KR102041389B1

KR102041389B1 - N-(9,13b-디하이드로-1H-디벤조[c,f]이미다조[1,5-a]아제핀-3-일)-2-하이드록시벤즈아미드 및 2-((9,13b-디하이드로-1H-디벤조[c,f]이미다조[1,5-a]아제핀-3-일) 카바모일)페닐 아세테이트의 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 항염증 및 진통제 조성물

Info

Publication number: KR102041389B1
Application number: KR1020170170098A
Authority: KR
Inventors: 서홍원; 이재용; 임순성; 이정태; 황승환; 장상필; 박성환; 전정호; 임현민; 이주미
Original assignee: (주)프론트바이오
Priority date: 2017-12-12
Filing date: 2017-12-12
Publication date: 2019-11-27
Also published as: WO2019117592A1; CN111566107A; KR20190069815A; US20200369668A1; US11396511B2

Abstract

본 발명은 N-(9,13b-디하이드로-1H-디벤조[c,f]이미다조[1,5-a]아제핀-3-일)-2-하이드록시벤즈아미드 및 2-((9,13b-디하이드로-1H-디벤조[c,f]이미다조[1,5-a]아제핀-3-일) 카바모일)페닐 아세테이트의 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 항염 효과 및 통증 억제에 효과가 뛰어난 화합물 및 이의 제조방법, 및 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 염증 및/또는 통증의 예방 또는 치료용 조성물이 제공된다.

Description

N-(9,13b-디하이드로-1H-디벤조[c,f]이미다조[1,5-a]아제핀-3-일)-2-하이드록시벤즈아미드 및 2-((9,13b-디하이드로-1H-디벤조[c,f]이미다조[1,5-a]아제핀-3-일) 카바모일)페닐 아세테이트의 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 항염증 및 진통제 조성물{N-(9,13b-dihydro-1H-dibenzo[c,f]imidazo[1,5-a]azepin-3-yl)-2-hydroxybenzamide and 2-((9,13b-dihydro-1H-dibenzo[c,f]imidazo[1,5-a]azepin-3-yl) carbamoyl)phenyl acetate compound, and method for producing the same, and composition for the anti-inflammatory and analgesia comprising the same}

본 발명은 N-(9,13b-디하이드로-1H-디벤조[c,f]이미다조[1,5-a]아제핀-3-일)-2-하이드록시벤즈아미드 및 2-((9,13b-디하이드로-1H-디벤조[c,f]이미다조[1,5-a]아제핀-3-일) 카바모일)페닐 아세테이트의 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

국제통증학회(IASP: International Association for the Study of Pain)의 정의에 의하면 통증이란 "실질적인 또는 잠재적인 조직 손상이나 이러한 손상에 관련하여 표현되는 감각적이고 정서적인 불유쾌한 경험"으로 정의된다. 통증은 크게 침해성 통증(nociceptive pain), 염증성 통증(inflammatory pain) 및 신경병성 통증(neuropathic pain) 등 3가지로 분류될 수 있다. 이러한 통증은 감각적인 면과 정서적인 면을 포함하고 있으며, 같은 자극에 대해서도 개개인에 따라 그 반응이 다르게 나타나게 된다.

일반적으로 통증은 조직의 실제적 손상이나 잠재적 손상에 의한 일차 통각 수용체(nociceptive receptor)의 활성에 의해 유발된다. 통각 수용체는 다른 감각 수용체와는 달리 따로 존재하는 기관이 아니고 말초신경 중 감각신경의 자유 신경 종말(free nerve ending) 형태로 표피세포 사이에 존재하게 된다. 통증을 전달하는 말초신경세포의 세포체는 척수 옆의 배쪽 뿌리 신경절(dorsal root ganglion)에 위치하고 있으며 기다란 하나의 구심성 돌기와 척수 쪽으로 뻗는 짧은 돌기를 가지고 있는 세포이다. 통증 발생과 전달의 주역은 신경세포와 신경세포 사이에 존재하는 시냅스와 신경전달물질로 이루어진다. 통각수용체의 흥분은 변환(transduction), 전달(transmission), 변연계에서의 조정(modulaton)을 거쳐 대뇌 피질에서 인지(perception)하게 된다. 즉 조직의 손상은 통각 수용체에서 염증 반응을 일으키게 되고, 이 염증반응은 통각 수용체의 흥분으로 이어진다. 통각 수용체의 흥분은 유발전위(action potential)를 생성하면 이 유발전위가 축삭을 통해 전달되어 배쪽뿌리신경절에 있는 신경세포체가 흥분하게 된다. 배쪽뿌리신경절 속의 신경세포는 척수 쪽으로 뻗어 있는 축삭을 통해 유발전위를 전파하는데, 결국에는 척수 배쪽 뿔(dorsal horn) 안에 위치하여 있는 척수쪽 신경종말로 이 유발전위가 전파된다. 신경종말에서는 시냅스 안으로 신경전달물질을 분비하여 이차 신경세포를 흥분시켜 통증신호를 뇌 쪽으로 전달하게 된다. 이때의 신경전달물질은 글루타메이트(glutamate)가 주된 역할을 할 것으로 생각되고 있다. 척수에서 일차 감각신경세포는 이차 감각신경세포뿐만 아니라 많은 사이신경세포(interneuron)와 시냅스를 이룬다.

통증을 느끼게 하는 통각의 전달경로에 대해서는 신경해부학적으로 비교적 잘 알려져 있으나, 기전이나 증상의 경감 및 진통 기전에 대해서는 아직도 잘 알려져 있지 않은 점이 많다. 특히 만성 통증은 인간의 삶 가운데 가장 고통을 주는 문제로 이를 해결하고자 하는 노력은 인간 역사 이래로 지속되어 왔으며 이의 기전과 치료에 많은 학자들의 노력이 경주되어 왔다. 그러나 통증을 일으키는 병인이 매우 다양하고, 이에 따른 통각 유발 기전의 차이가 있으며, 통증 연구에 필요한 적절한 동물모델이 정립되어 있지 않기 때문에 많은 연구가 집중되어 왔음에도 불구하고 아직도 적절한 해답은 없다고 할 수 밖에 없다.

염증은 혈관확장, 혈액 삼출, 염증세포의 이동, 통각 수용체의 감작 등에 의하여 박절, 부종, 열감, 통증 등을 수반하는 일련의 증후군이다. 사람에 있어서는 류마티스성 관절염, 세균감염 및 그 밖의 염증 질환이 만성적인 통증의 발현에 중요한 요인으로 알려져 있다. 이러한 염증성 통증이 지속적으로 유지되어 만성 통증으로 진전되는 경우 환자는 통증 자체에 의한 고통뿐만 아니라 정신적 및 사회적 고통도 함께 동반되기 때문에 즉각적이고 적극적으로 치료되어야 한다. 하지만 질병에 대한 효과적인 치료법이나 치료약제의 결핍으로 치료에 어려움을 겪고 있는 실정이다.

