KR102073690B1 - 소장점막하조직의 탈세포화 방법 및 이로부터 제조된 무세포 소장점막조직 - Google Patents

소장점막하조직의 탈세포화 방법 및 이로부터 제조된 무세포 소장점막조직 Download PDF

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Abstract

본 발명은 소장점막하조직의 탈세포화 방법 및 이로부터 제조된 무세포 소장점막조직에 관한 것으로, 소장점막하조직의 탈세포화 방법에 있어서, (a) 인간을 제외한 포유동물의 소장점막하조직의 채취하여 효소제제를 처리하는 효소처리단계; (b) 상기 효소제제로 처리된 소장점막하조직을 동결하는 동결단계; (c) 상기 동결된 소장점막하조직을 해동하는 해동단계; 및 (d) 상기 해동된 소장점막하조직을 원심분리하여 세포외기질부분을 선택적으로 취하는 원심분리단계를 포함하는 소장점막하조직의 탈세포화 방법 및 이로부터 제조된 무세포 소장점막조직을 제공한다.

Description

소장점막하조직의 탈세포화 방법 및 이로부터 제조된 무세포 소장점막조직 {Decellularizing method of small intestinal submucosa and cell-free small intestinal submucosa made therefrom}
본 발명은 소장점막하조직의 탈세포화 방법 및 이로부터 제조된 무세포 소장점막조직에 관한 것으로 보다 상세하게는 포유동물의 소장점막하조직을 특별한 공정을 통해 탈세포화하는 방법 및 이로부터 제조된 무세포 소장점막조직에 관한 것이다.
소장점막하조직은 주로 1형 콜라겐으로 구성되어 있으며 세포친화력이 우수한 당 단백질과 각종 치유인자 또한 함유하고 있다. 소장점막하조직의 세포외기질은 탈세포화를 통해 생체 재료로서 이용될 수 있다. 소장점막하조직은 각막궤양, 피부 손상, 복벽이나 막성 구조물의 결핍, 손상된 인대나 건 등 다양하게 가공되어 적용될 수 있다. 현재까지 주로 돼지의 소장점막하조직이 상용화되어 이용되고 있다.
한편, 이종간의 조직이식은 잔존 세포와 물질들이 면역원이 되어 여러 부작용과 면역반응을 일으킬 수 있기 때문에, 이를 방지하기 위한 방법으로 다양한 탈세포화 기법을 적용해야 한다. 하지만 과도한 적용은 세포외기질의 손상을 일으키게 되고 이는 생체재료로서의 가치를 떨어트리게 된다.
현재 세계적으로 통용되고 있는 탈세포화의 기준은 3가지로 알려져 있다. 첫 번째로는 헤마톡실린 및 에오신 염색 (H & E)과 4’6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 염색에서 세포가 관찰되지 않아야 하고, 두 번째로 건조된 DNA 중량이 50ng/mg 이하여야 하며, 마지막으로 DNA 길이가 200 bp 이하여야 한다.
현재 소장점막하조직은 상용화 된 돼지 유래의 제품을 고가에 전량 수입해서 사용하는 실정이고, 최근 종교적인 이유와 인수공통 전염병 등의 이유로 다른 동물의 생체재료를 개발하려는 연구가 진행되고 있다.
따라서, 새로운 종에서의 무세포화 소장점막하조직의 개발이 시급히 요구되는 실정이다.
특허문헌 1 : 한국등록특허 제0750287호 특허문헌 2 : 한국등록특허 제1288088호 특허문헌 3 : 한국공개특허 제2003-0041389호
상기 문제점을 해결하기 위해 본 발명은 콜라겐의 변성없는 무세포의 소장점막하조직 지지체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 소장점막하조직을 탈세포화하는 데 있어서, 세포외기질을 거의 손상없이 분리함으로써 이를 이용하여 이종간에 이식시에 면역거부반응을 유발하지 않는 조직을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은 소장점막하조직의 탈세포화 방법에 있어서, (a) 인간을 제외한 포유동물의 소장점막하조직의 채취하여 효소제제를 처리하는 효소처리단계; (b) 상기 효소제제로 처리된 소장점막하조직을 동결하는 동결단계; (c) 상기 동결된 소장점막하조직을 해동하는 해동단계; 및 (d) 상기 해동된 소장점막하조직을 원심분리하여 세포외기질부분을 선택적으로 취하는 원심분리단계를 포함하는 소장점막하조직의 탈세포화 방법을 제공한다.
또한, 본 발명에 따르면, 상기 소장점막하조직은 돼지, 소, 개, 말의 소장점막하조직인 것을 특징으로 하는 소장점막하조직의 탈세포화 방법을 제공한다.
