KR101006700B1 - Fluorescent surface enhanced raman scattering nano-tagging particle and method for preparing thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 생체 분석 물질을 빠르게 추적(tracking), 표적(targeting) 및 형상(imaging) 하는데 이용할 수 있는 형광 표면증강 라만 산란 나노-표지 입자 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 형광 표면증강 라만 산란 나노-표지 입자는 형광 및 라만 산란에 매우 민감하기 때문에 생체 분석 물질을 보다 쉽고, 빠르게 분석할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 형광 표면증강 라만 산란 나노-표지 입자는 세포와 조직에서 암 또는 다른 질병과 관련된 다양한 세포학적 및 분자학적 현상의 분석에 쉽게 이용될 수 있다.The present invention relates to fluorescent surface-enhanced Raman scattering nano-labeled particles that can be used to rapidly track, target and image bioanalytes and methods for their preparation. Fluorescent surface-enhanced Raman scattering nano-labeled particles according to the present invention are very sensitive to fluorescence and Raman scattering, so that bioanalyticals can be analyzed more easily and quickly. Thus, the fluorescent surface-enhanced Raman scattering nano-labeled particles according to the present invention can be readily used for the analysis of various cellular and molecular phenomena associated with cancer or other diseases in cells and tissues.
라만, 형광, 나노-표지입자, 아포프토시스 Raman, fluorescence, nano-labeled particles, apoptosis
Description
도 1은 본 발명에 따른 형광 표면증강 라만 산란 나노-표지 입자의 구조를 나타낸 개략도.1 is a schematic view showing the structure of the fluorescence surface enhanced Raman scattering nano-labeled particles according to the present invention.
도 2는 형광 표면증강 라만 산란 나노-표지 입자의 합성 방법을 나타낸 개략도.Figure 2 is a schematic diagram showing the synthesis method of fluorescent surface-enhanced Raman scattering nano-labeled particles.
도 3은 형광 표면증강 라만 산란 나노-표지 입자에 대해 형광과 라만 분석을 수행한 결과를 나타낸 사진.Figure 3 is a photograph showing the results of performing fluorescence and Raman analysis on fluorescence surface enhanced Raman scattering nano-labeled particles.
A: 라만 표지물질로 아미노티오페놀 및 형광물질로 플루오레세인 이소티오시아네이트가 포함된 나노-표지 입자의 라만 스펙트럼A: Raman spectra of nano-labeled particles containing aminothiophenol as the Raman label and fluorescein isothiocyanate as the fluorescent material
B: 라만 표지물질로 4-머캡토톨루엔 및 형광물질로 로다민 6G 이소티오시아네이트가 포함된 나노-표지 입자의 라만 스펙트럼B: Raman spectra of nano-labeled particles containing 4-mercaptotoluene as the Raman marker and rhodamine 6G isothiocyanate as the fluorescent substance
C: 라만 표지물질로 2-나프탈렌티올 및 형광물질로 알렉사플루오로 647이 포함된 나노-표지 입자의 라만 스펙트럼 C: Raman spectra of nano-labeled particles containing 2-naphthalenethiol as Raman label and Alexafluoro 647 as fluorescent material
도 4a 내지 도 4c는 본 발명에 따른 형광 표면증강 라만 산란 나노-표지 입 자의 세포독성 실험 결과를 나타낸 그래프.4a to 4c are graphs showing the results of cytotoxicity experiments of fluorescent surface-enhanced Raman scattering nano-labeled particles according to the present invention.
도 5는 본 발명에 따른 형광 표면증강 라만 산란 나노-표지 입자에 아넥신 V(annexin V)를 도입하는 과정을 나타낸 개략도.Figure 5 is a schematic diagram showing the process of introducing annexin V (annexin V) to the fluorescent surface-enhanced Raman scattering nano-labeled particles according to the present invention.
도 6은 본 발명에 따른 형광 표면증강 라만 산란 나노-표지 입자와 암 세포주를 같이 배양한 후, 아포프토시스가 유발된 부위에 대해 형광분석을 수행한 결과를 나타낸 사진. Figure 6 is a photograph showing the results of the fluorescence analysis of the apoptosis-induced fluorescence surface-intensified Raman scattering nano-labeled particles and cancer cell lines together in accordance with the present invention.
A: STS 처리하지 않은 정상 세포의 현미경 이미지A: microscopic image of normal cells not treated with STS
B: STS 처리하지 않은 정상 세포의 형광 이미지B: Fluorescence image of normal cells not treated with STS
C: STS 처리한 아포프토시스 유발 세포의 현미경 이미지C: microscopic image of apoptosis-induced cells treated with STS
D: STS 처리한 아포프토시스 유발 세포의 형광 이미지D: Fluorescence image of STS-treated apoptosis-inducing cells
도 7a는 본 발명에 따른 형광 표면증강 라만 산란 나노-표지 입자와 STS를 처리하지 않은 세포주를 같이 배양한 후, 라만 분석을 수행한 결과를 나타낸 사진.Figure 7a is a photograph showing the results of performing a Raman analysis after incubating the cell surface not treated with STS-treated fluorescent surface-enhanced Raman scattering nano-labeled particles according to the present invention.
A: 현미경 이미지A: microscope image
B: 라만 스펙트럼에 의한 매핑(mapping) 이미지B: Mapping Image by Raman Spectrum
C: 라만 분석 스펙트럼 C: Raman analysis spectrum
도 7b는 본 발명에 따른 형광 표면증강 라만 산란 나노-표지 입자와 STS를 처리하여 아포프토시스가 유발된 세포주를 같이 배양한 후, 라만 분석을 수행한 결과를 나타낸 사진.Figure 7b is a photo of the results of performing a Raman analysis after culturing together apoptosis-induced apoptosis-induced apoptosis-induced cell line with the fluorescent surface-enhanced Raman scattering nano-labeled particles according to the invention.
A: 현미경 이미지A: microscope image
B: 라만 스펙트럼에 의한 매핑(mapping) 이미지B: Mapping Image by Raman Spectrum
C: 라만 분석 그래프C: Raman analysis graph
* 도면의 주요 부분에 대한 부호 설명* Explanation of symbols on the main parts of the drawing
101: 실리카 중심 입자101: silica center particle
102: 표지물질이 코팅된 은나노입자층102: silver nanoparticle layer coated with a labeling material
103: 극성고분자층103: polar polymer layer
104: 형광물질을 포함하는 실리카 껍질 104: silica shell containing fluorescent material
105: 폴리에틸렌글리콜과 아민을 포함하는 기능기층105: functional group layer containing polyethylene glycol and amine
106: 생체 수용체106: bioreceptor
본 발명은 형광 표면증강 라만 산란 나노-표지 입자 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 세포 또는 조직내의 암 또는 질병과 관련된 생체 표지 물질의 분석, 특히 아포프토시스를 민감하고 빠르게 추적, 표적 및 형상하는데 이용할 수 있는 형광 표면 증강 라만 산란 나노-표지 입자 및 이의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to fluorescent surface-enhanced Raman scattering nano-labeled particles and a method for preparing the same, and more particularly, to sensitively and rapidly track, target and shape the analysis of biomarkers related to cancer or disease in cells or tissues, particularly apoptosis. The present invention relates to fluorescent surface-enhanced Raman scattering nano-labeled particles and methods for preparing the same.
