KR102076917B1 - 자가조립 나노 입자를 제조하기 위한 유전자 재조합 발현 벡터 시스템 및 이를 이용하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 목적 단백질의 N-말단에 인간유래 라이실 tRNA 합성효소 중 N-말단 도메인 RID (RNA-interaction domain)를 신규 융합파트너로 사용하고, C-말단에 페리틴이 결합된 자가조립 나노 입자 구조체, 이를 제조할 수 있는 발현벡터 및 이의 신규한 용도에 관한 것이다. 본 발명에 의하면 종래 수용성 생성이 어렵던 60kDa ~110 kDa의 불용성 목적 단백질을 재접힘 없이 수용성으로 대량 생산할 수 있고, 목적 단백질이 면역적으로 의미 있는 구조로 표면에 제시되는 자가조립 나노 입자를 형성할 수 있으므로, 면역원성을 증가시키는 백신 및 다양한 질병을 진단하는 진단 항원으로 활용할 수 있다.

Description

자가조립 나노 입자를 제조하기 위한 유전자 재조합 발현 벡터 시스템 및 이를 이용하는 방법{Expression vector system for preparing recombinant self-assembled nanoparticles, and method of using the same}

본 발명은 자가조립 나노 입자를 제조하기 위한 유전자 재조합 발현 벡터 시스템 및 이를 이용하는 방법에 관한 것이다.

바이러스는 외피 바이러스 (enveloped virus)와 외피가 없는 바이러스(non-enveloped virus)로 크게 2종류로 구별된다. 외피가 없는 바이러스의 경우 바이러스 표피가 캡시드 단백질만으로 이루어져 있으며 따라서 캡시드 단백질만으로 VLP로의 자가조립이 가능하다. 그러나, 외피가 있는 바이러스는 바이러스 형태를 이루기 위해 막 구성요소(membrane component)가 필수적으로 요구된다. 따라서 바이러스 유사입자(VLP)로의 자가조립을 위하여는 표면 항원 이외에도 막 구성요소를 필요로 한다. 즉 envelope-바이러스유사입자(VLP) 자가조립 공정에 단량체 항원 단백질의 폴딩 뿐 아니라 이의 지질막이 필수적으로 요구된다. 그러나 지질막은 구조적으로 균일하지 않으며 특성화하기가 어려워 VLP로의 형성은 고등세포 (동물세포, 곤충세포, 인체유래세포, 또는 효모 등)에서만 생성할 수 있었다. 따라서, 막 구성요소 대신 자가조립 가능한 단백질을 스캐폴드(scaffold)로 재조합하여 발현시킴으로써 다양한 항원 단백질을 공통적으로 구축하는 방법이 필요하다.

페리틴(ferritin)은 대부분의 생물 종에 존재하며 자가 조립되어 나노 입자를 형성하는 특징을 가지고 있다. 종래 연구에서 인간 유래 페리틴 또는 헬리코박터 파일로리 페리틴(Helicobacter pylori ferritin)을 이용하여 진핵세포(곤충, 동물세포)에서 바이러스 나노 입자를 형성하였다(L. He, N. de Val et al.: Presenting native-like trimeric HIV-1 antigens with self-assembling nanoparticles. Nat Commun, 7, 12041 (2016) doi:10.1038/ncomms12041, H. M. Yassine et al. : Hemagglutinin-stem nanoparticles generate heterosubtypic influenza protection. Nature medicine, 21(9), 1065-1070 (2015)). 그러나, 진핵세포 생산 시스템은 비용이 높고, 생산성이 낮으며 대량 생산공정이 어려운 문제점이 있었다.

이를 해결하기 위해서는 대장균을 사용하여 페리틴 나노입자 구조체를 생산하는 방법의 개발이 필요하다. 그러나 대장균에서 외래 단백질을 발현하는 경우 단백질의 접힘이 어려운 문제가 있어, 재접힘 공정이 추가됨에 따른 비용 및 시간이 증가되는 문제가 있다.

상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 본 발명의 목적은 대장균에서 수용성 발현이 어려운 목적 단백질을 수용성으로 생성하고 자가 조립하여 안정한 형태의 나노 입자를 형성할 수 있는 재조합 발현벡터, 및 상기 발현벡터로 형질 전환된 숙주세포를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 발현 벡터 및 숙주세포를 이용하여 수용성 융합 단백질 및 나노 입자를 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 제조방법으로 제조된 나노 입자를 포함하는 바이러스 진단용 조성물, 약학 조성물 또는 백신 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명자들은 목적 단백질의 N-말단에 인간유래 라이실 tRNA 합성효소 중 N-말단 도메인 RID (RNA-interaction domain)를 신규 융합파트너로 사용 및 C-말단에 페리틴이 결합된 나노 입자 구조체를 제조할 수 있는 발현벡터를 제작하였고, 이를 이용하여 종래 수용성 생성이 어렵던 60kDa ~110 kDa의 불용성 목적단백질을 재접힘 없이 수용성으로 생성하였다. 또한 철 이온의 농도를 조절함으로써 나노 입자의 형성 및 수율이 향상될 수 있음을 확인하였으며, 나노 입자 표면에 원하는 항원 단백질을 면역적으로 가치 있는 구조로 제시하여 외래유래 항원을 표면에 제시 하는 나노 입자가 기존의 모노머 단백질보다 백신 및 진단용으로 효과가 크게 증대됨을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

즉, 본 발명에 의하면 이하의 발명이 제공된다.

1) 목적 단백질; 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드; 페리틴(ferritin);을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 자가조립 나노 입자 제조용 발현 벡터.

2) 상기 펩타이드는 사람 유래 라이실 tRNA 합성효소로부터 분리한 N-말단 도메인(hLysRS N-terminal appended RNA interacting domain; hRID)의 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것인, 벡터.

3) 상기 페리틴은 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 것인, 벡터.

4) 상기 벡터는 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 페리틴을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 사이에 링커를 더욱 포함하는 벡터.

5) 상기 링커는 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 SSG 링커인 벡터.

6) 상기 목적 단백질은 항원, 항체, 세포수용체, 효소, 비정형 단백질, 구조 단백질 및 세포 단백질로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것인 벡터.

7) 상기 목적 단백질은 바이러스 항원이 나노입자에 제시된 면역원성 에피토프가 삼합체 형태인 것인 벡터.

8) 상기 면역원성 에피토프가 삼합체 형태인 바이러스는 중동호흡기증후군 코로나바이러스, 인플루엔자바이러스 H5N1, 인간면역결핍바이러스(human immunodeficiency virus; HIV), 광견병바이러스(rabies virus; RABV), 중증급성호흡기증후군바이러스(Severe Acute Respiratory Syndrome coronavirus; SARS-CoV)등으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 벡터.

9) 상기 발현벡터로 형질 전환된 숙주세포.

10) 상기 숙주세포는 에스케리키아(Escherichia)속 세균; 바실러스 바실러스 (Bacillus)속 세균; 슈도모나스 (Pseudomonas)속 세균; 유산균; 효모; 동물세포; 및 곤충 세포로 이루어진 군에서 선택되는 것인 형질 전환된 숙주세포.

11) (a) 목적 단백질; 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드; 및 페리틴(ferritin);을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;

(b) 상기 발현 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계;

(c) 상기 형질전환체를 배양하여 목적 단백질-페리틴 융합단백질의 발현을 유도하는 단계; 및

(d) 상기 발현된 목적 단백질-페리틴 융합단백질의 자가조립에 의해 형성된 나노 입자를 정제하는 단계;를 포함하는 자가조립 나노 입자의 제조방법.

12) 상기 단계 (c)에서 형질전환체를 철 이온이 포함된 배지에서 배양하는 것인 제조방법.

13) 상기 제조방법에 의해 제조되고, 목적 단백질 및 페리틴이 융합된 융합단백질 단량체 24개를 포함하는 나노 입자.

14) 상기 발현 벡터 또는 상기 나노 입자를 포함하는 바이러스 감염 진단용 조성물.

15) 상기 발현 벡터 또는 상기 나노 입자를 포함하는 면역 증강용 백신 조성물.

본 발명에 따른 자가조립 나노 입자 제조용 벡터는 숙주 세포에서 목적 단백질-페리틴 융합단백질의 수용성 발현을 현저하게 증진시킬 수 있고, 그 생산 효율을 높일 수 있다.

