KR102073690B1 - Decellularizing method of small intestinal submucosa and cell-free small intestinal submucosa made therefrom - Google Patents

Abstract

본 발명은 소장점막하조직의 탈세포화 방법 및 이로부터 제조된 무세포 소장점막조직에 관한 것으로, 소장점막하조직의 탈세포화 방법에 있어서, (a) 인간을 제외한 포유동물의 소장점막하조직의 채취하여 효소제제를 처리하는 효소처리단계; (b) 상기 효소제제로 처리된 소장점막하조직을 동결하는 동결단계; (c) 상기 동결된 소장점막하조직을 해동하는 해동단계; 및 (d) 상기 해동된 소장점막하조직을 원심분리하여 세포외기질부분을 선택적으로 취하는 원심분리단계를 포함하는 소장점막하조직의 탈세포화 방법 및 이로부터 제조된 무세포 소장점막조직을 제공한다.The present invention relates to a method for decellularization of small intestinal submucosa and to acellular small intestinal mucosa prepared therefrom, the method for decellularization of small intestinal submucosa, comprising: (a) extracting enzymes from small intestine An enzyme treatment step of treating the agent; (b) a freezing step of freezing the small intestinal submucosa treated with the enzyme preparation; (c) thawing the frozen small intestinal submucosa; And (d) centrifuging the thawed small intestinal submucosa to selectively take extracellular matrix portions to provide a method for decellularization of small intestinal submucosa and acellular small intestinal mucosa prepared therefrom.

Description

소장점막하조직의 탈세포화 방법 및 이로부터 제조된 무세포 소장점막조직 {Decellularizing method of small intestinal submucosa and cell-free small intestinal submucosa made therefrom}Decellularizing method of small intestinal submucosa and cell-free small intestinal mucosa prepared therefrom {Decellularizing method of small intestinal submucosa and cell-free small intestinal submucosa made therefrom}

본 발명은 소장점막하조직의 탈세포화 방법 및 이로부터 제조된 무세포 소장점막조직에 관한 것으로 보다 상세하게는 포유동물의 소장점막하조직을 특별한 공정을 통해 탈세포화하는 방법 및 이로부터 제조된 무세포 소장점막조직에 관한 것이다.The present invention relates to a method for decellularizing small intestine submucosa and acellular small intestine mucosa prepared therefrom. More specifically, a method for decellularizing small intestine submucosa in a mammal through a special process and acellular small intestine prepared therefrom It relates to mucosal tissue.

소장점막하조직은 주로 1형 콜라겐으로 구성되어 있으며 세포친화력이 우수한 당 단백질과 각종 치유인자 또한 함유하고 있다. 소장점막하조직의 세포외기질은 탈세포화를 통해 생체 재료로서 이용될 수 있다. 소장점막하조직은 각막궤양, 피부 손상, 복벽이나 막성 구조물의 결핍, 손상된 인대나 건 등 다양하게 가공되어 적용될 수 있다. 현재까지 주로 돼지의 소장점막하조직이 상용화되어 이용되고 있다.The small intestinal submucosa consists mainly of collagen type 1 and contains glycoproteins and various healing factors with excellent cell affinity. The extracellular matrix of the small intestinal submucosa can be used as a biomaterial through decellularization. Small intestinal submucosa can be applied to various processes such as corneal ulceration, skin damage, lack of abdominal wall or membrane structure, damaged ligaments or tendons. Until now, the small intestinal submucosa of pigs has been commercialized and used.

한편, 이종간의 조직이식은 잔존 세포와 물질들이 면역원이 되어 여러 부작용과 면역반응을 일으킬 수 있기 때문에, 이를 방지하기 위한 방법으로 다양한 탈세포화 기법을 적용해야 한다. 하지만 과도한 적용은 세포외기질의 손상을 일으키게 되고 이는 생체재료로서의 가치를 떨어트리게 된다.On the other hand, tissue transplantation between xenografts can be applied to various decellularization techniques as a way to prevent the remaining cells and substances become immunogens and cause various side effects and immune responses. Excessive application, however, results in damage to the extracellular matrix, which degrades its value as a biomaterial.

현재 세계적으로 통용되고 있는 탈세포화의 기준은 3가지로 알려져 있다. 첫 번째로는 헤마톡실린 및 에오신 염색 (H & E)과 4’6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 염색에서 세포가 관찰되지 않아야 하고, 두 번째로 건조된 DNA 중량이 50ng/mg 이하여야 하며, 마지막으로 DNA 길이가 200 bp 이하여야 한다. Currently, there are three known decellularization criteria that are commonly used throughout the world. First, no cells should be observed in hematoxylin and eosin staining (H & E) and 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining, and the second dried DNA weight should be less than 50 ng / mg. Finally, DNA length should be less than 200 bp.

현재 소장점막하조직은 상용화 된 돼지 유래의 제품을 고가에 전량 수입해서 사용하는 실정이고, 최근 종교적인 이유와 인수공통 전염병 등의 이유로 다른 동물의 생체재료를 개발하려는 연구가 진행되고 있다. Currently, small intestinal submucosa imports and uses commercially available pig-derived products at a high price. Recently, research is being conducted to develop biomaterials of other animals for religious reasons and common infectious diseases.

따라서, 새로운 종에서의 무세포화 소장점막하조직의 개발이 시급히 요구되는 실정이다.Therefore, the development of acellularized small intestinal submucosa in a new species is urgently required.

특허문헌 1 : 한국등록특허 제0750287호Patent Document 1: Korean Registered Patent No. 0750287 특허문헌 2 : 한국등록특허 제1288088호Patent Document 2: Korean Patent No. 1288088 특허문헌 3 : 한국공개특허 제2003-0041389호Patent Document 3: Korean Patent Publication No. 2003-0041389

상기 문제점을 해결하기 위해 본 발명은 콜라겐의 변성없는 무세포의 소장점막하조직 지지체를 제공하는 데 있다.The present invention to solve the above problems is to provide a cell-free small intestinal submucosal tissue support without collagen degeneration.

본 발명의 다른 목적은 소장점막하조직을 탈세포화하는 데 있어서, 세포외기질을 거의 손상없이 분리함으로써 이를 이용하여 이종간에 이식시에 면역거부반응을 유발하지 않는 조직을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to decellularize small intestinal submucosa, and to provide tissue that does not cause an immunorejection reaction upon transplantation between xenografts by separating extracellular matrix with little damage.

상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은 소장점막하조직의 탈세포화 방법에 있어서, (a) 인간을 제외한 포유동물의 소장점막하조직의 채취하여 효소제제를 처리하는 효소처리단계; (b) 상기 효소제제로 처리된 소장점막하조직을 동결하는 동결단계; (c) 상기 동결된 소장점막하조직을 해동하는 해동단계; 및 (d) 상기 해동된 소장점막하조직을 원심분리하여 세포외기질부분을 선택적으로 취하는 원심분리단계를 포함하는 소장점막하조직의 탈세포화 방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a method for decellularizing small intestinal submucosa, which comprises: (a) an enzyme treatment step of collecting an intestinal submucosa of a mammal, except for humans, to treat an enzyme preparation; (b) a freezing step of freezing the small intestinal submucosa treated with the enzyme preparation; (c) thawing the frozen small intestinal submucosa; And (d) centrifuging the thawed small intestinal submucosa to selectively remove extracellular matrix, thereby providing a decellularization method of the small intestinal submucosa.

또한, 본 발명에 따르면, 상기 소장점막하조직은 돼지, 소, 개, 말의 소장점막하조직인 것을 특징으로 하는 소장점막하조직의 탈세포화 방법을 제공한다.In addition, according to the present invention, the small intestinal submucosa provides a method for decellularization of the small intestinal submucosa, characterized in that the small intestine submucosa tissue of pigs, cattle, dogs, horses.

또한, 본 발명에 따르면, 상기 효소처리단계에서 염기성물질, 증류수, 트립신, EDTA를 추가하는 데, 염기성물질로 pH 8을 조절한 DW 용매 100중량부에 대하여 트립신 3~10중량부, EDTA 3~10중량부를 추가하여 35~40℃에서 1~2시간동안 처리하는 소장점막하조직의 탈세포화 방법을 제공한다.In addition, according to the present invention, in addition to the basic material, distilled water, trypsin, EDTA in the enzyme treatment step, trypsin 3 ~ 10 parts by weight, EDTA 3 ~ 10 parts by weight based on 100 parts by weight of DW solvent adjusted to pH 8 The addition of 10 parts by weight provides a method for decellularization of the small intestinal submucosa treated for 1 to 2 hours at 35 ~ 40 ℃.

