KR102082185B1

KR102082185B1 - 저분자 화합물을 이용한 골격근육세포 분화 방법

Info

Publication number: KR102082185B1
Application number: KR1020180020537A
Authority: KR
Inventors: 김경규
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2017-02-21
Filing date: 2018-02-21
Publication date: 2020-02-27
Also published as: KR20180096538A

Abstract

본 발명은 체세포 또는 성체줄기세포의 골격근세포로의 분화 유도용 조성물 등에 관한 것으로서, 본 발명의 분화 유도용 조성물를 포함하는 배양 배지에서 세포를 배양하는 간단한 방법을 통하여 체세포를 직접분화하여 골격근세포를 수득할 수 있으며, 상기 골격근세포로의 분화는 상승된 분화 속도 및 효율을 나타내고, 비용면에서 경제적인 이점이 있다. 또한, 상기 수득된 골격근세포는 체세포로부터 분화되어 이식 후 암 발생의 위험이 없고, 유전자 도입 없이 저분자성 화합물의 혼합만을 이용하여 유전적으로 안정한 장점이 있다. 아울러 본 발명은 상기 조성물이 중간엽줄기세포의 골격근세포로의 분화 또한 빠르고 효율적으로 유도함을 확인하였으며, 특히 상기 조성물에 GSK inhibitor의 결여가 분화 효율에 긍정적 효과를 나타냄을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 보다 빠른 시간 내에 많은 양의 골격근세포로의 분화를 유도하여 골격근 질환 치료를 위한 경제적이고 효율적인 세포치료제 개발에 유용하게 사용될 것으로 기대된다.

Description

저분자 화합물을 이용한 골격근육세포 분화 방법{Process for the chemically induced skeletal muscle differentiation}

본 발명은 체세포 또는 성체줄기세포를 골격근세포로 분화시키는 방법 등에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 유전자 도입 없이 저분자성 물질을 이용하여 체세포 또는 성체줄기세포를 안전하고 높은 효율로 화학적 유도 골격근세포 (CiSMC: Chemically induced skeletal musclecells)로 분화시키는 방법 등에 관한 것이다.

유전적 돌연변이에 의한 근육이상, 근육 미발달, 및 근육 퇴화 등의 유전근육질환, 근육 또는 신경의 손상 또는 노화에 의한 근육감소, 그리고 과도한 근육소모 (muscle wasting)에 의한 근육 손상이 동반되는 근육질환의 치료를 위해서는 근육의 재생이 필요하다. 새로 태어난 아기는 근육 재생 능력이 상대적으로 뛰어나지만, 성인은 근육 줄기 세포 및 전구 세포의 노화로 근육 재생 능력이 감소하게 된다. 또한, 근육 재생이 어느 정도 가능한 경우라도 외상이나 질병에 의한 근육손상이 큰 경우 새로운 근육 분화의 가능성이 감소하게 되어, 전통적인 의료행위로는 근육 손상의 영구적인 회복을 기대하기 어려운 측면이 있다. 따라서, 이러한 근육질환의 치료를 위해서는 근육세포 또는 근육전구세포의 이식이 필요하다. 그러나, 이러한 근육이식에 의한 치료는 면역형 일치 기증자로부터 유래된 근육 또는 근육 전구 세포의 이식이 아닌 경우 면역거부 반응에 의한 부작용이 발생하는 문제가 있다.

세포치료를 위해 필요한 세포를 제작하기 위하여 배아줄기세포(Embryonic stem cells: ESC)나 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell: iPSC)를 이용하는 방법이 많이 연구되었으나, 줄기세포를 이용하여 제작된 세포의 경우 미분화 줄기세포가 포함되어 있을 수 있으며, 미분화 줄기세포가 생체에 이식된 후 테라토마(teratoma)를 형성하여 암을 유발하는 문제가 있다. 따라서 줄기세포에서 분화된 세포를 이용한 세포치료나 줄기세포를 바로 이용하는 줄기세포치료는 현재 망막질환과 같이 매우 제한된 분야에서만 임상적으로 적용되고 있다.

상기의 문제를 해결하기 위한 방법으로써 배아줄기세포나 유도만능줄기 세포 (induced pluripotent stem cell: iPSC)와 같은 분화능이 높은 만능줄기세포 (pluripotent stem cell)를 이용하지 않고, 분화능이 아주 제한된 중간엽세포(Mesenchymal Stem Cells: MSC)나 분화가 완전히 끝난 체세포(somatic cell)를 원하는 세포로 직접 분화 시키는 연구가 활발히 이루어 지고 있다. 직접분화를 이용해서 세포치료에 필요한 세포를 바로 만드는 방법은 만능줄기세포를 포함하지 않기 때문에 암 발생가능성이 없을 뿐 아니라, 배아줄기세포를 이용할 때 발생하는 윤리적인 문제에서 자유롭다는 장점이 있다. 또한 체세포를 역분화시켜 iPSC를 만들고 이를 다시 분화시키는 과정에 비해서 시간 및 효율이 훨씬 뛰어나다는 장점이 있다. 무엇보다도 이러한 직접분화의 장점은 타인의 세포를 이용할 때 발생하는 면역거부반응이 없이 환자본인의 세포를 바로 이용하는 자가 세포치료가 가능하다는 점이다.

iPSC를 이용한 세포분화의 경우 생체 발생과정에서 발생하는 여러 단계의 세포분화과정을 모두 거치게 되는 반면, 환자의 체세포나 성체줄기세포(adult stem cell)를 이용하는 직접분화는 최종분화세포에서 발현되는 유전자를 강제 혹은 유도 발현하는 방법을 통해 세포를 분화시키게 되므로 줄기세포 분화 과정에서 만들어지는 중간단계의 세포를 거치지 않는다. 이처럼 분화방법이 단순하다는 직접분화의 특징 때문에 줄기세포를 이용하여 치료제로 사용될 세포를 만드는 방법에 비해 세포분화에 필요한 시간이 적게 걸릴 뿐 아니라, 세포분화에 필요한 비용도 절약할 수 있다. 예를 들어, iPSC를 이용한 골격근의 분화를 위해서는 iPSC를 중배엽으로 분화시키고, 축엽중배엽, 근전구세포, 군육모세포 들을 거쳐 근육관세포를 만들어야 하지만, 직접분화방법을 이용하는 경우 체세포를 직접 근육관세포로 분화시킬 수 있다.

체세포를 이용한 직접분화를 위해서는 분화시키고자 하는 세포에서 중요한 역할을 수행하면서 그 세포를 특징짓는 마커 유전자들을 선택적으로 발현시켜야 하는데, 상기 마커 유전자들의 발현은 그 세포의 마스터 전사인자에 의해 조절되기 때문에 직접분화를 위해 가장 많이 사용되는 방법은 마스터 전사인자를 강제로 발현시키는 것이다. 예를 들면, 골격근으로의 직접분화는 근육관세포의 마스터 전사인자이면서 근유관세포의 마커로 알려진 전사인자 MyoD의 강제 발현에 의해 달성될 수 있다. 하지만 이러한 특정 유전자의 선택적 발현을 위해서는 외부 유전자를 세포안으로 넣어야 하는데, 이 과정에서 유전자 전달매개체로 사용하는 바이러스의 안정성이 확인되지 않았고, 또한 외부 유전자가 유전체에 삽입되는 과정에서 유전체의 안정성을 저해하여 원하지 않은 부작용을 유래할 가능성이 있다.

이처럼 유전자도입에 의한 직접분화에서 생기는 문제를 해결하기 위한 대안으로서 유전자의 삽입이 아닌 저분자 화합물을 통해 특정 신호전달 또는 후성유전학신호를 조절하여서 특정세포에 특징적인 유전자를 발현시키는 화학적 유도 직접분화법이 연구되고 있다.

저분자 물질을 이용한 직접분화 방법은 앞에서 제시하였던 장점 외에도 저분자 물질의 세포전달 용이성, 결과의 재현성, 분화의 효율성 및 연구범위의 확장성이라는 장점을 가지고 있다. 가장 중요하게 유전자 조작이 없다는 점에서 기존의 다른 세포치료제에 비해 안정성이 높고, 따라서 임상적 목적으로 쉽게 이용이 가능하다.

사람의 세포는 약 24,000개의 유전자가 있다고 알려져 있는데 이중 약 10,000개정도의 유전자만 각 세포에서 발현이 된다고 알려져 있다. 사람의 몸에는 현재까지 약 200개의 서로 다른 모양과 기능을 갖는 세포가 존재한다고 알려져 있다. 이렇게 서로 다른 세포에는 세포의 공통적인 기능을 수행하는데 필요한 필수유전자들이 공통적으로 발현되고 있지만, 이들 세포의 차이점은 서로 다른 유전자들의 발현에 의해 결정되게 된다. 따라서 세포의 직접 분화를 위해서는 원래세포의 특정 유전자들의 분화를 막고, 분화시키고자 세포의 특징을 좌우하는 특정 유전자들을 발현시켜야 한다. 하지만 두 세포의 특징이 많이 다른 경우 수천 개 이상의 유전자 발현이 변화하기 때문에 해당 유전자의 발현을 정밀하게 조정하는 것은 현재까지 불가능에 가깝다. 이러한 이유로 세포의 저분자 화합물을 이용한 세포의 직접분화 조건을 발견하기 위해서는 이러한 다수의 유전자 변화를 유도하는 조건을 매우 많은 실험을 통해 찾아가야 한다. 즉, 세포의 신호 조절, 후성유전, 대사조절 등과 같이 세포의 여러 기능을 조절하는 화합물들을 다양한 농도의 조합으로 처리하여 가장 원하는 유전자발현에 가까운 조건을 찾아나가야 한다.

저분자 화합물을 이용하여 다양한 세포의 직접분화가 보고되고 있다. 예를 들어, 저분자 화합물을 이용하여 섬유아세포로부터 심장근육을 만드는 방법은 이미 보고된바 있다 (한국등록특허 제10-1539132호 및 Science, 2016, 352, 1216-1220.). 하지만 근육관련 질환에 사용할 수 있는 골격근을 화학적 직접분화법으로 제작하는 방법은 아직 보고된바 없다.

한편, 골격근과 심장근은 도 1에 나타낸 바와 같이 전혀 다른 분화과정을 거치고, 각 세포의 마커 유전자 또한 상이한바, 양 세포는 상이한 특징을 가지고 있다. 구체적으로, 골격근은 중배엽, 축엽중배엽, 근원선전구세포, 근육모세포를 거쳐 근육관 혹은 근육섬유로 분화되고 있는 반면, 심장근육 세포는 측판중배엽 및 심장발생중배엽을 거쳐서 만들어지므로 골격근육과는 전혀 다른 분화과정을 거치게 된다. 즉, 심장근육세포와 골격근육세포는 전혀 다른 유전자들이 발현되고 있기 때문에 이들 유전자들의 발현을 선택적으로 조절하여 각 세포를 만들기 위해서는 서로 다른 세포신호전달이나 후성유전을 조절해야 한다는 것이다. 일반적으로 특정 세포 발현을 확인하기 위해서는 그 세포에서만 발현이 일어나는 대표적인 유전자 (마커)의 발현을 확인하는 방법을 사용하는데, 도 1에서 보는 바와 같이 심장근육세포와 골격근육세포의 발현 마커가 완전히 다르다는 것을 확인할 수 있다.

본 기술은 섬유아세포 같이 완전히 분화가 끝난 체세포나지방유래 중간엽세포처럼 근육과 전혀 무관한 성체줄기세포를 화학적인 방법을 이용하여 골격근육세포를 바꾸는 방법에 대한 것으로써, 배아줄기세포나 iPSC를 이용해 골격근육세포를 만드는 방법에 비해 간편하고 효율적이다. 또한 이러한 방법으로 만들어진 세포는 암발생 가능성이 없어서 안정성 측면에서 세포치료제로 사용될 가능성이 높다. 한편 유전자 조작에 의한 직접 분화방법에 비해 유전체의 변형가능성이 적기 때문에 안정성 측면에서 또한 유리한 방법이다. 무엇보다도 이식을 요하는 환자의 세포를 이용할 수 있으므로 면역거부반응 없는 세포치료제 개발이 가능하다. 또한 저분자 화합물만을 사용하여 세포의 직접분화를 유도함으로써 기존에 알려진 다른 세포분화 방법에 비해 비용과 시간면에서 효과적이다.

