KR102054762B1 - FATTY ACID CHAIN ELONGASE GENE FROM Berryteuthis magister AND USES THEREOF - Google Patents

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Abstract

본 발명은 갈고리 흰오징어 유래의 지방산 사슬연장효소 단백질 및 이를 이용하여, 에이코사디에노익 산(Eicosadienoic acid), 디-호모-감마리놀레익산(di-homo-gamma linolenic acid, DGLA), 도코사테트라에노익산(docosatetraenoic acid, DTA) 및 도코사펜타에노익산(docosapentaenoic acid, DPA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 불포화지방산을 생산하는 방법에 관한 것이다. The present invention is derived from hook white squid Fatty Acid Chain Extender Protein and Eicosadienoic Acid, Di-homo-gamma linolenic acid (DGLA), docosatetraenoic acid (docosatetraenoic acid) DTA) and docosapentaenoic acid (docsapentaenoic acid, DPA).

Description

갈고리 흰오징어 유래의 지방산 사슬연장효소 유전자 및 이의 용도{FATTY ACID CHAIN ELONGASE GENE FROM Berryteuthis magister AND USES THEREOF}FATY ACID CHAIN ELONGASE GENE FROM Berryteuthis magister AND USES THEREOF}

본 발명은 갈고리 흰오징어(Berryteuthis magister ) 유래의 지방산 사슬연장효소 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention is hooked white squid ( berryteuthis magister ) and fatty acid chain extender genes and uses thereof.

불포화지방산(Unsaturated fatty acid)은 한 분자 속에 하나 이상의 이중결합을 가지는 사슬 모양 화합물로 동식물 속에 널리 분포하며, 일반적으로 탄소수 12 내지 20개 정도의 짝수 개로 구성되어 있다. 지방산 분자가 단 하나의 이중결합을 갖고 있으면 단일불포화지방산이라고 하며, 두 개 이상의 이중결합을 갖고 있으며 다가불포화지방산이라고 부른다. 불포화지방산은 이중결합 바로 다음의 수소원자가 결합된 형태에 따라 시스 형(cis configuration)과 트랜스 형(trans configuration)으로 나뉜다. 시스 형은 인접한 수소원자가 이중결합과 같은 방향에 있는 것을 말하며, 트랜스 형은 다음 2개의 수소원자가 이중결합과 반대의 방향으로 결합한 것을 말한다. 지방산 사슬에서 이중결합이 형성되면 수소원자가 제거되어야 하는데, 이 때문에 포화지방산에서 '포화'라는 용어는 수소원자가 포화되었다는 것을 의미한다. 세포내 대사에서 수소-탄소 결합은 에너지 생산을 위해 결합이 깨지거나 산화된다. 따라서 불포화지방산은 같은 크기의 포화지방산에 비해 에너지를 더 적게 함유한다. 또한, 불포화지방산은 더 낮은 녹는점을 갖고 있어서 세포막의 유동성을 증가시키는 작용도 하는 것으로 알려졌다. Unsaturated fatty acid (Unsaturated fatty acid) is a chain-like compound having one or more double bonds in one molecule, widely distributed in the flora and fauna, and is composed of an even number of about 12 to 20 carbon atoms. When a fatty acid molecule has only one double bond, it is called monounsaturated fatty acid, and it has two or more double bonds and is called polyunsaturated fatty acid. Unsaturated fatty acids are divided into cis configuration and trans configuration depending on the form of hydrogen atoms immediately following the double bond. The cis type means that adjacent hydrogen atoms are in the same direction as the double bond, and the trans type means that the next two hydrogen atoms are bonded in the opposite direction to the double bond. When a double bond is formed in the fatty acid chain, the hydrogen atom must be removed, which is why the term 'saturated' in saturated fatty acid means that the hydrogen atom is saturated. In intracellular metabolism, hydrogen-carbon bonds are broken or oxidized for energy production. Thus, unsaturated fatty acids contain less energy than saturated fatty acids of the same size. In addition, unsaturated fatty acids are known to have a lower melting point, thereby increasing the fluidity of cell membranes.

포화지방산의 섭취는 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia), 동맥경화(atherosclerosis) 등과 같은 심혈관계 질환(cardiovascular disease)의 위험성과 관련이 깊은 반면, 불포화지방산의 섭취는 혈중 콜레스테롤의 감소 및 동맥경화의 발병 위험 감소와 관련이 있는 것으로 잘 알려져 있다. 불포화지방산의 예로는 팔미톨레익산(palmitoleic acid), 올레익산(oleic acid), 미리스톨레익산(myristoleic acid), 리놀레익산(linoleic acid), 아라키도닉산(arachidonic acid), 에이코사펜타에노익산(eicosapentaenoic acid, EPA), 도코사헥사에노익산(docosahexaenoic acid, DHA) 등이 있다. 이러한 불포화지방산을 함유하는 식품으로는 아보카도, 견과류, 카놀라유나 올리브유와 같은 식물성 기름 등이 있다. 비록 불포화지방산이 포화지방산보다는 건강에 유익하지만, 미 식품의약국(FDA)에서는 불포화지방산의 섭취량이 하루 칼로리 섭취량의 30%를 넘지 않도록 권고한다. Consumption of saturated fatty acids is associated with the risk of cardiovascular diseases such as hypercholesterolemia and atherosclerosis, while ingesting unsaturated fatty acids reduces blood cholesterol and reduces the risk of developing arteriosclerosis. It is well known to be associated with. Examples of unsaturated fatty acids include palmitoleic acid, oleic acid, myristoleic acid, linoleic acid, arachidonic acid, eicosapentaeno Icosapentaenoic acid (EPA), docosahexaenoic acid (dochahexaenoic acid, DHA). Foods containing such unsaturated fatty acids include avocados, nuts, vegetable oils such as canola oil and olive oil. Although unsaturated fatty acids are healthier than saturated fatty acids, the Food and Drug Administration (FDA) recommends that intake of unsaturated fatty acids not exceed 30% of calorie intake per day.

오메가6(ω6) 및 오메가3(ω3) 계통의 고도불포화지방산(Polyunsaturated fatty acids: PUFA)인 아라키도닉산(arachidonic acid, ARA, C20:4 ω6)와 에이코사펜타에노익산(eicosapentaenoic acid, EPA, C20:5 ω3), 도코사펜타에노익산(docosahexaenoic acid, DHA, C22:6 ω3)는 동물 세포막의 필수 구성성분으로 포스포파티딜콜린(phosphatidylcholine)과 결합한 형태로 세포막의 인지질 층에 삽입되어 세포막의 유동성을 좋게 하고, 혈중 콜레스테롤을 감소시키며, 암 증식을 억제하는 등의 질병예방 효과가 뛰어나다. 특히 DHA는 뇌 기능 강화와 기억력 증진을 통한 영, 유아의 뇌 기능 성장발달과 학습기능 향상, 통증을 알려주는 프로스타글란딘(prostaglandin)과 같은 호르몬의 전구체로서 호르몬 조절 작용 등의 중요한 기능이 규명되었다. 최근 식품첨가제와 화장품 원료 및 의약품 분야에서 큰 시장을 형성하고 있다. 포유동물은 ω6/Δ12 및 ω3/Δ15 불포화효소(desaturase)가 발현되지 않아 PUFA의 de novo 합성을 할 수 없으며, 정상적인 성장과 발달을 위하여 리놀레익산(linoleic acid, LA, C18:2 ω6)와 알파-리놀레익산(α-linolenic acid, ALA, C18:3 ω3)를 반드시 음식물로 섭취해야만한다(도 1 참고). Arachidonic acid (ARA, C20: 4 ω6) and eicosapentaenoic acid (EPA), polyunsaturated fatty acids (PUFAs) of the omega 6 (ω6) and omega 3 (ω3) lines , C20: 5 ω3) and docosapentenoic acid (DHA, C22: 6 ω3) are essential components of animal cell membranes and are incorporated into the phospholipid layer of the cell membrane in combination with phosphatidylcholine. It is excellent in disease prevention effect such as improving cell membrane fluidity, reducing blood cholesterol, and inhibiting cancer proliferation. In particular, DHA has been identified as a precursor of hormones such as prostaglandin, which informs pain, improves brain function growth and learning, and improves pain through enhancing brain function and memory. Recently, it is forming a big market in the field of food additives, cosmetic raw materials and pharmaceuticals. Mammals do not express ω6 / Δ12 and ω3 / Δ15 desaturase and thus cannot de novo synthesis of PUFA, and they can be used for linoleic acid (LA, C18: 2 ω6) for normal growth and development. Alpha-linolenic acid (ALA, C18: 3 ω3) must be taken as food (see Figure 1).

