KR102047061B1 - Double coded microdisk and multiplexed bioassay using it - Google Patents

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Abstract

본 발명은 분광 표지 및 시각적으로 인식 가능한 그래픽 표지를 가진 이중 표지 마이크로 디스크, 및 그를 이용한 복수의 타겟 바이오물질의 검출방법에 관한 것으로, 그래픽 표지 입자 크기를 줄이면서 라만 산란 표지와 이중으로 사용하고, 또한 타겟 바이오물질과 결합 가능한 리셉터를 그래픽 표지 입자 외에 별도의 마이크로 비드에 결합시킴으로써, 다중 검출방법에 활용하기에 제한점이 되었던 그래픽 입자의 크기 문제를 해결하여, 복수의 타겟 바이오물질의 검출이 가능하게 한다.The present invention relates to a dual-label micro disk having a spectroscopic label and a visually recognizable graphic label, and a method for detecting a plurality of target biomaterials using the same, wherein the graphic label particle size is used in combination with a Raman scattering label, In addition, by attaching a receptor capable of binding to a target biomaterial to a separate microbead in addition to the graphic labeling particles, the size problem of graphic particles, which has been a limitation for use in multiple detection methods, is solved, thereby enabling the detection of a plurality of target biomaterials. do.

Description

이중 표지 마이크로 디스크 및 그를 이용한 다중 검출방법{Double coded microdisk and multiplexed bioassay using it}Double coded microdisk and multiplexed bioassay using it}

타겟 바이오물질의 검출방법, 특히 복수의 타겟 바이오물질의 다중 검출방법 및 그에 이용되는 이중 표지 마이크로 디스크에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for detecting a target biomaterial, and in particular, to a method for multiple detection of a plurality of target biomaterials and a double-labeled micro disc used therein.

생체 내에 존재하는 다양한 바이오물질들은 생체 표지자로서 질병과 관련된 생체지표, 예를 들어 암표지자 유무 및 농도 분석, 생체 이온 농도, 혈당 수치 등을 포함하고 있다. 생체 표지자의 분석은 개인의 건강 상태를 종합적으로 모니터링 할 수 있으며 새로운 신약 후보 물질을 탐색하고 개발하는 연구에도 활용되고 있다. 그러나 체내에 존재하는 생체 표지자들은 그 종류가 매우 많기 때문에, 한 번에 하나의 물질만을 검출하는 기존의 방법에는 분명한 한계가 있다. 따라서 생체 표지자들의 발현, 분포 등을 종합적으로 연구하기 위해서 한 번의 분석으로 여러 종류의 생체 표지자들을 검출할 수 있는 다중 분석(Multiplex Analysis) 또는 다중 검출 기술의 개발이 요구되며, 다중 분석을 위한 미세입자로써, 서로 다른 종류의 신호를 발생시키는 다중 표지 미세입자가 집중적으로 연구되고 있다.Various biomaterials present in the living body are biomarkers and include biomarkers associated with disease, such as cancer marker presence and concentration analysis, bioion concentration, and blood glucose level. Biomarker analysis can be used to comprehensively monitor an individual's health status and to find and develop new drug candidates. However, since there are so many types of biological markers present in the body, there is a clear limitation to the existing method of detecting only one substance at a time. Therefore, in order to comprehensively study the expression and distribution of biomarkers, it is required to develop a multiplex analysis or a multiple detection technique capable of detecting several types of biomarkers in one analysis. As a result, multiple labeled microparticles generating different kinds of signals have been intensively studied.

다중 분석을 위해서는 신호 간 간섭이 없으며, 타겟 물질에 민감하게 반응하는 나노 프로브 및 표지자의 개발이 필요하다. 다중 분석을 가능하게 하는 새로운 개념의 나노 프로브 및 표지자의 개발은 다중 분석 분야에서 핵심 원천 기술로 인정받을 수 있으며, 질병 진단, 진단 시약 탐색 분야에서 파급효과가 매우 클 것으로 예상된다. Multiple analysis requires no signal-to-signal interference and the development of nano probes and markers that are sensitive to the target material. The development of a new concept of nano probes and markers to enable multiple assays could be recognized as a key source technology in the field of multiple assays, and is expected to have a significant impact on disease diagnosis and diagnostic reagent screening.

현재 가장 많이 사용하고 있는 형광 프로브는 밴드 폭이 넓어서 3개 이상의 신호를 구별하기 어려울 뿐 아니라, 체내 자가 발광 현상으로 인한 민감도 저하, 별개의 광원을 사용해야 하는 번거로움 등, 제한 요소가 다수 존재한다. 한편 양자점(Quantum dot)을 프로브 물질로 이용하는 연구도 활발히 진행되고 있지만, 신호의 대역폭이 여전히 넓어서 5개 이상의 신호를 분별하기에는 한계가 있다.The most widely used fluorescent probes have a wide band width, making it difficult to distinguish three or more signals, and there are a number of limiting factors, such as reduced sensitivity due to self-luminescence phenomena in the body and troublesome use of separate light sources. On the other hand, researches using quantum dots as a probe material are being actively conducted, but there is a limit in distinguishing five or more signals due to the wide bandwidth of the signal.

라만 산란 신호는 광학신호의 선(band)폭이 양자점과 비교하여도 약 1/50 정도로 매우 좁아, 다중 검출에 이용될 수 있으며, photo-bleaching이 없고, 하나의 광원으로 다중 표지 검출을 할 수 있어 광학계 구성이 간단하다. 따라서 다중 표지를 위한 미세입자의 개발에는 라만산란을 이용한 표지가 가장 적합하다. 하지만 라만 산란만을 표지 방법으로 이용할 경우 현재까지는 40 개정도 이상의 분리된 신호를 얻을 수는 없다.
The Raman scattering signal has a very narrow band width of about 1/50 even when compared to a quantum dot, so that it can be used for multiple detection, no photo-bleaching, and multiple label detection with one light source. The configuration of the optical system is simple. Therefore, the label using Raman scattering is most suitable for the development of microparticles for multiple labels. However, if only Raman scattering is used as a labeling method, it is not possible to obtain a separate signal of more than 40 revisions to date.

한국공개특허공보 제10-2011-0107498호Korean Patent Publication No. 10-2011-0107498 한국공개특허공보 제10-2010-0046138호Korean Laid-Open Patent Publication No. 10-2010-0046138

본 발명은 그래픽 표지 입자 크기를 줄이면서 타겟 바이오물질의 검출이 용이한 이중 표지 마이크로 디스크를 제공하는 것을 목적으로 한다.It is an object of the present invention to provide a dual labeled micro disc which is easy to detect a target biomaterial while reducing the size of the graphic labeled particles.

본 발명은 상기 이중 표지 마이크로 디스크를 이용한 타겟 바이오물질의 검출방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
An object of the present invention is to provide a method for detecting a target biomaterial using the double labeled micro disk.

본 발명은 하나 이상의 홀(hole)이 형성되어 상기 홀의 개수 및 위치에 따라 시각적으로 인지 가능한 그래픽 표지; 및 표면에 형성되거나 결합되는 라만 산란 표지;를 포함하여 이루어지는 이중 표지 마이크로 디스크를 제공한다.The present invention provides a graphic marker that is formed visually perceptible according to the number and location of one or more holes (hole) formed; And a Raman scattering label formed on or bonded to the surface thereof.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 마이크로 디스크의 개요도로서, 지름 5 ㎛의 마이크로 디스크에 1 내지 1.2 ㎛의 3 개의 홀이 형성되고, 표면에는 20 nm의 요철을 가진 금 나노요철층이 형성되어 있다. 도 1에서 홀 3 개를 최대로 가정하고 홀의 개수와 위치만으로 가능한 그래픽 표지는, 홀이 없는 경우, 홀이 좌측에만 있는 경우, 홀이 중앙에만 있는 경우, 홀이 좌측과 중앙 2 개 있는 경우, 홀이 좌측과 우측 2 개 있는 경우, 및 홀이 3 개 있는 경우로서 총 6 개의 다른 그래픽 표지의 조합이 형성될 수 있고, 홀의 개수는 마이크로 디스크의 너비와 홀의 지름에 따라 더 증가될 수 있고, 홀의 개수 및 위치 뿐만 아니라 마이크로 디스크의 형태가 원, 세모, 네모, 팔각형 등으로 다양하게 형성될 수 있고, 나아가 홀의 형태 역시 원뿐만 아니라 세모, 네모 등으로 형성될 수 있으므로 수많은 그래픽 표지가 형성될 수 있다.1 is a schematic diagram of a micro disk according to an embodiment of the present invention, wherein three holes having a diameter of 1 to 1.2 µm are formed in a micro disk having a diameter of 5 µm, and a gold nano-concave-convex layer having irregularities of 20 nm is formed on a surface thereof. It is. In FIG. 1, a graphic cover that can assume only three holes and only a maximum number of holes and positions is provided in the case that there are no holes, the holes are only at the left side, the holes are only at the center, and the holes are at the left and two centers. If there are two holes left and right, and three holes in total, a combination of six different graphic indicia can be formed, the number of holes can be further increased depending on the width of the micro disc and the diameter of the holes, As well as the number and location of the holes, the shape of the micro disk can be variously formed into circles, triangles, squares, octagons, etc. Furthermore, since the shape of holes can be formed from not only circles but also triangles, squares, etc., numerous graphic signs can be formed. have.