본 특허에서는 세포기능을 조절한다고 알려져 있는 다양한 화합물을 여러 가지 조합으로 처리함으로써 체세포나 중간엽세포와 같은 성체세포를 골근육세포로 직접분화하는 기술을 발명하였고, 이러한 직접분화를 통해 만들어진 골격근세포가 골격근이 갖는 세포활성을 갖는다는 것을 증명하였다. 따라서 분화시킨 골근육세포 혹은 분화된 골근육세포에서 유래된 물질이 골근육 관련 질환의 치료제로 사용될 수 있을 것이다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 체세포 혹은 중간엽세포와 같은 성체세포를 바로 근육세포로 변화시키기는 방법을 찾고자 예의 노력한 결과, (1) histone deacetylase의 저해를 통해 open chromatin을 형성 (2) glycogen synthase kinase저해제를 통해 Wnt/beta-catenin신호를 활성화, (3) ALK-5 kinase저해제를 통해 TFG-beta신호 저해, (4) cAMP signaling activator를 통해 세포신호전달물질인 cyclic AMP (cAMP)를 합성이 성체세포의 골격근육세포로의 직접분화에 필요하다는 사실을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은 판히스톤 디아세틸라제 억제제 (Pan-histone deacetylase inhibitor), GSK 억제제 (Glycogen synthease kinase inhibitor), ALK5 억제제 (activin A receptor type II-like kinase 5 inhibitor), 및 cAMP 시그널링 활성제 (cAMP signaling activator)를 유효성분으로 포함하는, 체세포 또는 성체줄기세포의 골격근세포로의 분화 유도용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 분화 유도용 조성물을 포함하는 배양배지에 체세포 또는 성체줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 체세포 또는 성체줄기세포의 골격근세포로의 분화 유도 방법 및 상기 단계 이후에 Activin A, BMP4(Bone morphogenetic protein 4), VEGF(Vascular endothelial growth factor), GSK 억제제(Glycogen synthase kinase inhibitor), 및 src tyrosine kinase inhibitor로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는 배지에서 골격근세포로 분화 유도된 세포를 성숙시키는 단계를 추가로 포함하는 골격근세포로의 분화 유도 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 방법에 의해 골격근세포로 분화된 세포를 포함하는 골격근 질환 치료용 세포치료제를 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 판히스톤 디아세틸라제 억제제 (Pan-histone deacetylase inhibitor), GSK 억제제 (Glycogen synthase kinase inhibitor), ALK5 억제제 (activin A receptor type II-like kinase 5 inhibitor), 및 cAMP 시그널링 활성제 (cAMP signaling activator)를 유효성분으로 포함하는, 체세포 또는 성체줄기세포의 골격근세포로의 분화 유도용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 판히스톤 디아세틸라제 억제제 (Pan-histone deacetylase inhibitor), ALK5 억제제 (activin A receptor type II-like kinase 5 inhibitor), 및 cAMP 시그널링 활성제 (cAMP signaling activator)를 유효성분으로 포함하는, 성체줄기세포의 골격근세포로의 분화 유도용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 체세포는 섬유아세포(fibroblast)일 수 있으며, 상기 섬유아세포는 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblast) 또는 마우스 피부 섬유아세포(mouse skin fibroblast)일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 성체줄기세포는 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell: MSC)일 수 있으며, 상기 중간엽줄기세포는 지방유래 줄기세포(adipocyte-derived stem cell: ADSC)일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 판히스톤 디아세틸라제 억제제는 발프론산 (Valproic acid), Sodium butyrate,수베로일아닐리드 하이드록삼산 (Suberoylanilide hydroxamic acid), 히드록삼산 (hydroxamic acid), 사이클릭 테트라펩티드 (cyclic tetrapeptide), 뎁시펩티드 (depsipeptides), 트리코스타틴 A (Trichostatin A), 보리노스타트 (Vorinostat), 벨리노스타트 (Belinostat), 파노비노스타트 (Panobinostat), 벤즈아마이드 (Benzamide), 엔티노스타트 (Entinostat), 또는 부틸레이트 (butyrate)을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 판히스톤 디아세틸라제 억제제는 1 내지 1000 μM 농도로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 400 내지 600 μM, 더욱 바람직하게는 500 μM 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 pan-HDACi의 농도는 이용되는 pan-HDACi의 종류와 분화의 대상이 되는 세포에 따라 적절하게 조절할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 ALK5 억제제는 RepSox (1,5-Naphthyridine, 2-[3-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]); SB431452 4-[4-(1,3-benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]benzamide; SB525334 (6-(2-tert-butyl-4-(6-methylpyridin-2-yl)-1H-imidazol-5-yl)quinoxaline); GW788388 (4-(4-(3-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl)pyridin-2-yl)-N-(tetrahydro-2H-pyran-4-yl)benzamide); SD-208 (2-(5-chloro-2-fluorophenyl)-N-(pyridin-4-yl)pteridin-4-amine); Galunisertib (LY2157299, 4-(2-(6-methylpyridin-2-yl)-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl)quinoline-6-carboxamide); EW-7197 (N-(2-fluorophenyl)-5-(6-methyl-2-pyridinyl)-4-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridin-6-yl-1H-imidazole-2-methanamine); LY2109761 (7-(2-morpholinoethoxy)-4-(2-(pyridin-2-yl)-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl)quinoline); SB505124 (2-(4-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-2-tert-butyl-1H-imidazol-5-yl)-6-methylpyridine); LY364947 (Quinoline, 4-[3-(2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]); SB431542 (4-(4-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-5-(pyridin-2-yl)-1H-imidazol-2-yl)benzamide); K02288 (3-[(6-Amino-5-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-3-pyridinyl]phenol]; 또는 LDN-212854 (Quinoline, 5-[6-[4-(1-piperazinyl)phenyl]pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl])를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 ALK5 억제제는 1 내지 100 μM 농도로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 5 내지 15 μM, 더욱 바람직하게는 10 μM 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 ALK5 억제제의 농도는 이용되는 ALK5 억제제의 종류와 분화의 대상이 되는 세포에 따라 적절하게 조절할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 cAMP 시그널링 활성제는 포스콜린 (Forskolin), isoproterenol, NKH 477, isoprotereno (Chemical based), PACAP 1-27, 또는 PACAP 1-38 (peptide based)을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 cAMP 시그널링 활성제는 1 내지 100 μM 농도로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 40 내지 60 μM, 더욱 바람직하게는 50 μM 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 cAMP 시그널링 활성제의 농도는 이용되는 cAMP 시그널링 활성제의 종류와 분화의 대상이 되는 세포에 따라 적절하게 조절할 수 있다. 예를들어, Forskolin의 경우 50 μM (±10 μM), NKH477의 경우 5 μM(±10 μM)의 농도로 포함되는 경우 적절한 분화를 확인할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 GSK 억제제는 Chir99021 (6-(2-(4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-2-yl)pyrimidin-2-ylamino)ethylamino)nicotinonitrile); 1-azakenpaullone (9-Bromo-7,12-dihydro-pyrido[3’,2’:2,3]azepino[4,5-b]indol-6(5H)-one); AZD2858; 3-amino-6-(4-((4-methylpiperazin-1-yl)sulfonyl)phenyl)-N-(pyridin-3-yl)pyrazine-2-carboxamide; BIO ((2’Z,3’E)-6-Bromoindirubin-3’-oxime); ARA014418 (N-(4-Methoxybenzyl)-N’-(5-nitro-l,3-thiazol-2-yl)urea); Indirubin-3’-monoxime; 5-Iodo-indirubin-3’-monoxime; kenpaullone (9-Bromo-7,12-dihydroindolo-[3,2-d][1]benzazepin-6(5H)-one); SB-415286 (3-[(3-Chloro-4-hydroxyphenyl)amino]-4-(2-nitro-phenyl)-1H-pyrrole-2,5-dione); SB-216763 (3-(2,4-Dichlorophenyl)-4-(1-methyl-1H-indol-3-yl)-lH-pyrrole-2,5-dione); Maybridge SEW00923SC (2-anilino-5-phenyl-1,3,4-oxadiazole); (Z)-5-(2,3-Methylenedioxyphenyl)-imidazolidine-2,4-dione; TWS 119 (3-(6-(3-aminophenyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yloxy)phenol); Chir98014 (N2-(2-(4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(1 H-imidazol-1-yl)pyrimidin-2-ylamino)ethyl)-5-nitropyridine-2,6-diamine); SB415286 (3-(3-chloro-4-hydroxyphenylamino)-4-(2-nitrophenyl)-1H-pyrrole-2,5-dione); Tideglusib (2-(1-naphthalenyl)-4-(phenylmethyl)); 또는 LY2090314 (3-imidazo[1,2-a]pyridin-3-yl-4-[1,2,3,4-tetrahydro-2-(1-piperidinylcarbonyl)-pyrrolo[3,2,jk][1，4]benzodiazepin-7-yl])를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 GSK 억제제는 0.001 내지 100 μM 농도로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 30 μM, 더욱 바람직하게는 20 μM 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 GSK 억제제의 농도는 이용되는 GSK 억제제의 종류와 분화의 대상이 되는 세포에 따라 적절하게 조절할 수 있다. 예를들어, Chir99021의 경우 20 μM (±10 μM), AZD2858의 경우 10 nM(±10 nM)의 농도로 포함되는 경우 적절한 분화를 확인할 수 있다.

또한, 본 발명은 Activin A, BMP4(Bone morphogenetic protein 4), VEGF(Vascular endothelial growth factor), GSK 억제제(Glycogen synthase kinase inhibitor) 및 src tyrosine kinase inhibitor로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는, 골격근세포의 성숙화 유도용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 판히스톤 디아세틸라제 억제제 (Pan-histone deacetylase inhibitor), ALK5 억제제 (activin A receptor type II-like kinase 5 inhibitor), 및 cAMP 시그널링 활성제 (cAMP signaling activator)를 유효성분으로 포함하는 배지에서 체세포 또는 성체줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 체세포 또는 성체줄기세포의 골격근세포로의 분화 유도 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 배지는 GSK 억제제 (Glycogen synthase kinase inhibitor)를 추가로 포함하는 체세포의 골격근세포로의 분화 유도 방법일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 배양은 5 내지 25일 동안 수행될 수 있으며, 체세포의 골격근세포로의 분화 유도의 경우 바람직하게는 4 내지 12일 동안, 더욱 바람직하게는 6 내지 8일 동안 수행될 수 있고, 성체줄기세포의 골격근세포로의 분화 유도의 경우 20 내지 25일 동안 수행될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 방법은 상기 방법에 의해 골격근세포로 분화 유도된 세포를 성숙시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 골격근세포로 분화 유도된 세포를 성숙시키는 단계는 Activin A, BMP4(Bone morphogenetic protein 4), VEGF(Vascular endothelial growth factor), GSK 억제제(Glycogen synthase kinase inhibitor), 및 src kinase inhibitor로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는 배지에서 상기 세포를 배양하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 성숙시키는 단계에서 세포의 배양은 1 내지 5 일 동안 수행될 수 있으며, 바람직하게는 3 일 동안 수행될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 골격근세포로 분화 유도된 세포를 포함하는 골격근 질환 치료용 세포치료제를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 골격근 질환은 유전적 및 후천적 요인에 의해 유발되는 골격근 질환을 포함하며, 구체적으로 베커근이영양증 (Becker musculardystrophy), 선천성근이영양증 (Congenital musculardystrophy), 듀켄씨근이영양증 (Duchenne musculardystrophy), 원위근이영양증 (Distal musculardystrophy), 에머리 드라이푸스 근이영양증 (Emery-Dreifuss musculardystrophy), 안면견갑상완근이영양증 (Facioscapulohumeral musculardystrophy), 지대근이영양증 (Limb-girdle musculardystrophy), 근긴장성이영양증 (Myotonic musculardystrophy), 및 안구인두근이영양증 (Oculopharyngeal musculardystrophy)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 선천성 골격근 질환인 근이영양증(musculardystrophy)일 수 있으며, 후천적 요인에 의한, 예를들어 물리적 충격, 염증에 의한 근육세포 사멸, 대사작용 이상, 노화 등에 의한 근감소증, 근위축증, 근경화증, 근염좌, 또는 염증성 근육 질환 등일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 세포치료제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 골격근 질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 골격근 질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 제조를 위한 상기 방법에 의해 골격근세포로 분화 유도된 세포의 용도를 제공한다.

