KR102062311B1 - 흰들버섯 추출물 제조방법, 이를 이용한 추출물 및 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

피부 미백, 주름 및 피부 탄력 개선 효과를 갖는, 흰들버섯 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

흰들버섯 추출물 제조방법, 이를 이용한 추출물 및 화장료 조성물{Method for Producing Agaricus Blazei Extract, Extract and Cosmetic Composition Using the Same}

본 발명은 흰들버섯 추출물을 제조하는 방법, 이를 이용한 흰들버섯 추출물, 및 흰들버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

노화는 크게 자연노화 혹은 내인성 노화와 외적 노화로 구분되며 자연노화는 유전적 원인에 의한 것이므로 조절이 어려우나 외적 노화는 환경적 원인에 의한 것이므로 인위적인 조절이 용이하다. 따라서 외적 노화를 방지하기 위한 연구가 지속되어 왔으며, 특히 장기간 자외선 노출에 의해 진행되는 외인성 광노화에 따른 주름 형성 방지에 대한 연구가 주목되고 있다(Gilchrest B.A., J. Am. Acad. Dermatol., 1989:21:610-613). 상기 외인성 피부노화인 광노화의 임상적 특징은 피부가 거칠고 탄력성이 없어지며, 불규칙한 색소 침착이 발생되고, 깊은 주름살이 증가되는 것이다.

현재 개발되고 있는 피부 주름개선 또는 항노화를 위한 유효성분들은 일부 화장품 원료로 사용할 수 없거나 매우 불안정하고, 피부로의 전달이 용이하지 않아 특별한 안정화 시스템과 전달체계가 필요하며, 피부 주름의 개선 효과가 가시적이지 않는 등의 문제점이 있어서 최근 레티노이드(retinoid)를 함유한 피부보호제로 관심이 점차 집중되고 있다. 상기 레티노이드는 일광으로 축적된 결과인 주름살, 피부의 두꺼워짐, 처짐, 탄력 감소 등의 광노화 현상을 해결하는 수단으로 이용되고 있다. 그러나 레티노이드는 매우 불안정한 화합물로 자외선, 수분, 열, 산소에 민감하여 쉽게 화학적인 변화를 일으키는 문제점이 있어 이를 해결하기 위한 천연물 유래의 유효성분 개발에 연구가 집중되고 있는 실정이다.

본 발명자들은 피부 상태를 개선시킬 수 있는 천연물 유래의 물질을 찾기 위해 연구한 결과, 흰들버섯 추출물이 엘라스타제(elastase), 티로시나제(tyrosinase) 및 콜라겐 분해효소(collagenase)의 활성을 억제하는 효능이 있는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

1. 대한민국 등록특허 제10-0535875호

본 발명의 일 목적은 주름 개선, 피부 미백 또는 피부 탄력 개선 효과를 갖는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 양상은 흰들버섯(Agaricus blazei) 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

흰들버섯은 담자균류 주름버섯목 주름버섯과에 속하며, 아가리쿠스(Agaricus) 버섯, 신령버섯이라고도 불리운다. 단백질, 지방, 섬유질, 비타민, 무기염류 및 핵산 등 각종 영양소가 풍부하고, 암을 비롯한 각종 성인병에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 흰들버섯 추출물은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 제조될 수 있다. 구체적으로 흰들버섯을 세척, 건조 및 분쇄한 후, 통상적인 온도와 압력의 조건으로 통상적인 용매를 사용하여 흰들버섯 추출물을 제조할 수 있다.

상기 용매는 증류수, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 에틸아세테이트, 클로로포름, 디에틸에테르, 디클로로메탄, 헥산, 아세톤 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 증류수인 것이 바람직하다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 흰들버섯(Agaricus blazei) 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물로서,

상기 흰들버섯 추출물은,

흰들버섯을 세척하고 건조하는 단계;

추출탱크에 건조된 흰들버섯을 투입하고, 흰들버섯의 총 중량 대비 8 내지 10배 중량의 정제수를 투입한 후, 110 내지 125℃에서 5 내지 9시간 동안 추출하고, 추출탱크로부터 제 1 추출물을 회수하는 단계;

제 1 추출물이 회수된 추출탱크에 잔존하는 흰들버섯의 총 중량 대비 8배 내지 10배 중량의 정제수를 추가적으로 투입한 후, 110 내지 125℃에서 5 내지 9시간 동안 추출하고, 추출탱크로부터 제 2 추출물을 회수하는 단계; 및

회수된 상기 제 1 추출물 및 상기 제 2 추출물을 혼합하고 필터로 여과하는 단계를 포함하는 추출방법에 의하여 수득된 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 흰들버섯 추출물은 상기 필터로 여과하는 단계 후에 여과된 추출물을 진공 농축하는 단계를 추가적으로 수행하는 추출방법에 의하여 수득된 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 진공 농축하는 단계는 5 브릭스(brix) 이상으로 농축하는 것일 수 있다.

