KR102087743B1 - IL-1beta에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 IL-1beta에 특이적으로 결합하여 IL-1beta pathway를 효과적으로 억제함으로써 우수한 항염증 효과를 나타내는 IL-1beta에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도를 제공한다.

Description

IL-1beta에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도{Antibody that specifically binds to IL-1beta and uses thereof}
본 발명은 IL-1beta에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것으로서, 더 상세하게는 IL-1beta에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도에 관한 것이다.
의약품으로서 항체가 가지는 의의를 이해하기 위해서는 먼저 사람의 면역반응을 이해할 필요가 있다. 사람은 외부로부터 유해물질이나 병원균(이들을 항원이라 함)이 체내에 유입될 경우 면역반응을 통해 이를 제거한다. 사람의 면역반응은 크게 세포성 면역반응과 체액성 면역반응으로 구분된다. 세포성 면역반응은 cytotoxic T cell, macrophage, NK cell 등이 활성화되어 항원을 제거하는 과정이며, 체액성 면역반응은 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 생산함으로써 항원을 중화(neutralization)하거나 제거하는 과정이다.
한편, 염증성 장질환(IBD, inflammatory bowel disease)은 T 세포의 비정상적인 반응이 IFN-γ, TNF-α, IL-6 및 IL-12 등의 염증성 사이토카인 및 케모카인을 분비하여 염증세포를 축적하고 조직 파괴를 유도함으로써 발병되며, 대표적인 예로 크론씨병(Crohn's disease)과 궤양대장염(ulcerative colitis)이 있다. 또한, 무균상태에서 사육된 쥐는 염증성 장질환을 발생시키지 않지만, 장내 미생물에 대한 지속적인 면역 반응의 결함이 염증성 장질환을 유발하는 것으로 알려져 있다. 이와 관련하여 대한민국 공개특허 제2008-0105674호는 항-마우스 GITRL 단일클론 항체 또는 항-인간 AITRL 단일클론 항체 및 이를 유효성분으로 함유하는 염증성 장질환의 예방 및 치료용 조성물에 대해 개시하고 있다.
상기 선행기술의 경우, 항-마우스 GITRL 단일클론 항체 또는 항-인간 AITRL 단일클론 항체가 GITR/GITRL 또는 AITR/AITRL 신호를 차단하는 것으로 충분한 항염증 효과를 나타내고 있지 않다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, IL-1beta에 특이적으로 결합하여 IL-1beta pathway를 효과적으로 억제함으로써 우수한 항염증 효과를 나타내는 IL-1beta에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 하기와 같은 상보성 결정지역(complementary determining region, CDR)을 포함하는, IL-1β에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 또는 그의 기능성 단편이 제공된다:
서열번호 9로 기재되는 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR1);
서열번호 10으로 기재되는 경쇄 상보성 결정 영역 2(LCDR2);
서열번호 11로 기재되는 경쇄 상보성 결정 영역 3(LCDR3);
서열번호 12로 기재되는 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR1);
서열번호 13으로 기재되는 중쇄 상보성 결정 영역 2(HCDR2); 및
서열번호 14로 기재되는 중쇄 상보성 결정 영역 3(HCDR3).
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 단일클론항체 또는 그의 기능성 단편을 유효성분으로 포함하는, IL-1beta의 과발현에 의해 유발되는 염증성 장질환 치료용 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 단일클론 항체 또는 그의 기능성 단편을 유효성분으로 함유하는, IL-1β의 과발현에 의해 유발되는 염증성 장질환 예후 판정용 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 단일클론 항체 또는 그의 기능성 단편을 시료에 처리하는 단계; 및 상기 단일클론 항체 또는 그의 기능성 단편의 항원과의 결합 여부를 측정하는 단계를 포함하는, IL-1β의 과발현에 의해 유발되는 염증성 장질환 예후 판정을 위한 정보제공 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 단일클론항체의 중쇄 또는 그의 기능성 단편의 중쇄 상응 부위를 암호화하는 핵산분자가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 단일클론항체의 경쇄 또는 그의 기능성 단편의 경쇄 상응 부위를 암호화하는 핵산분자가 제공된다.
상기한 바와 같이 본 발명의 IL-1beta에 특이적으로 결합하는 항체는 재조합 인간 IL-1beta 및 재조합 마우스 IL-1beta 모두에 결합하여 염증 모델에서 우수한 항염증 효과를 확인하였으므로 다양한 염증 치료를 위한 약학적 조성물 제조에 활용할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 파아지 디스플레이(phage display) 기술을 이용하여 IL-1beta에 결합하는 클론을 선별하는 과정을 개략적으로 나타내고 있는 개요도이다.
도 2는 재조합 인간 IL-1beta 및 재조합 마우스 IL-1beta에 대한 스크리닝 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 염기서열이 상이한 3개 양성클론의 phage ELISA 결과를 분석한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 선별한 3종 항체의 SDS-PAGE 결과를 나타내고 있는 겔 사진이다.
도 5는 본 발명의 3종 항체의 IgG 결합력을 분석한 것으로 1F IgG 결합력(a), 7F IgG 결합력(b) 및 10F IgG 결합력(c)을 분석한 그래프이다.
도 6은 대장염 유발 마우스로부터 적출한 대장의 외관을 관찰한 사진(a)이고 대장의 결축 및 외관 점수를 분석한 그래프이다(b).
도 7은 대장염 유발 마우스로부터 적출한 대장조직을 이용하여 면역조직화학염색에 따른 조직병리학적 연구를 분석한 것으로 H&E 염색을 수행한 사진이고(a) IL-1β 면역조직화학염색 사진이며(b), IL-1β 염색 영역을 분석한 그래프이고(c), IL-6 면역조직화학염색 사진이며(d), IL-6 염색 영역을 분석한 그래프이다(e).