염증과 관련된 통증에 대한 연구는 통증 연구의 가장 오래된 모델 중 하나이다. 염증이 유발되었을 경우, 조직 내에서는 프로스타그란딘(prostaglandin), 히스타민(histamine), 브라디키닌(bradykinin), 세로토닌(serotonin), 인터류킨-1, 인터류킨-6, 물질(substance) P 등 많은 종류의 화학 매개물질(chemical mediators)이 염증세포와 손상조직, 신경 종말 등에서 유리되어 조직의 해부학적, 생리학적 변화를 유발하며, 유해자극수용기(nociceptor)를 활성화시켜 통각을 유발한다. 또한 이러한 급성 통증이 신경계 내부의 변형을 초래하여 지속적인 통증을 일으키는 것으로도 생각되고 있다.

한편, 신경계의 손상이나 기능적이상으로 발생하는 통증인 신경병성 통증은 난치성이며 만성적으로 오래 지속되는 특성이 있다. 이러한 통증을 가진 환자는 삶의 질이 현저히 저하되고 통증 자체뿐만 아니라 수면장애, 우울증과 같은 정서장애, 사회 적응력 저하로 인한 생산성 저하 등의 사회적 문제까지 야기시킨다.

통증 완화 또는 억제하는 종래기술로, 미국특허번호 제5,942,503호에 에피나스틴을 포함하는 동통치료용 약제학적 조성물이 공지되어 있으며, 미국특허번호 제8,828,979호에 살리실산이 통증 완화 효과를 갖는다는 것이 공지되어 있다. 또한, 통증을 억제하기 위하여 일반적으로 비스테로이드성 소염진통제가 사용되는데, 이의 예로는 아스피린, 이부프로펜 또는 케토프로펜이 있다. 그러나, 비스테로이드성 소염진통제(non-steroidal anti-inflammatory drugs; NSAIDs)는 잠재적으로 위장관장애 및 출혈 등의 부작용 때문에 사용이 제한적이다. 더욱이, 신경병성 통증에 대한 치료는 주로 말초신경이나 중추 신경에서 이온통로 활성도 조절(gabapentin, pregabalin, lidocaine 등)이나 내인성 억제 기전의 보강(TCA, duloxetine, 아편계 약물) 등에 국한되어 있다. 많은 약들이 신경병증 통증에 효과가 있다고 알려져 왔지만 효과가 그리 만족스럽지 못하고 있는 실정이다.

이에 따라, 신규한 화합물을 포함하는 염증 억제 또는 통증의 완화 효과가 있는 조성물의 개발이 필요한 실정으로, 본 발명의 합성 화합물을 이용한 통증의 완화 또는 염증 억제 효과에 대해서는 개시된 바가 없으며, 부작용이 적고 우수한 효과를 나타낼 수 있는 통증 완화 또는 염증 억제 효과를 가지는 진통제 조성물의 개발이 필요한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 항염 효과 및 통증 억제에 효과가 뛰어난 화합물 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 염증 및/또는 통증의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.

명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 기술자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

본원에서 사용된 용어 “알킬”은 단독 또는 다른 치환기의 일부로서, 지정된 탄소수를 갖는 직쇄형 또는 분지형 사슬인 완전히 포화된 지방족 탄화수소 라디칼을 의미한다. 예를 들어, "C₁-C₁₀ 알킬"은 부모 알칸의 단일 탄소 원자로부터 하나의 수소 원자를 제거함으로써 유도된 1 내지 10개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄형 또는 분지형의 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 본 발명의 문맥에서, 달리 특정하지 않는 한, 용어 "알킬"은 "C₁-C₁₀ 알킬", 바람직하게는 "C₁-C₅ 알킬"을 의미한다.

본원에서 사용된 용어 “알킬카보닐”은 단독 또는 다른 치환기의 일부로서, 알칸카복실산으로부터 유도된 아실기, 즉 알킬-C(O)-, 예를 들어 아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 발레릴, 4-메틸발레릴 등을 지칭한다. 본 발명의 문맥에서, 달리 특정하지 않는 한, 용어 "알킬카보닐"은 "C₁-C₁₀ 알킬카보닐", 바람직하게는 "C₁-C₅ 알킬카보닐"을 의미한다.

본 발명은 하기 화학식 A를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공하며,

[화학식 A]

여기서, R은 수소, C₁-C₅ 알킬 및 C₁-C₅ 알킬카보닐로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 화합물은 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:

(1) N-(9,13b-디하이드로-1H-디벤조[c,f]이미다조[1,5-a]아제핀-3-일)-2-하이드록시벤즈아미드(E-S); 및

(2) 2-((9,13b-디하이드로-1H-디벤조[c,f]이미다조[1,5-a]아제핀-3-일) 카바모일)페닐 아세테이트(E-A).

또한, 본 발명은 화학식 A를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 치료학적으로 유효한 양으로 포함하는 통증의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 통증은 통각수용기성 통증, 침해성 통증, 심인성 통증, 염증성 통증, 병적 통증, 신경병성 통증, 암 통증, 수술후 통증, 삼차 신경통, 특발성 통증, 당뇨 신경병성 통증 및 편두통으로부터 선택되지만, 이에 제한되지는 않는다.

또한, 본 발명은 화학식 A를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 치료학적으로 유효한 양으로 포함하는 염증의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 약학조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, pH 조절제, 안정화제, 보존제, 감미제 및 착향제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 추가로 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 약학조성물은 점안제, 주사제, 과립제, 정제, 환제, 캡슐제, 겔, 시럽, 현탁제, 유제, 점적제 및 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형인 것을 특징으로 하지만, 이에 제한되지는 않는다.

본원에 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 조성물의 투여로 염증 및/또는 통증 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본원에 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 조성물의 투여로 염증 및/또는 통증의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다

본원에 사용되는 용어 "약학적으로 유효한 양"은, 통증을 예방, 완화 또는 치료하기 위한 효능 및 작용을 나타내고 달성하기 충분한 양을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "라세미체"는, 다른 입체구조인 2개의 광학이성질체가 등량이고, 광학활성이 결여된 것을 의미한다.

본원에서 사용된 용어 "거울상이성질체"는 서로의 겹치지 않는 거울상인 화합물의 두 입체이성질체를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "부분입체이성질체"는, 광학이성질체가 아닌 입체이성질체를 의미하고, 화합물의 2개 이상의 입체이성질체가 등가의 카이랄 중심 중 하나 이상(전부는 아님)에서 다른 구조를 갖는 경우에 발생하므로 서로 거울상이 아니다.