여기에 도 2에서 보듯이 m 개의 그래픽 표지에 라만 산란 표지 n 개를 곱한 수만큼 다중 표지가 형성될 수 있다.As shown in FIG. 2, multiple markers may be formed by multiplying m graphical markers by n Raman scattering markers.

상기 마이크로 디스크의 너비는 3 내지 30 ㎛, 바람직하게는 4 내지 20 ㎛, 더욱 바람직하게는 5 내지 15 ㎛이다. 상기 하한치 미만에서는 다양한 그래픽 표지의 조합을 얻을 수 있는 홀을 형성하기 위한 마이크로 디스크 면적을 확보하기 어렵고, 상기 상한치를 초과하는 경우에는 다중 검출을 위하여 상기 마이크로 디스크를 별도의 마이크로 비드에 결합시키기 어려울 뿐만 아니라, 마이크로 비드에 결합되는 마이크로 디스크의 개수나 그 조합이 줄어든다.The width of the micro disc is 3 to 30 μm, preferably 4 to 20 μm, more preferably 5 to 15 μm. Below the lower limit, it is difficult to secure a micro disk area for forming holes for obtaining various graphic marker combinations, and when the upper limit is exceeded, it is difficult to couple the micro disk to separate micro beads for multiple detection. Rather, the number of microdisks or combinations thereof coupled to the microbeads is reduced.

상기 그래픽 표지는 2차원의 마이크로 디스크에 형성되는 것으로, 마이크로 디스크의 두께에 대한 너비의 비율은 3 내지 30이고, 바람직하게는 3.5 내지 15, 더욱 바람직하게는 4 내지 10 이다. 상기 하한치 미만에서는 얻어지는 그래픽 표지 조합의 수에 비해서 그래픽 표지의 무게가 증가하고, 그래픽 표지가 형성되지 않은 두께에 해당하는 옆면이 마이크로 비드에 결합할 수 있어 신호의 감도가 떨어질 수 있고, 상기 상한치를 초과할 경우 마이크로 디스크의 성형이 어렵고 또한 그래픽 표지를 유지하기 위한 필요한 충분한 강도를 얻기 어렵다.The graphic mark is formed on a two-dimensional micro disc, and the ratio of the width to the thickness of the micro disc is 3 to 30, preferably 3.5 to 15, more preferably 4 to 10. Below the lower limit, the weight of the graphic cover is increased compared to the number of graphic cover combinations obtained, and the side surface corresponding to the thickness at which the graphic cover is not formed may be bonded to the microbead, so that the sensitivity of the signal may be lowered. If exceeded, it is difficult to form the micro disc and obtain sufficient strength necessary to maintain the graphic cover.

상기 홀의 지름은 0.2 내지 5 ㎛, 바람직하게는 0.4 내지 4 ㎛, 더욱 바람직하게는 0.6 내지 2 ㎛이다. 상기 하한치 미만에서는 광학 현미경 또는 전자주사 현미경의 해상도로 인하여 홀의 시각적 인지가 어려울 수 있고, 제조가 용이하지 않으며, 상기 상한치를 초과할 경우 다양한 그래픽 표지의 조합을 얻을 수 있는 홀을 형성하기 위한 마이크로 디스크 면적을 확보하기 어렵다.The diameter of the hole is 0.2 to 5 mu m, preferably 0.4 to 4 mu m, more preferably 0.6 to 2 mu m. Below the lower limit, the resolution of an optical microscope or an electron scanning microscope may make it difficult to visually recognize the hole, and may not be easy to manufacture. If the upper limit is exceeded, a micro disc for forming a hole may be obtained by combining various graphic markers. It is difficult to secure an area.

상기 시각적으로 인지 가능한 그래픽 표지는 그 방법이나 배율을 특별히 한정할 필요는 없으나, 광학 현미경 또는 전자주사현미경의 이미지로 인지 가능하다.The visually recognizable graphic label need not be particularly limited in its method or magnification, but may be recognized as an image of an optical microscope or an electron scanning microscope.

상기 마이크로 디스크의 재질은 실리카로서 테트라에틸 오르소실리케이트(tetraethyl orthosilicate) 및 테트라메틸 오르소실리케이트 (tetramethyl orthosilicate)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상으로부터 제조되는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.The material of the micro disc is preferably made from one or more selected from the group consisting of tetraethyl orthosilicate and tetramethyl orthosilicate as silica, but is not limited thereto.

상기 마이크로 디스크의 표면에 형성되거나 결합된 라만 분광 표지는, 상기 마이크로 디스크 표면에 형성된 금 나노요철층 또는 은 나노요철층이거나, 또는 상기 마이크로 디스크 표면에 결합된 금 나노입자층 또는 은 나노입자층일 수 있다.The Raman spectroscopic label formed or bonded to the surface of the micro disk may be a gold nanoconcave-convex layer or a silver nanoconcave-convex layer formed on the surface of the micro disk, or may be a gold nanoparticle layer or silver nanoparticle layer bonded to the micro disk surface. .

상기 금 나노요철층, 은 나노요철층, 상기 금 나노입자층 또는 은 나노입자층 표면에는 라만 산란 표지물질이 결합될 수 있다.Raman scattering labeling material may be coupled to the surface of the gold nanoconcave-convex layer, the silver nanoconcave-convex layer, the gold nanoparticle layer or the silver nanoparticle layer.

상기 표지물질은 4-머켑토 톨루엔(4-MT), 3,5-디메틸 벤젠티올(3,5-DMT), 티오페놀(TP), 4-아미노 티오페놀(4-ATP), 벤젠티올(BT), 4-브로모 벤젠티올(4-BBT), 2-브로모 벤젠티올(2-BBT), 4-이소프로필 벤젠티올(4-IBT), 2-나프탈렌 티올(2-NT), 3,4-디클로로 벤젠티올(3,4-DCT), 3,5-디클로로 벤젠티올(3,5-DCT), 4-클로로 벤젠티올(4-CBT), 2-클로로 벤젠티올(2-CBT), 2-플루오로 벤젠티올(2-FBT), 4-플루오로 벤젠티올(4-FBT), 4-메톡시 벤젠티올(4-MOBT), 3,4-디메톡시 벤젠티올(3,4-DMOBT), 2-머켑토 피리미딘(2-MPY), 2-머켑토-1-메틸 이미다졸(2-MMI), 2-머켑토-5-메틸 벤즈이미다졸(2-MBI), 2-아미노-4-(트리플루오로메틸) 벤젠티올(2-ATFT), 벤질 머켑탄(BZMT), 벤질 디설파이드(BZDSF), 2-아미노-4-클로로 벤젠티올(2-ACBT), 3-머켑토 벤조산(3-MBA), 1-페닐테트라졸-5-티올(1-PTET), 5-페닐-1,2,3-트리아졸-3-티올(5-PTRT), 2-아이오도아닐린(2-IAN), 페닐 이소티오시아네이트(PITC), 4-니트로페닐 디설파이드(4-NPDSF), 4-아지도-2-브로모아세토페논(ABAPN) 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 금 나노요철층, 은 나노요철층, 상기 금 나노입자층 또는 은 나노입자층과 결합력이 높은 화학물질이면 제한되지 않고 사용될 수 있다. The labeling substance is 4-mercotto toluene (4-MT), 3,5-dimethyl benzenethiol (3,5-DMT), thiophenol (TP), 4-amino thiophenol (4-ATP), benzenethiol ( BT), 4-bromo benzenethiol (4-BBT), 2-bromo benzenethiol (2-BBT), 4-isopropyl benzenethiol (4-IBT), 2-naphthalene thiol (2-NT), 3 , 4-dichloro benzenethiol (3,4-DCT), 3,5-dichloro benzenethiol (3,5-DCT), 4-chloro benzenethiol (4-CBT), 2-chloro benzenethiol (2-CBT) , 2-fluoro benzenethiol (2-FBT), 4-fluoro benzenethiol (4-FBT), 4-methoxy benzenethiol (4-MOBT), 3,4-dimethoxy benzenethiol (3,4- DMOBT), 2-mercetopyrimidine (2-MPY), 2-merceto-1-methyl imidazole (2-MMI), 2-merceto-5-methyl benzimidazole (2-MBI), 2- Amino-4- (trifluoromethyl) benzenethiol (2-ATFT), benzyl mertantan (BZMT), benzyl disulfide (BZDSF), 2-amino-4-chloro benzenethiol (2-ACBT), 3-mersanto Benzoic acid (3-MBA), 1-phenyltetrazol-5-thiol (1-PTET), 5-phenyl-1,2,3-triazole-3-thiol (5-PTRT), 2-io Any one selected from the group consisting of aniline (2-IAN), phenyl isothiocyanate (PITC), 4-nitrophenyl disulfide (4-NPDSF), 4-azido-2-bromoacetophenone (ABAPN), and the like. Although it is preferable that the above, gold nano-concave-convex layer, silver nano-concave-convex layer, the gold nano-particle layer or silver nano-particle layer can be used without limitation as long as the chemical material has a high bonding strength.