지난 수년간 생물-화학 분야에서는 미량의 합성물질 및 생체 분자의 대사, 분포 및 결합 등을 연구하는데 특정 물질로 표지된 나노 입자 및 화학물질을 널리 사용해 왔다. 대표적으로는 방사성 동위원소를 이용한 방법, 유기 형광물질을 이용한 방법, 무기 물질인 양자점(Quantum dots)을 이용한 방법이 있다.Over the years, bio-chemistry has widely used nanoparticles and chemicals labeled with specific substances to study the metabolism, distribution, and binding of trace compounds and biomolecules. Representative methods include radioisotopes, organic fluorescent materials, and inorganic quantum dots.
방사성 동위원소를 이용한 방법에서 방사성 표지물질(Radioactive isotope)로는 생체 내에서 널리 발견되는 1H, 12C, 31P, 32S, 127I 등의 방사성동위체인 3H, 14C, 32P, 35S, 125I 등이 널리 사용된다. 방사성 동위원소들은 비 방사성의 동위체와 화학적 성질이 거의 비슷하여 임의로 치환이 가능하고, 방출 에너지가 비교적 커서 소량의 검출도 가능하다는 장점이 있기 때문에 오랫동안 사용되어 왔다. 그러나, 인체에 해로운 방사선 때문에 다루기가 용이하지 않고, 일부 동위원소의 방사성은 방출에너지가 큰 대신 반감기가 짧아서 장시간의 보관이나 실험에 불편한 단점도 있다.Roneun one that is widely found in vivo H, radioactive labeling substance (Radioactive isotope) in the method using a radioactive isotope, 12 C, 31 P, 32 S , a 3 H, a radioactive isotope such as 127 I 14 C, 32 P, 35 S, 125 I and the like are widely used. Radioactive isotopes have been used for a long time because they have almost the same chemical properties as non-radioactive isotopes, which can be arbitrarily substituted and have a relatively large amount of emission energy. However, it is not easy to handle due to radiation harmful to the human body, and the radioactivity of some isotopes has a disadvantage in that it is inconvenient for long-term storage or experiment due to the short half-life instead of large emission energy.
방사성 동위원소에 대한 또 다른 대안으로 널리 사용되는 것은 유기 형광물질(Organic fluorescent dyes)이다. 형광물질들은 특정 파장에 의해서 활성이 되면 고유의 파장을 갖는 빛을 발광하게 된다. 특히, 검색법이 소형화됨에 따라, 방사성 물질 역시 검출 한계를 나타내어 검색에 오랜 시간이 요구된다. 이에 비해 형광물질의 경우 적절한 조건에서 분자당 수천 개의 광자를 방출할 수 있어 단일분자 수준의 검출까지도 이론적으로 가능하다. 그러나, 방사성 동위원소처럼 활성 리간드의 원소를 직접 치환할 수는 없고, 구조 활성관계를 통해 비교적 활성에 영향을 주지 않는 부분을 변형하여 형광물질을 연결해야 하는 제한점이 있다. 또한, 이러한 형광 표지물질들은 시간이 지나면서 형광 세기가 약해지며(photobleaching), 활성을 시키는 빛의 파장이 매우 좁고 발광되는 빛의 파장이 매우 넓어 서로 다른 형광물질 간에 간섭이 있는 단점을 가지고 있다. 또한, 사용할 수 있는 형광물질의 수가 극히 제한되어 있다.Another widely used alternative to radioactive isotopes is organic fluorescent dyes. When fluorescent materials are activated by a specific wavelength, they emit light having a specific wavelength. In particular, as search methods become smaller, radioactive materials also exhibit detection limits, requiring a long time to search. In contrast, fluorescent materials can emit thousands of photons per molecule under the right conditions, making it possible to theoretically detect single molecules. However, there is a limitation in that it is not possible to directly substitute the element of the active ligand like the radioisotope, and to connect the fluorescent material by modifying the part which does not affect the activity relatively through the structure activity relationship. In addition, these fluorescent markers have a disadvantage in that the fluorescence intensity becomes weaker with time (photobleaching), and the wavelength of light to be activated is very narrow and the wavelength of light to be emitted is very wide so that there is interference between different fluorescent materials. In addition, the number of fluorescent materials that can be used is extremely limited.
반도체 나노 물질인 양자점은 CdSe, CdS, ZnS, ZnSe 등으로 구성되어 있으며 크기 및 종류에 따라서 각각 다른 색의 빛을 발광한다. 유기 형광물질에 비하여 넓은 활성 파장을 가지고 있으며 좁은 발광 파장을 나타내기 때문에 다른 색을 발광하는 가짓수가 유기 형광물질 보다 많다. 따라서, 최근 들어 유기 형광물질의 단점들을 극복하기 위한 방법으로 양자점이 많이 사용되고 있다. 그러나, 독성이 있을 수 있고, 대량 생산이 힘들다는 단점이 있다. 또한, 이론적으로 그 가지 는 다양하나 실제적으로 사용되고 있는 수는 극히 제한되어 있다. Quantum dots, which are semiconductor nanomaterials, are composed of CdSe, CdS, ZnS, ZnSe, and the like, and emit light of different colors according to their size and type. Compared with organic fluorescent materials, they have broader active wavelengths and have narrower emission wavelengths, so that the number of different colors emitting organic light is larger than that of organic fluorescent materials. Therefore, recently, quantum dots have been widely used as a method for overcoming disadvantages of organic fluorescent materials. However, there is a disadvantage that it may be toxic, and mass production is difficult. In theory, the branches vary, but the number actually used is extremely limited.
이러한 문제점들을 해결하기 위한 방법으로 최근에는 표면증강 라만 산란법(Surface Enhanced Raman Scattering)을 이용한 표지물질을 이용하고 있다. 대표적으로는 표면증강 라만 산란 표지물질을 만들기 위해서 5~10nm 금 나노 입자와 DNA를 사용한 방법이 있다. 먼저 DNA의 3' 말단에 금 입자와 친화력이 강한 티올(thiol)기를 도입한 후, 표지물질로써 Cy3, Cy5를 각각 도입하였으며, 5' 말단에는 특정 생체 물질을 인식할 수 있는 리간드를 도입한다. 이와 같이 개질(modification)된 DNA는 금 나노 입자 표면에 도입하여 표지물질로 사용된다. 이러한 표면증강 라만 산란 금 나노 표지물질은 목표 생체 물질과 반응 후, 금 나노 입자에 의해서 라만에 활성이 강한 형태로 만들어진 후 분석된다. 그러나 이 방법은 표지물질로써 사용되는 DNA를 개질하기 힘들고 가격이 높다는 단점을 가지고 있다. Recently, a label using surface enhanced Raman Scattering has been used as a method for solving these problems. Typically, 5-10 nm gold nanoparticles and DNA are used to make surface-enhanced Raman scattering markers. First, a thiol group having strong affinity with gold particles is introduced at the 3 'end of DNA, and then Cy3 and Cy5 are introduced as markers, and a ligand capable of recognizing a specific biomaterial is introduced at the 5' end. The modified DNA is introduced into the surface of the gold nanoparticles and used as a label. The surface-enhanced Raman scattering gold nanolabels are analyzed after being reacted with the target biological material and made into a Raman active form by gold nanoparticles. However, this method has the disadvantage that it is difficult to modify the DNA used as a label and is expensive.