한편, 상기 흰들버섯 추출물은 상술한 용매 추출법에 의한 추출물뿐만 아니라, 통상적인 정제 과정을 거친 추출물도 포함한다. 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시한 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 은피 추출물에 포함될 수 있다. 또한, 상기 흰들버섯 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다. 구체적으로, 상기 흰들버섯 추출물은 살균 및 분무건조 과정을 거쳐서 분말 형태로 제조될 수 있으며, 70 내지 90℃의 온도에서 10 내지 40분 동안 살균한 후, 분무건조기를 이용하여 분말 형태로 제조될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 제 1 추출물 및 제 2 추출물은 110 내지 125℃, 115 내지 125℃, 115 내지 121℃, 118 내지 121℃, 또는 120 내지 121℃에서 추출이 수행되어 수득되는 것일 수 있고, 110℃ 미만의 온도에서 추출하는 경우에는 주름 개선, 피부 미백, 피부 탄력 증진, 피부 자극 완화, 또는 보습 효과를 갖는 활성 성분이 충분히 추출되지 않을 수 있고, 125℃ 초과된 온도에서 추출하는 경우에는 상기 활성 성분이 변성될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 제 1 추출물 및 제 2 추출물은 5 내지 9시간, 6 내지 9시간, 5 내지 8시간, 6 내지 8시간, 7 내지 8시간, 또는 6 내지 7시간 동안 추출이 수행되어 수득되는 것일 수 있고, 5시간 미만의 시간 동안 추출을 수행하는 경우 주름 개선, 피부 미백, 피부 탄력 증진, 피부 자극 완화, 또는 보습 효과를 갖는 활성 성분이 충분히 추출되지 않을 수 있고, 9시간을 초과하여 추출을 수행하는 경우 미리 추출된 성분이 변성되어 본원발명의 일 구체예에 따른 주름 개선, 피부 미백, 피부 탄력 증진, 피부 자극 완화, 또는 보습 효과가 떨어질 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 제 1 추출물 및 제 2 추출물은 고압의 조건에서 추출이 수행되어 수득되는 것일 수 있고, 추출이 수행되는 추출탱크 내의 기압은 1 내지 10atm, 1 내지 8atm, 1 내지 6atm, 1 내지 5atm, 1.1 내지 5atm, 1.1 내지 4atm, 1.1 내지 3atm, 1.1 내지 2.1atm, 1.1 내지 1.5atm, 1.1 내지 1.2atm, 또는 1.2 내지 1.5atm일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 필터는 0.5 내지 2.0㎛, 0.5 내지 1.5㎛, 0.5 내지 1.0㎛, 또는 1㎛의 공극 크기를 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 화장료 조성물은 엘라스타제, 티로시나제 및 콜라겐 분해효소로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소의 활성을 억제하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 화장료 조성물은 주름 개선, 피부 미백, 피부 탄력 증진, 피부 자극 완화, 및 보습 효과로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 효과를 갖는 것일 수 있다.

본 발명에서, "미백"은 피부를 하얗게 하는 것을 의미하고, 멜라닌의 합성을 저해하여 멜라닌의 피부 침착을 억제하거나 방지하는 모든 작용을 의미한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 조성물은 티로시나아제(tyrosinase)의 활성을 저해하는 것일 수 있다.

본 발명에서 “티로시나아제”는 활성 부위에 한 쌍의 구리 이온을 함유하고 있는 금속 함유 단백질로서, 멜라닌의 생성 경로에서 L-티로신이 하이드록실화 반응을 거쳐 3,4-디하이드록시 페닐알라닌(L-DOPA)으로 전환되고, 이것이 다시 페닐알라닌-3,4-퀴논(도파퀴논)으로 산화된 다음, 도파크롬(dopachrome), 인돌-5,6-퀴논 등의 여러 중간체를 거쳐 멜라닌으로 합성되는 단계에 관여하는 효소를 의미한다.

