KR102067445B1 - 양전하 유기 첨가물 처리에 의한 단백질-오염물 복합체 및 단백질 제제 내 응집체 레벨의 감소 방법 - Google Patents
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Abstract
우레이드(예를 들면, 우레아, 요산 또는 알란토인) 또는 유기 조절제(예를 들면, 비이온성 유기 고분자, 계면활성제, 유기 용매 또는 우레이드)와 조합되어 낮은 농도의 양전하 유기 첨가물(예를 들면, 에타크리딘, 클로르헥시딘 또는 폴리에틸렌이민)로 처리를 통해 항체 및 다른 단백질 제조물 내의 응집체 레벨을 감소시키는 방법이 제공된다. 본 발명의 일부 측면은 세포 배양 수확물의 정제와 결합되어 응집체 레벨을 감소시키는 방법과 연관된다. 또한 다른 정제 방법들과 이러한 능력을 병합하여 최종 정제의 원하는 레벨을 구현하는 것과 관련된다.
Description
본 발명은 양전하 유기 첨가물 처리에 의한 단백질-오염물 복합체 및 단백질 제제 내 응집체 레벨의 감소 방법에 관한 것이다.
호스트-세포 유도 오염물 및 인-비트로 세포 배양 방법에 의해 생산된 재조합 단백질들 사이에서 비천연 헤테로-회합체가 자발적으로 형성됨이 지적되어왔다(Shukla et al., Biotechnol. Progr. (2008) 24:1115-1121; Luhrs et al., J. Chromatogr. B (2009) 877:1543-1552; Mechetner et al., J. Chromatogr. B (2011) 879:2583-2594; Gagnon et al., J. Chromatogr. A, (2011) 1218:2405-2412; Gagnon, Bioprocessing J. (2010) 9(4):14-24). 이러한 헤테로-회합체들은 두가지 측면에서 비천연적인 것으로 간주될 수 있다: 1) 오염물 성분들(constituent contaminants)은 살아있는 비-인간 호스트 세포들에 의해 분비되거나 비-인간 호스트 세포들이 용해사멸될 때 배양 배지 내부로 방출되는 것과 같이 자주 비-인간 유래의 것이다. 살아있는 인간에 있어서, 이러한 비-인간 오염물들은 존재하지 않는다. 2) 오염물 성분들은 죽은 세포 성분들이 빠르게 제거되는 인간 인-비보 시스템과 달리 고농도로 축적된다. 이에 따라, 재조합 생성물들은 일반적으로 생체 시스템에서는 일어나지 않는 농도에서 강하게 상호작용 가능한 오염물들의 높은 레벨에 노출된다. 반면, 재조합 단백질들의 고발현 레벨은 이들을 이러한 비-인간 오염물들과의 비특이적 결합을 위한 적절한 기질로 만들며, 복합체 및 응집체를 포함하는 다양한 조성물의 원하지 않는 헤테로-회합체의 형성을 유발한다.
헤테로-응집체들의 오염 단백질 성분은 상기 오염 단백질의 직접 타겟팅(Shukla et al. 및 Gagnon et al. supra) 및 상기 오염 단백질의 원인이 되는 대응 DNA 성분의 타겟팅을 통한 간접적 방법(Luhrs et al. 및 Gagnon supra)을 통해 어느 정도 해결되어 왔다. 항체 응집체의 감소는 일부 복합체들이 분리될 때 나타났다(Shukla et al., Mechetner et al., 및 Gagnon supra). 음이온 교환기의 항체-오염물 복합체를 감소하는 능력은 개시되어왔으나(Luhrs et al. 및 Gagnon et al., supra), 헤테로-응집체들을 완전히 제거가능한 음이온 교환 처리 방법은 보고되지 않았다. 크기 배제(size exclusion), 양이온 교환, 및 소수성 상호작용 크로마토그래피들이 헤테로-응집체를 감소시키기 위해 채용되어 왔으나, 이러한 기술들은 일반적으로 음이온 교환에 비해 열등하다(Gagnon et al., supra).
헤테로-응집체들을 분리시킬 수 있는 것으로 기대되는 제제로 항체 제조물을 처리하는 방법은 일반적으로 비효과적인 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, 고농도의 우레아, 염, 또는 이들의 조합의 사용은 실질적으로 IgM-오염물 헤테로-응집체들을 분리시키지 못한다(Gagnon et al., supra). 단백질 G 친화도 크로마토그래피와 함께 우레아, 염 및 EDTA를 결합하는 예비-용출 세척(Mechetner et al., supra)과 유사하게, 우레아, 알코올 및 계면활성제의 예비-용출(pre-elution) 세척을 포함하는 단백질 A 친화도 크로마토그래피는 세척이 없는 것보다 효과적으로 헤테로-응집체 레벨을 감소시키는 것으로 밝혀졌다(Shukla et al., supra). 우레아의 예비-용출 세척을 포함한 음이온 교환 크로마토그래피는 우레아 세척이 없는 것보다 효과적으로 헤테로-응집체들을 감소시키는 것으로 밝혀졌다(Gagnon et al., supra). 양이온 교환 크로마토그래피 역시 세척이 없는 것보다 예비-용출 EDTA 세척을 포함하는 것이 보다 효과적으로 헤테로-응집체들을 감소시키는 것으로 밝혀졌다(Gagnon et al., supra). 마지막으로, 우레아 및/또는 염의 예비-용출 세척을 포함한 히드록시아파타이트(hydroxyapatite) 또한 그러한 세척이 없는 것보다 효과적으로 헤테로-응집체들을 감소시켰다(Gagnon, supra). 이러한 관찰에도 불구하고, 일반적으로, 크로마토그래피 칼럼에 결합된 항체들의 예비-용출 세척에 있어서 분리 제제의 사용은 단지 미약한 성공만을 보여주었다.
양전하 유기 첨가물은 DNA 및 내독소(endotoxin)의 침전(Glynn supra; Cordes et al., Biotechnol. Progr., (1990) 6:283-285; Dissing et al., Bioseparation, (1999) 7 221:9-11) 및 바이러스의 불활성화(Bernhardt, U.S. Patent. 5,559,250) 뿐만 아니라 산성 단백질의 침전(Farhner et al., U.S. 특허 출원 제2008-0193981호; Ma et al., J. Chromatogr. B (2010) 878:798-806; Peram et al., Biotechnol. Progr., (2010) 26:1322-1326; Glynn, in U. Gottschalk (ed.), Process Scale Purification of Antibodies, J. T. Wiley and Sons, (2009) Hoboken, 309-324)을 위해 제시되어왔다. 다가(multivalent) 금속 양이온 또한 일부 단백질 제조물로부터 DNA 및 내독소를 제거하는 것으로 제시되어왔다(Akcasu et al., Nature, (1960) 187:323-324; Matsuzawa et al., Nucl. Acids Res., (2003) 3(3):163-164; Christensen et al., Prot. Expr. Purif., (2004) 37:468-471; Kejnovsky et al., Nucl. Acids Res., (1997) 25:1870-1871; Ongkudon et al., Anal. Chem., (2011) 83 391:13-17).
본 발명은 단백질-오염물 복합체 및 응집체 레벨의 감소 방법을 제공한다.
일부 실시예들에 있어서, 단백질 제조물과 같은 원하는 단백질 종류를 함유하는 샘플 내의 생성물-오염물 복합체 및 응집체들을, 양전하 유기 첨가물들로 상기 샘플을 처리함에 의해 감소시키는 방법들이 제공된다. 일부 실시예들에 있어서, 복합체 및/또는 응집체들의 감소는 양전하 유기 첨가물의 극소 레벨로 달성된다. 일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 특히 뉴클레오좀(nucleosomes) 및/또는 히스톤, 및/또는 DNA와 같은 크로마틴 잔유물(chromatin remnants)을 포함하는 응집체들의 양을 감소시킨다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 샘플은 상승된 전도도 값(염 농도)에서 처리된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 샘플은 추가적으로 비용해된 우레이드(ureide)로 처리되고, 원하는 단백질을 함유하는 상청액은 수집된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 샘플은 교대로 또는 추가적으로 복합체 및 응집체들 내의 원하는 단백질과 결합된 오염물들의 분리를 증진하기 위해 비이온성 유기 폴리머, 유기 용매, 계면 활성제 또는 우레이드와 같은 다른 유기 첨가물로 처리된다. 일부 실시예들에 있어서, 처리된 상기 샘플은 후속으로 원하는 단백질로부터 양전하 유기 첨가물 및 잠재적으로 다른 화학 물질들을 선택적으로 제거하는 화학 잔기들을 함유한 고체 물질에 노출된다.
단백질의 정제를 위한 방법들 및 키트들(kits)이 제공된다. 일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 항체 또는 다른 단백질들의 제조물로부터 이러한 원하는 단백질과 양전하 유기 첨가물(electropositive organic additive)의 접촉을 통해 단백질-오염물 복합체 및 응집체의 감소를 위해 제공된다. 일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 소위 생리학적 조건으로부터 이러한 생리학적 조건의 3배 이상까지의 전도도 레벨 범위에서 실행될 수 있다; 이러한 상승된 전도도 레벨은 원하는 혹은 타겟 단백질의 침전을 억제할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 상기 양전하 유기 첨가물의 극미량의 농도; 이러한 첨가물이 침전 중재 목적으로 사용되는 농도보다 10 배 내지 100 배 낮은 레벨과 같은 농도로 실행될 수 있다. 본 발명은 일부 실시예들에 있어서, 관심 단백질에 맞춤화된 방법 개발 요구의 감소, 관심 단백질의 향상된 회수, 정제 방법의 향상된 재생성, 및 응집체 제거를 위한 추가적인 단계의 필요성 감소와 같은 이점들을 제공한다.