상기 금 나노요철층, 은 나노요철층, 상기 금 나노입자층 또는 은 나노입자층과 결합력이 높은 화학물질은 말단에 티올기(-SH), 아민기(-NH2), 시아나이드기(-CN), 이소시아나이드(-CNO), 이소티오시아나이드(-CNS), 다이설파이드(-SS-) 또는 아자이드기(-N3) 등이 존재하는 화학물질을 의미한다.The chemical substance having high bonding strength with the gold nanoconcave-convex layer, the silver nanoconcave-convex layer, the gold nanoparticle layer or the silver nanoparticle layer has a thiol group (-SH), an amine group (-NH 2 ), and a cyanide group (-CN) , Isocyanide (-CNO), isothiocyanide (-CNS), disulfide (-SS-) or azide group (-N 3 ) means a chemical present.

상기 표지물질이 결합된 금 나노요철층, 은 나노요철층, 금 나노입자층 또는 은 나노입자층은 실리카, 고분자 및 단백질 중에서 선택되는 어느 하나 이상으로 껍질층으로 둘러싸여 있다. 껍질층으로는 실리카뿐만 아니라 고분자 및 단백질 등도 포함될 수 있다. 고분자의 경우 친수성 고분자이면 특별히 한정할 필요는 없으나, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌이민, 폴리비닐알코올 등의 합성 고분자 또는 셀룰로오스, 셀루로오스 유도체, 히아룰론산, 아르기닐산, 키토산 천연 고분자 등도 사용될 수 있고, 단백질로는 알부민, 스트랩타비딘 등이 사용될 수 있다. 상기 껍질층은 하나 이상의 껍질이 적층된 형태일 수 있다. 상기 껍질로 인하여 이중 표지 마이크로 디스크의 안정성이 증대되고, 물에 대한 용해성이 증대되며, 비특이적인 결합을 방지하고, 자가 형광을 제거할 수 있으며, 이중 표지 마이크로 디스크의 제어되지 않는 응집을 억제하고, 표지물질의 누출이나 이중 표지 마이크로 디스크 표면에 원치 않는 화합물의 흡착을 억제할 수 있으며, 특정 물질과 결합하는 리간드나 기능기를 도입할 수 있다.The gold nanoconcave-convex layer, the silver nanoconcave-convex layer, the gold nanoparticle layer, or the silver nanoparticle layer, to which the labeling substance is bound, is surrounded by a shell layer with at least one selected from silica, polymer, and protein. The shell layer may include not only silica but also polymers and proteins. The polymer is not particularly limited as long as it is a hydrophilic polymer. For example, synthetic polymers such as polyvinylpyrrolidone, polyethyleneimine, and polyvinyl alcohol or cellulose, cellulose derivatives, hyaluronic acid, arginyl acid, chitosan natural Polymers may also be used, and albumin, straptavidin, and the like may be used as the protein. The shell layer may have a form in which one or more shells are stacked. The shell increases the stability of the double labeled microdisks, increases their solubility in water, prevents nonspecific binding, eliminates autofluorescence, inhibits uncontrolled aggregation of the double labeled microdisks, It is possible to suppress the leakage of labeling material or the adsorption of unwanted compounds on the surface of the dual labeling micro disk, and to introduce ligands or functional groups that bind to specific materials.

상기 실리카 껍질은 실리카 전구 물질, 즉 테트라에틸 오르소실리케이트 또는 테트라메틸 오르소실리케이트로부터 제조될 수 있고, 두께는 5 내지 10 nm인 것이 바람직하다. 상기 실리카 껍질의 두께가 5nm 미만으로 너무 얇게 되면 표지물질이 코팅된 은 나노입자 층을 외부의 환경으로부터 보호해 줄 수 없고, 10 nm를 초과하게 되면 세포나 생체 조직 등의 생물학적 응용시 제약이 될 수 있는 문제점이 있기 때문에 상기 범위의 두께로 조절하는 것이 바람직하다.The silica shell can be prepared from a silica precursor, ie tetraethyl orthosilicate or tetramethyl orthosilicate, with a thickness of 5 to 10 nm. If the thickness of the silica shell is too thin, less than 5nm can not protect the layer of silver nanoparticles coated with the label from the outside environment, if it exceeds 10nm it will be a restriction in biological applications such as cells or biological tissues Since there is a problem that can be adjusted to the thickness of the above range is preferable.

상기 껍질층은 표면에 전하를 띄거나, 또는 표면에 아미노기, 아민기, 암모늄기, 하이드록시기, 카르복실기, 에폭시기, 이소시아네이트기 및 숙신이미딜에스터기 중에서 선택되는 기능기가 결합되는 것이, 마이크로 비드와 결합시키기 용이하다는 점에서 바람직하다.The shell layer has a charge on the surface, or a functional group selected from amino group, amine group, ammonium group, hydroxy group, carboxyl group, epoxy group, isocyanate group and succinimidyl ester group is combined with the microbead on the surface It is preferable at the point which is easy to make.

또한 본 발명은 타겟 바이오물질에 결합 가능한 리셉터가 작용기를 통해 표면에 결합된 마이크로 비드에, 상기 타겟 바이오물질에 따라 상기 마이크로 비드의 식별이 가능하도록 상기 본 발명의 이중 표지 마이크로 디스크를 결합시키는 단계; 상기 이중 표지 마이크로 디스크가 결합된 마이크로 비드의 리셉터와 타겟 바이오물질을 유체 상태에서 반응시키거나 결합시키는 단계; 및 상기 타겟 바이오물질과 반응하거나 결합된 상기 이중 표지 마이크로 디스크가 결합된 마이크로 비드를 라만 산란과, 광학 현미경 또는 전자주사현미경을 이용한 시각적 이미지를 조합하여 검출하는 단계;를 포함하는 이중 표지 마이크로 디스크의 그래픽 표지 및 라만 분광 표지의 조합을 통한 복수의 표적 바이오물질의 다중 검출방법을 제공한다.In another aspect, the present invention comprises the steps of binding the dual-labeled micro-disc of the present invention to the microbeads, wherein the receptor capable of binding to the target biomaterial is bound to the surface through a functional group, so that the microbeads can be identified according to the target biomaterial; Reacting or binding the receptor of the microbead to which the dual label micro disk is bound and the target biomaterial in a fluid state; And detecting the microbeads to which the double-labeled microdisks reacted with or coupled to the target biomaterial are combined, using Raman scattering and a visual image using an optical microscope or an electron scanning microscope. Provided are multiple detection methods of a plurality of target biomaterials through a combination of graphical labels and Raman spectroscopic labels.

상기 마이크로 비드는 일반적으로 생물학적 샘플의 성분에 대해 불활성인 고분자로 이루어진다; 이들은 고체이며 샘플에 불용성이다. 사용 가능한 고분자는 예를 들어, 폴리스티렌, 폴리에틸렌글리콜 및 폴리에틸렌글리콜이 함유된 폴리스티렌, 폴리에스테르, 폴리에테르, 폴리올레핀, 폴리아미드, 폴리사카라이드, 폴리우레탄 또는 셀룰로오스일 수 있다. 또한 비드의 통합성 및 구조를 위해 결합제를 사용할 수도 있다.The microbeads generally consist of a polymer that is inert to the components of the biological sample; These are solid and insoluble in the sample. Polymers that can be used can be, for example, polystyrene, polyethylene glycol and polystyrene, polyesters, polyethers, polyolefins, polyamides, polysaccharides, polyurethanes or celluloses containing polyethylene glycol. Binders may also be used for the integrity and structure of the beads.

상기 마이크로 비드에 작용기를 도입하여 타겟 바이오물질을 결합 또는 반응하게 할 수 있다. 이들 작용기는 아미노기, 아민기, 암모늄기, 하이드록시기, 카르복실기, 에폭시기, 이소시아네이트기 및 숙신이미딜에스터기일 수 있다. 폴리올레핀에 카르복실기를 도입하는데 가장 자주 사용되는 모노머는 아크릴산 또는 메타크릴산이다.A functional group may be introduced into the microbeads to bind or react with the target biomaterial. These functional groups may be amino groups, amine groups, ammonium groups, hydroxyl groups, carboxyl groups, epoxy groups, isocyanate groups and succinimidyl ester groups. The monomers most often used to introduce carboxyl groups into polyolefins are acrylic acid or methacrylic acid.

상기 마이크로 비드 표면에 마이크로 디스크의 부착은 정전기적 인력, 친화성 인력, 소수성 인력 또는 공유결합 등으로 수행될 수 있다.Attachment of the micro disk to the surface of the microbead may be performed by electrostatic attraction, affinity attraction, hydrophobic attraction or covalent bonding.

상기 마이크로 비드 하나에 5 내지 1000 개, 바람직하게는 20 내지 600 개, 더욱 바람직하게는 50 내지 300 개의 본 발명의 이중 표지 마이크로 디스크가 결합되도록 농도를 조절하는 것이 바람직하다.It is preferable to adjust the concentration so that 5 to 1000, preferably 20 to 600, more preferably 50 to 300, double-labeled micro discs of the present invention are bound to one microbead.