본 발명의 일 구체예에 따른 흰들버섯 추출물이 농도 의존적으로 티로시나아제 저해 활성을 갖는 바, 본 발명의 일 구체예에 따른 조성물은 미백 활성을 가질 수 있다.

본 발명에서, "엘라스타제"는 피부 탄력에 관여하는 엘라스틴의 가수분해 반응을 촉매하는 역할을 갖는 효소를 의미한다.

본 발명의 일 구체예에서, 흰들버섯 추출물이 농도 의존적으로 엘라스타제 저해 활성을 갖는 바, 본 발명의 일 구체예에 따른 조성물은 주름 개선 활성을 가질 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따른 조성물은 콜라겐 섬유(collagen fiber) 손상을 억제하는 것일 수 있다.

콜라겐 섬유는 콜라겐으로 이루어진 섬유조직으로, 뼈, 연골, 피부, 힘줄 등의 결합조직에 존재한다. 피부가 자외선에 노출될 경우, 피부 탄력에 관여하는 콜라겐 섬유가 손상되어 피부의 노화가 진행된다.

본 발명의 일 구체예에서, 흰들버섯 추출물이 농도 의존적으로 콜라겐 섬유 손상 억제 활성을 갖는 바, 본 발명의 일 구체예에 따른 조성물은 주름 개선 활성을 가질 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 유효 성분으로서 상기 흰들버섯 추출물을 포함하는 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 반드시 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 화장료 조성물은 유연 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 밀크로션, 크림, 에센스, 스킨토너, 수중유형(oil-in-water) 에멀젼, 유중수형(water-in-oil) 에멀젼, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 바디오일, 바디로션, 수중유형 메이크업베이스, 유중수형 메이크업베이스, 및 파운데이션으로 이루어진 군 중에서 선태되는 제형일 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따른 흰들버섯 추출물은 엘라스타제, 티로시나제 및 콜라겐 분해효소의 활성을 억제하는 효능이 우수하므로 피부 개선용 화장료 조성물의 유효성분으로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1a 내지 도 1c는 추출 조건의 변화에 따른 흰들버섯 추출물의 추출 수율을 확인한 결과를 보여준다: 도 1a는 추출 온도(60, 80, 90, 100 또는 120℃)에 따른 추출 수율을 나타내고, 도 1b는 추출 시간(6, 8, 10 또는 12시간)에 따른 추출 수율을 나타내며, 도 1c는 에탄올 함량(0, 30, 50 또는 70%)에 따른 추출 수율을 나타낸 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따른 흰들버섯 추출물 제조 과정을 개략적으로 보여준다.
도 3은 흰들버섯 추출물의 엘라스타제 저해 활성을 측정한 결과를 보여준다.
도 4는 흰들버섯 추출물의 콜라겐 분해효소 저해 활성을 측정한 결과를 보여준다.
도 5는 인간 피부 섬유아세포에서 흰들버섯 추출물을 처리시 측정한 MMP-1의 발현양을 나타낸다.
도 6은 인간 피부 섬유아세포에서 흰들버섯 추출물을 처리시 측정한 타입 I 콜라겐의 발현양을 나타낸다.
도 7은 흰들버섯 추출물의 티로시나제 저해 활성을 측정한 결과를 보여준다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 구체예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 흰들버섯 추출물 제조

실시예 1-1. 추출물 제조 조건의 확립

추출 조건에 따른 추출 수율을 확인하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.

흰들버섯(Agaricus blazei)은 김상민아가리쿠스(제주, 대한민국)에서 구입하여 부착물을 제거한 후, 깨끗한 담수로 씻어 실온에서 완전히 건조시켰다. 추출탱크에 건조시킨 흰들버섯을 투입하고, 열수 또는 에탄올을 흰들버섯 무게의 8 내지 10배 무게로 첨가하여 총 2회 추출하였다. 이때 추출 온도는 60℃, 80℃, 90℃, 100℃, 120℃로 변화시키고, 추출 시간은 6시간, 8시간, 10시간, 12시간으로 변화시켰다. 에탄올은 0%(열수), 30%, 50% 및 70%를 이용하였다.