본 출원에 개시된 실시예들은 원하는 단백질을 포함하는 샘플의 응집체 양을 감소시키는 방법, 상기 샘플을 양전하 유기 첨가물 및 비용해 우레이드와 접촉시키는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
15 mS/cm 이상의 전도도 값에서 원하는 단백질을 포함하는 샘플의 응집체 양을 감소시키는 방법과 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 방법은 양전하 유기 첨가물을 0.1% 이하의 농도로 첨가하는 것을 포함한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 원하는 단백질을 포함하는 샘플의 응집체 양을 줄이는 방법에서, 상기 샘플은 5 mS/cm 이상의 전도도 값을 가지며, 양전하 유기 첨가물을 일 이상의 유기 첨가물의 존재하에서 0.1 % 이하의 농도로 첨가하여 침전물의 형성을 감소시키는 것을 포함하며, 상기 일 이상의 유기 첨가물은 우레이드, 유기 용매 또는 계면 활성제로 구성된 그룹에서 선택된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 원하는 단백질을 포함하는 샘플의 응집체 양을 감소시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 응집체를 함유한 상기 샘플을 제공하는 것을 포함하고, 상기 원하는 단백질은 상기 샘플 내의 용액 상태이며, 상기 샘플을 양전하 유기 첨가물과 접촉시키는 것을 포함한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 우레이드는 알란토인이다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 우레이드는 약 0.5% 내지 약 2%의 중량/부피(weight/volume) 범위로 존재한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 양전하 유기 첨가물은 에타크리딘(ethacridine), 클로르헥시딘(chlorhexidine), 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine), 메틸렌 블루(methylene blue), 및 벤잘코늄 클로라이드(benzalkonium chloride)로 구성된 그룹에서 선택된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 우레이드는 양전하 유기 첨가물 전에 첨가된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 염이 실질적으로 상기 원하는 단백질의 침전을 방지하는 레벨로 첨가된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 원하는 단백질은 항체, Factor VIII, 성장 호르몬 및 재조합 단백질로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 양전하 유기 첨가물은 1% 이하의 중량/부피 레벨로 첨가된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 양전하 유기 첨가물은 0.1% 이하의 중량/부피 레벨로 첨가된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 양전하 유기 첨가물은 0.01% 이하의 중량/부피 레벨로 첨가된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 양전하 유기 첨가물은 0.001% 이하의 중량/부피 레벨로 첨가된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 양전하 유기 첨가물은 0.02% 내지 0.03% 범위의 농도로 존재한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 일 이상의 양전하 유기 첨가물이 존재한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 일 이상의 양전하 유기 첨가물의 응집체 농도는 1% 이하의 중량/부피비를 갖는다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 일 이상의 양전하 유기 첨가물의 응집체 농도는 0.1% 이하의 중량/부피비를 갖는다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 일 이상의 양전하 유기 첨가물의 응집체 농도는 0.01% 이하의 중량/부피비를 갖는다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 일 이상의 양전하 유기 첨가물의 응집체 농도는 0.001% 이하의 중량/부피비를 갖는다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 비용해된 우레이드는 알란토인이다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 알란토인은 약 0.56% 내지 약 1% 중량/부피비 범위의 농도로 존재한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 알란토인은 약 1% 중량/부피 내지 약 2% 중량/부피 범위의 농도로 존재한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 알란토인은 약 2% 중량/부피 내지 약 5% 중량/부피 범위의 농도로 존재한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 알란토인은 약 5% 중량/부피 내지 약 10% 중량/부피 범위의 농도로 존재한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 알란토인은 약 10% 중량/부피 내지 약 15% 중량/부피 범위의 농도로 존재한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 우레이드는 상기 양전하 유기 첨가물의 첨가 전에 첨가된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 샘플의 전도도는 침전을 통해 상기 원하는 단백질의 실질적 손실에 대응할 수 있는 충분한 고농도로 조절된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 샘플의 전도도는 상기 원하는 단백질의 실질적 손실에 대응하기 위해 필요한 것보다 높은 레벨로 조절된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 샘플의 전도도는 생리적 전도도의 2배까지 조절된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 샘플의 전도도는 생리적 전도도의 3배 이상으로 조절된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 샘플의 전도도는 감소되나 상기 원하는 단백질의 실질적 손실에 대응하기에 충분히 높은 레벨로 유지된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 샘플의 전도도는 상기 양전하 유기 첨가물의 첨가 전에 조절된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 유기 용매가 존재한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 유기 용매는 에탄올, 이소프로판올, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 트리(n-부틸)포스페이트 및 글리세롤로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 유기 용매는 약 0.01% 내지 약 20% 중량/부피 범위의 농도를 포함한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 유기 용매는 약 0.01 내지 약 1% 범위의 농도의 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 에탄올, 이소프로판올 또는 트리(n-부틸)포스페이트를 포함한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 유기 용매는 약 1% 내지 약 5% 범위의 농도의 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 에탄올 또는 이소프로판올을 포함한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 유기 용매는 약 5% 내지 약 10% 범위의 농도의 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 에탄올 또는 이소프로판올을 포함한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 유기 용매는 약 10% 내지 약 20% 범위의 농도의 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 또는 글리세롤을 포함한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 유기 용매가 존재하며, 에탄올, 이소프로판올 및 트리(n-부틸)포스페이트로 구성된 그룹에서 선택된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 유기 용매의 농도는 1% 미만이다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 유기 용매의 농도는 0.1% 미만이다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 유기 용매의 농도는 0.01% 미만이다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 가용성(soluble) 우레이드가 존재한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 가용성 우레이드는 우레아(urea)이다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 가용성 우레이드는 약 0.5 M 내지 약 1 M 범위의 농도로 존재한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 가용성 우레이드는 약 1 M 내지 약 2 M 범위의 농도로 존재한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 가용성 우레이드는 약 2 M 내지 약 4 M 범위의 농도로 존재한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 가용성 우레이드는 약 4 M 내지 약 8 M 범위의 농도로 존재한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 계면활성제가 존재한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 계면활성제는 비이온성 계면활성제를 포함한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 Tween 및 Triton으로 구성된 그룹에서 선택된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 계면활성제는 양쪽이온성(zwitterionic) 계면활성제를 포함한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 양쪽이온성 계면활성제는 CHAPS, CHAPSO 및 옥타글루코시드(octaglucoside)로 구성된 그룹에서 선택된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 계면활성제는 1% 미만의 0이 아닌 농도로 존재한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 계면활성제는 0.1% 미만의 0이 아닌 농도로 존재한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 계면활성제는 0.01% 미만의 0이 아닌 농도로 존재한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 킬레이트제가 존재한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 킬레이트제는 양전하를 가진다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 양전하를 갖는 킬레이트제는 트리스(2-아미노에틸)아민(tris(2-aminoethyl)amine) 또는 디페록사민(deferoxamine)을 포함한다,
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 킬레이트제는 100 mM 미만의 0이 아닌 농도로 존재한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 킬레이트제는 50 mM 미만의 0이 아닌 농도로 존재한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 킬레이트제는 20 mM 미만의 0이 아닌 농도로 존재한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 킬레이트제는 10 mM 미만의 0이 아닌 농도로 존재한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 킬레이트제는 5 mM 미만의 0이 아닌 농도로 존재한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 다음 중 2 이상이 존재한다. (a) 유기 용매, (b) 유기 폴리머, (c) 가용성 우레이드, (d) 계면 활성제, (e) 킬레이트제, 및 (f) 염.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 접촉된 샘플은 일 이상의 고체에 노출되어 잔류하는 오염물들로부터 원하는 단백질을 분별하는 후속 공정 단계 이전에 적어도 하나의 양전하 유기 첨가물을 제거한다.
상술한 적어도 하나의 실시예들에 따른 방법을 실행하기 위한 키트(kit)가 제공된다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 호모-응집체와 같은, 원하는 단백질과 대비하여 고분자량을 갖는 응집체의 레벨을 감소시키고, 또한 헤테로-응집체와 같은, 원하는 단백질보다 미소하게 큰 하이드로다이나믹(hydrodynamnic) 사이즈의 응집체를 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시예들에 있어서, 응집체들은 원하는 단백질 및 오염물의 헤테로-응집체를 포함하며, 일부 실시예들에 있어서, 상기 오염물은 핵산, 뉴클레오티드, 내독소, 금속 이온, 단백질, 지질, 또는 세포 배양 배지 성분이다. 일부 실시예들에 있어서, 원하는 단백질의 호모-응집체들의 존재가 실질적으로 제거된다. 일부 실시예들에 있어서, 원하는 단백질 및 오염물의 헤테로-응집체들의 존재가 실질적으로 제거된다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 추가적으로 DNA, 내독소 및 바이러스와 같은 오염물의 레벨을 응집체 감소와 함께 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 추가적인 항바이러스 제제가 포함되어 수행된다.
일부 실시예들에 있어서, 관심 대상종 단백질(예를 들면, 정제될 원하는 단백질)은 재조합 유래이고, 단백질 제조물은 세포-함유 세포 배양물, 세포 배양 상청액, 분류된 세포 배양 상청액, 크로마토그래피 칼럼으로부터의 용출액, 혹은 정제 이전 단계로부터 수득된 단백질-함유 용액을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 단백질 제조물은 항체를 함유하며, 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 항체는 IgG, IgM 혹은 이들의 절편 형태, 혹은 Fc-융합 단백질과 같은 항체 또는 항체 절편의 융합 단백질(fusion protein)이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 원하는 단백질은 Factor VIII과 같은 응고성 단백질(clotting protein)이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 원하는 단백질은 인간 성장 호르몬과 같은 펩티드 호르몬일 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 샘플의 전도도가 상기 샘플로부터 원하는 단백질의 침전을 실질적으로 회피할 수 있는 충분한 고농도에 있도록 실행된다. 전도도는 당해 기술분야에서 공지된 방법에 따라 염 또는 희석액의 첨가에 의해 조절될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 전도도는 상기 원하는 단백질의 실질적 침전을 회피하기 위해 필요한 결정된 레벨보다 큰 5mS/cm, 10 mS/cm, 15mS/cm 또는 20mS/cm 이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 전도도는 20 mS/cm, 25 mS/cm, 30 mS/cm, 35 mS/cm, 40 mS/cm, 45 ms/cm 보다 크며, 또는 45 mS/cm 보다 크다. 상승된 전도도에서 오염물들의 중요한 서브셋들을 제거하는 본 발명의 능력은 이러한 시스템에서 전하 상호작용은 상승된 전도도에서 감소된다고 알려져 있으므로, 본 발명의 현저한 특징들 중 하나를 반영한다. 예를 들면, 25 mS/cm 이상의 전도도에서 단지 극히 일부의 음전하 단백질만이 양전하 표면에 결합된다고 알려져 있다. 본 방법과는 별도로, 대부분의 양전하 제제를 IgG 항체들의 제조에 적용하는 것은 5 mS/cm 미만의 전도도에서 일어나며, 일반적으로 알칼리성 pH의 동작 요건과 함께 수행된다. 본 방법에서 이러한 pH 동작요건은 필요하지 않다. 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상승된 전도도는 응집체들에서의 내부 정전 회합을 약화시키는 효과를 가지며, 이에 따라 본 발명의 응집체의 분리 및/또는 원하는 단백질과 결합된 오염물들의 분리를 획득하는 능력이 증가됨을 명확히 이해할 것이다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 양전하 유기 첨가물은 에타크리딘, 9-아미노아크리딘(9-aminoacridine, 아미나크린(aminacrine)), 3,6 아크리디네디아민(3,6 acridinediamine, 프로플라빈(proflavin)), 아크리소르신(acrisorcin), 아크리잔(acrizane, 페나크리단(phenacridane)), 아크리딘 오렌지, 퀴나크린(quinacrine), 아크리사이드(acricide), 아크리돈(acridone), 아크리딘-9-카르복실산, 아크라닐(1-[(6-클로로-2-메톡시-9-아크리디닐)아미노]-3-(디에틸아미노)-2-프로판올 디하이드로클로라이드), 페노사프라닌(phenosafranin), 페녹사진(phenoxazine), 페노티아진(phenothiazine), 아크리플라빈 (3,6-디아미노-10-메틸아크리디늄, 클로라이드 및 3,6-아크리딘이디아민), 폴리에틸렌이민 (폴리(이미노에틸렌)), 클로르헥시딘(chlorhexidine), 또는 폴리-아미노산이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 양전하 유기 첨가물은 에타크리딘, 폴리에틸렌이민 혹은 클로르헥시딘, 또는 이의 염이다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 양전하 유기 첨가물은 원하는 정도의 응집체의 감소를 촉진하기에 충분한 실질적으로 최소의 농도로 제공된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 양전하 유기 첨가물의 농도는 0.1%, 0.05%, 0.04%, 0.025%, 혹은 0.001%(부피 당 중량 기준으로) 미만일 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 양전하 유기 첨가물은 0.01-0.04% 또는 0.02-0.025% 범위의 농도로 제공된다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 양전하 유기 첨가물은 에타크리딘. 폴리에틸렌이민(PEI) 혹은 클로르헥시딘이다. 상기 양전하 유기 첨가물의 농도가 0.1% 미만인 본 방법의 유용한 효과를 획득하는 방법의 능력은 본 방법의 현저한 또 하나의 특징을 부각시킨다: 상승된 전도도에서, 그리고 알칼라인 pH 요구 조건 없이 작동됨에 추가하여, 본 방법은 상당한 침전량의 형성을 유발하지 않고 매우 효과적일 수 있다. 양전하 유기 첨가물은 다른 오염물들 중 산성 단백질, DNA, 및 바이러스의 침전을 중재하기 위해 흔히 사용된다. 이들은 1% 이상과 같이 고농도로 사용된다. 본 발명의 목적은 응집체들을 분리시키거나, 응집체들에서의 내부 회합을 약화시키거나, 응집체들을 안정화시키는 부산물인 오염물들을 제거하는 것이다. 다수의 실시예들에서, 본 방법의 2차 목적은 침전을 최소화 혹은 회피하여 이들의 제거의 필요성을 최소화 혹은 회피하는 것이며, 이는 양전하 유기 첨가물의 저농도 및 높은 작동 전도도에 양쪽에 대한 이유가 된다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 샘플 내의 응집체의 양을 감소시키면서 원하는 단백질의 침전을 회피 또는 제한하기 위해 선택된 pH 레벨에서 수행될 수 있다. 상기 pH 레벨은 종래의 수단에 의해 조절될 수 있으며, 전도도 선택과 조합되어 선택될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 샘플의 상기 pH 레벨은 약 4 내지 약 9, 약 5 내지 약 8, 또는 약 6 내지 약 7.5 사이의 값을 가질 수 있다. 이는 양전하 유기 첨가물의 사용의 비통상적인 성질을 다시 부각시킨다,
일부 실시예들에 있어서, 샘플은 추가적으로 항바이러스 제제와 접촉되며, 바람직하게는 상기 양전하 유기 첨가물과 실질적으로 동일한 시간으로 접촉될 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 항바이러스 제제 자체는 벤잘코늄 클라이드 또는 메틸렌 블루와 같은 양전하 유기 분자이다. 트리(n-부틸)포스페이트와 같은 전기적 중성 혹은 비이온성 항바이러스 제제 또한 사용될 수 있다. 항바이러스 제제는 약 1%(w/v) 미만, 약 0.1%(w/v) 미만, 또는 약 0.01%(w/v) 미만 또는 약 0.001% 미만의 양으로 존재할 수 있다. 이러한 제제들은 낮은 pH에서의 처리에 의한 바이러스 불활성화를 용인하지 않는 단백질에 있어서 특히 유용하다.
일부 실시예들에 있어서, 본 방법은 추가적으로 샘플 내에 용해되지 않는 충분한 양의 우레이드와 샘플을 접촉시키는 단계를 포함한다. 원하는 단백질을 포함하는 상청액은 이어서 침전된 오염물을 포함하는 샘플의 균형으로부터 분리될 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 우레이드는 양전하 유기 첨가물과 샘플을 접촉시키는 단계 이전에 공급되며, 다른 실시예들에 있어서, 우레이드는 상기 양전하 유기 첨가물과 상기 샘플을 접촉시키는 단계와 실질적으로 동시에 공급되며, 그리고 또 다른 실시예들에 있어서, 우레이드는 상기 양전하 유기 첨가물과 상기 샘플을 접촉시키는 단계 이후에 공급된다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 우레이드는 요산, 히단토인 (이미다졸리딘-2,4-디온), 알란토인 (2,5-디옥소-4-이미다졸리디닐) 우레아, 알클록사(alcloxa), 알디옥사(aldioxa), 헤모칸(hemocane), 우레이도히단토인(ureidohydantoin), 5-우레이도히단토인, 글리옥실우레이드, 글리옥실 산 디우레이드, 2,5-디옥소-4-이미다졸리디닐 우레아, 이미다졸리디닐 우레아, 및 퓨린(purine) 중에서 선택될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 우레이드는 알란토인이며, 이러한 경우 알란토인은 0.56%(w/v), 1%, 1.5%, 2% 이상의 농도로 존재한다. 일부 실시예들에 있어서, 우레이드는 요산이며, 이러한 경우 요산은 0.0025%(w/v), 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 1% 이상의 농도로 존재한다.