또한, 본 발명에 따르면, 염기성물질은 NaOH, Tris EDTA 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 소장점막하조직의 탈세포화 방법을 제공한다.In addition, according to the present invention, the basic material provides a method for decellularization of the small intestinal submucosa, characterized in that any one of NaOH, Tris EDTA.

또한, 본 발명에 따르면, 상기 동결단계에서 소장점막하조직의 동결은 -80℃ ~ -200℃에서 10~20분 동안 실시하는 것을 특징으로 하는 소장점막하조직의 탈세포화 방법을 제공한다.In addition, according to the present invention, the freezing of the small intestinal submucosa in the freezing step provides a method for decellularization of the small intestinal submucosa, characterized in that performed for 10 to 20 minutes at -80 ℃ ~ -200 ℃.

또한, 본 발명에 따르면, 상기 해동단계에서 소장점막하조직의 해동은 30℃ ~ 40℃에서 10 ~ 20분 동안 실시하는 것을 특징으로 하는 소장점막하조직의 탈세포화 방법을 제공한다.In addition, according to the present invention, thawing of the small intestine submucosa in the thawing step provides a method for decellularization of the small intestinal submucosa, characterized in that carried out for 10 to 20 minutes at 30 ℃ to 40 ℃.

또한, 본 발명에 따르면, 동결단계 및 해동단계를 추가로 4 ~ 6회 더 실시하는 것을 특징으로 하는 소장점막하조직의 탈세포화 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for decellularization of the small intestinal submucosa, characterized in that the freezing step and thawing step are further performed 4 to 6 times.

또한, 본 발명에 따르면, 상기 원심분리단계에서 원심분리는 12,000 ~ 18,000 rpm에서 15~25분 동안 실시하는 것을 특징으로 하는 소장점막하조직의 탈세포화 방법을 제공한다.In addition, according to the present invention, the centrifugation in the centrifugation step provides a decellularization method of the small intestinal submucosa, characterized in that carried out for 15 to 25 minutes at 12,000 ~ 18,000 rpm.

또한, 본 발명에 따르면, 상기 방법으로 제조된 무세포 소장점막하조직을 제공한다.In addition, according to the present invention provides a cell-free small intestinal submucosa prepared by the above method.

본 발명에 따른 소장점막하조직의 탈세포화 방법은 여러가지의 공정 조합하여 동물의 소장 점막을 무세포화 할 수 있으며, 단일 공정을 이용하여 콜라겐의 변성없이 탈세포화의 조건을 확립하였는 데, 효소제제 - 동결과 해동 - 원심분리로 구성된 공정으로 콜라겐의 변성없는 무세포의 소장점막하조직 지지체를 제조할 수 있다.Decellularization method of the small intestine submucosa according to the present invention can be acellularized the small intestine mucosa of the animal by a combination of various processes, using a single process to establish the conditions of decellularization without degeneration of collagen, enzyme preparation-freezing Over thawing-A process consisting of centrifugation can produce a cell-free small intestinal submucosa scaffold without collagen degeneration.

본 발명에 따른 소장점막하조직의 탈세포화 방법은 세포와 면역원성 물질등을 효과적으로 제거하고 세포외기질을 거의 손상없이 분리함으로써 이를 이용하여 이종간에 이식시에 면역거부반응을 유발시키지 않는 효과가 있다.The decellularization method of the small intestinal submucosa according to the present invention effectively removes cells and immunogenic substances and separates extracellular matrix with almost no damage, thereby having no effect of inducing an immunorejection reaction when transplanted between xenografts.

본 발명에 따른 소장점막하조직의 탈세포화 방법은 탈세포화 하려는 조직의 특성에 따라 조건화 되어 사용되어지는데, 이들을 비교/분석하여 세포외기질의 손상이 적으면서 가장 효과적이고 효율적인 탈세포화 조건을 찾아내었으며, 이는 효소제제-동결과 해동-원심분리 방법을 이용하여 기존의 화학처리 혹은 삼투압을 처리한 방법보다 효율적이고 효과적으로 탈세포화 할 수 있다.The decellularization method of the small intestinal submucosa according to the present invention is conditioned according to the characteristics of the tissue to be decellularized, by comparing and analyzing them to find the most effective and efficient decellularization conditions with little damage to the extracellular matrix, It can be decellularized more efficiently and effectively than the conventional chemical treatment or osmotic pressure treatment method using enzyme preparation-synthesis and thawing-centrifugation.

즉, 효소제제-동결과 해동-원심분리 방법을 통해 가장 효율적이고 콜라겐 변성이 적게 나타나며, 콜라겐의 손상도 적어서 의료용으로 활용가치가 높다.In other words, enzyme preparation-synchronization and thawing-centrifugation method show the most efficient and less collagen degeneration and less damage of collagen, so it is highly useful for medical use.

본 발명에 따른 소장점막하조직의 탈세포화 방법으로 제조된 소장점막하조직은 세포외기질 물질로써 의료용으로 활용가능한 데, 복막결손, 각막궤양, 피부손상 등의 밴디지(bandage) 역할을 할 수 있다.The small intestinal submucosa prepared by the decellularization method of the small intestinal submucosa according to the present invention can be used for medical purposes as an extracellular matrix material, and may act as a bandage such as peritoneal defect, corneal ulcer, and skin damage.

도 1은 포유동물인 말의 소장을 약 10cm로 분절한 사진이다.
도 2는 말의 소장에서 소장점막하조직만 남긴 모습을 나타낸 사진이다.
도 3은 탈세포 과정 없이 실시한 정상조직인 소장점막하조직의 조직학적 평가사진이다.
도 4는 SDS를 처리한 실험 1(비교예 1) ~ 실험 4(비교예 4) 그룹의 조직 염색사진이다.
도 5는 효소제제를 처리한 실험 5(비교예 5) ~ 실험 7(비교예 7)그룹의 조직 염색사진이다.
도 6은 동결과 해동을 반복 처리한 실험 8(비교예 8) 및 실험 9(비교예 9) 그룹의 조직 염색사진이다.
도 7은 효소제제-동결과 해동 4회 처리한 실험 10(비교예 10)과 효소제제-동결과 해동 4회 처리후 원심분리 처리한 실험 11(실시예 1)의 조직 염색사진이다.
도 8은 효소제제-동결과 해동 4회 처리후에 저장액(DW)(실험 12(비교예 11)), 고장액(NaOH)(실험 13(비교예 12)), 등장액(PBS)(실험 14(비교예 13))에 처리한 군의 조직 염색사진이다.
도 9는 효소제제-동결과 해동 4회 처리후에 SDS를 처리한 그룹(실험 15(비교예 14) ~ 실험 18(비교예 17))의 조직 염색사진이다.
도 10은 정상조직 및 실험 1 ~ 실험 18의 조직을 DNA 추출 후 Picogreen dsDNA assay kit를 이용하여 정량한 것을 비교한 도표이다.
도 11은 정상조직 및 실험 1 ~ 실험 18 조직에서 추출된 DNA의 전기영동 검사결과를 나타낸 것이다.1 is a photograph of a small intestine of about 10 cm in length, which is a mammal.
Figure 2 is a photograph showing the appearance of only the small intestine submucosa in the small intestine of the horse.
3 is a histological evaluation photograph of the small intestinal submucosa, which is a normal tissue performed without decellularization.
Figure 4 is a tissue staining photograph of Experiment 1 (Comparative Example 1) to Experiment 4 (Comparative Example 4) group treated with SDS.
5 is a tissue staining picture of Experiment 5 (Comparative Example 5) to Experiment 7 (Comparative Example 7) treated with the enzyme preparation.
6 is a tissue staining picture of the Experiment 8 (Comparative Example 8) and the Experiment 9 (Comparative Example 9) group which was repeatedly treated with freezing and thawing.
7 is a tissue staining photograph of Experiment 10 (Comparative Example 10) treated with enzyme preparation-thaw 4 times and centrifugation after treatment with enzyme preparation-thaw 4 times.
FIG. 8 shows stock solution (DW) (Experiment 12 (Comparative Example 11)), hypertonic fluid (NaOH) (Experiment 13 (Comparative Example 12)), isotonic solution (PBS) after experiment 4 times of thawing. (Comparative Example 13) It is a tissue staining photograph of the group treated in ().
FIG. 9 is a tissue staining photograph of the group treated with SDS after four treatments of enzyme preparation-synthesis (Experiment 15 (Comparative Example 14) to Experiment 18 (Comparative Example 17)).
10 is a diagram comparing normal tissues and tissues of Experiments 1 to 18 after quantification using Picogreen dsDNA assay kit after DNA extraction.
Figure 11 shows the results of electrophoresis of DNA extracted from normal tissues and experiments 1 to 18 tissues.

