CYP3A5 are involved in the formation of FMS S-oxide (Figure 40).

구체적으로, 피마사르탄(FMS)의 대사 산물을 측정하기 위해 5% CO2에서 37℃에서 24시간 동안 50μM FMS로 처리된 PHH, D-HO, S-HO, HepG2 및 2D HLC에서 반응을 수행했다. FMS는 각 24 웰 배양 플레이트에서 최종 부피가 웰 당 0.7㎖가 되도록 처리되었다. 70㎕의 배지를 각각 3, 6, 12 및 24시간에 회수하고 내부 표준 물질로 100 nM BR-A-563을 포함하는 얼음처럼 차가운 ACN 70㎕를 첨가하여 반응을 켄칭했다. 샘플을 4℃에서 10분 동안 16,000g에서 원심 분리하고 상청액을 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(LC-MS / MS)에 적용했다. 데이터는 단백질 농도로 정규화되었다.Specifically, to measure the metabolites of fimasartan (FMS), reactions were performed on PHH, D-HO, S-HO, HepG2, and 2D HLC treated with 50 μM FMS for 24 h at 37°C in 5% CO 2 did. FMS was processed to a final volume of 0.7 ml per well in each 24-well culture plate. 70 μl of medium was withdrawn at 3, 6, 12, and 24 h, respectively, and the reaction was quenched by adding 70 μl of ice-cold ACN containing 100 nM BR-A-563 as an internal standard. Samples were centrifuged at 16,000 g for 10 min at 4°C and the supernatant was subjected to liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Data were normalized to protein concentration.

그 결과, 도 41에 나타난 바와 같이, FMS의 순차 대사 산물 생산은 PHH 및 hHO와 2D HLC에서 나타났으나, CYP3A4에 의한 FMS의 3단계 대사인 BR-A-535의 생산은 HepG2에서 관찰되지 않았다. 또한, 도 42에 나타난 바와 같이, CYP2C9는 FMS의 n-부틸 하이드록실화에 독점적인 역할을 했다. D-HO 및 S-HO가 HepG2 및 2D HLC보다 1-OH, 2- 또는 3-OH 및 4-OH 부틸 FMS를 포함한 더 많은 대사 산물을 생성한다는 것을 확인하였다.As a result, as shown in Figure 41, production of sequential metabolites of FMS was observed in PHH, hHO, and 2D HLC, but production of BR-A-535, the third step metabolism of FMS by CYP3A4, was not observed in HepG2. . Additionally, as shown in Figure 42, CYP2C9 played an exclusive role in n-butyl hydroxylation of FMS. It was confirmed that D-HO and S-HO produced more metabolites including 1-OH, 2- or 3-OH and 4-OH butyl FMS than HepG2 and 2D HLC.

상기 결과는 간 오가노이드가 CYP450 매개 약물 대사를 연구하고 테스트하기 위한 시험관 내 모델로 기능할 수 있음을 제시한다.The above results suggest that liver organoids can serve as an in vitro model to study and test CYP450-mediated drug metabolism.

<< 실험예Experiment example 9> 간 9> Liver 오가노이드의of organoids 심장 독성 평가 Cardiac toxicity assessment

간 오가노이드가 약물 대사 산물에 의해 유도된 심장 독성 평가에 사용될 수 있는지 여부를 간 오가노이드에 사이클로포스파마이드 및 테르비나핀을 처리하여 확인하였다.Whether liver organoids can be used to evaluate cardiotoxicity induced by drug metabolites was determined by treating liver organoids with cyclophosphamide and terbinafine.

<9-1> 사이클로포스파마이드(<9-1> Cyclophosphamide ( cyclophosphamidecyclophosphamide , CP)의 심장 독성 평가, CP) Cardiotoxicity evaluation

사이클로포스파마이드(CP)는 항암 화학 요법 약물에 사용되는 알킬화제이며 심장 독성을 유발하는 것으로 알려져 있다. CP는 CYP2B6, CYP2C9/C19 및 CYP3A4/ A5를 포함하는 약물 대사 효소인 간 CYP450에 의해 활성화되어 4-하이드록시-CP를 형성하고 토토머인 AldoCP와 공존한다. 심장에서 AldoCP는 아크롤레인(acrolein)과 포스포마이드 머스타드(phsophormide mustard, PM)로 분해된다(도 43). 아크롤레인은 심근, 심근 세포 및 내피세포에 독성을 유발하는 독성 대사 산물이다. 따라서, FC 처리 S(-)-HO를 포함하거나 포함지 않는 조건에서 공동 배양된 hiPSC 유래 심근 세포 (hiPSC-CMs)에서 CP의 전기 생리학적 효과를 테스트했다.Cyclophosphamide (CP) is an alkylating agent used in anticancer chemotherapy drugs and is known to cause cardiotoxicity. CP is activated by hepatic CYP450, a drug-metabolizing enzyme that includes CYP2B6, CYP2C9/C19, and CYP3A4/A5, to form 4-hydroxy-CP and coexists with the tautomer AldoCP. In the heart, AldoCP is broken down into acrolein and phsophormide mustard (PM) (Figure 43). Acrolein is a toxic metabolite that causes toxicity to the myocardium, cardiomyocytes, and endothelial cells. Therefore, we tested the electrophysiological effects of CP in co-cultured hiPSC-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) under conditions with or without FC-treated S(-)-HO.