일부 실시예들에 있어서, 본 방법은 추가적으로 샘플을 완전 용해되는 양의 우레이드와 접촉시키는 단계를 포함한다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 가용성 우레이드는 우레아, 이미다졸리디날 우레아(imidazolydinal urea) 또는 다른 우레아일 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 우레이드는 우레아며, 이러한 경우 우레아는 0.5 M 이상, 또는 1 M 이상, 또는 2 M 이상, 또는 4 M 이상, 또는 6 M 이상, 또는 8 M 이상의 농도로 존재한다. 이는 단백질 침전의 회피가 특정한 목적인 본 발명의 현저한 성질을 다시 부각시킨다. 우레아와 같은 매우 높은 용해성의 우레이드는 많은 화합물들의 용해도를 증가시키는 일반적 효과를 가지며, 이는 이의 존재가 침전물의 형성을 방해함을 말하는 것이다. 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 고용해성 우레이드의 존재는 응집체에서의 내부 소수성 및/또는 수소 결합 회합을 약화시키는 효과를 가질 수 있으며, 따라서 본 방법의 응집체의 분리 및/또는 원하는 단백질과 회합된 오염물의 제거를 획득하는 능력을 증가시킬 수 있음을 이해할 것이다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명의 유용성은 또한 세포 배양물 내의 세포 잔해물의 침강(sedimentation)을 가속시키며, 실질적으로 DNA, 내독소 및 바이러스의 레벨을 감소시킨다는 사실에 의해 증진된다. 실험 데이터는 응집체, 내독소 및 바이러스와 선호적으로 상호작용하는 일부 우레이드들의 능력이 이러한 효과에 기여하는 것으로 제시하며, 또한 용해된 우레이드의 낮은 레벨이 우레이드 부존재 하에서 양전하 유기 첨가물 처리와 대비하여 높은 항체 회수에 기여할 수 있음을 나타낸다. 본 발명은 비-양전하 항바이러스 제제의 첨가와 양립할 수 있으며, 이는 본 유용성을 더욱 확장시킬 수 있다. 처리에 이어서, 고체 물질이 침강 또는 여과에 의해 제거될 수 있으며, 상청액 내에 실질적으로 응집체-프리(aggregate-free) 단백질이 잔류할 수 있다. 이는 다른 방법들에 의해 처리된 물질들은 전형적으로 탁하고 흐린 것에 비해, 처리된 물질이 광학적으로 클리어하며 입자들이 없다는 본 발명의 또 다른 이점을 제공한다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 샘플을 비이온성 유기 고분자, 유기 용매, 계면 활성제 또는 우레이드와 같은 가용성 유기 조절제(modulator)와 접촉시키는 추가적인 단계와 함께 수행될 수 있다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 유기 조절제와 상기 샘플을 접촉시키는 단계는 상기 샘플을 상기 양전하 유기 첨가물과 접촉시키는 단계 이전에 수행될 수 있다. 다른 실시예들에 있어서, 상기 샘플을 상기 유기 조절제와 접촉시키는 단계는 상기 샘플을 상기 양전하 유기 첨가물과 접촉시키는 단계와 실질적으로 동시에 발생할 수 있다. 또 다른 실시예들에 있어서, 상기 샘플을 상기 유기 조절제와 접촉시키는 단계는 상기 샘플을 상기 양전하 유기 첨가물과 접촉시키는 단계 이후에 발생할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 유기 조절제는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 및 폴리부틸렌 글리콜과 같은 비이온성 유기 고분자이며, 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 비이온성 유기 고분자는 약 1000 D 이하, 500 D 이하, 250 D 이하, 또는 100 D 이하의 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 유기 조절제는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 부틸렌 글리콜, 디메틸설폭사이드, 에탄올 또는 페녹시에탄올과 같은 유기 용매이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 유기 조절제는 약 1%(w/v) 이상의 농도로 제공된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 유기 조절제는 Tween, triton, CHAPS, CHAPSO 또는 옥틸 글루코시드(octyl glucoside)와 같은 계면활성제이며, 이러한 일부 실시예들에 있어서 상기 계면활성제는 약 1%(w/v) 이하, 약 0.1%(w/v) 이하 또는 약 0.02%(w/v) 이하의 농도로 제공된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 유기 조절제는 부포화(subsaturating) 양으로 제공되는 우레이드이며, 이러한 일부 실시예들에 있어서, 우레이드는 우레아, 히단토인 또는 알란토인이다. 이는 양전하 유기 첨가물이 상당한 양의 침전물의 형성을 감소 또는 제거하는 조건 하에서 사용되는 본 방법의 특이적인 성질을 다시 부각시킨다. 상기 양전하 유기 첨가물의 비통상적으로 낮은 농도에 부가하여, 높은 동작 전도도, 알칼리 pH에의 비의존성 및 우레아의 공지된 용해 영향, 유기 용매 및 계면활성제의 존재는 일부 바람직한 양전하 유기 첨가물과 단백질 또는 다른 오염물 사이의 소수성 상호작용을 약화시키는 효과를 갖는다. 이는 특히 에타크리딘 또는 이의 유사체와 같은 소수성 양전하 유기 첨가물, 또는 클로르헥시딘 혹은 벤잘코늄 클로라이드에 적용된다. 당해 기술 분야에 통상을 지식을 가진 자라면, 상술한 유기 첨가물의 존재는 응집체들의 내부 화학적 회합을 약화시키는 효과를 가질 수 있으며, 이에 따라 본 방법의 응집체의 분리 및/또는 원하는 단백질과 회합된 오염물들의 제거를 실현하는 능력을 증가시킬 수 있음을 명확히 이해할 것이다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 용액 내에서 원하는 단백질을 함유하는 샘플의 응집체 양을 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 샘플은 양전하 유기 첨가물과 접촉된다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 샘플의 전도도는 상기 샘플로부터 원하는 단백질의 침전을 실질적으로 회피하기에 충분한 높은 레벨이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 전도도는 15 mS/cm 또는 30 mS/cm를 초과할 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 양전하 유기 첨가물의 농도가 약 0.1% (w/v) 보다 작은 방법을 제공한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 양전하 유기 첨가물은 에타크리딘, 9-아미노아크리딘(아미나크리딘), 3,6 아크리딘디아민(프로플라빈), 아크리소르신, 아크리잔(페나크리단), 아크리딘 오렌지, 퀴나크린, 아크리사이드, 아크리돈, 아크리딘-9-카르복실산, 아크라닐(1-[(6-클로로-2-메톡시-9-아크리디닐)아미노]-3-(디에틸아미노)-2-프로판올 디하이드로클로라이드), 페노사프라닌, 페녹사진, 페노티아진, 아크리플라빈 (3,6-디아미노-10-메틸아크리디늄, 클로라이드 및 3,6-아크리딘이디아민), 폴리에틸렌이민, 클로르헥시딘, 및 폴리-아미노산으로 구성된 그룹에서 선택된다. 일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 양전하 유기 첨가물이 에타크리딘, 폴리에틸렌이민 또는 클로르헥시딘 또는 이의 염인 방법을 제공한다. 일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 상기 양전하 유기 첨가물이 약 0.01% 내지 약 0.05%, 또는 약 0.01% 미만, 또는 약 0.005% 미만, 또는 약 0.001% 미만의 양으로 존재한다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 샘플의 pH가 약 4 내지 약 9, 또는 약 5 내지 약 8, 또는 약 6 내지 약 7.5인 방법을 제공한다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 감소된 응집체들이 원하는 단백질의 호모-응집체를 포함하는 방법을 제공하며, 다른 실시예들에 있어서, 감소된 응집체들은 원하는 단백질 및 오염물의 헤테로-응집체를 포함하며, 다른 실시예들에 있어서, 상기 응집체들은 이러한 호모-응집체 및 헤테로-응집체를 함께 함유한다. 일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 응집체들이 샘플 내에서 실질적으로 제거되는 방법을 제공한다. 일부 실시예들에 있어서, 감소된 응집체들은 실질적으로 원하는 단백질과 동일한 하이드로다이나믹 크기를 갖는다. 일부 실시예들에 있어서, 감소된 응집체들은 핵산, 뉴클레오티드, 내독소, 금속 이온, 단백질, 지질, 또는 세포 배양 배지 성분을 포함하는 헤테로-응집체들이다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 원하는 단백질이 항체 또는 항체 절편인 방법을 제공한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 샘플은 세포 배양물, 세포 배양 상청액, 세포 배양으로부터 유래된 항체-함유 용액, 또는 단백질 정제의 이전 단계로부터의 항체-함유 용액이다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 상기 샘플이 단백질 정제의 이전 단계로부터의 원하는 단백질 함유하는 용액이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 샘플은 크로마토그래피 칼럼으로부터의 용출액(eluate)이다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 상기 샘플이 추가적으로 항바이러스 제제와 접촉되는 방법을 제공한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 항바이러스 제제는 벤잘코늄 클로라이드, 메틸렌 블루 및 트리 (n-부틸) 포스페이트로 구성된 그룹에서 선택된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 항바이러스 제제는 약 1% (w/v) 미만, 또는 약 0.1% (w/v) 미만, 또는 약 0.01% (w/v) 미만의 양으로 존재한다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 샘플을 상기 샘플 내에 비용해되기에 충분한 양의 우레이드와 접촉시키고, 상기 샘플 일부로부터 원하는 단백질을 함유하는 상청액을 분리시키는 추가적인 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 상기 샘플을 우레이드와 접촉시키는 단계는 상기 샘플을 양전하 유기 첨가물과 접촉시키는 단계 이전에 발생하는 방법을 제공한다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 상기 샘플을 우레이드와 접촉시키는 단계는 상기 샘플을 상기 양전하 유기 첨가물과 접촉시키는 단계와 실질적으로 동시에 발생하는 방법을 제공한다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 상기 샘플을 우레이드와 접촉시키는 단계는 상기 샘플을 상기 양전하 유기 첨가물과 접촉시키는 단계 이후에 발생하는 방법을 제공한다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 우레이드가 우레아, 요산, 히단토인, 알란토인, 알클록사, 알디옥사, 헤모칸, 우레이도히단토인, 5-우레이도히단토인, 글리옥시우레이드, 글리옥실산 디우레이드, 2,5-디옥소-4-이미다졸리디닐 우레아, 및 퓨린으로 구성된 그룹에서 선택되는 방법을 제공한다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 우레이드가 알란토인인 방법을 제공한다. 일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 알란토인이 0.5% (w/v) 보다 큰 양으로 존재하는 방법을 제공한다. 일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 알란토인이 약 1% (w/v) 보다 큰 양으로 존재하는 방법을 제공한다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 우레이드가 요산인 방법을 제공한다. 일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 요산이 약 0.0025% (w/v) 보다 큰 양으로 존재하는 방법을 제공한다. 일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 요산이 약 0.01% (w/v) 보다 큰 양으로 존재하는 방법을 제공한다. 일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 요산이 약 0.1% (w/v) 보다 큰 양으로 존재하는 방법을 제공한다. 일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 요산이 약 1% (w/v) 보다 큰 양으로 존재하는 방법을 제공한다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 상기 샘플을 비이온성 유기 고분자, 유기 용매, 계면 활성제 및 우레이드로 구성된 그룹에서 선택된 유기 조절제와 접촉시키는 추가적인 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 상기 샘플을 상기 유기 조절제에 접촉시키는 단계가 상기 샘플을 상기 양전하 유기 첨가물과 접촉시키는 단계 이전에 발생하는 방법을 제공한다. 일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 상기 샘플을 상기 유기 조절제와 접촉시키는 단계가 상기샘플을 상기 양전하 유기 조절제와 접촉시키는 단계와 실질적으로 동시에 발생하는 방법을 제공한다. 일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 상기 샘플을 상기 유기 조절제와 접촉시키는 단계가 상기 샘플을 상기 양전하 유기 첨가물과 접촉시키는 단계 이후에 발생하는 방법을 제공한다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 상기 유기 조절제가 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 및 폴리부틸렌 글리콜로 구성된 그룹으로부터 선택되는 비이온성 유기 고분자인 방법을 제공한다. 일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 상기 비이온성 유기 고분자는 500 D 이하의 평균 분자량을 갖는 방법을 제공한다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 상기 유기 조절제가 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 부틸렌 글리콜, 디메틸설폭사이드, 에탄올 및 페녹시에탄올로 구성된 그룹에서 선택되는 유기 용매인 방법을 제공한다. 일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 상기 유기 조절제가 약 1% (w/v) 이상의 농도로 제공되는 방법을 제공한다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 상기 유기 조절제가 Tween, triton, CHAPS, CHAPSO 및 옥틸 글루코시드로 구성된 그룹에서 선택되는 계면활성제인 방법을 제공한다. 일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 상기 계면활성제가 약 1% (w/v) 이하의 농도로 제공되는 방법을 제공한다. 일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 상기 계면활성제가 약 0.1% (w/v) 이하의 농도로 제공되는 방법을 제공한다. 일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 상기 유기 조절제가 부포화 양으로 제공되는 우레이드인 방법을 제공한다. 일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 우레이드가 우레아, 히단토인, 및 알란토인으로 구성된 그룹에서 선택된 우레이드인 방법을 제공한다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 본 출원에 개시된 방법들 중 임의의 방법의 용이한 실행을 위해 제공되는 키트들을 제공하며, 상기 키트는 양전하 유기 첨가물, 샘플의 과포화를 위해 충분한 양의 적어도 하나의 우레이드, 유기 조절제, 및 항바이러스 제제를 포함하며, 제공된 물질들은 키트가 제공되는 샘플에 대해 본 발명의 용이한 실행을 위해 충분한 양으로 제공된다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 본 발명의 일부 방법들의 용이한 실행을 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 일 이상의 다가 유기 양이온, 우레이드, 유기 조절제, 항바이러스 제제 및 전도도 조절을 위한 시약과 같은 본 발명의 실행에 유용한 시약들을 제공한다. 상기 키트는 단백질 정제 용도를 위한 본 발명의 실행에 적절한 양 및 농도의 물질들을 제공할 수 있다. 이러한 키트들은 IgG 또는 IgM 항체들과 같은 특정 단백질들의 용도에 적합할 수 있으며, 단백질 제조 및 정제의 특정 스케일에 적절한 양으로 조절될 수 있다. 물질들은 용액 형태의 용도로 바로 사용가능하도록 공급될 수 있으며, 희석을 위해 적절한 농축 용액 또는 본 발명의 방법 실행을 위한 용액 제조에 있어서 사용자에 의해 사용되는 고체 형태로 공급될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 이후에, 추가적인 공정 이전에 샘플로부터 양전하 제제들 또는 다른 샘플 성분들을 선택적으로 제거하는 효과를 갖는 고체를 갖는 고체 물질과 상기 샘플을 접촉시키는 단계가 수행될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 종래의 단백질 정제 방법과 결합되어 보다 높은 레벨의 정제도를 획득하거나 다른 오염물들을 제거할 수 있다. 예를 들면, 본 발명은 침전, 크로마토그래피 및 액체-액체 추출법을 포함하는 종래의 정제 방법들과 결합되어 수행될 수 있다. 이러한 추가적인 방법들은 본 발명과 조합되어, 이들은 본 발명의 특징들 이전에, 동시에 또는 이후에 수행될 수 있다. 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 이러한 방법들의 적절한 조건들을 개발하고 이들을 본 출원에 기술된 방법들과 통합하여 원하는 생성물의 정제를 실현할 수 있을 것이다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 크로마토그래피 정제가 개시되기 전에 응집체 레벨을 감소가능케 하며, 후속 공정 단계들의 부담을 제거한다. DNA, 내독소 및 바이러스 레벨이 응집체 감소와 함께 감소될 수 있으며, 이는 하류의 정제 단계들의 부감을 초가로 감소시킬 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 저농도의 양전하 유기 첨가물과 조합된 유기 조절제의 사용은 실질적인 침전문의 형성을 방지하며, 고체 제거를 위한 중간 공정 단계 없이 본 발명에 따라 처리된 샘플을 바로 크로마토그래피 칼럼에 적용가능토록 한다. 이러한 실시예들은 추가적으로 비-양이온성 유기 첨가물 항바이러스 제제의 첨가와 양립가능할 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 동작 조건은 응집체들이 감소되고 원하는 단백질이 용액 내에 잔류하는 정도를 조절하기 위해 pH 및/또는 킬레이트제, 유기 고분자 또는 용매, 계면 활성제, 카오트로프(chaotropes) 및 다양한 종류의 염들의 존재에 따라 변화될 수 있다.