또한, 본 발명의 벡터에 의하면 자가조립에 의해 나노 입자를 형성하여 표면에 목적 단백질을 제시할 수 있어 질병의 진단에 이용할 수 있고, 외래 항원이 표면에 제시된 나노 입자의 경우 다양한 면역 반응을 증가시켜 백신 및 치료제로 활용할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 발현 벡터의 구조 및 이를 이용하여 자가조립 나노 입자를 제조하는 개략적인 개념을 도시한 도면으로서, 도 1a는 목적 단백질(RBD, S1, HAgd)의 N-말단에 RID 융합단백질 결합 및 C-말단에 페리틴이 결합된 단백질이 자가 조립되어 나노 입자 플랫폼을 형성시키는 발현 벡터의 도메인 개략도이고, 도 1b는 RID가 목적 단백질-페리틴 융합 단백질 단량체에 수용성 및 접힘을 촉진시킨 후 절단되어 적절하게 접힌 융합 단백질이 삼량체 구조를 형성하고, 8개의 삼량체가 조립되어 나노 입자를 제조하는 과정을 보여주는 개념도이다.
도 2는 페리틴과 목적 단백질 사이의 링커가 융합 단백질의 수용성 발현 및 나노 입자 형성에 미치는 효과를 확인한 도면으로, 도 2a는 MODELER 및 ClusPro를 이용한 컴퓨터 모델링에 의해 SSG 링커가 가장 안정적이고 구조화된 삼량체를 형성하는 것을 확인한 3D-구조이고, 도 2b는 SDS-PAGE을 통해 hRID 융합 파트너 및 링커의 존재 또는 부재 하에, 다양한 온도 조건(37℃, 30℃, 18℃)에서 RBD-FR, hRID-RBD-FR, RBD-SSG-FR, hRID-RBD-SSG-FR 및 hRID-RBD-ASG-FR의 수용성을 비교한 결과이다. 또한, 도 2c는 MERS-CoV RBD 나노 입자 단백질의 SSG linker 결합 여부에 따라 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 및 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것이고, 도 2d는 negative-stain TEM 사진을 통해 나노 입자의 형성을 비교한 결과이다.
도 3은 RID가 나노 입자 단백질의 수용성 증진에 미치는 효과를 확인한 도면으로, 도 3a는 SDS-PAGE을 통해 hRID 융합 파트너가 존재할 때 MERS-CoV의 S1 단백질과 페리틴의 융합 단백질의 수용성이 증가함을 확인한 결과이고, 도 3b는 hRID 융합 파트너가 존재할 때 HAgd 단백질과 페리틴 융합 단백질의 수용성이 증가함을 확인한 결과이고, 도 3c는 다양한 온도조건(37℃, 30℃, 18℃)에서 사람 유래 페리틴을 이용하였을 때 hRID-RBD-HFR의 수용성을 비교한 결과이다.
도 4는 페리틴이 나노 입자 조립에 미치는 효과를 확인한 도면으로, 도 4a는 사람 유래 페리틴을 이용하였을 때 hRID-RBD-HFR 나노 입자가 형성된 것을 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)로 확인한 결과이고, 도 4b는 negative-stain TEM 사진을 통해 hRID-RBD-HFR 나노 입자의 형성을 확인한 결과이다. 도 4c는 대장균 유래 페리틴을 이용하였을 때 hRID-S1-SSG-FR 나노 입자가 형성된 것을 SEC과 SDS-PAGE로 확인한 결과이고, 도 4d는 negative-stain TEM 사진을 통해 hRID-S1-SSG-FR 나노 입자의 형성을 확인한 결과이다. 도 4e는 Influenza H5N1 HAgd 나노 입자인 hRID-HAgd-FR을 TEV protease로 hRID를 cleavage한 후 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)로 분리한 결과이다. 이때 cleavage된 HAgd-FR과 cleavage 되지 않은 hRID-HAgd-FR의 SDS-PAGE 분석과 negative-stain TEM 사진을 통해 나노 입자의 형성을 확인한 결과이다.
도 5는 철 이온이 페리틴 융합 나노 입자 수율에 미치는 효과를 확인한 도면으로, 도 5a는 다양한 농도의 철 이온을 배지에 처리하여 대장균을 배양한 후 정제한 나노 입자의 생성량을 SDS-PAGE 분석으로 정량하여 Fe²⁺ 농도에 따른 MERS-CoV RBD 나노 입자의 형성 및 생성 수율을 확인한 결과이고, 도 5b는 SDS-PAGE 분석 및 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 Fe²농도에 따른 나노 입자의 형성을 비교한 결과이다.
도 6은 RNA가 단백질의 수용성 유지 및 나노 입자의 자가조립에 미치는 효과를 hRID 돌연변이를 통해 확인한 결과로서, 도 6a의 좌측은 hRID(WT, 2m, 9m)-RBD-FR의 용해도에 대한 RNase A 처리를 통한 RNA 제거 시 RNA의 단백질 안정성이 유지되는지 아가로스 겔에서 분석한 결과이고, 우측은 수용성 층에 RNase A를 처리한 후 원심 분리하여 수용성(SS') 및 불용성(SP') 분획으로 분리하고 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯으로 분석한 결과이다. 도 6b 내지 6e는 RAN가 나노 입자의 자가 조립에 미치는 효과를 확인한 결과로, 도 6b는 hRID의 point mutation에 차이에 따른 크기 배제 크로마토그래피 결과 비교 (좌측) 및 SDS-PAGE 로 sample 분획 별 확인(우측)한 결과이다. 도 6c는 hRID의 point mutation 차이에 따른 RBD-FR 나노 입자 형성을 투과전자현미경(TEM)으로 확인한 결과이고, 도 6d는 동적 광 산란법(DLS)을 이용하여 RBD-FR (W, 2m, 9m)에 따른 intensity distribution diameter 측정한 결과이다.
도 7은 페리틴 융합 나노 입자의 진단 항원으로의 이용 가능성을 확인한 도면으로, RBD-FR 나노 입자와 293cell 유래 RBD 단백질(양성 대조군)을 마이크로플레이트에 코팅한 후 MERS-CoV 감염 환자(n=4)로부터 얻은 혈청을 이용하여 ELISA를 수행하였을 때 대장균에서 생산한 페리틴 융합 나노입자가 양성 대조군과 유사하게 MERS-CoV에 감염된 4명의 환자 혈청과 특이적으로 높은 민감성을 가짐을 확인한 결과이다. (모든 혈액은 1:100에서 1/2로 희석하여 사용하였다. 모든 데이터는 n=2를 이용하여 사용한 결과이다.)
도 8은 마우스에 MERS-CoV RBD 나노 입자를 면역하여 나타난 다양한 항체 면역반응을 확인한 결과이다. 이 결과는 IgG (a), IgG1 (b), IgG2a (c) and IgG2b (d)의 Endpoint titer를 측정한 결과이다. 모든 데이터는 n=5를 이용하여 사용한 결과이다. (OD, optical density)
도 9는 MERS-CoV RBD 나노 입자를 면역화 된 마우스 혈청이 MERS-CoV RBD(5ug/ml)와 hDPP4 수용체(5ug/ml) 사이의 상호 작용을 억제 하는 것을 확인한 도표이다. 이는 항-RBD mouse sera(RBD-[SSG]-FR, RBD-FR and RBD)를 면역화한 사용하였다. FR-면역화 mouse serum은 negative control이다. 모든 혈액은 1:10에서 1/2로 희석하여 사용하였다. 모든 데이터는 n=5를 이용하여 사용한 결과이다.
도 10은 Influenza H5N1 HAgd 나노 입자인 hRID-HAgd-FR와 HAgd-FR 생쥐 혈청을 이용한 Hemagglutinin inhibition(HI) assay 분석 및 Plaque Reduction Neutralization Test (PRNT) 분석 결과이다. PBS와 hRID-FR은 negative control이다. 모든 데이터는 n=5를 이용하여 사용한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

일 측면에서, 본 발명은 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드; 및 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 3'-말단에 결합된 페리틴;을 포함하는 자가조립 나노 입자 제조용 발현 벡터를 제공한다.

하기 도 1은 본 발명에 따른 발현 벡터의 구조(도 1a) 및 이를 이용하여 자가조립 나노 입자를 제조하는 개략적인 개념을 도시한 도면(도 1b)으로서, hRID가 목적 단백질-페리틴 융합 단백질 단량체에 수용성 및 접힘을 촉진시킨 후 절단되어 적절하게 접힌 융합 단백질이 삼량체 구조를 형성하고, 8개의 삼량체가 조립되어 나노 입자를 제조하는 과정을 보여주는 개념도이다.

본 발명의 "목적 단백질(target protein)"은 당업자가 대량으로 생산하고자 하는 단백질로서, 재조합 발현벡터에 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하여 숙주세포에서 발현이 가능한 모든 단백질을 의미한다. 본 발명에서 "목적 단백질"은 숙주세포에서 페리틴과 융합된 형태로 발현되고 페리틴에 의해 자가 조립된 나노 입자의 내부에는 존재하지 않으며, 상기 나노 입자의 표면에 위치하게 된다.

본 발명의 '목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드'는 목적 단백질과 페리틴의 융합 단백질을 수용성 형태로 발현시킬 수 있다고 보고된 펩타이드로서, 예를 들어 GST(Glutathione S transferase), 말토오스 결합 단백질, 유비퀴틴, 타오레독신 등이 포함되며, 바람직하게는 rRID, mRID, hRID, LysRS와 같은 융합 단백질에서 선택될 수 있고, 가장 바람직하게는 사람 유래 라이실 tRNA 합성효소로부터 분리한 N-말단 도메인(hLysRS N-terminal appended RNA interacting domain; hRID)의 아미노산 서열을 포함하여 구성될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "RID(RNA interaction domain)"은 RNA와 기타 단백질 간의 상호작용에 관여하는 고유한 N-말단 연장부위(70 아미노산)를 의미하며, 인간 유래 라이실 tRNA 합성 효소로부터 분리한 것이다. 본 발명의 바람직한 일실시예에서는, RID에 태그 서열을 결합한 tag-RID(서열번호 1로 표시됨)를 박테리아에서 목적 단백질의 수용성 발현을 위한 결합 파트너로 사용하였다.

본 발명자들은 이전 연구에서 상호작용 하는 RNA가 샤페론처럼 작용하기 때문에 RID가 응집되기 쉬운 단백질의 용해도를 향상시킬 수 있음을 확인하였으며, RID의 돌연변이가 야행형 보다 단백질의 수용성 발현을 증가시키는 것을 확인한 바 있다. 본 발명에서는 상기 RID를 자가조립 나노입자의 제조에 적용하기 위하여, 상기 RID가 융합단백질의 수용성 발현뿐 아니라 단백질 접힘 및 나노입자 구조형성에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.

이에, 본 발명의 일 실시예에서는, 상기 RID에서 RNA 결합 여부에 따라 단백질 접힘 및 나노입자 구조형성에 영향이 있는지 비교하기 위해 hRID 도메인 9개 중에 K19 및 K23 부위에 대해 변이시킨(K19A, K23A) double-mutant hRID를 만들었고 K19A, K23A, R24A, K27A, K30A, K31A, K35A, K38A, K40A로 돌연변이 된 nine mutant hRID 를 만들었다. 융합파트너로 상기 2가지 돌연변이 hRID 및 야생형 hRID(WT) 이용시 hRID에 RNA가 결합된 야생형 hRID(WT)가 융합된 경우에만 단백질 접힘이 향상되어 나노 입자가 잘 형성됨을 알 수 있었다(도 6의 a-d). 상기 돌연변이체의 돌연변이 부위와 아미노산 서열은 하기 [표 1]에 나타내었으며, 야생형 tag-hRID(WT)의 아미노산 서열은 서열번호 1에 나타내고, 염기서열은 서열번호 2에 나타내었다.

[표 1]

본 발명에서 페리틴(ferritin)은 이들 각각이 단위체로써 케이지(cage) 형태의 복합 단백질을 형성할 수 있는 활성이 있는 단백질이라면 제한 없이 사용될 수 있다.

본 발명에서 페리틴 단백질 또는 단편은 케이지 형태의 복합 단백질을 형성할 수 있는 활성이 유지되는 한 제한이 없으며, 서열번호 2의 아미노산 서열에서 아미노산 잔기가 일부 추가, 삭제 또는 치환되어 형성된 단백질 또는 단편일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "발현 벡터"는 발현 벡터의 전사에 제공되는 추가단편에 작동 가능하게 연결된 관심의 폴리펩티드를 암호화하는 단편으로 구성되는 선형 또는 원형의 DNA 분자이다. 그와 같은 추가단편은 프로모터 및 종료암호 서열을 포함한다. 발현 벡터는 하나 이상의 복제 개시점, 하나 이상의 선택 마커, 폴리아데닐화 신호 등을 또한 포함한다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유도되거나, 또는 둘 다의 요소를 함유한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "작동 가능하게 연결된"은 프로모터에서 전사가 개시하고 암호화 서열을 통해 종료 암호로 진행하는데 작용하도록 단편이 배열되는 것을 나타낸다.

본 발명에 따른 발현 벡터에 있어서, 상기 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 파지 입자 또는 게놈 삽입물 일 수 있다. 상기 발현 벡터는 숙주세포 내로 형질전환 된 후, 숙주세포의 게놈과 무관하게 복제되거나 숙주세포의 게놈 내로 통합될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 벡터는 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 페리틴 사이에 링커를 더욱 포함하여 제작될 수 있다.