이하 본 발명에 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 우선, 도면들 중, 동일한 구성요소 또는 부품들은 가능한 한 동일한 참조부호를 나타내고 있음에 유의하여야 한다. 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명은 본 발명의 요지를 모호하지 않게 하기 위하여 생략한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings. First of all, in the drawings, the same components or parts should be noted that the same reference numerals as possible. In describing the present invention, detailed descriptions of related well-known functions or configurations are omitted in order not to obscure the subject matter of the present invention.

본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 “약”, “실질적으로” 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.As used herein, the terms “about”, “substantially”, and the like, are used at, or in close proximity to, numerical values when manufacturing and material tolerances inherent in the meanings indicated are intended to aid the understanding of the invention. Accurate or absolute figures are used to assist in the prevention of unfair use by unscrupulous infringers.

본 발명은 소장점막하조직의 탈세포화 방법 및 이로부터 제조된 무세포 소장점막조직에 관한 것으로, 탈세포화 방법은 (a) 효소처리단계, (b) 동결단계, (c) 해동단계 및 (d) 원심분리단계를 거쳐 탈세포화를 완성한다.The present invention relates to a method for decellularizing small intestinal submucosa and to acellular small intestinal mucosa prepared therefrom, the method for decellularizing (a) an enzyme treatment step, (b) freezing step, (c) thawing step and (d) The decellularization is completed by centrifugation.

이하 각 단계별로 탈세포화 과정을 설명하기로 한다.Hereinafter, the decellularization process will be described for each step.

(a) 효소처리단계(a) enzyme treatment step

인간을 제외한 포유동물의 소장점막하조직을 채취하여 효소처리를 하는 데, 상기 포유동물로는 돼지, 소, 개, 말 등을 이용할 수 있다.The small intestinal submucosa of mammals other than humans is collected and subjected to enzyme treatment. As the mammals, pigs, cows, dogs, and horses can be used.

상기 소장점막하조직은 증류수(DW), 염기성물질, 트립신, EDTA(ethylenediaminetetra acetic acid)의 효소제제에 넣어줌으로써 이용하여 효소처리할 수 있다.The small intestinal submucosa can be enzymatically treated by putting it in an enzyme preparation of distilled water (DW), a basic substance, trypsin, and ethylenediaminetetra acetic acid (EDTA).

증류수(DW) 용매에 염기성물질을 추가하여 pH 8로 조절한다.The pH is adjusted to 8 by adding a basic substance to the distilled water (DW) solvent.

염기성물질로는 NaOH, Tris EDTA 중 어느 하나를 1이상 이용할 수 있다.As the basic material, any one or more of NaOH and Tris EDTA may be used.

증류수에 염기성물질을 추가함으로써 pH 8로 조절할 수 있다. 이는 효소제제 중 트립신이 pH 8과 37℃ 하에서 가장 큰 활성도를 나타내며 세포 잔존물질들을 효과적으로 제거할 수 있기 때문이다.The pH can be adjusted to 8 by adding a basic substance to distilled water. This is because trypsin shows the highest activity under pH 8 and 37 ° C and can effectively remove cell remnants.

염기성물질로 pH 8을 조절한 DW 용매 100중량부에 대하여 트립신 3~10중량부, EDTA 3~10중량부를 추가하여 35~40℃에서 1~2시간동안 소장점막하조직을 담가두어 처리한다.Add 3 to 10 parts by weight of trypsin and 3 to 10 parts by weight of EDTA with respect to 100 parts by weight of the DW solvent adjusted to pH 8 with a basic substance, and soak the submucosal tissue for 1 to 2 hours at 35 to 40 ° C.

상기 트립신은 탈세포화 과정에서 단백질 용해 가능한 효소제제로 DNA도 분절시킬 수 있는 효과가 있다. 상기 트립신은 농도와 시간에 영항을 받는데, 35~40℃하에서 3~10중량부가 포함하고 1~2시간 효소처리를 하게 되면 탈세포화와 함께 DNA 분절을 시킬 수 있게 된다.The trypsin has the effect of segmenting DNA into protein soluble enzyme preparation during decellularization. The trypsin is affected by concentration and time, including 3-10 parts by weight under 35-40 ° C. and enzymatic treatment for 1 to 2 hours to allow DNA fragmentation with decellularization.

상기 트립신이 DNA를 분절하였는지 여부는 전기영동 결과로 알 수 있는 데, 전기영동 결과를 관찰하였을 때, 트립신이 포함된 효소제제로 소장점막하조직을 처리하였을 때 모두 DNA가 분절되어 크기가 작아지는 것이 확인할 수 있었다.Whether or not the trypsin segmented the DNA can be seen by the electrophoresis results, when observing the electrophoresis results, when the small intestinal mucosal tissue is treated with enzyme preparations containing trypsin all DNA is confirmed to be smaller in size Could.

상기 EDTA는 주로 트립신과 같이 사용하는 데, 세포외기질 단백질의 철이온을 격리시킴으로써 세포를 해리시키는 역할을 한다.The EDTA is mainly used with trypsin, and serves to dissociate cells by sequestering iron ions of the extracellular matrix protein.

또한, 본 발명의 효소처리단계는 35~40℃에서 1~2시간 실시하는 것이 바람직하다.In addition, the enzyme treatment step of the present invention is preferably carried out for 1 to 2 hours at 35 ~ 40 ℃.

35~40℃ 하에서 실시함으로써 트립신 및 EDTA를 활성화시켜 효과적으로 세포를 해리시키게 되며, 1~2시간 실시함으로써 콜라겐의 변성 일어나지 않아 세포외기질의 손상을 최소화할 수 있게 된다.By carrying out at 35 ~ 40 ℃ activates trypsin and EDTA to dissociate cells effectively, and by performing for 1 to 2 hours, collagen degeneration does not occur, thereby minimizing damage to extracellular matrix.

이러한 효소처리단계는 세포를 완전히 파괴하지는 못하지만 미세구조를 느슨하게 만들어 다른 탈세포 방법들의 침투력을 높이기 때문에 탈세포의 초기에 사용되는 것이 바람직하며 본 발명에서는 동결 및 해동 전에 이를 처리하였다.This enzyme treatment step does not completely destroy the cells, but it is preferable to be used in the early stage of decellularization because it loosens the microstructure to increase the penetration of other decellularization methods, and in the present invention, it was treated before freezing and thawing.

(b) 동결단계 및 (c) 해동단계(b) freezing and (c) thawing

효소제제로 처리된 소장점막하조직을 동결할 수 있는 데, 소장점막하조직의 동결은 -80℃ ~ -200℃에서 10~20분 동안 실시하는 것이 바람직하다.The small intestinal submucosa treated with the enzyme preparation can be frozen, and the small intestinal submucosa is preferably frozen at -80 ° C to -200 ° C for 10 to 20 minutes.

상기 동결 과정에서는 세포와 주위의 간질액에서 얼음결정을 형성하며 세포손상을 주게 되고, 한 번의 수행으로도 면역원성을 효과적으로 줄일 수 있다.In the freezing process, ice crystals are formed in cells and surrounding interstitial fluid, and cell damage is caused, and immunogenicity can be effectively reduced with a single run.

이후 해동단계를 거치는 데, 상기 해동단계에서 소장점막하조직의 해동은 30℃ ~ 40℃에서 10 ~ 20분 동안 실시하는 것이 바람직하다.After the thawing step, the thawing of the small intestinal submucosa in the thawing step is preferably carried out for 10 to 20 minutes at 30 ℃ to 40 ℃.

한편, 동결 및 해동단계를 복수로 실시할 수도 있는 데, 동결단계 및 해동단계를 추가로 4 ~ 6회 더 실시할 수 있다. 이를 통해 세포와 세포외기질의 간격을 벌려 보다 효과적으로 세포외기질로 부터 세포를 분리할 수 있도록 할 수 있다.Meanwhile, the freezing and thawing step may be performed in plural, and the freezing and thawing step may be additionally performed 4 to 6 times. Through this, it is possible to separate the cells from the extracellular matrix by increasing the gap between the cells and the extracellular matrix.