본 발명의 추가적인 목적 및 이점들은 하기의 상세한 설명에서 부분적으로 제시될 것이며, 부분적으로는 상기 상세한 설명으로부터 자명할 것이며, 또는 본 발명의 실행으로부터 학습될 수 있을 것이다. 본 발명의 목적 및 이점들은 청구항에 특정된 구성들 및 조합들의 수단에 의해 실현 및 획득될 것이다.
또한, 하기의 일반적 설명 및 이에 따른 상세한 설명은 단지 예시적인 것이며 청구된 본 발명을 제한하는 목적이 아님을 이해해야 한다.
용어의 정의
본 발명의 용이한 이해를 위해 용어들이 정의된다. 추가적인 정의들은 상세한 설명을 통해 제공된다.
"응집체(aggregate(s))"는 생리적 조건에서 안정적인 2 이상의 분자들의 회합체를 지칭하며, 넓은 범위의 pH에 및 전도도 조건에서 안정적으로 잔류할 수 있다. 응집체는 자주 단백질, 핵산, 또는 지질 및 다른 분자 혹은 금속 이온과 같은 일 이상의 생분자를 포함한다. 이러한 회합은 임의의 타입의 혹은 임의의 화학적 상호작용의 조합을 통해 유발될 수 있다. 항체들의 응집체는 두 카테고리로 분류될 수 있다: "호모응집체(homoaggregates)"는 2 이상의 항체 분자들의 안정적 회합을 지칭한다; "헤테로-응집체(Hetero-aggregates)"는 일 이상의 항체 분자와 일 이상의 비-항체 분자의 안정적 회합을 지칭한다. 상기의 비-항체 성분은 뉴클레오티드, 내독소, 금속 이온, 단백질, 지질 또는 세포 배양 배지 성분으로 구성된 그룹으로부터의 일 이상의 개체들로 구성될 수 있다.
"항체"는 면역글로불린, 합성물(composite) 또는 이들의 절편 형태를 지칭할 수 있다. 항체는 이에 제한되는 것은 아니나, 천연 또는 인간화, 인간, 단일-사슬, 키메릭, 합성, 재조합, 하이브리드, 돌연변이, 이식, 및 인 비트로 생성 항체들과 같은 유전적으로 조절된 형태들을 포함하는 인간 혹은 다른 포유류 세포주들로부터의 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 클래스들의 폴리클로날 또는 모노클로날 항체들을 포함할 수 있다. "항체"는 또한 이에 제한되는 것은 아니나, 면역글로불린 잔기를 함유하는 융합 단백질을 포함하는 합성물 형태를 포함할 수 있다. "항체"는 또한 항원-결합 기능을 보유하거나 보유하지 않는 Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb, Fc 및 다른 조성물과 같은 항체 절편들을 포함할 수 있다.
"내독소(Endotoxin)"는 용균(lysis) 시 세포로부터 방출되는 그람-음성 박테리아의 외피 멤브레인 내에 존재하는 독성 열-안정적인 리포폴리사카라이드 물질을 지칭한다.
"비-이온성 유기 고분자(Non-ionic organic polymer)"는 천연적으로 발생되거나 하전된 그룹이 없는 연결된 반복 유기 서브유닛으로 구성된 합성 탄화수소를 지칭한다. 이는 선형, 일부 브랜치가 있는 지배적 선형, 또는 지배적으로 브랜치된 형태일 수 있다. 본 발명을 실행하는데 적절한 예들은 이에 제한되는 것은 아니나, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 및 폴리비닐피롤리돈(PVP)을 포함한다. PEG는 HO-(CH2-CH2-O)n-H의 구조식을 갖는다. 예를 들면, 이에 제한되는 것은 아니나, 100 미만으로부터 내지 1000 daltons 이상의 평균 고분자 분자량을 갖는 조성물을 포함한다.
"양전하 유기 첨가물(Electropositive organic additive)"적어도 하나의 양전하를 함유한 천연 또는 합성 유래의 유기 분자, 양이온 또는 염을 지칭하며, 복수의 양전하를 함유할 수 있다. 상기 양전하 유기 첨가물은 음 전하를 보유할 수도 있으나, 이러한 경우에 있어서 여전히 그것이 채용되는 동작 조건에서 네트(net) 양전하를 갖는다. 상기 양전하 유기 첨가물이 네트 양성일 때, 이는 클로라이드, 브로마이드, 설페이트, 유기산, 락테이트, 글루코네이트, 및 본 방법과 양립할 수 있는 다른 음이온과 같은 짝이온(음이온)과 함께 제공될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 양전하 유기 첨가물의 특정 양전하는 아민, 이민, 또는 다른 질소 잔기들에 의해 공급된다. 상기 양전하 유기 첨가물은 추가적으로 소수성 잔기, 금속 친화 잔기, 수소 결합 잔기, 다른 관능성 잔기를 포함할 수 있으며, 또한 다른 타입의 화학적 상호작용에 참여하는 능력을 보유할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서 양전하 유기 첨가물의 예들은 이에 제한되는 것은 아니나, 디아미노산, 폴리리신(polylysine), 폴리아르기닌(polyarginine), 폴리히스티딘(polyhistidine), 폴리오르니틴(polyornithine)과 같은 디-, 트리- 또는 더 큰 호모- 혹은 헤테로-펩티드; 폴리에틸렌이민; 폴리알릴아민; 폴리디메트린(polydimethrine), 폴리메틸아크릴아미도프로필트리메틸암모니아; 폴리디알릴디메틸암모니아; 폴리비닐벤질트리메틸암모니아; 폴리비닐구아니딘(polyvinylguanidine); 폴리(N-에틸-4-비닐피리딘); DEAE-덱스트란; DEAE-셀룰로오스; 에타크리딘(CAS number 442-16-0); 7-에톡시아크리딘-3,9-디아민; 트리스(2-아미노에틸)아민; 구아니딘; 클로르헥시딘; 알렉시딘(alexidine); 시트리시달(citricidal), 프로타민(protamine); 스페르민(spermine); 스페르미딘(spermidine); 살민(salmine); 키토산(chitosan); 및 이들의 변이체 및 유도체들을 포함한다. 예를 들면, 에타크리딘의 변이체 및 유도체들은 9-아미노아크리딘(아미나크린), 3,6 아크리딘디아민(프로플라빈), 아크리소르신, 아크리잔(페나크리단), 아크리딘 오렌지, 퀴나크린, 아크리사이드, 아크리돈, 아크리딘-9-카르복실산, 아크라닐(1-[(6-클로로-2-메톡시-9-아크리디닐)아미노]-3-(디에틸아미노)-2-프로판올 디하이드로클로라이드), 페노사프라닌, 페녹사진, 페노티아진, 아크리플라빈 (3,6-디아미노-10-메틸아크리디늄, 클로라이드 및 3,6-아크리딘이디아민), 및 이들의 염(예를 들면, 클로라이드, 브로마이드, 설페이트, 락테이트, 글루코네이트)을 포함하는 것으로 이해된다.
"유기 용매"는 액상으로 존재하는 천연 유래 혹은 합성 유기 화합물을 지칭한다. 본 발명 실행에 적절한 예들은, 이에 제한되는 것은 아니나, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 디메틸 설폭사이드, 에탄올 및 페녹시에탄올을 포함한다.
"유기 고분자"는 유기 모노머의 천연 유래 또는 합성 고분자를 지칭한다. 비제한적인 예로서 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 덱스트란 또는 셀룰로오스를 들 수 있다.
"폴리뉴클레오티드"는 사슬 내에 공유 결합된 복수의 뉴클레오티드 모노머들로 구성된 생고분자를 지칭한다. DNA(deoxyribonucleic acid) 및 RNA(ribonucleic acid)가 폴리뉴클레오티드의 예이다.
"단백질"은 탄소, 수소, 산소, 질소 및 일반적으로 황을 함유하는 유기 마크로분자 복합체 그룹을 지칭하며, 주로 펩티드 결합에 의해 연결된 일 이상의 아미노산 사슬로 구성된다. 단백질은 천연의 또는 재조합 유래일 수 있다. 단백질은 글리코실레이션, 페길레이션, 또는 다른 화학적 잔기들과 콘쥬게이션과 같은 비-아미노산 잔기들로 변성될 수 있다. 단백질의 비제한적인 예로서, 항체, 응고 인자, 효소 및 펩티드 호르몬을 들 수 있다.
"비용해 우레이드(Undissolved ureide)"는 특정 단백질 제조물에 있어서 지배적인 조건 하에 그것의 최대 용해도를 초과하는 양의 우레이드를 함유한 용액을 지칭한다. 일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 우레이드의 일부가 샘플 내의 비용해 형태로 존재하는 조건 하의 샘플 내 우레이드의 용해도보다 많은 양의 우레이드를 갖는 샘플을 제공한다.
"계면활성제(Surfactant)"는 일반적으로 소수성 부분 및 친수성 부분을 포함하며, 양친매성(amphiphilic)으로 지칭되는 유기 분자 클래스와 같은 "표면 활성 제제"를 지칭한다. 수용액 내 충분한 농도에서, 계면활성제는 클러스터로 자기-회합되어 소수성 부분은 중심에 집중되어 물과의 접촉을 최소화하고, 친수성 부분은 외부로 방사되어 물과의 접촉이 최대화된다. 특히 소수성 성질 또는 소수성 영역을 보유한 물질을 함유하는 생물학적 제제의 존재 하에, 계면활성제의 상기 소수성 부분은 소수성 물질의 일부와 자발적으로 회합되는 경향이 있으며, 계면 활성제의 친수성 부분의 영향을 통해 용해도롤 증가시킨다. 이들은 또한 수용성 용매 내에 용해된 서로 다른 소수성 물질들 사이에 발생하는 소수성 상호작용을 조절하기 위해 사용될 수도 있다. 본 발명의 일부 실시예들의 실행에 적절한 계면활성제들의 예들은 이에 제한되는 것은 아니나, 폴리소르베이트 계면활성제들(예를 들면, Tween 20, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트, 및 Tween 80, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올리에이트) 및 Triton(예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 p-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)-페닐 에테르)과 같은 비이온성 계면활성제, 및 CHAPS (3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트), CHAPSO (3-[(3-콜아미도프로필) 디메틸암모니오]-2-히드록시-1-프로판설포네이트), 및 옥틸 글루코시드(예를 들면, (2R,3S,4S,5R,6R)-2-(히드록시메틸)-6-옥트옥시옥산-3,4,5-트리올)과 같은 양쪽 이온성 계면활성제들을 들 수 있다.