상기 링커는 목적 단백질을 페리틴 모노머 단편의 C-말단 또는 N-말단의 특정부위에 부착시키기 위한 것으로, 1개 내지 수 개의 아미노산으로 이루어질 수 있다.

본 발명에서 상기 링커는 목적 단백질과 페리틴 사이에 도입되어 두 도메인 사이의 입체 장애를 최소화함으로써, 삼량체 및 나노 입자 구조의 형성을 향상시키는 역할을 수행할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 목적 단백질과 페리틴 사이에 SSG, ASG 및 D6 링커를 결합하여 목적 단백질-페리틴 융합 단백질을 제작하였고, 상기 융합 단백질로부터 삼합체 및 나노 입자가 잘 형성될 수 있는지 여부를 평가하였다. 그 결과, ASG 및 D6 링커로 연결된 융합 단백질이 삼량체 구조를 형성하는 데 실패하였고 또한 적절한 단백질 접힘이 되지 않아 비수용성으로 발현되었다. 반면, SSG 링커로 연결된 융합 단백질은 삼량체 및 나노 입자의 구조를 안정적으로 형성하고 수용성 또한 향상되는 것을 확인할 수 있었다(도 3a).

본 발명에서 사용된 SSG 링커의 염기서열은 다음과 같다:

서열번호 5 (링커)

TCCTCCGGC

본 발명에서 상기 나노 입자는 저 분자량의 단일체(모노머, monomer)들의 정밀한 자가조립 성질에 의하여 형성되며, 내부에 공간을 가지는 단백질로 된 케이지 형태의 입자를 의미한다. 본 발명의 나노 입자는 본 발명의 목적 단백질-페리틴 융합 단백질을 상기 케이지를 구성하는 단일체로 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "자가조립(self-assembly)"이란 어떤 분자들이 외부의 특별한 자극이나 인위적인 유도 없이, 스스로 알아서 특정한 나노 구조를 형성하는 성질을 의미한다.

본 발명의 나노 입자는 상기 목적 단백질-페리틴 융합 단백질 모노머 단편이 삼량체(trimer)를 형성한 후, 상기 삼량체 8개가 3차원적으로 규칙적으로 배열된 것으로, 이는 모노머 24개가 모여 형성된 것일 수 있다.

본 발명에서, 상기 목적 단백질은 상기 나노 입자의 표면에 표시될 수 있는 것이면 제한없이 사용될 수 있고, 항원, 항체, 세포수용체, 효소, 구조 단백질, 혈청 및 세포 단백질로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 대장균에서 수용성 발현이 어렵고, 면역원성 에피토프가 삼합체 형태로 존재하는 중동호흡기증후군 코로나바이러스(Middle East respiratory syndrome coronavirus; MERS-CoV)의 RBD(receptor binding domain) 및 인플루엔자바이러스 H5N1의 HAgD(hemagglutinin globular domain) 단백질을 목적 단백질로 하는 벡터를 제작하고, 이를 대장균에서 발현시킨 후 자가 조립된 나노 입자의 표면에 표시하여 면역원성을 확인하였다.

이에, 본 발명에서 상기 목적 단백질은 바이러스 항원일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니나 에피토프가 삼합체 형태로 존재하는 바이러스일 수 있다.

상기 에피토프가 삼합체 형태로 존재하는 바이러스의 예로는 중동호흡기증후군 코로나바이러스, 인플루엔자바이러스 H5N1, 인간 면역 결핍 바이러스 (human immunodeficiency virus; HIV), 광견병바이러스.(rabies virus; RABV), 중증급성호흡기증후군 (Severe Acute Respiratory Syndrome coronavirus; SARS-CoV) 등이 존재한다.

한편, 본 발명에 따라 목적 단백질-페리틴 융합단백질을 코딩하는 핵산 또는 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터는 숙주 세포를 형질전환(transformation) 또는 형질감염(transfection) 시킬 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드" 는 단일 또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "재조합 단백질(recombinant protein)" 또는 "융합 단백질(fusion protein)"은 원래의 목적 단백질 서열의 N-말단 또는 C-말단에 다른 단백질이 연결되거나 다른 아미노산 서열이 부가된 단백질을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "단백질" 은 "펩타이드(peptide)" 또는 "폴리펩타이드(polypeptide)"와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.

본 발명의 재조합 벡터는 본 발명의 핵산을 적당한 벡터에 연결(삽입)하여 획득할 수 있다. 본 발명의 핵산이 삽입될 벡터는 그것이 숙주 안에서 복제될 수 있는 한 특별히 제한되지는 않는다. 예를 들어, 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 사용될 수 있다. 플라스미드 DNA의 구체적인 예로는 pCDNA31+(Invitrogen) 같은 상업적인 플라스미드를 포함한다. 본 발명에 사용될 수 있는 플라스미드의 다른 예로는 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118 및 pUC119), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)-유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5) 및 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50)가 있다. 파아지 DNA의 구체적인 예로는 λ-파아지(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11 및 λZAP)가 있다. 또한, 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus) 또는 백시니아 바이러스(vaccinia virus)와 같은 동물 바이러스, 배큘로바이러스(baculovirus)와 같은 곤충 바이러스가 또한 사용될 수 있다.

본 발명의 핵산을 벡터로 삽입하기 위해, 정제된 DNA를 적당한 제한효소로 절단하여 적당한 벡터 DNA의 제한 부위 또는 클로닝 부위에 삽입하는 방법이 사용될 수 있다.

본 발명의 핵산은 벡터에 작동 가능하게 연결되는 것이 바람직하다. 본 발명의 벡터는 프로모터 및 본 발명의 핵산 외에 인핸서(enhancer)와 같은 시스 요소(cis element), 스플라이싱 시그널(splicing signal), 폴리 A 추가 시그널(poly A addition signal), 선택 마커(selection marker), 라이보좀 결합 서열(ribosome binding sequence, SD sequence) 등을 추가로 포함할 수 있다. 선택 마커의 예로, 클로람페니콜 저항 핵산, 암피실린 저항 핵산, 디하이드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase), 네오마이신 저항 핵산 등이 사용될 수 있으나, 상기 예들에 의해 작동 가능하도록 연결되는 추가적 구성요소가 제한되는 것은 아니다.

다른 측면에서, 본 발명은 상술한 발현 벡터로 형질 전환된 숙주세포를 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, '형질전환(transformation)'이란 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다.

본 발명의 형질전환 방법은 임의의 형질전환 방법이 사용될 수 있으며, 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다. 일반적으로 형질전환 방법에는 CaCl₂ 침전법, CaCl₂ 방법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 있다.

본 발명의 목적 단백질-페리틴 융합단백질을 코딩하는 핵산 또는 이를 포함하는 벡터를 형질전환 시키기 위한 방법은 상기 예들에 국한되지 않으며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 형질전환 또는 형질감염 방법이 제한 없이 사용될 수 있다.

목적 핵산인 목적 단백질-페리틴 융합단백질를 코딩하는 핵산 또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 숙주로 도입함으로써 본 발명의 형질전환체(transformant)를 획득할 수 있다.

숙주는 본 발명의 핵산을 발현하도록 하는 한 특별히 제한되지는 않는다. 본 발명에 사용될 수 있는 숙주의 특정한 예로는 대장균(E coli)과 같은 에스케리키아(Escherichia)속 세균; 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 같은 바실러스 (Bacillus)속 세균; 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 같은 슈도모나스 (Pseudomonas)속 세균; 락토바실러스와 엔테로코커스 등 유산균; 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 같은 효모; 등의 원핵세포와 동물세포 및 곤충 세포가 있다.

기존 연구에서는 보조 접힘, 번역 후 변형 및 다중 성분 나노 입자의 생성 가능성으로 인해 효모, 곤충 및 포유루 세포와 같은 진핵세포가 대장균 보다 선호되어 왔으나, 이러한 진핵세포 사용시 대량생산공정이 어려운 문제가 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 상기 문제점을 해결하기 위하여 저렴하며 용이하게 대량 생산이 가능한 대장균을 사용하여 목적 단백질이 표시된 자가조립 나노 입자 구조체를 생산하였다.

이에, 본 발명의 숙주세포는 이에 제한되는 것은 아니나, 저렴하고 용이하게 대량생산이 가능한 측면에서 대장균 일 수 있다.

대장균과 같은 세균이 숙주로서 사용될 때, 본 발명의 재조합 벡터는 숙주 내에서 자율적인 복제를 할 수 있고, 프로모터, 라이보좀 결합서열, 본 발명의 핵산 및 전사 종료 서열(transcription termination sequence)로 구성되어 있다.

본 발명의 프로모터는, 본 발명의 핵산을 대장균과 같은 숙주에서 발현하도록 하는 한 어떠한 프로모터도 사용될 수 있다. 예를 들어, trp 프로모터, lac 프로모터, PL 프로모터 또는 PR 프로모터 같은 대장균 또는 파아지-유래 프로모터; T7 프로모터 같은 대장균 감염 파아지-유래 프로모터가 사용될 수 있다. 또한 tac 프로모터 같은 인공적으로 변형된 프로모터도 사용될 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 (a) 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 상기 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드;및 페리틴을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 발현 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; (c) 상기 형질전환체를 배양하여 목적 단백질-페리틴 융합단백질의 발현을 유도하는 단계; 및 (d) 상기 발현된 목적 단백질-페리틴 융합단백질의 자가조립에 의해 형성된 나노 입자를 정제하는 단계;를 포함하는 자가조립 나노 입자의 제조방법을 제공한다.

상기 발현 벡터, 형질전환체 및 자가조립 나노 입자에 대한 구체적인 내용은 상술한 내용과 동일하다.

본 발명에서 회수되는 목적 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, 플라스미드 벡터는 필요에 따라 다른 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 추가로 포함될 수 있는 서열은 단백질 정제용 태그 서열일 수 있으며, 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), MBP(말토스 결합 단백질, USA), FLAG(IBI, USA) 및 헥사히스티딘(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있고, 가장 바람직하게는 헥사히스티딘 일 수 있으나, 상기 예들에 의하여 목적 단백질의 정제를 위하여 필요한 서열의 종류가 제한되는 것은 아니다.

상기 융합 서열이 포함되어 있는 벡터에 의해 발현된 융합 단백질의 경우, 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 예컨대, 글루타티온-S-트랜스퍼라제가 융합된 경우에는 이 효소의 기질인 글루타티온을 이용할 수 있고, MBP가 이용된 경우에는 아밀로오즈 컬럼을 이용하여 원하는 목적 단백질을 용이하게 회수할 수 있다.