확인 결과, 도 1a에 나타난 바와 같이 추출 온도가 증가할수록 추출 수율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 1b에 나타난 것과 같이 동일한 추출 온도(120℃)에서 추출 시간만을 변화시킨 경우 추출 시간과 관계없이 추출 수율이 오차범위 이내에서 일정한 것을 알 수 있었다.

추출 용매로 에탄올을 이용하여 70℃에서 6시간 동안 2회 추출한 경우, 도 1c에 나타난 것과 같이 에탄올 농도가 높아짐에 따라 추출 수율이 증가하는 것을 알 수 있었다. 120℃에서 8시간 동안 2회 추출한 대조군(열수 추출)의 경우 51.4%의 추출 수율을 나타내었다. 그러나 에탄올 추출물은 열수 추출물과 다르게 고농도로 농축할수록 불용성 성분이 나타나고, 농축하지 않은 경우에도 에탄올이 증발함에 따라 불용성 성분이 침전되는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 식품 또는 화장품의 원료로 에탄올 추출물을 이용하면 최종 제품의 제형에 영향을 미칠 수 있으므로, 이후 실험에는 열수를 추출 용매로 이용하였다.

실시예 1-2. 흰들버섯 추출물 제조

추출탱크에 건조된 흰들버섯을 투입하고, 흰들버섯 무게의 8 내지 10배 무게로 정제수를 첨가하였다. 121℃, 1.2 내지 1.5atm의 조건하에서 6시간 내지 8시간 동안 추출하여 1차 추출물을 회수하고, 추출탱크에 흰들버섯 무게의 8 내지 10배의 정제수를 추가로 첨가하였다. 121℃, 1.2 내지 1.5atm의 조건하에서 6시간 내지 8시간 동안 추출하여 2차 추출물을 회수하였다. 회수한 1차 추출물과 2차 추출물을 혼합하여 1.0㎛의 공극 크기를 갖는 필터(레인보우, 대한민국)로 여과하고, 121℃에서 추출한 열수 추출물(이하, 추출물 1)을 수득하였다.

여과된 추출물은 5 브릭스(brix) 이상으로 진공농축 하였다. 흰들버섯 추출물의 농축액을 회수한 후 성상, 이물, 수분, 일반세균 및 대장균 존재 유무를 검사하여 안전한 것을 확인하였다.

본 구체예에 따른 흰들버섯 추출물의 제조 방법을 순서에 따라 도 2에 도시하였다. 또한, 온도를 60℃(이하, 추출물 2), 80℃(이하, 추출물 3), 90℃(이하, 추출물 4), 100℃(이하, 추출물 5)로 변경한 것을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 흰들버섯 추출물 2 내지 추출물 5를 제조하였다.

실시예 2. 흰들버섯 추출물의 페놀 함량 분석

상기 실시예 1-2에서 제조한 흰들버섯 추출물 1의 페놀 함량을 분석하였다.

121℃에서 추출한 흰들버섯 열수 추출물(추출물 1) 1㎖에 3차 증류수 10㎖를 첨가하고, Folin-Ciocalteu 페놀 용액 2㎖를 첨가하여 혼합하였다. 실온에서 5분 동안 반응시킨 후, 20% 탄산 나트륨(sodium carbonate) 용액 2㎖를 첨가하고, 상온에서 2시간 동안 추가로 반응시켰다. 푸른색의 혼합물이 생성되면 680㎚에서 흡광도를 측정하고, 지표물질인 카테킨(catechin)을 이용하여 정량곡선을 확인하였다. 실험 결과는 흰들버섯 추출물 1g당 함유된 페놀 함량을 ㎎ 단위로 표시하였다.

확인 결과, 표 1에 나타난 바와 같이 흰들버섯 추출물의 총 페놀 함량은 898.96㎎/g인 것을 확인할 수 있었다.

추출물	총 페놀 함량 (㎎/g)
흰들버섯 추출물 1	898.96±42.66

실시예 3. 엘라스타제(elastase) 활성 억제 효과

피부의 진피 조직은 콜라겐과 엘라스틴이 그물망 구조를 형성하고 있으며, 엘라스틴이 엘라스타제에 의하여 분해되면 피부의 그물망 구조가 해체되어 피부에 주름이 생성된다. 따라서 흰들버섯 추출물의 피부 개선 효능을 확인하기 위하여 엘라스타제 활성 저해 여부를 실험하였다.