또한, 본 발명에 따르면, 상기 효소처리단계에서 염기성물질, 증류수, 트립신, EDTA를 추가하는 데, 염기성물질로 pH 8을 조절한 DW 용매 100중량부에 대하여 트립신 3~10중량부, EDTA 3~10중량부를 추가하여 35~40℃에서 1~2시간동안 처리하는 소장점막하조직의 탈세포화 방법을 제공한다.
또한, 본 발명에 따르면, 염기성물질은 NaOH, Tris EDTA 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 소장점막하조직의 탈세포화 방법을 제공한다.
또한, 본 발명에 따르면, 상기 동결단계에서 소장점막하조직의 동결은 -80℃ ~ -200℃에서 10~20분 동안 실시하는 것을 특징으로 하는 소장점막하조직의 탈세포화 방법을 제공한다.
또한, 본 발명에 따르면, 상기 해동단계에서 소장점막하조직의 해동은 30℃ ~ 40℃에서 10 ~ 20분 동안 실시하는 것을 특징으로 하는 소장점막하조직의 탈세포화 방법을 제공한다.
또한, 본 발명에 따르면, 동결단계 및 해동단계를 추가로 4 ~ 6회 더 실시하는 것을 특징으로 하는 소장점막하조직의 탈세포화 방법을 제공한다.
또한, 본 발명에 따르면, 상기 원심분리단계에서 원심분리는 12,000 ~ 18,000 rpm에서 15~25분 동안 실시하는 것을 특징으로 하는 소장점막하조직의 탈세포화 방법을 제공한다.
또한, 본 발명에 따르면, 상기 방법으로 제조된 무세포 소장점막하조직을 제공한다.
본 발명에 따른 소장점막하조직의 탈세포화 방법은 여러가지의 공정 조합하여 동물의 소장 점막을 무세포화 할 수 있으며, 단일 공정을 이용하여 콜라겐의 변성없이 탈세포화의 조건을 확립하였는 데, 효소제제 - 동결과 해동 - 원심분리로 구성된 공정으로 콜라겐의 변성없는 무세포의 소장점막하조직 지지체를 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 소장점막하조직의 탈세포화 방법은 세포와 면역원성 물질등을 효과적으로 제거하고 세포외기질을 거의 손상없이 분리함으로써 이를 이용하여 이종간에 이식시에 면역거부반응을 유발시키지 않는 효과가 있다.
본 발명에 따른 소장점막하조직의 탈세포화 방법은 탈세포화 하려는 조직의 특성에 따라 조건화 되어 사용되어지는데, 이들을 비교/분석하여 세포외기질의 손상이 적으면서 가장 효과적이고 효율적인 탈세포화 조건을 찾아내었으며, 이는 효소제제-동결과 해동-원심분리 방법을 이용하여 기존의 화학처리 혹은 삼투압을 처리한 방법보다 효율적이고 효과적으로 탈세포화 할 수 있다.
즉, 효소제제-동결과 해동-원심분리 방법을 통해 가장 효율적이고 콜라겐 변성이 적게 나타나며, 콜라겐의 손상도 적어서 의료용으로 활용가치가 높다.
본 발명에 따른 소장점막하조직의 탈세포화 방법으로 제조된 소장점막하조직은 세포외기질 물질로써 의료용으로 활용가능한 데, 복막결손, 각막궤양, 피부손상 등의 밴디지(bandage) 역할을 할 수 있다.
도 1은 포유동물인 말의 소장을 약 10cm로 분절한 사진이다.
도 2는 말의 소장에서 소장점막하조직만 남긴 모습을 나타낸 사진이다.
도 3은 탈세포 과정 없이 실시한 정상조직인 소장점막하조직의 조직학적 평가사진이다.
도 4는 SDS를 처리한 실험 1(비교예 1) ~ 실험 4(비교예 4) 그룹의 조직 염색사진이다.
도 5는 효소제제를 처리한 실험 5(비교예 5) ~ 실험 7(비교예 7)그룹의 조직 염색사진이다.
도 6은 동결과 해동을 반복 처리한 실험 8(비교예 8) 및 실험 9(비교예 9) 그룹의 조직 염색사진이다.
도 7은 효소제제-동결과 해동 4회 처리한 실험 10(비교예 10)과 효소제제-동결과 해동 4회 처리후 원심분리 처리한 실험 11(실시예 1)의 조직 염색사진이다.
도 8은 효소제제-동결과 해동 4회 처리후에 저장액(DW)(실험 12(비교예 11)), 고장액(NaOH)(실험 13(비교예 12)), 등장액(PBS)(실험 14(비교예 13))에 처리한 군의 조직 염색사진이다.