타겟 바이오물질의 다중 검출을 위해서, 그래픽 표지의 수 및 라만 산란 표지의 수 뿐만 아니라, 상기 마이크로 비드에 결합되는 복수개의 이중 표지 마이크로 디스크의 조합을 달리하여 각각의 마이크로 비드를 식별할 수 있으므로, 다중 표지 가능한 수는 더욱 증대될 수 있다.For multiple detection of target biomaterials, each microbead can be identified by varying the number of graphical labels and the number of Raman scattering labels as well as the combination of a plurality of dual labeled microdisks bound to the microbeads. The labelable number can be further increased.

상기 마이크로 비드는 통상 구형의 입자로서 지름이 상기 마이크로 디스크 너비의 10 내지 100 배, 바람직하게는 15 내지 50 배, 더욱 바람직하게는 20 내지 40 배이다. 상기 하한치 미만에서는 다중 검출을 위하여 상기 마이크로 디스크를 별도의 마이크로 비드에 결합시키기 어려울 뿐만 아니라, 마이크로 비드에 결합되는 마이크로 디스크의 개수나 그 조합이 줄어들고, 상기 상한치를 초과하면 무게가 증가하여 유체 상태에서 현탁시켜 다중 검출에 적용하기 오히려 불리하다. 또한 이를 위하여 마이크로 비드의 크기는 30 내지 1000 ㎛, 바람직하게는 50 내지 600 ㎛, 더욱 바람직하게는 100 내지 300 ㎛이다. The microbeads are usually spherical particles having a diameter of 10 to 100 times, preferably 15 to 50 times, more preferably 20 to 40 times the width of the micro disc. Below the lower limit, not only is it difficult to couple the micro disks to separate micro beads for multiple detection, but the number or combination of micro disks coupled to the micro beads is reduced, and when the upper limit is exceeded, the weight increases to increase the weight in the fluid state. It is rather disadvantageous to suspend and apply to multiple detections. Also for this purpose the size of the microbeads is 30 to 1000 μm, preferably 50 to 600 μm, more preferably 100 to 300 μm.

상기 타겟 바이오물질은 펩타이드, 펩토이드, 사이클릭펩타이드, 사이클릭펩토이드, PNA(Peptide Nucleic Acid), 효소, 단백질, 핵산, 아미노산, 올리고당, 세포, 암세포, 암줄기세포, 항원 및 압타머 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.The target biomaterial is a peptide, peptoid, cyclic peptide, cyclic peptide, PNA (Peptide Nucleic Acid), enzymes, proteins, nucleic acids, amino acids, oligosaccharides, cells, cancer cells, cancer stem cells, antigens and aptamers It may be any one or more selected.

상기 타겟 바이오물질에 결합할 수 있는 리셉터는 펩타이드, 펩토이드, 효소기질, 리간드, 아미노산, 단백질, 핵산, 지질, 코펙터, 탄수화물 및 항체 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.The receptor capable of binding to the target biomaterial may be any one or more selected from peptides, peptoids, enzyme substrates, ligands, amino acids, proteins, nucleic acids, lipids, cofactors, carbohydrates, and antibodies.

상기 마이크로 비드와 리셉터를 결합시키기 위한 작용기는 아민기, 카르복시기 및 티올기 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
The functional group for coupling the microbead and the receptor may be any one or more selected from amine groups, carboxyl groups and thiol groups.

본 발명은 광학 신호의 선폭이 좁고 포토 블리칭(photo-bleaching)이 없는 라만 산란 표지 및 시각적으로 인식 가능한 그래픽 표지를 가진 이중 표지 마이크로 디스크를 타겟 바이오물질의 검출방법에 적용함으로써, 다중 표지 가능한 개수를 라만 산란 표지의 수와 그래픽 표지의 수의 곱만큼 다중 표지 가능한 수를 늘릴 수 있고, 나아가 타겟 바이오물질과 결합 가능한 리셉터를 그래픽 표지 입자 외에 별도의 마이크로 비드에 결합시킴으로써 마이크로 비드에 결합된 이중 표지 마이크로 디스크의 조합에 따라 다중 표지 가능한 수를 더 늘릴 수 있다.
The present invention provides a method for detecting a target biomaterial by applying a dual-labeled micro disk having a Raman scattering label and a visually recognizable graphic label having a narrow line width of an optical signal and no photo-bleaching. The number of multiple labels can be increased by the product of the number of Raman scattering labels and the number of graphic labels, and furthermore, the double label bound to the microbeads is bound to a separate microbead in addition to the graphic labeling particles by attaching a receptor capable of binding to the target biomaterial. Depending on the combination of micro discs, the number of multiple markers can be further increased.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 마이크로 디스크의 개요도이다.
도 2는 m개의 그래픽 표지와 n개의 분광 표지의 조합을 통해 생성할 수 있는 서로 다른 표지의 개수를 설명하기 위한 그래프이다.
도 3은 실시예 1의 마이크로 디스크 제작 공정 개요도이다.
도 4는 실시예 1의 마이크로 디스크 제작 공정의 각 단계별 사진으로, 도 4a는 각각 홀을 1개, 2개 또는 3개 가진 그래픽 패턴을 가진 마이크로 디스크로 그래픽 패턴을 형성한 후의 100 배 확대한 전자주사현미경 사진과 광학 현미경 사진이고, 도 4b는 각각 홀을 1개, 2개 또는 3개 가진 마이크로 디스크의 전자주사현미경 사진과 그 중 홀을 1개 가진 마이크로 디스크의 전자주사현미경 사진의 확대도이며, 도 4c는 심도반응성 이온 식각을 통해 마이크로 디스크 아래 실리콘 기둥이 형성된 전자주사현미경 사진의 확대도이고, 도 4d는 등방성 건식 식각으로 실리콘 기둥의 주변부를 식각한 상태의 전자주사현미경 사진의 확대도이며, 도 4e는 등방성 건식 식각으로 실리콘 웨이퍼를 제거한 후 마이크로 디스크에 크롬층 및 금층을 증착한 후, 마이크로 디스크가 형성된 실리콘 웨이퍼를 이소프로필 알코올 용액에 분산시킨 상태의 전자주사현미경 사진의 확대도이다.
도 5a는 실시예 1과 비교예 1의 4-플루오로벤젠티올로 표지된 마이크로 디스크의 라만 산란 강도를 비교한 그래프이고, 도 5b는 실시예 1의 금 나노요철층이 표면에 형성된 이중 표지 마이크로 디스크 중에서 1 개의 홀을 가진 마이크로 디스크의 광학 현미경 사진과 그에 해당하는 4-플루오로벤젠티올의 표면증강 라만 산란 신호 강도를 도식화(mapping)한 것이다.
도 6a는 실시예 2의 은 나노입자가 표면에 결합되어 은 나노입자층을 형성한 마이크로 디스크 중에서 홀이 1개인 것의 전자주사현미경 사진과 그 확대사진이고, 도 6b는 실리카 껍질층으로 보호된 이중 표지 마이크로 디스크 중에서 홀이 2개인 것의 전자주사현미경 사진과 그 확대사진이며, 도 6c는 실시예 2 및 3에서 머켑토프로필트리메톡시실란(3-mercaptopropyl)trimethoxysilane, MPTS) 처리된 마이크로 디스크에, 은 나노입자층을 형성하고, 라만 산란 표지물질을 결합시킨 후, 실리카 껍질층을 형성하고, 마이크로 비드와 결합 가능한 기능기를 결합시키는 공정의 개략적 예시도이다.
도 7a 및 도 7b의 좌측은 1개의 홀을 가진 이중 표지 마이크로 디스크가 결합된 마이크로 비드, 우측은 2개의 홀을 가진 이중 표지 마이크로 디스크가 결합된 마이크로 비드의 것으로, 위는 광학 현미경 사진이고, 아래는 전자주사 현미경 사진이며, 광확 현미경 사진에 겹쳐서 라만 스펙트럼을 나타내었다.1 is a schematic diagram of a micro disk according to an embodiment of the present invention.
FIG. 2 is a graph illustrating the number of different labels that can be generated through a combination of m graphic labels and n spectral labels.
3 is a schematic diagram of a micro disc manufacturing process of Example 1. FIG.
Figure 4 is a photograph of each step of the micro-disc manufacturing process of Example 1, Figure 4a is an electron magnified 100 times after forming a graphic pattern with a micro disk having a graphic pattern having one, two or three holes, respectively 4B are scanning electron micrographs and optical micrographs, and FIG. 4B is an enlarged view of an electron scanning micrograph of a micro disc having one, two, or three holes, and an electron scanning micrograph of a micro disc having one hole, respectively. 4C is an enlarged view of an electron scanning micrograph in which a silicon pillar is formed under a micro-disc through depth-reactive ion etching, and FIG. 4D is an enlarged view of an electron scanning microscope image in which a peripheral portion of the silicon pillar is etched by isotropic dry etching. 4E shows that after removing the silicon wafer by isotropic dry etching and depositing a chromium layer and a gold layer on the micro disk, the micro disk is It is an enlarged view of the electron scanning microscope photograph in which the formed silicon wafer was disperse | distributed to the isopropyl alcohol solution.
Figure 5a is a graph comparing the Raman scattering intensity of the micro-disk labeled with 4-fluorobenzenethiol of Example 1 and Comparative Example 1, Figure 5b is a double-labeled micro-layer formed on the surface of the gold nano-concave-convex layer of Example 1 The optical micrograph of the micro-disc with one hole in the disk and the corresponding surface-enhanced Raman scattering signal intensity of 4-fluorobenzenethiol are plotted.
FIG. 6A is an electron scanning micrograph and an enlarged photograph of one hole of a micro disk in which silver nanoparticles of Example 2 are bonded to a surface to form a silver nanoparticle layer, and FIG. 6B is a double label protected by a silica shell layer. An electron scanning microscope photograph of two holes in the micro disk and an enlarged photograph thereof are shown. FIG. 6C shows a silver-based micro disk treated with 3-mercaptopropyl trimethoxysilane (MPTS) in Examples 2 and 3. It is a schematic illustration of the process of forming a nanoparticle layer, bonding the Raman scattering labeling material, forming a silica shell layer, and bonding functional groups capable of bonding with microbeads.
7A and 7B, the left side is a microbead combined with a double-labeled micro disc with one hole, and the right side is a microbead coupled with a double-labeled micro disc with two holes, and the top is an optical micrograph, and the bottom is Is an electron scanning micrograph and shows a Raman spectrum superimposed on a light micrograph.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 설명한다. 단, 아래 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, an Example demonstrates this invention. However, the following examples are merely to illustrate the present invention, the content of the present invention is not limited to the following examples.