"바이러스" 또는 "비리온(virion)"은 주로 박테리아, 식물 및 동물들과 같은 살아있는 호스트 세포들 내부에서만 복제하는 초미세의(약 20 내지 300 nm 직경의) 대사적으로 불활성의, 전염성 제제를 지칭한다: RNA 또는 DNA 코어, 단백질 코트, 및, 보다 복잡한 타입에 있어서 외피로 구성된다.
일부 실시예들에 따라 본 발명 사용을 위한 제조물에 있어서, 양전하 유기 첨가물 선택이 필요하다. 실험 데이터는 일반적으로 양전하 유기 첨가물의 소수성이 낮아질수록, 관심 대상 단백질의 회수율이 높아짐을 나타낸다. 또한, 소수성이 작아질수록, 보다 넓고 높은 농도 범위에서 상기 양전하 유기 첨가물이 적용되어 단백질의 상당한 손실 없이 효과적으로 응집체 감소를 구현할 수 있다. 따라서, 약하게 소수성인 PEI는 보다 소수성이 강한 에타크리딘, 또는 그보다 더 소수성이 강한 클로르헥시딘보다 좋은 후보로 간주될 수 있다. 그러나, 생성물 회수율 외에도 다른 이슈들 역시 고려되어야 한다. PEI는 널리 알려진 세포독성 성질을 포함하며, 정제 공정을 통해 단백질 제조물로부터 이의 제거를 용이하게 확인하기 위한 적절한 감도로 검출하는 것이 어렵다. 에타크리딘은 플라즈마 단백질 분별 분야 및 항바이러스 제제로서 오랫동안 사용된 것으로서 선호될 수 있다. 추가적으로, 이것의 밝은 황색 컬러 및 고유의 형광 특성은 주어진 샘플에서 측정 감도를 향상시킬 수 있으며, 이에 따라 본 방법의 실행에 이은 제거의 기록을 촉진할 수 있다. 서로 다른 양전하 유기 첨가물이 원하는 효과를 중재하는 이들의 능력을 보유하는 서로 다른 이차 화학적 작용성을 포함할 수 있다. 예를 들면, PEI는 DNA에 주로 정전 상호작용 및 수소 결합을 통해 결합하는 것으로 이해된다. 에타크리딘은 두 상호작용에 대해 더 작은 기회를 제공하나, DNA를 끼워 넣는 것으로 알려졌다. 이러한 차이점들은 미소하지만, 하나의 양전하 유기 첨가물이 다른 것에 대한 상대적 적절성에 있어서 유용한 차이점을 갖도록 기여하며, 이는 표면적으로는 비이상적으로 보일 수 있는 후보들을 평가하는 실용적 이점이 있음을 부각시킨다.
일부 실시예들에 있어 사용되는 양전하 유기 첨가물의 평가 과정에 있어서, 상기 양전하 유기 첨가물의 적용을 위한 조건은 다음과 같이 조사될 수 있다. 양전하 유기 첨가물의 사용은 잠재적으로 일부 실시예들에 따른 본 방법의 실행에 사용되는 조건 상에 일부 제한을 가할 수 있다. 예를 들면, 상기 양전하 유기 첨가물 및 관심 대상 단백질 사이의 강한 상호작용을 실질적으로 방지하는 조건을 채용하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 조건들의 근사치를 획득하는 간단한 방법은 관심 대상 단백질을 음이온 교환기에 적용하여 염 농도 구배 내에서 용출시키는 것이다. 단백질이 용출되는 문턱 값 바로 위의 염 농도는 대략적으로 본 방법이 가장 효과적으로 수행될 수 있는 최소 전도도를 확인시킬 수 있다. 이러한 농도는 pH에 의해 영향받을 수 있으며, 이는 동일한 수단에 의해 모델링될 수 있다. 상기 방법이 세포 배양 상청액에 적용되는 경우, IgG 항체는 상당한 손실의 회피를 위해 염 추가 또는 pH의 조절을 요구하지 않을 수 있다. IgM 항체는 30 mS/cm(생리학적 값의 약 2 배) 전도도 수치까지 도달할 때까지 염 추가를 요구할 수 있다. 비용해 우레이드 및 양전하 유기 첨가물의 사용을 포함하는 일부 실시예들에 있어서, IgG 적용은 1 mS/cm 이하의 값을 포함할 수 있는, 생리학적 전도도보다 낮은 조건에서 수행될 수 있으며, 이 경우 호스트 단백질의 실질적인 양이 응집체 분리와 함께 제거될 수 있다. 이러한 적용은 양전하 유기 첨가물의 농도가 증가되어 호스트 단백질에의 결합을 통해 손실되는 양을 보충할 것을 요구할 수 있다. 이러한 환경에서 낮은 동작 전도도는 또한 DNA, 내독소 및 바이러스의 제거를 향상시킬 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 일반적으로 95% 이상, 보통은 98-99%의 항체 회수율을 지지할 수 있다. 샘플의 전도도 및 pH 조건은 일반적으로 우레이드 또는 양전하 유기 첨가물 중 어느 하나의 추가 전에 수립되어야 한다.
일부 실시예들에 있어서, 이온성 상호작용에 의해 중재되는 대부분의 공정들과 달리, 본 발명을 실행하기 위한 조건들의 평가는 특히 실질적으로 실용적 최소값 위의 전도도 값을 포함하고 선호할 수 있다. 특히 세포 배양 상청액과 같은 크루드(crude) 샘플들에 적용될 때, 생리적 전도도 보다 상당히 아래의 조건들은 양전하 유기 첨가물과 산성 단백질의 강한 상호작용을 증진시킬 수 있으며, 적어도 두 바람직하지 않은 결과들을 생성할 수 있다. 하나는 침전물 형성을 촉진하는 것이며, 다른 하나는 산성 단백질 및/또는 침전물에 의한 상기 양전하 유기 첨가물의 서브집단의 격리가 잔류하는 양전하 우기 첨가물의 가능한 농도를 감소시키고, 본 발명의 응집체양 감소 능력을 제한하는 효과를 가질 수 있다는 것이다. 일반적으로, 생리학적 값보다 3배 까지의 전도도 상승은 효과적인 응집체 감소 및 90% 이상의 항체 회수를 지지할 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 특히 생분자 및 양전하 유기 첨가물 사이의, 이온성 상호작용에 의해 중재되는 대부분의 공정에서의 권장사항과는 달리, pH는 4 이하의 값까지 감소될 수 있다. 이러한 극단적 값은 필요하더라도 드물 것이고, 중성 pH 값보다 단백질 용해도를 유지하기 위한 더 높은 전도도를 요구할 것이다.
일부 실시예들에 있어서, IgG 모노클로날 항체들을 함유하는 정제된 세포 배양 상청액을 위한 조건을 평가하는 하나의 효과적인 수단은 0.005 내지 0.05% 범위의 양전하 유기 첨가물 및 생리학적 값에서 이의 2배 범위까지의 전도도를 커버하는 것이다. 상기 범위는 바람직한 경우 확장 또는 축소될 수 있다. 침전이 이러한 범위 내에서 관찰되는 경우, 이는 전도도를 생리학적 값의 3배 까지 증가시킴으로써 응집체 감소의 손실 없이 방지될 수 있다. 이는 약 45 mS/cm에 해당한다. 더 높은 전도도도 가능할 수 있다. 일반적으로 상기 양전하 유기 첨가물의 추가 이전에 샘플의 전도도를 조절하는 것이 유리할 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 정제된 세포 배양 상청액을 위한 본 발명에 따른 정제 공정을 개발하기 위한 편리한 출발점은 0.02% 에타크리딘을 사용하는 것이다. 비정제된 세포-함유 수확물은 상기 세포들이 충분히 양전하의 유기 첨가물에 결합하여 헤테로-응집체의 분리 가능한 양을 감소시키기 때문에 고농도로 사용하는 것이 유리할 수 있다. 세포-함유 제조물에 적용될 경우, 본 발명의 이차적 이점은 이것이 실질적으로 세포 및 잔해들의 침강을 가속시키고, 이들의 제거를 촉진한다는 것이다. 본 발명이 세포-함유 제조물에 적용되는 경우, 과량의 세포 사멸 및/또는 세포 내용물의 제조물로의 배출을 회피하기 위해 생리학적 조건과 근접한 조건을 유지하는 것이 바람직할 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 양전하 유기 첨가물의 추가 이전에 단백질 제조물 내에 유기 조절제를 분산시킴으로서 시작하는 것이 항체 회수를 향상시킨다는 측면에서 유리할 수 있다. 상기 양전하 유기 첨가물의 추가 이전에 긴 배양 시간은 불필요할 수 있다; 긴 배양시간에 특별히 불리한 점은 없으나, 15 분 이하가 적당하다. 실험 데이터는 일반적으로 상기 양전하 유기 첨가물에 앞서 첨가되는 경우, 약 1%의 상청액 내의 알란토인의 추가는 IgG의 회수를 증가시키는 것을 제시한다.
일부 실시예들에 있어서, 샘플로의 추가 전에 예를 들면 물 혹은 버퍼액 내에서 상기 양전하 유기 첨가물 양이온이 용해되어 단백질 제조물을 통한 빠른 분포를 촉진할 것이 추천된다. 지속되는 국부적 과량을 주의해야 하며, 예를 들면 점진적으로 용해된 양전하 유기 첨가물을 잘 혼합된 서스펜션 내부로 융합시킬 수 있다. 배양 시간은 적어도 15 분 이상이어야 하며, 바람직하게는 30 분일 수 있으나, 60 분 이상의 시간은 이득이 없는 것으로 보인다.
본 방법은 일반적으로 대기 온도에서 수행될 수 있으나, 예를 들면 4 oC 내지 37 oC와 같은 그보다 높거나 낮은 온도에서 수행될 수도 있다. 실험 데이터는 온도는 실질적으로 수득 결과를 변경하지 않는 것으로 나타나며, 이는 동작 온도의 선택에 있어서 단백질의 결정 인자의 안정성 요건을 남겨놓을 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 양전하 유기 첨가물은, 예를 들면 물 또는 버퍼액 내에 용해되거나 분산되며, 이의 추가 이전에 pH가 조절된다. 이는 특히 양이온성 고분자를 포함하는 일부 양전하 유기 첨가물은 극도로 알칼리성이며 예상치 못한 방식으로 실험 조건을 실질적으로 변경시킬 가능성이 있기 때문이다.
과포화 우레이드 및 양전하 유기 첨가물 양자를 사용하는 일부 실시예들에 있어서, 상기 양전하 유기 첨가물을 첨가하기 전에 단백질 제조물 내에 우레이드를 분산시킴으로서 개시하는 것이 일반적으로 유리할 수 있다. 이는 우레이드 알란토인을 사용한 실험 결과가 이러한 실행법이 항체 회수를 향상시킬 수 있음을 나타내기 때문이다. 상기 양전하 유기 첨가물 첨가 전에 긴 배양시간은 불필요하다; 긴 배양시간에 특별한 불이익은 없으나, 15분 이하가 적당하다.
일부 실시예들에 있어서, 유기 조절제 및 양전하 유기 첨가물을 선택하여 어느 조합 및 동작 조건이 특정 적용예에 가장 적합한지 결정하는 공정을 시작하는 것이 바람직할 수 있다. 그 선택에 있어서 양전하 유기 첨가물의 성질이 적어도 부분적으로 가장 적절한 유기 조절제, 또는 상기 유기 조절제의 작동 농도를 결정함, 및/또는 그 역(vice versa)에 대한 지식이 도움이 될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 일반적으로 양전하 유기 첨가물이 보다 소수성이 될수록, 유기 조절제가 소수성 상호작용을 약화시키는 능력을 보다 강하게 가질 것이 요구되거나, 고농도에서 보다 약한 소수성 조절제가 사용될 것이 요구된다. 조절은 또한 수소 결합이 관여되고, 상이한 양전하 유기 첨가물 및 상이한 유기 조절제가 서로 다른 소수성 상호작용 및 수소 결합 친화도 균형을 포함하는 것으로 예상되므로 이는 지나치게 단순화한 것이나 개념을 설명할 수 있다. 따라서, 약한 소수성 PEI는 약한 유기 조절제의 최소 농도로 양호한 결과를 생성할 수 있으므로, 일부 경우에 있어서 선호될 수 있으나, PEI는 이의 알려진 세포독성 성질 및 정제 공정을 통해 단백질 제조물로부터의 제거를 용이하게 확인할 수 있는 적절한 감도로 PEI를 검출하는 것에 어려움 때문에 선호도가 낮을 수 있다. 강한 소수성을 갖는 에타크리딘은 일부 경우에 있어서 상호작용하는 물질과의 침전 경향 때문에 선호되지 않을 수 있다. 그러나, 에타크리딘은 플라즈마 단백질 분별 분야 및 항바이러스 제제로서 널리 사용되어 왔으므로 선호될 수 있다. 추가적으로, 이의 밝은 황색 컬러 및 고유의 형광 특성은 주어진 샘플에서의 이의 고감도 측정을 가능케하며, 이에 따라 본 방법 실행에 이어서 이것의 제거의 기록화를 용이하게 할 수 있다. 에타크리딘의 결합/침전 경향은 적절한 농도에서 적절한 유기 조절제에 의해 보상될 수 있다. 클로르헥시딘의 더 높은 소수성은 고도의 조절을 요구할 수 있으나, 그 선택은 280 nm에서의 이의 강한 UV 흡수에 의해 선호되지 않을 수 있다.