(#: 양성대조군과 student's t test를 통한 비교결과<0.05, ##: 양성대조군과 student's t test를 통한 비교결과<0.01, *: 음성대조군과 student's t test를 통한 비교 결과 P<0.05, **: 음성대조군과 student's t test를 통한 비교결과<0.01,***: 음성대조군과 student's t test를 통한 비교 결과 P<0.001).
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 "염증(inflammation)"은 병원체의 침입 또는 손상된 조직 제거를 개시하기 위해 상처부위에 대해 나타나는 지역적인 반응으로 인체에서 발생하는 염증은 크게 급성 염증반응(acute inflammation)과 만성 염증반응(chronic inflammation)으로 구분할 수 있다. 급성 염증반응은 외부로부터 유입된 항원으로부터 신체를 보호하기 위해 급속하게 발생하는 반응이다.
본 문서에서 사용되는 "염증성 장질환(inflammatory bowel disease, IBD)"은 호전과 재발을 반복하면서 장내 만성적인 염증과 궤양을 일으키는 질환으로, 아직 명확한 원인이 밝혀지진 않았지만, 환경적 요인, 유전적 요인과 함께 장내에 정상적으로 존재하는 세균에 대한 우리 몸의 과도한 면역반응 등이 중요한 발병 요인으로 여겨지고 있다. 세균 또는 바이러스에 의하여 유발되는 장염은 일시적인 염증이고 대부분 원인이 분명하고 특이 치료 약제로 바로 치료가 가능하지만, 염증성 장질환은 이러한 증상이 6개월 이상 지속되는 것이 특징이다.
본 문서에서 사용되는 "IL-1β(Interleukin 1 beta)"는 사람에서 IL 1 베타 유전자에 의해 코딩되는 사이토카인 단백질로 백혈구 발열인자, 백혈구 내인성 매개체, 단핵 세포 인자, 림프구 활성화 인자 등으로 알려져 있다. IL-1beta 전구체는 성숙한 IL-1beta를 형성하기 위해 cytosolic caspase 1(인터루킨 1 베타 전환 효소)에 의해 절단된다.
본 발명에서 용어, "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미하며, 항체의 균질성을 기준으로 다클론항체 및 단일클론항체를 포함하고, 그 길이를 기준으로 전장항체(full length antibody) 및 항체의 기능성 단편(functional fragment)을 모두 포함한다. 상기 항체의 기능성 단편은 다른 용어로 항원 결합 단편(antigen binding fragment)로도 불리운다. 또한, 상기 용어는 키메라성 항체(chimeric antibody), 인간화 항체(humanized antibody) 및 이가성(bivalent) 또는 양특이성 분자(예를 들어, 양특이성 항체), 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디를 포함한다. 상기 전장항체는 2개의 전체 길이의 경쇄(light chain) 및 2개의 전체 길이의 중쇄(heavy chain)를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화결합으로 연결되어 있다. 상기 전장항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG를 포함하며, IgG는 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 상기 "항체의 기능성 단편" 또는 "항원 결합 단편"은 실질적으로 전장항체가 인식하는 것과 동일한 항원결합부위(epitope)를 인식하는 항체의 단편을 의미하며, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 첫 번째 불변 도메인(CH1 도메인)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 이황화결합을 이루면서 생성된다. Fv(variable fragment, 가변단편)는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인만을 가지고 있는 최소의 항체조각을 의미한다. 이중쇄 가변단편(dsFv)은 디설파이드 결합으로 중쇄 가변 도메인과 경쇄 가변 도메인이 연결되어 있고 단일쇄 가변단편(scFv)은 일반적으로 펩티드 링커를 통하여 중쇄의 가변 도메인과 경쇄의 가변 도메인이 공유 결합으로 연결되어 있다. 이러한 항체의 기능성 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하며 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다. 상기 단편들 중 특히 scFv는 단일쇄로 발현되기 때문에, 후술할 융합단백질을 제조하는데 유리하기 때문에 특별히 선호된다.
본 발명에서 용어, "단일클론항체"는 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 지칭하고, 이러한 단일클론항체는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다. 전형적으로, 면역글로불린은 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 도메인 및 가변 도메인을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인은, 상보성 결정 영역(complementarity- determining region, 이하 "CDR"이라 함)이라 불리우는 3개의 다변가능한 영역 및 4개의 구조 영역(framework region, FR)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 에피토프(epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 불리우고, 경쇄의 CDR은 LCDR로 불리우며, 중쇄의 CDR은 HCDR로 불리우며, 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.
한편, 상기 단일클론항체는 상기에서 설명한 바와 같이 인체에 적용하기 위해 면역원성을 감소시킨 키메라성 항체 또는 인간화 항체의 형태일 수 있다.
발명의 상세한 설명:
본 발명의 일 관점에 따르면, 하기와 같은 상보성 결정지역(complementary determining region, CDR)을 포함하는, IL-1β에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 또는 그의 기능성 단편이 제공된다:
서열번호 9로 기재되는 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR1);
서열번호 10으로 기재되는 경쇄 상보성 결정 영역 2(LCDR2);
서열번호 11로 기재되는 경쇄 상보성 결정 영역 3(LCDR3);
서열번호 12로 기재되는 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR1);
서열번호 13으로 기재되는 중쇄 상보성 결정 영역 2(HCDR2); 및
서열번호 14로 기재되는 중쇄 상보성 결정 영역 3(HCDR3).
상기 단일클론항체 또는 그의 기능성 단편은 불변영역이 인간항체의 불변영역으로 치환된 키메라성 항체이거나 또는 구조 영역이 인간항체의 상응하는 구조 영역으로 치환된 인간화 항체일 수 있다.