본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 화합물은 라세미체, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체, 거울상 이성질체의 혼합물 또는 부분입체 이성질체의 혼합물 형태를 포함하며, 본 발명의 화합물들이 특정한 입체화학을 갖는 것들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 1) 하기 화학식 (2)로 나타나는 화합물을 용매에 용해시켜 혼합물을 제조하는 단계; 2) 상기 혼합물에 하기 화학식 (1)로 나타나는 화합물을 첨가하여 혼합하여 커플링 반응을 진행하는 단계; 3) 상기 혼합물에 염기를 추가로 첨가하는 단계; 및 4) 상기 커플링 반응에 사용되는 커플링제를 추가로 첨가하는 단계를 포함하는 하기 화학식 (3)으로 나타나는 화합물 (3)의 제조방법을 제공한다.

[화학식 (1)]

[화학식 (2)]

[화학식 (3)]

본 발명의 일 구체예에서, 상기 용매는 DCM, CH₃CN 및 CHCl₃로 이루어진 군으로부터 선택되지만 이에 제한되지는 않으며, 가장 바람직하게는 CHCl₃가 사용된다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 염기는 DIPEA 및 TEA로 이루어진 군으로부터 선택되지만 이에 제한되지는 않으며, 가장 바람직하게는 TEA가 사용된다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 커플링제는 DCC, HATU 및 EDCI로 이루어진 군으로부터 선택되지만 이에 제한되지는 않으며, 가장 바람직하게는 EDCI가 사용된다.

또한, 본 발명은1) 하기 화학식 (3)으로 나타나는 화합물 (3)을 산촉매 존재하에서 아세트산무수물과 반응시키는 것을 포함하는 하기 화학식 (4)로 나타나는 화합물 (4)의 제조방법을 제공한다.

[화학식 (3)]

[화학식 (4)]

본 발명의 약학적으로 허용 가능한 염은 본 기술 분야에 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있으며, 예를 들어, 염산, 브롬산, 황산, 황산 수소 나트륨, 포스페이트, 나이트레이트 및 카보네이트와 같은 무기산을 갖는 염; 및 포름산, 아세트산, 프로피온산, 옥살산, 숙신산, 벤조산, 시트르산, 말레산, 말론산, 타르타르산, 글루콘산, 젖산, 겐티스산, 푸마르산, 락토비오닉산, 살리실산, 트리플루오로아세트산 및 아세틸살리실산 (아스피린)과 같은 유기산을 갖는 염; 또는 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신, 세린, 시스테인, 시스틴, 아스파르트산, 글루타민, 리신, 아르기닌, 타이로신 및 프롤린과 같은 아미노산을 갖는 염; 메탄 설포네이트, 에탄 설포네이트, 벤젠 설포네이트 및 톨루엔 설포네이트와 같은 설폰산을 갖는 염; 소듐, 리튬 및 포타슘과 같은 알칼리 금속과의 반응에 의한 금속염; 또는 암모늄 이온을 갖는 염이지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학조성물은 유효 성분 화합물뿐만 아니라 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 본 발명의 약학조성물에 포함되는 약학적으로 허용 가능한 담체는 통상적으로 약제 처방에 사용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 포타슘 포스페이트, 알기네이트, 젤라틴, 포타슘 실리케이트, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸하이드록시 벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 탈크, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 약학조성물은 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용 가능한 담체 및 제형의 상세는 Remington's Pharmaceutical Sciences(제19판, 1995년)를 참조할 수 있다.

본 발명의 약학조성물에 사용될 수 있는 부형제로는 감미제, 결합제, 용해제, 용해보조제, 습윤제, 유화제, 등장화제, 흡착제, 붕해제, 산화방지제, 방부제, 활택제, 충진제, 방향제 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들면 부형제로서 락토스, 덱스트로스, 슈크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로오스, 글라이신, 실리카, 마그네슘 알루미늄 규산염, 녹말, 젤라틴, 트라가칸트 고무, 알지닌산, 소듐알진산염, 메틸셀룰로오스, 소듐카복실메틸셀룰로오스, 물, 에탄올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 염화나트륨, 염화칼슘, 오렌지 엣센스, 딸기 엣센스, 바닐라 향 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 화합물을 약제로서 사용하기 위해, 후자를 제약 제제의 형태로 제조하며, 이는 경구 또는 비경구 투여용 활성 성분 이외에 적합한 제약상 유기 또는 무기 불활성 담체 물질, 예를 들어, 물, 젤라틴, 아라비아 검, 락토스, 전분, 식물성 오일, 폴리알킬렌글리콜 등을 함유한다. 제약 제제는 고체 형태, 예를 들어, 정제, 당의정, 좌제 또는 캅셀제, 또는 액체 형태, 예를 들어, 액제, 현탁제 또는 유제로서 존재할 수 있다. 또한, 이들은 임의로 보조제, 예를 들어, 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제; 삼투압 변경용 염 또는 완충제를 함유한다.

경구 투여용으로는, 특히 활석 및/또는 탄화수소 비히클 또는 결합제, 예를 들어, 락토스, 옥수수 또는 감자 전분을 함유하는 정제, 당의정 또는 캡슐제가 적합하다. 또한, 액체 형태, 예를 들어, 감미제가 첨가된 쥬스로 투여할 수 있으며, 비경구 투여용으로는, 특히 주사 액제 또는 현탁제가 바람직하며, 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 주입 또는 관절 내 주입으로 투여할 수 있다. 보다 구체적으로, 근육 주입 또는 복강 주입으로 투여한다.

또한, 본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물의 인체에 대한 용량은 일반적으로 몸무게가 70 kg인 성인환자를 기준으로 할 때 0.1 mg/일 내지 2,000 mg/일의 범위인 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 화합물은 1일 1회 내지 수 회로 분할 투여할 수 있다. 다만, 상기한 투여 용량은 환자의 건강상태, 나이, 몸무게 및 성별과, 투여 형태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 이에 따라 본 발명의 범주는 상기 제시한 투여용량에 국한되지는 않는다.

본 발명에 의하면, 염증 및/또는 통증의 예방 및 치료에 효과가 뛰어난 화합물 및 이의 제조방법이 제공된다.

또한, 본 발명에 의하면, 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 염증 및/또는 통증의 예방 및 치료용 조성물이 제공된다.

본 발명에 따른 제조방법을 이용함으로써, 우수한 수율로 수득되는 함염 효과 및 통증 억제에 우수한 효과를 갖는 화합물 및 이를 포함하는 조성물이 제공된다.