본 발명의 목적 단백질-페리틴 융합단백질을 발현시키기 위해 상기의 방법으로 형질 전환된 숙주 세포는 당업계에서 사용되는 통상적인 방법으로 배양할 수 있다. 예를 들면, 상기 목적 단백질-페리틴 융합단백질을 발현하는 형질전환체는 다양한 배지에서 배양할 수 있으며, 유가식(fed-batch) 배양 및 연속 배양 등을 수행할 수 있으나, 상기 예에 의해 본 발명의 형질전환체의 배양방법이 제한되는 것은 아니다. 또한, 숙주 세포의 생장을 위하여 배지 중에 포함될 수 있는 탄소원은 제조된 형질전환체의 종류에 따라 당업자의 판단에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 배양 시기 및 양을 조절하기 위해 적당한 배양 조건을 채택할 수 있다.

적절한 숙주 세포를 선택하여 배지 조건을 조성하여 주면 목적 단백질이 성공적으로 형질 전환된 형질전환체는 목적 단백질-페리틴 융합단백질을 생산하게 되며, 벡터의 구성 및 숙주 세포의 특징에 따라 생산된 목적 단백질-페리틴 융합단백질은 숙주 세포의 세포질 내, 페리플라즈믹 스페이스(periplasmic space) 또는 세포 외로 분비될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 철 이온의 농도가 나노 입자 형성에 미치는 영향을 조사하였으며, 철 이온의 농도가 증가하면 단백질의 올리고머의 형태는 감소하고 자가 조립된 나노 입자가 증가함을 확인할 수 있었다. 또한 철 이온의 농도가 증가하면 단백질 생산 수율이 증가함을 확인할 수 있었다(도 5a 및 도 5b).

숙주 세포 내 또는 외에서 발현된 단백질은 통상의 방식으로 정제될 수 있다. 정제 방법의 예로는 염석(예를 들어 황산암모늄 침전, 인산 나트륨 침전 등), 용매 침전(예를 들어, 아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전 등), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 컬럼 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용하여 본 발명의 단백질을 정제할 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조되는 나노 입자를 제공한다. 본 발명에 따른 목적 단백질-페리틴 융합단백질은 단량체 24개가 자가조립에 의해 구형의 나노 입자를 형성할 수 있다. 이때, 나노 입자의 직경은 24 내지 30 nm 일 수 있다.

상기 나노 입자에 대한 구체적인 내용은 상술한 내용과 동일하다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 나노 입자를 포함하는 바이러스 감염 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 바이러스의 발병 여부 또는 발병 가능성 여부를 확인하는 것이다.

상기 바이러스 감염 진단용 조성물은 바이러스 항원 단백질을 포함하는 상기 나노 입자뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 시약 등이 추가로 포함될 수 있다. 이러한 시약으로는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 나노 입자를 포함하는 면역 증강용 약학 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 백신 형태일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 나노 입자를 단독으로 함유하거나 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 될 수 있으며, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기에서 '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다.

약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러, 펩티드 제제에 대한 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸-또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.

경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다.

나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, [0206] 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995)에 기재되어 있다.

본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 001㎍ 내지 10,000mg, 가장 바람직하게는 0.1 mg 내지 500 mg일 수 있다. 그러나 상기 약학적 조성물의 용량은 제제화 방법, 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 조성물의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

이하, 발명의 이해를 돕기 위해 다양한 실시예를 제시한다. 하기 실시예는 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 발명의 보호범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실험 방법]

1. 단백질 발현 벡터의 제작

1-1. MERS-CoV 페리틴 나노 입자를 위한 벡터의 제작

(1) pGE-LysRS 벡터에서 LysRS 유전자를 nde1과 kpn1으로 효소적으로 절단 후 human LysRS의 N-말단의 1-69 아미노산인 hRID (RNA interaction domain originated from human)의 PCR 생성물을 동일한 제한 효소를 사용하여 잘라내어 pGE-hRID 벡터를 만들었다. 그런 다음, pGE-hRID 벡터를 SalI 및 HindⅢ 제한효소로 절단하고, 미생물 유래의 페리틴 유전자(Genebank accession no. NC_000913.3)를 삽입하여 hRID-FR 벡터를 만들었다. MERS-COV의 S 서열(GenBank accession no. AFS88936.1)을 주형으로 N-말단의 RBD (367~606aa) 부분을 SSG 또는 ASG 링커로 삽입하여 hRID에 TEV cleavage site및 6x-His-RBD-FR로 구성된 벡터를 제작하였다. 또한 MERS-COV의 S서열을 주형으로하여 N-말단의 S1 (18~751aa) 부분을 SSG linker로 삽입하여 hRID에 TEV cleavage site및 6x-His-RBD-FR로 구성된 벡터를 제작하였다. 또한 hRID의 RNA 결합 부위를 돌연변이 시킨 mutant hRID(2m) (K19A 및 K23A)및 hRID(9m) (K19A, K23A, R24A, K27A, K30A, K31A, K35A, K38A, 및 K40A)을 각각 생성하는 pGE-hRID mutant (3) 벡터 2가지를 제작 하였다.

1-2. 인플루엔자 H5N1 페리틴 나노 입자를 위한 벡터의 제작

A/Indonesia/5/2005/H5N1) 유래 HA 단백질 중 항원성이 뛰어나고 수용성 단백질 발현이 용이한 Hemagglutinin globular domain 부위 (HAgd)의 발현을 위해 해당부위(45~229) 유전자 서열을 DNA 합성하고 E.coli에서 발현이 적합한 형태로 codon optimization을 수행하였다. pGE-hRBD 플라스미드를 BamH1 및 EcoRV를 사용하여 잘라내고, 그 위치에 H5N1 바이러스의 헤마글루티닌 글로불라 도메인(hemagglutinin globular domain; 이하 HAgd-FR)을 삽입하고, Sal1과 Hind3를 사용하여 박테리아 페리틴을 삽입하여 hRID에 TEV cleavage site, 6x-His-HAgd-FR로 구성된 벡터를 제작하였다.

2. 단백질의 발현 및 정제

2-1. MERS-CoV RBD 나노 입자

모든 플라스미드는 SHuffle® T7 Competent E. coli에 형질전환 시켰다. 50ml의 LB 배지에 암피실린을 50ug/ml로 처리 후 30℃에서 밤새 배양하였다. 각각의 형질전환체를 암피실린을 포함하는 LB 배지 500ml 에 18℃로 대용량 배양하여 O.D=0,6~0.8에서 1 mM IPTG(isopropyl β-D-1-thioglalactopyranoside)를 induction 한 후 12시간 동안 단백질을 발현 시킨다. 대장균을 원심 분리하여 세포를 가라앉히고, 세포는 wash buffer (0mM NaCl)에서 초음파를 이용하여 파쇄 하였다. 단백질 정제시 Histrap HP column (GE healthcare, 17-5248-02)을 이용하였고 이때 wash buffer는 [50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 200 mM NaCl, 10% glycerol, 2mM 2-mercaptoethanol, TWEN-20 0.1%, and 40mM imidazole]를 사용 하였으며, elution buffer는 [50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 200 mM NaCl, 10% glycerol, 2mM 2-mercaptoethanol, 0.1% TWEN-20, and 300mM imidazole]로 단백질을 정제 분리하였다. 그 후 centrifugal filters (Centriprep, Merck Millipore Ltd)로 농축한 후 acTEV protease를 처리하여 hRID를 절단하고 a Superose 6 10/300 column (GE Healthcare)을 이용하여 나노 입자를 정제하였다.

2-2. 인플루엔자 H5N1 HAgd 나노 입자

상기 벡터는 T7 프로모터에 의해 발현되고, IPTG에 의해서 프로모터 활성화가 조절된다. 이 재조합 플라스미드를 BL21*(DE3)-pLysS competent cell에 형질전환 시키고 16℃ 조건에서 16시간 동안 단백질을 발현했다. wash buffer는 50mM Tris(pH 7.5), 100mM NaCl, 10% glycerol, 2mM 2-mercaptoethanol, TWEN-20 0.1%, and 40mM imidazole]하였고 elution buffer of [50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 200 mM NaCl, 10% glycerol, 2mM 2-mercaptoethanol, 0.1% TWEN-20, and 300mM imidazole]로 정제하였다. 나머지는 2-1 방법과 동일하다.

3. Fe ²⁺ 농도에 따른 나노 입자의 형성

나노 입자 형성에 대한 Fe²⁺의 효과를 평가하기 위해, 세포를 다양한 농도의 Fe²⁺(0, 200, 500, 1000μM)를 갖는 LB 배지에서 배양 하였다. NP 형성은 NaCl (0~300mM) 또는 Fe²⁺의 다양한 농도에서 크기 배제 크로마토그래피 (SEC), SDS-PAGE, TEM 및 DLS에 의해 검사되었다.

4. RNA의 단백질의 접힘성 및 안정성 분석

hRID가 융합 파트너로써 RNA 매개 접힘 및 안정성을 확인하기 위해서 상기 2의 발현 방법에서와 같은 방법으로 배양된 세포 10ml를 수득하였다. 500ul의 B-PER II (Thermo scientific, cat. No.78248)로 세포를 용해시켰다. 12,000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 수용성 분획(soluble fraction)을 얻어 200ul씩 반으로 나누었고, RNase A (Ribonuclease A, cat.No.27062, iNtRON Biotechnology)를 250μg/ml 처리한 것과 RNaseA를 처리하지 않은 음성 대조군을 37℃에서 15분간 배양하였다. 그리고 12000rpm에서 15분간 원심분리하여 수용성 분획과 불용성 분획으로 나누었다. 각각의 샘플을 SDS-PAGE gel에 로딩하여 웨스턴 블롯(western blot) 및 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250(coomassie brilliant blue R-250)로 염색하여 확인하였다. 1차 항체로 Penta-His Antibody(QIAGEN, Cat # 34660)를 1/5000로 희석한 것을 사용하였고 2차 항체는 anti-mouse IgG (Sigma, A4416)로 1/20000로 희석한 것을 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 실시하였다.

5. 항원을 이용한 MERS-Cov 감염 진단

RBD-[SSG]-FR 및 RBD-FR(WT)의 2가지 단백질 250 ng을 96 웰 마이크로 플레이트 (NUNC, Roskilde, Denmark)에 넣고 4 ℃에서 밤새 배양 하였다. MERS-CoV RBD 단백질 (MERS-RBD-005P, eEnzyme)을 양성 대조군으로 사용하였다. 각 단계 후에, 웰을 완충액 (0.05 % TWEEN 20-PBS; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)으로 3 회 세척하였다. 코팅 항원을 제거하고, 웰을 PBST (PBS 및 Tween-20 중의 5% skim milk)로 37 ℃에서 1 시간 동안 차단시켰다. 2 시간 후, 블로킹 용액을 제거 하였다. 4 명의 환자에서 2 배 연속 희석된 혈청 (CNNH-0709, 0809, 1009 및 1309)을 각 웰에 첨가하고 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하였다. 항원 코팅 웰을 37 ℃에서 1 시간 동안 peroxidase가 결합된 염소유래 항-인간 IgG 항체 (KPL, SeraCare Life Sciences, Milford, MA, USA)와 함께 배양 하였다. 1차 항체를 제거하고 비색 기질로서 각 웰에 3,3',5,5´-tetramethylbenzidine (TMB; Sigma-Aldrich)을 첨가하였다. 정지 용액 (Sigma-Aldrich)으로 반응을 처리 한 직후, 광학 밀도를 450 nm에서 판독하였다.