4회 내지 6회 반복해서 동결 및 해동을 실시하더라도 세포외기질에는 큰 영향을 주지않으며, 효과적으로 세포손상을 주는것과 동시에 면역원성을 효과적으로 줄일 수 있다.Repeated freezing and thawing four to six times does not significantly affect extracellular matrix, and can effectively reduce cell cytotoxicity and reduce immunogenicity.

(d) 원심분리단계(d) centrifugation step

해동단계 이후에는 원심분리단계를 거치는 데, 원심분리단계에서 원심분리는 12,000 ~ 18,000 rpm에서 15~25분 동안 실시하는 것이 바람직하다.After the thawing step, the centrifugation step is performed. In the centrifugation step, the centrifugation is preferably performed at 12,000 to 18,000 rpm for 15 to 25 minutes.

물리적 탈세포 방법 중 하나인 원심분리는 각막과 양막의 탈세포화에 적용되어 조직 사이의 세포 잔존물질들을 효과적으로 제거하는 데 효과적이다.Centrifugation, one of the physical decellularization methods, is applied to the decellularization of the cornea and amnion and is effective in effectively removing cell remnants between tissues.

상기 원심분리는 효소처리단계에서의 트립신과 동결-해동 과정을 거쳐 세포외기질과 분리된 잔존세포물질들을 물리적으로 제거하는 역할을 한다. 상기 원심분리를 실시하는 장치를 특별히 제한되지 않는다.The centrifugation serves to physically remove the remaining cellular material separated from the extracellular matrix through trypsin and freeze-thaw in the enzyme treatment step. The apparatus for carrying out the centrifugation is not particularly limited.

이하, 본 발명의 실시예 및 비교예에 대하여 설명하는 데, 다양한 실험예를 통해 실시예 및 비교예 를 설명한다.Hereinafter, examples and comparative examples of the present invention will be described. Examples and comparative examples will be described through various experimental examples.

소장점막하조직Small intestinal mucosa 준비 Ready

포유동물인 말의 소장조직을 이용하여 소장점막하조직 준비하였는 데, 말의 소장 조직은 검역원에서 안락사 된 지 4시간 이내에 채취하여 차가운 PBS(phosphate-buffered saline) (pH 7.4)에 담근 채 옮겼다. 옮겨진 소장을 차가운 PBS에 수차례 세척한 뒤 길이가 약 10cm 되도록 분할하였다. The small intestine submucosa was prepared using the small intestine tissue of a horse. The small intestine tissue of the horse was taken within 4 hours after being euthanized by the quarantine and soaked in cold PBS (phosphate-buffered saline) (pH 7.4). The transferred small intestine was washed several times in cold PBS and divided into about 10 cm in length.

도 1은 포유동물인 말의 소장을 약 10cm로 분절한 사진이다.1 is a photograph of a small intestine of a mammal, which is divided into about 10 cm.

도 1의 (A)에는 소장의 내측인 점막층이 관찰되며, 도 1의 (B)에는 소장의 외측인 장막층이 관찰된다.In FIG. 1A, the mucosal layer inside the small intestine is observed, and in FIG. 1B, the mucosal layer outside the small intestine is observed.

다음 과정을 진행할 때까지 -70℃ 냉장고에 보관하였다.It was stored in a -70 ℃ refrigerator until the next process.

냉장고에 보관된 소장 절편을 37℃의 항온수조에서 약 1시간동안 해동시켰다. 소장의 절편은 플라스틱 스크래퍼를 이용하여 장막층, 근육층, 점막층을 물리적으로 제거하였다. PBS로 세척한 뒤, 소장점막 샘플을 2 x 2 cm 조각으로 절단하고, 실험을 위해 18개의 그룹으로 나누었다.Small intestine sections stored in the refrigerator were thawed in a constant temperature water bath at 37 ° C. for about 1 hour. Sections of the small intestine were physically removed from the membrane, muscle and mucosa layers using a plastic scraper. After washing with PBS, small intestinal mucosa samples were cut into 2 × 2 cm pieces and divided into 18 groups for experiments.

도 2는 말의 소장에서 소장점막하조직만 남긴 모습을 나타낸 사진이다. Figure 2 is a photograph showing the appearance of only the small intestine submucosa in the small intestine of the horse.

도 2의 (A)는 소장에서 소장점막하조직만 남기고 나머지는 기계적으로 제거한 모습이며, 도 2의 (B) 실험을 위해 2 ×2 cm로 분절하여 18개의 조직으로 나눈 모습이다.Figure 2 (A) is a small intestine mucosa tissue in the small intestine, the remainder is mechanically removed, divided into 18 tissues divided into 2 × 2 cm for the experiment of Figure 2 (B).

나눠진 18개의 조직을 이용하여 18개의 다른 조건으로 실험을 실시하였다.Using 18 divided tissues, the experiment was conducted under 18 different conditions.

실험 1(Experiment 1 ( 비교예Comparative example 1) ~ 실험 4( 1) ~ Experiment 4 ( 비교예Comparative example 4) 4)

소장점막하조직을 0.1% SDS(sodium dodecyl sulfate) 용액(비교예 1), 1% SDS 용액(비교예 2), 2% SDS 용액(비교예 3), 5% SDS 용액(비교예 4)에 각각 담궈 약 12시간동안 150 rpm의 교반기에서 교반하였다. 교반시 온도는 실온(25℃)에서 실시하였다.The small intestinal submucosa was added to 0.1% sodium dodecyl sulfate (Comparative Example 1), 1% SDS solution (Comparative Example 2), 2% SDS solution (Comparative Example 3), and 5% SDS solution (Comparative Example 4). Dip and stir in a stirrer at 150 rpm for about 12 hours. The temperature at the time of stirring was performed at room temperature (25 degreeC).

이 후 24시간 동안 12시간마다 PBS 용액을 바꿔주며 세척하였다.This was followed by washing with PBS solution every 12 hours for 24 hours.

실험 5(Experiment 5 ( 비교예Comparative example 5) ~ 실험 7( 5) ~ Experiment 7 ( 비교예Comparative example 7) 7)

소장점막하조직을 용액에 넣어 교반하였는 데, 상기 용액은 증류수를 염기성물질인 NaOH로 pH를 8로 맞춘 용매 100중량부에 트립신 5중량부와 EDTA 5중량부를 섞은 용액으로, 37℃로 150 rpm에 1시간(비교예 5), 24시간(비교예 6), 36시간(비교예 7)동안 교반하였다. The small intestinal mucosa was added to the solution and stirred. The solution was a mixture of 5 parts by weight of trypsin and 5 parts by weight of EDTA in 100 parts by weight of distilled water, which was adjusted to pH 8 with basic NaOH. It stirred for 1 hour (comparative example 5), 24 hours (comparative example 6), and 36 hours (comparative example 7).

실험 8(Experiment 8 ( 비교예Comparative example 8) ~ 실험 9( 8) to Experiment 9 ( 비교예Comparative example 9) 9)

소장점막하조직을 동결 및 해동하는 과정만 거쳤는 데, 동결기로는 ICE CUBE freezer (Series 14; SY-LAB GmbH, Purkersdorf, Austria)를 이용하여 15분 동안 - 80℃에서 동결시킨 뒤 37℃의 항온수조에서 15분간 해동시키는 과정을 각각 4회(비교예 8), 5회(비교예 9) 실시하였다.Only the process of freezing and thawing the small intestinal submucosa was performed. The freezer was frozen at -80 ° C for 15 minutes using an ICE CUBE freezer (Series 14; SY-LAB GmbH, Purkersdorf, Austria). The thawing process for 15 minutes at was performed 4 times (Comparative Example 8) and 5 times (Comparative Example 9).

실험 10(Experiment 10 ( 비교예Comparative example 10)  10)

소장점막하조직을 효소처리단계, 동결단계 및 해동단계만을 거쳤는 데,The small intestinal submucosa has undergone only enzyme treatment, freezing and thawing.

효소처리를 위해 증류수를 염기성물질인 NaOH로 pH를 8로 맞춘 용매 100중량부에 트립신 5중량부와 EDTA 5중량부를 담근 뒤에 진탕 배양기에서 150 rpm에 1시간동안 교반하였다.For enzymatic treatment, 5 parts by weight of trypsin and 5 parts by weight of EDTA were immersed in 100 parts by weight of a solvent adjusted to pH 8 with basic NaOH, followed by stirring at 150 rpm in a shaking incubator for 1 hour.