도 1은 본 발명의 실시형태에 따른 화합물의 NO 생성량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 실시형태에 따른 화합물의 세포 생존율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 실시형태에 따른 화합물의 웨스턴 블랏 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 실시형태에 따른 화합물의 비틀림 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 실시형태에 따른 화합물의 포르말린 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 실시형태에 따른 화합물의 열판 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 실시형태에 따른 화합물 E-S의 당뇨병성 신경병증 모델에서의 본 프레이 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 실시형태에 따른 화합물 E-A의 당뇨병성 신경병증 모델에서의 본 프레이 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 실시형태에 따른 화합물 E-S의 요산 일나트륨 모델에서의 본 프레이 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 실시형태에 따른 화합물 E-A의 요산 일나트륨 모델에서의 본 프레이 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 실시형태에 따른 화합물 E-S의 항암제유도 말초신경병증 모델에서의 본 프레이 시험 결과를 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

재료 및 방법

본 실험에서 사용한 모든 시약은 Aldrich 사와 TCI 사, Alfa aesar 사의 제품을 사용하였으며, 용매는 Junsei, Samchun, Burdick & Jackson 사의 제품을 정제없이 사용하였다. 반응에 사용한 모든 유리 기구는 120℃에서 12시간 이상 건조 시킨 뒤 사용하였다. NMR 스펙트럼인 수소 핵 자기 공명 스펙트럼(¹H NMR spectrum), 탄소 핵 자기 공명 스펙트럼(¹³C NMR spectrum)은 TMS에 대한 ppm(parts per million)으로 보고된 화학적 이동(shift)(δ) 및 Hz로 표시한 커플링 상수(J)를 사용하여, ¹H의 경우 Varian Mercury TM 300MHz FT-NMR 및 ¹³C의 경우 75MHz에서 기록하였다. NMR 용매는 CDCl₃, acetone-d₆, DMSO-d₆ 및 메탄올-d₄를 사용하여 내부 표준인 TMS로써 사용하였다. 플래쉬 크로마토그래피(Flash chromatography)는 실리카겔 Merck 60(230-400mesh)을 사용하여 수행하였다. 박층 크로마토그래피(TLC) 는 TLC 실리카 겔 60 F254(Merck, 층 두께 0.2mm), 유리가 부착된 실리카겔 플레이트에서 UV 광(254nm)에 의한 시각화 또는 p-아니스알데히드로 처리하여 수행하였다. 녹는점은 MEL-TEMP II 장치에서 측정되었고 보정되지 않았다. UV 흡광도를 Shimadzu UV-1800 분광계로 측정하고 Origin 8 프로그램을 사용하여 화합물의 IC₅₀ 값을 계산하였다. 질량 스펙트럼은 강원대학교 중앙연구소의 Jeol JMS-700에서 획득되었다. GC/MSD(가스 크로마토그래피/질량분광분석)는 Agilient Technologies Inc의 7802A GC/5977E MSD로 얻었다.

제조예 : 화합물의 합성

제조예 1: N-(9,13b- 디하이드로 -1H- 디벤조[c,f]이미다조[1,5-a]아제핀 -3-일)-2-하이드록시벤즈아미드(E-S)의 합성

100mL 둥근바닥 플라스크에 아르곤 환경하에서 살리실산 (2)(0.36g, 2.62mmol)를 클로로폼(10mL)에 용해시켰다. 혼합물에 HOBt(1-하이드록시벤조트리아졸, 0.47g, 3.50mmol)와 9,13b-디하이드로-1H-디벤조[c,f]이미다조[1,5-a]아제핀-3-아민 (1)(0.5g, 1.75mmol)을 넣고, TEA(트리에틸아민, 0.52mL, 3.85mmol)을 넣고 30분 동안 교반시켰다. 0에서 혼합물에 EDCI(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드, 0.67g, 3.50mmol)을 천천히 넣어준 후, 12시간 동안 점차 온도를 증가시켜 실온에서 교반시켰다. 반응이 완결된 후 에틸 아세테이트(20mL)를 첨가하였다. 포화된 NaHCO₃(소듐 바이카보네이트, 20mL)와 브라인(20mL)으로 세척하였다. Na₂SO₄를 첨가하여 수분을 제거한 후, 회전농축기로 용매를 제거하고 컬럼 크로마토그래피(헥산:에틸 아세테이트=4:1)로 분리하여 흰색 고체인 N-(9,13b-디하이드로-1H-디벤조[c,f]이미다조[1,5-a]아제핀-3-일)-2-하이드록시벤즈아미드 (3)(0.31g, 0.84mmol, 47.7%)를 수득하였다. ¹H NMR (300MHz, CDCl₃) δ: 3.50 (d, 1H, J=14.4 Hz), 3.70 (t, 1H, J=10.2 Hz), 4.25(t, 1H, J=9.6 Hz), 4.54 (d, 1H, J=14.4 Hz), 5.20 (t, 1H, J=10.2 Hz), 6.75 (d, 1H, J=7.5 Hz), 6.78 (d, 1H, J=7.5 Hz), 6.94 (t, 1H, J=4.3 Hz), 7.16-7.42 (m, 7H), 7.51 (d, 1H, J=7.8 Hz) 7.97 (d, 1H, J=8.4 Hz), 9.25 (s, 1H), 13.20 (s, 1H); ¹³C NMR (75MHz, CDCl₃) δ: 38.7, 50.7, 60.8, 117.4, 118.1, 119.3, 127.2, 127.3, 127.7, 127.8, 127.9, 128.5, 128.7, 130.2, 130.4, 133.8, 135.0, 135.4, 135.5, 139.5, 160.8, 161.4; LRMS (EI⁺) m/z (%): 369 ([M]+), 248 (base), 194, 121.

합성결과

N-(9,13b-디하이드로-1H-디벤조[c,f]이미다조[1,5-a]아제핀-3-일)-2-하이드록시벤즈아미드 (3)의 합성을 몇몇의 커플링제와 함께 조사하였으며, 이를 하기 표 1에 나타내었다. DCC(N,N'-디사이클로헥실카보이미드)와 TEA(트리메틸아민) 또는 DIPEA(N,N-디이소프로필에틸아민)를 사용한 살리실산 (2)과 9,13b-디하이드로-1H-디벤조[c,f]이미다조[1,5-a]아제핀-3-아민 (1)의 커플링 반응은 수율이 낮은 것으로 나타났다(수율 16~17%). HATU(1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트)를 DIPEA와 함께 사용한 경우 수율이 매우 낮았다(수율 2%). EDCI 및 HOBt를 TEA와 함께 커플링 반응에 사용한 경우, 용매는 수율에 큰 영향을 미친 것으로 나타났다. 반응 조건의 최적화 후, 최종 반응 조건에서 용매를 CHCl₃로 설정하였다(수율 48%).