한편, 아포프토시스(apoptosis)는 세포 및 조직의 유지에 중요한 역할을 하는 세포내 현상으로서, 핵분열, 세포막의 수포화 및 세포 수축과 같은 특정의 형태학적 변화를 수반한다. 분자 수준에서, 아포프토시스는 100여개의 서로 다른 단백질간 세포 신호에 관여하고 있다. 따라서, 세포 및 조직내 아포프토시스의 분석은, 세포 항상성을 유지하기 위한 다양한 세포학적 및 분자학적 현상의 분석을 보다 용이하게 할 수 있다.Apoptosis, on the other hand, is an intracellular phenomenon that plays an important role in the maintenance of cells and tissues and involves certain morphological changes such as fission, cell membrane saturation and cell contraction. At the molecular level, apoptosis is involved in cellular signals between over 100 different proteins. Thus, analysis of apoptosis in cells and tissues may facilitate analysis of various cellular and molecular phenomena to maintain cell homeostasis.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는, 암 또는 다른 특정 질병과 관련된 생체 표지물질, 특히 아포프토시스(apoptosis)를 민감하고 빠르게 형광과 라만 분석법으로 추적, 표적 및 형상하는데 이용할 수 있는 나노-표지 입자를 제공하는 것이다.SUMMARY OF THE INVENTION The present invention seeks to provide nano-labeled particles that can be used to sensitively and rapidly track, target and shape biomarkers associated with cancer or other specific diseases, in particular apoptosis with fluorescence and Raman assays. will be.
상기와 같은 기술적 과제를 달성하기 위하여 본 발명은, 실리카 중심 입자; 상기 실리카 중심 입자 주변을 둘러싸고 있는 은나노입자층; 상기 은나노입자층을 둘러싸고 있는 극성고분자층; 상기 극성고분자층을 둘러싸고 있고, 형광물질을 포함하는 실리카 껍질; 및 상기 실리카 껍질을 둘러싸고 있는 기능기층으로 이루어진 형광 표면증강 라만 산란 나노-표지 입자를 제공한다.In order to achieve the above technical problem, the present invention, silica core particles; A silver nanoparticle layer surrounding the silica center particle; A polar polymer layer surrounding the silver nanoparticle layer; A silica shell surrounding the polar polymer layer and including a fluorescent material; And it provides a fluorescent surface-enhanced Raman scattering nano-labeled particles consisting of a functional layer surrounding the silica shell.
또한, 본 발명은 실리카 중심 입자 주변에 은나노입자층을 형성시키는 단계; 상기 은나노입자층의 은나노입자 표면에 표지물질을 코팅시키는 단계; 상기 표지물질이 코팅된 은나노입자층 주변에 극성고분자층을 형성시키는 단계; 상기 극성고분자층 주변에 형광물질을 포함하는 실리카 껍질을 형성시키는 단계; 및 상기 실리카 껍질 주변에 기능기층을 형성시키는 단계를 포함하는 형광 표면증강 라만 산란 나노-표지 입자의 제조방법을 제공한다.In addition, the present invention comprises the steps of forming a silver nanoparticle layer around the silica core particles; Coating a label on the surface of the silver nanoparticles of the silver nanoparticle layer; Forming a polar polymer layer around the silver nanoparticle layer coated with the label material; Forming a silica shell including a fluorescent material around the polar polymer layer; And it provides a method for producing a fluorescent surface-enhanced Raman scattering nano-labeled particles comprising forming a functional group around the silica shell.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명에 따른 형광 표면증강 라만 산란 나노-표지 입자는, (1) 실리카 중심 입자, (2) 상기 실리카 중심 입자 주변을 둘러싸고 있고 표지물질로 코팅된 은나노입자층, (3) 상기 은나노입자층을 둘러싸고 있는 극성고분자층, (4) 상기 극성고분자층을 둘러싸고 있고, 형광물질을 포함하는 실리카 껍질, 및 (5) 상기 실리카 껍질을 둘러싸고 있는 기능기층으로 이루어져 있는 것을 특징으로 한다.Fluorescent surface-enhanced Raman scattering nano-labeled particles according to the present invention, (1) the silica center particles, (2) the silver nanoparticle layer surrounding the silica center particles and coated with a labeling material, (3) surrounding the silver nanoparticle layer It is characterized by consisting of a polar polymer layer, (4) a silica shell surrounding the polar polymer layer, containing a fluorescent material, and (5) a functional group layer surrounding the silica shell.
본 발명에 따른 형광 표면증강 라만 산란 나노-표지 입자의 중심을 형성하고 있는 실리카 중심 입자는 크기가 50~300nm인 것이 바람직한데, 이는 중심 입자의 크기가 50nm 미만이면 라만 표면증강 효과가 떨어지는 문제점이 있고, 300nm를 초과하면 생물학적 응용시 많은 제약을 받는 문제점이 있기 때문이다. 구체적으로는 100~150nm 크기인 것이 바람직하다. 상기 실리카 중심 입자는 테트라에틸 오르소실리케이트(tetraethyl orthosilicate) 및 테트라메틸 오르소실리케이트 (tetramethyl orthosilicate)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상으로 이루어지는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. The silica core particles forming the center of the fluorescent surface-enhanced Raman scattering nano-labeled particles according to the present invention preferably have a size of 50 to 300 nm, which is a problem that the Raman surface enhancement effect is lowered when the size of the center particle is less than 50 nm. If it exceeds 300nm, there is a problem that a lot of restrictions in biological applications. Specifically, the size is preferably 100 nm to 150 nm. The silica center particle is preferably made of one or more selected from the group consisting of tetraethyl orthosilicate and tetramethyl orthosilicate, but is not limited thereto.
상기 실리카 중심 입자 표면 주변에는 첫 번째로 은나노입자층이 존재한다. 상기 은나노입자층에서 밀집된 은나노입자간에는 핫스팟(hot spot) 또는 정션(junction)이라고 불리는 접점이 존재하게 되는데, 이 위치에서는 증강된 라만 산란(surface enhanced Raman scattering) 현상이 더욱 강하게 발생하게 된다. 즉, 이러한 밀집된 은나노입자층은 라만 분광법을 기반으로 하는 본 발명의 나노-표지입자의 응용을 보다 용이하게 해줄 수 있다는 이점이 있다. The silver nanoparticle layer exists first around the surface of the silica center particle. There is a contact point called hot spot or junction between the dense silver nanoparticles in the silver nanoparticle layer, whereby enhanced surface enhanced Raman scattering phenomenon occurs more strongly. In other words, such a dense silver nanoparticle layer has an advantage that can facilitate the application of the nano-labeled particles of the present invention based on Raman spectroscopy.