구체적으로, hiPSC-CM 인 Cardiosight®-S (NEXEL Co., South Korea)의 전기적 활동은 37℃로 설정된 MEA 시스템 (Axion BioSystems, Maestro, US)을 사용하여 측정되었으며 5% CO2, 20% O2, 및 75% N2로 관류되었다. hiPSC-CM은 먼저 웰당 4× 104 세포의 밀도로 12-웰 MEA 플레이트에 씨딩되었고, 2일마다 수행되는 절반-중간 변화로 안정화되도록 NEXEL Co.에서 제공하는 심근 세포 배양 배지에서 7일 동안 유지되었다. 일주일 후, 배양 배지를 간 오가노이드 분화 배지(DM)으로 교체했다. 그런 다음 Transwell 삽입물 (Corning)을 각 웰에 배치하고 FC 처리된 S(-)-HO를 삽입물에 씨딩하고, 3일 동안 배양하였다. 화합물 적용 당일, 배양 배지를 웰 및 삽입물에서 완전히 제거하고 웰 당 정확한 부피(총 2㎖/웰)를 보장하기 위해 새로운 배지를 추가했다. 세포는 4시간 동안 평형을 이루도록 허용되었고, 온라인 매개 변수는> 40분 동안 안정적인 기준선을 보장하기 위해 모니터링 되었다. 세포는 웰 당 단일 용량으로 사이클로포스파마이드 약물에 노출되었다. 약물 또는 대조군(0.1% DMSO)를 적용한 후, 72시간 동안 30초 동안 5분 마다 필드 전위를 측정했다. 필드 전위 신호는 Axion BioSystems의 통합 스튜디오(AxIS) 소프트웨어로 기록 및 분석되어 박동 주파수(beating frequency)와 필드 전위 지속 시간을 측정했다. 일반적으로 Fredericia의 속도 보정 알고리즘(FPDcF)은 속도 의존 효과를 보정하는 데 사용된다. 여기서 FPDcF = FPD / Beat Period0.33이다. 데이터는 전처리 된 대조군 값으로 정규화되었다.Specifically, the electrical activity of Cardiosight®-S (NEXEL Co., South Korea), a hiPSC-CM, was measured using an MEA system (Axion BioSystems, Maestro, US) set at 37°C, 5% CO 2 , 20% O 2 , and perfused with 75% N 2 . hiPSC-CMs were first seeded in 12-well MEA plates at a density of 4 × 10 cells per well and maintained for 7 days in cardiomyocyte culture medium provided by NEXEL Co. to stabilize with half-to-medium changes performed every 2 days. It has been done. After one week, the culture medium was replaced with liver organoid differentiation medium (DM). Then, a Transwell insert (Corning) was placed in each well, FC-treated S(-)-HO was seeded into the insert, and cultured for 3 days. On the day of compound application, culture medium was completely removed from the wells and inserts and fresh medium was added to ensure the correct volume per well (2 mL/well total). Cells were allowed to equilibrate for 4 h, and online parameters were monitored to ensure a stable baseline for >40 min. Cells were exposed to cyclophosphamide drug at a single dose per well. After application of drug or control (0.1% DMSO), field potentials were measured every 5 minutes for 30 seconds for 72 hours. Field potential signals were recorded and analyzed with Axion BioSystems' Integrated Studio (AxIS) software to measure beating frequency and field potential duration. Typically, Fredericia's velocity correction algorithm (FPDcF) is used to correct for velocity-dependent effects. Here, FPDcF = FPD / Beat Period0.33. Data were normalized to pretreated control values.

그 결과, 도 44에 나타난 바와 같이, 24시간 및 72시간 동안 250 및 500μM의 농도로 CP를 처리한 후, 간 오가노이드가 있는 hiPCS-CM의 박동률이 hiPSC-CM 단독에 비해 현저히 감소하여 CP의 심장 독성을 유발했다.As a result, as shown in Figure 44, after treatment with CP at concentrations of 250 and 500 μM for 24 hours and 72 hours, the beating rate of hiPCS-CMs with liver organoids was significantly reduced compared to hiPSC-CMs alone, resulting in CP's It caused cardiac toxicity.

또한, 도 45에 나타난 바와 같이, Fridericia의 공식 (FPDcF)을 사용하여 비트 주파수에 의해 보정된 필드 전위 지속 시간은 간 오가노이드가 있는 hiPSC-CM에서 250μM의 CP를 처리한 경우 24시간 및 72시간 후에 증가하여 심장 독성을 나타내었다.Additionally, as shown in Figure 45, the field potential duration corrected by beat frequency using Fridericia's formula (FPDcF) was 24 and 72 hours for hiPSC-CMs with liver organoids treated with 250 μM of CP. It later increased and showed cardiotoxicity.