도 9는 효소제제-동결과 해동 4회 처리후에 SDS를 처리한 그룹(실험 15(비교예 14) ~ 실험 18(비교예 17))의 조직 염색사진이다.
도 10은 정상조직 및 실험 1 ~ 실험 18의 조직을 DNA 추출 후 Picogreen dsDNA assay kit를 이용하여 정량한 것을 비교한 도표이다.
도 11은 정상조직 및 실험 1 ~ 실험 18 조직에서 추출된 DNA의 전기영동 검사결과를 나타낸 것이다.
이하 본 발명에 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 우선, 도면들 중, 동일한 구성요소 또는 부품들은 가능한 한 동일한 참조부호를 나타내고 있음에 유의하여야 한다. 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명은 본 발명의 요지를 모호하지 않게 하기 위하여 생략한다.
본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 “약”, “실질적으로” 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.
본 발명은 소장점막하조직의 탈세포화 방법 및 이로부터 제조된 무세포 소장점막조직에 관한 것으로, 탈세포화 방법은 (a) 효소처리단계, (b) 동결단계, (c) 해동단계 및 (d) 원심분리단계를 거쳐 탈세포화를 완성한다.
이하 각 단계별로 탈세포화 과정을 설명하기로 한다.
(a) 효소처리단계
인간을 제외한 포유동물의 소장점막하조직을 채취하여 효소처리를 하는 데, 상기 포유동물로는 돼지, 소, 개, 말 등을 이용할 수 있다.
상기 소장점막하조직은 증류수(DW), 염기성물질, 트립신, EDTA(ethylenediaminetetra acetic acid)의 효소제제에 넣어줌으로써 이용하여 효소처리할 수 있다.
증류수(DW) 용매에 염기성물질을 추가하여 pH 8로 조절한다.
염기성물질로는 NaOH, Tris EDTA 중 어느 하나를 1이상 이용할 수 있다.
증류수에 염기성물질을 추가함으로써 pH 8로 조절할 수 있다. 이는 효소제제 중 트립신이 pH 8과 37℃ 하에서 가장 큰 활성도를 나타내며 세포 잔존물질들을 효과적으로 제거할 수 있기 때문이다.
염기성물질로 pH 8을 조절한 DW 용매 100중량부에 대하여 트립신 3~10중량부, EDTA 3~10중량부를 추가하여 35~40℃에서 1~2시간동안 소장점막하조직을 담가두어 처리한다.
상기 트립신은 탈세포화 과정에서 단백질 용해 가능한 효소제제로 DNA도 분절시킬 수 있는 효과가 있다. 상기 트립신은 농도와 시간에 영항을 받는데, 35~40℃하에서 3~10중량부가 포함하고 1~2시간 효소처리를 하게 되면 탈세포화와 함께 DNA 분절을 시킬 수 있게 된다.
상기 트립신이 DNA를 분절하였는지 여부는 전기영동 결과로 알 수 있는 데, 전기영동 결과를 관찰하였을 때, 트립신이 포함된 효소제제로 소장점막하조직을 처리하였을 때 모두 DNA가 분절되어 크기가 작아지는 것이 확인할 수 있었다.
상기 EDTA는 주로 트립신과 같이 사용하는 데, 세포외기질 단백질의 철이온을 격리시킴으로써 세포를 해리시키는 역할을 한다.
또한, 본 발명의 효소처리단계는 35~40℃에서 1~2시간 실시하는 것이 바람직하다.
35~40℃ 하에서 실시함으로써 트립신 및 EDTA를 활성화시켜 효과적으로 세포를 해리시키게 되며, 1~2시간 실시함으로써 콜라겐의 변성 일어나지 않아 세포외기질의 손상을 최소화할 수 있게 된다.
이러한 효소처리단계는 세포를 완전히 파괴하지는 못하지만 미세구조를 느슨하게 만들어 다른 탈세포 방법들의 침투력을 높이기 때문에 탈세포의 초기에 사용되는 것이 바람직하며 본 발명에서는 동결 및 해동 전에 이를 처리하였다.
(b) 동결단계 및 (c) 해동단계
효소제제로 처리된 소장점막하조직을 동결할 수 있는 데, 소장점막하조직의 동결은 -80℃ ~ -200℃에서 10~20분 동안 실시하는 것이 바람직하다.
상기 동결 과정에서는 세포와 주위의 간질액에서 얼음결정을 형성하며 세포손상을 주게 되고, 한 번의 수행으로도 면역원성을 효과적으로 줄일 수 있다.
이후 해동단계를 거치는 데, 상기 해동단계에서 소장점막하조직의 해동은 30℃ ~ 40℃에서 10 ~ 20분 동안 실시하는 것이 바람직하다.