DHA는 주로 참치와 같은 등 푸른 생선으로부터 생산하고 있으나, 다량의 DHA를 식품에 첨가하게 되면 물고기 특유의 비린내 때문에 상품성에 문제가 되어 그 냄새를 제거하기 위한 순수 분리, 정제가 관건이 되고 있다. 해양 조류를 통해서도 DHA 생산이 가능하나, 낮은 성장률로 말미암아 DHA의 대량 생산을 위해서는 고가의 장비를 필요로 한다. 최근 이러한 문제점들을 해결하고 저비용 고효율의 DHA를 생산하고자 식물 종자에서의 발현 시스템을 이용한 PUFA 생산에 대한 관심이 높아지고 있다. PUFA은 전구체인 LA와 ALA(도. 1)로부터 일련의 불포화화(desaturation)와 2탄소 사슬 연장(elongation) 과정을 통해 생합성 된다. 식물은 PUFA를 생합성 하지 못하며, LA와 ALA로부터 PUFA를 생합성 하기 위해서는 Δ6 불포화효소(Δ6 desaturase, Δ6DES), Δ6 사슬 연장효소(Δ6 elongase, Δ6ELS), 그리고 Δ5 불포화효소(Δ5 desaturase, Δ5DES)의 도입이 필요하다. 따라서, 고 함량의 PUFA를 축적하는 해양 미생물, 조류 혹은 어류 유래의 지방산 불포화 효소 및 2탄소 사슬 연장 효소 유전자를 식물 종자 특이적으로 발현시키는 대사공학적인 방법을 이용하여 얻을 수 있다. DHA is mainly produced from blue fish such as tuna, but when a large amount of DHA is added to foods, it is a problem for commerciality because of fish's unique fishy, and pure separation and purification to remove the odor is a key issue. DHA production is also possible through marine algae, but low growth rates require expensive equipment for mass production of DHA. Recently, in order to solve these problems and produce low cost, high efficiency DHA, there is increasing interest in the production of PUFA using the expression system in plant seeds. PUFAs are biosynthesized from a series of desaturation and 2-carbon chain elongation processes from the precursors LA and ALA (Fig. 1). Plants do not biosynthesize PUFA, and in order to biosynthesize PUFA from LA and ALA, the introduction of Δ6 desaturase (Δ6DES), Δ6 chain extender (Δ6 elongase, Δ6ELS), and Δ5 desaturase (Δ5DES) This is necessary. Therefore, it can be obtained by using a metabolic method of expressing plant seed specifically the marine microorganism, algae or fish-derived fatty acid unsaturated enzyme and 2-carbon chain extension enzyme gene which accumulate high content of PUFA.

현재까지 자연계에는 3 종류의 PUFA 생합성의 경로가 알려져 있다[Qiu X (2003) Biosynthesis of docosahexaenoic acid (DHA, 22:6-4, 7, 10, 13, 16, 19): two distinct pathways. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 68, 181-186.]. (1) 물 곰팡이류에 속하는 Saprolegnia는 전구물질인 ALA에 대하여 Δ6 불포화, 연장 및 Δ5 불포화 반응을 통하여서 EPA를 합성하는 경로를 이용하는 반면[Pereira SL 등 (2004a) A novel omega 3-fatty acid desaturase involved in the biosynthesis of eicosapentaenoic acid. Biochem J 378, 665-671.], (2) Euglena등의 원생생물은 Δ9 연장, Δ8 불포화 및 Δ5 불포화에 의해 EPA를 생합성 한다[Wallis과 Browse, (1999) The Delta8-desaturase of Euglenagracills: an alternate pathway for synthesis of 20-carbon polyunsaturated fatty acids. Arch Biochem Biophys 365, 307-316.]. 위의 두 경로를 통해서 생합성 된 EPA는 Δ5 연장과 Δ4 불포화에 의해 최종적으로 DHA를 생합성 한다[Pereira 등, 2004b]. 포유동물은 EPA로부터 4단계의 더 복잡한 경로 즉, β-산화에 의한 역전환(retro-conversion) 과정을 거쳐 DHA를 생합성 하게 된다[Sprecher 등(1995) Reevaluation of the pathways for the biosynthesis of polyunsaturated fatty acids. J Lipid Res 36, 2471-2477., 1995; Wallis 등, Polyunsaturated fatty acid synthesis: what will they think of next Trends Biochem Sci 27, 467-473.] (3) 해양 조류(Schizochytrium)와 해양 미생물(Shewanella)은 PKSe(polyketide synthas) 경로를 이용하여 DHA를 생합성 한다[Metz 등, (2001) Production of polyunsaturated fatty acids by polyketide synthases in both prokaryotes and eukaryotes.Science 293, 290-293.]. PKS 경로는 앞의 두 PUFA 생합성 경로에 필수적인 수종의 불포화효소와 연장효소 대신에 3-케토아실-합성효소(3-ketoacyl synthase), 3-케토아실 환원효소(3-ketoacyl reductase), 아실 캐리어 단백질(acyl carrier protein), 체인 길이 인자(chain length factor) 그리고 아실 트랜스퍼레이즈(acyl transferase)와 같은 PKS의 합성 도메인을 하나의 유전자 집단(gene cluster)으로 구성하고 있어 PUFA 생합성에 필요한 반응 횟수를 줄일 수 있다. 이러한 해양 생물들은 육상 식물들의 PUFA 생합성 경로를 재구성하는데 필요한 유용한 유전자원으로 활용할 경우 주로 생선을 통해서만 섭취하던 EPA와 DHA을 식물을 통해서 섭취할 수 있는 유전공학적 기반을 구축할 수 있다.To date, three pathways of PUFA biosynthesis are known in nature [Qiu X (2003) Biosynthesis of docosahexaenoic acid (DHA, 22: 6-4, 7, 10, 13, 16, 19): two distinct pathways. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 68, 181-186.]. (1) Saprolegnia, a member of the water fungus, uses a route to synthesize EPA through the Δ6 unsaturated, extended and Δ5 unsaturated reactions for the precursor ALA [Pereira SL et al. (2004a) A novel omega 3-fatty acid desaturase involved in the biosynthesis of eicosapentaenoic acid. Biochem J 378, 665-671.], (2) Protists such as Euglena biosynthesize EPA by Δ9 prolongation, Δ8 desaturation and Δ5 desaturation [Wallis and Browse, (1999) The Delta 8-desaturase of Euglenagracills: an alternate pathway for synthesis of 20-carbon polyunsaturated fatty acids. Arch Biochem Biophys 365, 307-316.]. EPA biosynthesized through these two pathways finally synthesizes DHA by Δ5 extension and Δ4 unsaturation [Pereira et al., 2004b]. Mammalians biosynthesize DHA through four more complex pathways from EPA: retro-conversion by β-oxidation [Sprecher et al. (1995) Reevaluation of the pathways for the biosynthesis of polyunsaturated fatty acids. . J Lipid Res 36, 2471-2477., 1995; Wallis et al., Polyunsaturated fatty acid synthesis: what will they think of next Trends Biochem Sci 27, 467-473.] (3) Marine algae (Schizochytrium) and marine microorganisms (Shewanella) use the PKSe (polyketide synthas) pathway to produce DHA. Biosynthesis [Metz et al., (2001) Production of polyunsaturated fatty acids by polyketide synthases in both prokaryotes and eukaryotes. Science 293, 290-293.]. The PKS pathway is a 3-ketoacyl synthase, 3-ketoacyl reductase, or acyl carrier protein instead of several desaturases and extenders essential for the first two PUFA biosynthetic pathways. Synthetic domains of PKS such as acyl carrier protein, chain length factor and acyl transferase are organized into a single gene cluster, reducing the number of reactions required for PUFA biosynthesis. have. These marine organisms, if used as a useful gene source for reconstructing the PUFA biosynthetic pathways of land plants, can establish a genetic engineering base that can ingest EPA and DHA, which are mainly obtained only from fish, through plants.