<9-2> <9-2> 테르비나핀(terbinafine)의of terbinafine 심장 독성 평가 Cardiac toxicity assessment

테르비나핀(Terfenadine, TER)은 생명을 위협하는 심실 부정맥을 유발할 수 있다. 테르비나핀은 간에서 CYP3A4에 의해 대사되며, 주요 활성 대사 산물은 테르비나핀에 비해 독성 효과가 낮은 것으로 알려진 펙소페나딘(FEX)이다(도 46).Terfenadine ( TER) can cause life-threatening ventricular arrhythmias. Terbinafine is metabolized by CYP3A4 in the liver, and the main active metabolite is fexofenadine (FEX), which is known to have lower toxic effects compared to terbinafine (Figure 46).

사이클로포스포마이드 대신 테르비나핀을 처리한 것을 제외하고 상기 실험예 9-1와 동일한 방법 및 조건으로 간 오가노이드에서 테르비나핀의 심장 독성을 측정하였다.The cardiac toxicity of terbinafine was measured in liver organoids using the same method and conditions as in Experimental Example 9-1, except that terbinafine was treated instead of cyclophosphomide.

그 결과, 도 47에 나타난 바와 같이, 간 오가노이드와 함께 배양하지 않은 hiPSC-CM에서 테르비나핀 첨가 30분 이내에 자발적인 박동의 중단을 유도함을 확인하였다. 또한, 도 48에 나타난 바와 같이, 간 오가노이드와 함께 배양된 hiPSC-CM은 1 및 10 μM TER의 처리에 의해 박동 빈도의 증가를 유도했으며, FPDcF가 변화하지 않았음을 확인하였다. 상기 결과는 hiPSC-CM에서 박동률 및 필드 잠재력과 관련된 테르비나핀의 심장 독성이 간 오가노이드를 통한 대사(독성이 없는 펙소페나딘)에 의해 완화되었음을 나타낸다. As a result, as shown in Figure 47, it was confirmed that the addition of terbinafine induced cessation of spontaneous beating within 30 minutes in hiPSC-CMs not cultured with liver organoids. Additionally, as shown in Figure 48, hiPSC-CM cultured with liver organoids induced an increase in beating frequency by treatment with 1 and 10 μM TER, and it was confirmed that FPDcF did not change. The results indicate that the cardiotoxicity of terbinafine in relation to beating rate and field potential in hiPSC-CMs was alleviated by metabolism (non-toxic fexofenadine) via liver organoids.

상기 결과를 종합하면, 본 발명의 간 오가노이드는 간 CYP450 매개 약물 대사에 의해 유도된 표적 장기 독성을 연구하고 테스트하기 위한 시험관 내 모델 역할을 수행할 수 있음을 제시한다.Taken together, the above results suggest that the liver organoids of the present invention can serve as an in vitro model for studying and testing target organ toxicity induced by hepatic CYP450-mediated drug metabolism.

<< 실험예Experiment example 10> 윌슨 병 모델의 제조 10> Fabrication of the Wilson disease model

<10-1> <10-1> 윌슨병Wilson's disease 간 liver 오가노이드organoid 모델의 제조 Manufacturing of models

윌슨 병(Wilson's disease, WD)은 유전적 간 질환이며, 환자는 간에서 구리의 배출 및 이용 능력이 부족하여 결과적으로 간 및 신경의 비정상적인 표현형을 가진다(Ala et al., 2007; Prohaska, 1986; Wu et al. , 2015). Wilson's disease (WD) is a genetic liver disease in which patients have deficient hepatic excretion and utilization of copper, resulting in abnormal hepatic and neurological phenotypes (Ala et al., 2007; Prohaska, 1986; Wu et al., 2015).

윌슨병 모델을 제조하기 위하여 인간 유도 만능 줄기세포(iPSC) 대신, ATP7B 유전자를 코딩하는 단백질에 윌슨병 유발 돌연변이(ATP7B 단백질의 778번째 아미노산인 아르기닌(Arg, R)이 류신(leucine, L)로 치환된 R778L)가 있는 인간 배아 줄기 세포(hESC)와 대조군으로 인간 배아 줄기 세포주(BG01 cell line)를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1의 방법 및 조건으로 간 내배엽 오가노이드를 제조한 후 상기 실시예 2의 방법 및 조건으로 간 오가노이드로 분화시켰다.To produce a Wilson disease model, instead of using human induced pluripotent stem cells (iPSCs), a Wilson disease-causing mutation (arginine (Arg, R), the 778th amino acid of the ATP7B protein, is changed to leucine (L)) is used in the protein encoding the ATP7B gene. Liver endoderm organoids were prepared using the method and conditions of Example 1, except that human embryonic stem cells (hESC) with a substituted R778L) and a human embryonic stem cell line (BG01 cell line) were used as a control, followed by the above procedure. It was differentiated into liver organoids using the method and conditions of Example 2.

<10-2> 윌슨 병 모델에서 간 <10-2> Liver in Wilson's disease model 마커marker 및 구리 수송 관련 유전자의 발현 확인 and confirmed expression of copper transport-related genes.