상기 단일클론항체 또는 그의 기능성 단편에 있어서, 서열번호 35로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 가변영역 및 서열번호 36으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있고 상기 기능성 단편은 Fab, F(ab')2, Fab', scFv, di-scFv, 또는 sdAb일 수 있으며 상기 Fv는 이중쇄 가변단편(dsFv) 또는 단일쇄 가변단편(scFv)일 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "가변성(variable)"은 가변 영역(variable region) 또는 가변 도메인(variable domain)의 특정 부분이 항체 중에서 아미노산 서열이 극심하게 상이하다는 사실을 의미한다. 상기 가변 도메인은 특정 항원에 대하여 각각의 특정 항체가 결합하는 부분으로서 항체의 특이도를 결정한다. 그러나, 상기 가변성은 항체의 가변 도메인 전체를 통해 균일하게 분포되어 있는 것이 아니며, 중쇄 및 경쇄 양쪽 모두에서 과가변성 영역(hypervariable region)으로 알려진 상보성 결정 지역(complementary determining region, CDR)으로 불리우는 세 단편에 집중되어 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 단일클론항체의 중쇄 또는 그의 기능성 단편의 중쇄 상응 부위를 암호화하는 핵산분자가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 단일클론항체의 경쇄 또는 그의 기능성 단편의 경쇄 상응 부위를 암호화하는 핵산분자가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 단일클론항체 또는 그의 기능성 단편을 유효성분으로 포함하는, IL-1beta의 과발현에 의해 유발되는 염증성 장질환 치료용 조성물이 제공된다.
상기 조성물에 있어서, 상기 염증성 장질환은 궤양성 대장염, 크론병, 베체트 장염, 옥사졸론 유도성 대장염 또는 장결핵일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 단일클론 항체 또는 그의 기능성 단편을 유효성분으로 함유하는, IL-1β의 과발현에 의해 유발되는 염증성 장질환 예후 판정용 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 단일클론 항체 또는 그의 기능성 단편을 시료에 처리하는 단계; 및 상기 단일클론 항체 또는 그의 기능성 단편의 항원과의 결합 여부를 측정하는 단계를 포함하는, IL-1β의 과발현에 의해 유발되는 염증성 장질환 예후 판정을 위한 정보제공 방법이 제공된다.
상기 정보제공방법에 있어서, 상기 시료 내에서 상기 항원의 발현정도가 정상세포 대조군에 비하여 유의하게 높게 나타날 경우 예후가 좋지 않은 것으로 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, IL-1β의 과발현에 의해 유발되는 염증성 장질환의 치료방법이 제공된다.
본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 환부의 종류, 적용부위, 처리회수, 처리시간, 제형, 환자의 상태, 보조제의 종류 등에 따라 변할 수 있다. 사용량은 특별히 한정되지 않지만, 0.01μg/kg/day 내지 10 mg/kg/day일일 수 있다. 상기 1일량은 1일에 1회, 또는 적당한 간격을 두고 하루에 2~3회에 나눠 투여해도 되고, 수일(數日) 간격으로 간헐(間歇)투여해도 된다.
본 발명의 약학적 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 0.1-100 중량%로 함유될 수 있고 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 약학적 조성물의 제조에는 고체 또는 액체의 제제용 첨가물을 사용할 수 있다. 제제용 첨가물은 유기 또는 무기 중 어느 것이어도 된다. 부형제로서는 예를 들면 유당, 자당, 백당, 포도당, 옥수수 전분(cornstarch), 전분, 탈크, 소르비트, 결정 셀룰로오스, 덱스트린, 카올린, 탄산칼슘 및 이산화규소 등을 들 수 있다. 결합제로서는 예를 들면 폴리비닐알코올, 폴리비닐에테르, 에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 아라비아고무, 트래거캔스(tragacanth),젤라틴, 셀락(shellac), 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 구연산칼슘, 덱스트린 및 펙틴(pectin) 등을 들 수 있다. 활택제로서는 예를 들면 스테아린산마그네슘, 탈크, 폴리에틸렌글리콜, 실리카, 경화식물유 등을 들 수 있다. 착색제로서는 통상 의약품에 첨가하는 것이 허가되어 있는 것이라면 모두 사용할 수 있다. 이들의 정제, 과립제에는 당의(糖衣), 젤라틴코팅, 기타 필요에 따라 적절히 코팅할 수 있다. 또한, 필요에 따라 방부제, 항산화제 등을 첨가할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 당 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며(예: 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 최신판;Mack Publishing Company, Easton PA), 제제의 형태는 특별히 한정되는 것은 아니다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042(Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기술되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여되는 것이 가능하며, 바람직하게는 비경구 투여로 정맥내 주입, 피하 주입, 뇌실내 주입(intracerebroventricular injection), 뇌척수액내 주입(intracerebrospinal fluid injection), 근육내 주입 및 복강 주입 등으로 투여할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: IL-1beta 양성 클론 스크리닝
1-1: 클론 선별
본 발명자들은 파아지 디스플레이(phage display) 기술을 이용하여 IL-1beta에 결합하는 클론을 선별하였다(도 1). 먼저, 재조합 인간 IL-1β (Sino Biological, 미국) 및 재조합 마우스 IL-1β(Sino Biological, 미국)을 각각 2.5 ㎍씩 마그네틱 비드(magnetic beads)에 컨쥬게이션(conjugate)시켰다. 그 후 3% 우혈청 알부민(Sigma, 미국) 용액에 분산된 1012 CFU의 비면역 닭 항체 파아지 라이브러리 및 상기 마그네틱 비드에 컨쥬게이션된 IL-1β를 상온에서 2시간 동안 반응시킴으로써 IL-1beta에 친화력을 가진 파아지를 결합시킨 다음, 이를 PBST(Phosphate buffered saline-0.05% Tween 20)로 세척하고, 산성 용액을 이용하여 용출하였다. 용출된 파아지를 라운드 패닝(panning)을 위해 대장균 ER2738에 감염시켜 밤새 배양하여 증식시켰고 상기 과정을 4차례 반복하여 패닝(panning)을 진행하였다. 이때 1차, 3차는 재조합 인간 IL-1beta가 컨쥬게이션된 마그네틱 비드를 사용하였고, 2차, 4차는 재조합 마우스 IL-1beta가 컨쥬게이션된 마그네틱 비드를 사용하였다. 1차에서 1회, 2~3차에서 3회, 4차에서 5회 세척하여 패닝 횟수가 증가할수록 세척 횟수가 증가하여 결합력이 높은 파아지를 축적하였다. 4차 패닝 결과물의 플레이트로부터 선별된 96개의 클론을 96 딥웰(deep well) 플레이트에서 100 ㎍/ml 카베니실린, 70 ㎍/ml 카나마이신 및 VCSM13 헬퍼 파아지(1:1000)를 첨가 후 37℃에서 밤새 배양하여 항체가 발현된 파아지의 증식을 유도하였다. 이어서 상기 배양액을 원심분리하여 파아지를 포함한 배지 상등액을 수득하여 재조합 인간 IL-1beta 및 재조합 마우스 IL-1beta가 각각 코팅되어 있는 ELISA 플레이트에 넣고 37℃에서 2시간 동안 배양하였으며, HRP가 컨쥬게이션되어 있는 항-M13 항체를 이차 항체로 이용하여 재조합 인간 IL-1beta 및 재조합 마우스 IL-1beta에 모두 결합하는 항체를 ELISA로 확인하였다.