상기 은나노입자층의 각 은나노입자 표면에는 특정 표지물질로 이루어진 자기조립단층이 코팅되어 있다. 본 발명에서 사용되는 표지물질은 간단한 구조를 가지면서도 뚜렷한 지문 영역에서 라만 스펙트럼을 보여주기 때문에, 본 발명의 나노-표지 입자에 적합한 물질이라고 볼 수 있다. Each silver nanoparticle surface of the silver nanoparticle layer is coated with a self-assembled monolayer made of a specific labeling material. Since the labeling material used in the present invention has a simple structure and shows a Raman spectrum in a distinct fingerprint region, it can be regarded as a suitable material for the nano-labeled particles of the present invention.
본 발명에서 사용되는 표지물질은 2-메틸벤젠티올(2-methyl benzenethiol), 4-메틸벤젠티올(4-methyl benzenethiol), 4-머켑토피리딘(4-mercaptopyridine), 2-나프탈렌티올(2-naphthalenethiol), 4-메톡시벤젠티올(4-methoxybenzenethiol), 3-메톡시벤젠티올(3-methoxybenzenethiol), 3,4-디메틸벤젠티올(3,4-dimethylbenzenethiol), 티오페놀(thiophenol), 3,5-디메틸벤젠티올(3,5-dimethylbenzenethiol), 아미노티오페놀(aminothiophenol) 및 4-머켑토톨루엔(4-mercaptotoluene)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 은나노입자층을 이루는 은나노입자와 결합력이 높은 화학물질이면 제한되 지 않고 사용될 수 있다. 상기에서 "은나노입자와 결합력이 높은 화학물질"은 말단에 티올기(-SH), 아민기(-NH2), 시아나이드기(-CN), 이소시아나이드(-CNO), 이소티오시아나이드(-CNS), 다이설파이드(-SS-) 또는 아자이드기(-N3)가 존재하는 화학물질을 의미하며, 이와 같이 말단에 티올기, 아민기, 시아나이드기, 이소시아나이드, 이소티오시아나이드, 다이설파이드 또는 아자이드기가 있는 화학물질은 은나노입자와 강한 친화력이 있으므로, 본 발명에서 사용되는 것이 바람직하다 .Labels used in the present invention is 2-methyl benzenethiol, 4-methyl benzenethiol, 4-mercaptopyridine, 4-mercaptopyridine, 2-naphthalenethiol (2- naphthalenethiol), 4-methoxybenzenethiol, 3-methoxybenzenethiol, 3,4-dimethylbenzenethiol, thiophenol, 3, It is preferably at least one selected from the group consisting of 5-dimethylbenzene thiol, 3,5-dimethylbenzenethiol, aminothiophenol and 4-mercaptotoluene. Chemicals with high bonding strength can be used without limitation. In the above, "a chemical substance having high binding force with silver nanoparticles" is a thiol group (-SH), an amine group (-NH 2 ), cyanide group (-CN), isocyanide (-CNO), isothiocyanide (-CNS), disulfide (-SS-) or azide group (-N 3 ) refers to the chemical present, such as thiol group, amine group, cyanide group, isocyanide, isothio Chemicals with cyanide, disulfide or azide groups have a strong affinity with silver nanoparticles and are therefore preferably used in the present invention.
본 발명에 따른 나노-표지 입자에서 상기 자기조립단층으로 코팅된 은나노입자층은 극성고분자층으로 둘러싸여 있다. 상기 극성고분자층은 본 발명에 따른 나노-표지 입자에 하기 실리카 껍질이 보다 용이하게 형성될 수 있는 환경을 마련해주며, 폴리비닐피롤리돈(poly(4-vinylpyrrolidone); PVP), 폴리에틸렌이민(polyethylene imine) 및 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이 사용될 수 있으나, 극성이 강한 고분자라면 제한되지 않고 사용될 수 있다.In the nano-labeled particles according to the present invention, the silver nanoparticle layer coated with the self-assembled monolayer is surrounded by a polar polymer layer. The polar polymer layer provides an environment in which the following silica shell can be more easily formed on the nano-labeled particles according to the present invention, and polyvinylpyrrolidone (poly (4-vinylpyrrolidone); PVP) and polyethyleneimine (polyethylene imine) and polyvinyl alcohol (polyvinyl alcohol) may be used any one or more selected from the group consisting of, but may be used without limitation if the polymer is a strong polarity.
본 발명에 따른 나노-표지 입자에서 상기 극성고분자층은 형광물질을 포함하고 있는 실리카 껍질로 둘러싸여 있다.In the nano-labeled particles according to the present invention, the polar polymer layer is surrounded by a silica shell containing a fluorescent material.
상기 실리카 껍질은 실리카 전구 물질, 즉 테트라에틸 오르소실리케이트 또는 테트라메틸 오르소실리케이트와 형광물질-아미노프로필트리에톡시실란 접합체(fluorescent dye-3-aminopropyltriethoxysilane conjugate)를 포함하고 있으며, 두께는 5~10nm인 것이 바람직하다. 상기에서 접합체에 아미노프로필트리에톡시실 란을 사용하는 이유는, 형광물질과 용이하게 결합할 뿐만 아니라 형광 실리카 껍질로부터 형광물질의 이탈을 방지할 수 있고, 실리카 껍질 표면에 아미노기를 도입하기 위해서이며, 상기 아미노기는 이후 실리카 껍질 표면에 기능기층의 도입을 용이하게 할 수 있다.The silica shell contains a silica precursor, i.e. tetraethyl orthosilicate or tetramethyl orthosilicate and a fluorescent dye-3-aminopropyltriethoxysilane conjugate, the thickness of which is 5-10 nm. Is preferably. The reason for using aminopropyltriethoxysilane as a conjugate in the above is not only to bind easily to the fluorescent material, but also to prevent the separation of the fluorescent material from the fluorescent silica shell, and to introduce amino groups on the surface of the silica shell. The amino group may then facilitate the introduction of a functional group layer on the surface of the silica shell.
상기 실리카 껍질의 두께가 5nm 미만으로 너무 얇게 되면 표지물질이 코팅된 은나노입자층을 외부의 환경으로부터 보호해 줄 수 없고, 10nm를 초과하게 되면 세포나 조직 등의 생물학적 응용시 제약이 될 수 있는 문제점이 있기 때문에 상기 범위의 두께로 조절하는 것이 바람직하다.If the thickness of the silica shell is too thin, less than 5nm can not protect the silver nanoparticle layer coated with the label from the external environment, if it exceeds 10nm there is a problem that can be a restriction in biological applications such as cells or tissues Since it is preferable to adjust to the thickness of the said range.