실시예 1: 금 나노요철층이 표면에 형성된 이중 표지 마이크로 디스크의 제조Example 1: Preparation of a dual-labeled micro disk with a gold nanoconcave-convex layer formed on its surface

도 3에 이중 표지 마이크로 디스크 제조 공정 개요도를 나타내었다. 기판에 원하는 마이크로 디스크의 두께로 실리카를 증착시키는 단계(a), 스테퍼 포토리쏘그래피(stepper photolithography) 및 반응성 이온 식각(reactive ion etching)을 통해 실리카층에 마이크로 디스크의 형태 외곽선 및 홀의 외곽선을 포함하는 그래픽 패턴을 형성하는 단계(b), 추가 반응성 이온 식각을 통해 표면증강 라만 산란 신호의 강도를 증가시키기 위하여 마이크로 디스크의 거칠기를 증가시키는 단계(c), 심도반응성 이온 식각(deep reactive ion etching)을 통해 기판을 식각하여 마이크로 디스크가 상부에 증착된 기판 기둥을 형성하는 단계(d), 등방성 건식 식각(isotropic dry etching)으로 마이크로 디스크가 상부에 증착된 기판 기둥의 둘레를 식각하는 단계(e), 및 열증착(thermal evaporation)을 통해 상기 마이크로 디스크 표면에 금속층을 형성하는 단계(f)를 통해 이중 표지 마이크로 디스크를 제조할 수 있다.3 shows a schematic diagram of a double label micro disk manufacturing process. Depositing silica to the substrate to the desired thickness of the micro disk, including the shape outline of the micro disk and the outline of the hole in the silica layer through stepper photolithography and reactive ion etching. Forming a graphical pattern (b), increasing the roughness of the microdisk to increase the strength of the surface enhanced Raman scattering signal through additional reactive ion etching (c), and deep reactive ion etching. Etching the substrate to form a substrate pillar having the micro disk deposited thereon (d), etching the circumference of the substrate pillar having the micro disk deposited thereon by isotropic dry etching (e), And (f) forming a metal layer on the surface of the micro disc through thermal evaporation. Whether it is possible to manufacture a micro disk.

먼저 150 mm 실리콘 웨이퍼에 0.5 내지 1 ㎛ 두께로 실리카를 증착시켰다. 상기 실리카층 위에 마이크로 디스크의 형태 외곽선 및 홀의 외곽선을 포함하는 그래픽 패턴을 가진 포토레지스트층을 형성하고, 노광을 통해 포토레지스트를 제거하고 상기 그래픽 패턴이 형성된 실리카 마이크로 디스크를 반응성 이온 식각을 통해 100 nm 식각하였다. 상기 그래픽 패턴은 지름이 1 내지 1.2 ㎛인 홀을 1 내지 3개 가진 지름 5 ㎛의 마이크로 디스크이다. 상기 각각의 그래픽 패턴을 가진 마이크로 디스크의 100 배 확대한 전자주사현미경 사진과 광학 현미경 사진을 도 4a에 나타내었고, 각각 홀을 1개, 2개 또는 3개 가진 마이크로 디스크의 전자주사현미경 사진과 그 중 홀을 1개 가진 마이크로 디스크의 전자주사현미경 사진의 확대도를 도 4b에 나타내었다.Silica was first deposited to a thickness of 0.5 to 1 μm on a 150 mm silicon wafer. A photoresist layer having a graphic pattern including a shape outline of a micro disc and an outline of a hole is formed on the silica layer, photoresist is removed through exposure, and the silica micro disc on which the graphic pattern is formed is 100 nm through reactive ion etching. Etched. The graphic pattern is a 5 μm diameter micro disc with 1 to 3 holes having a diameter of 1 to 1.2 μm. An electron scanning microscope photograph and an optical microscope photograph of a 100 times magnification of the micro disk having each graphic pattern are shown in FIG. 4A, and an electron scanning microscope photograph of a micro disk having one, two or three holes, respectively, and its An enlarged view of the electron scanning micrograph of the micro disk having one hole is shown in FIG. 4B.

다음으로 추가 반응성 이온 식각을 통해 표면증강 라만 산란 신호의 강도를 증가시키기 위하여 실리콘 웨이퍼 상에 그래픽 패턴으로 형성된 마이크로 디스크의 거칠기를 증가시켰다. 상기 거칠기의 요철은 높이가 약 20 nm이었다.Next, to increase the intensity of the surface enhanced Raman scattering signal through additional reactive ion etching, the roughness of the micro disk formed in the graphic pattern on the silicon wafer was increased. The roughness of the roughness was about 20 nm in height.

다음으로 심도반응성 이온 식각을 통해 실리콘 웨이퍼를 식각하였다. 상기 심도반응성 이온 식각을 통해 마이크로 디스크 아래 실리콘 기둥이 형성된 전자주사현미경 사진의 확대도를 도 4c에 나타내었다.Next, the silicon wafer was etched through the deep reactive ion etching. An enlarged view of the electron scanning micrograph in which the silicon pillar is formed under the micro disc through the depth reactive ion etching is shown in FIG. 4C.

다음으로 등방성 건식 식각으로 마이크로 디스크가 상부에 증착된 실리콘 기둥의 둘레를 식각하였다. 상기 등방성 건식 식각으로 실리콘 기둥의 주변부를 식각한 상태의 전자주사현미경 사진의 확대도를 도 4d에 나타내었다.Next, the circumference of the silicon pillar on which the micro disk was deposited was etched by isotropic dry etching. 4D shows an enlarged view of the electron scanning microscope image in which the peripheral portion of the silicon pillar is etched by the isotropic dry etching.

다음으로 상기 등방성 건식 식각으로 실리콘 기둥이 식각된 상태에서 열증착을 통해 상기 마이크로 디스크 표면에 5 nm 두께로 크롬층을 증착 형성하고, 그 위에 다시 20 nm 두께로 금층을 증착 형성하였다.Next, a 5 nm thick chromium layer was deposited on the surface of the micro disk by thermal evaporation in a state in which the silicon pillar was etched by the isotropic dry etching, and then a gold layer was further formed on the micro disk by 20 nm thickness.

다음으로 상기 금층이 증착된 마이크로 디스크를 가진 웨이퍼를 이소프로필 알코올 용액에 침지시켜, 5 분 동안 초음파 처리하고, 이를 원심분리하여 침전물에서 이중 표지 마이크로 디스크를 회수하였다. 상기 이중 표지 마이크로 디스크 중 1개의 홀을 가진 이중 표지 마이크로 디스크를 포함하는 이소프로필 알코올 용액을 슬라이드 글라스에 떨어뜨려 광학 현미경으로 100 배 확대한 사진을 도 4e에 나타내었다. Next, the wafer with the microdisks on which the gold layer was deposited was immersed in an isopropyl alcohol solution, sonicated for 5 minutes, and centrifuged to recover the double-labeled microdisks from the precipitate. The isopropyl alcohol solution containing the double-labeled micro-disk having one hole among the double-labeled micro-disks was dropped on a slide glass and magnified 100 times with an optical microscope.