N-(9,13b-디하이드로-1H-디벤조[c,f]이미다조[1,5-a]아제핀-3-일)-2-하이드록시벤즈아미드 (3)의 반응조건

번호	시약	염기	용매	수율
1	DCC	DIPEA	DCM	17%
2	DCC	TEA	DCM	16%
3	HATU	DIPEA	CH₃CN	2%
4	EDCI	TEA	DCM	5%
5	EDCI	TEA	CHCl₃	48%

제조예 2: 2 -((9,13b- 디하이드로 -1H- 디벤조[c,f]이미다조[1,5-a]아제핀 -3-일) 카바모일)페닐 아세테이트(E-A)의 합성

100mL 둥근바닥 플라스크에 아르곤 환경하에서 N-(9,13b-디하이드로-1H-디벤조[c,f]이미다조[1,5-a]아제핀-3-일)-2-하이드록시벤즈아미드 (3)(0.19g, 0.51mmol)를 아세트산무수물(0.44mL)에 용해시켰다. 혼합물에 H₂SO₄(황산, 0.05mL, 3.50mmol)을 넣고 70℃에서 1시간 동안 교반시켰다. 반응이 완결되면 증류수(5mL)를 넣어 반응을 종결시킨 후, 디클로로메탄(20mL)으로 추출하였다. Na₂SO₄를 첨가하여 수분을 제거한 후, 회전농축기로 용매를 제거하고 컬럼 크로마토그래피(헥산:에틸 아세테이트=4:1)로 분리하여 흰색 고체인 2-((9,13b-디하이드로-1H-디벤조[c,f]이미다조[1,5-a]아제핀-3-일)카바모일)페닐 아세테이트(4)(0.10g, 0.20mmol, 38.5%)를 수득하였다. ¹H NMR (300MHz, CDCl₃) δ: 2.10 (s, 3H), 3.52 (d, 1H, J=14.4 Hz), 3.69 (t, 1H, J=10.7 Hz), 4.22(t, 1H, J=9.5 Hz), 4.63 (d, 1H, J=14.1 Hz), 5.16 (t, 1H, J=10.7 Hz), 6.96 (d, 1H, J=8.4 Hz), 7.00 (d, 1H, J=3.9), 7.16-7.37 (m, 9H), 7.55 (d, 1H, J=7.8 Hz) 8.06 (d, 1H, J=7.8 Hz), 9.20 (s, 1H); ¹³C NMR(75MHz, CDCl₃) δ: 21.0, 39.1, 50.0, 61.4, 123.1, 125.4, 127.2, 127.3, 127.4, 127.6, 127.8, 128.1, 130.3, 130.6, 131.6, 132.3, 135.6, 135.8, 136.9, 138.8, 150.3, 162.9, 169.7, 176.9; LRMS (EI⁺) m/z (%): 411 ([M]⁺), 369 (base), 339, 248.

합성결과

2-((9,13b-디하이드로-1H-디벤조[c,f]이미다조[1,5-a]아제핀-3-일)카바모일)페닐 아세테이트 (4)의 합성 조건을 하기 표 2에 나타내었다. EDCI, HATU 및 DCC와 같은 여러 커플링제를 사용하더라도 화합물 (1)과 아스피린(경로 1) 사이의 직접 연결은 원하는 생성물 (4)를 적당한 수율로 제공하지 못했다(표 2의 번호 1, 2 및 3). 따라서, 화합물 (4)의 합성은 화합물 (3)으로부터 수행하였다(경로 2). 아세트산무수물을 사용한 화합물 (3)의 페놀계 -OH의 단순한 아세틸화는 염기성 조건에서 수득되지 않은 반면(표 2의 번호 4) 산성 조건에서 높은 수율(39%)로 수득되었다(표 2의 번호 5).

2-((9,13b-디하이드로-1H-디벤조[c,f]이미다조[1,5-a]아제핀-3-일)카바모일)페닐 아세테이트 (4)의 반응조건

번호	시약 1	시약 2	용매	수율
1	EDCI	아스피린	DCM	N/A
2	DCC	아스피린	DCM	6%
3	HATU	아스피린	DCM	9%
4	TEA	아세트산무수물	DCM	N/R
5	H₂SO₄	아세트산무수물	용매없음	39%

동물모델

당뇨병성 신경병증(diabetic neuropathy) 모델

당뇨병을 유발하기 위하여 65mg/kg의 스트렙토조토신(Sigma corp, USA)을 pH 4.5, 0.1 M의 citrate buffer에 15 mg/ml의 농도로 용해하여 마우스에 복강 내 투여함. 약물투여 일주일 후 혈당을 측정하여 당뇨병에 이환된 마우스를 선별하였다.

항암제유도 말초신경병증 (chemical-induced peripheral neuropathy) 모델

비크리스틴은 유방암, 백혈병, 림프종, 원발성 뇌종양 등을 포함한 악성종양에 광범위하게 사용되는 항암 치료제이나, 비크리스틴 사용 후 말초신경섬유에서 신경독성이 나타나며 감각성 또는 운동성 신경병증이 나타난다고 보고되어 있다. 항암치료제 중 비크리스틴은 모든 환자, 특히 치료용량을 사용하는 환자에서도 예측 가능하고 일정한 형태의 신경독성을 유발하며, 통증이 동반된 감각이상이 가장 먼저 나타나며 용량에 비례하는 것으로 알려져 있다. 신경병증이 진행되면 축삭이 소실되며 운동기능도 함께 소실된다. 비크리스틴은 말초신경계에서 C 신경섬유 통각 수용기 신경세포의 과반응성을 유도한다고 알려져 있다. 비크리스틴을 투여하여 신경병증을 유발시켰으며, 비크리스틴 첫 투여시에는 0.05mg/kg을 복강내 투여하고, 그 후 6주 동안 일주일에 2회 0.125mg/kg을 복강 투여하였다. 신경병증성 통증의 증상은 투여 3주째부터 나타나기 시작하여 4주째부터는 유의성 있는 통증을 보였다. 신경병증성 통증의 정도는 꼬리-튕기기 시험(Tail-flick test)을 통해 측정하였다(Junzo et al., 2005).