한편, 동결 및 해동단계를 복수로 실시할 수도 있는 데, 동결단계 및 해동단계를 추가로 4 ~ 6회 더 실시할 수 있다. 이를 통해 세포와 세포외기질의 간격을 벌려 보다 효과적으로 세포외기질로 부터 세포를 분리할 수 있도록 할 수 있다.
4회 내지 6회 반복해서 동결 및 해동을 실시하더라도 세포외기질에는 큰 영향을 주지않으며, 효과적으로 세포손상을 주는것과 동시에 면역원성을 효과적으로 줄일 수 있다.
(d) 원심분리단계
해동단계 이후에는 원심분리단계를 거치는 데, 원심분리단계에서 원심분리는 12,000 ~ 18,000 rpm에서 15~25분 동안 실시하는 것이 바람직하다.
물리적 탈세포 방법 중 하나인 원심분리는 각막과 양막의 탈세포화에 적용되어 조직 사이의 세포 잔존물질들을 효과적으로 제거하는 데 효과적이다.
상기 원심분리는 효소처리단계에서의 트립신과 동결-해동 과정을 거쳐 세포외기질과 분리된 잔존세포물질들을 물리적으로 제거하는 역할을 한다. 상기 원심분리를 실시하는 장치를 특별히 제한되지 않는다.
이하, 본 발명의 실시예 및 비교예에 대하여 설명하는 데, 다양한 실험예를 통해 실시예 및 비교예 를 설명한다.
소장점막하조직 준비
포유동물인 말의 소장조직을 이용하여 소장점막하조직 준비하였는 데, 말의 소장 조직은 검역원에서 안락사 된 지 4시간 이내에 채취하여 차가운 PBS(phosphate-buffered saline) (pH 7.4)에 담근 채 옮겼다. 옮겨진 소장을 차가운 PBS에 수차례 세척한 뒤 길이가 약 10cm 되도록 분할하였다.
도 1은 포유동물인 말의 소장을 약 10cm로 분절한 사진이다.
도 1의 (A)에는 소장의 내측인 점막층이 관찰되며, 도 1의 (B)에는 소장의 외측인 장막층이 관찰된다.
다음 과정을 진행할 때까지 -70℃ 냉장고에 보관하였다.
냉장고에 보관된 소장 절편을 37℃의 항온수조에서 약 1시간동안 해동시켰다. 소장의 절편은 플라스틱 스크래퍼를 이용하여 장막층, 근육층, 점막층을 물리적으로 제거하였다. PBS로 세척한 뒤, 소장점막 샘플을 2 x 2 cm 조각으로 절단하고, 실험을 위해 18개의 그룹으로 나누었다.
도 2는 말의 소장에서 소장점막하조직만 남긴 모습을 나타낸 사진이다.
도 2의 (A)는 소장에서 소장점막하조직만 남기고 나머지는 기계적으로 제거한 모습이며, 도 2의 (B) 실험을 위해 2 ×2 cm로 분절하여 18개의 조직으로 나눈 모습이다.
나눠진 18개의 조직을 이용하여 18개의 다른 조건으로 실험을 실시하였다.
실험 1( 비교예 1) ~ 실험 4( 비교예 4)
소장점막하조직을 0.1% SDS(sodium dodecyl sulfate) 용액(비교예 1), 1% SDS 용액(비교예 2), 2% SDS 용액(비교예 3), 5% SDS 용액(비교예 4)에 각각 담궈 약 12시간동안 150 rpm의 교반기에서 교반하였다. 교반시 온도는 실온(25℃)에서 실시하였다.
이 후 24시간 동안 12시간마다 PBS 용액을 바꿔주며 세척하였다.
실험 5( 비교예 5) ~ 실험 7( 비교예 7)
소장점막하조직을 용액에 넣어 교반하였는 데, 상기 용액은 증류수를 염기성물질인 NaOH로 pH를 8로 맞춘 용매 100중량부에 트립신 5중량부와 EDTA 5중량부를 섞은 용액으로, 37℃로 150 rpm에 1시간(비교예 5), 24시간(비교예 6), 36시간(비교예 7)동안 교반하였다.
실험 8( 비교예 8) ~ 실험 9( 비교예 9)
소장점막하조직을 동결 및 해동하는 과정만 거쳤는 데, 동결기로는 ICE CUBE freezer (Series 14; SY-LAB GmbH, Purkersdorf, Austria)를 이용하여 15분 동안 - 80℃에서 동결시킨 뒤 37℃의 항온수조에서 15분간 해동시키는 과정을 각각 4회(비교예 8), 5회(비교예 9) 실시하였다.