엘라스타제는 N-숙시닐-Ala-Ala-Ala-p-니트로아닐리드(N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide)를 가수분해하여 p-니트로아닐린(p-nitroaniline)을 생성한다. 0.1M Tris-Cl 완충액(pH 8.0)을 사용하여 2 mM N-숙시닐-Ala-Ala-Ala-p-니트로아닐리드용액 100㎕를 준비하고, 이 용액에 레티놀(양성 대조군) 또는 실시예 1-2에서 제조한 흰들버섯 추출물 1을 100㎍/㎖ 농도로 첨가하여 가볍게 혼합하였다. 여기에 엘라스타제 용액(0.1360unit/㎖, E7885, SIGMA USA) 50㎕를 첨가하여 37℃에서 10분 동안 반응시키고, 410㎚에서 흡광도를 측정하였다(Synergy2, BioTek Inc., USA). 엘라스타제 활성 억제율은 하기 수학식 1에 따라 계산하여, 표 2 및 도 3에 나타내었다.

확인 결과, 하기 표 2 및 도 3에 나타난 바와 같이 양성 대조군인 레티놀에 비해 흰들버섯 추출물 1의 엘라스타제 저해 활성이 약 25% 높은 것을 확인할 수 있었다.

추출물	엘라스타제 저해 활성 (%)
레티놀(양성 대조군)	19.26±1.00
흰들버섯 추출물 1	34.35±0.38

실시예 4. 콜라겐 분해효소(collanase) 저해 활성

콜라겐은 피부, 혈관, 근육 등 모든 결합조직의 주된 단백질로 피부 건조량의 70% 내지 80%를 차지하고 있으며, 콜라겐 분해효소에 의해 분해된다. 본 시험에서는 콜라겐 분해효소의 기질로 사용 되어지는 4-Phenylazobenzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg trifluoroacetate salt를 이용하여 흰들버섯 추출물을 포함하는 시료의 콜라겐 분해효소 억제 활성을 1차적으로 스크리닝하였다.

0.1 M Tris-HCl 완충액(pH 7.5)에 4mM CaCl₂를 첨가하고, 여기에 0.3㎎/㎖ 농도의 4-phenyl azobenzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg(Sigma, USA)를 녹인 기질액 125㎕, 0.2㎎/㎖ 농도의 콜라겐 분해효소(Sigma, USA) 용액 75㎕ 및 실시예 1-2에서 제조한 흰들버섯 추출물 1(100㎍/㎖)을 첨가하여 실온에 20분 동안 방치하였다. 양성 대조군으로는 아스코르브산(100㎍/㎖)을 이용하였다. 이후 6% 시트르산(citric acid) 용액 250㎕을 첨가하여 반응을 정지시키고, 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 1.5㎖을 첨가하여 320㎚에서 흡광도를 측정하였다. 하기 수학식 2에 따라 콜라겐 분해효소 저해 활성(%)을 계산하여 표 3 및 도 4에 나타내었다.

확인 결과, 표 3 및 도 4에 나타난 바와 같이 양성 대조군인 아스코르브산과 비교하여 흰들버섯 추출물의 콜라겐 분해효소 저해 활성이 약 2배 정도 우수한 것을 알 수 있었다.

추출물	콜라겐 분해효소 저해 활성 (%)
아스코르브산(양성 대조군)	5.49±2.14
흰들버섯 추출물 1	11.88±1.69

실시예 5. MMP-1 저해 활성 평가

콜라겐 분해효소인 MMP-1(Matrix metalloproteinase-1)은 피부 콜라겐 쇠퇴에서 가장 영향을 끼치는 효소 중 하나로서, MMP-1을 억제하는 활성 성분은 피부의 노화를 억제할 수 있으며, 피부 주름 개선, 피부 탄력 증진 및 피부 노화방지에 좋은 효과를 가진다. 실시예 4의 콜라겐 분해 효소 억제능은 시험관 내에서 한정된 특정 기질에 관하여 시험을 진행하였으나, 본 실시예 5에서는 인간세포(HDF; Human dermal fibroblast)내에서 생성되는 MMP-1의 저해 활성을 확인함으로써, 세포에 대한 시료의 ADME(Absorption;흡수도, Distribution;분포, Metabolism;대사, Excetion;배설)를 해결하며, 특정 기질에 한정된 것이 아닌 세포내의 콜라겐(Collagen) 합성 관련 인자들의 복합적인 작용을 고려한 심층적인 주름개선 활성을 보고자 하였다.