그 결과, 상기 제조한 96개의 클론 중 22개가 재조합 인간 IL-1beta 및 재조합 마우스 IL-1beta 모두에서 양성신호(positive signal)를 나타내었다(도 2).
1-2: 시퀀싱 분석
본 발명자들은 상기 선별한 양성 클론의 시퀀싱 분석을 수행하였다. 먼저 상기 선별한 재조합 인간 IL-1beta 및 재조합 마우스 IL-1beta 모두에 양성신호를 나타내는 22개의 클론을 포함하는 ER2738을 SB 배지로 밤새 배양한 후 원심분리하여 대장균을 수득하였다. 그 후 DNA 미니 프렙 키트(LaboPass, 한국)를 이용하여 플라스미드 DNA를 수득하였고 시퀀싱용 정방향 프라이머(서열번호 1) 및 역방향 프라이머(서열번호 2)를 이용하여 염기서열을 분석하였다.
그 결과, 서열이 동일한 클론들이 다수 존재하였으며 상이한 염기서열을 가진 3개의 클론이 확인되어 상기 클론을 1F, 7F 및 10F로 명명하였다(표 2 내지 5 참조), 또한 상기 상이한 염기서열을 가진 3개의 클론을 대상으로 재조합 인간 IL-1beta 및 재조합 마우스 IL-1beta에 대한 친화도를 phage ELISA를 통하여 확인한 결과, 3개의 클론은 각각의 항원에 대하여 친화도를 나타내었고, 7F는 1F와 10F에 비하여 재조합 인간 IL-1beta에 대하여 낮은 친화도를 나타내었다(도 3).
상기 염기서열 분석에 사용한 프라이머에 대한 정보를 하기 표 1에, 염기서열 분석 결과를 표 2에, 1F, 7F 및 10F의 각각의 경쇄 CDR아미노산 서열은 하기 표 3에, 중쇄 CDR아미노산 서열은 표 4에, 경쇄 및 중쇄 가변영역 아미노산 서열을 표 5에 요약하였다.
scFv 시퀀싱 프라이머 염기서열 정보
프라이머 염기서열 (5'-->3') 서열번호
정방향 AAT TCA GGA GG 1
역방향 TGA CCG AAA CCG 2
염기서열 분석 결과
총 스크리닝 클론수 양성 클론수 시퀀싱 클론수 상이한 서열의 클론수
96 22 22 3
선별된 항체의 경쇄 CDR 아미노산 서열정보
LCDR1 LCDR2 LCDR3
1F SGGGGSYG
(서열번호 3)		 DNTNRPS
(서열번호 4)		 GTYDSSAGI
(서열번호 5)
7F SGGGRWYG
(서열번호 9)		 ANDKRPS
(서열번호 10)		 GGYDSSNYVGM
(서열번호 11)
10F SGGGGSYYG
(서열번호 15)		 DNTNRPS
(서열번호 16)		 GSIDSSGTTAL
(서열번호 17)
선별된 항체의 중쇄 CDR 아미노산 서열정보
HLCDR1 HLCDR2 HLCDR3
1F SVNMG
(서열번호 6)		 VITKDGGGTAYGAAVKG
(서열번호 7)		 ESTGCSYRAGYSCGTAGIDA
(서열번호 8)
7F SYDMG
(서열번호 12)		 GISNTGSSTGYGSAVKG
(서열번호 13)		 STGYGCTYGLCAGTVDT
(서열번호 14)
10F DRGMH
(서열번호 18)		 GIGSDDGSGTNYGSAVKG
(서열번호 19)		 AAGSPYYWYSGSSAHIDA
(서열번호 20)
scFv 시퀀싱 프라이머 염기서열 정보
아미노산 서열 서열번호
1F 경쇄 가변 영역 ALTQPSSVSANPGGTVKITCSGGGGSYGWYQQKAPGSAPVTVIYDNTNRPSDIPSRFSGSKSGSTATLTITGVQVEDEAVYYCGTYDSSAGIFGAGTTLTVL 33
1F 중쇄 가변 영역 AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFTFSSVNMGWVRQAPGKGLEWVGVITKDGGGTAYGAAVKGRATISRDDGQSTVRLQLNNLRAEDTATYYCAKESTGCSYRAGYSCGTAGIDAWGHGTEVIVSS 34
7F 경쇄 가변 영역 ALTQPSSVSANLGGTVKVTCSGGGRWYGWYQQKAPGSAPVTVIDANDKRPSDIPSRFSGSKSGSTHTLTITGVQADDEAVYYCGGYDSSNYVGMFGAGTTLTVL 35
7F 중쇄 가변 영역 AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFTFSSYDMGWVRQAPGKGLEWVAGISNTGSSTGYGSAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYFCARSTGYGCTYGLCAGTVDTWGHGTEVIVSS 36
10F 경쇄 가변 영역 ALTQPSSVSANLGGTVKITCSGGGGSYYGWYQQKAPGSAPVTVIYDNTNRPSNIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVQVDDEAVYYCGSIDSSGTTALFGAGTTLTVL 37
10F 중쇄 가변 영역 AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFDFSDRGMHWVRQAPGKGLEWVAGIGSDDGSGTNYGSAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAKAAGSPYYWYSGSSAHIDAWGHGTEVIVSS 38
실시예 2: 항체 전환 및 발현/정제