요산 일나트륨 ( MSU ) 모델

요산 100mg을 20ml의 증류수에 60μl의 10N NaOH와 함께 용해시킨 후, pH 7.2-7.4로 HCl(1N)을 이용하여 60℃에서 맞춘 후, 5일동안 밤새 실온에서 교반하며 용액을 제조하였다. 5일 후, 15ml 튜브에 분주하여 4에서 4일 동안 보관하였다. 니들(needle)과 비슷한 크리스탈이 회수될 때까지 밤새 볼텍스(vortex)하였다. 크리스탈이 채취되도록 100% 에탄올로 2번 정도 행줘주고, 3000rpm에서 2분 동안 4에서 원심분리하였다. 마지막으로, MSU 크리스탈을 내독소-미함유 PBS 25μg/μl에 용해시켰다. 이렇게 제조된 시료를 마우스 마취 후, MSU 300ug/10ul로 관절내주입(PBS 중)하였다. 24시간 후 통증 또는 발목 붓기(ANKLE SWELLING)를 측정하고, 시험물질의 진통작용 효능을 측정할 수 있었다.

화합물 (3) 및 ( 4)의 염증 억제 효과 확인

실험예 1: NO 생성량 측정

Raw 264.7 세포를 96웰 세포 배양 플레이트에 넣었다(50,000세포/웰). 지질다당류(LPS)를 세포배양 배지에 100ng/ml의 농도로 희석하여 넣었다. 24시간 동안 LPS 자극을 주어 Raw 264.7 세포의 활성을 유도하고, 96웰 세포 배양 플레이트로부터 상층액을 50μl씩 얻어 새로운 플레이트에 넣었다. 설파닐아미드 용액을 50μl 넣어준 뒤 10분간 반응시키고, NED 용액 50μl를 넣어 10분간 반응시켰다. 세포배양 배지에서 세포로부터 발생된 NO의 생성량을 540nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 확인하였다.

시험 결과, 아스피린 및 살리실산에서 Raw 264.7 세포에 LPS(100ng/ml)과 함께 처리하였을 때, NO의 생성량의 감소효과는 적게 나타난 반면에, 에피나스틴에서는 100μM에서 NO의 감소현상을 확인할 수 있었다(도 1). 또한, 화합물 (3)(E-S) 및 화합물 4(E-A)를 Raw 264.7 세포에 LPS(100ng/ml)과 함께 처리하였을 때, 농도에 의존적으로 NO의 생성량이 감소하는 효과를 확인할 수 있었다(도 1 및 표 2). 또한, 화합물 (3)(E-S) 및 화합물 4(E-A)에서의 NO 생성량의 감소 효과가 종래 제제인 아스피린, 살리실산 및 에피나스틴 보다 우수한 효과를 갖는다는 것을 확인할 수 있다.

화합물	12.5 μM	25 μM	50 μM	100 μM
화합물	Inhibition %
아스피린	0	0	9.29	12.40
살리실산	0	1.27	7.18	15.64
에피나스틴	0	5.48	18.73	33.40
E-S	0	9.47	30.83	40.83
E-A	0	17.09	40.10	52.35

실험예 2: 세포 생존율 측정

Raw 264.7세포를 96 웰 세포 배양 플레이트에 넣어준다 (50,000 cell/well). 생존율을 측정하기 위하여 96 웰 세포 배양 플레이트에 있는 세포배양 배지를 제거 한 뒤, CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega)를 100μl씩 넣어주고, 37℃에서 20분간 반응시켰다. 반응이 끝나면 세포의 생존율을 490nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 확인하였다.

시험 결과, 아스피린, 살리실산, 에피나스틴, 화합물 (3)(E-S) 및 화합물 4(E-A) 모두에서 세포독성이 나타나지 않았다(도 2).

실험예 3: 웨스턴 블랏 분석

세포를 수확한 뒤 1x PBS로 세척하고, 단백질 추출 완충액(150mM NaCl, 50mM Tris-HCl pH 7.4, 5mM EDTA pH 8.0, 1% NP-40)에 프로테아제억제인자 혼합제(Protease inhibitor cocktail)를 첨가하여 세포를 현탁시켰다. 그 다음 20분간 얼음에서 반응시키고 초음파처리(sonication)를 한 후 원심분리를 시켜 상층액을 수득하였다(13,000rpm, 30분). 상층액을 BCA 정량을 통해 단백질의 농도를 정량한 후 SDS PAGE 겔을 이용하여 단백질의 사이즈 별로 분리시켰다. 이후 PVDF 멤브레인으로 단백질을 이동시킨 후, 1시간동안 탈지유에서 차단시켰다. 그리고 1차, 2차 항체를 결합시켜 ECL 용액을 통해 감광시켜 원하는 단백질의 발현정도를 측정하였다.

시험 결과, 화합물 (3)(E-S)의 경우, LPS 신호에 의한 염증 반응 기전 중 MAPK의 신호에는 많은 영향을 미치지 않는 것으로 보였으나, LPS에 의한 Akt의 인산화가 100μM에서 감소하는 현상을 확인하였다. 화합물 (4)(E-A)의 경우, LPS 신호에 의한 MAPK 신호와 Akt 신호에 모두 영향을 주며 단백질의 활성을 감소시키는 것으로 나타났다(도 3).

결과적으로, 아스피린과 살리실산의 경우 에피나스틴과의 결합을 통해 LPS 신호에 의한 세포 내 NO의 생성량을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. LPS 신호가 세포 내에 주어졌을 때, 초기 염증반응 신호인 MAPK 신호전달 체계와 Akt 신호전달 체계를 확인하였으며, 두 가지 화합물에 의해 농도에 따라 MAPK 혹은 Akt의 활성이 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 이에 따른 염증 반응의 하위 신호전달 기전을 확인함으로써 두 합성물질인 화합물 (3) 및 화합물 (4)가 염증반응 기전 중 신호를 저해함으로써 염증반응을 최종적으로 억제할 수 있는지에 대한 기전을 확인 할 수 있었다.

화합물 (3) 및 ( 4)의 통증 억제 효과 확인

실험예 4: 비틀림 시험((Writhing test)

복부 수축 반응을 지표로 말초신경의 진통효력 시험을 측정하는 가장 보편화된 방법으로서, 마우스에 1% 아세트산을 복강내에 투여함으로 복강내 모세혈관의 손상과 통증을 유발시켰다. 아세트산을 주입한 이후 마우스의 행동양상, 스트레칭 및 몸을 비트는 동작의 횟수를 30분 동안 관찰함으로 그 시험물질의 진통작용 효능을 측정할 수 있었다.

화합물 (3)(E-S)의 진통 효능을 확인하기 위해 10, 20, 40, 80mg/kg의 농도로 전처치하여 30분 후 비틀림 시험을 진행한 결과, 농도 의존적인 진통 효능을 확인하였으며(도 4a 및 표 4), 동일한 방법으로 화합물 (4)(E-A)의 진통 효능을 확인한 결과, 10mg/kg의 농도에서 가장 우수한 진통 효능을 보이는 것을 확인할 수 있었다(도 4b 및 표 5).