본 발명에 따른 나노-표지 입자의 주요 구성 요소인 형광물질을 포함하는 실리카 껍질은 라만 스펙트럼과의 조합을 통해 표지 가능한 대상의 개수를 배수적으로 증가(라만 표지물질의 수 × 형광물질의 수)시킬 수 있을 뿐만 아니라, 라만 분광만을 기능으로 하는 표지입자들이 제공하지 못하는 형광 영상을 통한 추적 기능을 제공한다. 상기에서 형광물질은 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 로다민 6G 이소티오시아네이트(RITC), Cy3, Cy5, 알렉사플루오로 405, 알렉사플루오로 430, 알렉사플루오로 488, 알렉사플루오로 532, 알렉사플루오로 546, 알렉사플루오로 555, 알렉사플루오로 568, 알렉사플루오로 594, 알렉사플루오로 633, 알렉사플루오로 647, 알렉사플루오로 660, 알렉사플루오로 680 및 알렉사플루오로 700으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.The silica shell containing the fluorescent material, which is the main component of the nano-labeled particles according to the present invention, increases the number of labelable objects in multiples by combining with the Raman spectrum (number of Raman labels × number of fluorescent materials). In addition to providing a tracking function through a fluorescent image that can not be provided by marker particles that only function Raman spectroscopy. The fluorescent material is fluorescein isothiocyanate (FITC), rhodamine 6G isothiocyanate (RITC), Cy3, Cy5, Alexafluoro 405, Alexafluoro 430, Alexafluoro 488, Alexafluoro 532 , Alexafluoro 546, Alexafluoro 555, Alexafluoro 568, Alexafluoro 594, Alexafluoro 633, Alexafluoro 647, Alexafluoro 660, Alexafluoro 680 and Alexafluoro 700 It is preferably one or more, but is not limited thereto.
본 발명에 따른 나노-표지 입자에서 상기 실리카 껍질은 기능기층으로 둘러 싸여 있으며, 상기 기능기층은 폴리에틸렌글리콜과 아민기를 포함하고 있다.In the nano-labeled particles according to the present invention, the silica shell is surrounded by a functional group layer, and the functional group layer includes polyethylene glycol and an amine group.
한편, 본 발명에서는 실리카 중심 입자 주변에 은나노입자층을 형성시키는 단계; 상기 은나노입자층의 은나노입자 표면에 표지물질을 코팅시키는 단계; 상기 표지물질이 코팅된 은나노입자층 주변에 극성고분자층을 형성시키는 단계; 상기 극성고분자층 주변에 형광물질을 포함하는 실리카 껍질을 형성시키는 단계; 및 상기 실리카 껍질 주변에 기능기층을 형성시키는 단계를 포함하는 형광 표면증강 산란 나노-표지 입자의 제조방법을 제공한다.On the other hand, the present invention comprises the steps of forming a silver nanoparticle layer around the silica core particles; Coating a label on the surface of the silver nanoparticles of the silver nanoparticle layer; Forming a polar polymer layer around the silver nanoparticle layer coated with the label material; Forming a silica shell including a fluorescent material around the polar polymer layer; And it provides a method for producing a fluorescent surface enhancement scattering nano-labeled particles comprising the step of forming a functional layer around the silica shell.
먼저, 실리카 중심 입자는 당업계에서 통상적으로 이용되는 방법으로 제조될 수 있다(W.Stober et al., Controlled growth of monodisperse silica spheres in micro size range, J.Colloid Interface Sci. 1968, 26, 62). 본 발명에서는 구체적으로 테트라에틸 오르소실리케이트(tetraethyl orthosilicate)를 암모니아 용액에 첨가한 후, 상기 용액을 실온에서 12시간 동안 교반하여 제조하였다. 이후, 상기 실리카 중심 입자에 3-머캡토프로필트리메톡시실란(3-mercaptopropyl trimethoxysilane)을 첨가하여 실리카 중심 입자 표면에 은나노입자가 고정될 수 있도록 티올기(-SH)를 도입하였다. First, silica core particles can be prepared by methods commonly used in the art (W.Sberber et al., Controlled growth of monodisperse silica spheres in micro size range, J. Colloid Interface Sci . 1968, 26, 62). . In the present invention, tetraethyl orthosilicate was specifically added to the ammonia solution, and then the solution was prepared by stirring at room temperature for 12 hours. Thereafter, 3-mercaptopropyl trimethoxysilane was added to the silica center particles to introduce a thiol group (-SH) to fix the silver nanoparticles on the surface of the silica center particles.
이후, 상기 실리카 중심 입자 주변에 은나노입자층을 형성시키는 단계를 거치게 된다(Y.Kobayashi et al., Deposition of silver nanoparticles on silica spheres by pre-treatment steps in electroless plating, Chem. Mater. 2001, 13, 1630-1633). 상기에도 언급한 바와 같이, 실리카 중심 입자 주변에 형성된 밀집된 은나노입자층은 표면 증강 라만 산란(surface enhanced Raman scattering) 효과를 더욱 강하게 부여하여 이후 라만 분광법에 의한 분석을 보다 용이하게 할 수 있다.Subsequently, a silver nanoparticle layer is formed around the silica center particle (Y. Kobayashi et al., Deposition of silver nanoparticles on silica spheres by pre-treatment steps in electroless plating, Chem. Mater . 2001, 13, 1630). -1633). As mentioned above, the dense silver nanoparticle layer formed around the silica center particles may give a stronger surface enhanced Raman scattering effect to facilitate subsequent analysis by Raman spectroscopy.
다음으로 상기 은나노입자층의 은나노입자 표면에 표지물질 자기조립단층을 코팅시키고, 은나노입자층 주변에 극성고분자층을 형성시키는 단계를 거치게 된다. 구체적으로, 은나노입자로 둘러싸인 실리카 중심 입자를 극성고분자를 포함하는 수용액에서 24시간 동안 실온에서 반응시킨 후, 추가적으로 표지물질을 포함하는 에탄올 용액에서 1시간 동안 반응시키는 것에 의해 이루어질 수 있는데, 표지물질이 극성고분자로 싸여있는 실리카 나노입자의 은나노입자층까지 확산하여 표지물질 자기조립층이 형성되게 된다. 상기에서 극성고분자로 이루어진 층은 이후 실리카 껍질이 용이하게 형성될 수 있도록 도와주는 역할을 한다. Next, a coating material self-assembled monolayer is coated on the surface of the silver nanoparticles of the silver nanoparticle layer, and a polar polymer layer is formed around the silver nanoparticle layer. Specifically, the silica center particles surrounded by silver nanoparticles may be reacted at room temperature for 24 hours in an aqueous solution containing polar polymer, and then reacted for 1 hour in an ethanol solution containing a labeling substance. The self-assembling layer of the labeling material is formed by diffusing the silver nanoparticle layer of the silica nanoparticles wrapped with the polar polymer. The layer made of a polar polymer in the above serves to help the silica shell can be easily formed.