본 발명은 골격근세포로 분화시키는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 체세포 또는 성체줄기세포를 유전자 도입 없이 저분자성 물질만을 이용하여 화학 유도 골격근세포 (Chemically Induced skeletal musclecells; CiSMC)로 직접분화하는 방법에 관한 것이다. 본 발명자들은 세포의 에피제넥스와 신호전달을 조절하는 다양한 저분자성 물질을 조합하여 섬유아세포에 처리하여 골격근육세포가 분화되는 조건을 찾은 결과, 저분자 물질을 이용하여 히스톤아세틸화효소저해, Wnt신호 활성화, TGF-beta신호 저해 및 cAMP활성화를 통해 효율적인 골격근육세포가 분화가 유도된다는 사실을 발견하였다.

직접분화시킨 CiSMC는 포유동물의 골근육세포에서 발현되는 주요한 마커인자가 잘 발현이 되고 있음을 확인하였고, 또한 포유동물의 골근육세포와 유사한 자발적 수축 (Spontaneous contraction)을 하는 현상을 관찰함으로써 CiSMC가 기능적으로 골근육세포아 유사하다는 것을 확인하였다. 따라서 유전자 조작없이 저분자성 물질만을 배양액에 처리하여 세포를 키우는 간단한 방법을 통하여 섬유아세포 및 중간엽세포와 같은 성체세포를 골격근육세포로 직접분화하는 기술은 환자 유래 자가세포를 이용하는 안전한 세포치료제 개발에 유용하게 사용될 것으로 기대된다.

또한, 본 발명에 의해 생산된 골격근육세포는 사고나 질병에 의한, 혹은 질병과 동반되는 근육손상, 및 베커 근이영양증 (Becker musculardystrophy) 및 선천성 근위축증 (Congenital musculardystrophy) 등을 포함하는 근골격계 질환을 예방, 치료, 및 개선하기 위한 세포치료제 조성물로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 심근세포와 골격근세포의 분화과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2의 (A)는 MEF 분리하여 6 가지 화합물(VCRFPT)을 포함하는 혼합물을 처리하여 골격근세포로의 분화 유도 과정을 개략적으로 나타낸 도이고, (B)는 면역염색을 이용하여 MF20 및 MyoD의 공동 발현(상위 패널), sarcomeric a Actinin의 발현(중간 패널), 및 myogenin의 발현(하위 패널)을 확인한 도이며, (C)는 qRT-PCR 분석에 의해 정량화된 골격근 특이적 전사체의 발현을 나타낸 도이다.
도 3a 및 도 3b는VCRF로 구성된 혼합물이 섬유아세포의 골격근세포로의 분화 유도에 최적의 혼합물임을 확인한 도면이다.
구체적으로, 도 3a의 (A)는 서로 다른 저분자 화합물의 조합으로 구성된 혼합물을 MEF에 처리하여 골격근세포로의 분화 유도 과정을 개략적으로 나타낸 도이고, (B)는 상기 서로 다른 구성의 혼합물을 처리함에 따라 MF20 양성 콜로니의 발생정도를 정량적으로 나타낸 도이고, (C)는 상기 MF20 양성 콜로니를 면역형광염색한 도이고, (D)는 MF20 및 MyoD의 공동 발현(상위 패널), sarcomeric a Actinin의 발현(중간 패널), 및 myogenin의 발현(하위 패널)을 확인한 도이고, (E)는 MF20 및 MyoD의 발현 정도를 qRT-PCR 분석을 통해 정량화한 도이고, (F)는 근골격근세포 분화에 최적의 혼합물 구성인 VCRF을 나타낸 도이다.
또한, 도 3b의 (A)는 서로 다른 저분자 화합물의 조합으로 구성된 혼합물을 이용하여 MEF를 분화 유도 후 Facs 분석으로 분화된 세포를 분석한 도이고, (B)는 MF20 양성 세포를 정량화한 도이고, (C)는 유세포 분석 결과 도이다.
도 4는 골격근세포로의 분화 유도에 최적의 배양기간을 확인한 도면으로, (A)는 VCRF를 포함하는 배지에 MEF를 배양하는 기간에 따른 골격근세포로의 분화를 개략적으로 나타낸 도이고, (B)는 유세포 분석을 통한 Sarcomeric actinin 양성 세포의 수를 나타낸 도이고, (C)는 MyoD1, Myogenin, Myomaker, 및 Mck의 발현 정도를 나타낸 도이다.
도 5는 사이토카인의 유무에 따른 골격근 특이적 마커의 발현 정도를 나타낸 것으로, (A)는 전근원성 중배엽(premyogenic mesoderm)에 특이적 마커, (B)는 근원성 전구세포(myogenic precursor)에 특이적 마커, (C)는 성숙한 근육세포(mature muscle)에 특이적 마커의 발현 수준을 정량화하여 나타낸 도이다.
도 6은 골격근세포로 분화 유도된 세포의 성숙에 필요한 최적의 혼합물로서 BMP4, Activin A, Chir99021, 및 VEFG로 구성된 혼합물을 확인한 도면으로, (A)는 ACRF 유도 단계 후, MEF를 골격근으로 성숙시키는 과정을 개략적으로 나타낸 도이고, (B)는 VCRF 또는 VCRFPT로 분화 유도 후 사이토카인의 유무에 따른 골격근세포의 성숙 정도를 나타낸 도이고, (C)는 MF20 양성 콜로니를 면역형광염색한 도이고, (D)는 MF20 및 MyoD의 공동 발현(상위 패널), sarcomeric a Actinin의 발현(중간 패널), 및 myogenin의 발현(하위 패널)을 확인한 도이고, (E)는 MF20 및 MyoD의 발현 정도를 qRT-PCR 분석을 통해 정량화한 도이다.
도 7은 골격근세포로 분화 유도된 세포의 성숙에 필요한 최적의 화합물을 확인한 도면으로, (A)는 분화 유도 이후에 src tyrosine kinase inhibitor(PP1)을 추가로 포함하여 골격근으로 성숙시키는 과정을 개략적으로 나타낸 도이고, (B)는 src tyrosine kinase inhibitor의 화학 구조이고, (C)는 PP1을 추가로 포함하여 성숙시킨 세포에서 MF20 및 MyoD이 공동 발현을 확인한 도이고, (D)는 sarcomeric a Actinin 및 MyoD의 공동 발현을 확인한 도이고, (E)는 PP1 추가 없이 사이토카인만으로 성숙시킨 세포에서 MF20 및 MyoD이 공동 발현을 확인한 도이고, (F)는 sarcomeric a Actinin 및 MyoD의 공동 발현을 확인한 도이다.
도 8은 Fsp1-cre:R26RtdTomato 마우스 교배를 통하여 FSP1-dTomato 자손을 생산하는 과정을 모식적 나타낸 도이다.
도 9a는 사이토카인에 의한 세포 성숙 없이 VCRF에 의해 분화 유도된 세포에서 dTomato 및 MF20의 공동 발현(1st 패널), dTomato 및 sarcomeric a Actinin의 공동 발현(2nd 패널), dTomato 및 MyoD의 공동 발현(3th 패널), dTomato 및 Myogenin의 공동 발현(4th 패널)을 확인한 도이다.
도 9b의 (A)는 사이토카인에 의한 세포 성숙 없이 VCRFPT에 의해 분화 유도된 세포에서 dTomato 및 MF20의 공동 발현(상위 패널), dTomato 및 sarcomeric a Actinin의 공동 발현(하위 패널)을 확인한 도이고, (B)는 VCRF에 의해 분화 유도 후 사이토카인에 의한 세포 성숙 과정 이후에 세포에서 dTomato 및 MF20의 공동 발현(상위 패널), dTomato 및 sarcomeric α Actinin의 공동 발현(하위 패널)을 확인한 도이다.
도 10의 (A)는 VCRF 화합물이 수행하는 기능을 모식화한 도이고, (B) Valproic acid, CHIR99021, SB431542, 및 NKH477을 포함하는 혼합물을 이용하여 분화한 세포에서 MF20 및 MyoD의 공동 발현(상위 패널), sarcomeric a Actinin 및 MyoD의 공동 발현(하위 패널)의 발현을 확인한 도이고, (C)는 sodium butyrate, AZD2858, SB431542, 및 NKH477을 포함하는 혼합물을 이용하여 분화한 세포에서 MF20 및 MyoD의 공동 발현(상위 패널), sarcomeric a Actinin 및 MyoD의 공동 발현(하위 패널)의 발현을 확인한 도이다.
도 11은 dermal fibroblast에 VCRF를 처리하여 골격근세포로 분화 유도된 세포의 MF20 및 MyoD의 공동 발현(상위 패널), sarcomeric a Actinin 및 MyoD의 공동 발현(하위 패널)의 발현을 확인한 도이다.
도 12의 (A)는 지방 유래 줄기세포에 Valproic Acid, Repsox, 및 Forskolin로 구성된 혼합물을 처리하여 골격근세포로 분화 유도한 세포에서 αSMA의 발현을 확인한 도면이고, (B)는 Valproic Acid, 및 SB431542, NKH422로 구성된 혼합물을 처리하여 골격근세포로 분화 유도한 세포에서 αSMA의 발현을 확인한 도면이다.
도 13은 본 발명의 골격근세포로 분화 유도용 조성물을 처리하는 경우 골격근세포 마커(MyoD 및 alpha-actinin)는 발현되지만, 심근세포 마커(cTNT 및 Nkx2.5)는 발현되지 않음을 확인한 도면이다.

본 발명은 판히스톤 디아세틸라제 억제제 (Pan-histone deacetylase inhibitor), ALK5 억제제 (activin A receptor type II-like kinase 5 inhibitor), 및 cAMP 시그널링 활성제 (cAMP signaling activator)를 유효성분으로 포함하는, 체세포 또는 성체줄기세포의 골격근세포로의 분화 유도용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어 상기 분화 유도용 조성물은 GSK 억제제 (Glycogen synthase kinase inhibitor)를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, "판히스톤 디아세틸라제 억제제 (Pan-histone deacetylase inhibitor: pan-HDACi)"는 히스톤으로부터 아세틸 그룹을 제거하는 효소의 억제제를 의미한다. 상기 판히스톤 디아세틸라제 억제제의 비제한적인 예로는 발프론산 (Valproic acid), Sodium butyrate,수베로일아닐리드 하이드록삼산 (Suberoylanilide hydroxamic acid), 히드록삼산 (hydroxamic acid), 사이클릭 테트라펩티드 (cyclic tetrapeptide), 뎁시펩티드 (depsipeptides), 트리코스타틴 A (Trichostatin A), 보리노스타트 (Vorinostat), 벨리노스타트 (Belinostat), 파노비노스타트 (Panobinostat), 벤즈아마이드 (Benzamide), 엔티노스타트 (Entinostat), 및 부틸레이트 (butyrate) 등이 있으며, 상기 pan-HDACi는 히스톤으로부터 아세틸 그룹을 제거하는 효소를 억제하는 기능을 수행하는 것이라면 제한되지 아니하나, 바람직하게는 Valproic Acid 또는 butyrate,더욱 바람직하게는 Valproic Acid 또는 sodium butyrate 일 수 있다.