동결단계를 위해 ICE CUBE freezer (Series 14; SY-LAB GmbH, Purkersdorf, Austria)를 이용하여 15분 동안 - 80℃에서 동결시킨 뒤, 해동단계를 위해 37℃의 항온수조에서 15분간 해동시키는 과정을 각각 4회 실시하였다.Freeze for 15 minutes using ICE CUBE freezer (Series 14; SY-LAB GmbH, Purkersdorf, Austria) for freezing at -80 ° C and thaw for 15 minutes in a constant temperature bath at 37 ° C for thawing. Four times each.

실험 11(Experiment 11 ( 실시예Example 1) One)

소장점막하조직을 효소처리단계, 동결단계, 해동단계 및 원심분리단계를 거쳤는 데,Intestinal submucosa was subjected to enzyme treatment, freezing, thawing and centrifugation.

소장점막하조직을 실험 10과 동일한 과정을 거친 뒤에 원심분리기를 이용하여 상온에서 15,000 rpm에서 20분 동안 원심분리를 하였다.After the small intestinal submucosa was subjected to the same procedure as in Experiment 10, centrifugation was performed at 15,000 rpm for 20 minutes at room temperature.

실험 12(비교예 11) ~ 실험 14(비교예 13)Experiment 12 (Comparative Example 11) to Experiment 14 (Comparative Example 13)

소장점막하조직을 실험 10과 동일한 과정을 거친 뒤에,After the small intestinal submucosa was subjected to the same procedure as in Experiment 10,

각각 증류수(DW)(비교예 11), 5% NaCl(비교예 12), PBS(비교예 13)에 담궈 상온에서 150 rpm으로 24시간 동안 교반하였다. Each was immersed in distilled water (DW) (Comparative Example 11), 5% NaCl (Comparative Example 12), PBS (Comparative Example 13) and stirred for 24 hours at 150 rpm at room temperature.

실험 15(비교예 14) ~ 실험 18(비교예 17)Experiment 15 (Comparative Example 14) to Experiment 18 (Comparative Example 17)

소장점막하조직을 실험 10과 동일한 과정을 거친 뒤에, 0.1% SDS 용액(비교예 14), 1% SDS 용액(비교예 15), 2% SDS 용액(비교예 16), 5% SDS 용액(비교예 17)에 각각 담궈 약 12시간동안 150 rpm의 교반기에서 교반하여 탈세포 하였고, 12시간 간격으로 2회에 걸쳐 PBS로 세척하였다.After the small intestinal submucosa was subjected to the same procedure as in Experiment 10, 0.1% SDS solution (Comparative Example 14), 1% SDS solution (Comparative Example 15), 2% SDS solution (Comparative Example 16), 5% SDS solution (Comparative Example) 17), each cell was decellularized by stirring in a stirrer at 150 rpm for about 12 hours, and washed twice with PBS at 12 hour intervals.

실험 1 내지 실험 18의 공정을 간단히 정리하면 표 1과 같다.Table 1 briefly summarizes the processes of Experiments 1 to 18.

실험그룹Experiment group 탈세포화 공정Decellularization Process 준비Ready 1h 해동, 물리적 제거(장막층, 근육층, 점막층 제거)1h thawing, physical removal (removal of membranes, muscles, mucosa) 실험 1(비교예1)Experiment 1 (Comparative Example 1) 0.1% SDS용액-12h 교반, 24h PBS 세척0.1% SDS solution-12h stirred, 24h PBS wash 실험 2(비교예2)Experiment 2 (Comparative Example 2) 1% SDS용액-12h 교반, 24h PBS 세척1% SDS solution-12h stirred, 24h PBS wash 실험 3(비교예3)Experiment 3 (Comparative Example 3) 2% SDS용액-12h 교반, 24h PBS 세척2% SDS solution-12h stirred, 24h PBS wash 실험 4(비교예4)Experiment 4 (Comparative Example 4) 5% SDS용액-12h 교반, 24h PBS 세척5% SDS solution-12h stirred, 24h PBS wash 실험 5(비교예5)Experiment 5 (Comparative Example 5) NaOH, 트립신, EDTA 용액-1h 교반NaOH, trypsin, EDTA solution-1h stirring 실험 6(비교예6)Experiment 6 (Comparative Example 6) NaOH, 트립신, EDTA 용액-24h 교반NaOH, trypsin, EDTA solution-24h stirring 실험 7(비교예7)Experiment 7 (Comparative Example 7) NaOH, 트립신, EDTA 용액-36h 교반NaOH, trypsin, EDTA solution-36h stirring 실험 8(비교예8)Experiment 8 (Comparative Example 8) 동결 및 해동 4회 반복Freeze and thaw 4 times 실험 9(비교예9)Experiment 9 (Comparative Example 9) 동결 및 해동 5회 반복Freeze and thaw 5 times 실험10(비교예10)Experiment 10 (Comparative Example 10) NaOH, 트립신, EDTA 용액-1h 교반, 동결 및 해동 4회 반복NaOH, trypsin, EDTA solution-1h stirring, freezing and thawing 4 times 실험11(실시예1)Experiment 11 (Example 1) NaOH, 트립신, EDTA 용액-1h 교반, 동결 및 해동 4회 반복, 원심분리NaOH, trypsin, EDTA solution-1h stirring, freezing and thawing 4 times, centrifugation 실험12(비교예11)Experiment 12 (Comparative Example 11) NaOH,트립신,EDTA 용액-1h 교반, 동결 및 해동 4회 반복, DW에 24h 교반NaOH, trypsin, EDTA solution-1h stirring, freezing and thawing 4 times, 24h stirring in DW 실험13(비교예12)Experiment 13 (Comparative Example 12) NaOH,트립신,EDTA 용액-1h 교반, 동결 및 해동 4회 반복, NaOH에 24h 교반NaOH, trypsin, EDTA solution-1h stirring, freezing and thawing 4 times, stirring 24h in NaOH 실험14(비교예13)Experiment 14 (Comparative Example 13) NaOH,트립신,EDTA 용액-1h 교반, 동결 및 해동 4회 반복, PBS에 24h 교반NaOH, trypsin, EDTA solution-1h stirring, freezing and thawing 4 times, stirring in PBS 24h 실험15(비교예14)Experiment 15 (Comparative Example 14) NaOH,트립신,EDTA 용액-1h 교반, 동결 및 해동 4회 반복, 0.1% SDS용액-12h 교반, 2회 PBS 세척(12h 간격)NaOH, trypsin, EDTA solution-1h Stir, freeze and thaw 4 times, 0.1% SDS solution-12h, 2 times PBS wash (12h interval) 실험16(비교예15)Experiment 16 (Comparative Example 15) NaOH,트립신,EDTA 용액-1h 교반, 동결 및 해동 4회 반복, 1% SDS용액-12h 교반, 2회 PBS 세척(12h 간격)NaOH, Trypsin, EDTA solution-1h Stir, freeze and thaw 4 times, 1% SDS solution-12h, 2 times PBS wash (12h interval) 실험17(비교예16)Experiment 17 (Comparative Example 16) NaOH,트립신,EDTA 용액-1h 교반, 동결 및 해동 4회 반복, 2% SDS용액-12h 교반, 2회 PBS 세척(12h 간격)NaOH, trypsin, EDTA solution-1h Stir, freeze and thaw 4 times, 2% SDS solution-12h, 2 times PBS wash (12h interval) 실험18(비교예17)Experiment 18 (Comparative Example 17) NaOH,트립신,EDTA 용액-1h 교반, 동결 및 해동 4회 반복, 5% SDS용액-12h 교반, 2회 PBS 세척(12h 간격)NaOH, trypsin, EDTA solution-1h Stir, freeze and thaw 4 times, 5% SDS solution-12h, 2 times PBS wash (12h interval)

실험 1 ~ 실험 18을 실시한 조직에 대하여 조직분석, DNA정량분석, 전기영동 및 통계분석을 실시하였다.Tissue analysis, DNA quantitative analysis, electrophoresis and statistical analysis were performed on the tissues from Experiment 1 to Experiment 18.

조직분석Organizational Analysis

실험 1 ~ 실험 18의 탈세포화 후, 소장점막하조직을 10% 포르말린에서 72시간 동안 고정시키고 수세하였다. 탈세포화된 샘플은 70%, 80%, 90%, 및 100% 에탄올로 순차적으로 탈수하고, 자일렌으로 세척한 뒤 파라핀으로 캐스팅하였다. 파라핀으로 포맷된 샘플은 Rotary microtome을 사용하여 4㎛ 단면으로 절단하고 H & E 염색하였다. 광학현미경으로 100배 배율로 단면을 관찰하였다. 세포핵을 확인하기 위해 DAPI로 염색하고 형광현미경으로 관찰하였다.After decellularization in Experiments 1-18, small intestinal submucosa was fixed in 10% formalin for 72 hours and washed with water. Decellularized samples were sequentially dehydrated with 70%, 80%, 90%, and 100% ethanol, washed with xylene and cast into paraffin. Paraffin-formatted samples were cut into 4 μm cross sections using a rotary microtome and H & E stained. The cross section was observed at 100 times magnification with an optical microscope. To confirm the cell nuclei, stained with DAPI and observed by fluorescence microscope.