상기 실험예 10-1에서 제조한 윌슨 병 모델 및 대조군 간 오가노이드에서 간 마커 및 구리 수송 관련 유전자의 발현 수준을 상기 실험예 1에 개시된 RT-qPCR과 동일한 방법 및 조건으로 확인하였다.The expression levels of liver markers and copper transport-related genes in the Wilson's disease model and control liver organoids prepared in Experimental Example 10-1 were confirmed using the same method and conditions as RT-qPCR disclosed in Experimental Example 1.

그 결과, 도 49에 나타난 바와 같이, 간 마커인 AAT 및 HNF4A가 발현되는 것을 확인하였으며, 도 50에 나타난 바와 같이, 대조군 및 윌슨병 간 오가노이드는 mRNA 수준 및 단백질 수준에서 간 마커(ALB, AAT, ASGR1, CYP2C9, CYP2C19, CYP3A4)를 표현했다. 도 51에 나타난 바와 같이, 간 오가노이드에서 윌슨병 표현형을 관찰하기 전에 구리 수송에 관련된 유전자인 CTR1 및 구리 배출에 관련된 유전자인 ATP7B가 대조군 간 오가노이드 및 윌슨병 유발 간 오가노이드에서 고도로 발현되고 있음을 확인했다. 윌슨병 유발 간 오가노이드에서는 ATP7B가 고도로 발현되지만 돌연변이로 인해 역할을 제대로 수행하지 못한다.As a result, as shown in Figure 49, it was confirmed that the liver markers AAT and HNF4A were expressed, and as shown in Figure 50, the control and Wilson's disease liver organoids expressed liver markers (ALB, AAT) at the mRNA level and protein level. , ASGR1, CYP2C9, CYP2C19, CYP3A4). As shown in Figure 51, before observing the Wilson disease phenotype in liver organoids, CTR1, a gene involved in copper transport, and ATP7B, a gene involved in copper excretion, were highly expressed in control liver organoids and Wilson disease-induced liver organoids. confirmed. ATP7B is highly expressed in Wilson's disease-induced liver organoids, but does not perform its role properly due to mutations.

<10-3> 윌슨 병 모델에서 <10-3> In the Wilson disease model 염화 구리(CuClCopper chloride (CuCl 22 )의)of 처리 process

윌슨 병 간 오가노이드 모델이 구리 배출에 결함이 있는지 확인하기 위해 하기의 실험을 수행하였다.The following experiment was performed to determine whether the Wilson disease liver organoid model was defective in copper excretion.

구체적으로, 윌슨병에 대한 구리 및 약물 처리로 세포 생존력을 측정하기 위해 화학 물질을 각 실험에서 지정된 농도로 48시간 동안 처리했다. 100㎕의 배양 배지에 대해 10㎕의 세포 계수 키트-8(CCK-8; Dojindo, Kumamoto, Japan)을 오가노이드에 첨가하고 2 내지 4시간 동안 배양하였다. 흡광도는 iMark ™ 마이크로 플레이트 리더 (Bio-Rad)를 사용하여 450nm에서 측정하고 Bradford 분석으로 측정한 단백질 함량으로 정규화했다. 세포 생존력은 하기 수학식 1을 사용하여 계산하였다.Specifically, to measure cell viability with copper and drug treatments for Wilson's disease, chemicals were treated for 48 hours at the concentrations specified in each experiment. For 100 μl of culture medium, 10 μl of Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Dojindo, Kumamoto, Japan) was added to the organoids and cultured for 2 to 4 hours. Absorbance was measured at 450 nm using an iMark™ microplate reader (Bio-Rad) and normalized to protein content determined by Bradford assay. Cell viability was calculated using Equation 1 below.

<수학식 1><Equation 1>

생존율(%)=(A시료-A블랭크)/(A대조군-A블랭크)×100Survival rate (%)=(A sample -A blank )/(A control group -A blank )×100

그 결과, 도 52에 나타난 바와 같이, 고농도 CuCl2의 처리는 대조군보다 윌슨병 모델 간 오가노이드에서 세포 내 구리의 더 높은 축적 수준을 가져 왔으며, 이는 윌슨 병 간 오가노이드가 구리를 배출하는데에 결함이 있음을 나타낸다. 또한, 도 53에 나타난 바와 같이, 윌슨 병 간 오가노이드의 세포 생존력은 대조군 간 오가노이드와 비교하여 CuCl2 처리에 의해 용량 의존적으로 감소했다. As a result, as shown in Figure 52, treatment with high concentration CuCl 2 resulted in a higher accumulation level of intracellular copper in Wilson's disease model liver organoids than in the control group, which suggests that Wilson's disease liver organoids are defective in excreting copper. It indicates that there is. Additionally, as shown in Figure 53, the cell viability of Wilson's disease liver organoids was decreased in a dose-dependent manner by CuCl 2 treatment compared to control liver organoids.