본 발명에 있어서, "GSK 억제제 (Glycogen synthase kinase inhibitor)"는 Wnt 신호전달과정에 관여하는 GSK1/2를 표적으로 하는 저해제를 의미한다. 상기 GSK 억제제의 비제한적인 예로는 Chir99021 (6-(2-(4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-2-yl)pyrimidin-2-ylamino)ethylamino)nicotinonitrile); 1-azakenpaullone (9-Bromo-7,12-dihydro-pyrido[3’,2’:2,3]azepino[4,5-b]indol-6(5H)-one); AZD2858; 3-amino-6-(4-((4-methylpiperazin-1-yl)sulfonyl)phenyl)-N-(pyridin-3-yl)pyrazine-2-carboxamide; BIO ((2’Z,3’E)-6-Bromoindirubin-3’-oxime); ARA014418 (N-(4-Methoxybenzyl)-N’-(5-nitro-l,3-thiazol-2-yl)urea); Indirubin-3’-monoxime; 5-Iodo-indirubin-3’-monoxime; kenpaullone (9-Bromo-7,12-dihydroindolo-[3,2-d][1]benzazepin-6(5H)-one); SB-415286 (3-[(3-Chloro-4-hydroxyphenyl)amino]-4-(2-nitro-phenyl)-1H-pyrrole-2,5-dione); SB-216763 (3-(2,4-Dichlorophenyl)-4-(1-methyl-1H-indol-3-yl)-lH-pyrrole-2,5-dione); Maybridge SEW00923SC (2-anilino-5-phenyl-1,3,4-oxadiazole); (Z)-5-(2,3-Methylenedioxyphenyl)-imidazolidine-2,4-dione; TWS 119 (3-(6-(3-aminophenyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yloxy)phenol); Chir98014 (N2-(2-(4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(1 H-imidazol-1-yl)pyrimidin-2-ylamino)ethyl)-5-nitropyridine-2,6-diamine); SB415286 (3-(3-chloro-4-hydroxyphenylamino)-4-(2-nitrophenyl)-1H-pyrrole-2,5-dione); Tideglusib (2-(1-naphthalenyl)-4-(phenylmethyl)); 및 LY2090314 (3-imidazo[1,2-a]pyridin-3-yl-4-[1,2,3,4-tetrahydro-2-(1-piperidinylcarbonyl)-pyrrolo[3,2,jk][1，4]benzodiazepin-7-yl]) 등이 있으며, 상기 GSK 억제제는 GSK1/2를 표적으로 하는 것이라면 제한되지 아니하나, 바람직하게는 Chir 99021 또는 AZD2858일 수 있다.

본 발명에 있어서, "ALK5 억제제 (ALK-5 kinase inhibitor)"는 ALK5 (activin A receptor type II-like kinase 5)에 결합하여 TGF-β 타입 I의 정상적인 신호전달 과정을 방해하는 물질을 의미하며, 상기 ALK5는 TGF-β 타입 I 리셉터라고도 불리우며, 상기 TGF-β 타입 I (Transforming growth factor-β type I)은 세포증식, 분화 및 다양한 종류의 세포에 다양한 작용을 하는 다기능성 펩타이드로서, 이러한 다기능성은 지방세포형성, 근세포형성, 골세포형성, 상피세포 분화 등 여러 조직의 성장 및 분화에서 중추적인 역할을 한다. 상기 ALK5 억제제 (TGF-β 타입 I 리셉터 억제제: TGF β type I receptor inhibitor)의 비제한적인 예로는 RepSox (1,5-Naphthyridine, 2-[3-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]); SB431452 4-[4-(1,3-benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]benzamide; SB525334 (6-(2-tert-butyl-4-(6-methylpyridin-2-yl)-1H-imidazol-5-yl)quinoxaline); GW788388 (4-(4-(3-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl)pyridin-2-yl)-N-(tetrahydro-2H-pyran-4-yl)benzamide); SD-208 (2-(5-chloro-2-fluorophenyl)-N-(pyridin-4-yl)pteridin-4-amine); Galunisertib (LY2157299, 4-(2-(6-methylpyridin-2-yl)-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl)quinoline-6-carboxamide); EW-7197 (N-(2-fluorophenyl)-5-(6-methyl-2-pyridinyl)-4-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridin-6-yl-1H-imidazole-2-methanamine); LY2109761 (7-(2-morpholinoethoxy)-4-(2-(pyridin-2-yl)-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl)quinoline); SB505124 (2-(4-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-2-tert-butyl-1H-imidazol-5-yl)-6-methylpyridine); LY364947 (Quinoline, 4-[3-(2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]); SB431542 (4-(4-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-5-(pyridin-2-yl)-1H-imidazol-2-yl)benzamide); K02288 (3-[(6-Amino-5-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-3-pyridinyl]phenol]; 및 LDN-212854 (Quinoline, 5-[6-[4-(1-piperazinyl)phenyl]pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]) 등이 있으며, 상기 ALK5 억제제는 TGF-β 타입 I 리셉터에 결합하여 TGF-β I의 정상적인 신호전달 과정을 방해하는 물질이라면 제한되지 아니하나, 바람직하게는 Repsox 또는 SB431452일 수 있다.

본 발명에 있어서, "cAMP 시그널링 활성제 (cAMP signaling activator)"는 cAMP 신호를 활성화시키는 물질을 의미한다. 상기 cAMP 시그널링 활성제의 비제한적인 예로는 포스콜린 (Forskolin), isoproterenol, NKH 477, isoprotereno (Chemical based), PACAP 1-27, 및 PACAP 1-38 (peptide based) 등이 있으며, 상기 cAMP 시그널링 활성제는 cAMP 신호를 활성화 시키는 것이라면 제한되지 아니하나, 바람직하게는 Forskolin 또는 NKH477일 수 있다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 Activin A, BMP4(Bone morphogenetic protein 4), VEGF(Vascular endothelial growth factor), GSK 억제제(Glycogen synthase kinase inhibitor) 및 src tyrosine kinase inhibitor로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는, 골격근세포의 성숙화 유도용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 src tyrosine kinase inhibitor는 src의 인산화를 방해하는 물질을 의미한다. src tyrosine kinase inhibitor의 비제한적인 예로는 PP1 (1-(1,1-dimethylethyl)-3-(4-methylphenyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine), PP2 (3-(4-chlorophenyl)-1-(1,1-dimethylethyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine), SU6656 (2,3-dihydro-N,N-dimethyl-2-oxo-3-[(4,5,6,7-tetrahydro-1H-indol-2-yl)methylene]-1H-indole-5-sulfonamide), 및 Dasatinib (N-(2-chloro-6-methylphenyl)-2-[[6-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-2-methyl-4-pyrimidinyl]amino]-5-thiazolecarboxamide) 등이 있으며, 상기 src tyrosine kinase inhibitor는 src의 인산화를 방해하는 물질이라면 제한되지 아니하나, 바람직하게는 PP1일 수 있다.

상기 골격근세포의 성숙화 유도용 조성물은 골격근세포의 성숙을 유도하는 1종 이상의 사이토카인(cytokine)을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 골격근세포를 유도함에 있어서, 출발 세포 (모세포)의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 체세포(somatic cell) 또는 성체줄기세포(stem cell)를 이용할 수 있다. 체세포의 경우 그 종류에 제한되지 아니하며, 예를 들어, 태아기 (embryonic period)의 체세포 이외에 성숙한 (matured) 체세포일 수 있으나, 바람직하게는 섬유아세포일 수 있다. 성체줄기세포의 경우에도 그 종류에 제한되지 아니하나, 바람직하게는 중간엽줄기세포일 수 있고, 더욱 바람직하게는 지방 유래 중간엽줄기세포일 수 있다. 유도 골격근육세포를 질병의 치료에 이용하는 경우에는 환자로부터 분리된 세포를 이용하는 것이 바람직하며, 예를 들어, 질병에 관여하는 체세포나 질병치료에 관여하는 체세포 등을 이용할 수 있다. 본 발명에서 섬유아세포 및 성체줄기세포는 인간과 마우스, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 동물 유래의 모든 섬유아세포 및 성체줄기세포를 포함한다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 판히스톤 디아세틸라제 억제제, GSK 억제제, ALK5 억제제, 및 cAMP 시그널링 활성제를 유효성분으로 포함하는 배지에서 체세포 또는 성체줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 체세포 또는 성체줄기세포의 골격근세포로의 분화 유도 방법을 제공한다.

상기 분화 유도 방법에 있어서, 성체줄기세포의 골격근세포로의 분화 유도의 경우 상기 배지는 GSK 억제제를 포함하지 않을 수 있으며, 상기 배양은 골격근육세포로 분화를 유도할 수 있는 기간이라면 제한이 없이 이루어질 수 있으나, 바람직하게는 5 내지 25일 동안 수행될 수 있고, 보다 구체적으로, 체세포의 경우 4 내지 12일 동안, 성체줄기세포의 경우 20 내지 25일 동안 수행될 수 있다.

또한, 상기 분화 유도 방법에 있어 상기 단계 이후에 Activin A, BMP4(Bone morphogenetic protein 4), VEGF(Vascular endothelial growth factor), GSK 억제제(Glycogen synthase kinase inhibitor), 및 src tyrosine kinase inhibitor로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는 배지에서 골격근세포로 분화 유도된 세포를 성숙시키는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 성숙시키는 단계는 상기 분화가 유도된 세포가 성숙할 수 있는 기간이라면 제한이 없이 이루어질 수 있으나, 바람직하게는 1 내지 5일 동안 수행될 수 있고, 더욱 바람직하게는 2 내지 4일 동안 수행될 수 있다. 또한, 본 발명의 분화 유도 방법을 사용하는 경우, 종래의 알려진 화학적 유도 세포 분화 방법과 비교하여, 보다 짧은 시간의 처리만으로 목적하는 세포로의 분화를 효율적으로 유도할 수 있다는 장점이 있다.

상기 체세포 또는 성체줄기세포를 배양하는 배지는 당해 분야에서 섬유아세포 또는 중간엽줄기세포 배양에 통상적으로 사용되는 배지를 모두 포함한다. 배양에 사용되는 배양액은 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 이에 한정되는 것은 아니나, 상기 배지는 DMEM/F12, N2, B27, bFGF (basic fibroblast growth factor), 및 EGF (epidermal growth factor)를 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 배양을 위한 배지는 당업계에 알려진 기본 배지를 제한 없이 사용할 수 있다. 기본 배지는 인위적으로 합성하여 제조할 수 있으며, 상업적으로 제조된 배지를 사용할 수도 있다. 상업적으로 제조되는 배지의 예를 들면, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium),MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM (α-Minimal essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium) 및 Isocove's Modified Dulbecco'sMedium 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, DMEM 배지일 수 있다.

본 발명의 실시예에서는, 다양한 분화 유도 물질 등 저분자성 물질 중에서 보다 효율적으로 골격근육세포를 유도할 것으로 예상되는 4종의 저분자성 물질(VCRF)을 선별하였으며, 선별된 저분자성 물질을 통하여 직접분화를 시도한 결과 4종의 저분자성 물질 처리를 통하여 근육세포와 유사한 자발적 수축 (Spontaneous contraction) 현상을 관찰하였으며, 이러한 방법으로 유사 골격근육세포를 유도하였을 때 매우 높은 수율로 직접분화됨을 확인하였다(실시예 2 내지 4 참조).

또한, 본 발명의 실시예에서는, 상기 VCRF를 구성하는 각각의 화합물과 동일한 기능을 수행하는 다른 화합물을 처리하는 경우에도 동일한 효과를 확인하였다. 구체적으로 ALK5 inhibitor 기능을 수행하는 화합물은 RepSox 대신 SB431452를 이용하였고, cAMP signaling activator 기능을 수행하는 화합물은 Forskolin 대신 NKH477을 사용하였으며, HDAC inhibitor 기능을 수행하는 화합물은 valproic acid 대신 sodium butyrate를 사용하였고, GSK inhibitor 기능을 수행하는 화합물은 Chir99021 대신 AZD2858을 이용하여 그 동일한 효과를 확인하였다(실시예 8 참조).

또한, 본 발명의 실시예에서는, 본 발명의 분화 유도용 조성물을 이용하여 배아 섬유아세포 뿐만 아니라 피부 섬유아세포의 근골격세포로의 분화가 효과적으로 일어남을 확인하였으며(실시예 9 참조), 또한, 섬유아세포 뿐만 아니라 인간 지방 유래 줄기세포의 근골격세포로의 분화 유도에 본 발명의 분화 유도용 조성물이 효과적임을 확인하였다(실시예 10 참조).