Control	E-S 10mg/kg	E-S 20mg/kg	E-S 40mg/kg	E-S 80mg/kg
41.75	33.75	29.75	23.75	12.75

Control	E-A 10mg/kg	E-A 20mg/kg	E-A 40mg/kg	E-A 80mg/kg
41.75	8.25	13.75	11.25	12.25

실험예 5: 포르말린 시험

5% 포르말린을 마우스의 뒷발바닥에 피하주사를 하면 처음 5분까지 포르말린으로 인한 통증으로 발바닥을 핥고 흔들게 된다. 그리고 주사 후 20분에서 40분까지 이차 단계에 다시 발바닥을 핥거나 발을 흔든다. 포르말린 주사 후 5분까지(일차 단계) 느끼는 통증은 신체를 유해하게 자극할 때에 수반되는 통증과 같은 종류이고, 20분에서 40분(이차 단계)사이에 나타나는 통증은 주로 긴장성(tonic) 염증 통증으로써 보통 큰 수술을 하고 난 뒤에 느끼는 통증과 상당히 유사하다고 알려져 있다.

화합물 (3)(E-S)의 진통 효능을 확인하기 위해 10, 20, 40, 80mg/kg의 농도로 전처치하여 30분 후 포르말린 시험을 진행하여 진통 효능을 비교한 결과, 이차 단계에서 진통 효능이 있음을 확인하였으며(도 5a 및 표 6), 동일한 방법으로 화합물 (4)(E-A)의 진통 효능을 확인한 결과, 이차 단계에서 진통 효능이 있다는 것을 확인할 수 있었다(도 5b 및 표 7).

Control	E-S 10mg/kg	E-S 20mg/kg	E-S 40mg/kg	E-S 80mg/kg	Control	E-S 10mg/kg	E-S 20mg/kg	E-S 40mg/kg	E-S 80mg/kg
55.5	66.25	60.5	60.5	52.0	72.5	48.5	48.25	45.0	44.5

Control	E-A 10mg/kg	E-A 20mg/kg	E-A 40mg/kg	E-A 80mg/kg	Control	E-A 10mg/kg	E-A 20mg/kg	E-A 40mg/kg	E-A 80mg/kg
68.5	73.0	54.7	62.0	61.5	101.7	102.0	83.5	60.0	60.0

실험예 6: 열판 시험(Hot-plate test)

열판 시험은 전열기를 이용하여 시험물질의 급성 열 자극에 대한 진통작용을 측정하는 방법이다. 실험동물에 시험약물이나 비히클(대조군)를 주사한 후 전열기(열판)에 차례로 놓았다. 결과로서 도출되는 열 자극원(약 55 정도)에 대한 반응시간은 실험동물이 발을 핥을 때까지의 시간으로써 측정하였다. 시험계로서는 일반적으로 마우스(체중 22 내지 25g, 4 내지 5 주, 수컷, 군 당 10 마리)를 사용하였다.

화합물 (3)(E-S)의 진통 효능을 확인하기 위해 10, 20, 40, 80mg/kg의 농도로 전처치하여 30분 후 열판 시험을 진행하여 진통 효능을 비교한 결과, 40 및 80mg/kg에서 유의성 있는 진통 효능을 확인하였으며(도 6a 및 표 8), 동일한 방법으로 화합물 (4)(E-A)의 진통 효능을 확인한 결과, 이차 단계에서 진통 효능이 있다는 것을 확인할 수 있었다(도 6b 및 표 9).

Control	E-S 10mg/kg	E-S 20mg/kg	E-S 40mg/kg	E-S 80mg/kg
10.94	8.64	13.34	15.52	19.30

Control	E-A 10mg/kg	E-A 20mg/kg	E-A 40mg/kg	E-A 80mg/kg
10.94	9.58	14.98	17.42	18.30

실험예 7: 본 프레이 시험( Von - frey test)

좌골신경 손상 후 기계적 자극에 대한 이질통을 측정하였다. 마우스를 철망 실험대 위에 설치된 아크릴 상자에 넣고 60분 이상 적응시켰다. 본 프레이 필라멘트를 사용하여 연속적인 반응을 용량고저법(Up-Down method)으로 평가하였다. 필라멘트를 좌측 환부 발바닥에 수직으로 접촉시키고 5~6초간 유지시켜 쥐가 신속한 회피반응을 보이거나 움찔하거나 발바닥을 핥으면 양성반응을 보인 것으로 간주하였다. 본 프레이 필라멘트부터 자극하여 양성반응을 보이면 약한 필라멘트로 자극하고 양성반응이 없으면 강한 필라멘트로 자극하며 진행하였다.

당뇨병성 신경병증 모델에서 통증 억제 효과를 측정하기 위해 10, 20, 40, 80mg/kg의 농도로 경구 투여한 후 시간대별로 본 프레이 시험을 통해 역치값을 측정하였다. 진통 효능을 비교하였을 때 화합물 (3)(E-S)을 처치한 후 농도 의존적으로 1-2시간 후까지 80mg/kg의 농도에서 가장 높은 진통 효능을 보였고, 그 후 점점 감소하는 것을 확인하였다(도 7 및 표 10). 동일한 방법으로 화합물 (4)(E-A)를 처치한 후 농도 의존적으로 1시간 후부터 시작하여 40 및 80mg/kg의 농도에서 가장 높은 진통 효능을 보였고, 3시간대까지 유지되다가 그 후 점점 감소하는 것을 확인하였다(도 8 및 표 11).

basal						1h
Intact	Control	E-S 10mg/kg	E-S 20mg/kg	E-S 40mg/kg	E-S 80mg/kg	Intact	Control	E-S 10mg/kg	E-S 20mg/kg	E-S 40mg/kg	E-S 80mg/kg
0.747	0.183	0.247	0.208	0.225	0.164	0.747	0.183	0.247	0.286	0.314	0.613
2h						3h
Intact	Control	E-S 10mg/kg	E-S 20mg/kg	E-S 40mg/kg	E-S 80mg/kg	Intact	Control	E-S 10mg/kg	E-S 20mg/kg	E-S 40mg/kg	E-S 80mg/kg
0.747	0.183	0.208	0.208	0.391	0.574	0.747	0.183	0.363	0.314	0.352	0.391
4h						5h
Intact	Control	E-S 10mg/kg	E-S 20mg/kg	E-S 40mg/kg	E-S 80mg/kg	Intact	Control	E-S 10mg/kg	E-S 20mg/kg	E-S 40mg/kg	E-S 80mg/kg
0.747	0.183	0.330	0.186	0.314	0.419	0.747	0.183	0.286	0.324	0.391	0.225