본 발명자들은 상기 실시예 1에 따라 선별된 항체인 1F, 7F 및 10F는 단쇄가변분절(ScFv) 형태이므로 이들을 완전항체 전환시키는 과정을 거쳐 full IgG 형태로 제조하였다. 먼저 scFv를 포함하는 pComb3x로부터 중쇄 및 경쇄의 가변영역과 불변영역의 절편을 하기 표 6의 프라이머 조합을 이용해서 PCR을 통해 수득하였다. PCR은 scFv를 포함하는 pComb3x DNA를 주형으로 하여 30 pmole 순방향 및 역방향 프라이머, 5x PCR 버퍼, 200 μM dNTPs 및 0.5 ㎕ Taq DNA 폴리머라제를 혼합하여 최종 50 ㎕를 맞춘 후, 94℃에서 5분 반응 시키고, 94℃에서 30초, 65℃에서 5초 및 72℃에서 1분간 반응시키는 과정을 25사이클 반복하여 PCR을 수행하였다. 또한 각 항체의 가변영역과 불변영역을 하기 표 6의 HC 및 LC 프라이머 조합 및 상기 PCR 조건을 이용하여 각각 중쇄와 경쇄를 수득하였고, pcDNA3.3TM-TOPO®TA 클로닝 키트 및 pOPTIVECTM-TOPO®TA 클로닝 키트(Invitrogen, 미국)를 이용하여 포유류 세포 발현 플라스미드로 옮겼다. 그 후, 각 벡터(pcDNA3.3TM-TOPO® 벡터 및pOPTIVECTMTOPO® 벡터) 1 ㎕와 절편을 200 mM NaCl 및 10 mM MgCl2이 포함된 완충액에 총 6 ㎕가 되게 첨가하여 상온에서 5분 동안 반응시켰다. 이어서 DH 5α 대장균 활성화세포(competent cell)에 열충격을 가하는 방법으로 형질전환하여 콜로니를 얻은 후 대량 배양하여 플라스미드를 수득하였다.
상기에서 제조된 플라스미드를 이용하여 HEK293F 세포(Invitrogen, 미국)에 형질감염 시킨 후, 7일 동안 배양하여 수득한 항체를 단백질 A 컬럼(GE, 미국)을 사용하여 정제하였다. 그 후 배양액을 컬럼에 로딩하여 배양액 중에 있는 항체(IgG)를 단백질 A와 결합시키고 20 mM 구연산 나트륨 버퍼(pH3.0)로 용출하였으며 SDS-PAGE를 통해 경쇄와 중쇄의 이론적 계산치와 일치하는 분자량과 높은 순도를 확인하였다(도 4). 상기 PCR 증폭에 사용한 프라이머의 핵산서열을 하기 표 6에 요약하였다.
프라이머 염기서열 정보
명칭 프라이머 염기서열 (5'-->3') 서열번호
VH 정방향 GCT AGC CGC CAC CAT GGG CTG GTC CTG CAT CAT CCT GTT CCT GGT GGC CAC CGC CAC CGG CGC CGT GAC GTT GGA CGA GTC CGG G 21
역방향 GGG CCC TTG GTG GAG GCG GAG GAG ACG ATG ACT TCG GTC CC 22
CH 정방향 GCC TCC ACC AAG GGC CCC TC 23
역방향 CGG GAT CCC TTG CCG GCC GT 24
HC 정방향 GCT AGC CGC CAC CAT GGG 25
역방향 GGA TCC CTT GCC GGC CGT CGC ACT CAC TT 26
VL 정방향 AAG CTT GCC GCC ACC ATG GGC TGG TCC TGC ATC ATC
CTG TTC CTG GTG GCC ACC GCC ACC GGC GCC CTG ACT
CAG CCG TCC TCG GTG		 27
역방향 GAG GGG GCG GCC ACG GTC CGT AGG ACG GTC AGG GTT
GTC CCG GC		 28
CK 정방향 CGG ACC GTG GCC GCC CCC TC 29
역방향 GCT CTA GAC TAG CAC TCG C 30
LC 정방향 AAG CTT GCC GCC ACC ATG 31
역방향 TCT AGA CTA GCA CTC GCC 32
실시예 3: 항원에 대한 단일클론 항체의 친화도 분석
상기 실시예 2에서 제작한 완전항체의 재조합 인간 IL-1beta 및 재조합 마우스 IL-1beta에 대한 결합력을 direct ELISA를 이용하여 조사하였다. 구체적으로, Direct ELISA는 50 μL의 PBS에 1 ㎍/ml로 재조합 인간 IL-1beta 및 재조합 마우스 IL-1beta를 각각 희석하여 96웰 면역 플레이트(Corning, 미국)에 넣고, 4℃에서 보관하여 밤새 흡착시켰다. 3% 우혈청 알부민(Sigma, 미국)이 포함된 완충용액으로 상온에서 1시간 반응시킨 후, 0.5% Tween 20이 포함된 완충용액으로 3회 세척하고, 순차적 농도 (0.0001, 0.0003, 0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10 nM)로 희석한 각각의 항체를 웰 당 50 ㎕씩 처리하였다. 이어서 항원에 항체가 결합할 수 있도록 상온에서 2시간 반응시킨 후, 완충용액으로 3회 세척하였다. 그 후 항-인간 면역글로불린 Fc-HRP 항체(Jackson, USA)를 1:3000으로 희석하여 웰 당 50 μL씩 처리한 후, 상온에서 1시간 동안 반응시켰고 반응이 끝난 다음, 완충 용액으로 3회 세척하였으며, TMB 50 ㎕씩 첨가하여 20분간 발색시켰다. 50 ㎕의 0.16 M H2SO4를 추가한 후, 분광 광도계(Biotek, 미국)를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 일 실시예에 따라 선별된 항체들은 완전항체로 개발된 이후에도 1F, 7F 및 10F 세 항체 모두 재조합 인간 IL-1beta 및 재조합 마우스 IL-1beta에 각각 결합함을 확인할 수 있었다. Phage ELISA 결과와 상이하게 1F와 10F에 비하여 7F가 각각의 항원에 대하여 높은 친화도를 나타내었고, 7F의 재조합 인간 IL-1beta에 대한 EC50은 0.56 nM, 재조합 마우스 IL-1beta에 대한 EC50은 0.19 nM로 재조합 마우스 IL-1beta가 재조합 인간 IL-1beta에 비하여 다소 높은 친화도를 나타내었다(도 5a 내지 5c).