도 3은 탈세포 과정 없이 실시한 정상조직인 소장점막하조직의 조직학적 평가사진이다.Figure 3 is a histological evaluation of the small intestinal submucosa tissue that was performed without decellularization process.

즉, 실험 1 ~ 실험 18의 실시 전, 장막층, 근육층, 점막층을 물리적으로 제거한 소장점막하조직의 H & E 염색 및 DAPI 염색하에서의 사진이다.In other words, before the experiments 1 to 18, the small intestinal submucosa of the small intestine, muscle, and mucosa were physically removed under H & E staining and DAPI staining.

도 3의 (A)는 H & E 염색사진인데 점막하층에 세포가 촘촘히 관찰되며, 혈관 등 밀집된 곳에서는 세포가 더 많이 관찰된다. 즉, H & E 염색에서는 세포가 콜라겐 구조에 흩어져 분포했고 혈관과 같은 고밀도 조직에는 밀집해 있는 양상으로 관찰되었다.Figure 3 (A) is a H & E staining is a cell is closely observed in the submucosal layer, more cells are observed in dense places such as blood vessels. In other words, in H & E staining, the cells were scattered in the collagen structure and concentrated in dense tissues such as blood vessels.

도 3의 (B)는 DAPI 염색상에서는 세포핵이 염색되어 관찰된다.3B is observed by staining the cell nucleus on the DAPI staining.

도 4는 SDS를 처리한 실험 1(비교예 1) ~ 실험 4(비교예 4) 그룹의 조직 염색사진이다.Figure 4 is a tissue staining photograph of Experiment 1 (Comparative Example 1) to Experiment 4 (Comparative Example 4) group treated with SDS.

도 4의 (A)는 0.1 % SDS를 처리한 군의 H & E 염색, 도 4의 (B)는 0.1 % SDS를 처리한 군의 DAPI 염색 사진이다.(실험 1(비교예 1))4 (A) is H & E staining of the group treated with 0.1% SDS, Figure 4 (B) is a DAPI staining photo of the group treated with 0.1% SDS. (Experiment 1 (Comparative Example 1))

도 4의 (C)는 1 % SDS를 처리한 군의 H & E 염색, 도 4의 (D)는 1 % SDS를 처리한 군의 DAPI 염색사진이다. (실험 2(비교예 2))Figure 4 (C) is a H & E staining of the group treated with 1% SDS, Figure 4 (D) is a DAPI stained photo of the group treated with 1% SDS. (Experiment 2 (Comparative Example 2))

도 4의 (E)는 2 % SDS를 처리한 군의 H & E 염색, 도 4의 (F)는 2 % SDS를 처리한 군의 DAPI 염색 사진이다. (실험 3(비교예 3))Figure 4 (E) is a H & E staining of the group treated with 2% SDS, Figure 4 (F) is a DAPI staining photograph of the group treated with 2% SDS. (Experiment 3 (Comparative Example 3))

도 4의 (G)는 5 % SDS를 처리한 군의 H & E 염색, 도 4의 (H)는 5 % SDS를 처리한 군의 DAPI 염색 사진이다. (실험 4(비교예 4))4 (G) is H & E staining of the group treated with 5% SDS, Figure 4 (H) is a DAPI staining photograph of the group treated with 5% SDS. Experiment 4 (Comparative Example 4)

실험 1 ~ 실험 4 모두 H & E 염색과 DAPI 염색에서 잔존세포는 관찰되지 않았으며, 실험 2(비교예 2)~ 실험 4(비교예 4)에서는 콜라겐의 변성이 관찰되었다. 즉, 1% 이상의 SDS 농도로 처리된 군에서 콜라겐의 변성이 관찰되었다.In Experiments 1 to 4, no residual cells were observed in H & E staining and DAPI staining. Collagen degeneration was observed in Experiment 2 (Comparative Example 2) and Experiment 4 (Comparative Example 4). That is, denaturation of collagen was observed in the group treated with SDS concentration of 1% or more.

도 5는 효소제제를 처리한 실험 5(비교예 5) ~ 실험 7(비교예 7)그룹의 조직 염색사진이다.5 is a tissue staining picture of Experiment 5 (Comparative Example 5) to Experiment 7 (Comparative Example 7) treated with the enzyme preparation.

즉, NaOH로 pH를 8로 맞춘 용매 100중량부에 트립신 5중량부와 EDTA 5중량부를 섞은 용액으로 교반을 각각 1시간(실험 5(비교예 5)), 24시간(실험 6(비교예 6)), 36시간(실험 7(비교예 7)) 실시한 조직의 염색사진이다.That is, the solution was mixed with 5 parts by weight of trypsin and 5 parts by weight of EDTA to 100 parts by weight of a solvent adjusted to pH 8 with NaOH, respectively, for 1 hour (Experiment 5 (Comparative Example 5)) and 24 hours (Experiment 6 (Comparative Example 6). ), And stained pictures of tissues subjected to 36 hours (Experiment 7 (Comparative Example 7)).

도 5의 (A)는 1 시간 효소제제를 처리한 군의 H & E 염색, 도 5의 (B)는 1 시간 효소제제를 처리한 군의 DAPI 염색사진이다.(실험 5(비교예 5))5 (A) is H & E staining of the group treated with the enzyme preparation for 1 hour, Figure 5 (B) is a DAPI stained photo of the group treated with the enzyme preparation for 1 hour. (Experiment 5 (Comparative Example 5) )

도 5의 (C)는 24 시간 TE를 처리한 군의 H & E 염색, 도 5의 (D)는 24 시간 TE를 처리한 군의 DAPI 염색사진이다.(실험 6(비교예 6)) FIG. 5C is H & E staining of the group treated with TE for 24 hours, and FIG. 5D is a DAPI stained photograph of the group treated with TE for 24 hours. (Experiment 6 (Comparative Example 6))

도 5의 (E)는 36 시간 TE를 처리한 군의 H & E 염색, 도 5의 (F)는 36 시간 TE를 처리한 군의 DAPI 염색사진이다.(실험 7(비교예 7)) FIG. 5E shows H & E staining of the group treated with TE for 36 hours, and FIG. 5F shows DAPI staining of the group treated with TE for 36 hours. (Experiment 7 (Comparative Example 7))

실험 5 ~ 실험 7 모두 H & E 염색과 DAPI 염색에서 잔존세포는 관찰되지 않지만, 24시간(실험 6) 처리한 군부터 세포외기질(ECM)의 결손(붉은 화살표)이 관찰되기 시작하였다.In Experiments 5 to 7, no residual cells were observed in H & E staining and DAPI staining, but the deletion of extracellular matrix (ECM) began to be observed from the group treated for 24 hours (Experiment 6).

도 6은 동결과 해동을 반복 처리한 실험 8(비교예 8) 및 실험 9(비교예 9) 그룹의 조직 염색사진이다.6 is a tissue staining picture of the Experiment 8 (Comparative Example 8) and the Experiment 9 (Comparative Example 9) group which was repeatedly treated with freezing and thawing.

도 6의 (A)는 동결과 해동 4회 처리한 군의 H & E 염색, 도 6의 (B)는 동결과 해동 4회 처리한 군의 DAPI 염색사진이다.(실험 8(비교예 8)) FIG. 6 (A) shows H & E staining of the group treated with freezing and thawing four times, and FIG. 6 (B) shows DAPI staining of the group treated with freezing and thawing four times. (Experiment 8 (Comparative Example 8) )

도 6의 (C)는 동결과 해동 5회 처리한 군의 H & E 염색, 도 6의 (D)는 동결과 해동 5회 처리한 군의 DAPI 염색사진이다.(실험 9(비교예 9)) Figure 6 (C) is H & E staining of the group treated five times freeze and thaw, Figure 6 (D) is a DAPI staining photograph of the group treated five times freezing and thawing. (Experiment 9 (Comparative Example 9) )

실험 8 및 실험 9의 조직에는 대조군인 정상조직과 유사한 수준으로 잔여세포가 분명히 남아 있는 것이 관찰되었다.In the tissues of Experiments 8 and 9, it was observed that residual cells remained at a level similar to that of the control tissue.