또한, 본 발명의 실시예에서는, 골격근육 세포 직접 분화 조건에서는 심근세포가 전혀 만들어지지 않는다는 것을 확인함으로써, 본 발명에서 제안하는 조성물 및 분화방법으로는 심근세포 분화는 일어나지 않고 골격근세포분화만 일어난다는 것을 확인하였다 (실시예 11 참조).

또한, 본 발명의 실시예에서는, 지방 유래 줄기세포의 근골격세포로의 분화 유도에 있어서 VCRF를 처리한느 경우보다 VRF를 처리하는 경우 더 많은 수의 근육세포를 관찰하였는바, 상기로부터 성체줄기세포의 근골격세포로의 분화 유도에 있어 GSK inhibitor의 결여가 더 효과적임을 확인하였다(실시예 10 참조). 상기로부터 성체줄기세포의 근골격세포로의 분화 유도용 조성물에 있어 GSK inhibitor를 포함하지 않는 것에 분화 효율 상승 효과가 있음은 자명하다.

상기 4종의 저분자 화합물을 포함하는 분화 유도용 조성물로 골격근육세포를 효율적으로 유도할 수 있다. 상기 분화 유도용 조성물은 GSK inhibitor를 포함하지 않는 것으로 할 수 있다. 또한, 상기 분화 유도용 조성물을 구성하는 각각의 저분자 화합물의 농도는 체세포 또는 성체줄기세포를 골격근세포로 분화 유도할 수 있는 농도이면 특별히 제한이 없으며, 예를들어 Valproic acid 및 sodium butyrate은 1~1000 μM, chir99021 및 AZD2858은 0.001~100 nM, RepSox 및 SB431452는 1~100 μM, Forskolin 및 NKH477은 1~100 μM의 농도로 첨가될 수 있다.

체세포를 직접분화 (Direct conversion) 방법을 이용하여 골격근육세포로 유도하는 대부분의 방법은 외부 유전자를 도입하는 방식으로 이루어지고 있다. 다만, 바이러스를 이용하여 유전자를 도입하는 것은 외부 유전자의 무작위적인 삽입 (integration)으로 인한 유전적 불안정성 (genomic instability)을 야기하여, 향후 환자에 임상적용 시 암이 발생할 가능성이 있다. 이러한 이유로 인해 점차적으로 외부 유전자를 주입하지 않고 저분자성 물질 (small molecule)을 이용하는 방법들이 제시되고 있는 실정이다. 그러나 최근 다양한 저분자성 화합물들을 이용하여 직접분화를 유도하는 연구가 활발하게 진행되고 있음에도 불구하고 최소한 하나의 유전자는 이용되고 있으며, 유전자 도입 없이는 여전히 인간 체세포로부터 원하는 골격근세포로 전환할 수 없는 상태이다.

그러나, 본 발명은 외부 유전자의 도입 없이 체세포로부터 골격근육세포를 유도하는 유전적 안정성이 확보된 방법으로써, 기존의 유전자를 이용한 유전적 결손을 유도하는 방법을 해결하고자 고안된 것이다.

본 발명에서는 저분자성 물질의 조합만을 이용하여 체세포를 골격근육세포로 직접분화하였다. 이에, 기존의 기술이 가진 많은 문제점들을 극복함으로써, 환자를 위한 세포치료제로 활용 가능성이 매우 높다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 방법에 의해 골격근세포로 분화 유도된 세포 및/또는 상기 방법에 의해 분화된 골격근세포를 포함하는 골격근 질환 치료용 세포치료제를 제공한다. 본 명세서에서 세포치료제에 포함되는 세포로서 골격근세포로 분화 유도된 세포, 분화 유도된 골격근세포, 및 분화된 골격근세포는 서로 혼용될 수 있다.

본 발명에서 용어 “골격근세포”는 골격근의 기능을 수행하는 세포를 의미하며, 상기와 같은 기능을 수행하는 세포라면 제한이 없으나, 태아형 골격근세포 또는 성체 골격근세포일 수 있다. "골격근세포로 분화 유도된 세포"는 장래에 기능적인 골격근세포가 될 수 있는 능력을 가진 근원성 전구세포, 근육 전구세포, 근육모세포 등의 모든 분화 단계의 세포를 제한 없이 포함하며, 이하에 기재된 적어도 하나, 바람직하게는 복수의 방법에 의하여 적어도 하나, 바람직하게는 복수의 마커나 기준으로 확인할 수 있는 세포를 의미한다. 골격근세포 특이적인 각종 마커의 발현은, 공지의 생화학적 또는 면역화학적 방법으로 검출할 수 있으며, 이러한 방법은 제한 없이 사용할 수 있다. 이러한 방법에서, 골격근 전구세포 또는 골격근세포에 결합하는 마커 특이적인 다클론성 항체 또는 단일 클론 항체를 사용할 수 있다. 개개의 특이적 마커를 표적으로 하는 항체는 시판용이나 공지의 방법에 의해 제조된 것을 제한 없이 사용할 수 있다. 골격근 전구세포 또는 골격근세포에 특이적인 마커의 예로는 MF20, sarcomeric Actinin, MyoD 및 Myogenin 등을 들 수 있다. 또는, 골격근 전구세포 또는 골격근세포 특이적 마커의 발현은, 특정한 방법에 한정되지 않으나, 역전사 효소 매개 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)이나 혼성화 분석인, 임의의 마커 단백질을 코딩하는 mRNA를 증폭, 검출, 해석하기 위한 종래에 흔히 사용되는 분자생물학적 방법으로 확인할 수 있다. 골격근 전구세포 또는 골격근세포에 특이적인 마커 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 이미 공지되어 있어 유전자은행 (GenBank)과 같은 공공 데이터베이스로부터 얻을 수 있으며, 프라이머 또는 프로브로 사용하기 위하여 필요한 마커 특이적 서열을 용이하게 결정할 수 있다. 또한, 체세포의 골격근육세포로의 분화를 확인하기 위해, 생리학적 기준을 추가적으로 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 골격근 질환은 유전적 또는 후천적 요인에 의해 유발되는 골격근의 손상, 골격근 세포의 수 감소, 골격근 세포의 기능 약화 등에 의한 질환을 의미하고, 상기 골격근 질환의 비제한적인 예로는 베커근이영양증 (Becker musculardystrophy), 선천성근위축증 (Congenital musculardystrophy), 듀켄씨근이영양증 (Duchenne musculardystrophy), 원위근이영양증 (Distal musculardystrophy), 에머리 드라이푸스 근이영양증 (Emery-Dreifuss musculardystrophy), 안면견갑상완근위축증 (Facioscapulohumeral musculardystrophy), 지대근이영양증 (Limb-girdle musculardystrophy), 근긴장성이영양증 (Myotonic musculardystrophy), 및 안구인두근위축증 (Oculopharyngeal musculardystrophy) 등이 있으며, 이 외에도 후천적 요인에 의한 근감소증, 근위축증, 근경화증, 금염좌, 및 염증성 근육질환 등이 있다.

본 발명의 용어 "세포치료제 (cellular therapeutic agent)"란, 인간으로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품 (미국 FDA 규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 이러한 세포가 질병의 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.

본 발명에서 용어, "치료"는 상기 세포치료제의 투여로 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 세포치료제의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 비경구 투여, 예를 들어, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 세포치료제는 세포 치료에 일반적으로 사용되는 약제학적 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack PublishingCompany, Easton, PA, 1995).

또한, 상기 세포치료제는 골격근세포로 분화 유도된 세포 또는 분화 유도된 골격근세포가 표적 부위로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다.

본 발명의 세포치료제는 상기 질환의 치료를 위하여 치료학적으로 유효한 양의 세포치료제 조성물을 포함할 수 있다. '치료학적으로 유효한 양 (therapeutically effective amount)'은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다.

본 발명의 세포치료제에 포함되는 조성물은 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로 최적의 함량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 포함하는 것이 중요하다. 예컨대, 본 발명의 골격근세포로 분화 유도된 세포 또는 분화 유도된 골격근세포의 1일 투여량은 1.0×10⁴ 내지 1.0×10¹⁰세포/kg 체중, 바람직하게는 1.0×10⁵ 내지 1.0×10⁹ 세포/kg 체중을 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 유효성분의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 치료방법에서 본 발명의 세포치료제를 직장, 정맥내 (intravenous therapy, i.v), 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

본 발명은 포유동물에게 치료학적으로 유효한 양의 본 발명의 상기 세포치료제 조성물을 투여하는 것을 포함하는 치료방법을 제공한다. 여기에서 사용된 용어 포유동물은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험 준비 및 실험 방법

1-1. 동물실험 (세포 분리 및 배양)

마우스 배아 섬유아세포 (Mouse embryonic fibroblasts: MEF)는 배아기 13.5일째 C57BL.6 마우스 배아로부터 분리하였다. 머리, 척수 및 내부 장기를 조심스럽게 제거하여 신경능선세포 (neural crest cells)의 오염 가능성을 제거하였다. 0.25 % 트립신-EDTA (GIBCO)로 조직의 나머지 부분을 절단하고, 트립신 처리하여 단일 세포 현탁액을 제조하였다. 이어서 10 % FBS, 1 % 페니실린 및 스트렙토마이신 (Welgene)이 첨가된 고-글루코스 DMEM (Welgene)에서 배양하였다. 혈통 추적 실험을 위하여, FSP-Cre 마우스를 R26RtdTomato 마우스 (Jackson laboratories)와 교배시켜 MEF에서 tdTomato를 특이적으로 발현하는 섬유아세포를 갖는 마우스를 생산하였다. MEF를 상기와 유사한 과정으로 동정하였다.

1-2. 골격근 형성 (Generation of skeletal muscle)

마우스 배아 섬유아세포 (MEF)를 상온에서 2 시간 동안 1:100 마트리겔 (BD Biosciences)로 예비 코팅한 후, 플레이트당 60,000 세포의 밀도로 35 mm 플레이트에 씨딩(seeding)하고, VCRFPT 또는 VCRF의 화합물의 조합을 포함하는 Muscle Reprogramming 배지 (knockout DMEM (Gibco), 15 % knockout serum replacement, 5 % FBS (Gibco), 1 % Glutamax (Gibco), 1 % 비필수아미노산 (Gibco), 0.1 mM β-메르캅토에탄올 (Sigma) 및 1x 페니실린/스트렙토마이신)에서 배양하였다. 상기 VCRFPT 또는 VCRF의 화합물 조합은 각각 0.5 mM Valproic Acid (V), 10 μM CHIR99021 (C), 10 μM RepSox (R), 50 μM Forskolin (F), 5 μM Parnate (P), 및 1 μM TTNPB (T)로 이루어지는 군으로부터 선택되었다 (Medchemexpress). 섬유아세포는 3 일마다 배지를 교체하면서 6 일 동안 분화를 유도 (induction phase)하였다.

분화 유도 6 일 후, 다양한 사이토카인 혼합물 (25 ng/ml BMP4 (Preprotech), 10 ng/ml Activin A (R&D), 10 ng/ml VEGF (Preprotech), 10 μM CHIR99021 (Medchemexpress), 200 μg/ml Phospho Ascorbic Acid (Sigma), 0.15 mM Monothioglycerol (Sigma), 및 1x B27 보충제 (Lifetechnologies))을 포함하는 MRF에서 배양하였다. Pax3의 경우, 유도 단계 후에 양성 근원중배엽 확장 MEF는 EM (DMEM/F12 (Welgene), 1% 페니실린 및 스트렙토마이신, 0.5% BSA (Gibco), 1% Glutamax, 1% 비필수아미노산 (Gibco), 200 μg/ml Phospho Ascorbic Acid, 10 ng/ml BMP4, 0.15 mM Monothioglycerol, 1x B27 보충제, 10 μM CHIR99021, 및 20 ng/ml FGF2)에서 배양하였다.