이에 본 발명자들은 고등생물 체내에서 혈액순환계, 호르몬 분비계 및 면역계 등 여러 가지 생리활성을 갖는 고도불포화지방산을 합성하는 데 관여하는 지방산 사슬연장효소 유전자(BmFAE)를 두족류인 갈고리 흰오징어(Berryteuthis magister)로부터 분리하여 그 기능을 확인하고 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors have identified a fatty acid chain extending enzyme gene ( BmFAE ) which is involved in synthesizing polyunsaturated fatty acids having various physiological activities such as blood circulation system, hormone secretion system and immune system in a higher organism, berry squid ( berryteuthis magister ). Separation from this confirms its function and completes the present invention.

한국특허등록 제0316068호Korean Patent Registration No. 0316068 한국특허등록 제0606612호Korean Patent Registration No.0606612

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본 발명의 목적은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 갈고리 흰오징어(Berryteuthis magister) 유래의 지방산 사슬연장효소 단백질, 이를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하기 위한 것이다.An object of the present invention is a fatty acid chain extender protein derived from hookteuthis magister consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, a gene encoding the same, a recombinant vector comprising the gene and a host cell transformed with the recombinant vector It is to provide.

본 발명의 다른 목적은 상기 갈고리 흰오징어 유래 지방산 사슬연장효소 유전자를 이용하여 불포화지방산을 생산하는 방법에 관한 것이다.Another object of the present invention relates to a method for producing unsaturated fatty acid using the hook white squid-derived fatty acid chain extender gene.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 불포화지방산을 생산하는 식물체 및 이의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.Still another object of the present invention is to provide a plant producing the unsaturated fatty acid and a method for producing the same.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 갈고리 흰오징어 유래 지방산 사슬연장효소 유전자를 포함하는 조성물을 제공하기 위한 것이다.Still another object of the present invention is to provide a composition comprising the squid-derived fatty acid chain extender gene.

본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 갈고리 흰오징어 유래의 지방산 사슬연장효소 단백질을 제공한다. The present invention provides a fatty acid chain extender protein derived from hook white squid, consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.

본 발명에 따른 지방산 사슬연장효소 단백질의 범위는 갈고리 흰오징어로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. 본 발명에서 "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체 내에서 어느 하나의 불포화지방산의 탄소 사슬을 연장시켜 다른 불포화지방산, 예를 들면, 에이코사디에노익 산(Eicosadienoic acid), 디-호모-감마리놀레익산(di-homo-gamma linolenic acid, DHLA), 도코사테트라에노익산(docosatetraenoic acid, DTA) 및 도코사펜타에노익산(docosapentaenoic acid, DPA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 불포화지방산으로 각각 전환시키는 활성을 의미한다.The range of fatty acid chain extender protein according to the present invention includes a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 isolated from hooked squid and a functional equivalent of the protein. "Functional equivalent" means at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90%, even more preferably at least 70% of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 as a result of the addition, substitution, or deletion of the amino acid Is 95% or more of sequence homology, and refers to a protein that exhibits substantially homogeneous physiological activity with the protein represented by SEQ ID NO: 2. In the present invention, "substantially homogeneous physiological activity" refers to extending the carbon chain of any unsaturated fatty acid in a plant to other unsaturated fatty acids, such as Eicosadienoic acid, di-homo-gamma Conversion to an unsaturated fatty acid selected from the group consisting of di-homo-gamma linolenic acid (DHLA), docosatetraenoic acid (DTA) and docosapentaenoic acid (DPA), respectively. It means the activity to make.

또한, 본 발명은 상기 사슬연장효소 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 사슬연장효소 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다.The present invention also provides a gene encoding the chain extender protein. Genes of the invention include both genomic DNA and cDNA encoding chain extender proteins. Preferably, the gene of the present invention may be composed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.

또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.In addition, variants of the above nucleotide sequences are included within the scope of the present invention. Specifically, the gene has a base sequence having a sequence homology of at least 70%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, most preferably at least 95% with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, respectively. It may include. The "% sequence homology" for a polynucleotide is determined by comparing the comparison region with two optimally arranged sequences, wherein part of the polynucleotide sequence in the comparison region is the reference sequence (addition or deletion) for the optimal alignment of the two sequences. It may include the addition or deletion (ie, gap) compared to).

또한, 본 발명은 갈고리 흰오징어 유래 사슬연장효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.The present invention also provides a recombinant expression vector comprising a gene encoding a hook white squid-derived chain extending enzyme.

본 발명의 상기 유전자를 공지의 적절한 발현벡터에 삽입하여, 이 유전자를 포함하는 발현벡터를 얻을 수 있다. 상기 발현 벡터의 예로써는 대장균 발현벡터 pQE30 시리즈, 효모 발현벡터 pYES2 가 있으며, 특히 피딩 테스트(feeding test)를 위하여 숙주로서 효모를 사용하고, 갈락토스에 의해 단백질 발현을 유도할 수 있는 효모 유래의 발현벡터인 pYES2를 사용할 수 있다.The gene of the present invention can be inserted into a known appropriate expression vector to obtain an expression vector containing the gene. Examples of the expression vectors include E. coli expression vectors pQE30 series and yeast expression vectors pYES2. In particular, yeast is used as a host for feeding tests, and expression vectors derived from yeast capable of inducing protein expression by galactose. PYES2 can be used.