실험 10( 비교예 10)
소장점막하조직을 효소처리단계, 동결단계 및 해동단계만을 거쳤는 데,
효소처리를 위해 증류수를 염기성물질인 NaOH로 pH를 8로 맞춘 용매 100중량부에 트립신 5중량부와 EDTA 5중량부를 담근 뒤에 진탕 배양기에서 150 rpm에 1시간동안 교반하였다.
동결단계를 위해 ICE CUBE freezer (Series 14; SY-LAB GmbH, Purkersdorf, Austria)를 이용하여 15분 동안 - 80℃에서 동결시킨 뒤, 해동단계를 위해 37℃의 항온수조에서 15분간 해동시키는 과정을 각각 4회 실시하였다.
실험 11( 실시예 1)
소장점막하조직을 효소처리단계, 동결단계, 해동단계 및 원심분리단계를 거쳤는 데,
소장점막하조직을 실험 10과 동일한 과정을 거친 뒤에 원심분리기를 이용하여 상온에서 15,000 rpm에서 20분 동안 원심분리를 하였다.
실험 12(비교예 11) ~ 실험 14(비교예 13)
소장점막하조직을 실험 10과 동일한 과정을 거친 뒤에,
각각 증류수(DW)(비교예 11), 5% NaCl(비교예 12), PBS(비교예 13)에 담궈 상온에서 150 rpm으로 24시간 동안 교반하였다.
실험 15(비교예 14) ~ 실험 18(비교예 17)
소장점막하조직을 실험 10과 동일한 과정을 거친 뒤에, 0.1% SDS 용액(비교예 14), 1% SDS 용액(비교예 15), 2% SDS 용액(비교예 16), 5% SDS 용액(비교예 17)에 각각 담궈 약 12시간동안 150 rpm의 교반기에서 교반하여 탈세포 하였고, 12시간 간격으로 2회에 걸쳐 PBS로 세척하였다.
실험 1 내지 실험 18의 공정을 간단히 정리하면 표 1과 같다.
실험그룹 탈세포화 공정
준비 1h 해동, 물리적 제거(장막층, 근육층, 점막층 제거)
실험 1(비교예1) 0.1% SDS용액-12h 교반, 24h PBS 세척
실험 2(비교예2) 1% SDS용액-12h 교반, 24h PBS 세척
실험 3(비교예3) 2% SDS용액-12h 교반, 24h PBS 세척
실험 4(비교예4) 5% SDS용액-12h 교반, 24h PBS 세척
실험 5(비교예5) NaOH, 트립신, EDTA 용액-1h 교반
실험 6(비교예6) NaOH, 트립신, EDTA 용액-24h 교반
실험 7(비교예7) NaOH, 트립신, EDTA 용액-36h 교반
실험 8(비교예8) 동결 및 해동 4회 반복
실험 9(비교예9) 동결 및 해동 5회 반복
실험10(비교예10) NaOH, 트립신, EDTA 용액-1h 교반, 동결 및 해동 4회 반복
실험11(실시예1) NaOH, 트립신, EDTA 용액-1h 교반, 동결 및 해동 4회 반복, 원심분리
실험12(비교예11) NaOH,트립신,EDTA 용액-1h 교반, 동결 및 해동 4회 반복, DW에 24h 교반
실험13(비교예12) NaOH,트립신,EDTA 용액-1h 교반, 동결 및 해동 4회 반복, NaOH에 24h 교반
실험14(비교예13) NaOH,트립신,EDTA 용액-1h 교반, 동결 및 해동 4회 반복, PBS에 24h 교반
실험15(비교예14) NaOH,트립신,EDTA 용액-1h 교반, 동결 및 해동 4회 반복, 0.1% SDS용액-12h 교반, 2회 PBS 세척(12h 간격)
실험16(비교예15) NaOH,트립신,EDTA 용액-1h 교반, 동결 및 해동 4회 반복, 1% SDS용액-12h 교반, 2회 PBS 세척(12h 간격)
실험17(비교예16) NaOH,트립신,EDTA 용액-1h 교반, 동결 및 해동 4회 반복, 2% SDS용액-12h 교반, 2회 PBS 세척(12h 간격)
실험18(비교예17) NaOH,트립신,EDTA 용액-1h 교반, 동결 및 해동 4회 반복, 5% SDS용액-12h 교반, 2회 PBS 세척(12h 간격)
실험 1 ~ 실험 18을 실시한 조직에 대하여 조직분석, DNA정량분석, 전기영동 및 통계분석을 실시하였다.