상기 금 나노요철층이 형성된 이중 표지 마이크로 디스크 약 210만개에 2 mM의 라만 산란 표지물질인 4-플루오로벤젠티올이 녹아있는 에탄올 1 ㎖를 첨가하고, 상기 혼합용액을 25 ℃에서 1 시간 동안 교반하여, 라만 표지물질의 자기조립층이 형성되고 금 나노요철층이 형성된 마이크로 디스크를 얻었다.
To about 2.1 million double-labeled microdisks on which the gold nanoconcave-convex layer was formed, 1 ml of ethanol containing 4- mM fluorobenzenethiol, a 2 mM Raman scattering labeling substance, was added, and the mixed solution was stirred at 25 ° C. for 1 hour. Thus, a micro disk on which a self-assembled layer of Raman labeling material was formed and a gold nanoconcave-convex layer was formed.

비교예 1: 금 나노요철층이 표면에 형성되지 않은 마이크로 디스크의 제조Comparative Example 1: Preparation of a micro disk in which the gold nanoconcave-convex layer was not formed on the surface

실시예 1과 동일하게 마이크로 디스크를 제조하되, 추가 반응성 이온 식각을 통해 마이크로 디스크의 거칠기를 증가시키는 공정만을 생략하여, 금 나노요철층이 형성되지 않은 마이크로 디스크를 제조하였다.
A micro disc was prepared in the same manner as in Example 1, except that only the process of increasing the roughness of the micro disc through additional reactive ion etching was performed, thereby preparing a micro disc in which no gold nanoconcave-convex layer was formed.

실험예 1: 라만 산란 강도 비교Experimental Example 1: Raman scattering intensity comparison

실시예 1과 비교예 1의 4-플루오로벤젠티올로 표지된 마이크로 디스크의 라만 스펙트럼을 확인하고, 강한 피크를 나타내는 1073 cm-1에서 산란 강도를 비교하여 도 5a에 나타내었다. 4-플루오로벤젠티올은 647 nm 레이저로 필터 D 0.6, 시료 전력 1.84 mW로 측정하였다.The Raman spectra of the micro disks labeled with the 4-fluorobenzenethiol of Example 1 and Comparative Example 1 were confirmed, and the scattering intensities were compared at 1073 cm −1 showing strong peaks and are shown in FIG. 5A. 4-fluorobenzenethiol was measured with a filter D 0.6 and a sample power of 1.84 mW with a 647 nm laser.

실시예 1의 금 나노요철층이 표면에 형성된 이중 표지 마이크로 디스크의 라만 산란 강도가 비교예 1의 금 나노요철층이 표면에 형성되지 않은 마이크로 디스크에 비하여 현저히 상승하였음을 확인하였다.It was confirmed that the Raman scattering intensity of the double-labeled micro disk on which the gold nanoconcave-convex layer of Example 1 was formed was significantly increased compared to the micro disk on which the gold nanoconcave-convex layer of Comparative Example 1 was not formed on the surface.

또한 실시예 1의 금 나노요철층이 표면에 형성된 이중 표지 마이크로 디스크 중에서 1 개의 홀을 가진 마이크로 디스크의 광학 현미경 사진과 그에 해당하는 4-플루오로벤젠티올의 표면증강 라만 산란 신호 강도를 도식화(mapping)한 것을 도 5b에 나타내었다.
In addition, the optical micrograph of the microdisc having one hole in the double-labeled microdisc formed on the surface of the gold nanoconcave-convex layer of Example 1 and the surface enhancement Raman scattering signal intensity of the corresponding 4-fluorobenzenethiol (mapping) ) Is shown in Figure 5b.

실시예 2: 은 나노입자층이 표면에 형성된 이중 표지 마이크로 디스크의 제조Example 2 Preparation of Double Labeled Micro Disks with Silver Nanoparticle Layers Formed on Their Surfaces

먼저 실시예 1과 동일하게, 150 mm 실리콘 웨이퍼에 0.5 내지 1 ㎛ 두께로 실리카를 증착시키고, 상기 스테퍼 포토리쏘그래피 및 반응성 이온 식각을 통해 실리카층에 마이크로 디스크의 형태 외곽선 및 홀의 외곽선을 포함하는 그래픽 패턴을 형성하였다.First, in the same manner as in Example 1, the silica was deposited to a thickness of 0.5 to 1 μm on a 150 mm silicon wafer, and the stepped photolithography and reactive ion etching included the shape of the micro disc in the silica layer and the outline of the holes. A pattern was formed.

실시예 1의 마이크로 디스크 표면의 거칠기를 증가시키는 단계를 생략하고, 심도반응성 이온 식각을 통해 실리콘 웨이퍼를 식각을 통해 마이크로 디스크 아래 실리콘 기둥이 형성하고, 등방성 건식 식각으로 마이크로 디스크가 상부에 증착된 실리콘 기둥의 둘레를 식각하였다.The step of increasing the roughness of the surface of the micro disk of Example 1 was omitted, and the silicon wafer was formed under the micro disk by etching the silicon wafer through the depth reactive ion etching, and the silicon on which the micro disk was deposited by the isotropic dry etching. The perimeter of the column was etched.

다음으로 실시예 1의 크롬층 및 금층 증착 단계를 생략하고, 마이크로 디스크를 가진 웨이퍼를 이소프로필 알코올 용액에 침지시켜, 5 분 동안 초음파 처리하고, 이를 원심분리하여 침전물에서 마이크로 디스크를 회수하였다.Next, the chromium layer and gold layer deposition step of Example 1 were omitted, and the wafer with the micro disk was immersed in an isopropyl alcohol solution, sonicated for 5 minutes, and centrifuged to recover the micro disk from the precipitate.

상기 마이크로 디스크 약 210만개를 1 ㎖ 에탄올에 분산시킨 후, 30 ㎕의 3-머켑토프로필트리메톡시실란((3-mercaptopropyl)trimethoxysilane, MPTS)과 10 ㎕의 25 % 암모니아수를 첨가후 25 ℃에서 1 시간 동안 교반하였다. 이를 원심분리 후 에탄올로 수회 세척하여 표면에 티올기가 도입된 마이크로 디스크, 즉 MPTS 처리된 마이크로 디스크를 합성하였다.After dispersing about 2.1 million microdisks in 1 ml ethanol, 30 µl of 3-mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTS) and 10 µl of 25% aqueous ammonia were added thereto at 25 ° C. Stir for 1 hour. This was centrifuged and washed several times with ethanol to synthesize a micro disk in which a thiol group was introduced, that is, a MPTS-treated micro disk.

상기 MPTS 처리된 마이크로 디스크 약 210만개를 에틸렌글리콜에 0.5mM로 용해된 AgNO3 1 ㎖에 분산시켰고, 분산된 MPTS 처리된 마이크로 디스크에 옥틸아민(octylamine) 8 ㎕을 첨가하였다. 상기 혼합용액을 25 ℃에서 1 시간 동안 교반한 후, 원심분리와 에탄올 세척을 통해 은 나노입자가 표면에 결합된 마이크로 디스크를 얻었다. 상기 은 나노입자가 표면에 결합되어 은 나노입자층이 형성된 마이크로 디스크 중 홀이 1개인 것의 전자주사현미경 사진과 그 확대사진을 도 5a에 나타내었다. 상기 도 6a를 보면 마이크로 디스크의 그래픽 패턴, 즉 마이크로 디스크의 형태, 홀의 개수 및 위치, 또는 홀의 형태를 식별할 수 있었다.
About 2.1 million MPTS-treated micro disks were dispersed in 1 ml of AgNO 3 dissolved in 0.5 mM in ethylene glycol, and 8 µl of octylamine was added to the dispersed MPTS-treated micro disks. After stirring the mixed solution for 1 hour at 25 ℃, centrifugation and ethanol wash to obtain a micro disk with silver nanoparticles bonded to the surface. 5A shows an electron scanning microscope photograph and an enlarged photograph of one hole of a micro disk in which silver nanoparticles are bonded to a surface to form a silver nanoparticle layer. Referring to FIG. 6A, a graphic pattern of the micro disk, that is, the shape of the micro disk, the number and location of the holes, or the shape of the holes could be identified.

실시예 3: 표지물질 및 코팅층이 형성된 이중 표지 마이크로 디스크의 제조Example 3 Preparation of a Dual Label Micro Disc with Labeling Material and Coating Layer

상기 실시예 2의 은 나노입자층이 형성된 마이크로 디스크 약 210만개에 2 mM의 라만 산란 표지물질인 4-플루오로벤젠티올이 녹아있는 에탄올 1 ㎖를 첨가하고, 상기 혼합용액을 25 ℃에서 1 시간 동안 교반하여, 라만 표지물질의 자기조립층이 형성되고 은 나노입자층이 형성된 마이크로 디스크를 얻었다.1 ml of ethanol in which 4-fluorobenzenethiol, a 2 mM Raman scattering label, is dissolved, is added to about 2.1 million micro disks on which the silver nanoparticle layer of Example 2 is formed, and the mixed solution is maintained at 25 ° C. for 1 hour. By stirring, a self-assembled layer of Raman labeling material was formed to obtain a micro disk on which a silver nanoparticle layer was formed.