구체적으로, 본 발명에서는 효모 유래의 발현벡터 pYES2를 사용하여 상기 갈고리 흰오징어 유래 사슬연장효소를 코딩하는 유전자 포함하는 재조합 발현벡터를 제조하였고, 상기 재조합 발현 벡터를 본 발명에서 “pYES2-BmFAE”로 명명하였다.Specifically, in the present invention, a recombinant expression vector comprising a gene encoding the hook white squid-derived chain extending enzyme was prepared using the expression vector pYES2 derived from yeast, and the recombinant expression vector was referred to as “pYES2- BmFAE ” in the present invention. Named it.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.The term “recombinant” refers to a cell in which a cell replicates a heterologous nucleic acid, expresses the nucleic acid, or expresses a protein encoded by a peptide, a heterologous peptide, or a heterologous nucleic acid. Recombinant cells can express genes or gene fragments that are not found in the natural form of the cell in either the sense or antisense form. Recombinant cells can also express genes found in natural cells, but the genes are modified and reintroduced into cells by artificial means.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.The term “vector” is used to refer to a DNA fragment (s), a nucleic acid molecule, that is delivered into a cell. Vectors can replicate DNA and be reproduced independently in host cells. The term "carrier" is often used interchangeably with "vector". The term “expression vector” refers to a recombinant DNA molecule comprising a coding sequence of interest and an appropriate nucleic acid sequence necessary to express a coding sequence operably linked in a particular host organism. Promoters, enhancers, termination signals and polyadenylation signals available in eukaryotic cells are known.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주세포로서 대장균(E. coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.Vectors of the present invention can typically be constructed as vectors for cloning or expression. In addition, the vector of the present invention can be constructed using prokaryotic or eukaryotic cells as hosts. For example, when the vector of the present invention is an expression vector and the prokaryotic cell is a host, a strong promoter (for example, a pLλ promoter, a trp promoter, a lac promoter, a T7 promoter, a tac promoter, etc.) capable of promoting transcription, It is common to include ribosomal binding sites and transcription / detox termination sequences for initiation of translation. When E. coli is used as a host cell, a promoter and an operator site of the E. coli tryptophan biosynthetic pathway, and a phage λ left promoter (pLλ promoter) can be used as regulatory sites.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.On the other hand, vectors that can be used in the present invention are plasmids (eg, pSC101, ColE1, pBR322, pUC8 / 9, pHC79, pGEX series, pET series and pUC19, etc.) which are often used in the art, phage (e.g., λgt4.λB , λ-Charon, λΔz1 and M13, etc.) or viruses (eg SV40, etc.).

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.On the other hand, when the vector of the present invention is an expression vector and the eukaryotic cell is the host, a promoter derived from the genome of the mammalian cell (for example, metallothionine promoter) or a promoter derived from a mammalian virus (for example, adeno) Late virus promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus promoter and tk promoter of HSV) can be used and generally have a polyadenylation sequence as a transcription termination sequence.

본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.Vectors of the present invention may include antibiotic resistance genes commonly used in the art as optional markers, for example ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin, neomycin And resistance genes for tetracycline.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 숙주세포 또는 형질전환체를 제공한다. 본 발명에서 상기 숙주세포는 식물세포 또는 효모 일 수 있고, 이에 제한되지 않는다.The present invention also provides a host cell or transformant transformed with the recombinant expression vector. In the present invention, the host cell may be a plant cell or a yeast, but is not limited thereto.

상기 식물세포의 예를 들면 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수로 이루어진 군에서 선택된 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근으로 이루어진 군에서 선택된 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채로 이루어진 군에서 선택된 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나로 이루어진 군에서 선택된 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립으로 이루어진 군에서 선택된 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스로 이루어진 군에서 선택된 사료작물류로부터 유래된 식물세포일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 식물의 씨, 열매, 가지 또는 잎에 지방 성분을 포하하고 있는 유지식물의 세포일 수 있고, 상기 유지식물은 유채, 들깨 및 참깨로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다..Examples of the plant cells include food crops selected from the group consisting of rice, wheat, barley, corn, soybeans, potatoes, wheat, red beans, oats and sorghum; Vegetable crops selected from the group consisting of Arabidopsis, Chinese cabbage, radish, red pepper, strawberry, tomato, watermelon, cucumber, cabbage, melon, pumpkin, green onion, onion, and carrot; Special crops selected from the group consisting of ginseng, tobacco, cotton, sesame, sugar cane, sugar beet, perilla, peanut and rapeseed; Fruit trees selected from the group consisting of apple trees, pear trees, jujube trees, peaches, lambs, grapes, citrus fruits, persimmons, plums, apricots and bananas; Flowers selected from the group consisting of roses, gladiolus, gerberas, carnations, chrysanthemums, lilies and tulips; And plant cells derived from feed crops selected from the group consisting of lygras, red clover, orchardgrass, alpha alpha, tolsque cue and perennial lygragrass, but are not limited thereto. Preferably, it may be a cell of a fat or oil containing a fat component in a seed, fruit, branch or leaf of a plant, and the fat or oil may be selected from the group consisting of rapeseed, perilla and sesame.

본 발명에 있어서 식물세포로의 형질전환은 유전자를 식물세포에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 본 발명에 있어서 식물체의 형질전환은 아그로박테리움이나 바이러스 벡터 등을 이용한 통상의 방법에 의해 달성할 수 있다. 예컨대, 본 발명에 따른 BrPSR 유전자를 보유하는 벡터로 아그로박테리움 속 미생물을 형질전환시킨 다음, 상기 형질전환된 아그로박테리움 속 미생물을 대상 식물의 조직 등에 감염시켜 형질전환된 식물을 수득할 수 있다. 이외에도 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70) 등의 방법을 이용할 수 있으며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 형질전환을 포함한다.In the present invention, transformation into plant cells means any method of transferring genes to plant cells. Plant transformation in the present invention can be achieved by a conventional method using Agrobacterium, viral vectors and the like. For example, a microorganism of the genus Agrobacterium may be transformed with a vector containing a BrPSR gene according to the present invention, and then the transformed plant may be infected by infecting the transformed Agrobacterium microorganisms with tissues of a target plant. . In addition, calcium / polyethylene glycol methods for protoplasts (Krens, FA et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), protoplasts Perforation (Shillito RD et al., 1985 Bio / Technol. 3, 1099-1102), microscopic injection into plant elements (Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), Methods such as (DNA or RNA-coated) particle bombardment (Klein ™ et al., 1987, Nature 327, 70) of various plant elements can be used and can be appropriately selected by those skilled in the art. Preferred methods according to the invention include Agrobacterium mediated transformation.

본 발명의 상기 형질전환에 사용할 수 있는 숙주세포로는 본 발명의 상기 유전자의 발현에 적합한 것이면 어느 것이라도 포함될 수 있고, 세포배양 및 구입의 용이 등의 측면에서 특히 효모(Saccharomyces cerevisiae)를 포함할 수 있다.The host cell that can be used for the transformation of the present invention may include any one suitable for the expression of the gene of the present invention, and may include yeast (Saccharomyces cerevisiae) in particular in terms of ease of cell culture and purchase. Can be.

여기서, '형질전환체'란 프로모터와 작동 가능하게 연결되며, 유용물질을 코딩하는 DNA 서열로 이루어지는 DNA 구조물(DNA construct)에 의해 형질전환된 세포 또는 식물체를 의미한다. 본 발명에서 형질전환체는 형질전환된 미생물, 동물세포, 식물세포, 형질전환된 동물 또는 식물체 및 이들로부터 유래된 배양세포 등을 포함하는 의미이다.Here, the 'transformer' refers to a cell or plant operably linked to a promoter and transformed by a DNA construct consisting of a DNA sequence encoding a useful substance. In the present invention, the transformant is meant to include transformed microorganisms, animal cells, plant cells, transformed animals or plants, and cultured cells derived from them.

본 발명자들은 본 발명의 상기 유전자를 포함하는 발현벡터 pYES2-BmFAE를 제작한 후, 이 발현벡터를 효모(Saccharomyces cerevisiae)에 형질전환시켜 안정적인 효모 형질전환체를 확립하였다. The present inventors constructed an expression vector pYES2- BmFAE comprising the gene of the present invention, and then transformed the expression vector into yeast (Saccharomyces cerevisiae) to establish a stable yeast transformant.

본 발명은 또한, 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 갈고리 흰오징어(Berryteuthis magister) 유래의 지방산 사슬연장효소 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는, 숙주세포에서 불포화지방산을 생산하는 방법을 제공한다.The present invention also comprises the step of transforming a host cell with a recombinant vector comprising a fatty acid chain extender gene derived from a hooked squid Berryteuthis magister consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, unsaturated fatty acid in the host cell Provide a way to produce.

상기 불포화지방산은 감마-리놀레익산(gamma-linolenic acid, GLA)의 탄소 사슬이 연장되어 생산된 디-호모-감마리놀레익산(di-homo-gamma linolenic acid, DHLA)일 수 있다.The unsaturated fatty acid may be di-homo-gamma linolenic acid (DHLA) produced by extending the carbon chain of gamma-linolenic acid (GLA).