6. 다양한 백신항원이 결합된 페리틴 나노 입자를 이용한 생쥐에서의 백신화 실험

MERS-CoV의 RBD와 인플루엔자 H5N1 HAgd 나노 입자를 20ug씩 Alum과 1:1의 비율로 섞은 후, 복강 접종(intraperitoneal;IP) 및 근육 접종(intramuscular; IM) 방법으로 생쥐에서 총 3 차례, 2주 간격으로 주사를 수행했다. 생쥐의 혈액은 단백질을 주사하고 난 2주 뒤에 안와 채혈을 통해 얻었다. 각 혈액은 4℃에서 24시간 동안 보관 후에 원심분리를 수행하여 혈청으로 분리했다.

7. RBD 항원과 hDPP4 수용체 사이의 경쟁적 ELISA

경쟁적 ELISA는 MERS-CoV 항원 (RBD-[SSG]-FR, RBD-FR, RBD 및 FR (음성 대조군))으로 면역화된 마우스 혈청이 hDPP4 수용체에 RBD 단백질의 결합을 억제하는지 여부를 결정하기 위해 수행되었다. 500 ng/웰 hDPP4 단백질(Abcam)을 Nunc 96-웰 microtiter immunoplates(Thermo Fisher Scientific)에 코팅하고 밤새 4 ℃에서 배양하였다. 플레이트를 세척하고 블로킹 완충액 (PBS 중 5 % skim milk 및 Tween 20 (PBST))으로 37 ℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 이때 동시에 RBD, RBD-[SSG]-FR, RBD-FR 및 FR로 면역화된 마우스 혈청을 버퍼는 (TBST (50 mM Tris-Cl (pH 7.4), 0.05 % Tween-20)를 이용하여 1/10에서 1/160로 1/2로 연속 희석시켰다. 희석 혈청과 결합 단백질인 RBD 단백질(MERS-RBD-005P; eEnzyme)을 웰당 500ng으로 첨가하고 37℃에서 1 시간 동안 배양 하였다. 그 후 혈청과 단백질을 반응시킨 혼합용액을 100μl를 37 ℃에서 각 웰에 첨가하고 2 시간 동안 배양 하였다. 그 후, horseradish peroxidase (1:1000, Thermo Fisher Scientific)가 접합 된 anti-6xHis tag 항체 100μl를 각 웰에 첨가하고 37 ℃에서 1 시간 동안 배양 하였다. 플레이트를 TBST로 3 회 세척하고, 100 ㎕/웰의 기질 TMB 용액 (BD Biosciences)을 어두운 곳에서 37 ℃에서 30 분 동안 배양하였다. ELISA reader FLUOstar OPTIMA (BMG LABTECH)를 사용하여 450μM에서 흡광도를 측정하고 색 반응을 멈추기 위해 50μl의 정지 용액 (2N H₂SO₄)을 웰에 첨가 하였다.

8. 혈청의 수용체파괴효소(RDE) 처리

생쥐로부터 얻은 혈청과 수용체파괴효소(receptor destroying enzyme; RDE)를 1:3의 비율로 섞은 후 18시간에서 24시간 정도 동안 37℃에서 반응시킨다. 반응 후 56℃ 조건에서 혼합물을 1시간 동안 반응시킨 후 다음 각 실험에 사용했다.

9. HI 분석 (hemagglutination assay)

96 웰 플레이트(v-shape)에 25ul/웰의 PBS를 넣고, 각 혈청 샘플을 첫번째 웰에 25ul씩 넣은 다음 1/2로 희석을 진행한다. 1번부터 11번 웰까지 진행하고 12번째 웰은 대조군으로 사용한다. 이후 25ul의 바이러스를 각 웰에 넣어주고 37℃ 조건에서 1시간 동안 반응시켜준다. 이 후 50ul의 1% cRBC(chicken Red Blood Cell)를 각 웰에 넣고 4℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 확인한다.

10. PRNT (plaque reduction neutralization test)

1/20에서 1/640까지 2fold 희석시킨 생쥐 혈청에 200pfu/100ul 농도로 희석한 바이러스를 섞어준 후 37℃ 조건에서 90분 동안 반응시킨다. 이 때 희석에는 SF 배지를 사용한다. 반응 후 MDCK 세포를 키운 6웰에 각 웰 당 0.1ml씩 항원으로 면역화된 마우스 혈청을 넣고 37℃ 조건에서 90분 동안 반응시킨다. 반응시키는 동안 1% 아가로스 용액과 2x DMEM(4% FBS) 용액을 1:1 비율로 섞어준 후 반응이 끝나면 바이러스-혈청 혼합물을 버린 뒤 아가로스와 DMEM이 섞인 혼합물을 각 웰에 3ml씩 부어준다. 37℃ 조건에서 반응을 진행하면서 각 웰에 플라크(plaque)가 생기는 것을 관찰한다. 플라크가 육안으로 셀 수 있을 정도로 생성되었을 때 포르말린 용액을 각 웰에 200ul씩 넣어주고 반응을 멈춘 후 각 웰에 생긴 플라크개수를 센다.

11. 호몰로지 모델링과 RBD-FR 삼량체 시뮬레이션

MERS-CoV RBD 단백질과 대장균 유래 페리틴 융합 복합체는 대장균 유래 페리틴 (PDB ID code 1bcf)과 MERS-CoV RBD (PDB ID code 4kqz)를 사용하여 MODERER version 9.16 (캘리포니아의 Sali Lab)을 사용하여 modeling을 통해 제작되었다. RBD와 BFR 사이의 다양한 링커를 결합하여 ClusPro (ABC Group and Structural Bioinformatics Lab Boston University and Stony Brook University)의 dimer 도킹을 사용하여 삼량체가 형성되는지 시뮬레이션을 수행하였다. 상기 방법 을 통해 RBD-BFR, RBD-SSG 링커-BFR, RBD-ASG 링커-BFR, RBD-D6 링커-BFR를 삼량체 구조 형성시 에너지적으로 안정한지를 예측 하였다.

12. TEM과 cryo-EM을 이용한 나노입자의 특징분석

나노 입자를 플라즈마 처리한 Formvar carbon copper grid에 올려 2% Uranyl acetate/D.W. 로 20초 Negative stain 하였다. 그리고 filter paper로 Uranyl acetate를 제거하였다. KIST에 설치된 Cryo-TEM (FEI, CryoTecnai F20)으로 grid를 200 kV로 accelerating 하여 high resolution으로 examined and photographed 하였다.

13. 동적 광 산란 (DLS)

나노 입자 단백질 (3ml)을 Dispo-H cell에 넣고 Zeta-potential & Particle size Analyzer (ELS-2000ZS; Otsuka Electronics)를 이용하여 size를 측정 및 분석하였다. 나노입자의 intensity distribution diameter은 물 용매에 25°C 조건에서 2번 측정되었고, 이? sample accumulation time은 200초 조건으로 측정하였다.

[실시예]

실시예 1. 본 발명의 목적 단백질의 수용성 개선을 위한 벡터 제작

본 발명에서는 pGE hRID 벡터를 이용하여, 목적 단백질 (RBD, S1, HAgd)의 N-말단에 RID 융합 단백질이 결합되고, C-말단에 나노 입자를 형성할 수 있는 페리틴이 결합된 발현 벡터를 제작하였다 (도 1a). 상기 벡터는 T7 프로모터를 이용하고, lac 오퍼레이터를 이용해 IPTG에 의해서 프로모터가 활성화 된다. 특정 조건 시 RID 융합 파트너를 절단하기 위하여 RID와 목적 단백질 사이에 TEV 프로테아제 부위(protease site)를 삽입한 벡터를 제작하였다. 도1b는 hRID를 이용해 페리틴이 결합된 발현 벡터를 이용해 목적 나노입자 단백질을 생성하는 요약 도면이다.

실시예 2. 페리틴 과 목적 단백질의 사이의 링커가 융합 단백질의 수용성 발현 및 나노 입자 형성에 미치는 효과

본 발명에서는, SSG, ASG 및 D6을 포함하는 다양한 링커를 목적 단백질과 페리틴 사이에 도입하였을 때 나노 입자 형성이 잘 되면서도 단백질이 수용성으로 발현이 잘 되는 링커를 선발하고자 하였다. 그 결과, 도 2a에 나타난 바와 같이 SSG 링커가 목적 단백질과 페리틴 사이의 입체 장애를 최소화 함으로써 삼량체 및 나노 입자 형성이 잘 되게 하면서도, 도 2b에 나타난 바와 같이, 단백질의 수용성 발현량 또한 월등하게 높은 것을 확인하였다.

다음으로, SSG 링커 유무에 따른 나노 입자 형성 효과를 확인하기 위하여, Ni-NTA로 정제 후 SEC (Superose 6 Increase 10/300 GL) 통해 calibration 단백질과 비교하여 나노 입자가 자가조립이 됐는지 분석하였다. 이때 SSG 링커에 결합된 형태가 링커가 비결합된 것 대비 void volume (oligomer form)이 50%로 적어지고 나노 입자가 형성된 부분이 증가함을 SDS-PAGE 분석(도 2c) 및 TEM (도 2d)으로 확인하였다. 이때 hRID 융합 형태가 자가조립 되어 1024kDa (45kDa x 24) 나노 입자 크기의 RBD-FR 단백질이 많이 형성됨을 확인하였다.

실시예 3. RID가 나노입자 단백질의 수용성 증진에 미치는 효과

융합 파트너로서 RID가 융합 단백질의 수용성 증진에 미치는 효과를 삼량체 형태의 에피토프를 가지면서, 대장균에서 수용성 발현이 잘 되지 않는 것으로 알려진 MERS-CoV의 RBD 단백질, MERS-CoV의 S1 단백질 및 인플루엔자 바이러스의 HAgd 단백질을 벡터에 도입하여 수용성으로 발현됨을 확인하였다.

도 2b에서, 18℃ 조건에서 hRID 유무에 따른 RBD 단백질의 발현여부를 비교해보면, 대장균에서 수용성 발현이 잘 되지 않는 것으로 알려진 MERS-CoV의 RBD 단백질을 페리틴에 융합한 RBD-FR 단백질은 수용성이 5%인데, hRID 융합시에 수용성이 60%인 것을 확인하였으며, 이는 RBD-FR대비 hRID-RBD-FR이 약 1200% 증가에 해당된다. 또한 수용성 발현이 되지 않는 S1 단백질은 수용성이 0%이지만, hRID 융합시에 수용성이 80%이며 이는 S1-FR 대비 hRID-S1-FR이 약 8000% 증가에 해당된다(도 3a). 마지막으로 HAgd 단백질은 수용성이 0%인데, hRID 융합시에는 수용성이 12%이며, 이는 HAgd-FR대비 hRID-HAgd-FR이 약 1200% 수용성이 증가함을 확인하였다(도 3b).