조직분석
실험 1 ~ 실험 18의 탈세포화 후, 소장점막하조직을 10% 포르말린에서 72시간 동안 고정시키고 수세하였다. 탈세포화된 샘플은 70%, 80%, 90%, 및 100% 에탄올로 순차적으로 탈수하고, 자일렌으로 세척한 뒤 파라핀으로 캐스팅하였다. 파라핀으로 포맷된 샘플은 Rotary microtome을 사용하여 4㎛ 단면으로 절단하고 H & E 염색하였다. 광학현미경으로 100배 배율로 단면을 관찰하였다. 세포핵을 확인하기 위해 DAPI로 염색하고 형광현미경으로 관찰하였다.
도 3은 탈세포 과정 없이 실시한 정상조직인 소장점막하조직의 조직학적 평가사진이다.
즉, 실험 1 ~ 실험 18의 실시 전, 장막층, 근육층, 점막층을 물리적으로 제거한 소장점막하조직의 H & E 염색 및 DAPI 염색하에서의 사진이다.
도 3의 (A)는 H & E 염색사진인데 점막하층에 세포가 촘촘히 관찰되며, 혈관 등 밀집된 곳에서는 세포가 더 많이 관찰된다. 즉, H & E 염색에서는 세포가 콜라겐 구조에 흩어져 분포했고 혈관과 같은 고밀도 조직에는 밀집해 있는 양상으로 관찰되었다.
도 3의 (B)는 DAPI 염색상에서는 세포핵이 염색되어 관찰된다.
도 4는 SDS를 처리한 실험 1(비교예 1) ~ 실험 4(비교예 4) 그룹의 조직 염색사진이다.
도 4의 (A)는 0.1 % SDS를 처리한 군의 H & E 염색, 도 4의 (B)는 0.1 % SDS를 처리한 군의 DAPI 염색 사진이다.(실험 1(비교예 1))
도 4의 (C)는 1 % SDS를 처리한 군의 H & E 염색, 도 4의 (D)는 1 % SDS를 처리한 군의 DAPI 염색사진이다. (실험 2(비교예 2))
도 4의 (E)는 2 % SDS를 처리한 군의 H & E 염색, 도 4의 (F)는 2 % SDS를 처리한 군의 DAPI 염색 사진이다. (실험 3(비교예 3))
도 4의 (G)는 5 % SDS를 처리한 군의 H & E 염색, 도 4의 (H)는 5 % SDS를 처리한 군의 DAPI 염색 사진이다. (실험 4(비교예 4))
실험 1 ~ 실험 4 모두 H & E 염색과 DAPI 염색에서 잔존세포는 관찰되지 않았으며, 실험 2(비교예 2)~ 실험 4(비교예 4)에서는 콜라겐의 변성이 관찰되었다. 즉, 1% 이상의 SDS 농도로 처리된 군에서 콜라겐의 변성이 관찰되었다.
도 5는 효소제제를 처리한 실험 5(비교예 5) ~ 실험 7(비교예 7)그룹의 조직 염색사진이다.
즉, NaOH로 pH를 8로 맞춘 용매 100중량부에 트립신 5중량부와 EDTA 5중량부를 섞은 용액으로 교반을 각각 1시간(실험 5(비교예 5)), 24시간(실험 6(비교예 6)), 36시간(실험 7(비교예 7)) 실시한 조직의 염색사진이다.
도 5의 (A)는 1 시간 효소제제를 처리한 군의 H & E 염색, 도 5의 (B)는 1 시간 효소제제를 처리한 군의 DAPI 염색사진이다.(실험 5(비교예 5))
도 5의 (C)는 24 시간 TE를 처리한 군의 H & E 염색, 도 5의 (D)는 24 시간 TE를 처리한 군의 DAPI 염색사진이다.(실험 6(비교예 6))
도 5의 (E)는 36 시간 TE를 처리한 군의 H & E 염색, 도 5의 (F)는 36 시간 TE를 처리한 군의 DAPI 염색사진이다.(실험 7(비교예 7))
실험 5 ~ 실험 7 모두 H & E 염색과 DAPI 염색에서 잔존세포는 관찰되지 않지만, 24시간(실험 6) 처리한 군부터 세포외기질(ECM)의 결손(붉은 화살표)이 관찰되기 시작하였다.
도 6은 동결과 해동을 반복 처리한 실험 8(비교예 8) 및 실험 9(비교예 9) 그룹의 조직 염색사진이다.
도 6의 (A)는 동결과 해동 4회 처리한 군의 H & E 염색, 도 6의 (B)는 동결과 해동 4회 처리한 군의 DAPI 염색사진이다.(실험 8(비교예 8))
도 6의 (C)는 동결과 해동 5회 처리한 군의 H & E 염색, 도 6의 (D)는 동결과 해동 5회 처리한 군의 DAPI 염색사진이다.(실험 9(비교예 9))
실험 8 및 실험 9의 조직에는 대조군인 정상조직과 유사한 수준으로 잔여세포가 분명히 남아 있는 것이 관찰되었다.