상기 결과는 파아지 디스플레이를 통해 선별한 본 발명의 IL-1beta 특이적인 항체는 재조합 인간 IL-1beta 및 재조합 마우스 IL-1beta 모두에 결합함을 확인함으로써 파아지 디스플레이를 통해 제작된 항체는 대장염을 포함하여 각종 염증의 약학적 치료 조성물 제조에 매우 유용하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
실시예 4: 항체(7F)의 항염증 효과 분석
본 발명자들은 TNBS(2,4,6-Trinitrobenzenesulfonic acid)로 유도한 대장염 마우스 모델을 이용하여 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 항체(7F)의 항염증 효과를 분석하였다.
4-1: 실험동물의 준비
본 발명에서 사용된 4주령 ICR 수컷 마우스(24-27g)는 오리엔트바이오㈜로부터 구입하였다. 모든 마우스는 습도 50±10% 및 온도 25±2℃의 조절된 환경 조건에서 사육하였으며 조명은 각각 12시간의 명암조건을 적용하였다. 또한 사료는 표준 실험용 사료(Samyang, Korea)를 사용하였으며 음용수는 자유롭게 섭취하도록 하였으며 모든 실험에서 실험군 당 6마리로 제한하였다.
4-2: TNBS에 의한 대장염 유발
대장염 유발을 위해 실험동물 중 한 실험군을 정상군으로 분류하고, 나머지 군의 실험동물에 대해서는 TNBS로 대장염을 유발하였다. 구체적으로 실험동물을 가볍게 마취한 후 TNBS 용액 2.5g을 50% 에탄올에 혼합한 용액을 끝이 둥근 1㎖ 용량의 주사기를 이용하여 항문을 통해 대장 내로 0.1 ㎖씩 투여하고 수직으로 들어 30초간 유지하여 염증을 유발하였다. 24시간 후, 7F 단일클론 항체를 1 mg/kg 또는 2.5 mg/kg의 용량으로 복강투여 하였다. 양성 대조군으로 대장염 환자에서 항염증 효과를 나타내는 설파살라진(Sulfasalazine)(Sigma, 미국)을 사용하였고, 설파살라진은 TNBS 투여 다음날부터 매일 1회씩 3일간 50 mg/kg의 용량으로 경구투여 하였다. 설파살라진 투여 종료된 다음날에 실험동물을 이산화탄소로 질식시켜 희생한 후, 맹장으로부터 항문 직전 부위까지의 대장을 적출하였다.
4-2: 대장의 외관 분석
상기 실시예 4-2에서 적출한 대장은 그 길이와 외관을 관찰하여 하기 표 7의 기준(Hollenbach 등, 2005 대장염 정도에 대한 기준)에 따라 점수로 매겼다. 외관 분석 후, 일부는 병리조직용 샘플로 사용하기 위해 4% 포름알데히드 고정액으로 고정하였고 나머지는 분자생물학적 분석을 위해 -80℃에서 냉동보관 하였다.
그 결과, 양성 대조군인 설파살라진과 비교하여 본 발명의 7F 단일클론 항체는 TNBS에 의해 유도된 마우스 대장의 결축 및 외관 점수를 유의적으로 감소시킨 것으로 나타났다(도 6a 및 6b). 상기 결과는 IL-1beta의 억제가 대장염의 치료에 효율적인 전략이 될 수 있음을 시사하는 것이다.
대장염 정도에 대한 기준
외관 점수 기준
0 어떠한 궤양과 염증도 발견되지 않음
1 출혈이 없는 궤양이 발견됨
2 궤양과 국소적인 출혈이 발견됨
3 한 곳에서만 궤양과 염증이 발견됨
4 궤양과 염증이 2곳 이상에서 발견됨
5 궤양이 2 cm 이상으로 확대되어 있음
실시예 5: 조직병리학적 연구(Histopathological studies)
본 발명자들은 면역조직화학염색(Immunohistochemistry)에 따른 조직병리학적 연구를 수행하였다. 먼저 면역조직화학염색은 록원바이오 융합연구재단에서 수행하였고, 조직병리학적 분석은 을지대학교에서 수행하였다. 이를 위해 상기 적출한 대장조직을 4% 포름알데히드 용액에 고정한 후 파라핀으로 포매하였다. 이 후 조직절편은 4 μm 두께로 박절하고, 파라핀을 제거한 뒤 재수화한 후, 헤마톡실린(hematoxylin)(Sigma, 미국)과 이오신(eosin)(Sigma, 미국)을 염색하였고, 광학현미경으로 관찰하였다.