상기에서 형광물질을 포함하는 실리카 껍질을 형성시키는 단계는, 구체적으로 형광물질과 3-아미노프로필트리에톡시실란의 혼합물을 상온에서 6시간 반응시킨 접합체를 상기 극성고분자층이 형성된 입자에 실리카 전구 물질, 즉 테트라에틸 오르소실리케이트 또는 테트라메틸 오르소실리케이트 및 암모니아수와 함께 첨가한 후, 실온에서 6 ~ 12시간 동안 교반하여 수행된다. 상기에서 형광물질과 3-아미노프로필트리에톡시실란을 반응시켜 투입하는 이유는, 공유결합을 통해 형광물질을 실리카 껍질에 효과적이고 안정적으로 도입하기 위해서이며, 상기 형광물질과 3-아미노프로필트리에톡시실란의 혼합비는 1:2 ~ 24인 것이 바람직하다. 형광물질과 3-아미노프로필트리에톡시실란의 혼합비가 상기 범위 밖, 즉 형광물질과 3-아미노프로필트리에톡시실란의 혼합비가 1:2 미만이어서 아민기가 적을 경우에는 접합체 가 효율적으로 형성되지 않고, 형광물질과 3-아미노프로필트리에톡시실란의 혼합비가 1:24를 초과하여 아민기가 과다할 경우에는 이후의 기능기층 형성에 방해가 되기 때문에, 상기 범위로 혼합하는 것이 바람직하다. In the forming of the silica shell including the fluorescent substance, specifically, a conjugate obtained by reacting a mixture of the fluorescent substance and 3-aminopropyltriethoxysilane at room temperature for 6 hours with a silica precursor on the particles having the polar polymer layer formed thereon. That is, it is added with tetraethyl orthosilicate or tetramethyl orthosilicate and ammonia water, followed by stirring at room temperature for 6 to 12 hours. The reason why the fluorescent material reacts with 3-aminopropyltriethoxysilane is introduced in order to effectively and stably introduce the fluorescent material into the silica shell through the covalent bond. It is preferable that the mixing ratio of oxysilane is 1: 2 ~ 24. When the mixing ratio of the fluorescent substance and 3-aminopropyltriethoxysilane is outside the above range, that is, when the mixing ratio of the fluorescent substance and 3-aminopropyltriethoxysilane is less than 1: 2 and the amine group is small, the conjugate is not formed efficiently. In the case where the mixing ratio of the fluorescent substance and 3-aminopropyltriethoxysilane exceeds 1:24 and the amine group is excessive, the formation of the functional group layer thereafter is hindered, so mixing in the above range is preferable.
또한, 본 발명에 따른 형광 표면증강 산란 나노-표지 입자의 제조방법에서는 나노-표지 입자 표면에 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)과 아민기를 포함하는 기능기층을 형성시킴으로써 생체친화성 및 단백질, 항체, 펩티드 또는 압타머(aptamer)와 같은 생체 물질과 쉽게 결합할 수 있는 기능성을 나노입자에 부여하였다. 상기 폴리에틸렌글리콜은 양 말단이 메톡시(-OMe)와 트리에톡시실란(-Si-OEt3)으로 되어 있고, 분자량이 300~4000인 것이 바람직하며, 구체적으로는 상기 폴리에틸렌글리콜은 분자량이 300~4000인 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 2-메톡시(폴리에틸렌옥시)-프로필)트리메톡시실란[2-(methoxy(polyethyleneoxy)-propyl)trimethoxysilane] 및 분자량이 800~4000인 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 O-(메톡시(폴리에틸렌옥시)-N-(트리메톡시실릴프로필)카바메이트[O-(methoxy(polyethyleneoxy))-N-(trimethoxysilylpropyl)carbamate]로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하다. 또한, 아민기를 도입하기 위해서는 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-aminopropyltriethoxysilane)을 사용하는 것이 바람직하다. In addition, in the method for preparing fluorescent surface-enhanced scattering nano-labeled particles according to the present invention, biocompatible and protein, antibody, and the like are formed by forming a functional layer including polyethylene glycol (PEG) and an amine group on the surface of the nano-labeled particle. The nanoparticles are endowed with the ability to easily bind to biological materials such as peptides or aptamers. The polyethylene glycol has both ends of methoxy (-OMe) and triethoxysilane (-Si-OEt 3 ), and preferably has a molecular weight of 300 to 4000, specifically, the polyethylene glycol has a molecular weight of 300 to 2-methoxy (polyethyleneoxy) -propyl) trimethoxysilane containing polyethylene glycol of 4000 and O- (including polyethylene glycol having a molecular weight of 800-4000 At least one selected from the group consisting of methoxy (polyethyleneoxy) -N- (trimethoxysilylpropyl) carbamate [O- (methoxy (polyethyleneoxy))-N- (trimethoxysilylpropyl) carbamate]. In order to introduce an amine group, it is preferable to use 3-aminopropyltriethoxysilane.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.
[실시예 1] 형광 표면증강 라만 산란 나노-표지 입자의 제조 Example 1 Preparation of Fluorescent Surface Enhanced Raman Scattering Nano-labeled Particles
1-1. 실리카 중심 입자 합성1-1. Silica Center Particle Synthesis
먼저, 1㎖의 테트라에틸오르소 실리케이트(4.5mmol) 및 78㎖의 95% 에탄올, 5㎖ 증류수(H2O)와 1㎖의 25% 암모니아수(NH4OH( aq )) 혼합 용액을 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. 원심분리를 통해 정제하여 크기가 평균 120nm인 실리카 중심 입자를 합성하였다(J. Colloid Interface Sci. 1968, 26, 62). 상기 입자를 에탄올에 분산시킨 후, 50㎕의 3-머켑토프로필트리메톡시실란((3-mercaptopropyl)trimethoxy silane, MPTS)과 100㎕의 25% 암모니아수(NH4OH(aq))를 첨가후 25℃에서 12시간 동안 교반하여 실리카 중심 입자 표면에 티올기를 도입하였다.First, 1 ml of tetraethylortho silicate (4.5 mmol) and 78 ml of 95% ethanol, 5 ml of distilled water (H 2 O) and 1 ml of 25% aqueous ammonia (NH 4 OH ( aq ) ) were mixed at 25 ° C. Stir at 12 h. Purification by centrifugation synthesized silica center particles having an average size of 120 nm ( J. Colloid Interface Sci . 1968, 26, 62). After dispersing the particles in ethanol, 50 μl of 3-mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTS) and 100 μl of 25% aqueous ammonia (NH 4 OH (aq) ) were added thereto. Stirring at 25 ° C. for 12 hours introduces a thiol group to the silica core particle surface.