복수의 옵션들이 본 방법에 의해 실현되는 응집체 분리 또는 제거를 모니터링하기 위해 존재하며, 개발 또는 제조 중이다. 가장 간단한 것은 적절한 선택성을 갖는 칼럼 상의 크기 배제 크로마토그래피 분석을 수행하고 280 nm의 UV 파장에서 모니터링하는 것이다. 이는 HMW(high molecular weight) 응집체들을 나타낼 수 있으며, 이는 일반적으로 비-응집체 생성물 크기의 복수체로 용이하게 변형되는 하이드로다이나믹 크기를 포함하기 때문이다. 헤테로-응집체들은 본 방법에 있어서, 이들의 하이드로다이나믹 크기가 비-응집 생성물의 크기보다 단지 미소하게 크기 때문에 일반적으로 간과된다. 이러한 경우, 응집체의 이형(heteromorphic) 조성물은 254(혹은 260) nm 내지 280 nm에서의 UV 흡수 비율을 계산하고, 이어서 회합된 오염물이 완전히 제거된 것으로 간주되는 정제된 단백질의 흡수 비율에 대해 이를 비교함으로써 나타날 수 있다. 헤테로-응집체 함유 DNA는, 예를 들면, 254/280의 상승된 비율에 의해 나타날 수 있다. 크로마토그래피가 용량을 제공하는 경우, 에타크리딘 함량은 365 nm에서 동시에 모니터링될 수 있다. 이는 후속 정제 공정을 통해 에타크리딘 제거를 기록하는데 있어 유용할 수 있다. 복수의 파장 모니터링이 또한 다른 크로마토그래피 방법들과 결합되어 사용될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 후속 정제 이전에 양전하 유기 첨가물 및 잠재적인 다른 성분들 제거를 위한 처리와 병합될 수 있다. 이러한 처리들은 상기 양전하 유기 첨가물들의 성질에 대해 상보적인 화학 잔기들을 함유한 고체에 샘플을 노출시키는 것을 포함할 수 있으며, 이는 상기 샘플의 잔여물로부터 상기 양전하 유기 첨가물을 격리시키는 목적으로 사용될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 비제한적인 예로서 단백질 A 및 다른 형태의 생물학적 친화도 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 고정 금속 친화도 크로마토그래피, 히드록시아파타이트 또는 다른 혼합 모드 크로마토그래피, 및/또는 침전 및 액체-액체 추출과 같은 비-크로마토그래피 방법들을 포함하는 일 이상의 정제 방법들과 병합될 수 있다. 당해 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자라면 다양한 방법들에 대한 적절한 조건들을 설정하고 이를 본 출원에 개시된 발명과 병합하여 특정 항체의 필요한 정체를 구현할 수 있을 것이다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명 수행 용도 평가를 위해 적어도 하나의 종의 우레이드를 선택하는 것이 필요할 수 있다. 요산은 사실상 불용성이며 비용해 요산의 제거 후에 처리된 단백질 제조물로부터 거의 존재하지 않는다는 장점이 있으나, 용해된 알란토인은 양전하 유기 첨가물의 효과를 조절하며, 일반적으로 높은 항체 회수를 지지하는 것으로 추정된다. 양전하 유기 첨가물의 선택에 대해, 에타크리딘은 플라즈마 단백질 분별 분야 및 항바이러스 제제로서 오랫동안 사용된 점을 포함하여 일부 매력적인 특징들을 제공한다. 또한, 이는 DNA를 끼어넣으며, 내독소에 강하게 결합한다. 추가적으로, 이의 밝은 황색 컬러 및 고유의 형광 특성은 주어진 샘플에서 측정 감도를 향상시키며, 이에 따라 본 발명의 수행에 이은 제거를 기록하는데 용이하다.
일부 실시예들에 있어서, 우레이드 및 양전하 유기 첨가물의 바람직한 농도는 처리에 사용되는 단백질 제조물의 조성물에 의해 영향받을 수 있다. 정제된 세포 배양 상청액에 대한 편리한 출발점은 1% 알란토인 및 0.02% 에타크리딘이다. 양자 모두 실험적으로 조절되어 원하는 결과물을 제공하는 양을 미세-조정할 수 있다. 세포-함유 세포 배양 수확물에의 본 발명 적용은 다량의 우레이드 및 양전하 유기 첨가물을 요구할 수 있다. 실험 데이터에 의하면 특히 일부 실시예들에 있어서, 많은 양의 알란토인이 상청액 획득에 요구될 수 있으며, 많은 양의 에타크리딘이 세포 표면 상에서 소실된 양의 보상을 위해 요구될 수 있다. 양자의 적절한 유효량을 확인하는데 실험이 도움이 될 수 있다. 본 발명은 일부 실시예들에 있어서, 특히 매우 높은 밀도의 배양물이 응집된 항체의 다수를 생성하는 상황에 있어서, 응집체를 제거하기 보다는 분리시킴에 의한 항체 회수를 증가시키는 현저한 효과를 제공한다. 이는 따라서 극단적인 고-생성 세포 배양물로부터 단백질 정제를 가능케하며, 실질적으로 생성물/정제 공정 전체의 생산성 및 경제성을 향상시킬 수 있다. 본 발명의 또 다른 이점은 세포들 및 잔해물의 침강을 실질적으로 가속시키며, 이들의 제거를 촉진한다는 것이다.
시차 주사 열량측정법(differential scanning calorimetry)에 데이터에 따르면, 35 mM(포화에 근사) 알란토인은 IgG의 열적 전이 온도를 35 mM 우레아가 열적 전이 온도를 낮추는 양의 약 반으로 낮추는 효과를 갖는다. 이는 알란토인에 의한 단백질 변성의 위험이 영(nil)임을 나타낸다. 이는 또한 알란토인과 양전하 유기 첨가물의 조합이 양전하 유기 첨가물 단독으로 구현되는 것에 비해 바이러스 불활성 레벨을 증가시킬 수 있음을 나타내며, 이러한 바이러스 불활성은 비용해 우레이드에 의한 바이러스의 결합에 부가되어 발생하는 것으로 보인다.
실험예
실험예 1
HMW 응집체 감소 및 헤테로응집체의 분리에 대한 양전하 유기 첨가물의 비교가 수행되었다. 모노클로날 IgM-함유 정제 세포 배양 상청액이 200mM 아르기닌, 10mM EDTA, 50mM MES, pH 6.5의 버퍼 내에서 수행되는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분석되었다. 상기 물질은 11% HMW 응집체를 함유하였고, IgM 피크는 헤테로-응집체의 실질적 존재를 지시하는 0.506의 254/280 비율을 나타냈다. 상기 상청액의 전도도는 소듐 클로라이드의 첨가에 의해 20 mS/cm로 상승하였다. 9개의 샘플들이 0.01, 0.05, 및 0.1% PEI-1200, 0.01, 0.05, 및 0.1% 에타크리딘, 및 0.01, 0.05, 및 0.1% 클로르헥시딘으로 처리되고, 30 분동안 배양시킨 후 SEC에 의해 분석되었다(하기의 결과). 0.1% 클로르헥시딘 샘플이 분석 전에 침전되었다. 상기 샘플들은 30분 동안 배양되고, SEC에 의해 분석되었다. 에타크리딘만이 HMW 응집체를 제거하였다. 이는 또한 유효한 헤테로-응집체 분리를 지지하였다. PEI는 모든 농도들에서 97% 이상의 회수를 제공하였으며, 양호한 헤테로-응집체 분리를 보였으나, 열등한 헤테로응집체 감소를 나타냈다. 클로르헥시딘은 대략적으로 에타크리딘 및 PEI의 중간으로 나타났다.
실험예
2
HMW 응집체 감소 및 헤테로응집체들의 분리를 위한 양전하 유기 첨가물이 비교되었다. 실험예 1의 형태가 다른 항체로 반복되었다. 상기 항체는 7.5% HMW 응집체 및 낮은 헤테로-응집체 함량을 나타냈다. 실험예 1과 기본적으로 동일한 경향이 얻어졌으나, 명확한 차이가 나타났고, 이는 상기 항체의 성질에 기인한 것으로 추정된다. 결과는 하기에 표시된다.
실험예
3
보다 높은 전도도의 효과. 실험예 2의 에타크리딘 시리즈가 40 mS/cm의 상청액 전도도에서 반복되었다. HMW 응집체 및 헤테로-응집체 레벨은 20 mS/cm에서 보다 미처리 조절에서 낮아졌다. HMW 응집체는 에타크리딘 농도에 대해 동일한 경향을 가지나, 헤테로응집체들은 반도 방향의 경향을 가졌으며, 회수는 낮았다.
실험예
4
단일클로날 IgM-함유 세포-배양 상청액 내의 DNA-항체 헤테로-응집체의 레벨 감소를 위한 작용 조건의 결정. 히드록시아파타이트 크로마토그래피는 모노클로날 IgM 85가 DNA와 과하게 결합됨을 보여주었다. 이는 280 nm에서의 UV 흡수와 거의 동등한 254 nm에서의 IgM 피크의 UV 흡수를 나타냈다. DNA-프리 IgM은 약 2:1의 280/254 비율을 갖는다. 모노클로날 IgM-함유 정제된 세포 배양 상청액이 양전하 유기 첨가물 PEI-1300 및 우레이드 알란토인의 다양한 조합들과 결합된 실험을 세팅하여 IgM으로부터 DNA 분리를 위한 가장 효과적인 조합을 결정하였다. 샘플들은 오염물의 존재로 초기에 갈색을 나타냈으며, 다소 탁하였으며, 이는 침전물의 존재를 나타냈다. 모든 샘플들은 건조 알란토인 파우더의 직접 추가에 의해 알란토인으로 포화되었다. 모든 알란토인-함유 샘플들은 외관상 두껍게 흐렸다. PEI의 스톡 용액이 50% PEI-1300 (Sigma)을 아세트산으로 pH 7.0으로 적정하고 물을 첨가하여 최종 PEI 농도 10%로 제조되었다. PEI가 샘플에 첨가되어 2%, 1%, 0.5%, 0.025%, 0.0125%, 및 0.00625%의 최종 농도를 생성하였다. PEI가 없으나 알란토인을 포함하는 실험 통제가 제조되었다. 알란토인은 부존재하고 0.05% PEI를 갖는 또 다른 통제가 제조되었다. 후자의 통제에서 흐릿함은 변화되지 않았으며, 이는 PEI-1300 단독으로 실질적인 DNA 또는 다른 성분들의 침전을 야기하지 못함을 나타낸다. 각 샘플은 0.22 μm 멤브레인으로 여과되었다. 샘플들은 용이하게 여과되었고, 처리 후에 반짝이면서 광학적으로 클리어했다. 이는 본 발명의 구분되는 특징이다. 각 샘플은 50 mM Hepes, pH 7.0로 평형된 히드록시아파타이트(CHT type II, 40 μm, 1 mL, 5x50 mm, 1 mL/min) 칼럼에 적용되고; 50 mM Hepes, 2 M NaCl, pH 7.0로 세척되고; 초기 조건으로 다시 평형되고; 10 칼럼 부피(CV) 선형 그래디언트로 250mM 소듐 포스페이트, pH 7.0으로 용리되고; 이어서 500 mM 포스페이트, pH 7.0으로 세정되었다. PEI-단독 샘플은 부분적 분리를 보여주었다. 매우 큰 DNA 피크가 세정 단계에서 용리되었다. 알란토인-단독 샘플은 복합 DNA의 더 약한 감소를 보여주었으나, 세정 피크에서 매우 작은 DNA 용리를 보여주었다. 모든 PEI/알란토인-처리 샘플들로부터 용리된 IgM은 이상적인 280/254 비율을 보여주었고, 이는 IgM으로부터 세정단게에서 무시할 수 있는 양의 DNA 용리만 보여주면서 실질적인 완전한 DNA 분리가 수행되었음을 나타낸다. 1% PEI에서 수집된 히드록시아파타이트-분별 IgM은 분석 SEC 칼럼에 적용되었다. IgM은 잔류 DNA 없이 95% 순도보타 높은 것으로 측정되었다. 이러한 실험예는 본 발명의 피드 내에 높은 DNA 레벨의 존재에 의해 일반적으로 효과가 없는 방법에 의해 캡쳐되는 유효한 생성물을 가능케하는 본 발명의 능력을 설명한다. 이는 또한 양전하 유기 첨가물 및 수소 도너/억셉터의 조합이 DNA-양전하 유기 첨가물의 높은 친화도를 갖는- 및 높지만 DNA 보다는 낮은 양전하 유기 첨가물에 대한 친화도를 갖는 생성물 사이의 미세한 구별을 구현할 수 있음을 나타낸다. 이 실험은 또한, 본 기술의 가치에 대한 중요한 관점 및 예들을 제공한다. PEI-단독 처리 상의 DNA 피크는 대략 미처리 샘플 상에서의 DNA 피크의 2배였다. 이는 최초 샘플 내의 DNA의 대략 반이 단백질을 갖는 헤테로-응집체에 함유되었음을 나타내며, 이들의 분리의 중요성을 부각시킨다. 상기의 예는 또한 결정-클리어한 생물학적 샘플을 획득하는 비통상적인 바람직한 결과를 고도로 획득할 수 있는 본 발명의 능력을 부각시킨다. 많은 방법들이 세포 배양 상청액의 정제를 위해 존재하나, 대부분 샘플내의 탁한 특성을 남기며, 이는 후속 정제 방법을 방해하는 것으로 간주된다. 본 방법에 의해 처리된 놀라운 용액의 명확성은 특히 비용해된 알란토인과 결합되어 수행될 때 얻어지며, 다른 방법들에 의해 현저히 구별된다.