또한 상기 재수화한 절편을 이용하여 면역조직화학염색을 실시하였다. 먼저, 면역퍼옥시다아제 라벨링을 위해 세포 내의 퍼옥시다아제를 0.3% H2O2에 15분간 노출하여 억제하였고 항원 복구를 위해 항원 복구액(antigen retrieval solution; TE pH 9.0)(Sigma, 미국)에 넣고 압력 쿠커(pressure cooker)(Bio SB, 미국)에서 30분 동안 가열하였으며 비특이성 면역 반응 배제를 위해 블로킹 용액에 20분간 노출시켰다. TNBS로부터 유도된 염증에 의하여 증가한 대장 내 IL-1beta의 정도를 평가하기 위하여, 마우스 IL-1beta에 대한 일차 토끼 항체(Abcam, 영국)을 사용하여 IL-1beta에 대한 면역조직화학염색을 수행하였다. 블로킹 용액을 처리한 조직 절편 위에 희석한 일차 항체를 1시간 동안 상온에서 반응시켜 항원-항체 반응 복합체를 형성시켰다. EnVision+System-HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit (Dako, 미국)을 사용하여 항원-항체 반응 복합체에 HRP가 표지된 2차 항체를 결합시킨 후, Liquid DAB+ Substrate Chromogen System (Dako, 미국)을 사용하여 3,3'Diaminobenzidine (DAB)를 기질로 발색하였다. 헤마톡실린 (Hematoxylin) 염색은 DAB 염색의 대조염색으로 수행하였고 이미지는 ix71 광학현미경 (Olympus, 일본)을 사용하여 관찰하였다. IL-1beta 염색 부위의 비율은 Image J 소프트웨어 (NIH, 미국)를 사용하여 계산하였다.
아울러, IL-1beta의 증가는 IL-1beta와 더불어 pro-inflammatory cytokine에 포함되는 IL-6의 증가를 유도한다. 상기 대장 내의 IL-6의 정도를 평가하기 위하여, 마우스 IL-6에 대한 일차 토끼 항체(Abcam, 영국)를 사용하여 IL-6의 면역조직화학 염색을 수행하였다. 면역조직화학 염색은 상기 Ki67 염색과 동일한 과정으로 수행하였다. 이미지는 ix71 광학현미경 (Olympus, 일본)을 사용하여 관찰하였다. 염색 부위의 비율은 Image J 소프트웨어 (NIH, 미국)를 사용하여 확인하였다.
그 결과, H&E 염색 음성대조군은 장벽 전체에 부종이 심하고, 상피층이 거의 소실되었고 염증세포들은 점막하층과 근육층 일부까지 침윤되어 있었으며, 음와(crypt)의 손상이 심하여 형태가 유지되지 않았다. 그러나 7F 단일클론 항체 1 mg/kg 투여군에서는 장벽의 부종이 음성대조군에 비하여 경미하고, 음와 형태는 비교적 잘 유지되어 있었다. 한편 7F 단클론 항체 2.5 mg/kg 투여군도 염증세포의 침윤이 음성대조군에 비해 거의 관찰되지 않았다(도 7a)
또한 면역화학조직염색 결과, 음성대조군에서 IL-1beta 및 IL-6의 발현이 가장 높게 나타났다(도 7b 및 7c). 상기 결과는 H&E 염색 결과에서 확인한 음성대조군의 염증 정도와 비례하고 TNBS에 의하여 유발된 대장염이 IL-1beta pathway를 활성화 시켰다는 것을 시사한다. 아울러 IL-6의 면역조직화학염색 결과, 7F 단일클론 항체는 TNBS로부터 유도된 pro-inflammatory cytokine인 IL-1beta 및 IL-6의 농도를 현저하게 감소시키는 것으로 나타났다(도 7d 및 7e). 상기 결과는 7F 단일클론 항체의 IL-1beta에 대한 높은 특이성에 기인함으로 IL-1beta의 억제는 IL-6의 억제를 유도하며, 이는 IL-1beta pathway의 억제는 염증 치료에 효과적인 전략임을 시사한다.
결론적으로, 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 IL-1beta에 특이적으로 결합하는 항체인 7F 단일클론 항체는 재조합 인간 IL-1beta 및 재조합 마우스 IL-1beta 모두에 결합함을 확인하였고, 마우스 대장염 모델에서 매우 우수한 항염증 효과 확인하였으므로 대장염을 포함하여 각종 염증의 약학적 치료 조성물 제조에 매우 유용하게 사용될 수 있고 항염증 효과 예측에 활용될 수 있다.