1-2. 은나노입자층의 형성1-2. Formation of silver nanoparticle layer
상기 티올기가 도입된 실리카 중심 입자 주변에 은나노입자층을 형성시키기 위하여, 상기 실리카 중심 입자 220㎎을 증류수과 에탄올의 혼합용액(증류수:에탄올=1:1, 30㎖)에 분산시켰고, 이후 100㎕의 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA) 및 100㎎의 SnCl2를 순차적으로 첨가하였다. 상기 혼합용액을 25℃에서 1시간 동안 교반한 후, 에탄올로 세척하였고, 250㎖의 증류수와 50㎖의 6mM AgNO3를 첨가하여 25℃에서 30분 반응시켜 실리카 중심 입자 표면에 은나노입자층을 형성시켰다. 증류수로 3회, 에탄올로 5회 세척하여 정제하였다. In order to form a silver nanoparticle layer around the silica center particle into which the thiol group was introduced, 220 mg of the silica center particle was dispersed in a mixed solution of distilled water and ethanol (distilled water: ethanol = 1: 1, 30 ml), and then 100 µl of tree Fluoroacetic acid (TFA) and 100 mg of SnCl 2 were added sequentially. The mixed solution was stirred at 25 ° C. for 1 hour, washed with ethanol, and 250 mL of distilled water and 50 mL of 6 mM AgNO 3 were added and reacted at 25 ° C. for 30 minutes to form a silver nanoparticle layer on the surface of silica core particles. . Purified by washing three times with distilled water, five times with ethanol.
1-3. 극성고분자층 및 표지물질로 이루어진 자기조립단층의 형성1-3. Formation of self-assembled monolayer consisting of polar polymer layer and labeling substance
은나노입자층이 형성된 실리카 중심 입자에 라만 산란 효과를 부여하고, 추후에 이루어지는 형광 실리카 껍질의 형성을 용이하게 하기 위해, 극성고분자로 폴리비닐피롤리돈과 라만 표지물질을 순차적으로 도입하였다. 먼저 50㎎의 은나노입자층이 형성된 실리카 중심 입자에 0.5% 폴리비닐피롤리돈 수용액 30㎖을 투입하여 25℃에서 25시간 반응하였다. 증류수와 에탄올로 각각 1회씩 세척한 후, 표지물질로 10mM 아미노티오페놀(aminothiophenol, ATP) 20㎖를 첨가하여 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. 에탄올로 3회 세척하여 라만 표지물질과 폴리비닐피롤리돈이 도입된 나노-표지입자를 얻을 수 있었다.In order to give a Raman scattering effect to the silica center particle in which the silver nanoparticle layer was formed, and to facilitate formation of the fluorescent silica shell which will be formed later, polyvinylpyrrolidone and a Raman labeling substance were sequentially introduced into the polar polymer. First, 30 ml of 0.5% polyvinylpyrrolidone aqueous solution was added to a silica core particle having a 50 mg silver nanoparticle layer and reacted at 25 ° C. for 25 hours. After washing once with distilled water and ethanol, 20 ml of 10 mM aminothiophenol (ATP) was added as a label and stirred at 25 ° C. for 2 hours. Washing three times with ethanol to obtain a nano-labeled particle introduced with a Raman labeling material and polyvinylpyrrolidone.
1-4. 형광물질을 포함하는 실리카 껍질의 형성1-4. Formation of Silica Shells Containing Phosphors
상기와 같이 제조된 나노 입자에 형광물질이 포함된 실리카 껍질을 도입하기 위해 먼저 형광물질-아미노프로필트리에톡실란 접합체(fluorescence dye-(3-aminopropyl)triethoxysilane conjugate)를 합성하였다. 0.42nM 알렉사플루오로 647/다이메틸술폭사이드(DMSO) 용액 200㎕와 0.84nM 3-아미노프로필트리에톡실란 /DMSO 용액 200㎕를 혼합하여 25℃에서 6시간 동안 반응시켰다. 상기 화합물을 50㎕ 테트라에틸 오르소실리케이트 및 200㎕ 암모니아수와 함께 폴리비닐피롤리돈으로 둘러싸인 실리카 나노 입자 50㎎가 분산되어 있는 30㎖ 에탄올 수용액에 투입한 후, 25℃에서 6시간 동안 교반하였다. 얻어진 나노 입자는 정제를 위해 에탄올로 3차례 세척하였다.In order to introduce a silica shell containing a fluorescent material in the nanoparticles prepared as described above, a fluorescent material- (3-aminopropyl) triethoxysilane conjugate was first synthesized. 200 μl of 0.42 nM Alexafluoro 647 / dimethylsulfoxide (DMSO) solution and 200 μl of 0.84 nM 3-aminopropyltriethoxysilane / DMSO solution were mixed and reacted at 25 ° C. for 6 hours. The compound was added to a 30 ml ethanol aqueous solution in which 50 mg of silica nanoparticles surrounded by polyvinylpyrrolidone were dispersed together with 50 µl tetraethyl orthosilicate and 200 µl ammonia water, followed by stirring at 25 ° C. for 6 hours. The obtained nanoparticles were washed three times with ethanol for purification.
1-5. 기능기층의 형성1-5. Formation of functional base layer
형광물질이 포함된 실리카 껍질 주변에 생체친화성 및 기능성을 지닌 기능기층을 형성시키기 위하여, 상기 형광 실리카 껍질이 도입된 나노 입자 10㎎을 10㎖ 에탄올에 분산시킨 후, 2-메톡시(폴리에틸렌옥시)-프로필)트리메톡시실란(2-[methoxy(polyethyleneoxy)-propy]trimethoxysilane, 분자량: 490~560) 11㎕(5μmol), 3-아미노프로필트리에톡시실란 0.22㎎ 및 100㎕ 암모니아수 (25%)를 투입하여 25℃에서 6시간 동안 교반하였다. 수득된 나노 입자(F-SERS 입자)는 정제를 위해 에탄올로 3차례 세척하였다.In order to form a functional layer having biocompatibility and functionality around the silica shell containing the fluorescent substance, 10 mg of the nanoparticles containing the fluorescent silica shell were dispersed in 10 ml ethanol, followed by 2-methoxy (polyethyleneoxy ) -Propyl) trimethoxysilane (2- [methoxy (polyethyleneoxy) -propy] trimethoxysilane (molecular weight: 490 ~ 560) 11 μl (5 μmol), 0.22 mg of 3-aminopropyltriethoxysilane and 100 μl ammonia water (25% ) Was added and stirred at 25 ° C. for 6 hours. The obtained nanoparticles (F-SERS particles) were washed three times with ethanol for purification.
상기와 같이 제조된 형광 표면증강 라만 산란 나노-표지 입자(F-SERS 입자)의 구조를 도 1에 나타내었고, 간략한 제조 방법을 도 2에 나타내었다. The structure of the fluorescent surface-enhanced Raman scattering nano-labeled particles (F-SERS particles) prepared as described above is shown in FIG. 1, and a brief manufacturing method is shown in FIG. 2.
또한, 상기 F-SERS 입자에 대해 라만 분석을 실시하여 그 결과를 도 3에 나타내었다. 이 결과로부터 하나의 나노 입자에 라만 신호와 형광 신호를 동시에 부여할 수 있으며, 두 스펙트럼은 다양한 응용을 위하여 조합 가능한 분광학적 신호임을 확인할 수 있었다. In addition, Raman analysis was performed on the F-SERS particles and the results are shown in FIG. 3. From these results, it is possible to simultaneously provide a Raman signal and a fluorescence signal to a single nanoparticle, and the two spectra are combinable spectroscopic signals for various applications.