1-3. 면역염색 (Immunostaining)

유도 단계 또는 성숙 단계 이후에 마우스 배아 섬유아세포로부터 분화된 골격근을 각각 6 일 또는 9 일에 수확하고, 1x PBS (Welgene)로 2 회 세척한 후, 4 % 파라포름알데히드 (Sigma-Aldrich)로 10 분 동안 고정시키고 0.25 % 트리톤 X-100 (USB Corporation) 함유 PBS를 22 ℃에서 10 분 동안 처리한 후, PBS로 각각 2 회씩 5 분 동안 세척하였다. PBS에서 1 % BSA (Amresco), 22.52 mg/ml 글리신 (Affymetrix), 및 0.1 % Tween 20 (Affymetrix)를 포함하는 차단 용액으로 60 분간 차단하고, 블로킹 용액으로 희석한 적절한 일차 항체로 4 ℃에서 밤새 염색하였다. 사용된 항체는 마우스 단클론성 MF20 (DSHB, 희석 1:20), 마우스 단클론성 anti-sarcomeric actinin (A7732, Sigma-Aldrich, 희석 1:100), 토끼 다클론성 anti MyoD (C-20) (sc-304, Santacruz 희석 1:20), 마우스 단클론성 anti myogenin (ab1835, Abcam, 희석 1:50), 및 마우스 anti Pax3 (MAB2457-SP, R&D, 희석 1:100)이다. 일차 항체로 배양 후, 세포를 PBST에서 3 회 세척하고, 1:100으로 희석한 Alexa-488-접합 염소 이차 anti-마우스 항체 (A11001, Invitrogen) 또는 Alexa-563-접합 염소 이차 anti-토끼 항체 (A21428, Invitrogen)로 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 세포를 1 μg/ml DAPI (D9542, Sigma-Aldrich)와 함께 실온에서 5 분간 배양하여 핵을 염색하고, 형광 현미경 (IX71S1F3, Olympus)을 사용하여 시각화하였다.

1-4. QuantitativeRT-PCR

유도 단계 또는 성숙 단계 후에 배아 섬유아세포로부터 유래된 마우스 골격근을 각각 6 일 또는 9 일에 수확하고, RNeasy Mini Kit (QIAGEN)로 총 RNA를 추출한 후, 총 RNA 5 μg을 RNA to cDNA EcoDry Premix (Oligo dT, Clontech)를 사용하여 cDNA로 합성하였다. qRT-PCR은 Bio-Rad Prime PCR 기기에서 SYBR Green PCR Master Mix (Bio-Rad)를 사용하여 수행하였으며, 총 RNA를 사용하여 P19 세포로부터 유래된 심근세포로부터의 심장 마커 유전자의 mRNA 수준을 평가하였다. qRT-PCR 조건은 95 ℃에서 30 초, 60 ℃에서 15 초, 72 ℃에서 15 초의 40 주기였다. 이 연구에서 사용된 프라이머는 하기 표 1과 같다.

Primer Name	Forward Primer (5’-3’)	서열번호	Reverse Primer (5’-3’)	서열번호
Tcf15	TTCTGTCTCAGCAACCAGCG	1	GGCTACACCCCTCACTTTCAA	2
Mesp1	GCTCGGTCCCCGTTTAAGC	3	ACGATGGGTCCCACGATTCT	4
Tbx6	ATGTACCATCCACGAGAGTTGT	5	CCAAATCAGGGTAGCGGTAAC	6
Six1	ATGCTGCCGTCGTTTGGTT	7	GGTGATTGTGAGGCGAGAACT	8
Six4	CCACGGTTTTTCCCTGACCC	9	GGTTGCATAGTTAGTGTTGCTGA	10
Myf5	CACCACCAACCCTAACCAGAG	11	AGGCTGTAATAGTTCTCCACCTG	12
Nppa	GTGCGGTGTCCAACACAGAT	13	TCCAATCCTGTCAATCCTACCC	14
Myl2	ATCGACAAGAATGACCTAAGGGA	15	ATTTTTCACGTTCACTCGTCCT	16
Lbx1	CGTCCGTGCGGAGAAGTTAC	17	CCTCCAGCCCCTTAAAGGTCT	18
Pax7	CTCAGTGAGTTCGATTAGCCG	19	AGACGGTTCCCTTTGTCGC	20
Pax3	TTTCACCTCAGGTAATGGGACT	21	GAACGTCCAAGGCTTACTTTGT	22
Myog	GCAATGCACTGGAGTTCG	23	ACGATGGACGTAAGGGAGTG	24
Myod1	CCCCGGCGGCAGAATGGCTACG	25	GGTCTGGGTTCCCTGTTCTGTGT	26
Myh6	CAACAACCCATACGACTACGC	27	ACATCAAAGGGCCACTATCAGTG	28
Myh3	GCATAGCTGCACCTTTCCTC	29	GGCCATGTCCTCAATCTTGT	30
Msgn1	CTTCTGACACCGCTGGTCTG	31	GTGACTGCCGTAGCCATCG	32
Meox1	TGGCCTATGCAGAATCCATTCC	33	TGGATCTGAGCTGCGCATGTG	34
T	CTGGACTTCGTGACGGCTG	35	TGACTTTGCTGAAAGACACAGG	36
Actb	AAATCGTGCGTGACATCAAA	37	AAGGAAGGCTGGAAAAGAGC	38

1-5. 유세포 분석 (flow cytometry quantitation)

분화된 CiSMC를 수확하고, FIX & PERM (Thermofisher)을 이용하여 세포 고정 및 투과성을 높였다. 계속해서 세포를 항체희석 버퍼에 처리한 후 (1xPBS, 5% BSA, 0.1% Tween20) 해당 마커에 결합하는 마우스 단클론성항체를 세포에 넣어서 하루밤 결합시켰다. 일차합체 결합된 세포는 1xPBS로 닦고 Alexa-488이 결합된 이차항체를 처리하여 3시간 동안 반응시켰다. 계속해서 세포를 1x PBS로 닦은 후 세포배양액에 넣고 유세포분석을 시도하였다.

실시예 2. 화학적 유도 골격근세포 (CiSMC) 분화를 유도하는 화학 물질의 확인

유전적 조작 없이 골격근 생성을 유도하기 위하여, 실시예 1-2의 방법으로 유도 화학 물질인 VCRFPT를 마우스 배아 섬유아세포에 9 일 동안 처리하였다.

그 결과, 도 1A에 나타낸 바와 같이, 몇 개의 근세포 (myocytes)가 자연적으로 수축하는 것을 확인하였고, 6 일째에는 근세포 (myocytes) 또는 근관세포 (myotube) 유사 구조를 확인하였다 (이하, 모든 후속 실험에서 6 일 처리를 사용).

나아가, 상기 myocyte/myotube 유사 구조가 골격근의 성질을 가진다는 것을 확인하고 검증하기 위하여, 상기 실시예 1-3 및 1-4의 방법에 따라 골격근 마커의 발현을 확인하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, myocyte/myotube 유사 구조 모두 MF20 (pan MHC 마커), sarcomeric Actinin, 및 MyoD 또는 Myogenin과 같은 성숙 골격근 마커에 대해 면역 양성이었으며, MF20 및 sarcomeric actinin의 세포질 위치 (Cytosolic localization), MyoD 핵 위치 (nuclear localization), 및 상기 마커들의 근육 분화 (myogenesis) 및 공-발현 (co-expression)을 확인하였다 (B). 또한, 성숙한 골격근 마커인 MyoD 및 Myogenein 의 발현이 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비하여 수차례의 폴드 (fold) 증가함을 확인하였다 (C). 이러한 결과는, 상기 myocyte/myotube 유사 구조가 골격근의 성질을 가지는바, 화학-유도 골격근 합성이 가능함을 의미한다.

실시예 3. 섬유아세포의 골격근세포로의 분화 유도에 필요한 최적의 혼합물 확인

상기 실시예 2의 결과에 기초하여, 골격근 유도에 결정적인 최소 혼합물을 확인하고 유도 과정을 최적화하기 위하여, 혼합물의 각 성분을 한번에 하나 또는 둘 씩 제거하여 형성되는 근육 (muscle) 콜로니를 정량적 및 정성적으로 평가하였다.

그 결과, 도 3a 및 3b에서 확인할 수 있는 바와 같이, 제거되는 경우 골격근세포로의 분화 유도를 상당히 약화시키는 효과를 나타내는 화학 물질은 Valproic acid, Chir99021, Repsox 및 Forskolin을 포함한다는 것을 확인하였다. 보다 구체적으로, Chir99021 (Wnt signaling activator) 제거 시, MF20 양성 세포를 관찰할 수 없을 정도로 근육 형성을 가장 약화시키는 효과를 나타냈으며, Repsox (TGF β inhibitor), Forskolin (cAMP agonist) 순으로 그 효과가 나타났다. 또한, Valproic acid (HDAC inhibitor)를 제거 시에도 콜로니 수의 현저한 감소를 확인한 반면, Parnate (epigenetic modulator) 또는 TTNPB (retinoic acid receptor agonist) 제거 시에는 상기 혼합물 (VCRFPT)과 비교할 때, 중간 정도의 효과가 나타나는 것을 확인하였다(B). 즉, 한 번에 Valproic acid, Chir 99021, Repsox 및 Forskoin 중 두 가지의 성분을 제거하는 경우, 상호 비슷한 수준으로 콜로니 수가 감소된 반면, Parnate 및 TTNPB를 제거하는 경우에는 콜로니 형성이 2 배 이상 향상되고, TTNPB의 제거만으로도 콜로니 형성을 향상시키는 것을 확인하였다.

또한, MF20 면역 양성 콜로니 정성적 결과, VCRF가 최대 수의 콜로니를 형성하고, 그 다음으로 VCRFP가, 다음으로 VCRF 및 VCRFPT가 비슷한 수의 콜로니를 형성하는 것을 확인하였다(C). 또한, 향상된 MF20 양성 콜로니는 sarcomeric actinin, MyoD 및 Myogenin 발현을 증가시키는 것을 확인하였으며(D), VCRF 처리 시 MyoD 및 Myogenin 발현이 유의한 수준에서 높게 발현되는 것을 추가로 확인하였다(E).

상기 결과를 종합한 결과, 섬유아세포의 골격근세포로의 분화 유도를 위한 최적의 화*j물의 조합 (Chir99021, Repsox, Forskolin, 및 Valproic acid)을 확인하였다 (F).

실시예 4. 섬유아세포의 골격근세포로의 분화 유도에 필요한 최적의 배양기간 확인

상기 실시예 3의 결과에 기초하여, 섬유아세포에 VCRF를 처리하여 배양하는 기간에 따른 골격근세포로의 분화 효율을 확인하였다. 보다 구체적으로, 섬유아세포를 VCRF의 혼합물을 포함하는 배지에 배양하고, 배양 후 6, 8, 10, 12, 15일 경과시 상기 실시예 1-5에 따른 유세포분석을 이용하여 Sarcomeric actinin 양성 세포를 계측하였다. 또한, 6, 8, 10, 12, 15일 경과시 골격근세포 특이적 마커(MyoD 및 Myogenin)와 성숙한 근육 세포 특이적 마커(Mck 및 Myomaker)의 발현 수준을 확인하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 배양하는 기간이 길어짐에 따라 Sarcomeric actinin 양성 세포의 수가 증가하고, 배양 10일 후 가장 많은 수를 계측할 수 있었다. 그러나, 배양 후 10일이 경과함에 따라 Sarcomeric actinin 양성 세포의 수가 증가 감소함을 확인할 수 있었다(B). 마커 발현 수준의 측정 결과도 유세포분석 결과와 마찬가지로 배양 10일 후에 골격근세포 특이적 마커 및 성숙한 근육 세포 특이적 마커의 발현 밴드가 가장 굵게 나타남을 확인할 수 있었다(C).

상기 결과는, 골격근세포로의 분화 유도에 있어 VCRF을 포함하는 배지에 섬유아세포를 4 내지 12일 동안 배양함으로써 높은 효율로 골격근세포를 수득할 수 있음을 의미한다.

실시예 5. 골격근세포로의 유도 또는 성숙 단계에서의 사이토카인의 효과 확인

상기 실시예　결과를 바탕으로, 각 단계에서 사이토카인의 효과를 확인하기 위하여, VCRF 또는 VCRFPT 처리에 대하여 섬유아세포 직접분화 단계의 mRNA 발현을 분석하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 사이토카인 처리는 VCRF 및 VCRFPT 모두와 비교하여, 모두 전근원성 중배엽(premyogenic mesoderm) 특이적 마커 (Msgn1 및 T)의 발현을 향상시키는 것을 확인하였으며, 근원성 전구세포(myogenic precursor) 특이적 마커 (pax3 및 pax7) 및 성숙한 근육 세포(mature muscle)특이적 마커 (MyoD 및 Myogenin)의 발현을 증진시키는 것을 확인하였다.