도 7은 효소제제-동결과 해동 4회 처리한 실험 10(비교예 10)과 효소제제-동결과 해동 4회 처리후 원심분리 처리한 실험 11(실시예 1)의 조직 염색사진이다.7 is a tissue staining photograph of Experiment 10 (Comparative Example 10) treated with enzyme preparation-thaw 4 times and centrifugation after treatment with enzyme preparation-thaw 4 times.

도 7의 (A)는 효소제제-동결과 해동 4 회 처리한 군의 H & E 염색, 도 7의 (B)는 효소제제-동결과 해동 4회 처리한 군의 DAPI 염색사진이다.(실험 10(비교예 10)) Figure 7 (A) is H & E staining of the group treated with enzyme preparation-thaw 4 times, Figure 7 (B) is a DAPI staining photograph of the group treated with enzyme preparation-thaw 4 times. 10 (comparative example 10))

도 7의 (C)는 효소제제-동결과 해동 4 회-원심분리 처리한 군의 H & E 염색, 도 7의 (D)는 효소제제-동결과 해동 4 회-원심분리 처리한 군의 DAPI 염색사진이다.(실험 11(실시예 1))Figure 7 (C) is the H & E staining of the enzyme preparation-thaw 4 times-centrifugation group, Figure 7 (D) is DAPI of the enzyme preparation-thaw 4 times-centrifugation group It is a stained picture. (Experiment 11 (Example 1))

실험 10, 실험 11 모두 H & E 염색과 DAPI 염색에서 잔존세포는 관찰되지 않고 콜라겐의 성상이 정상조직과 유사하다.In both experiments 10 and 11, no residual cells were observed in H & E staining and DAPI staining, and collagen properties were similar to those of normal tissues.

도 8은 효소제제-동결과 해동 4회 처리후에 저장액(DW)(실험 12(비교예 11)), 고장액(NaOH)(실험 13(비교예 12)), 등장액(PBS)(실험 14(비교예 13))에 처리한 군의 조직 염색사진이다. FIG. 8 shows stock solution (DW) (Experiment 12 (Comparative Example 11)), hypertonic fluid (NaOH) (Experiment 13 (Comparative Example 12)), isotonic solution (PBS) after experiment 4 times of thawing. (Comparative Example 13) It is a tissue staining photograph of the group treated in).

실험 12 ~ 실험 14의 조직 모두 H & E 염색과 DAPI 염색에서 잔존세포는 관찰되지 않지만 세포외기질(ECM)의 결손(붉은 화살표)이 관찰되었다.In the tissues of Experiments 12 to 14, no residual cells were observed in the H & E staining and DAPI staining, but the deletion of the extracellular matrix (ECM) (red arrow) was observed.

도 9는 효소제제-동결과 해동 4회 처리후에 SDS를 처리한 그룹(실험 15(비교예 14) ~ 실험 18(비교예 17))의 조직 염색사진이다.FIG. 9 is a tissue staining photograph of the group treated with SDS after four treatments of enzyme preparation-synthesis (Experiment 15 (Comparative Example 14) to Experiment 18 (Comparative Example 17)).

도 9의 (A)는 효소제제-동결과 해동 4회-0.1 % SDS를 처리한 군의 H & E 염색, 도 9의 (B)는 효소제제-동결과 해동 4회-0.1 % SDS를 처리한 군의 DAPI 염색사진이다.(실험 15(비교예 14))Figure 9 (A) H & E staining of the group treated with enzyme preparation-thaw 4 times-0.1% SDS, Figure 9 (B) treated with enzyme preparation-thaw 4 times-0.1% SDS One group of DAPI stained photographs (Exp. 15 (Comparative Example 14)).

도 9의 (C)는 효소제제-동결과 해동 4회 1 % SDS를 처리한 군의 H & E 염색, 도 9의 (D)는 효소제제-동결과 해동 4회-1 % SDS를 처리한 군의 DAPI 염색사진이다.(실험 16(비교예 15))Figure 9 (C) H & E staining of the group treated with enzyme preparation-thaw 4 times 1% SDS, Figure 9 (D) treated with enzyme preparation-thaw 4 times-1% SDS DAPI staining picture of the group. (Experiment 16 (Comparative Example 15))

도 9의 (E)는 효소제제-동결과 해동 4회-2 % SDS를 처리한 군의 H & E 염색, 도 9의 (F)는 효소제제-동결과 해동 4회-2 % SDS를 처리한 군의 DAPI 염색사진이다.(실험 17(비교예 16))FIG. 9E shows H & E staining of the group treated with enzyme preparation-thaw 4 times-2% SDS, FIG. 9F shows treatment with enzyme preparation-thaw 4 times-2% SDS One group of DAPI stained photographs (Exp. 17 (Comparative Example 16)).

도 9의 (G)는 효소제제-동결과 해동 4회-5 % SDS를 처리한 군의 H & E 염색, 도 9의 (H)는 효소제제-동결과 해동 4회-5 % SDS를 처리한 군의 DAPI 염색사진이다.(실험 18(비교예 17))Figure 9 (G) H & E staining of the group treated with enzyme preparation-thaw 4 times-5% SDS, Figure 9 (H) treated enzyme preparation-thaw 4 times-5% SDS One group of DAPI stained photographs (Experiment 18 (Comparative Example 17)).

콜라겐의 변성은 실험 16 ~ 실험 18의 조직에서 나타났는 데, SDS 용액을 단독 처리한 실험 1 ~ 실험 4의 그룹과 마찬가지로 1% SDS를 처리한 군부터 콜라겐의 변성이 관찰되었다.Collagen degeneration was observed in the tissues of Experiments 16 to 18. Collagen denaturation was observed from the group treated with 1% SDS as in the groups of Experiments 1 to 4 treated with SDS solution alone.

DNA 정량 분석DNA quantitation

각 실험군인 실험 1 ~ 실험 18은 대조군인 정상조직과 DNA 함량을 비교하였을 때 모두 유의미한 차이가 나타났다(p <0.05). In each experimental group, Experiment 1 ~ Experiment 18, all of the control group showed a significant difference when comparing DNA contents with normal tissues (p <0.05).

도 10은 정상조직 및 실험 1 ~ 실험 18의 조직을 DNA 추출 후 Picogreen dsDNA assay kit를 이용하여 정량한 것을 비교한 도표이다.10 is a diagram comparing normal tissues and tissues of Experiments 1 to 18 after quantification using Picogreen dsDNA assay kit after DNA extraction.

One way ANOVA 분석 후에 p value가 0.05 이하일 때 유의적인 차이가 있다고 간주하였다. 도표에서 가로축의 숫자는 실험 1 ~ 실험 18의 번호를 나타낸 것이다.After the one way ANOVA analysis, it was considered that there was a significant difference when the p value was less than 0.05. The numbers on the horizontal axis in the chart represent the numbers of Experiment 1 to Experiment 18.

대조군(정상조직)에서 DNA 양은 3,3에서 DNA 양은 3,385.78 ±123.52 ng/mg이었고, 네거티브 대조군 (DNA가 없는 군 (NC))의 DNA 양은 10.51 ±0.28 ng/mg 이었다.The amount of DNA in the control group (normal tissue) was 3,3 and the amount of DNA was 3,385.78 ± 123.52 ng / mg, and the amount of DNA of the negative control group (NC without group (NC)) was 10.51 ± 0.28 ng / mg.

실험 1 ~ 실험 4의 DNA 양은 각각 116.17 ±10.24 ng/mg, 1,024.21 ±27.51 ng/mg, 1,363.66 ±110.93 ng/mg, 1,806.71 ±217.01 ng/mg이었고, SDS의 농도가 감소함에 따라 점차적으로 감소했다.The DNA amounts of Experiments 1 to 4 were 116.17 ± 10.24 ng / mg, 1,024.21 ± 27.51 ng / mg, 1,363.66 ± 110.93 ng / mg, and 1,806.71 ± 217.01 ng / mg, respectively, and gradually decreased as the concentration of SDS decreased.

실험 5 ~ 실험 7에서 DNA 양은 각각 877.52 ±55.77 ng/mg, 186.40 ±10.03 ng/mg 및 191.33 ±20.71 ng/mg이었다. In Experiments 5-7, the DNA amounts were 877.52 ± 55.77 ng / mg, 186.40 ± 10.03 ng / mg and 191.33 ± 20.71 ng / mg, respectively.