qRT-PCR을 이용하여 MMP-1의 RNA 발현양을 측정하여, 본원발명의 일 구체예에 따른 흰들버섯 추출물을 포함하는 조성물이 MMP-1의 발현을 억제하여 MMP-1을 저해하는 활성이 있는지 살펴보았다. TRIzol 시약(Life Technologies, CA, USA)을 이용하여 제조사의 설명서에 따라 12시간 내지 24시간 동안 친염증성 사이토카인 TNF-α 10ng/㎖ 및 실시예 1-2에서 제조한 흰들버섯 추출물 1을 50㎍/㎖, 100㎍/㎖ 또는 200㎍/㎖의 농도로 인간　피부　섬유아세포(Human dermal　fibroblast,ATCC 이하 HDF 세포,ATCC)에 처리한 후 24시간 동안 37℃, CO₂ 조건에서 배양한 후 HDF 세포로부터 전체 RNA를 추출하였다.

8㎕의 Molony Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase(M-MLV RT) 5×버퍼, 3㎕의 10 mM dNTPs, 0.45㎕의 40U/㎕ RNase 억제제, 0.3㎕의 200U/㎕ M-MLV RT(Promega, Madison, WI, USA) 및 3.75㎕의 20μM oligo dT(Bioneer, Daejeon, Korea)가 포함된 반응 혼합물 40㎕을 이용하여 전체 RNA 5㎍을 역전사시켜 cDNA를 합성하였다.

10㎕의 RNaseH SYBR Green PCR 마스터 믹스, 2㎕의 프라이머, 7㎕의 PCR-grade water(Takara, Mountain View, CA, USA) 및 1㎕의 cDNA로 구성된 반응 혼합물 2㎕을 Power SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)와 함께 StepOnePlus Real-time PCR 시스템에서 qRT-PCR을 수행하였다. 95℃에서 10분 후에, 95℃에서 15초 및 60℃에서 1분으로 이루어진 사이클을 40회 수행하였다. 매 cycle이 끝난 후 형광강도를 측정하였다. 각 유전자의 Ct(threshold cycle)값을 β-actin의 Ct값으로 표준화한 후, Ct값의 변화량을 비교하여 각 유전자의 발현양을 분석하였다. 실험에 사용한 각 유전자의 프라이머 서열은 표 4에 기재하였다.

프라이머 이름		서열	서열번호
MMP-1	Forward	5'-ATGCTGAAACCCTGAAGGTG-3'	서열번호 1
	Reverse	5'-CTGCTTGACCCTCAGAGACC-3'	서열번호 2
타입 I 콜라겐 (Type I collagen)	Forward	5'-CTTCCTGCGCCTGATGTCCA-3'	서열번호 3
	Reverse	5'-CTCGTGCAGCCATCGACAGT-3'	서열번호 4
β-actin	Forward	5'-GGATTCCTATGTGGGCGACGA-3'	서열번호 5
	Reverse	5'-CGCTCGGTGAGGATCTTCATG-3'	서열번호 6

도 5는 인간 피부 섬유아세포에서 흰들버섯 추출물 1을 처리시 측정한 MMP-1의 RNA 발현양을 나타낸다. 도 5에 나타난 바와 같이, 시료 무처리군에 비하여 TNF-α의 처리시 MMP-1 의 발현이 3배 이상 현저히 증가하였고, 흰들버섯 추출물 1(도 5 상에 AC로 기재됨)을 처리시에는 증가된 MMP-1의 발현이 50% 이하로 감소되는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 6. 콜라겐 발현양 측정

상기 실시예 5-1의 방법으로 타입 Ⅰ 콜라겐의 상대적인 발현양을 qRT-PCR을 이용하여 측정하였다. 사용된 TNF-α 및 실시예 1-2에서 제조된 흰들버섯 추출물 1의 처리 농도도 실시예 5-1과 동일하다. 타입 Ⅰ 콜라겐의 발현양을 측정하기 위하여 사용된 프라이머 서열은 상기 표 4에 기재되어 있다.