상기 불포화지방산은 아라키도닉산(arachidonic acid, ARA, C20:4)의 탄소 사슬이 연장되어 생산된 도코사테트라에노익산(docosatetraenoic acid, DTA, C22:4)일 수 있다.The unsaturated fatty acid may be docosatetraenoic acid (DTA, C22: 4) produced by extending the carbon chain of arachidonic acid (ARAchidonic acid, ARA, C20: 4).

상기 불포화지방산은 에이코사펜타에노익산(eicosapentaenoic acid, EPA, C20:5)의 탄소 사슬이 연장되어 생산된 도코사펜타에노익산(docosapentaenoic acid, DPA, C22:5)일 수 있다.The unsaturated fatty acid may be docosapentaenoic acid (docsapentaenoic acid, DPA, C22: 5) produced by extending the carbon chain of eicosapentaenoic acid (EPA, C20: 5).

상기 불포화지방산은 리놀레익산(Linoleic acid, LA)의 탄소 사슬이 연장되어 생산된 에이코사디에노익 산(Eicosadienoic acid)일 수 있다.The unsaturated fatty acid may be Eicosadienoic acid produced by extending the carbon chain of linoleic acid (LA).

상기 탄소 사슬의 연장은 본 발명의 갈고리 흰오징어 유래의 지방산 사슬연장효소 유전자가 활성화되어 C20:4인 아라키도닉산이 탄소 2개 단위가 연장된 C22:4인 도코사테트라에노익산으로 전환되고, C20:5인 에이코사펜타에노익산가 역시 탄소 2개 단위가 연장된 C22:5인 도코사펜타에노익산으로 전환되어 일어난다. The extension of the carbon chain is activated by the fatty acid chain extending enzyme gene derived from hook squid of the present invention is converted to arachidonic acid of C20: 4 to docosatetraenoic acid of C22: 4 with two carbon units extended, Eicosapentaenoic acid, C20: 5, also occurs by conversion to docosapentaenoic acid, C22: 5, which extends two carbon units.

용어 "고도불포화지방산"은, 지방산 중에 이중결합을 4개 이상 포함하는 것을 말한다. 오메가6 및 오메가3 지방산 등이 포함되며, 이 기술분야에 고도불포화지방산의 종류는 널리 알려져 있다. 본 발명에서는 도코사테트라에노익산(docosatetraenoic acid, DTA) 및 도코사펜타에노익산(docosapentaenoic acid, DPA) 등이 포함된다.The term "highly unsaturated fatty acid" refers to containing four or more double bonds in fatty acids. Omega 6 and omega 3 fatty acids, and the like, and types of polyunsaturated fatty acids are well known in the art. In the present invention, docosatetraenoic acid (DTA) and docosapentaenoic acid (docosapentaenoic acid, DPA) and the like are included.

본 발명의 방법에서, 지방산 사슬연장효소 유전자 및 재조합 벡터는 전술한 바와 같다. 또한, 상기 숙주세포는 바람직하게는 효모이다.In the method of the present invention, the fatty acid chain extender gene and the recombinant vector are as described above. In addition, the host cell is preferably a yeast.

본 발명 일 실시예에서는 갈고리 흰오징어 안구조직로부터 얻은 지방산 사슬연장효소 유전자가 활성화되어 감마-리놀레닉산(GLA)으로부터 디-호모-감마리놀레닉산(DGLA, C20:3n-6)로 전환이 일어났고, 아라키도닉산(ARA, C20:4n-6) 혹은 에이코사펜타에노익산(EPA, C20:5n-3)의 경우, ARA를 도코사테트라에노익산(DTA, C22:4n-6)로, EPA를 도코사펜타에노익산(DPA, C22:5n-3)로 전환시켰다. 이를 통해 본 발명의 갈고리 흰오징어 유래 지방산 사슬연장효소 유전자 BmFAE의 발현으로 불포화지방산의 탄소 사슬 연장을 통해 다른 불포화지방산으로의 전환이 가능함을 확인하였다.In one embodiment of the present invention, the fatty acid chain extender gene obtained from hook squid eye tissue is activated to convert from gamma-linolenic acid (GLA) to di-homo-gammarinonic acid (DGLA, C20: 3n-6). In the case of arachidonic acid (ARA, C20: 4n-6) or eicosapentaenoic acid (EPA, C20: 5n-3), ARA was converted to docosatetraenoic acid (DTA, C22: 4n-6). ), EPA was converted to docosapentaenoic acid (DPA, C22: 5n-3). Through this, it was confirmed that the fatty acid chain extending enzyme gene BmFAE derived from the hook white squid of the present invention can be converted to other unsaturated fatty acids through carbon chain extension of unsaturated fatty acids.

상기 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시키는 단계에 있어서, 얻어진 본 발명의 일 실시예에서 제조된 pYES2-BmFAE를 효모에 도입하는 방법은 당업자에게 공지이며, 예를 들면, 입자 충격법(particle bombardment), 일렉트로포레이션법(electroporation), 형질감염법(transfection) 등이 있으며, 효모를 숙주로 하는 경우, 리튬아세테이트법(lithium acetate method)을 포함할 수 있다.In the step of transforming the host cell with the recombinant vector, a method of introducing pYES2- BmFAE prepared in one embodiment of the present invention into yeast is known to those skilled in the art, for example, particle bombardment , Electroporation, transfection, and the like, and in the case of using the yeast as a host, may include a lithium acetate method.

본 발명에 따른 지방산 사슬연장효소 유전자(BmFAE)를 이용하여 불포화지방산을 합성할 수 있다. 또한 본 발명은 상기 유전자를 이용하여 오메가 지방산과 같은 고도불포화지방산을 생산하는 미생물 또는 식물을 제공하는 효과를 가진다. 구체적으로, 본 발명의 갈고리 흰오징어 유래의 지방산 사슬연장효소 유전자를 유지 작물의 형질전환에 적용하여 부가가치가 높은 농업 소득 작목 개발에 활용할 수 있다.Unsaturated fatty acids can be synthesized using a fatty acid chain extender gene ( BmFAE ) according to the present invention. In another aspect, the present invention has the effect of providing a microorganism or plant that produces polyunsaturated fatty acids, such as omega fatty acids using the gene. Specifically, the fatty acid chain extending enzyme gene derived from hooked white squid of the present invention can be applied to the transformation of oily crops, and can be utilized for the development of high value-added agricultural income crops.