실험예 5
바람직한 추가 시퀀스의 결정. 실험예 4에서 설명된 2개의 항체 표본들이 0.025% PEI-1300 및 포화 알란토인으로 처리된 실험이 수행되었다. PEI가 일 실험에서 처음에 추가되었고, 다른 실험에서 알란토인이 처음에 추가되었다. 샘플들은 여과되고 상술한 바와 같은 히드록시아파타이트 칼럼에 적용되었다. 알란토인-최초 처리로부터의 IgM 피크는 PEI-최초 처리로부터의 피크보다 대략 2배 높았다. 이러한 결과는 생성물 회수를 최대화하는 첨가의 순서의 중요성을 부각시키며, 또한 단백질과 양전하 유기 첨가물의 상호작용을 조절하는 알란토인의 능력을 강조한다.
실험예 6
배양(incubation)의 결정. 알란토인이 PEI 추가 전에 1 내지 30분의 인터벌로 배양되며, 이어서 1-30분의 PEI 추가가 여과 전에 수행되는 실험이 진행되었다. 280/254 비율 또는 히드록시아파타이트 칼럼 상의 IgM 피크의 크기의 뚜렷한 경향은 없었다. 이는 DNA 분리 및 제거의 동역학이 매우 빠름을 제시한다.
실험예 7
모놀리스 상의 입체 배체 크로마토그래피에 의한 IgM의 정제. IgM-B07 세포 배양 상청액 샘플이 상술한 바와 같이 1% PEI-1200 및 포화 알란토인으로 처리되었다. 8 mL 히드록실 모놀리스(BIA Separations)는 50 mM Hepes, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10% 폴리에틸렌 글리콜-6000, pH 7.0으로 평형되었다. 처리된 IgM 상청액은 10% PEG에 적용되었다; 칼럼은 평형 버퍼로 세척되고, 3.75 CV 선형 그래디언트로 50 mM Hepes, 100 mM NaCl, pH 7.0에서 용리되었다. 미처리된 샘플은 참조를 위해 크로마토그래피 처리되었다. 미처리된 참조 샘플은 넓은, 꼬리가 긴, 흐린, 불명확한 피크로 용리되었다. 처리된 샘플은 샤프하고, 대칭적으로, 농축된, 광학적으로 클리어한 피크로 용리되었으며, 응집체의 트레일링(trailing) 피크로부터 잘 구별되었다. 분석 SEC는 처리된 샘플로부터의 IgM은 단지 단일 크로마토그래피 단계 후에 응집체-프리한 95% 이상의 순도를 가짐을 보여주었다.
실험예 8
효소적 소화된 DNA의 DNA 제거. 단일클로날 IgM 클론 A4가 벤조나아제(benzonase)로 먼저 처리되어 DNA를 절편들로 소화시켰다. 이어서, 포화 알란토인 및 0.01% PEI-1300으로 처리되어 헤테로-응집체를 분리시켰다. 침전물은 제거되고, 샘플은 입체 배제 크로마토그래피에 의해 분별되었다. DNA는 용리된 항체로부터 실질적으로 제거되었고, 이는 작은 DNA 절편들의 제거를 위한 본 발명의 효용성이 대형 DNA 제거의 효용성과 실질적으로 동일하게 나타남을 나타낸다.
실험예 9
실험예 4의 형태가 PEI-1300 대신 에타크리딘으로 반복되었다. 에타크리딘은 유사한 결과를 보여주며, 다만 더 좁은 동적 범위를 제공하는 것으로 나타났다. 항체 회수는 0.00625%까지 에타크리딘 농도에 반비례하였다. DNA 분리의 효율은 0.001% 내지 0.00625%의 에타크리딘 농도에 비례한다.
실험예 10
클로르헥시딘으로 IgM-DNA 복합체의 분리. IgM 85을 함유하는 여과된 세포 배양 상청액이 강한 음이온 교환 다공성 입자 수지(EMD TMAE)에 적용되어, 선형 그래디언트 내에서 1 M NaCl (pH 7.0)로 분별되었다. 알려진 높은 DNA 함량에도 불구하고, DNA 피크는 총 DNA의 약 2%를 나타냈다. 254 nm에서 흡수가 증가되며, IgM 및 DNA 사이에서 용리되는 피크는 DNA의 나머지가 헤테로-응집체에 존재함을 보여준다. 포화 알란토인으로 처리된 IgM 85 샘플은 작지만 헤테로-응집체의 양의 명확한 감소를 보여주었으며, 이에 상응하는 DNA 피크의 증가를 보여주었다. 클로르헥시딘은 알라토인-포화된 샘플에 0.001 내지 1%의 범위의 레벨로 첨가되고, 처리된 샘플은 음이온 교환기에 적용되었다, 헤테로-응집체들은 분리되고, 0.01-1.0% 클로르헥시딘 범위에서 DNA 제거되었다. 복합체들은 낮은 농도에서 단지 부분적으로 분리되고, DNA 감소는 최소였다. 심각한 항체 손실이 1% 및 0.5% 클로르헥시딘에서 관찰되었다. 이러한 결과는 백색 클로르헥시딘이 포화 알란토인의 존재 하에 헤테로-응집체 분리 및 DNA 제거에 효과적임을 보여주며, 이의 유효 범위는 PEI-1300 또는 에타크리딘 보다 높고 좁았다. 이러한 예는 또한, IgM 캡쳐 방법으로서 히드록시아파타이트의 가능성을 보여주는 실험예 4와 비교하여, 먼저 제거된 DNA를 갖는 본 발명에 있어서의 IgM 캡쳐 방법으로서 음이온 교환 크로마토그래피의 가능성을 설명한다.
실험예 11
상기의 실험예들에서 나타나듯이, 예를 들면, 일련의 PEI, 에타크리딘, 클로르헥시딘과 같은 양전하 유기 첨가물의 소수성을 증가시키는 것은 유용한 동적 범위를 좁히며, 관심 대상 단백질의 손실을 증가시킨다. 0.02% 에타크리딘 또는 0.02% PEI-1300과 조합된 1% 요산 및 1% 알란토인 사이의 실험적 비교가 수행되었다. IgM 회수는 두 우레이드들에, 및 알란토인을 갖는 에타크리딘에서 동일하였으나, 에타크리딘과의 요산 조합에서 94%로 감소하였다. 이러한 결과는 비용해 용액 내의 포화 성분 알란토인(약 36 Mm)이 항체와 에타크리딘의 상호작용을 조절함을 나타내는 것으로 해석되었다. 응집체의 분리는 모든 처리들에서 동일하였다. SEC는 또한 모든 실험들에서, 항체 피크의 크기가 명확하게 처리 결과로서 감소되었다. 이는 미소하게 관찰되었으나 용리 시간에 있어서 명확하게 증가하였고, 프로파일 오버레잉(overlaying)에 의해 명확히 나타났다. 254/280 비율의 유사한 감소는 사이즈의 변화가 항체에 결합된 254-지배적 오염물의 제거에 기인한 것으로 나타났다.
실험예 12
세포-함유 배양 브로스(broth)에의 알란토인 및 에타크리딘 첨가. 1.5L의 하이브리도마 세포 브로스가 쉐이크 플라스크로부터 수득되었다. 전도도는 25mS/cm로 조절되고, 알란토인 및 에타크리딘은 브로스에 각각 1%(w/v) 및 0.02%(w/v)로 첨ㄱ가되고 20분 동안 상온에서 잘 혼합되었다. 상기 혼합물은 원심분이에 의해 정제되고 분석 SEC에 의해 분석되었다. 이러한 초기 단계에서, 헤테로-응집체는 발견되지 않았으며, IgM 피크의 254/280 피크 높이 비율은 1:2였고, 이는 IgM이 DNA 오염물로부터 거의 프리함을 나타낸다. 이러한 예는 DNA 제거 및 응집체 분리를 세포 제거와 통합할 수 없음을 나타낸다.
실험예 13
모노클로날 IgM-함유 세포-배양 상청액 내의 DNA-항체 헤테로-응집체 레벨의 감소를 위한 작용 농도의 결정. 히드록시아파타이트 크로마토그래피는 모노클로날 IgM 클론 85가 DNA와 과하게 결합됨을 보여주었다. 이는 280 nm에서의 UV 흡수와 대략 동등한 254 nm에서의 IgM 피크의 UV 흡수에 의해 밝혀졌다. DNA-프리 IgM은 약 2:1의 280/254 비율을 갖는다. 모노클로날 IgM-함유 정제된 세포 배양 상청액의 10 mL의 샘플들이 양전하 유기 첨가물 PEI-1300 및 1 M 우레아의 다양한 조합들과 결합된 실험을 세팅하여 IgM으로부터 DNA 분리를 위한 가장 효과적인 조합을 결정하였다. 샘플들은 오염물의 존재로 초기에 갈색을 나타냈으며, 다소 탁하였으며, 이는 침전물의 존재를 나타냈다. PEI의 스톡 용액이 50% PEI-1300 (Sigma)을 아세트산으로 pH 7.0으로 적정하고 물을 첨가하여 최종 PEI 농도 10%로 제조되었다. PEI가 샘플에 첨가되어 2%, 1%, 0.5%, 0.025%, 0.0125%, 및 0.00625%의 최종 농도를 생성하였다. 건조 우레아가 1 M의 농도로 첨가되었다. PEI가 없으나 1 M 우레아를 포함하는 실험 통제가 제조되었다. 우레아는 부존재하고 0.05% PEI를 갖는 또 다른 통제가 제조되었다. 후자의 통제에서 흐릿함은 변화되지 않았다. 각 샘플은 0.22 μm 멤브레인으로 여과되었다. 각 샘플은 50 mM Hepes, pH 7.0로 평형된 히드록시아파타이트(CHT type II, 40 μm, 1 mL, 5x50 mm, 1 mL/min) 칼럼에 적용되고; 50 mM Hepes, 2 M NaCl, pH 7.0로 세척되고; 초기 조건으로 다시 평형되고; 10 칼럼 부피(CV) 선형 그래디언트로 250mM 소듐 포스페이트, pH 7.0으로 용리되고; 이어서 500 mM 포스페이트, pH 7.0으로 세정되었다. PEI-단독 샘플은 헤테로-응집체의 부분 분리를 보여주었으나, 세정 단계에서의 매우 큰 DNA 피크는 헤테로-응집체의 분리가 실질적이 아님을 보여주었다. 우레아-단독 샘플은 헤테로-응집체의 더 약한 감소를 보여주었고 세정 피크에서 더 작은 DNA를 나타냈다. 모든 PEI/우레아 처리된 샘플들로부터 용리된 IgM은 2.0 이상의 280/254 비율을 제공하였으며, 이는 세정단게에서 무시할 수 있는 양의 DNA 용리만 보여주면서 실질적인 완전한 DNA 분리가 수행되었음을 나타낸다. 1% PEI에서 수집된 히드록시아파타이트-분별 IgM은 분석 SEC 칼럽에 적용되었다. IgM은 0.2% 보다 작은 HMW 응집체 및 뚜렷한 헤테로-응집체 없이 95% 이상의 순도를 갖는 것으로 평가되었다. 회수는 98-99%로 나타났다. 이러한 예는 본 발명의 피드 내에 높은 DNA 레벨의 존재에 의해 일반적으로 효과가 없는 방법에 의해 캡쳐되는 유효한 생성물을 가능케하는 본 발명의 능력을 설명한다. 이러한 결과는, 미처리 샘플들과 비교하여, 최초 샘플 내의 대부분의 DNA가 항체 및 다른 단백질들과 헤테로-응집체에 관여한다는 중요한 포인트를 부각시킨다.
실험예 14
바람직한 추가 시퀀스의 결정. 실험예 14에서 설명된 2개의 항체 표본들이 0.025% PEI-1300 및 1 M 우레아로 처리된 실험이 진행되었다. PEI가 일 실험에서 처음에 추가되었고, 다른 실험에서 우레아가 처음에 추가되었다. 샘플들은 여과되고 상술한 바와 같은 히드록시아파타이트 칼럼에 적용되었다. 우레아-최초 처리로부터의 IgM 피크는 PEI-최초 처리로부터의 피크보다 대략 2배 높았다. 이러한 결과는 생성물 회수를 최대화하는 첨가의 순서의 중요성을 부각시키며, 또한 단백질과 양전하 유기 첨가물의 상호작용을 조절하는 우레아의 능력을 강조한다.