도 6은 인간 피부 섬유아세포에서 흰들버섯 추출물 1을 처리시 측정한 타입 I 콜라겐의 RNA 발현양을 나타낸다. 도 6에 나타난 바와 같이, 시료 무처리군에 비하여 TNF-α의 처리시 타입 Ⅰ 콜라겐의 발현이 약 25% 감소하였고, 흰들버섯 추출물 1(도 6 상에 AC로 기재됨)을 처리시에는 타입 1 콜라겐의 발현량이 약 1.5배 이상 증가된 것을 확인할 수 있었다.

실시예 7. 티로시나제(tyrosinase) 저해 활성

0.1M 포타슘 포스페이트 완충액(pH 6.8) 1.0㎖, 0.3㎎/㎖ L-티로신 수용액 1.0㎖ 및 1250unit/㎖ 머쉬룸 티로시나제 0.1㎖(sigma, USA)를 혼합하였다. 실시예 1-2에서 제조한 흰들버섯 추출물 1을 100㎍/㎖, 200㎍/㎖, 또는 400㎍/㎖ 농도로 첨가하여 37℃에서 10분 동안 반응시켰다. 이후 반응용액의 흡광도를 480㎚(JASCO V-550, japan)에서 측정하고, 하기 수학식 3에 따라 티로시나제 저해 활성을 계산하여 이를 표 5 및 도 7에 나타내었다. 양성 대조군으로는 50㎍/㎖ 농도의 코지산(kojic acid, 누룩산)을 이용하였다.

표 5 및 도 7에 나타난 바와 같이 흰들버섯 추출물이 농도 의존적으로 티로시나제의 활성을 억제하는 것을 알 수 있었다. 흰들버섯 추출물 200㎍/㎖, 또는 400㎍/㎖를 첨가한 경우 양성 대조군인 코지산보다 높은 티로시나제 억제 활성을 보였다. 본 발명의 일 구체예에 따른 흰들버섯 추출물은 정제된 단일 성분이 아님에도 농도 증가시 코지산보다 우수한 티로시나제 억제 활성을 나타내었다.

추출물	티로시나제 저해 활성 (%)
코지산(대조군)	95.59±0.39
흰들버섯 추출물 1 100㎍/㎖	33.58±1.55
흰들버섯 추출물 1 200㎍/㎖	47.01±1.97
흰들버섯 추출물 1 400㎍/㎖	51.74±1.14

실시예 8. 흰들버섯 추출물을 포함하는 화장료 조성물 제조

실시예 8-1. 영양 로션의 제조

전체 조성물 100 중량부 대비 프로필렌글리콜 3.0 중량부, 카르복시폴리머 0.1 중량부, 방부제 미량과 잔량의 정제수를 혼합교반하면서 80 내지 85℃로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고, 폴리솔베이트60 1.0 중량부, 솔비탄 세스퀴올레이트 0.5 중량부, 유동 파라핀 10.0 중량부, 솔비탄 스테아레이트 1.0 중량부, 친유형 모노스테아린산 글리세린 0.5 중량부, 스테아린산 1.5 중량부, 글리세릴스테아레이트/PEG-400 스테아레이트 1.0 중량부, 트리에탄올아민 0.2 중량부를 80 내지 85℃로 가열하여 투입한 뒤 유화하였다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 50℃까지 열 냉각한 뒤 향료 미량을 투입하고, 45℃까지 냉각한 뒤 색소 미량을 투입하고, 35℃에서 실시예 1-2에서 제조한 흰들버섯 추출물(추출물 1 내지 5) 5.0 중량부를 투입하여 혼합한 후 25℃까지 냉각하여 보관하였다.

실시예 8-2. 영양 크림의 제조

전체 조성물 100 중량부 대비 카르복시폴리머 0.3 중량부, 부틸렌글리콜 5.0 중량부, 글리세린 3.0 중량부 및 잔량의 정제수를 혼합교반하면서 80 내지 85℃로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고, 스테아린산 2.0 중량부, 세틸알콜 2.0 중량부, 글리세릴모노 스테아레이트 2.0 중량부, 폴리옥시에틸렌솔비탄모노스테아레이트 0.5 중량부, 솔비탄세스퀴올레이트 0.5 중량부, 글리세릴모노스테아레이트/글리세릴스테아레이트/폴리옥시에틸렌스테아레이트 1.0 중량부, 왁스 1.0 중량부, 유동파라핀 4.0 중량부, 스쿠알란 4.0 중량부, 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 4.0 중량부를 80 내지 85℃로 가열하여 투입한 뒤 트리에탄올아민 0.5 중량부를 투입하여 유화하였다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 35℃까지 냉각한 뒤 실시예 1-2에서 제조한 흰들버섯 추출물(추출물 1 내지 5)를 5.0 중량부를 투입하여 혼합한 후 25℃까지 냉각하여 보관하였다.