도 7은 효소제제-동결과 해동 4회 처리한 실험 10(비교예 10)과 효소제제-동결과 해동 4회 처리후 원심분리 처리한 실험 11(실시예 1)의 조직 염색사진이다.
도 7의 (A)는 효소제제-동결과 해동 4 회 처리한 군의 H & E 염색, 도 7의 (B)는 효소제제-동결과 해동 4회 처리한 군의 DAPI 염색사진이다.(실험 10(비교예 10))
도 7의 (C)는 효소제제-동결과 해동 4 회-원심분리 처리한 군의 H & E 염색, 도 7의 (D)는 효소제제-동결과 해동 4 회-원심분리 처리한 군의 DAPI 염색사진이다.(실험 11(실시예 1))
실험 10, 실험 11 모두 H & E 염색과 DAPI 염색에서 잔존세포는 관찰되지 않고 콜라겐의 성상이 정상조직과 유사하다.
도 8은 효소제제-동결과 해동 4회 처리후에 저장액(DW)(실험 12(비교예 11)), 고장액(NaOH)(실험 13(비교예 12)), 등장액(PBS)(실험 14(비교예 13))에 처리한 군의 조직 염색사진이다.
실험 12 ~ 실험 14의 조직 모두 H & E 염색과 DAPI 염색에서 잔존세포는 관찰되지 않지만 세포외기질(ECM)의 결손(붉은 화살표)이 관찰되었다.
도 9는 효소제제-동결과 해동 4회 처리후에 SDS를 처리한 그룹(실험 15(비교예 14) ~ 실험 18(비교예 17))의 조직 염색사진이다.
도 9의 (A)는 효소제제-동결과 해동 4회-0.1 % SDS를 처리한 군의 H & E 염색, 도 9의 (B)는 효소제제-동결과 해동 4회-0.1 % SDS를 처리한 군의 DAPI 염색사진이다.(실험 15(비교예 14))
도 9의 (C)는 효소제제-동결과 해동 4회 1 % SDS를 처리한 군의 H & E 염색, 도 9의 (D)는 효소제제-동결과 해동 4회-1 % SDS를 처리한 군의 DAPI 염색사진이다.(실험 16(비교예 15))
도 9의 (E)는 효소제제-동결과 해동 4회-2 % SDS를 처리한 군의 H & E 염색, 도 9의 (F)는 효소제제-동결과 해동 4회-2 % SDS를 처리한 군의 DAPI 염색사진이다.(실험 17(비교예 16))
도 9의 (G)는 효소제제-동결과 해동 4회-5 % SDS를 처리한 군의 H & E 염색, 도 9의 (H)는 효소제제-동결과 해동 4회-5 % SDS를 처리한 군의 DAPI 염색사진이다.(실험 18(비교예 17))
콜라겐의 변성은 실험 16 ~ 실험 18의 조직에서 나타났는 데, SDS 용액을 단독 처리한 실험 1 ~ 실험 4의 그룹과 마찬가지로 1% SDS를 처리한 군부터 콜라겐의 변성이 관찰되었다.
DNA 정량 분석
각 실험군인 실험 1 ~ 실험 18은 대조군인 정상조직과 DNA 함량을 비교하였을 때 모두 유의미한 차이가 나타났다(p <0.05).
도 10은 정상조직 및 실험 1 ~ 실험 18의 조직을 DNA 추출 후 Picogreen dsDNA assay kit를 이용하여 정량한 것을 비교한 도표이다.
One way ANOVA 분석 후에 p value가 0.05 이하일 때 유의적인 차이가 있다고 간주하였다. 도표에서 가로축의 숫자는 실험 1 ~ 실험 18의 번호를 나타낸 것이다.
대조군(정상조직)에서 DNA 양은 3,3에서 DNA 양은 3,385.78 ±123.52 ng/mg이었고, 네거티브 대조군 (DNA가 없는 군 (NC))의 DNA 양은 10.51 ±0.28 ng/mg 이었다.
실험 1 ~ 실험 4의 DNA 양은 각각 116.17 ±10.24 ng/mg, 1,024.21 ±27.51 ng/mg, 1,363.66 ±110.93 ng/mg, 1,806.71 ±217.01 ng/mg이었고, SDS의 농도가 감소함에 따라 점차적으로 감소했다.