도 1은 장쇄형 오메가3 지방산(DHA) 생합성 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 DHA 생합성 효소 유전자군을 분리하기 위하여 갈고리 흰오징어의 안구조직으로부터 total RNA를 분리하고 (도 2A) cDNA를 합성한 결과를 나타낸 것이다(도 2B).
도 3은 갈고리 흰오징어의 안구조직으로부터 분리된 RNA로 합성한 cDNA를 이용하여 RNA 시퀀싱한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 갈고리 흰오징어 유래의 지방산 사슬연장효소 유전자 염기서열 및 유전자 분리를 PCR로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 지방산 사슬연장효소 유전자 발현 효모 형질전환 운반체 및 상기 효모 발현 운반체 제작을 위해 제한효소 절단 부위를 삽입한 지방산 사슬연장효소 유전자를 나타낸 것이다..
도 6a은 pYES2와 pYES2-BmFAE 형질전환 효모의 기질 LA에 대한 ESA로의 전환을 분석한 지방산 가스크로마토그램이다.
도 6b는 pYES2와 pYES2-BmFAE 형질전환 효모의 기질 ARA에 대한 DTA로의 전환을 분석한 지방산 가스크로마토그램이다.
도 6c은 pYES2와 pYES2-BmFAE 형질전환 효모의 기질 EPA에 대한 DPA로의 전환을 분석한 지방산 가스크로마토그램이다.Figure 1 shows a schematic diagram of long-chain omega-3 fatty acid (DHA) biosynthesis.
Figure 2 shows the result of synthesizing cDNA by separating total RNA from the eye tissue of hooked white squid to separate the DHA biosynthetic enzyme gene group (Fig. 2A) (Fig. 2B).
Figure 3 shows the results of RNA sequencing using cDNA synthesized with RNA isolated from the eye tissue of hooked white squid.
Figure 4 shows the results of PCR confirmed the nucleotide sequence and fatty acid chain extender gene sequence derived from hook white squid.
Figure 5 shows a fatty acid chain extender gene expression yeast transform carrier and a fatty acid chain extender gene inserted with restriction enzyme cleavage site for the production of the yeast expression carrier.
6A is a fatty acid gas chromatogram analyzing the conversion of pYES2 and pYES2- BmFAE transformed yeast to ESA for substrate LA.
6B is a fatty acid gas chromatogram analyzing the conversion of pYES2 and pYES2- BmFAE transformed yeast to DTA for substrate ARA.
6C shows pYES2 and pYES2- BmFAE Fatty acid gas chromatogram analyzing the conversion of the transformed yeast to the substrate EPA to DPA.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples. However, the following examples are merely to illustrate the invention, but the content of the present invention is not limited to the following examples.

실시예Example 1: 갈고리  1: hook 흰오징어White Squid (( BerryteuthisBerryteuthis magistermagister )) 로부터from 지방산 사슬연장효소 유전자 분리 및 염기서열 분석 Fatty Acid Chain Extender Gene Isolation and Sequence Analysis

갈고리 흰오징어( Berryteuthis magister)의 안구조직으로부터 총 RNA(total RNA)를 분리하여 cDNA를 합성하고, RNA 시퀀싱을 실시하였다(도 2). 1억 2000만개 이상의 유전자 단편을 해독하였고(도 3A), 총 해독 정보량은 124억 bp 로서, 신규 유전자를 발굴하기에 충분한 양을 해독하였다(도 3B). Hooked Squid ( Berryteuthis Total RNA (total RNA) was isolated from the eye tissue of the magister ) to synthesize cDNA, and RNA sequencing was performed (FIG. 2). More than 120 million gene fragments were decoded (FIG. 3A), and the total amount of deciphered information was 12.4 billion bp, sufficient to detect new genes (FIG. 3B).

DHA 생합성 효소 유전자 군을 확보하기 위해서 오징어와 같은 두족류에 해당하는 문어에서 유래한 지방산 사슬연장효소 유전자 및 아미노산 서열을 reference(‘15, Albertin CB et al., Nature)로 하여 유전자 및 단백질 수준에서 비교 분석하여, 갈고리 흰오징어 유래 888 bp 크기의 신규 지방산 사슬 연장 효소 유전자(BmFAE)를 분리하였다(도 4), pGEM에 클로닝하여 염기서열 분석을 함으로써, 지방산 사슬연장효소 유전자(BmFAE)임을 확인하였다. 분리된 갈고리 흰오징어 유래 신규 지방상 사슬연장효소 유전자는 상기 문어 유래 지방산 사슬 연장 유전자와 유전자 수준에서 75% 상동성을 보였다. In order to secure the DHA biosynthetic enzyme gene group, fatty acid chain extender genes and amino acid sequences derived from octopus corresponding to cephalopods, such as squids, were compared at the gene and protein levels with reference ('15, Albertin CB et al., Nature) By analyzing, a new fatty acid chain extension enzyme gene ( BmFAE ) having a size of 888 bp derived from hook white squid was isolated (FIG. 4), and cloned into pGEM to perform sequencing to confirm that it was a fatty acid chain extension enzyme gene ( BmFAE ). The isolated aliphatic chain extender gene derived from the hooked squid showed 75% homology with the fatty acid chain extension gene from the octopus.

실시예Example 2: 지방산 사슬연장효소 유전자의 효모( 2: yeast of fatty acid chain extender gene SaccharomycesSaccharomyces cerevisiaecerevisiae )) 발현 형질전환 운반체 제작 및 형질전환 확인Expression transformation carrier production and transformation confirmation

지방산 사슬연장효소 유전자(BmFAE)의 전체 오픈리딩 프레임 (open reading frame, ORF)을 효모 발현 운반체인 pYES2의 제한효소 KpnI 및 XbaI 사이트에 삽입하여 발현운반체를 제작하였다(도 5). 제작된 운반체는 lithium acetate법을 이용하여 S. cerevisiae에 형질 전환되고 uracil이 결핍된 최소배지에서 선발되었다. 선발된 클론은 PCR을 통하여 대조군인 벡터만 있는 pYES2와 비교하여 삽입된 BmFAE 유전자가 있음을 확인하였고 (도 5), 이 클론들을 다시 E. coli에 역 형질 전환하여 올바른 클론임을 확인하였다.The whole open reading frame (ORF) of the fatty acid chain extending enzyme gene ( BmFAE ) was inserted into the restriction enzymes KpnI and XbaI sites of the yeast expression carrier pYES2 to prepare an expression carrier (FIG. 5). The prepared vehicle was selected from minimal media transformed into S. cerevisiae and lacking uracil by lithium acetate method. Selected clones were confirmed to have the inserted BmFAE gene compared to pYES2 containing only the control vector by PCR (FIG. 5), and the clones were back transformed into E. coli to confirm that they were correct clones.

실시예Example 3: 지방산 사슬연장효소 유전자 형질전환 효모의 탄소 사슬 C18로부터 C22로까지의 사슬 연장 확인 3: Identification of chain extension from carbon chain C18 to C22 of fatty acid chain extender gene transgenic yeast

지방산 사슬연장효소 유전자(BmFAE )가 삽입된 효모(pYES2-BmFAE)를 이용한 BmFAE 유전자의 기능을 확인하기 위하여 우라실 결핍 및 라피노스/갈락토스를 첨가한 배지에서 28℃ 조건으로 종균 배양(seed culture)하였다. 종균 배양액을 새로운 배지에 최종농도 OD600=0.4가 되도록 계대하고 기질인 리놀레익산(LA, C18:2 n-6), 감마-리놀레익산(GLA, C18:3 n-6) 또는 아라키도닉산(ARA, C20:4, n-6)을 각각 최종 농도 0.5 mM 되게 첨가하고, 기질이 배지에 잘 융합하도록 0.1%(v/v) 테르지톨(tergitol) NP-40을 첨가하였다. 20℃에서 3일간, 15℃에서 3일간 공동배양하여 추가된 기질로부터 새로운 산물로의 전환을 유도하였다. 대조구는 pYES2 운반체만 형질전환된 효모를 이용하였다. In order to confirm the function of the BmFAE gene using the yeast (pYES2- BmFAE ) into which the fatty acid chain extending enzyme gene ( BmFAE ) was inserted, seed culture was performed at 28 ° C. in a medium containing uracil deficiency and raffinose / galactose. The seed cultures are passaged in fresh medium to a final concentration of OD 600 = 0.4 and the substrate linoleic acid (LA, C18: 2 n-6), gamma-linoleic acid (GLA, C18: 3 n-6) or arachidonic Acids (ARA, C20: 4, n-6) were each added to a final concentration of 0.5 mM and 0.1% (v / v) tergitol NP-40 was added to allow the substrate to fuse well to the medium. Three days of co-culture at 20 ° C. and three days at 15 ° C. resulted in the conversion of the added substrate to the new product. The control group used yeast transformed with only the pYES2 carrier.