실시예 4. 페리틴이 나노입자 조립에 미치는 효과

(1) 사람 유래 페리틴을 이용한 hRID-RBD-HFR 나노 입자 형성

Ni-NTA로 정제 후 SEC (Superose 6 Increase 10/300 GL) 통해 calibration 단백질과 비교하여 나노 입자가 자가조립이 됐는지 분석하였다. 이때 hRID 융합 형태가 자가 조립되어 RBD-FR 단백질이 1344kDa (56kDa x 24)인 나노 입자 크기가 많이 형성됨을 확인하였다 (도 4a). 그리고 TEM (도 4b)으로 나노 입자가 형성됨을 확인하였다.

(2) 대장균 유래 페리틴을 이용한 hRID-S1-FR의 나노입자 형성

Ni-NTA로 정제 후 SEC (Superose 6 Increase 10/300 GL) 통해 calibration 단백질과 비교하여 나노 입자가 자가조립이 됐는지 분석하였다. 이때 hRID 융합시 110kDa의 S1 단백질이 수용성으로 생성된 후 자가 조립되어 크기가 2640kDa (110 x 24)인 나노 입자가 형성됨을 SEC(도 4c)과 SDS-PAGE 분석 및 TEM(도 4d)을 통해 확인하였다

(3) hRID-HAgd-FR 나노 입자 형성

Ni column 정제를 통해 얻은 HAgd-FR 단백질을 hRID 융합한 것과 융합 파트너를 절단한 단백질을 Superose 6 Increase 와 superdex column을 통해 gel filtration을 수행했다. 그 결과, 동일하게 진행한 Calibration 피크와 비교해서 확인했을 때, oligomer에 해당하는 fraction 2에서는 목적 단백질인 hRID-HAgd-FR 및 HAgd-FR 단백질이 단일 밴드로 확인되었다 (도4e). 이를 통해 hRID-HAgd-FR, HAgd-FR 단백질이 나노 입자를 이루고 있음을 간접적으로 확인 할 수 있다. 이 후 oligomer form 생각되는 fraction 2번의 단백질들이 실제로 나노 입자를 형성하고 있는지 확인하기 위해, 각 fraction을 TEM 분석을 통해 확인했다. 그 결과, 도4e에서 확인 할 수 있듯이, fraction 2에 얻어지는 단백질이 Negative staining후 TEM 촬영 결과 25nm의 파티클이 형성됨을 확인하였다 (도4e).

실시예 5. 철 이온이 페리틴 융합 나노 입자 수율에 미치는 효과

페리틴은 core에 Fe ion과 결합을 하는 자가 조립 되는 나노 입자이다. 이에, 철 이온 농도가 MERS RBD-FR 나노 입자의 형성 및 생산 수율에 영향을 주는지 확인하기 위해 다양한 농도의 철 이온(0, 200uM, 500uM, 1000uM)을 LB media에 처리하여 대장균을 배양 하였다. 그런 다음, 세포를 파쇄하여 MERS RBD-FR 나노 입자를 정제 후 정량 시 철 이온 농도를 500uM까지 증가시켰을 때 1L 배양시의 생성량 (yield)이 증가함을 SDS-PAGE 분석으로 확인하였다. 철 이온 농도가 500uM에서는 0 uM일 경우 보다 나노 입자 생성량이 270% 증가 함을 확인 하였다 (도 5a). 다양한 농도의 철 이온을 처리하여 배양된 단백질을 Ni-NTA로 정제 후 Superose 6 Increase 10/300 GL을 사용하여 SEC 분석하였다. 이때 철 이온 농도가 증가하면 단백질의 올리고머 형태가 감소하고 24개가 자가 조립된 나노 입자가 증가함을 SDS-PAGE 분석을 통해 확인하였다 (도 5b).

실시예 6. RNA가 단백질의 수용성 및 나노 입자의 자가 조립에 미치는 효과

(1) RNA가 단백질의 수용성에 미치는 영향

대장균에서 RNA가 분자 샤페론 처럼 기능하여 단백질을 stability와 folding을 한다고 알려졌다. 그래서 이를 확인하기 위해 Chaperna의 대표적인 hRID에 t-RNA가 결합하는 RNA interaction domain을 t-RNA가 결합하지 못하는 2가지의 점 돌연변이(point mutation form)를 만들었다. 정제된 hRID-RBD-FR 복합체를 agarose gel에 전기 영동을 하였다. 이를 통해 점 돌연변이 된 hRID 형태는 nucleic acid bands가 검출되지 않고 야생형(WT form)은 단백질과 같은 위치에서 nucleic acid bands를 확인하였다. 결과적으로 hRID-RBD-FR (2m, 9m)이 nucleic acid가 해리 됨을 확인하였다 (도6a, 왼쪽). RNA가 hRID-RBD-FR (W, 2m, 9m) 각각에 안정성을 유지하는지 확인하기 위해 sonication을 통해 세포를 용해 한 후에 원심분리 하였다. 그리고 나서 수용성 분획(S)을 둘로 나눠서 하나는 invitro에서 RNaseA를 처리하고 다른 하나는 처리 하지 않았다. RNaseA 처리시 hRID(W)-RBD-FR은 단백질의 수용성이 100%로 감소 되고 점 돌연변이 된 hRID-RBD-FR (2m, 9m)은 수용성이 유지됨을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 (도6a, 오른쪽)으로 확인하였다.

(2) RNA가 나노 입자의 자가 조립에 미치는 영향

페리틴 나노 입자 형성시에 RNA 의존성을 확인을 위해, RNA 결합이 나노 입자의 형성에 어떤 역할을 하는지 RBD-FR (WT, 2m, 9m) 정제된 단백질을 SEC (도 6b), TEM (도 6c) 및 DLS (도 6d)로 확인하였다. RBD-FR(WT)는 정의된 크기 (1,080 kDa)의 사이즈의 나노 입자를 형성함을 확인하였다. 그러나 point mutation이 증가하여 RNA interaction이 적어질수록 나노 입자가 형성된 부분이 줄어들고 oligomerization form이 70% 이상 증가함을 확인하였다. EM 분석을 통해서 RBD-FR(WT)이 나노 입자가 잘 구조화됨을 확인하였으며, 그러나 point mutation이 증가할수록 나노 입자 단백질이 unfolded하게 구조가 형성되어 시간이 지나면 구조가 무너지고 단백질이 oligomerization이 됨을 크기 배제 크로마토그래피(SEC)와 투과전자현미경(TEM)을 통해 확인하였다 (도 6a,b). 또한 동적 광 산란법(DLS)으로 측정한 결과, hRID(WT)는 25nm,hRID(2m)는 52nm와 717.7nm hRID(9m)에서는 34.2nm와 519.2nm(9m)로 측정되었다 (도 6d). 종합하면, RNA 결합은 불규칙한 형태로의 응집을 방지하고 단량체의 나노 입자 조립에 결정적으로 중요하다는 것을 명확하게 보여주었다.

실시예 7. 페리틴 융합 나노 입자의 진단 항원으로 이용

대장균에서 생성된 RBD-FR 나노 입자를 이용하여 MERS-CoV에 감염된 환자를 진단 할 수 있을지 확인하였다. 이에, RBD-FR 나노 입자(SSG linker 결합, W)와 293cell 유래 RBD 단백질 (양성 대조군)를 진단항원으로써 microplate에 코팅하였고 MERS-CoV에 감염된 환자 4명으로부터 얻어진 혈청을 이용하여 MERS-CoV의 감염여부를 ELISA로 확인하였다. 그 결과, 전반적으로 RBD-BR 나노 입자들은 양성 대조군인 RBD (293cell)과 유사하게 MERS-CoV에 감염된 4명의 환자 혈청과 특이적으로 높은 민감성을 가짐을 확인하였다(도 7). 이로부터, 대장균에서 생성된 페리틴 융합 나노 입자가 기존의 293cell 인 eukaryote system에서 생성된 단백질과 같은 양을 사용하더라도 MERS-CoV에 감염된 환자를 특이적으로 진단할 수 있을 뿐 아니라, 신속하고 경제적으로 생산할 수 있는 훌륭한 진단 항원임을 알 수 있었다.

실시예 8. 페리틴 융합 나노 입자를 항원 특이적 항체를 유도체로서 이용

페리틴 융합 나노 입자의 면역 원성을 평가하기 위해 나노 입자와 monomer 단백질을 면역보조제와 함께 생쥐에 면역화 시켰다. 면역보조제로 Alum 사용시 RBD-[SSG]-FR 나노 입자와 RBD-FR 나노 입자는 각각 항체의 End point titer(log₁₀)가 5.8이고 RBD 단량체 단백질은 항체의 End point titer(log₁₀)가 4.5로 측정되었다. 따라서 나노 입자는 RBD 단량체 보다 약 600% 더 높게 IgG 항체가가 나타남을 확인하였다. 또한 면역보조제로 MF59를 사용시 RBD-[SSG]-FR 나노 입자와 RBD-FR 나노 입자는 각각 항체 End point titer(log₁₀)가 6.5이고 RBD 단량체 단백질은 항체 End point titer(log₁₀)가 5.8이었다. 따라서 나노 입자는 RBD 단량체 보다 약 800% 더 높게 IgG 항체가가 증가함을 확인하였다. 그뿐만 아니라 페리틴 융합 나노 입자를 마우스에 면역 시 나타나는 항체 반응은 시험 된 모든 항체 (IgG1, IgG2a 및 IgG2b)에서 단량체 RBD 단백질보다 훨씬 증가함을 확인하였다 (도 8). 이러한 결과는 페리틴에 바이러스 유래 항원이 제시된 나노 입자는 다양한 항체를 생성하는 면역 반응을 증가시켜 단량체 항원을 쥐에 면역시보다 다양한 항체형성을 향상 시킴을 알 수 있었다.