<10-4> <10-4> 윌슨병Wilson's disease 간 liver 오가노이드organoid 모델에 on the model 윌슨병Wilson's disease 치료 약물의 처리 Disposal of therapeutic drugs

대조군과 윌슨병 간 오가노이드 간의 세포 내 구리 및 세포 생존력의 차이를 감안할 때 구리 농도를 50μM로 고정하고 4가지 윌슨병 임상 약물(D-penicillamine, Bathocuproinedisulfonic acid, Trientine, DL-alpha-Tocopherol acetate)을 처리하여 변화를 관찰하였다(Cells. 2020 Apr; 9(4): 872.).Considering the differences in intracellular copper and cell viability between control and Wilson's disease organoids, the copper concentration was fixed at 50 μM and four Wilson's disease clinical drugs (D-penicillamine, Bathocuproinedisulfonic acid, Trientine, and DL-alpha-Tocopherol acetate) were administered. Changes were observed after processing (Cells. 2020 Apr; 9(4): 872.).

구체적으로, 윌슨병에 대한 구리 및 약물 처리로 세포 생존력을 측정하기 위해 화학 물질을 각 실험에서 지정된 농도로 48시간 동안 처리했다. 100㎕의 배양 배지에 대해 10㎕의 세포 계수 키트-8(CCK-8; Dojindo, Kumamoto, Japan)을 오가노이드에 첨가하고 2 내지 4시간 동안 배양하였다. 흡광도는 iMark ™ 마이크로 플레이트 리더 (Bio-Rad)를 사용하여 450nm에서 측정하고 Bradford 분석으로 측정한 단백질 함량으로 정규화했다. 세포 생존력은 하기 수학식 1을 사용하여 계산하였다.Specifically, to measure cell viability with copper and drug treatments for Wilson's disease, chemicals were treated for 48 hours at the concentrations specified in each experiment. For 100 μl of culture medium, 10 μl of Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Dojindo, Kumamoto, Japan) was added to the organoids and cultured for 2 to 4 hours. Absorbance was measured at 450 nm using an iMark™ microplate reader (Bio-Rad) and normalized to protein content determined by Bradford assay. Cell viability was calculated using Equation 1 below.

<수학식 1><Equation 1>

생존율(%)=(A시료-A블랭크)/(A대조군-A블랭크)×100Survival rate (%)=(A sample -A blank )/(A control group -A blank )×100

그 결과, 도 54에 나타난 바와 같이, 구리 및 치료 약물 처리로 인한 대조군 및 윌슨병 간 오가노이드 모델에서 세포 생존능을 측정한 결과, 윌슨 병 환자에게 가장 많이 처방되는 약물인 D-Penicillamine은 10μM 처리된 경우 세포 생존능이 증가했으며, 윌슨병 간 오가노이드 모델에서 더 높은 용량에서 유사한 세포 생존능 증가 효과를 나타냈다. Bathocuproinedisulfonic acid, Trientine hydrochloride 및 DL-α-Tocopherol acetate (Vitamin E)와 같은 다른 약물도 용량 의존 방식으로 윌슨병 간 오가노이드에서 세포 생존능 증가 효과를 나타냈다.As a result, as shown in Figure 54, cell viability was measured in the control group and Wilson's disease liver organoid model due to treatment with copper and therapeutic drugs. As a result, D-Penicillamine, the most commonly prescribed drug for Wilson's disease patients, was treated at 10 μM. cell viability increased, and a similar increase in cell viability was observed at higher doses in the Wilson disease liver organoid model. Other drugs such as bathocuproinedisulfonic acid, Trientine hydrochloride, and DL-α-Tocopherol acetate (Vitamin E) also showed an effect of increasing cell viability in Wilson's disease liver organoids in a dose-dependent manner.

본 발명의 윌슨병 간 오가노이드 모델이 구리의 처리로 세포 생존능이 감소하며, 알려진 윌슨병 치료 약물의 처리로 세포 생존능이 증가하므로, 이는 본 발명의 윌슨병 간 오가노이드 모델이 윌슨병 치료약물의 스크리닝과 발병 기전 탐색에 적합한 세포 모델이라는 점을 제시한다.The cell viability of the Wilson's disease liver organoid model of the present invention is reduced by treatment with copper, and the cell viability is increased by treatment of known Wilson's disease treatment drugs, which means that the Wilson's disease liver organoid model of the present invention is a treatment drug for Wilson's disease. We suggest that it is a cell model suitable for screening and exploration of pathogenesis.

<10-5> <10-5> 윌슨병Wilson's disease 간 liver 오가노이드organoid 모델에서 in model 세룰로플라스민Ceruloplasmin 발현 수준 측정 Expression level measurement

임상 진단에서 혈장 내 세룰로플라스민(ceruloplasmin, CP) 감소 (세룰로플라스민 유전자에 의해 코딩되는 단백질)는 윌슨병의 특징이다. 인간 전분화능 줄기세포로부터 분화된 간세포 유사 세포(Hepatic-like cell, HLC)를 사용하는 기존의 윌슨병 모델은 세룰로플라스민을 발현하지 않았기 때문에 세룰로플라스민과 관련된 표현형을 모델링 할 수 없다는 한계가 있다(관련 참고문헌 기재 요청). 따라서, 본 발명의 윌슨병 간 오가노이드 모델에서 세룰로플라스민 mRNA 및 단백질 발현 수준을 하기와 같이 측정하였다.In clinical diagnosis, a decrease in plasma ceruloplasmin (CP) (a protein encoded by the ceruloplasmin gene) is a characteristic of Wilson disease. The existing Wilson disease model using hepatic-like cells (HLC) differentiated from human pluripotent stem cells does not express ceruloplasmin, so it cannot model ceruloplasmin-related phenotypes. There is (request for related references to be included). Therefore, ceruloplasmin mRNA and protein expression levels were measured in the Wilson disease liver organoid model of the present invention as follows.