갈고리 흰오징어 안구조직으로부터 얻은 지방산 사슬연장효소 활성을 확인하기 위하여 피딩 테스트(feeding test)를 하였다. A feeding test was performed to confirm the fatty acid chain extending enzyme activity obtained from hook squid eye tissue.

먼저, pYES2-BmFAE와 대조군 pYES2을 포함하는 효모 형질전환체를 2% 갈락토오스를 함유하는 배양액에 탄소 사슬 18개인 리놀레익산(LA, C18:2n-6) 또는 감마-리놀레닉산(GLA, C18:3n-6)를 첨가하여 유전자 발현에 의한 첨가된 지방산의 사슬연장을 분석하였다. 도 6a, 6b, 7 및 표 1에 나타난 것과 같이, 그 결과 pYES2-BmFAE는 리놀레익산(LA) 또는 감마-리놀레닉산(GLA, C18:3n-6)로부터 에이코사디에노익 산, C20:2n-8) 또는 디-호모-감마리놀레닉산(DGLA, C20:3n-6)로 전환이 일어났고(도 6b), 생성물 에이코사디에노익 산 및 DGLA로 각각 35.5% 및 4%의 기질 전환율을 보였다.First, yeast transformants containing pYES2- BmFAE and control pYES2 were linoleic acid with 18 carbon chains (LA, C18: 2n-6) or gamma-linolenic acid (GLA, C18) in a culture medium containing 2% galactose. : 3n-6) was added to analyze chain extension of added fatty acids by gene expression. As shown in Figures 6A, 6B, 7 and Table 1, the resulting pYES2- BmFAE was determined from eicosadienoic acid, C20: from linoleic acid (LA) or gamma-linolenic acid (GLA, C18: 3n-6). 2n-8) or conversion to di-homo-gammarinolenic acid (DGLA, C20: 3n-6) occurred (FIG. 6b) and substrate conversion rates of 35.5% and 4% with product eicosadienoic acid and DGLA, respectively. Showed.

pYES2-BmFAE와 대조군 pYES2을 포함하는 효모 형질전환체를 2% 갈락토오스를 함유하는 배양액에 탄소 사슬 18개인 감마-리놀레닉산(GLA, C18:3n-6)를 첨가하여 유전자 발현에 의한 첨가된 지방산의 사슬연장을 분석하였다. 도 6b, 7 및 표 1에 나타난 것과 같이, 그 결과 pYES2-BmFAE는 GLA로부터 디-호모-감마리놀레닉산(DGLA, C20:3n-6)로 전환이 일어났고(도 6b), 생성물 DGLA로 4%의 기질 전환율을 보였다.Fatty acid added by gene expression by adding 18-carbon gamma-linolenic acid (GLA, C18: 3n-6) to a culture medium containing 2% galactose in a yeast transformant containing pYES2- BmFAE and control pYES2 The chain extension of was analyzed. As shown in Figures 6B, 7 and Table 1, the result was that pYES2- BmFAE was converted from GLA to di-homo- gammarinolenic acid (DGLA, C20: 3n-6) (Figure 6B) and to product DGLA. The substrate conversion was 4%.

pYES2-BmFAE에 대한 탄소사슬 20개에 대한 기질 검정 실험을 하였다. 기질 아라키도닉산(ARA, C20:4n-6)을 넣어 주었을 때 pYES2-BmFAE 효모 형질전환체는 지방산 사슬연장효소 활성을 나타내어 기질 ARA를 도코사테트라에노익산(DTA, C22:4n-6) (도 6c)로 전환시켰다. 다시 표 1을 보면, DTA로 15,5%의 지방산사슬연장 전환율을 보였다. Substrate assay experiments were carried out on 20 carbon chains for pYES2- BmFAE . When the substrate arachidonic acid (ARA, C20: 4n-6) was added, the pYES2- BmFAE yeast transformant exhibited fatty acid chain extender activity, thereby converting the substrate ARA to docosatetraenoic acid (DTA, C22: 4n-6). (FIG. 6C). Looking back at Table 1, DTA showed 15,5% fatty acid chain extension conversion.

substratesubstrate ProductProduct Conversion rate(%4)Conversion rate (% 4) pYESpYES LA 6364.5LA 6364.5 에이코사디에노익 산 0Eicosadienoic Mountain 0 0%0% GLA 1643.2GLA 1643.2 DGLA 0DGLA 0 0%0% pYES2-BmFAE pYES2- BmFAE LA 4324.9LA 4324.9 에이코사디에노익 산 2521.9Eicosadienoic Mountain 2521.9 35.5%35.5% GLA 3090.9GLA 3090.9 DGLA309.5DGLA309.5 4%4%

이상 살펴본 바와 같이, 지방산 사슬연장효소 유전자를 효모발현 운반체인 pYES2의 갈락토오스 유도 프로모터의 조절을 받도록 운반체(pYES2-BmFAE)를 제작하여 효모에 형질전환하고 기질인 LA, GLA 또는 ARA를 첨가하여 배양했을 때, 대조구에서는 생합성되지 않는 ESA, DGLA 또는 DTA가 각각 합성되어짐을 확인하였다.As described above, the fatty acid chain extender gene was constructed to carry a carrier (pYES2- BmFAE ) under the control of the galactose-induced promoter of the yeast expression carrier pYES2, and transformed into yeast and cultured with the addition of the substrate LA, GLA or ARA. In the control group, ESA, DGLA or DTA was not synthesized, respectively.