실시예 9. 나노 입자를 이루는 백신 단백질을 이용한 백신 개발 효과

(1) Anti-NPs 생쥐 혈청을 이용한 백신으로의 효과 (inhibition assay)

MERS-CoV 감염은 RBD와 숙주 수용체 hDPP4의 상호 작용에 의해 매개된다. 이에, MERS-CoV 나노 입자를 쥐에 면역 하였을 때 생성된 항체가 hDPP4와 RBD 단백질 사이의 결합을 저해 할 수 있는지 여부를 검증하기 위해 경쟁 ELISA를 수행 하였다. 따라서, RBD 단백질을 면역화한 쥐 혈청 (1:10)과 RBD 단백질을 37℃에서 1시간 반응 시켰다. 그 후 혈청과 단백질 혼합 샘플을 hDPP4 단백질과의 결합을 측정 하였다. 도 9에 나타낸 바와 같이, RBD-[SSG]-FR 및 RBD-FR은 각각 93.3 %, 82.2 %로 MERS RBD 단백질과 hDPP4 수용체와의 결합을 저해 시켰고 RBD 단백질을 면역화한 쥐 혈청은 75.67 %로 MERS RBD의 hDPP4 수용체에 대한 결합을 저해 함을 확인하였다. 이는 RBD 단량체 대비 RBD-[SSG]-FR 및 RBD-FR 나노 입자를 쥐에 면역화시 MERS RBD의 hDPP4 수용체에 대한 결합을 저해하는 능력이 17.63%, 6.53% 가 증가함에 해당한다. 나노 입자는 단량체 항원을 쥐에 면역시 보다 MERS RBD의 hDPP4 수용체에 대한 결합을 저해하는 능력이 17.6%가 증대됨을 알았다. 대조적으로, 페리틴 만을 면역화한 마우스 혈청 (음성 대조군)은 MERS RBD의 hDPP4 수용체에 간에 결합을 억제하지 못했다. 이러한 결과를 종합하면, 항원을 페리틴에 융합한 나노 입자 백신은 MERS-CoV 특이적 항체 반응을 크게 유도하여 hDPP4 수용체 결합을 효과적으로 방해함을 시사한다.

(2) Anti-NPs 생쥐 혈청을 이용한 헤마글루티닌 저해(HI) 분석

Influenza H5N1 HAgd 나노 입자를 면역화한 쥐에 바이러스 감염시 바이러스로부터 저항할 수 있는 항체가 생성되었는지 확인하기 위해, 각 쥐의 혈청을 이용해 HI 어세이를 수행했다. 이 때 사용한 바이러스는 rH5N1 based PR8 이며, 이 바이러스는 H1N1 (PR8) 바이러스를 기반으로 HA 유전자와 NA 유전자만을 H5N1(Indonesia) 바이러스의 HA와 NA로 바꾼 재조합 바이러스이다.

그 결과, 도10의 A와 B에서 확인할 수 있듯이, 목적 단백질을 주사한 후 얻은 5마리의 쥐 혈청 중 2번부터 4번 쥐의 혈청은 H5N1 재조합바이러스의 HA 단백질과 충분히 반응하여 hemagglutination과의 결합을 방해함을 확인하였다. PBS를 쥐에 면역화 하여 얻은 혈청은 Hemagglutination을 저해함을 확인할 수 없었으며, hRID-HAgd-FR 나노입자를 주사하여 얻은 쥐 혈청의 경우엔, Hemagglutination 저해함을 확인 할 수 있었다. 이때 최저치인 1/8 바이러스 희석하여 HI titer 측정시 보다 나노입자를 주사시 HI titer가 128로 1600%로 크게 증대 됨을 확인하였다(도 10).

(3) Anti-NPs 생쥐 혈청을 이용한 Plaque Reduction Neutralization Test (PRNT) 분석

hRID-HAgd-FR 단백질을 주사한 후 얻은 혈청이 실제로 바이러스를 약독화 시킬 수 있는지 확인하기 위해 PRNT 분석을 수행했다. 이 때 사용한 바이러스는 H5N1 based PR8 재조합 바이러스이며, 각 sample은 5마리 개체의 혈청을 모두 동일한 양으로 섞은 mixed serum으로 실험을 진행했다. 그 결과, 도8의 C에서 나타낸 바와 같이 Influenza H5N1 HAgd 나노 입자를 주사 후 얻은 혈청과 HAgd-FR 단백질을 주사 후 얻은 혈청은 효과적으로 재조합 바이러스를 중화 시키는 것을 확인 할 수 있지만, 대조군으로서 사용된 hRBD-FR 단백질을 주사한 생쥐의 혈청은 바이러스 중화 기능이 없는 것을 확인했다 (도 10의 C). hRID-HAgd-FR과 HAgd-FR을 쥐에 주사 후 얻은 혈청의 중화항체 역가는 각각 64.85와 51.3임을 확인하였다. hRID-FR을 주사 후 얻은 혈청의 중화항체 역가는 8.67이므로, hRID-FR과 비교했을 때 hRID-HAgd-FR을 쥐에 면역화한 혈청은 약 중화항체 역가가 748%가 증가함을 확인하였고, 또한 HAgd-FR를 쥐에 면역화 하여 얻은 혈청은 중화항체 역가가 592%가 증가함을 확인하였다. 따라서 대장균 유래 페리틴이 HAgd-FR 단백질의 나노 입자 형성에 도움을 주어, 나노 입자 백신이 백신으로서의 효능을 증대 시킴을 확인할 수 있었다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation. Yonsei University <120> Expression vector system for preparing recombinant self-assembled nanoparticles, and method of using the same <130> 1064319 <160> 22 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hRID Protein seq <400> 1 Met Ser Glu Gln His Ala Gln Ala Ala Val Gln Ala Ala Glu Val Lys 1 5 10 15 Val Asp Gly Ser Glu Pro Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg 20 25 30 Leu Lys Ala Glu Lys Lys Val Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln Lys Glu 35 40 45 Leu Ser Glu Lys Gln Leu Ser Gln Ala Thr Ala Ala Ala Thr Asn His 50 55 60 Thr Thr Asp Asn Gly Val Gly Pro Glu Glu Glu Ser Val 65 70 75 <210> 2 <211> 231 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hRID DNA seq <400> 2 atgtctgaac aacacgcaca ggcggccgtg caggcggccg aggtgaaagt ggatggcagc 60 gagccgaaac tgagcaagaa tgagctgaag agacgcctga aagctgagaa gaaagtagca 120 gagaaggagg ccaaacagaa agagctcagt gagaaacagc taagccaagc cactgctgct 180 gccaccaacc acaccactga taatggtgtg ggtcctgagg aagagagcgt g 231 <210> 3 <211> 158 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacterioferritin Protein Seq <400> 3 Met Lys Gly Asp Thr Lys Val Ile Asn Tyr Leu Asn Lys Leu Leu Gly 1 5 10 15 Asn Glu Leu Val Ala Ile Asn Gln Tyr Phe Leu His Ala Arg Met Phe 20 25 30 Lys Asn Trp Gly Leu Lys Arg Leu Asn Asp Val Glu Tyr His Glu Ser 35 40 45 Ile Asp Glu Met Lys His Ala Asp Arg Tyr Ile Glu Arg Ile Leu Phe 50 55 60 Leu Glu Gly Leu Pro Asn Leu Gln Asp Leu Gly Lys Leu Asn Ile Gly 65 70 75 80 Glu Asp Val Glu Glu Met Leu Arg Ser Asp Leu Ala Leu Glu Leu Asp 85 90 95 Gly Ala Lys Asn Leu Arg Glu Ala Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val His 100 105 110 Asp Tyr Val Ser Arg Asp Met Met Ile Glu Ile Leu Arg Asp Glu Glu 115 120 125 Gly His Ile Asp Trp Leu Glu Thr Glu Leu Asp Leu Ile Gln Lys Met 130 135 140 Gly Leu Gln Asn Tyr Leu Gln Ala Gln Ile Arg Glu Glu Gly 145 150 155 <210> 4 <211> 255 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bacterioferritin DNA Seq <400> 4 atgaaaggtg atactaaagt tataaattat ctcaacaaac tgttgggaaa tgagcttgtc 60 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tggtttggca ttacacaaac tgctcaaggt 420 gttcacctct tctcatctcg gtatgttgat ttgtacggcg gcaatatgtt tcaatttgcc 480 accttgcctg tttatgatac tattaagtat tattctatca ttcctcacag tattcgttct 540 atccaaagtg atagaaaagc ttgggctgcc ttctacgtat ataaacttca accgttaact 600 ttcctgttgg atttttctgt tgatggttat atacgcagag ctatagactg tggttttaat 660 gatttgtcac aactccactg ctcatatgaa tccttcgatg ttgaatctgg agtttattca 720 720 <210> 7 <211> 734 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S1 Protein Seq <400> 7 Tyr Val Asp Val Gly Pro Asp Ser Val Lys Ser Ala Cys Ile Glu Val 1 5 10 15 Asp Ile Gln Gln Thr Phe Phe Asp Lys Thr Trp Pro Arg Pro Ile Asp 20 25 30 Val Ser Lys Ala Asp Gly Ile Ile Tyr Pro Gln Gly Arg Thr Tyr Ser 35 40 45 Asn Ile Thr Ile Thr Tyr Gln Gly Leu Phe Pro Tyr Gln Gly Asp His 50 55 60 Gly Asp Met Tyr Val Tyr Ser Ala Gly His Ala Thr Gly Thr Thr Pro 65 70 75 80 Gln Lys Leu Phe Val Ala Asn Tyr Ser Gln Asp Val Lys Gln Phe Ala 85 90 95 Asn Gly Phe Val Val Arg Ile Gly Ala Ala Ala Asn Ser Thr Gly Thr 100 105 110 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ttgttccaaa ataaaccagg ctctccatgg tgccaattta 2520 cgccaggatg attctgtacg taatttgttt gcgagcgtga aaagctctca atcatctcct 2580 atcataccag gttttggagg tgactttaat ttgacacttc tagaacctgt ttctatatct 2640 actggcagtc gtagtgcacg tagtgctatt gaggatttgc tatttgacaa agtcactata 2700 gctgatcctg gttatatgca aggttacgat gattgcatgc agcaaggtcc agcatcagct 2760 cgtgatctta tttgtgctca atatgtggct ggttacaaag tattacctcc tcttatggat 2820 gttaatatgg aagccgcgta tacttcatct ttgcttggca gcatagcagg tgttggctgg 2880 actgctggct tatcctcctt tgctgctatt ccatttgcac agagtatctt ttataggtta 2940 aacggtgttg gcattactca acaggttctt tcagagaacc aaaagcttat tgccaataag 3000 tttaatcagg ctctgggagc tatgcaaaca ggcttcacta caactaatga agcttttcag 3060 aaggttcagg atgctgtgaa caacaatgca caggctctat ccaaattagc tagcgagcta 3120 tctaatactt ttggtgctat ttccgcctct attggagaca tcatacaacg tcttgatgtt 3180 ctcgaacagg acgcccaaat agacagactt attaatggcc gtttgacaac actaaatgct 3240 tttgttgcac agcagcttgt tcgttccgaa tcagctgctc tttccgctca attggctaaa 3300 gataaagtca atgagtgtgt caaggcacaa tccaagcgtt ctggattttg cggtcaaggc 3360 acacatatag tgtcctttgt tgtaaatgcc cctaatggcc tttacttcat gcatgttggt 3420 tattacccta gcaaccacat tgaggttgtt tctgcttatg gtctttgcga tgcagctaac 3480 cctactaatt gtatagcccc tgttaatggc tactttatta aaactaataa cactaggatt 3540 gttgatgagt ggtcatatac tggctcgtcc ttctatgcac ctgagcccat tacctccctt 3600 aatactaagt atgttgcacc acaggtgaca taccaaaaca tttctactaa cctccctcct 3660 cctcttctcg gcaattccac cgggattgac ttccaagatg agttggatga gtttttcaaa 3720 aatgttagca ccagtatacc taattttggt tccctaacac agattaatac tacattactc 3780 gatcttacct acgagatgtt gtctcttcaa caagttgtta aagcccttaa tgagtcttac 3840 atagacctta aagagcttgg caattatact tattacaaca aatggccgtg gtacatttgg 3900 cttggtttca ttgctgggct tgttgcctta gctctatgcg tcttcttcat actgtgctgc 3960 actggttgtg gcacaaactg tatgggaaaa cttaagtgta atcgttgttg tgatagatac 4020 gaggaatacg acctcgagcc gcataaggtt catgttcac 4059 <210> 19 <211> 568 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Influenza HA Protein seq <400> 19 Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser 1 5 10 15 Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val 20 25 30 Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile 35 40 45 Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys 50 55 60 Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 65 70 75 80 Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val 85 90 95 Glu Lys Ala Asn Pro Thr Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Ser Phe Asn 100 105 110 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu 115 120 125 Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser 130 135 140 Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Leu Gly Ser Pro Ser Phe Phe 145 150 155 160 Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile 165 170 175 Lys Lys Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp 180 185 190 Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln 195 200 205 Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Ile Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg 210 215 220 Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly 225 230 235 240 Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn 245 250 255 Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile 260 265 270 Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly 275 280 285 Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser 290 295 300 Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys 305 310 315 320 Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser 325 330 335 Pro Gln Arg Glu Ser Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile 340 345 350 Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr 355 360 365 Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys 370 375 380 Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser 385 390 395 400 Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe 405 410 415 Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp 420 425 430 Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met 435 440 445 Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu 450 455 460 Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly 465 470 475 480 Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu 485 490 495 Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asn Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala 500 505 510 Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly 515 520 525 Thr Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala 530 535 540 Leu Ala Ile Met Met Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly 545 550 555 560 Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile 565 <210> 20 <211> 1779 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Influenza HA DNA seq <400> 20 agcaaaagca ggggttcaat ctgtaaaaat ggagaaaata gtgcttcttc ttgcaatagt 60 cagtcttgtt aaaagtgatc agatttgcat tggttaccat gcaaacaatt caacagagca 120 ggttgacaca atcatggaaa agaacgttac tgttacacat gcccaagaca tactggaaaa 180 gacacacaac gggaagctct gcgatctaga tggagtgaag cctctaattt taagagattg 240 tagtgtagct ggatggctcc tcgggaaccc aatgtgtgac gaattcatca atgtaccgga 300 atggtcttac atagtggaga aggccaatcc aaccaatgac ctctgttacc cagggagttt 360 caacgactat gaagaactga aacacctatt gagcagaata aaccattttg agaaaattca 420 aatcatcccc aaaagttctt ggtccgatca tgaagcctca tcaggagtga gctcagcatg 480 tccatacctg ggaagtccct ccttttttag aaatgtggta tggcttatca aaaagaacag 540 tacataccca acaataaaga aaagctacaa taataccaac caagaagatc ttttggtact 600 gtggggaatt caccatccta atgatgcggc agagcagaca aggctatatc aaaacccaac 660 cacctatatt tccattggga catcaacact aaaccagaga ttggtaccaa aaatagctac 720 tagatccaaa gtaaacgggc aaagtggaag gatggagttc ttctggacaa ttttaaaacc 780 taatgatgca atcaacttcg agagtaatgg aaatttcatt gctccagaat atgcatacaa 840 aattgtcaag aaaggggact cagcaattat gaaaagtgaa ttggaatatg gtaactgcaa 900 caccaagtgt caaactccaa tgggggcgat aaactctagt atgccattcc acaacataca 960 ccctctcacc atcggggaat gccccaaata tgtgaaatca aacagattag tccttgcaac 1020 agggctcaga aatagccctc aaagagagag cagaagaaaa aagagaggac tatttggagc 1080 tatagcaggt tttatagagg gaggatggca gggaatggta gatggttggt atgggtacca 1140 ccatagcaat gagcagggga gtgggtacgc tgcagacaaa gaatccactc aaaaggcaat 1200 agatggagtc accaataaag tcaactcaat cattgacaaa atgaacactc agtttgaggc 1260 cgttggaagg gaatttaata acttagaaag gagaatagag aatttaaaca agaagatgga 1320 agacgggttt ctagatgtct ggacttataa tgccgaactt ctggttctca tggaaaatga 1380 gagaactcta gactttcatg actcaaatgt taagaacctc tacgacaagg tccgactaca 1440 gcttagggat aatgcaaagg agctgggtaa cggttgtttc gagttctatc acaaatgtga 1500 taatgaatgt atggaaagta taagaaacgg aacgtacaac tatccgcagt attcagaaga 1560 agcaagatta aaaagagagg aaataagtgg ggtaaaattg gaatcaatag gaacttacca 1620 aatactgtca atttattcaa cagtggcgag ttccctagca ctggcaatca tgatggctgg 1680 tctatcttta tggatgtgct ccaatggatc gttacaatgc agaatttgca tttaaatttg 1740 tgagttcaga ttgtagttaa aaacaccctt gtttctact 1779 <210> 21 <211> 175 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human ferritin Protein seq <400> 21 Met Ser Ser Gln Ile Arg Gln Asn Tyr Ser Thr Asp Val Glu Ala Ala 1 5 10 15 Val Asn Ser Leu Val Asn Leu Tyr Leu Gln Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu 20 25 30 Ser Leu Gly Phe Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Glu Gly Val 35 40 45 Ser His Phe Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu Lys Arg Glu Gly Tyr Glu 50 55 60 Arg Leu Leu Lys Met Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Gln 65 70 75 80 Asp Ile Lys Lys Pro Ala Glu Asp Glu Trp Gly Lys Thr Pro Asp Ala 85 90 95 Met Lys Ala Ala Met Ala Leu Glu Lys Lys Leu Asn Gln Ala Leu Leu 100 105 110 Asp Leu His Ala Leu Gly Ser Ala Arg Thr Asp Pro His Leu Cys Asp 115 120 125 Phe Leu Glu Thr His Phe Leu Asp Glu Glu Val Lys Leu Ile Lys Lys 130 135 140 Met Gly Asp His Leu Thr Asn Leu His Arg Leu Gly Gly Pro Glu Ala 145 150 155 160 Gly Leu Gly Glu Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Thr Leu Lys His Asp 165 170 175 <210> 22 <211> 528 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human ferritin DNA seq <400> 22 atgagctctc agattcgtca gaactactcc accgacgtgg aggcagcagt taacagcctg 60 gtcaacctgt acctgcaagc atcctacacc tacctgtccc tgggtttcta cttcgaccgt 120 gacgacgtag ctctggaagg tgtttctcac ttcttccgcg agctggcaga agagaaacgt 180 gaaggttatg aacgcctgct gaaaatgcag aaccagcgcg gtggtcgtgc tctgttccag 240 gacatcaaga aaccagctga agatgaatgg ggcaaaaccc cggatgccat gaaagctgcc 300 atggcgctgg agaagaaact gaaccaggcg ctgctggatc tgcatgcgct gggttctgcg 360 cgtactgatc ctcatctgtg cgatttcctg gaaactcact ttctggatga agaagtgaaa 420 ctgatcaaga aaatgggcga ccacctgacc aatctgcacc gtctgggcgg cccggaagcg 480 ggcctgggcg aatatctgtt tgaacgtctg acgctgaaac acgactaa 528