구체적으로, 세룰로플라스민 mRNA 발현 수준은 상기 실험예 1의 RT-qPCR과 동일한 방법 및 조건으로 측정하였다. 또한, 분비된 세룰로플라스민(ceruloplasmin, CP)은 인간 세룰로플라스민 ELISA 키트(Novus Biologicals)를 사용하여 측정하였다. 간 오가노이드 분화 배지(DM)에서 3일 동안 간 오가노이드를 배양한 다음 간 오가노이드 및 배양 배지를 별도로 수확했다. 배양액을 3000×g에서 10분간 4℃에서 원심 분리하여 이물질을 제거하고 상층액을 수득하였다. 마이크로 플레이트 스트립에 상층액을 추가하고 2시간 동안 배양했다. 비오틴화 된 인간 세룰로플라스민 항체, 세룰로플라스민 접합체 및 발색체 기질과의 반응은 각각 1시간, 30분 및 25분 동안 순차적으로 수행되었다. 웰은 각 단계 사이에 세척 완충액으로 5회 세척되었고, 정지 용액을 첨가하고 iMark ™ 마이크로 플레이트 리더 (Bio-Rad)를 사용하여 450nm의 파장에서 흡광도를 측정했다. 모든 측정은 Bradford 분석에 의해 측정된 단백질 함량에 의해 정규화되었다.Specifically, the level of ceruloplasmin mRNA expression was measured using the same method and conditions as RT-qPCR in Experimental Example 1 above. Additionally, secreted ceruloplasmin (CP) was measured using a human ceruloplasmin ELISA kit (Novus Biologicals). Liver organoids were cultured in liver organoid differentiation medium (DM) for 3 days, and then liver organoids and culture medium were harvested separately. The culture was centrifuged at 3000 × g for 10 minutes at 4°C to remove foreign substances and obtain the supernatant. The supernatant was added to the microplate strip and incubated for 2 hours. Reactions with biotinylated human ceruloplasmin antibody, ceruloplasmin conjugate, and chromogenic substrate were performed sequentially for 1 hour, 30 minutes, and 25 minutes, respectively. Wells were washed five times with wash buffer between each step, stop solution was added and absorbance was measured at a wavelength of 450 nm using an iMark™ microplate reader (Bio-Rad). All measurements were normalized by protein content determined by Bradford assay.

그 결과, 도 55에 나타난 바와 같이, 세룰로플라스민 mRNA 발현이 윌슨병 간 오가노이드 모델에서 유의하게 감소함을 확인하였다. 또한, 도 56에 나타난 바와 같이, 윌슨병 간 오가노이드 모델에서 혈장 내 세룰로플라스민의 분비가 현저하게 감소함을 확인하였다. As a result, as shown in Figure 55, it was confirmed that ceruloplasmin mRNA expression was significantly decreased in the Wilson disease liver organoid model. Additionally, as shown in Figure 56, it was confirmed that the secretion of ceruloplasmin in plasma was significantly reduced in the Wilson disease liver organoid model.

상기 결과는 약물 반응 및 임상 바이오 마커와 관련하여간 오가노이드를 이용하여 윌슨병을 성공적으로 모델링할 수 있음을 보여주는 것이며, 본 발명의 간 오가노이드는 윌슨병 뿐만 아니라, 기타 다양한 간 질환의 모델로 활용될 수 있는 가능성이 있음을 제시한다.The above results show that Wilson's disease can be successfully modeled using liver organoids in relation to drug response and clinical biomarkers, and the liver organoid of the present invention can be used as a model for not only Wilson's disease but also various other liver diseases. It suggests that there is a possibility that this could happen.

<110> Korea Research Institute of Chemical Technology <120> Method for preparing wilson's disease model based on liver organoid and use thereof <130> 2020P-10-032 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA-1 <400> 1 agtgttccag ccaccggccc 20 <210> 2 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA-2 <400> 2 cattgccctg ggccggtggc 20 <210> 3 <211> 151 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssODNs <400> 3 ggagccctgt gacattcttc gacacgcccc ccatgctctt tgtgttcatt gccctgggcc 60 tgtggctgga acacttggca aaggtaacag cagcttcagg ttcagaaaag agctgctcct 120 tcagtaaaca aatctcactt cctctgaaca c 151 <110> Korea Research Institute of Chemical Technology <120> Method for preparing Wilson's disease model based on liver organoid and use thereof <130> 2020P-10-032 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223>sgRNA-1 <400> 1 agtgttccag ccaccggccc 20 <210> 2 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223>sgRNA-2 <400> 2 cattgccctg ggccggtggc 20 <210> 3 <211> 151 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssODNs <400> 3 ggagccctgt gacattcttc gacacgcccc ccatgctctt tgtgttcatt gccctgggcc 60 tgtggctgga acacttggca aaggtaacag cagcttcagg ttcagaaaag agctgctcct 120 tcagtaaaca aatctcactt cctctgaaca c 151