[실시예 2] 생체 적용을 위한 세포독성 시험Example 2 Cytotoxicity Test for In Vivo Application
실시예 1에서 제조된 F-SERS 입자가 생체 적용이 가능한지 알아보기 위한 세포독성 시험을 수행하였다.Cytotoxicity tests were performed to see if the F-SERS particles prepared in Example 1 were biocompatible.
WI-38(normal lung epithelial cells), SK-BR3(breast mammary gland epithelial cancer cell) 및 H226(lung squamous carcinoma cells)(한국세포주은행으로부터 구입)을 10% FBS가 포함된 RPMI-1640 배지에서 5% CO2 및 37℃의 조건하에 24시간 동안 배양하였다. 세포를 96 플레이트의 각 웰에 5×104개의 세포수로 분주하였고, 상기 실시예 1에서 제조한 F-SERS 입자를 처리하였으며, 결과를 도 4a 내지 도 4c에 나타내었다. Normal lung epithelial cells (WI-38), breast mammary gland epithelial cancer cells (SK-BR3) and lung squamous carcinoma cells (H226) (purchased from Korea Cell Line Bank) were 5% in RPMI-1640 medium containing 10% FBS. Incubated for 24 hours under conditions of CO 2 and 37 ° C. Cells were dispensed into 5 × 10 4 cell numbers in each well of 96 plates, and the F-SERS particles prepared in Example 1 were treated, and the results are shown in FIGS. 4A to 4C.
도 4a 내지 도 4c에 나타난 바에 따르면, 본 발명의 F-SERS 입자가 상기 모든 세포주에서 독성을 나타내지 않음을 확인할 수 있었다. 즉, 본 발명의 F-SERS 입자가 생체 적용에 적합함을 확인하였다.As shown in Figures 4a to 4c, it was confirmed that the F-SERS particles of the present invention does not show toxicity in all the cell lines. That is, it was confirmed that the F-SERS particles of the present invention is suitable for biological applications.
[실시예 3] 형광 표면증강 라만 산란 나노-표지 입자에 의한 아포프토시스가 유발된 세포의 분석 실험Example 3 Analysis of Cells Induced Apoptosis by Fluorescent Surface Enhancing Raman Scattering Nano-labeled Particles
상기 실시예 1에서 제조된 F-SERS 입자를 이용하여 아포프토시스가 유발된 부위를 분석하는 실험을 수행하였다. Experiments were performed to analyze the apoptosis-induced site using the F-SERS particles prepared in Example 1.
먼저, 폐암 세포주에 0.1μM의 스타우로스포린(STS, Sigma-Aldrich, Louis, MO, USA)을 처리하여 아포프토시스(apoptosis)를 유발시켰고, 이후 F-SERS 입자에 아넥신 V(annexin V)를 도입하였다(도 5 참조). 아넥신 V는 칼슘-의존 포스포리피드-결합 단백질로서 아포프토시스가 유발된 세포에서 발견되는 포스파티딜세린(Phosphatidylserin)에 강한 친화력을 갖고 있다(Martin et al, 1995). 따라서, 아넥신 V가 결합된 F-SERS 입자를 통해 아포프토시스가 유발된 세포를 검출할 수 있다.First, 0.1 μM of staurosporin (STS, Sigma-Aldrich, Louis, MO, USA) was treated in lung cancer cell lines to induce apoptosis, and then annexin V was introduced into F-SERS particles. (See FIG. 5). Annexin V is a calcium-dependent phospholipid-binding protein and has a strong affinity for Phosphhatidylserin found in apoptosis-induced cells (Martin et al, 1995). Thus, apoptosis-induced cells can be detected through F-SERS particles bound to Annexin V.
F-SERS 입자와 폐암 세포주를 같이 배양한 후, 아포프토시스가 일어난 부위에 대해 먼저 공초점 형광 현미경으로 형광분석을 수행하였고, 이후 공초점 라만 시스템(confocal Raman system, LabRam 300, JY-Horiba, Edison, NJ, USA)으로 라만 분석을 수행하여 그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다. After culturing F-SERS particles and lung cancer cell lines together, fluorescence analysis was first performed on confocal fluorescence microscopy on the site where apoptosis occurred, followed by confocal Raman system (LabRam 300, JY-Horiba, Edison, NJ, USA), the Raman analysis was performed and the results are shown in FIGS. 6 and 7.
도 6에 나타난 바에 따르면, STS를 처리하지 않은 정상 세포(A 및 B)와 비교하여 STS를 처리하여 아포프토시스가 유발된 세포에 F-SERS 입자를 처리한 경우(C 및 D), 아포프토시스 부위에서 붉은색 형광 신호가 나타남을 확인할 수 있었다. As shown in FIG. 6, when F-SERS particles were treated to apoptosis-induced cells by treating STS as compared to normal cells (A and B) not treated with STS (C and D), red at the apoptosis site It was confirmed that the color fluorescence signal appeared.
또한, 도 7에 나타난 바에 따르면, STS를 처리하지 않은 정상 세포와 비교하여(도 7a), STS를 처리하여 아포프토시스가 유발된 세포에 F-SERS 입자를 처리한 경우(도 7b) 아미노티오페놀(aminothiophenol)의 라만 신호가 발생하였음을 확인할 수 있었다. In addition, as shown in Figure 7, compared with normal cells that did not process STS (Fig. 7a), when treated with F-SERS particles to cells apoptosis-induced by treating STS (Fig. 7b) aminothiophenol ( It was confirmed that the Raman signal of aminothiophenol) was generated.
즉, 본 발명에 따라 제조된 형광 표면증강 라만 산란 나노-표지 입자가 형광 및 라만 신호를 이용하여 아포프토시스를 빠르고 민감하게 분석할 수 있음을 확인할 수 있었다. That is, the fluorescent surface-enhanced Raman scattering nano-labeled particles prepared according to the present invention was able to quickly and sensitively analyze apoptosis using fluorescence and Raman signals.
상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 형광 표면증강 라만 산란 나노-표지 입자는 형광분석 및 라만 스펙트럼에 매우 민감하기 때문에 아포프토시스를 보다 민감하고 빠르게 분석할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 형광 표면증강 라만 산란 나노-표지 입자는 세포 항상성을 유지하기 위해 중요한 아포프토시스를 비롯한 다양한 세포학적 및 분자학적 현상의 분석에 쉽게 이용될 수 있다.As described above, since the fluorescent surface-enhanced Raman scattering nano-labeled particles according to the present invention are very sensitive to fluorescence analysis and Raman spectrum, apoptosis can be analyzed more sensitively and quickly. Thus, the fluorescence surface enhanced Raman scattering nano-labeled particles according to the present invention can be readily used for the analysis of various cellular and molecular phenomena including apoptosis, which are important for maintaining cell homeostasis.
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