상기 라만 표지물질의 자기조립층이 형성되고 은 나노입자층이 형성된 마이크로 디스크를 1 ㎖의 에탄올에 분산시키고, 10 ㎖의 TEOS 와 10 ㎖의 25% 암모니아수를 첨가 후 25 ℃에서 1 시간 동안 교반하였다. 반응 후 원심분리와 에탄올 세척을 통해 실리카 껍질층으로 보호된 이중 표지 마이크로 디스크를 얻었다. 상기 실리카 껍질층으로 보호된 이중 표지 마이크로 디스크 중 홀이 2개인 것의 전자주사현미경 사진과 그 확대사진을 도 6b에 나타내었다.The self-assembled layer of the Raman labeling material was formed and the micro disk on which the silver nanoparticle layer was formed was dispersed in 1 ml of ethanol, and 10 ml of TEOS and 10 ml of 25% ammonia water were added and stirred at 25 ° C. for 1 hour. After the reaction, a double-labeled micro disk protected by a silica shell layer was obtained by centrifugation and ethanol washing. 6B shows an electron scanning micrograph and an enlarged photograph of two holes of the double-labeled microdisk protected by the silica shell layer.

상기 실리카 껍질층으로 보호된 이중 표지 마이크로 디스크에 마이크로 비드에 결합할 수 있는 기능기로 에폭시기를 부여하기 위하여, 1 ㎕의 3-글리시옥시프로필트리메톡시실란((3-Glycidoxypropyltrimethoxysilane, GPTS)과 5 ㎕의 25% 암모니아수를 첨가 후 25 ℃에서 1 시간 동안 교반하였다.1 μl of 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPTS) and 5 μl to give an epoxy group as a functional group capable of binding to microbeads to the double-labeled micro disc protected by the silica shell layer. After addition of 25% aqueous ammonia, the mixture was stirred at 25 ° C for 1 hour.

상기 실시예 2 및 3에서 MPTS 처리된 마이크로 디스크에, 은 나노입자층을 형성하고, 라만 산란 표지물질을 결합시킨 후, 실리카 껍질층을 형성하고, 마이크로 비드와 결합 가능한 작용기를 결합시키는 공정의 개략적 예시도를 도 6c에 나타내었다.
Schematic illustration of a process of forming a silver nanoparticle layer, a Raman scattering labeling material, a silica shell layer, and a bondable functional group to the microbeads on the MPTS-treated micro disks in Examples 2 and 3 Figure is shown in Figure 6c.

실험예 2: 이중 표지 마이크로 디스크를 이용한 타겟 바이오물질 다중 검출 가능성 확인Experimental Example 2: Confirmation of Multiple Detection of Target Biomaterials Using Double Labeled Micro Disks

특정 펩타이드, 펩토이드, 사이클릭펩타이드, 사이클릭펩토이드, PNA(Peptide Nucleic Acid) 등에 결합할 수 있는 리셉터가 결합될 수 있는 평균 지름 130 ㎛인 펩타이드 합성용 마이크로 비드[TentaGel S NH2, Rapp Polymere GmbH, 독일]를 통상의 방법으로 제조하여 사용하였다.Microbeads for peptide synthesis having an average diameter of 130 μm to which a receptor capable of binding a specific peptide, peptoid, cyclic peptide, cyclic peptide, PNA (Peptide Nucleic Acid), etc. can be bound [TentaGel S NH 2 , Rapp Polymere GmbH, Germany] was prepared and used in a conventional manner.

상기 마이크로 비드 10 mg에 실시예 3에서 제조된 4-플루오로벤젠티올로 표지되고 실리카 껍질층으로 보호되며 실리카 껍질층에 에폭시 작용기가 결합된 이중 표지 이중 표지 마이크로 디스크 중 홀이 1 개인 것[Encoder (1)]과 2 개인 것[Encoder (2)]을 각각 106 개 넣고, 교반기를 이용하여 10분간 세차게 교반하였다. 교반이 끝난 후 마이크로 비드에 붙지 않은 여분의 마이크로 디스크를 제거하기 위하여 원심분리기를 이용하여 완충액으로 다섯 차례 세척해주었다.One micro-labeled double-labeled micro-labeled micro-disk with 10 mg of microbeads labeled with 4-fluorobenzenethiol prepared in Example 3, protected with a silica shell layer, and an epoxy functional group bonded to the silica shell layer, has one hole. 10 [ 6 ] and 2 [Encoder (2)] were put in each, and it stirred vigorously for 10 minutes using the stirrer. After the agitation was completed, the resultant was washed five times with a buffer using a centrifuge to remove excess micro discs that did not adhere to the microbeads.

상기 각각의 마이크로 비드를 건조시키고, 실험예 1과 동일하게 라만 스펙트럼을 확인하여 도 7a 및 도 7b에 나타내었다. 도 7a 및 도 7b의 좌측은 1개의 홀을 가진 이중 표지 마이크로 디스크가 결합된 마이크로 비드, 우측은 2개의 홀을 가진 이중 표지 마이크로 디스크가 결합된 마이크로 비드의 것으로, 위는 광학 현미경 사진이고, 아래는 전자주사 현미경 사진이며, 광확 현미경 사진에 겹쳐서 라만 스펙트럼을 나타내었다.Each of the microbeads were dried, and Raman spectra were confirmed in the same manner as in Experimental Example 1, and are shown in FIGS. 7A and 7B. 7A and 7B, the left side is a microbead combined with a double-labeled micro disc with one hole, and the right side is a microbead coupled with a double-labeled micro disc with two holes, and the top is an optical micrograph, and the bottom is Is an electron scanning micrograph and shows a Raman spectrum superimposed on a light micrograph.

도 7a와 도 7b는 동일하게 4-플루오로벤젠티올을 이용하여 라만 산란 표지되어 라만 산란을 통해서는 식별할 수 없었지만, 광학 현미경이나 전자주사 현미경 사진을 통해 그래픽 표지, 즉 홀의 개수의 차이를 통해 식별 가능하였다.7a and 7b are identically labeled with Raman scattering using 4-fluorobenzenethiol and could not be identified through Raman scattering. However, through optical or electron scanning micrographs, graphic labels, i.e., differences in the number of holes, were used. It was identifiable.

Claims (19)