실험 8 및 실험 9에서 DNA 양은 각각 3422.15 ±622.15 ng/mg과 1924.63 ±215.01 ng/mg이었다. 실험 10 및 실험 11에서 DNA 양은 각각 864.15 ±10.69 ng/mg과 23.12 ±2.99 ng/mg이었다. 실험 12 ~ 실험 14에서 DNA 양은 각각 582.84 ±52.68 ng/mg, 124.85 ±21.40 ng/mg 및 294.69 ±13.69 ng/mg이었다. 실험 15 ~ 실험 18에서 DNA 양은 각각 47.76 ±0.68 ng/mg, 278.38 ±19.78 ng/mg, 333.19 ±3.77 ng/mg 및 346.04 ±34.68 ng/mg이었다.In Experiment 8 and Experiment 9, the DNA amounts were 3422.15 ± 622.15 ng / mg and 1924.63 ± 215.01 ng / mg, respectively. In Experiment 10 and Experiment 11, the DNA amounts were 864.15 ± 10.69 ng / mg and 23.12 ± 2.99 ng / mg, respectively. In experiments 12-14, the DNA amounts were 582.84 ± 52.68 ng / mg, 124.85 ± 21.40 ng / mg and 294.69 ± 13.69 ng / mg, respectively. In experiments 15 to 18, the DNA amounts were 47.76 ± 0.68 ng / mg, 278.38 ± 19.78 ng / mg, 333.19 ± 3.77 ng / mg and 346.04 ± 34.68 ng / mg, respectively.

전기영동Electrophoresis

도 11은 정상조직 및 실험 1 ~ 실험 18 조직에서 추출된 DNA의 전기영동 검사결과를 나타낸 것이다.Figure 11 shows the results of electrophoresis of DNA extracted from normal tissues and experiments 1 to 18 tissues.

DNA 분절의 크기는 아가로스 겔 전기영동에 의해 조사되었다. 대조군인 정상조직은 DNA가 분절되지 않은 채 내려가지 않는 것이 관찰되었다. SDS 단독으로 0.1 % 처리한 실험 1은 DNA가 분절되어 내려가는 것이 확인되었지만 실험 2 ~ 실험 4까지는 DNA 분절이 되지 않았다.The size of the DNA fragments was examined by agarose gel electrophoresis. Normal tissue as a control was observed not to descend DNA unfragmented. Experiment 1, which was treated with 0.1% SDS alone, confirmed that DNA was fragmented, but did not become a DNA segment until Experiment 2 to Experiment 4.

DNA 분절화가 실험 5 ~ 실험 7까지는 발견되었지만 크기가 200 bp 이상이었다. DNA 분절화는 실험 8 및 실험 9에서도 관찰되지 않았고 대조군(정상조직)과 유사하였다. DNA fragmentation was found from Experiment 5 to Experiment 7, but was over 200 bp in size. DNA fragmentation was not observed in experiments 8 and 9 and was similar to the control (normal tissue).

효소제제와 동결과 해동 처리한 실험 10 ~ 실험 18 까지는 모두 DNA가 분절되어 관찰되었으며, 원심분리까지 실시한 실험 11(실시예 1)에서는 DNA가 효과적으로 제거되어 관찰되지 않았다. 저장액(증류수)을 처리한 실험 12에서는 DNA 크기가 300 bp이하로 관찰되었다.DNA was fragmented and observed in experiments 10 to 18 in which enzyme preparation and freezing and thawing were performed. In experiment 11 (Example 1), which was performed until centrifugation, DNA was effectively removed and was not observed. In experiment 12 treated with stock solution (distilled water), the DNA size was observed below 300 bp.

이에 따라 DNA가 분절된 상태에서 이를 효과적으로 제거한 실험 11이 DNA 분절 및 제거가 효과적으로 이루어졌다고 볼 수 있다.Accordingly, it can be seen that Experiment 11 effectively removed DNA fragments and removed them from DNA fragmentation.

이를 통해 본 발명은 효소제제- 동결과 해동- 원심분리로 구성된 공정으로 콜라겐의 변성없는 상태로 무세포의 소장점막하조직을 효과적으로 제조할 수 있다.Through this, the present invention can effectively prepare a small cell small intestinal submucosa without degeneration of collagen in a process consisting of enzyme preparation-freezing and thawing-centrifugation.

이상에서 설명한 본 발명은 전술한 실시예 및 첨부된 도면에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능함은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 명백할 것이다.The present invention described above is not limited to the above-described embodiments and the accompanying drawings, and various substitutions, modifications, and changes can be made without departing from the technical spirit of the present invention. It will be evident to those who have knowledge of.

Claims (9)

소장점막하조직의 탈세포화 방법에 있어서,
(a) 인간을 제외한 포유동물의 소장점막하조직을 채취하여 효소제제를 처리하는 효소처리단계;
(b) 단계 (a)이후, 상기 효소제제로 처리된 소장점막하조직을 동결하는 동결단계;
(c) 단계 (b)이후, 상기 동결된 소장점막하조직을 해동하는 해동단계; 및
(d) 단계 (c)이후, 상기 해동된 소장점막하조직을 원심분리하여 세포외기질부분을 선택적으로 취하는 원심분리단계를 포함하고,
단계 (a)에서 NaOH, 증류수, 트립신 및 EDTA를 추가하는 데,
NaOH로 pH 8을 조절한 DW 용매 100중량부에 대하여 트립신 3~10중량부, EDTA 3~10중량부를 추가하여 35~40℃에서 1~2시간동안 처리하고,
단계 (b) 및 단계 (c)를 추가로 4 ~ 6회 더 실시하는 소장점막하조직의 탈세포화 방법.
In the method of decellularization of small intestinal submucosa,
(a) an enzyme treatment step of treating the enzyme preparation by collecting the small intestinal submucosa of mammals other than humans;
(b) after step (a), a freezing step of freezing the small intestinal submucosa treated with the enzyme preparation;
(c) after step (b), thawing the frozen small intestinal submucosa; And
(d) after step (c), the centrifugation of the thawed small intestinal submucosa and the centrifugation step to selectively take an extracellular matrix portion,
In step (a) add NaOH, distilled water, trypsin and EDTA,
3 to 10 parts by weight of trypsin and 3 to 10 parts by weight of EDTA were added to 100 parts by weight of a DW solvent adjusted to pH 8 with NaOH, and then treated at 35 to 40 ° C. for 1 to 2 hours.
Method for decellularization of the small intestinal submucosa, further comprising step (b) and step (c) four to six more times.
제1항에 있어서,
상기 소장점막하조직은 돼지, 소, 개 및 말 중 어느 하나의 소장점막하조직인 것을 특징으로 하는 소장점막하조직의 탈세포화 방법.
The method of claim 1,
The small intestinal submucosa is a decellularization method of small intestine submucosa, characterized in that any one of the small intestine submucosa tissue of pigs, cattle, dogs and horses.
삭제delete 삭제delete 제1항에 있어서,
상기 동결단계에서 소장점막하조직의 동결은 -80℃ ~ -200℃에서 10~20분 동안 실시하는 것을 특징으로 하는 소장점막하조직의 탈세포화 방법.
The method of claim 1,
The freezing of the small intestinal submucosa in the freezing step is a decellularization method of the small intestinal submucosa, characterized in that carried out for 10 to 20 minutes at -80 ℃ ~ -200 ℃.
제1항에 있어서,
상기 해동단계에서 소장점막하조직의 해동은 30℃ ~ 40℃에서 10 ~ 20분 동안 실시하는 것을 특징으로 하는 소장점막하조직의 탈세포화 방법.
The method of claim 1,
The thawing of the small intestinal submucosa in the thawing step is decellularized method of the small intestinal submucosa, characterized in that carried out for 10 to 20 minutes at 30 ℃ to 40 ℃.
삭제delete 제1항에 있어서,
상기 원심분리단계에서 원심분리는 12,000 ~ 18,000 rpm에서 15~25분 동안 실시하는 것을 특징으로 하는 소장점막하조직의 탈세포화 방법.
The method of claim 1,
Centrifugation in the centrifugation step is a decellularization method of the small intestinal submucosa, characterized in that carried out for 15-25 minutes at 12,000 ~ 18,000 rpm.
제1항, 제2항, 제5항, 제6항 및 제8항 중 어느 한 항에 따라 제조된 무세포 소장점막하 조직.Cell-free small intestinal submucosa prepared according to any one of claims 1, 2, 5, 6 and 8.

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