Claims (20)

1) 인간 전분화능 줄기세포(human pluripotent stem cell, hPSC)의 ATP7B(ATPase Copper Transporting Beta)에 돌연변이를 일으키는 단계;
2) 상기 단계 1)의 ATP7B 돌연변이 인간 전분화능 줄기세포(human pluripotent stem cell, hPSC)를 완전 내배엽 세포(definitive endoderm, DE)로 분화시키는 단계;
3) 상기 단계 2)의 완전 내배엽 세포를 간 내배엽 세포(hepatic endoderm, HE)로 분화시키는 단계;
4) 상기 단계 3)의 간 내배엽 세포를 간 내배엽 오가노이드 생산 배지에서 배양하여 간 내배엽 오가노이드로 발생시키는 단계;
5) 상기 단계 4)의 간 내배엽 오가노이드를 확장시키는 단계;
6) 단계 5)에서 확장된 간 내배엽 오가노이드를 계대배양하는 단계;
7) 단계 6)에서 얻은 간 내배엽 오가노이드를 간 오가노이드 분화 배지에서 간 오가노이드(hepatic organoid, hHO)로 분화시키는 단계;를 포함하는 윌슨병 모델의 간 오가노이드 제조방법으로서,
상기 단계 4)의 간 내배엽 오가노이드 생산 배지는 섬유아세포 성장 인자10(fibroblast growth factor, FGF10), 간 세포 성장 인자(hepatocyte growth factor, HGF), 니코틴아마이드(nicotinamide), [Leu15]-Gastrin I human, N-acetyl-L-cysteine, A83-01, Forskolin, CHIR 99021을 포함하는 것이고,
상기 단계 7)의 간 오가노이드 분화 배지는 골형성단백질 (bone morphogenetic protein 7, BMP7), 섬유아세포 성장 인자 19(fibroblast growth factor, FGF19), 간 세포 성장 인자(hepatocyte growth factor, HGF), [Leu15]-Gastrin I human, N-acetyl-L-cysteine, A83-01, DAPT, 덱사메타손(dexamethasone)을 포함하는 것인,
윌슨병 모델의 간 오가노이드 제조방법.
1) A step of causing a mutation in ATP7B (ATPase Copper Transporting Beta) of human pluripotent stem cells (hPSC);
2) Differentiating the ATP7B mutant human pluripotent stem cells (hPSC) of step 1) into definitive endoderm (DE) cells;
3) Differentiating the complete endoderm cells of step 2) into liver endoderm cells (hepatic endoderm, HE);
4) culturing the liver endoderm cells of step 3) in liver endoderm organoid production medium to develop liver endoderm organoids;
5) expanding the liver endoderm organoids of step 4);
6) subculturing the liver endoderm organoids expanded in step 5);
7) Differentiating the liver endoderm organoids obtained in step 6) into liver organoids (hepatic organoids, hHO) in liver organoid differentiation medium. A method of producing liver organoids for a Wilson disease model, comprising:
The liver endoderm organoid production medium in step 4) includes fibroblast growth factor 10 (FGF10), hepatocyte growth factor (HGF), nicotinamide, [Leu15]-Gastrin I human. , N-acetyl-L-cysteine, A83-01, Forskolin, CHIR 99021,
The liver organoid differentiation medium in step 7) contains bone morphogenetic protein 7 (BMP7), fibroblast growth factor 19 (fibroblast growth factor, FGF19), hepatocyte growth factor (HGF), and [Leu15 ]-Gastrin I human, N-acetyl-L-cysteine, A83-01, DAPT, dexamethasone,
Method for producing liver organoids for Wilson disease model.
 제1항에 있어서, 상기 인간 전분화능 줄기세포는 인간 배아줄기세포(human embryonic stem cell, hESC) 또는 인간 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)인, 윌슨병 모델의 간 오가노이드 제조방법.
The method of claim 1, wherein the human pluripotent stem cells are human embryonic stem cells (hESC) or human induced pluripotent stem cells (iPSC). .
 제1항에 있어서, 상기 단계 1)의 돌연변이는 ATP7B 단백질의 778번째 아미노산인 아르기닌(Arg, R)이 류신(leucine, L)로 치환된 R778L인 것인, 윌슨병 모델의 간 오가노이드 제조방법.
The method of claim 1, wherein the mutation in step 1) is R778L in which arginine (Arg, R), the 778th amino acid of the ATP7B protein, is replaced with leucine (L). .
 제1항에 있어서, 단계 4)의 상기 간 내배엽 오가노이드 생산 배지는 Matrigel GFR(growth factor reduced)를 더 포함하는 것인, 윌슨 병 모델의 간 오가노이드 제조방법.
The method of claim 1, wherein the liver endoderm organoid production medium in step 4) further contains Matrigel GFR (growth factor reduced).
 제1항에 있어서, 단계 4)의 상기 간 내배엽 세포는 R spondin-1, Noggin 및 EGF가 포함되지 않은 배지에서 배양되는 것인, 윌슨병 모델의 간 오가노이드 제조방법.
The method of claim 1, wherein the liver endoderm cells in step 4) are cultured in a medium that does not contain R spondin-1, Noggin, and EGF.