실험예 15
모놀리스 상의 입체 배체 크로마토그래피에 의한 분리된 IgM의 정제. IgM-B07 세포 배양 상청액 샘플이 1% PEI-1200 및 10% 프로필렌 글리콜로 처리되었다. 8 mL 히드록실 모놀리스(BIA Separations)가 50 mM Hepes, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10% 폴리에틸렌 글리콜-6000, pH 7.0으로 평형되었다. 처리된 IgM 상청액은 10% PEG에 적용되었다; 칼럼은 평형 버퍼로 세척되고, 이어서 3.75 CV 선형 그래디언트에서 50 mM Hepes, 100 mM NaCl, pH 7.0으로 용리되었다. 미처리된 샘플은 이어서 참조를 위해 크로마토그래피 처리되었다, 미처리된 참조 샘플은 넓은, 희석된, 탁한 피크로 용리되었다. 처리된 샘플은, 샤프하고, 대칭의, 농축된, 광학적으로 클리어한 피크로 용리되었다. 분석 SEC는 처리된 샘플로부터의 IgM이 0.1% 미만의 HMW 응집체 및 뚜렷한 헤테로-응집체 없이 95% 이상의 순도임을 보여주었다.
실험예 16
클로르헥시딘으로 IgM 헤테로-응집체의 분리. IgM 85을 함유하는 여과된 세포 배양 상청액이 강한 음이온 교환 다공성 입자 수지(EMD TMAE)에 적용되어, 선형 그래디언트 내에서 1 M NaCl (pH 7.0)로 분별되었다. 알려진 높은 DNA 함량에도 불구하고, DNA 피크는 총 DNA의 약 2%를 나타냈다. 254 nm에서 흡수가 증가되며, IgM 및 DNA 사이에서 용리되는 피크는 DNA의 나머지가 헤테로-응집체에 존재함을 보여준다. 1 M 우레아(클로르헥시딘 없이)로 처리된 IgM 85 샘플은 작지만 헤테로-응집체의 양의 명확한 감소를 보여주었으며, 이에 상응하는 DNA 피크의 증가를 보여주었다. 클로르헥시딘은 1 M 우레아 샘플에 0.001 내지 1%의 범위의 레벨로 첨가되고, 처리된 샘플은 음이온 교환기에 적용되었다. 헤테로-응집체들은 분리되고, 0.01-1.0% 클로르헥시딘 범위에서 DNA 제거되었다. 헤테로-응집체들은 낮은 농도에서 단지 부분적으로 분리되고, DNA 감소는 최소였다. 심각한 항체 손실이 1% 및 0.5% 클로르헥시딘에서 관찰되었다. 이러한 결과는 백색 클로르헥시딘이 HMW 응집체 및 헤테로-응집체의 분리에 효과적임을 보여주며, 이의 유효 범위는 PEI-1300 또는 에타크리딘 보다 높고 좁았다. 이러한 예는 또한, IgM 캡쳐 방법으로서 히드록시아파타이트의 가능성을 보여주는 실험예 14와 비교하여, 먼저 제거된 DNA를 갖는 본 발명에 있어서의 IgM 캡쳐 방법으로서 음이온 교환 크로마토그래피의 가능성을 설명한다.
실험예
17
바이러스 및 DNA 감소. 뮤린 루케미아 바이러스(murine leukemia virus, MuLV), 쥐의 미세 바이러스(minute virus of mice, MVM) 및 Chinese hamster ovary (CHO) 세포들의 살아있는 새포들을 함유하는 세포 배양물이 1% 알란토인 및 0.025% 에타크리딘으로 처리되었다. 모든 실험들은 생리학적 조건에서 수행되었다. MuLV는 1.6 로그(log), MVM은 3.1 로그로 감소하였다. CHO 배양물 내의 DNA는 2.1 로그로 감소하였다. 알란토인의 부존재하에 0.025% 에타크리딘으로 처리된 일련의 샘플들은 덜 효과적이었으며, MuLV를 1.3 로그, MVM을 1.4 로그, 및 DNA를 1.6 로그로 감소시켰다.
당해 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자라면, 본 실험예들에 기재된 바와 같은 실험들의 결과를 특정 요구조건을 만족하기 위한 부피에 대해 스케일 업 또는 스케일 다운하는 방법을 이해할 것이다.
인용되는 모든 참조문헌들은 참조로서 전체로 병합되며, 각 개별 공개 문헌 또는 특허 또는 특허 출원들은 특정적으로, 개별적으로 참조로 전체로서 병합되는 것으로 지시된다. 참조로서 병합된 공개문헌, 특허 또는 특허출원이 본 출원에 포함된 개시사항과 모순되는 경우, 본 출원이 모순된 사항을 대체하는 것으로 의도된다.
성분들의 양, 크로마토그래피 조건들, 명세서 및 청구항에 사용된 모든 숫자들은 용어 "약"에 의해 조절되는 것으로 이해된다. 따라서, 반대로 기재되지 않는 한, 본 출원에 제시된 수치 변수들은 대략적으로 본 발명에 의해 획득되는 원하는 성능에 의존하며 변화할 수 있다.
본 발명의 다양한 변형 및 조절예들이 당업자에게 명확하게 이해되는 바와 같이 이의 사상 및 범위에서 벗어나지 않고 수행될 수 있다. 본 출원에 설명된 특정 실시예들은 예로서 제시된 것이며, 제한적인 것으로 해석되지 않는다. 명세서 및 실시예들은 단지 예시적인 것으로 간주되며, 본 발명의 진정한 범위 및 사상은 하기의 청구항들에 의해 나타나는 것으로 의도된다.
Claims (69)
- 샘플의 응집체 함량을 감소시키는 방법으로서, 상기 샘플은 원하는 단백질을 포함하고,
상기 방법은 양전하 유기 첨가물 및 알란토인을 상기 샘플과 접촉시켜, 상기 샘플이 알란토인으로 과포화되는 단계를 포함하는 방법. - 샘플의 응집체 함량을 감소시키는 방법으로서, 상기 샘플은 원하는 단백질을 포함하며, 15 mS/cm 내지 45 mS/cm의 전도도 값을 가지고,
상기 방법은 양전하 유기 첨가물을 상기 샘플에 첨가하는 단계를 포함하며, 상기 양전하 유기 첨가물의 농도는 0.1% 이하인 방법. - 샘플의 응집체 함량을 감소시키는 방법으로서, 상기 샘플은 원하는 단백질을 포함하며, 5 mS/cm 내지 45 mS/cm의 전도도 값을 가지고,
상기 방법은 유기 첨가물의 존재 하에 양전하 유기 첨가물을 상기 샘플에 첨가하는 단계를 포함하고, 상기 유기 첨가물은 우레이드, 유기 용매 또는 계면 활성제로 구성된 그룹에서 선택되며, 상기 양전하 유기 첨가물은 0.1% 이하의 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법. - 샘플의 응집체 양을 감소시키는 방법으로서, 상기 샘플은 원하는 단백질 및 응집체를 포함하고,
상기 방법은 상기 샘플을 에타크리딘(ethacridine), 클로르헥시딘(chlorhexidine), 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine), 메틸렌 블루(methylene blue), 및 벤잘코늄 클로라이드(benzalkonium chloride)로 구성된 그룹에서 선택된 양전하 유기 첨가물과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양전하 유기 첨가물은 에타크리딘(ethacridine) 또는 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 알란토인은 상기 양전하 유기 첨가물 전에 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 원하는 단백질은 항체, Factor VIII, 성장 호르몬 및 재조합 단백질로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양전하 유기 첨가물은 1% (중량/부피) 이하의 레벨로 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양전하 유기 첨가물은 0.1% (중량/부피) 이하의 레벨로 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양전하 유기 첨가물은 0.01% (중량/부피) 이하의 레벨로 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양전하 유기 첨가물은 0.001% (중량/부피) 이하의 레벨로 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양전하 유기 첨가물은 상기 샘플 내에서 0.02% 내지 0.03% 범위의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플 내에 제2 양전하 유기 첨가물이 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제13항 있어서, 상기 샘플 내에서 상기 양전하 유기 첨가물의 총 농도는 1% (중량/부피) 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 샘플 내에서 상기 양전하 유기 첨가물의 총 농도는 0.1% (중량/부피) 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 샘플 내에서 상기 양전하 유기 첨가물의 총 농도는 0.01% (중량/부피) 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 샘플 내에서 상기 양전하 유기 첨가물의 총 농도는 0.001% (중량/부피) 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 알란토인은 0.56% (중량/부피) 내지 1% (중량/부피) 범위의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 알란토인은 1% (중량/부피) 내지 2% (중량/부피) 범위의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 알란토인은 2% (중량/부피) 내지 5% (중량/부피) 범위의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 알란토인은 5% (중량/부피) 내지 10% (중량/부피) 범위의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 알란토인은 10% (중량/부피) 내지 15% (중량/부피) 범위의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 알란토인은 상기 양전하 유기 첨가물의 첨가 전에 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플의 전도도는 25mS/cm 내지 45 mS/cm 의 값으로 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플의 전도도는 45 mS/cm 의 값으로 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제24항에 있어서, 상기 샘플의 전도도는 상기 양전하 유기 첨가물의 첨가 전에 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플 내에 유기 용매가 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제27항에 있어서, 상기 유기 용매는 에탄올, 이소프로판올, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 트리(n-부틸)포스페이트 및 글리세롤로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제28항에 있어서, 상기 유기 용매는 상기 샘플 내에서 0.01% (중량/부피) 내지 20% (중량/부피) 범위의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 유기 용매는 상기 샘플 내에서 0.01 (중량/부피) 내지 1% (중량/부피) 범위의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 유기 용매는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 에탄올, 이소프로판올 또는 트리(n-부틸)포스페이트를 포함하고, 상기 샘플 내에서 1% (중량/부피) 내지 5% (중량/부피) 범위의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 유기 용매는 상기 샘플 내에서 5% (중량/부피) 내지 10% (중량/부피) 범위의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 유기 용매는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 또는 글리세롤을 포함하고, 상기 샘플 내에서 10% (중량/부피) 내지 20% (중량/부피) 범위의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제28항에 있어서, 상기 유기 용매는 에탄올, 이소프로판올 및 트리(n-부틸)포스페이트로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제34항에 있어서, 상기 유기 용매의 농도는 1% (중량/부피) 미만인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제34항에 있어서, 상기 유기 용매의 농도는 0.1% (중량/부피) 미만인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제34항에 있어서, 상기 유기 용매의 농도는 0.01% (중량/부피) 미만인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플 내에 가용성(soluble) 우레이드가 존재하고, 상기 가용성 우레이드는 우레아인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제38항에 있어서, 상기 가용성 우레이드는 0.5 M 내지 1 M 범위의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제38항에 있어서, 상기 가용성 우레이드는 1 M 내지 2 M 범위의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제38항에 있어서, 상기 가용성 우레이드는 2 M 내지 4 M 범위의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제38항에 있어서, 상기 가용성 우레이드는 4 M 내지 8 M 범위의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플 내에 계면활성제가 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제43항에 있어서, 상기 계면활성제는 비이온성 계면활성제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제44항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 Tween 또는 Triton을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제43항에 있어서, 상기 계면활성제는 양쪽이온성(zwitterionic) 계면활성제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제46항에 있어서, 상기 양쪽이온성 계면활성제는 CHAPS, CHAPSO 및 옥타글루코시드(octaglucoside)로 구성된 그룹에서 선택되는 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제43항에 있어서, 상기 계면활성제는 1% 미만의 0이 아닌 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제43항에 있어서, 상기 계면활성제는 0.1% 미만의 0이 아닌 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제43항에 있어서, 상기 계면활성제는 0.01% 미만의 0이 아닌 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플 내에 킬레이트제가 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제51항에 있어서, 상기 킬레이트제는 양으로 하전된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제52항에 있어서, 상기 양으로 하전된 킬레이트제는 트리스(2-아미노에틸)아민(tris(2-aminoethyl)amine) 또는 디페록사민(deferoxamine)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제51항에 있어서, 상기 킬레이트제는 100 mM 미만의 0이 아닌 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제54항에 있어서, 상기 킬레이트제는 50 mM 미만의 0이 아닌 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제55항에 있어서, 상기 킬레이트제는 20 mM 미만의 0이 아닌 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제56항에 있어서, 상기 킬레이트제는 10 mM 미만의 0이 아닌 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제57항에 있어서, 상기 킬레이트제는 5 mM 미만의 0이 아닌 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 유기 용매, (b) 유기 폴리머, (c) 가용성 우레이드, (d) 계면 활성제, (e) 킬레이트제, 및 (f) 염 중에서 적어도 2 이상이 존재하는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 잔류하는 오염물들로부터 상기 원하는 단백질을 분별하는 후속 공정 단계 이전에, 적어도 하나의 양전하 유기 첨가물을 제거하기 위하여, 상기 샘플을 고체와 접촉시키는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 방법을 실행하는 키트(kit).
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Non-Patent Citations (4)
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| Protein Expr Purif.,19(2):219-26(2000.7.) |
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