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
<110> EULJI UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMY COOPERATION FOUNDATION <120> Antibody that specifically binds to IL-1beta and uses thereof <130> PD19-5789 <160> 38 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 aattcaggag g 11 <210> 2 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 tgaccgaaac cg 12 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1F LCDR1 <400> 3 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Gly 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1F LCDR2 <400> 4 Asp Asn Thr Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1F LCDR3 <400> 5 Gly Thr Tyr Asp Ser Ser Ala Gly Ile 1 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1F HLCDR1 <400> 6 Ser Val Asn Met Gly 1 5 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1F HLCDR2 <400> 7 Val Ile Thr Lys Asp Gly Gly Gly Thr Ala Tyr Gly Ala Ala Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 8 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1F HLCDR3 <400> 8 Glu Ser Thr Gly Cys Ser Tyr Arg Ala Gly Tyr Ser Cys Gly Thr Ala 1 5 10 15 Gly Ile Asp Ala 20 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 7F LCDR1 <400> 9 Ser Gly Gly Gly Arg Trp Tyr Gly 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 7F LCDR2 <400> 10 Ala Asn Asp Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 7F LCDR3 <400> 11 Gly Gly Tyr Asp Ser Ser Asn Tyr Val Gly Met 1 5 10 <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 7F HLCDR1 <400> 12 Ser Tyr Asp Met Gly 1 5 <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 7F HLCDR2 <400> 13 Gly Ile Ser Asn Thr Gly Ser Ser Thr Gly Tyr Gly Ser Ala Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 7F HLCDR3 <400> 14 Ser Thr Gly Tyr Gly Cys Thr Tyr Gly Leu Cys Ala Gly Thr Val Asp 1 5 10 15 Thr <210> 15 <211> 9 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41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH R <400> 22 gggcccttgg tggaggcgga ggagacgatg acttcggtcc c 41 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CH F <400> 23 gcctccacca agggcccctc 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CH R <400> 24 cgggatccct tgccggccgt 20 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HC F <400> 25 gctagccgcc accatggg 18 <210> 26 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HC R <400> 26 ggatcccttg ccggccgtcg cactcactt 29 <210> 27 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL F <400> 27 aagcttgccg ccaccatggg ctggtcctgc atcatcctgt tcctggtggc caccgccacc 60 ggcgccctga ctcagccgtc ctcggtg 87 <210> 28 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL R <400> 28 gagggggcgg ccacggtccg taggacggtc agggttgtcc cggc 44 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CK F <400> 29 cggaccgtgg ccgccccctc 20 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CK R <400> 30 gctctagact agcactcgc 19 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LC F <400> 31 aagcttgccg ccaccatg 18 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LC R <400> 32 tctagactag cactcgcc 18 <210> 33 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1F light chain variable region <400> 33 Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Gly Thr Val 1 5 10 15 Lys Ile Thr Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln 20 25 30 Lys Ala Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Asp Asn Thr Asn 35 40 45 Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser 50 55 60 Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Val Glu Asp Glu Ala Val 65 70 75 80 Tyr Tyr Cys Gly Thr Tyr Asp Ser Ser Ala Gly Ile Phe Gly Ala Gly 85 90 95 Thr Thr Leu Thr Val Leu 100 <210> 34 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1F heavy chain variable region <400> 34 Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Val 20 25 30 Asn Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Val Ile Thr Lys Asp Gly Gly Gly Thr Ala Tyr Gly Ala Ala Val 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asp Gly Gln Ser Thr Val Arg 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Glu Ser Thr Gly Cys Ser Tyr Arg Ala Gly Tyr Ser Cys Gly 100 105 110 Thr Ala Gly Ile Asp Ala Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser 115 120 125 Ser <210> 35 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 7F light chain variable region <400> 35 Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Leu Gly Gly Thr Val 1 5 10 15 Lys Val Thr Cys Ser Gly Gly Gly Arg Trp Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln 20 25 30 Lys Ala Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Ile Asp Ala Asn Asp Lys 35 40 45 Arg Pro Ser Asp Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser 50 55 60 Thr His Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Ala Asp Asp Glu Ala Val 65 70 75 80 Tyr Tyr Cys Gly Gly Tyr Asp Ser Ser Asn Tyr Val Gly Met Phe Gly 85 90 95 Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu 100 <210> 36 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 7F heavy chain variable region <400> 36 Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gly Ile Ser Asn Thr Gly Ser Ser Thr Gly Tyr Gly Ser Ala Val 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Gly Tyr Gly Cys Thr Tyr Gly Leu Cys Ala Gly Thr 100 105 110 Val Asp Thr Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser 115 120 125 <210> 37 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 10F light chain variable region <400> 37 Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Leu Gly 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Ala Gly Ser Pro Tyr Tyr Trp Tyr Ser Gly Ser Ser 100 105 110 Ala His Ile Asp Ala Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser 115 120 125

Claims (12)

  1. 서열번호 35로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 경쇄 및 서열번호 36으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체 중쇄를 포함하는 인간 및 마우스 IL-1β에 모두 교차반응하는 단일클론항체 또는 그의 기능성 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    불변영역이 인간항체의 불변영역으로 치환된 키메라성 항체이거나 또는 구조 영역이 인간항체의 상응하는 구조 영역으로 치환된 인간화 항체인, 단일클론항체 또는 그의 기능성 단편.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 기능성 단편은 Fab, F(ab')2, Fab', scFv, di-scFv, 또는 sdAb인, 단일클론항체 또는 그의 기능성 단편.
  5. 삭제
  6. 제1항의 단일클론항체의 중쇄 또는 그의 기능성 단편의 중쇄 상응 부위를 암호화하는 핵산분자.
  7. 제1항의 단일클론항체의 경쇄 또는 그의 기능성 단편의 경쇄 상응 부위를 암호화하는 핵산분자.
  8. 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항의 단일클론항체 또는 그의 기능성 단편을 유효성분으로 포함하는, IL-1β의 과발현에 의해 유발되는 염증성 장질환 치료용 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 염증성 장질환은 궤양성 대장염, 크론병, 베체트 장염, 옥사졸론 유도성 대장염 또는 장결핵인, 조성물.
  10. 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항의 단일클론항체 또는 그의 기능성 단편을 유효성분으로 함유하는, IL-1β의 과발현에 의해 유발되는 염증성 장질환 예후 판정용 조성물.
  11. 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항의 단일클론항체 또는 그의 기능성 단편을 시료에 처리하는 단계; 및 상기 단일클론항체 또는 그의 기능성 단편의 항원과의 결합 여부를 측정하는 단계를 포함하는, IL-1β의 과발현에 의해 유발되는 염증성 장질환 예후 판정을 위한 정보제공 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 시료 내에서 상기 항원의 발현정도가 정상세포 대조군에 비하여 유의하게 높게 나타날 경우 예후가 좋지 않은 것으로 판정하는 단계를 추가로 포함하는, IL-1β의 과발현에 의해 유발되는, 정보제공 방법.
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