이러한 결과는, 본 발명의 화학 물질 (VCRF)과 함께 사이토카인을 처리하는 경우 CiSMC에 대한 섬유아세포의 직접분화 효율이 현저히 증가한다는 것을 의미하며, 또한, VCRF는 사이토카인 유무에 관계없이 VCRFPT에 비해 높은 효율을 갖는 것을 알 수 있다.

실시예 6. VCRF에 의해 유도된 myocytes 또는 myotubes의 성숙에 필요한 최적의 화합물 또는 혼합물 확인

상기 실시예 3의 결과에 기초하여, VCRF에 의해 유도된 myocytes 또는 myotubes를 추가로 성숙시키기 위하여, 6 일 동안의 초기 유도 단계 후 근육 분화에 관여하는 것으로 알려진 여러 사이토카인과 함께 BMP4, Activin A, Chir99021, 및 혈관내피세포성장인자 (Vascular endothelial growth factor: VEGF)를 포함하는 혼합물 또는 src tyrosine kinase inhibitor(PP1)을 추가로 포함하는 배지에 세포를 배양하여 골격근세포의 성숙도를 확인하였다. 실험의 개략적인 모식도는 도 6(A) 및 도 7(A)에 나타내었다.

BMP4, Activin A, Chir99021, 및 혈관내피세포성장인자 (VEGF)를 포함하는 혼합물을 추가로 포함하는 배지에서 배양한 결과, 도 6(B) 및 (C)에 나타낸 바와 같이, 초기 유도 단계 후, BMP4, Chir99021, Activin A 및 VEGF로 3 일간 처리 시, 근육 성숙이 향상되는 것을 확인하였으며, 보다 구체적으로, VCRF 또는 VCRFTP 유도 CiMSC 모두에서 사이토카인을 처리한 경우에 더 두꺼운 다중 핵 구조로 변형된 길쭉한 스핀들 모양의 세포 구조를 관찰할 수 있었다(B). 나아가, 사이토카인 처리 시 보다 두껍고 눈에 띄는 관 모양의 구조에서 묘사 된 바와 같이 MF20 발현 범위를 향상시켰으며, 3 일 경과 후에는 성숙을 더 향상시키지 못하였는바(C), 6 일 동안의 유도 단계 이후, 3 일 동안 추가로 성숙시킨 결과 획득된 성숙한 근육세포는 MF20 및 sarcomeric actinin의 동시 발현으로, MyoD와 Myogenin을 발현하는 두드러진 다핵 구조를 보였고 (4D), MyoD 및 Myogenin의 전사 수준에서 사이토카인의 효과는 유사하게 나타났다 (E).

한편, src tyrosine kinase inhibitor(PP1)을 추가로 포함하는 배지에서 배양한 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 초기 유도 단계 후 PP1을 포함하는 배지에서 3일 동안 성숙시킨 경우 근육이 성숙된 양상을 나타냄을 확인할 수 있었으며, 사이토카인만 처리한 경우보다 PP1과 함께 처리하여 성숙시킨 근육세포가 보다 두꺼운 스핀들 모양의 다중 핵 세포 구조를 갖음을 확인할 수 있었다.

실시예 7. 화학적 유도 골격근육세포 ( CiSMC ) 혈통 추적을 통한 섬유아세포로부터 분화된 골격근세포 확인

배아기 (13.5 일) 마우스 배아에서 분리된 마우스 배아 섬유아세포 (Mouse embryonic fibroblasts: MEF)는 근육전구세포 (myogenic progenitor cells)를 불순물로 포함할 수 있다. 포함된 근육전구세포는 배양기간 동안 골격근세포로 분화할 수 있다. 따라서, 수득된 골격근세포가 불순물로 포함된 근육전구세포로부터 분화된 것이 아님을 확인하고, 오롯이 섬유아세포로부터 분화된 것임을 검증하기 위하여, Fsp1-cre:R26RtdTomato 마우스를 사용하여 혈통 추적을 수행하였다. 보다 구체적으로 FSP1-dTomato 자손을 얻었으며, 상기 FSP1-dTomato 마우스 배아에서 MEF를 분리하고, VCRF 또는 VCRFPT를 6 일 동안 처리하여 근육세포 특이적 마커 및 dTomato의 발현 수준을 확인하였으며, 사이토카인의 추가적 처리 유무에 따른 마커의 발현 수준도 확인하였다. 실험의 개략적인 모식도는 도 8에 나타내었다.

그 결과, 도 9a 및 도 9b에 나타낸 바와 같이, 사이토카인 처리의 유무와 상관없이 VCRF 또는 VCRFPT을 처리하여 수득된 골격근세포는 FSP1-dTomato과 MF20 마커를 동시에 발현함을 확인할 수 있었다.

dTomato 형광은 FSP1 단백질에 의해 제어되므로, 섬유아세포 기원 세포에서만 형광을 발하는 것을 고려할때, 상기 결과는, VCRF 또는 VCRFPT 처리에 따라 수득된 골격근세포가 섬유아세포로부터 분화되었음을 의미한다.

실시예 8. 동일 기능의 다른 화합물의 혼합을 이용한 섬유아세포의 골격근세포로의 분화 유도 효과 확인

상기 실시예 3의 결과를 통해서 섬유아세포의 골격근세포로의 분화 유도에 Valproic acid(V), CHIR99021(C), RepSox(R), 및 Forskolin(F) 을 포함하는 혼합물(VCRF)이 가장 효과적임을 알 수 있었다, Valproic acid는 HDAC inhibitor로서 기능하며, CHIR99021는 GSK inhibitor로 기능하고, RepSox는 ALK5 inhibitor로 기능하고, Forskolin는 cAMP signaling activator로 기능하는바, 상기 이용된 각각의 화합물과 동일한 기능을 수행하는 다른 화합물을 이용하는 경우에도 효과적인 섬유아세포의 골격근세포로의 분화 유도가 이루어 지는지 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 3의 방법과 동일하게 분화 유도 혼합물이 포함하는 화합물만 달리하여 실험하였다. ALK5 inhibitor 기능을 수행하는 화합물은 RepSox 대신 SB431452 (10μM) 를 이용하였고, cAMP signaling activator 기능을 수행하는 화합물은 Forskolin 대신 NKH477 (5μM)을 사용하였으며, HDAC inhibitor 기능을 수행하는 화합물은 valproic acid 대신 sodium butyrate (500μM)를 사용하였고, GSK inhibitor 기능을 수행하는 화합물은 Chir99021 대신 AZD2858 (10nM)을 이용하였다.

그 결과, 도 10에서 확인할 수 있는 바와 같이, Valproic acid, CHIR99021, SB431542, 및 NKH477을 포함하는 혼합물을 이용하여 분화를 유도하는 경우에도 섬유아세포의 골격근세포로의 분화가 효과적으로 유도되었으며(B), sodium butyrate, AZD2858, SB431542, 및 NKH477을 포함하는 혼합물을 이용하여 분화를 유도하는 경우에도 마찬가지 결과를 얻었다(C).

상기 결과로부터, 상기 조합의 화합물의 혼합물 이외에도 상기 화합물과 동일한 기능을 갖는 다른 화합물의 혼합에 의해서도 효과적으로 섬유아세포로부터 골격근세포로 분화를 유도할 수 있음을 알 수 있다.

실시예 9. 피부 섬유아세포의 골격근세포로의 분화 유도 효과 확인

상기 실시예의 결과를 통해서, 히스톤 디아세틸라제 억제제 (histone deacetylase inhibitor), GSK 억제제 (GSK inhibitor), ALK5 억제제 (ALK5 inhibitor), 및 cAMP 시그널링 활성제 (cAMP signaling activator)를 포함하는 배지에 마우스 배아 섬유아세포(MEF)를 배양하여 골격근세포로의 분화를 효과적으로 유도할 수 있음을 확인하였다. 본 실시예에서는 상기 화합물의 혼합물을 이용하여 일반적인 체세포로부터 골격근세포로의 분화 유도가 가능한지 확인하기 위하여, 배아 섬유아세포가 아닌 피부 섬유아세포(skin fibroblast)를 상기 혼합물을 포함하는 배지에서 배양하여 골격근세포 특이적 분화 마커의 발현을 확인하였다. 어린생쥐의 피부조직을 37℃ 에서 collagenase로 하루 밤 처리한 후 세포배양접시에 깔아서 자라나는 피부 섬유아세포를 사용하였다. 실험방법은 MEF의 경우와 같다.

그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 골격근의 대표 마커들의 발현을 확인함으로써 피부유래 섬유아세포도 본 발명의 분화조건에서 골격근으로의 분화가 일어나는 것을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과는 섬유아세포가 어떤 조직에서 분리되었냐에 상관없이 본 발명의 분화조건에서 골격근으로 분화될 수 있다는 것을 의미한다.

실시예 10. 중간엽줄기세포의 골격근세포로의 분화 유도 효과 확인

상기 실시예 9의 결과를 통해서, 히스톤 디아세틸라제 억제제, GSK 억제제, ALK5 억제제, 및 cAMP 시그널링 활성제를 포함하는 배지에 체세포를 배양하여 골격근세포로의 분화를 효과적으로 유도할 수 있음을 확인하였다. 본 실시예에서는 상기 화합물의 혼합물을 이용하여 체세포가 아닌 성체줄기세포의 골격근세포로의 분화 유도가 가능한지 확인하기 위하여, 인간 지방 유래 성체줄기세포(humanadipose-derived stem cell)를 상기 혼합물을 포함하는 배지에서 배양하여 골격근세포 특이적 마커의 발현유무를 통해 인간 지방 유래 성체줄기세포의 골격근 분화 여부를 확인하였다. 골격근 분화에 사용한 인간 지방 유래 줄기세포는 Lonza에서 구입하였고, high glucose DMEM (Gibco), 15% fetal bovine serum (Gibco) 조건에서 배양하였다. 실험방법은 MEF의 경우와 같다.

Chemical cocktail	Abundance of Muscles
Valproic Acid, Chir99021, Repsox, Forskolin,	+
Valproic Acid, Repsox	-
Valproic Acid, Repsox, Forskolin	++
Repsox, Forskolin, Chir99021	-
Repsox, Forskolin	-
Valproic Acid, Forskolin	-

상기 표 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 지방 유래 줄기세포에 VCRF를 처리하는 경우, 체세포와 마찬가지로, 골격근세포로의 분화가 유도됨을 확인할 수 있었다. 지방유래 성체줄기세포 분화와 관련된 보다 자세한 조건을 확인하기 위해 분화에 사용된 VCRF 네 가지 화합물을 여러가지로 조합하여 분화를 시도하였다 (표 2). 이러한 실험 결과 Valporic acid, Repsox, Forskolin이 없는 조건에서는 전혀 분화가 일어나지 않는 것을 확인함으로써 HDAC inhibitor, ALK-5 inhibitor, cAMP activator가 각각 분화에서 필수적이라는 것을 확인할 수 있었다. 하지만, GSK inhibitor를 포함하지 않는 경우 오히려 그 분화 효율이 뛰어남을 확인할 수 있었다 (도 12(A)).

한편 섬유아세포의 경우와 같이 분화와 관련된 신호 조절의 중요성을 확인하기 위해 Repsox대신 다른ALK-5 inhibitor인 SB431542, Forskolin 대신 다른 cAMP signaling activator인 NKH422를 처리하였을 때도 같은 효율로 분화가 일어나는 것을 확인하였다 (도 12(B)). 이러한 결과는 본 실시예에서 사용한 특정 화합물뿐 아니라 각 화학물의 기능을 갖는 동종의 화합물을 사용해도 성체줄기세포를 골격근세포로 분화할 수 있다는 것을 의미한다.

실시예 11. VCFR의 골격근세포 특이적 분화 유도 확인

본 발명의 분화 유도 조성물에 의한 분화가 골격근세포 특이적 분화이고, 심근세포로의 분화를 유도하지 않는 것을 확인하기 위하여, 상기 실시예 1-2 내지 1-4의 방법으로 실험을 수행하였다.