실험 5 ~ 실험 7에서 DNA 양은 각각 877.52 ±55.77 ng/mg, 186.40 ±10.03 ng/mg 및 191.33 ±20.71 ng/mg이었다.
실험 8 및 실험 9에서 DNA 양은 각각 3422.15 ±622.15 ng/mg과 1924.63 ±215.01 ng/mg이었다. 실험 10 및 실험 11에서 DNA 양은 각각 864.15 ±10.69 ng/mg과 23.12 ±2.99 ng/mg이었다. 실험 12 ~ 실험 14에서 DNA 양은 각각 582.84 ±52.68 ng/mg, 124.85 ±21.40 ng/mg 및 294.69 ±13.69 ng/mg이었다. 실험 15 ~ 실험 18에서 DNA 양은 각각 47.76 ±0.68 ng/mg, 278.38 ±19.78 ng/mg, 333.19 ±3.77 ng/mg 및 346.04 ±34.68 ng/mg이었다.
전기영동
도 11은 정상조직 및 실험 1 ~ 실험 18 조직에서 추출된 DNA의 전기영동 검사결과를 나타낸 것이다.
DNA 분절의 크기는 아가로스 겔 전기영동에 의해 조사되었다. 대조군인 정상조직은 DNA가 분절되지 않은 채 내려가지 않는 것이 관찰되었다. SDS 단독으로 0.1 % 처리한 실험 1은 DNA가 분절되어 내려가는 것이 확인되었지만 실험 2 ~ 실험 4까지는 DNA 분절이 되지 않았다.
DNA 분절화가 실험 5 ~ 실험 7까지는 발견되었지만 크기가 200 bp 이상이었다. DNA 분절화는 실험 8 및 실험 9에서도 관찰되지 않았고 대조군(정상조직)과 유사하였다.
효소제제와 동결과 해동 처리한 실험 10 ~ 실험 18 까지는 모두 DNA가 분절되어 관찰되었으며, 원심분리까지 실시한 실험 11(실시예 1)에서는 DNA가 효과적으로 제거되어 관찰되지 않았다. 저장액(증류수)을 처리한 실험 12에서는 DNA 크기가 300 bp이하로 관찰되었다.
이에 따라 DNA가 분절된 상태에서 이를 효과적으로 제거한 실험 11이 DNA 분절 및 제거가 효과적으로 이루어졌다고 볼 수 있다.
이를 통해 본 발명은 효소제제- 동결과 해동- 원심분리로 구성된 공정으로 콜라겐의 변성없는 상태로 무세포의 소장점막하조직을 효과적으로 제조할 수 있다.
이상에서 설명한 본 발명은 전술한 실시예 및 첨부된 도면에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능함은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 명백할 것이다.

Claims (9)

  1. 소장점막하조직의 탈세포화 방법에 있어서,
    (a) 인간을 제외한 포유동물의 소장점막하조직을 채취하여 효소제제를 처리하는 효소처리단계;
    (b) 단계 (a)이후, 상기 효소제제로 처리된 소장점막하조직을 동결하는 동결단계;
    (c) 단계 (b)이후, 상기 동결된 소장점막하조직을 해동하는 해동단계; 및
    (d) 단계 (c)이후, 상기 해동된 소장점막하조직을 원심분리하여 세포외기질부분을 선택적으로 취하는 원심분리단계를 포함하고,
    단계 (a)에서 NaOH, 증류수, 트립신 및 EDTA를 추가하는 데,
    NaOH로 pH 8을 조절한 DW 용매 100중량부에 대하여 트립신 3~10중량부, EDTA 3~10중량부를 추가하여 35~40℃에서 1~2시간동안 처리하고,
    단계 (b) 및 단계 (c)를 추가로 4 ~ 6회 더 실시하는 소장점막하조직의 탈세포화 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 소장점막하조직은 돼지, 소, 개 및 말 중 어느 하나의 소장점막하조직인 것을 특징으로 하는 소장점막하조직의 탈세포화 방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 동결단계에서 소장점막하조직의 동결은 -80℃ ~ -200℃에서 10~20분 동안 실시하는 것을 특징으로 하는 소장점막하조직의 탈세포화 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 해동단계에서 소장점막하조직의 해동은 30℃ ~ 40℃에서 10 ~ 20분 동안 실시하는 것을 특징으로 하는 소장점막하조직의 탈세포화 방법.
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서,
    상기 원심분리단계에서 원심분리는 12,000 ~ 18,000 rpm에서 15~25분 동안 실시하는 것을 특징으로 하는 소장점막하조직의 탈세포화 방법.
  9. 제1항, 제2항, 제5항, 제6항 및 제8항 중 어느 한 항에 따라 제조된 무세포 소장점막하 조직.
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