실시예 9. 피부 안정성 평가

본 발명의 흰들버섯 추출물의 피부 안정성을 평가하기 위하여, 건강한 성인 남녀 49명(남자 24명, 여자 25명)의 팔에 상기 실시예 8-2에서 제조한 크림을 도포하여, 인체 첩포 시험을 실시하였다.

구체적으로, 시험 대상자의 팔을 70% 에탄올로 닦은 후, 20㎕씩 점착 테이프를 이용하여 실시예 8-2에서 제조한 흰들버섯 추출물 1 내지 5를 포함하는 크림을 24시간 폐쇄 부착시켰다. 24시간 후에 점착 테이프를 제거하고, 가제로 피부에 잔존된 시료를 가볍게 닦아 제거한 뒤에 피부 상태를 관찰하고 다시 24시간 및 48시간 후에 한번 더 관찰하였다.

그 결과, 흰들버섯 추출물 1 내지 5를 포함하는 크림에서는 피부 자극성이 확인되지 않아, 본 발명의 일 구체예에 따른 조성물은 인체 피부에 자극성이 전혀 없어 안정한 것을 확인하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> UNIJEJU Co., Ltd. <120> Cosmetic Composition comprising Extract of Agaricus blazei <130> PN170370-P1 <150> KR 10-2017-0174568 <151> 2017-12-18 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-1_Forward <400> 1 atgctgaaac cctgaaggtg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-1_Reverse <400> 2 ctgcttgacc ctcagagacc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Type I collagen_Forward <400> 3 cttcctgcgc ctgatgtcca 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Type I collagen_Reverse <400> 4 ctcgtgcagc catcgacagt 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin_Forward <400> 5 ggattcctat gtgggcgacg a 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin_Reverse <400> 6 cgctcggtga ggatcttcat g 21

Claims (5)

1. 흰들버섯을 세척하고 건조하는 단계;
   추출탱크에 건조된 흰들버섯을 투입하고, 흰들버섯의 총 중량 대비 8 내지 10배 중량의 정제수를 투입한 후, 115 내지 121℃ 및 1.2 내지 1.5 atm에서 5 내지 9시간 동안 추출하고, 추출탱크로부터 제 1 추출물을 회수하는 단계;
   제 1 추출물이 회수된 추출탱크에 잔존하는 흰들버섯의 총 중량 대비 8배 내지 10배 중량의 정제수를 추가적으로 투입한 후, 115 내지 121℃ 및 1.2 내지 1.5 atm에서 5 내지 9시간 동안 추출하고, 추출탱크로부터 제 2 추출물을 회수하는 단계; 및
   회수된 상기 제 1 추출물 및 상기 제 2 추출물을 혼합하고 필터로 여과하는 단계를 포함하는 흰들버섯 추출물 제조방법.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 필터는 0.5 내지 1.5㎛의 공극 크기를 갖는 것인 흰들버섯 추출물 제조방법.
   
3. 제 1 항의 제조방법으로 제조한 흰들버섯 추출물을 포함하는 화장료 조성물.
   
4. 제 3 항에 있어서,
   상기 화장료 조성물은 주름 개선, 피부 미백, 피부 탄력 증진, 피부 자극 완화, 및 보습 효과로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 효과를 갖는 것인 조성물.
   
5. 제 3 항에 있어서,
   상기 화장료 조성물은 유연 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 밀크로션, 크림, 에센스, 스킨토너, 수중유형(oil-in-water) 에멀젼, 유중수형(water-in-oil) 에멀젼, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 바디오일, 바디로션, 수중유형 메이크업베이스, 유중수형 메이크업베이스 및 파운데이션으로 이루어진 군 중에서 선택되는 제형인 것인 조성물.
   
   
   

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