하나 이상의 홀(hole)이 형성되어 상기 홀의 개수 및 위치에 따라 시각적으로 인지 가능한 그래픽 표지; 및 표면에 형성되거나 결합되는 라만 산란 표지;를 포함하여 이루어지고,
상기 표면에 형성되거나 결합된 라만 분광 표지는, 상기 마이크로 디스크 표면에 형성된 금 나노요철층 또는 은 나노요철층이거나, 또는 상기 마이크로 디스크 표면에 결합된 금 나노입자층 또는 은 나노입자층인 것을 특징으로 하는 이중 표지 마이크로 디스크.One or more holes are formed to visually recognize the graphic marker according to the number and location of the holes; And a Raman scattering label formed or bound to the surface;
Raman spectroscopic label formed on or bonded to the surface is a gold nano-concave-convex layer or silver nano-concave-convex layer formed on the surface of the micro disk, or a gold nano-particle layer or silver nano-particle layer bonded to the surface of the micro disk. Cover micro disk. 제 1 항에 있어서, 상기 그래픽 표지 및 라만 산란 표지의 조합을 통해 복수의 타겟 바이오물질의 검출이 가능한 것을 특징으로 하는 이중 표지 마이크로 디스크.The dual label micro disc of claim 1, wherein a plurality of target biomaterials can be detected through a combination of the graphic label and the Raman scattering label. 제 1 항에 있어서, 상기 마이크로 디스크의 너비는 3 내지 30 ㎛인 것을 특징으로 하는 이중 표지 마이크로 디스크.The double-labeled micro disc of claim 1, wherein the micro disc has a width of 3 to 30 μm. 제 3 항에 있어서, 상기 마이크로 디스크의 두께에 대한 너비의 비율은 3 내지 30인 것을 특징으로 하는 이중 표지 마이크로 디스크.4. The dual label micro disc of claim 3, wherein the ratio of the width to the thickness of the micro disc is 3 to 30. 제 1 항에 있어서, 상기 홀의 지름은 0.2 내지 5 ㎛인 것을 특징으로 하는 이중 표지 마이크로 디스크.The dual label micro disc of claim 1, wherein the hole has a diameter of 0.2 to 5 μm. 제 1 항에 있어서, 상기 시각적으로 인지 가능한 그래픽 표지는 광학 현미경 또는 전자주사현미경으로 인지 가능한 것을 특징으로 하는 이중 표지 마이크로 디스크.The dual label micro disc of claim 1, wherein the visually recognizable graphical label is recognizable by an optical microscope or an electron scanning microscope. 제 1 항에 있어서, 상기 그래픽 표지는 상기 마이크로 디스크의 형태 또는 상기 홀의 형태를 추가로 변형시키는 것을 특징으로 하는 이중 표지 마이크로 디스크.2. The dual label micro disc of claim 1, wherein the graphical label further modifies the shape of the micro disc or the shape of the hole. 삭제delete 제 1 항에 있어서, 상기 금 나노요철층, 은 나노요철층, 상기 금 나노입자층 또는 은 나노입자층 표면에는 라만 산란 표지물질이 결합되고,
상기 표지물질은 4-머켑토 톨루엔(4-MT), 3,5-디메틸 벤젠티올(3,5-DMT), 티오페놀(TP), 4-아미노 티오페놀(4-ATP), 벤젠티올(BT), 4-브로모 벤젠티올(4-BBT), 2-브로모 벤젠티올(2-BBT), 4-이소프로필 벤젠티올(4-IBT), 2-나프탈렌 티올(2-NT), 3,4-디클로로 벤젠티올(3,4-DCT), 3,5-디클로로 벤젠티올(3,5-DCT), 4-클로로 벤젠티올(4-CBT), 2-클로로 벤젠티올(2-CBT), 2-플루오로 벤젠티올(2-FBT), 4-플루오로 벤젠티올(4-FBT), 4-메톡시 벤젠티올(4-MOBT), 3,4-디메톡시 벤젠티올(3,4-DMOBT), 2-머켑토 피리미딘(2-MPY), 2-머켑토-1-메틸 이미다졸(2-MMI), 2-머켑토-5-메틸 벤즈이미다졸(2-MBI), 2-아미노-4-(트리플루오로메틸) 벤젠티올(2-ATFT), 벤질 머켑탄(BZMT), 벤질 디설파이드(BZDSF), 2-아미노-4-클로로 벤젠티올(2-ACBT), 3-머켑토 벤조산(3-MBA), 1-페닐테트라졸-5-티올(1-PTET), 5-페닐-1,2,3-트리아졸-3-티올(5-PTRT), 2-아이오도아닐린(2-IAN), 페닐 이소티오시아네이트(PITC), 4-니트로페닐 디설파이드(4-NPDSF) 및 4-아지도-2-브로모아세토페논(ABAPN)을 포함하는 분자군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 이중 표지 마이크로 디스크.According to claim 1, Raman scattering labeling material is bonded to the surface of the gold nano-concave-convex layer, silver nano-concave-convex layer, the gold nanoparticle layer or silver nanoparticle layer,
The labeling substance is 4-mercotto toluene (4-MT), 3,5-dimethyl benzenethiol (3,5-DMT), thiophenol (TP), 4-amino thiophenol (4-ATP), benzenethiol ( BT), 4-bromo benzenethiol (4-BBT), 2-bromo benzenethiol (2-BBT), 4-isopropyl benzenethiol (4-IBT), 2-naphthalene thiol (2-NT), 3 , 4-dichloro benzenethiol (3,4-DCT), 3,5-dichloro benzenethiol (3,5-DCT), 4-chloro benzenethiol (4-CBT), 2-chloro benzenethiol (2-CBT) , 2-fluoro benzenethiol (2-FBT), 4-fluoro benzenethiol (4-FBT), 4-methoxy benzenethiol (4-MOBT), 3,4-dimethoxy benzenethiol (3,4- DMOBT), 2-mercetopyrimidine (2-MPY), 2-merceto-1-methyl imidazole (2-MMI), 2-merceto-5-methyl benzimidazole (2-MBI), 2- Amino-4- (trifluoromethyl) benzenethiol (2-ATFT), benzyl mertantan (BZMT), benzyl disulfide (BZDSF), 2-amino-4-chloro benzenethiol (2-ACBT), 3-mersanto Benzoic acid (3-MBA), 1-phenyltetrazol-5-thiol (1-PTET), 5-phenyl-1,2,3-triazole-3-thiol (5-PTRT), 2-io Any selected from the group of molecules including aniline (2-IAN), phenyl isothiocyanate (PITC), 4-nitrophenyl disulfide (4-NPDSF) and 4-azido-2-bromoacetophenone (ABAPN) At least one double-label micro disc. 제 9 항에 있어서, 상기 표지물질이 결합된 금 나노요철층, 은 나노요철층, 금 나노입자층 또는 은 나노입자층 주변을 둘러싸는 실리카, 단백질 및 고분자 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 껍질층을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 이중 표지 마이크로 디스크.10. The method of claim 9, wherein the labeling material further comprises at least one shell layer selected from silica, protein and polymer surrounding the gold nano-concave-convex layer, silver nano-concave-convex layer, gold nanoparticle layer or silver nanoparticle layer bound to the labeling material. A double cover micro disk, characterized in that. 제 10 항에 있어서, 상기 껍질층은 표면에 전하를 띄거나, 또는 표면에 아미노기, 아민기, 암모늄기, 하이드록시기, 카르복실기, 에폭시기, 이소시아네이트기 및 숙신이미딜에스터기 중에서 선택되는 기능기가 결합된 것을 특징으로 하는 이중 표지 마이크로 디스크.The method of claim 10, wherein the shell layer is charged on the surface, or the surface is combined with a functional group selected from amino, amine, ammonium, hydroxy, carboxyl, epoxy, isocyanate and succinimidyl ester groups A double cover micro disk, characterized in that. 타겟 바이오물질에 결합 가능한 리셉터가 작용기를 통해 표면에 결합된 마이크로 비드에, 상기 타겟 바이오물질에 따라 상기 마이크로 비드의 식별이 가능하도록 청구항 제1항 내지 제7항 및 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 이중 표지 마이크로 디스크를 결합시키는 단계;
상기 이중 표지 마이크로 디스크가 결합된 마이크로 비드의 리셉터와 타겟 바이오물질을 유체 상태에서 반응시키거나 결합시키는 단계; 및
상기 타겟 바이오물질과 반응하거나 결합된 상기 이중 표지 마이크로 디스크가 결합된 마이크로 비드를 라만 산란과, 광학 현미경 또는 전자주사현미경을 이용한 시각적 이미지를 조합하여 검출하는 단계;를 포함하는 이중 표지 마이크로 디스크의 그래픽 표지 및 라만 분광 표지의 조합을 통한 타겟 바이오물질의 검출방법.Claims 1 to 7 and 9 to 11 to enable the microbeads that are bound to the surface through a functional group, the receptor capable of binding to the target biomaterial, the identification of the microbead according to the target biomaterial. Joining the dual labeled micro discs according to any one of the preceding claims;
Reacting or binding the receptor of the microbead to which the dual label micro disk is bound and the target biomaterial in a fluid state; And
Detecting the microbeads to which the dual-labeled microdisks reacted with or coupled to the target biomaterial are combined by Raman scattering and visual images using an optical microscope or an electron scanning microscope; A method for detecting a target biomaterial through the combination of a label and a Raman spectroscopic label. 제 12 항에 있어서, 상기 마이크로 비드 하나에 5 내지 1000 개의 상기 이중 표지 마이크로 디스크가 결합되는 것을 특징으로 하는 타겟 바이오물질의 검출방법.The method of claim 12, wherein 5 to 1000 double-labeled micro discs are bound to the microbeads. 제 13 항에 있어서, 상기 마이크로 비드에 결합되는 복수개의 이중 표지 마이크로 디스크의 조합을 달리하여 각각의 마이크로 비드를 식별하는 것을 특징으로 하는 타겟 바이오물질의 검출방법.The method of claim 13, wherein the microbeads are identified by different combinations of a plurality of double-labeled microdisks coupled to the microbeads. 제 13 항에 있어서, 상기 마이크로 비드의 지름은 상기 마이크로 디스크 너비의 10 내지 100 배인 것을 특징으로 하는 타겟 바이오물질의 검출방법.The method of claim 13, wherein the diameter of the microbead is 10 to 100 times the width of the microdisk. 제 15 항에 있어서, 상기 마이크로 비드의 지름은 30 내지 1000 ㎛인 것을 특징으로 하는 타겟 바이오물질의 검출방법.The method of claim 15, wherein the microbeads have a diameter of 30 to 1000 μm. 제 12 항에 있어서, 상기 타겟 바이오물질은 펩타이드, 펩토이드, 사이클릭펩타이드, 사이클릭펩토이드, PNA(Peptide Nucleic Acid), 효소, 단백질, 핵산, 아미노산, 올리고당, 세포, 암세포, 암줄기세포, 항원 및 압타머 중에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 타겟 바이오물질의 검출방법.The method of claim 12, wherein the target biomaterial is a peptide, peptoid, cyclic peptide, cyclic peptoid, PNA (Peptide Nucleic Acid), enzymes, proteins, nucleic acids, amino acids, oligosaccharides, cells, cancer cells, cancer stem cells , The detection method of the target biomaterial, characterized in that any one or more selected from antigens and aptamers. 제 12 항에 있어서, 상기 리셉터는 펩타이드, 펩토이드, 효소기질, 리간드, 아미노산, 단백질, 핵산, 지질, 코펙터, 탄수화물 및 항체 중에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 타겟 바이오물질의 검출방법.The method of claim 12, wherein the receptor is any one or more selected from peptides, peptoids, enzyme substrates, ligands, amino acids, proteins, nucleic acids, lipids, cofactors, carbohydrates, and antibodies. . 제 12 항에 있어서, 상기 작용기는 아민기, 카르복시기 및 티올기 중에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 타겟 바이오물질의 검출방법.The method of claim 12, wherein the functional group is any one or more selected from an amine group, a carboxyl group, and a thiol group.
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