Claims (15)

1. 목적 단백질;
   상기 목적 단백질의 N-말단에 결합된, 사람 유래 라이실 tRNA 합성효소로부터 분리한 N-말단 도메인(hLysRS N-terminal appended RNA interacting domain; hRID); 및
   상기 목적 단백질의 C-말단에 결합된, 페리틴(ferritin) 단백질;을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 자가조립 나노 입자 제조용 발현 벡터.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 hRID는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것인, 벡터.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 페리틴 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 것인, 벡터.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 벡터는 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 페리틴을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 사이에 링커를 더욱 포함하는 것인 벡터.
   
5. 제4항에 있어서,
   상기 링커는 서열번호 14의 염기서열로 표시되는 SSG 링커인, 벡터.
   
6. 제1항에 있어서,
   상기 목적 단백질은 항원, 항체, 세포수용체, 효소, 비정형 단백질, 구조 단백질 및 세포 단백질로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것인 벡터.
   
7. 제1항에 있어서,
   상기 목적 단백질은 바이러스 항원이고, 면역원성 에피토프가 삼합체 형태인 것인 벡터.
   
8. 제7항에 있어서,
   상기 면역원성 에피토프가 삼합체 형태인 바이러스는 중동호흡기증후군 코로나바이러스, 인플루엔자바이러스 H5N1, 인간면역결핍바이러스(human immunodeficiency virus; HIV), 광견병바이러스(rabies virus; RABV), 중증급성호흡기증후군바이러스(Severe Acute Respiratory Syndrome coronavirus; SARS-CoV)로 이루어진 군에서 선택되는 것인 벡터.
   
9. 제1항에 따른 발현벡터로 형질 전환된 숙주세포.
   
10. 제9항에 있어서,
    상기 숙주세포는 에스케리키아(Escherichia)속 세균; 바실러스 바실러스 (Bacillus)속 세균; 슈도모나스 (Pseudomonas)속 세균; 유산균; 효모; 동물세포; 및 곤충 세포로 이루어진 군에서 선택되는 것인 형질 전환된 숙주세포.
    
11. (a) 목적 단백질; 상기 목적 단백질의 N-말단에 결합된, 사람 유래 라이실 tRNA 합성효소로부터 분리한 N-말단 도메인(hLysRS N-terminal appended RNA interacting domain; hRID); 및 상기 목적 단백질의 C-말단에 결합된, 페리틴(ferritin) 단백질;을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;
    (b) 상기 발현 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계;
    (c) 상기 형질전환체를 배양하여 목적 단백질-페리틴 융합단백질의 발현을 유도하는 단계; 및
    (d) 상기 발현된 목적 단백질-페리틴 융합단백질의 자가조립에 의해 형성된 나노 입자를 정제하는 단계;를 포함하는 자가조립 나노 입자의 제조방법.
    
12. 제11항에 있어서,
    단계 (c)에서 형질전환체를 철 이온이 포함된 배지에서 배양하는 것인 제조방법.
    
13. 삭제
14. 제1항에 기재된 발현 벡터를 포함하는 바이러스 감염 진단용 조성물.
    
15. 제1항에 기재된 발현 벡터를 포함하는 면역 증강용 백신 조성물.
    

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