<110> Republic of Korea <120> FATTY ACID CHAIN ELONGASE GENE FROM Berryteuthis magister AND USES THEREOF <130> P17R12C1755 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 888 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Berryteuthis magister <400> 1 atggcgaacg ttatacaagc catcatgcaa aagattgact atacagagca ttctatgtca 60 gatcctcgaa caaaagattg gtttcttata gagaacaacc ctataagagt atggtgcctc 120 actgccttat acattctatt tgttatatat ggaccaaaat tcatgcaaaa acggagaccc 180 tatgacttac ggatctttat gatgctctac aatctttcaa tggtcgtctt atctttatat 240 atgtttgttg agattatatt gagtacacaa gccttggatt acaaagttgt ttgttcagct 300 tattcaaaaa agagtatcca gaacccaaaa gagatgaggt tggctaaagt tctgtggtgg 360 tatttctttt ccaaagccct tgaactcatg gatacagttc tgatgatcct acgaaagaaa 420 catgatcaag tatctttcct gcatgtcttt catcatgcga ccatgttgaa tatttggtgg 480 tgggtcatga tgtttatccc tggaggacaa tcctggtttg gtgcatgtct aaactgcttc 540 atccatgttg ttatgtacag ctattatggc ctatctgcag tcccttcact ccgtggaaaa 600 ttatggtgga aaaagtatat taccagattg caattgatcc agttctgcat cacatttgtg 660 cactcagcca attctatgcg agtccaatgt gagtttcctc attggggcga gtgtttgtta 720 acaggctaca tggtcttcat ggtcattctc ttcagcaatt tctacattca ggcatacatt 780 aaaggcaggc ggaaccccaa attgcaacaa gaacaatcgc agaagcaaaa gaaaaaacaa 840 aatgcgcaaa atggcaacat gaacggcaca gtcaagaaaa cccattaa 888 <210> 2 <211> 295 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Berryteuthis magister <400> 2 Met Ala Asn Val Ile Gln Ala Ile Met Gln Lys Ile Asp Tyr Thr Glu 1 5 10 15 His Ser Met Ser Asp Pro Arg Thr Lys Asp Trp Phe Leu Ile Glu Asn 20 25 30 Asn Pro Ile Arg Val Trp Cys Leu Thr Ala Leu Tyr Ile Leu Phe Val 35 40 45 Ile Tyr Gly Pro Lys Phe Met Gln Lys Arg Arg Pro Tyr Asp Leu Arg 50 55 60 Ile Phe Met Met Leu Tyr Asn Leu Ser Met Val Val Leu Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Met Phe Val Glu Ile Ile Leu Ser Thr Gln Ala Leu Asp Tyr Lys Val 85 90 95 Val Cys Ser Ala Tyr Ser Lys Lys Ser Ile Gln Asn Pro Lys Glu Met 100 105 110 Arg Leu Ala Lys Val Leu Trp Trp Tyr Phe Phe Ser Lys Ala Leu Glu 115 120 125 Leu Met Asp Thr Val Leu Met Ile Leu Arg Lys Lys His Asp Gln Val 130 135 140 Ser Phe Leu His Val Phe His His Ala Thr Met Leu Asn Ile Trp Trp 145 150 155 160 Trp Val Met Met Phe Ile Pro Gly Gly Gln Ser Trp Phe Gly Ala Cys 165 170 175 Leu Asn Cys Phe Ile His Val Val Met Tyr Ser Tyr Tyr Gly Leu Ser 180 185 190 Ala Val Pro Ser Leu Arg Gly Lys Leu Trp Trp Lys Lys Tyr Ile Thr 195 200 205 Arg Leu Gln Leu Ile Gln Phe Cys Ile Thr Phe Val His Ser Ala Asn 210 215 220 Ser Met Arg Val Gln Cys Glu Phe Pro His Trp Gly Glu Cys Leu Leu 225 230 235 240 Thr Gly Tyr Met Val Phe Met Val Ile Leu Phe Ser Asn Phe Tyr Ile 245 250 255 Gln Ala Tyr Ile Lys Gly Arg Arg Asn Pro Lys Leu Gln Gln Glu Gln 260 265 270 Ser Gln Lys Gln Lys Lys Lys Gln Asn Ala Gln Asn Gly Asn Met Asn 275 280 285 Gly Thr Val Lys Lys Thr His 290 295 <110> Republic of Korea <120> FATTY ACID CHAIN ELONGASE GENE FROM Berryteuthis magister AND          USES THEREOF <130> P17R12C1755 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 888 <212> DNA <213> Unknown <220> Berryteuthis magister <400> 1 atggcgaacg ttatacaagc catcatgcaa aagattgact atacagagca ttctatgtca 60 gatcctcgaa caaaagattg gtttcttata gagaacaacc ctataagagt atggtgcctc 120 actgccttat acattctatt tgttatatat ggaccaaaat tcatgcaaaa acggagaccc 180 tatgacttac ggatctttat gatgctctac aatctttcaa tggtcgtctt atctttatat 240 atgtttgttg agattatatt gagtacacaa gccttggatt acaaagttgt ttgttcagct 300 tattcaaaaa agagtatcca gaacccaaaa gagatgaggt tggctaaagt tctgtggtgg 360 tatttctttt ccaaagccct tgaactcatg gatacagttc tgatgatcct acgaaagaaa 420 catgatcaag tatctttcct gcatgtcttt catcatgcga ccatgttgaa tatttggtgg 480 tgggtcatga tgtttatccc tggaggacaa tcctggtttg gtgcatgtct aaactgcttc 540 atccatgttg ttatgtacag ctattatggc ctatctgcag tcccttcact ccgtggaaaa 600 ttatggtgga aaaagtatat taccagattg caattgatcc agttctgcat cacatttgtg 660 cactcagcca attctatgcg agtccaatgt gagtttcctc attggggcga gtgtttgtta 720 acaggctaca tggtcttcat ggtcattctc ttcagcaatt tctacattca ggcatacatt 780 aaaggcaggc ggaaccccaa attgcaacaa gaacaatcgc agaagcaaaa gaaaaaacaa 840 aatgcgcaaa atggcaacat 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                165 170 175 Leu Asn Cys Phe Ile His Val Val Met Tyr Ser Tyr Tyr Gly Leu Ser             180 185 190 Ala Val Pro Ser Leu Arg Gly Lys Leu Trp Trp Lys Lys Tyr Ile Thr         195 200 205 Arg Leu Gln Leu Ile Gln Phe Cys Ile Thr Phe Val His Ser Ala Asn     210 215 220 Ser Met Arg Val Gln Cys Glu Phe Pro His Trp Gly Glu Cys Leu Leu 225 230 235 240 Thr Gly Tyr Met Val Phe Met Val Ile Leu Phe Ser Asn Phe Tyr Ile                 245 250 255 Gln Ala Tyr Ile Lys Gly Arg Arg Asn Pro Lys Leu Gln Gln Glu Gln             260 265 270 Ser Gln Lys Gln Lys Lys Lys Gln Asn Ala Gln Asn Gly Asn Met Asn         275 280 285 Gly Thr Val Lys Lys Thr His     290 295

Claims (12)

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 갈고리 흰오징어(Berryteuthis magister) 유래의 지방산 사슬연장효소 단백질.
 Hooked squid consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 magister ) fatty acid chain extender protein.
제 1항의 단백질을 코딩하는 유전자.
Gene encoding the protein of claim 1.
제 2항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것인 유전자.
According to claim 2, wherein the gene is a gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
제 2항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
Recombinant vector comprising the gene of claim 2.
제 4항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
A host cell transformed with the recombinant vector of claim 4.
제 5항에 있어서, 상기 숙주세포는 효모 또는 식물세포인 형질전환된 숙주세포.
The transformed host cell of claim 5, wherein the host cell is a yeast or plant cell.
서열번호 1의 염기서열로 이루어진 갈고리 흰오징어(Berryteuthis magister) 유래의 지방산 사슬연장효소 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는, 숙주세포에서 불포화 지방산의 생산 방법.
A method of producing an unsaturated fatty acid in a host cell, comprising transforming the host cell with a recombinant vector comprising a fatty acid chain extender gene derived from a berry squid consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
제 7항에 있어서,
상기 불포화지방산은 감마-리놀레익산(gamma-linolenic acid, GLA)의 탄소 사슬이 연장되어 생산된 디-호모-감마리놀레익산(di-homo-gamma linolenic acid, DGLA)인 불포화지방산의 생산 방법.
The method of claim 7, wherein
The unsaturated fatty acid is a di-homo-gamma linolenic acid (DGLA) produced by extending the carbon chain of gamma-linolenic acid (GLA). .
제 7항에 있어서, 상기 불포화지방산은 아라키도닉산(arachidonic acid, ARA)의 탄소 사슬이 연장되어 생산된 도코사테트라에노익산(docosatetraenoic acid, DTA)인 불포화지방산의 생산 방법.
The method of claim 7, wherein the unsaturated fatty acid is docosatetraenoic acid (DTA) produced by extending the carbon chain of arachidonic acid (ARA).
제 7항에 있어서, 상기 불포화지방산은 에이코사펜타에노익산(eicosapentaenoic acid, EPA)의 탄소 사슬이 연장되어 생산된 도코사펜타에노익산(docosapentaenoic acid, DPA)인 불포화지방산의 생산 방법.
The method of claim 7, wherein the unsaturated fatty acid is docosapentaenoic acid (DPA) produced by extending the carbon chain of eicosapentaenoic acid (EPA).
제 7항에 있어서, 상기 불포화지방산은 리놀레익산(Linoleic acid, LA)의 탄소 사슬이 연장되어 생산된 에이코사디에노익 산(Eicosadienoic acid)인 불포화지방산의 생산 방법.
The method of claim 7, wherein the unsaturated fatty acid is Eicosadienoic acid produced by extending the carbon chain of linoleic acid (LA).
제 7항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주세포는 효모 또는 식물세포인 방법.
The method of claim 7, wherein the host cell is a yeast or plant cell.
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