 제1항에 있어서, 상기 단계 4)는 10일 내지 18일 동안 수행되는 것인, 윌슨병 모델의 간 오가노이드 제조방법.
The method of claim 1, wherein step 4) is performed for 10 to 18 days.
 제1항에 있어서, 단계 5)의 상기 간 내배엽 오가노이드는 R spondin-1 및 EGF가 포함되지 않은 배지에서 배양되는 것인, 윌슨병 모델의 간 오가노이드 제조방법.
The method of claim 1, wherein the liver endoderm organoids in step 5) are cultured in a medium that does not contain R spondin-1 and EGF.
 제1항에 있어서, 상기 단계 5)는 3일 내지 7일 동안 수행되는 것인, 윌슨 병 모델의 간 오가노이드 제조방법.
The method of claim 1, wherein step 5) is performed for 3 to 7 days.
 삭제delete 제1항에 있어서 단계 7)의 간 오가노이드 분화 배지는 Matrigel GFR(growth factor reduced), 구연산 철 또는 상기 둘 모두를 더 포함하는 것인, 윌슨병 모델의 간 오가노이드 제조방법.
The method of producing liver organoids in a Wilson disease model according to claim 1, wherein the liver organoid differentiation medium in step 7) further contains Matrigel GFR (growth factor reduced), iron citrate, or both.
 제1항에 있어서, 상기 단계 6)의 간 내배엽 오가노이드는 R spondin-1 및 EGF가 포함되지 않은 배지에서 계대배양되는, 윌슨병 모델의 간 오가노이드 제조방법.
The method of claim 1, wherein the liver endoderm organoids in step 6) are subcultured in a medium that does not contain R spondin-1 and EGF.
 제1항에 있어서, 단계 7)의 상기 간 내배엽 오가노이드는 EGF가 포함되지 않은 배지에서 배양되어 간 오가노이드로 분화되는, 윌슨병 모델의 간 오가노이드 제조방법.
The method of claim 1, wherein the liver endoderm organoids in step 7) are differentiated into liver organoids by culturing them in a medium that does not contain EGF.
 제1항에 있어서, 단계 6)의 상기 간 내배엽 오가노이드를 계대 배양하는 단계는 3일 내지 7일 동안 수행되는 것인, 윌슨병 모델의 간 오가노이드 제조방법.
The method of claim 1, wherein the step of subculturing the liver endoderm organoids in step 6) is performed for 3 to 7 days.
 제1항에 있어서, 단계 7)의 상기 간 내배엽 오가노이드를 간 오가노이드로 분화시키는 단계는 10일 내지 20일 동안 수행되는 것인, 윌슨병 모델의 간 오가노이드 제조방법.
The method of claim 1, wherein the step of differentiating the liver endoderm organoids into liver organoids in step 7) is performed for 10 to 20 days.
 삭제delete 제1항 내지 제8항, 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항의 윌슨병 모델의 제조방법에 의해 제조된 간 오가노이드 기반 윌슨병 모델.
A liver organoid-based Wilson disease model prepared by the method for producing the Wilson disease model according to any one of claims 1 to 8 and 10 to 14.
 제16항에 있어서, 상기 윌슨병 모델은 세룰로플라스민(ceruloplasmin, CP)의 발현 감소를 특징으로 하는, 간 오가노이드 기반 윌슨병 모델.
The liver organoid-based Wilson's disease model according to claim 16, wherein the Wilson's disease model is characterized by reduced expression of ceruloplasmin (CP).
 제16항에 있어서, 상기 윌슨병 모델은 세포 내 구리 축적을 특징으로 하는, 간 오가노이드 기반 윌슨병 모델.
17. The liver organoid-based Wilson's disease model according to claim 16, wherein the Wilson's disease model is characterized by intracellular copper accumulation.
 제16항의 윌슨병 모델에 피검 물질을 접촉시키는 단계; 및
상기 피검 물질이 처리된 윌슨 병 모델에서 세룰로플라스민(ceruloplasmin, CP)의 발현 수준 또는 활성 수준, 또는 세포 생존능(cell viability)을 대조군 모델과 비교하는 단계를 포함하는, 윌슨 병의 예방 또는 치료제를 스크리닝하는 방법.
Contacting the test substance with the Wilson disease model of claim 16; and
Comprising the step of comparing the expression level or activity level of ceruloplasmin (CP), or cell viability in the Wilson disease model treated with the test substance with the control model, for the prevention or treatment of Wilson's disease How to screen.
 제19항에 있어서, 상기 세룰로플라스민 발현 수준 또는 활성 수준, 또는 세포 생존능이 대조군에 비해 증가한 경우, 윌슨 병의 예방 또는 치료제인 것으로 판단하는 것인, 윌슨 병의 예방 또는 치료제를 스크리닝하는 방법.








The method of claim 19, wherein when the ceruloplasmin expression level or activity level, or cell viability is increased compared to the control group, it is determined to be a preventive or therapeutic agent for Wilson's disease. .
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