그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, VCFR를 처리한 세포에서 골격근세포 마커(MyoD 및 alpha-actinin)는 발현되지만, 심근세포 마커(cTNT 및 Nkx2.5)는 발현되지 않음을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, 본 발명에 ?나 골격근육세포로 직접분화 조건에서는 심근세포가 전혀 만들어지지 않고, 골격근세포로의 분화만 일어남을 알 수 있다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> RESEARCH & BUSINESS FOUNDATION SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> Process for the chemically induced skeletal muscle differentiation <130> MP17-318 <150> KR 1020170022896 <151> 2017-02-21 <160> 38 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Tcf15_F <400> 1 ttctgtctca gcaaccagcg 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Tcf15_R <400> 2 ggctacaccc ctcactttca a 21 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Mesp1_F <400> 3 gctcggtccc cgtttaagc 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Mesp1_R <400> 4 acgatgggtc ccacgattct 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Tbx6_F <400> 5 atgtaccatc cacgagagtt gt 22 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Tbx6_R <400> 6 ccaaatcagg gtagcggtaa c 21 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Six1_F <400> 7 atgctgccgt cgtttggtt 19 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Six1_R <400> 8 ggtgattgtg aggcgagaac t 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Six4_F <400> 9 ccacggtttt tccctgaccc 20 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Six4_R <400> 10 ggttgcatag ttagtgttgc tga 23 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Myf5_F <400> 11 caccaccaac cctaaccaga g 21 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Myf5_R <400> 12 aggctgtaat agttctccac ctg 23 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Nppa_F <400> 13 gtgcggtgtc caacacagat 20 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Nppa_R <400> 14 tccaatcctg tcaatcctac cc 22 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Myl2_F <400> 15 atcgacaaga atgacctaag gga 23 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Myl2_R <400> 16 atttttcacg ttcactcgtc ct 22 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Lbxl_F <400> 17 cgtccgtgcg gagaagttac 20 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Lbxl_R <400> 18 cctccagccc cttaaaggtc t 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Pax7_F <400> 19 ctcagtgagt tcgattagcc g 21 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Pax7_R <400> 20 agacggttcc ctttgtcgc 19 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Pax3_F <400> 21 tttcacctca ggtaatggga ct 22 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Pax3_R <400> 22 gaacgtccaa ggcttacttt gt 22 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Myog_F <400> 23 gcaatgcact ggagttcg 18 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Myog_R <400> 24 acgatggacg taagggagtg 20 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Myod1_F <400> 25 ccccggcggc agaatggcta cg 22 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Myod1_R <400> 26 ggtctgggtt ccctgttctg tgt 23 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Myh6_F <400> 27 caacaaccca tacgactacg c 21 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Myh6_R <400> 28 acatcaaagg gccactatca gtg 23 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Myh3_F <400> 29 gcatagctgc acctttcctc 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Myh3_R <400> 30 ggccatgtcc tcaatcttgt 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Msgn1_F <400> 31 cttctgacac cgctggtctg 20 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Msgn1_R <400> 32 gtgactgccg tagccatcg 19 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Meox1_F <400> 33 tggcctatgc agaatccatt cc 22 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Meox1_R <400> 34 tggatctgag ctgcgcatgt g 21 <210> 35 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_T_F <400> 35 ctggacttcg tgacggctg 19 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_T_R <400> 36 tgactttgct gaaagacaca gg 22 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Actb_F <400> 37 aaatcgtgcg tgacatcaaa 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_Actb_R <400> 38 aaggaaggct ggaaaagagc 20

Claims

판히스톤 디아세틸라제 억제제 (Pan-histone deacetylase inhibitor), ALK5 억제제 (activin A receptor type II-like kinase 5 inhibitor), GSK 억제제 (Glycogen synthase kinase inhibitor), 및 cAMP 시그널링 활성제 (cAMP signaling activator)를 유효성분으로 포함하는, 체세포의 골격근세포로의 분화 유도용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 Parnate 및/또는 TTNPB를 추가로 포함하는, 골격근세포로의 분화 유도용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 체세포는 섬유아세포 (fibroblast)인 것을 특징으로 하는, 골격근세포로의 분화 유도용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 판히스톤 디아세틸라제 억제제는 발프론산 (Valproic acid), Sodium butyrate, 수베로일아닐리드 하이드록삼산 (Suberoylanilide hydroxamic acid), 히드록삼산 (hydroxamic acid), 사이클릭 테트라펩티드 (cyclic tetrapeptide), 뎁시펩티드 (depsipeptides), 트리코스타틴 A (Trichostatin A), 보리노스타트 (Vorinostat), 벨리노스타트 (Belinostat), 파노비노스타트 (Panobinostat), 벤즈아마이드 (Benzamide), 엔티노스타트 (Entinostat), 및 부틸레이트 (butyrate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 골격근세포로의 분화 유도용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 ALK5 억제제는 RepSox (1,5-Naphthyridine, 2-[3-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]); SB431452 4-[4-(1,3-benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]benzamide; SB525334 (6-(2-tert-butyl-4-(6-methylpyridin-2-yl)-1H-imidazol-5-yl)quinoxaline); GW788388 (4-(4-(3-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl)pyridin-2-yl)-N-(tetrahydro-2H-pyran-4-yl)benzamide); SD-208 (2-(5-chloro-2-fluorophenyl)-N-(pyridin-4-yl)pteridin-4-amine); Galunisertib (LY2157299, 4-(2-(6-methylpyridin-2-yl)-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl)quinoline-6-carboxamide); EW-7197 (N-(2-fluorophenyl)-5-(6-methyl-2-pyridinyl)-4-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridin-6-yl-1H-imidazole-2-methanamine); LY2109761 (7-(2-morpholinoethoxy)-4-(2-(pyridin-2-yl)-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl)quinoline); SB505124 (2-(4-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-2-tert-butyl-1H-imidazol-5-yl)-6-methylpyridine); LY364947 (Quinoline, 4-[3-(2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]); SB431542 (4-(4-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-5-(pyridin-2-yl)-1H-imidazol-2-yl)benzamide); K02288 (3-[(6-Amino-5-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-3-pyridinyl]phenol]; 및 LDN-212854 (Quinoline, 5-[6-[4-(1-piperazinyl)phenyl]pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl])로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 골격근세포로의 분화 유도용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 cAMP 시그널링 활성제는 포스콜린 (Forskolin), isoproterenol, NKH 477, isoprotereno (Chemical based), PACAP 1-27, 및 PACAP 1-38 (peptide based)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 골격근세포로의 분화 유도용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 GSK 억제제는 Chir99021 (6-(2-(4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-2-yl)pyrimidin-2-ylamino)ethylamino)nicotinonitrile); 1-azakenpaullone (9-Bromo-7,12-dihydro-pyrido[3’,2’:2,3]azepino[4,5-b]indol-6(5H)-one); AZD2858; 3-amino-6-(4-((4-methylpiperazin-1-yl)sulfonyl)phenyl)-N-(pyridin-3-yl)pyrazine-2-carboxamide; BIO ((2’Z,3’E)-6-Bromoindirubin-3’-oxime); ARA014418 (N-(4-Methoxybenzyl)-N’-(5-nitro-l,3-thiazol-2-yl)urea); Indirubin-3’-monoxime; 5-Iodo-indirubin-3’-monoxime; kenpaullone (9-Bromo-7,12-dihydroindolo-[3,2-d][1]benzazepin-6(5H)-one); SB-415286 (3-[(3-Chloro-4-hydroxyphenyl)amino]-4-(2-nitro-phenyl)-1H-pyrrole-2,5-dione); SB-216763(3-(2,4-Dichlorophenyl)-4-(1-methyl-1H-indol-3-yl)-lH-pyrrole-2,5-dione); Maybridge SEW00923SC (2-anilino-5-phenyl-1,3,4-oxadiazole); (Z)-5-(2,3-Methylenedioxyphenyl)-imidazolidine-2,4-dione; TWS 119 (3-(6-(3-aminophenyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yloxy)phenol); Chir98014 (N2-(2-(4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(1 H-imidazol-1-yl)pyrimidin-2-ylamino)ethyl)-5-nitropyridine-2,6-diamine); SB415286 (3-(3-chloro-4-hydroxyphenylamino)-4-(2-nitrophenyl)-1H-pyrrole-2,5-dione); Tideglusib (2-(1-naphthalenyl)-4-(phenylmethyl)); 및 LY2090314 (3-imidazo[1,2-a]pyridin-3-yl-4-[1,2,3,4-tetrahydro-2-(1-piperidinylcarbonyl)-pyrrolo[3,2,jk][1，4]benzodiazepin-7-yl])로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 골격근세포로의 분화 유도용 조성물.
판히스톤 디아세틸라제 억제제 (Pan-histone deacetylase inhibitor), ALK5 억제제 (activin A receptor type II-like kinase 5 inhibitor), 및 cAMP 시그널링 활성제 (cAMP signaling activator)를 유효성분으로 포함하는, 성체줄기세포의 골격근세포로의 분화 유도용 조성물.
제8항에 있어서,
상기 조성물은 GSK 억제제 (Glycogen synthase kinase inhibitor)를 추가로 포함하는, 골격근세포로의 분화 유도용 조성물.
제8항에 있어서,
상기 성체줄기세포는 중간엽줄기세포인 것을 특징으로 하는, 골격근세포로의 분화 유도용 조성물.
판히스톤 디아세틸라제 억제제 (Pan-histone deacetylase inhibitor), ALK5 억제제 (activin A receptor type II-like kinase 5 inhibitor), GSK 억제제 (Glycogen synthase kinase inhibitor), 및 cAMP 시그널링 활성제 (cAMP signaling activator)를 유효성분으로 포함하는 배지에서 체세포를 배양하는 단계를 포함하는, 체세포의 골격근세포로의 분화 유도 방법.
제11항에 있어서,
상기 배지는 Parnate 및/또는 TTNPB를 추가로 포함하는 것인, 골격근세포로의 분화 유도 방법.
제11항에 있어서,
상기 체세포는 섬유아세포 (fibroblast)인 것을 특징으로 하는, 골격근세포로의 분화 유도 방법.
제11항에 있어서,
상기 배양은 5 내지 25일 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 골격근세포로의 분화 유도 방법.
제11항에 있어서,
상기 방법은 상기 단계에 이후에 Activin A, BMP4(Bone morphogenetic protein 4), VEGF(Vascular endothelial growth factor), GSK 억제제(Glycogen synthase kinase inhibitor), 및 src tyrosine kinase inhibitor로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는 배지에서 골격근세포로 분화 유도된 세포를 성숙시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 골격근세포로의 분화 유도 방법.
제15항에 있어서,
상기 성숙시키는 단계는 1 내지 5일 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 골격근세포로의 분화 유도 방법.
판히스톤 디아세틸라제 억제제 (Pan-histone deacetylase inhibitor), ALK5 억제제 (activin A receptor type II-like kinase 5 inhibitor), 및 cAMP 시그널링 활성제 (cAMP signaling activator)를 유효성분으로 포함하는 배지에서 성체줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 성체줄기세포의 골격근세포로의 분화 유도 방법.
제17항에 있어서,
상기 배지는 GSK 억제제 (Glycogen synthase kinase inhibitor)를 추가로 포함하는 것인, 골격근세포로의 분화 유도 방법.
제17항에 있어서,
상기 성체줄기세포는 중간엽줄기세포인 것을 특징으로 하는, 골격근세포로의 분화 유도 방법.
제17항에 있어서,
상기 배양은 5 내지 25일 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 골격근세포로의 분화 유도 방법.
제17항에 있어서,
상기 방법은 상기 단계에 이후에 Activin A, BMP4(Bone morphogenetic protein 4), VEGF(Vascular endothelial growth factor), GSK 억제제(Glycogen synthase kinase inhibitor), 및 src tyrosine kinase inhibitor로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는 배지에서 골격근세포로 분화 유도된 세포를 성숙시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 골격근세포로의 분화 유도 방법.
제21항에 있어서,
상기 성숙시키는 단계는 1 내지 5일 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 골격근세포로의 분화 유도 방법.
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