basal						1h
Intact	Control	E-A 10mg/kg	E-A 20mg/kg	E-A 40mg/kg	E-A 80mg/kg	Intact	Control	E-A 10mg/kg	E-A 20mg/kg	E-A 40mg/kg	E-A 80mg/kg
0.747	0.186	0.286	0.186	0.247	0.208	0.747	0.186	0.260	0.263	0.286	0.391
2h						3h
Intact	Control	E-A 10mg/kg	E-A 20mg/kg	E-A 40mg/kg	E-A 80mg/kg	Intact	Control	E-A 10mg/kg	E-A 20mg/kg	E-A 40mg/kg	E-A 80mg/kg
0.747	0.184	0.263	0.324	0.458	0.391	0.747	0.186	0.324	0.321	0.419	0.247
4h						5h
Intact	Control	E-A 10mg/kg	E-A 20mg/kg	E-A 40mg/kg	E-A 80mg/kg	Intact	Control	E-A 10mg/kg	E-A 20mg/kg	E-A 40mg/kg	E-A 80mg/kg
0.747	0.186	0.286	0.247	0.391	0.286	0.747	0.186	0.225	0.225	0.186	0.186

요산 일나트륨 모델에서의 진통 효능을 확인하기 위해 10, 20, 40, 80mg/kg의 농도로 경구 투여한 후 시간대별로 본 프레이 시험을 통해 역치값을 측정하였다. 진통효능을 비교하였을 때 화합물 (3)(E-S)을 처치한 후 농도 의존적으로 2시간 후 80mg/kg의 농도에서 가장 높은 진통 효능을 보였고, 그 후 점점 감소하는 것을 확인하였다(도 9 및 표 12). 동일한 방법으로 화합물 (4)(E-A)를 처치한 후 의존적으로 2시간 후부터 3시간 때까지 80mg/kg의 농도에서 가장 높은 진통효능을 보였고, 그 후 점점 감소하는 것을 확인하였다(도 10 및 표 13).

basal						1h
Intact	Control	E-S 10mg/kg	E-S 20mg/kg	E-S 40mg/kg	E-S 80mg/kg	Intact	Control	E-S 10mg/kg	E-S 20mg/kg	E-S 40mg/kg	E-S 80mg/kg
0.670	0.176	0.127	0.127	0.127	0.138	0.670	0.176	0.173	0.194	0.183	0.239
2h						3h
Intact	Control	E-S 10mg/kg	E-S 20mg/kg	E-S 40mg/kg	E-S 80mg/kg	Intact	Control	E-S 10mg/kg	E-S 20mg/kg	E-S 40mg/kg	E-S 80mg/kg
0.670	0.176	0.211	0.163	0.214	0.439	0.670	0.176	0.148	0.117	0.278	0.301
4h						5h
Intact	Control	E-S 10mg/kg	E-S 20mg/kg	E-S 40mg/kg	E-S 80mg/kg	Intact	Control	E-S 10mg/kg	E-S 20mg/kg	E-S 40mg/kg	E-S 80mg/kg
0.670	0.176	0.166	0.207	0.257	0.267	0.670	0.176	0.107	0.194	0.152	0.155

basal						1h
Intact	Control	E-A 10mg/kg	E-A 20mg/kg	E-A 40mg/kg	E-A 80mg/kg	Intact	Control	E-S 10mg/kg	E-S 20mg/kg	E-S 40mg/kg	E-S 80mg/kg
0.747	0.186	0.186	0.208	0.190	0.186	0.747	0.186	0.166	0.203	0.144	0.203
2h						3h
Intact	Control	E-S 10mg/kg	E-S 20mg/kg	E-S 40mg/kg	E-S 80mg/kg	Intact	Control	E-S 10mg/kg	E-S 20mg/kg	E-S 40mg/kg	E-S 80mg/kg
0.747	0.186	0.109	0.212	0.237	0.362	0.747	0.186	0.151	0.247	0.324	0.314
4h						5h
Intact	Control	E-S 10mg/kg	E-S 20mg/kg	E-S 40mg/kg	E-S 80mg/kg	Intact	Control	E-S 10mg/kg	E-S 20mg/kg	E-S 40mg/kg	E-S 80mg/kg
0.747	0.186	0.102	0.173	0.247	0.205	0.747	0.186	0.122	0.247	0.286	0.190

항암제유도 말초신경병증 모델에서 진통 효능을 확인하기 위해 10, 20, 40, 80mg/kg의 농도로 경구 투여한 후 시간대별로 본 프레이 시험을 통해 역치값을 측정하였다. 진통효능을 비교하였을 때 화합물 (3)(E-S)를 처치한 후 농도 의존적으로 1시간 후 80mg/kg의 농도에서 가장 높은 진통 효능을 보였고, 그 후 3시간 후까지 진통 효능을 보였으며, 점점 감소하는 것을 확인하였다(도 11 및 표 14).

basal						1h
normal	control	E-S 10mg/kg	E-S 20mg/kg	E-S 40mg/kg	E-S 80mg/kg	normal	control	E-S 10mg/kg	E-S 20mg/kg	E-S 40mg/kg	E-S 80mg/kg
0.763	0.137	0.113	0.157	0.173	0.176	0.763	0.155	0.110	0.173	0.324	0.408
2h						3h
normal	control	E-S 10mg/kg	E-S 20mg/kg	E-S 40mg/kg	E-S 80mg/kg	normal	control	E-S 10mg/kg	E-S 20mg/kg	E-S 40mg/kg	E-S 80mg/kg
0.763	0.155	0.163	0.208	0.306	0.385	0.763	0.155	0.180	0.191	0.270	0.390
4h						5h
normal	control	E-S 10mg/kg	E-S 20mg/kg	E-S 40mg/kg	E-S 80mg/kg	normal	control	E-S 10mg/kg	E-S 20mg/kg	E-S 40mg/kg	E-S 80mg/kg
0.763	0.155	0.145	0.137	0.239	0.239	0.763	0.155	0.135	0.194	0.194	0.242

Claims

하기 화학식 A를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
[화학식 A]

여기서, R은 수소, C₁-C₅ 알킬 및 C₁-C₅ 알킬카보닐로 이루어진 군으로부터 선택된다.
제1항에 있어서,
상기 화합물이 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
(1) N-(9,13b-디하이드로-1H-디벤조[c,f]이미다조[1,5-a]아제핀-3-일)-2-하이드록시벤즈아미드(E-S); 및
(2) 2-((9,13b-디하이드로-1H-디벤조[c,f]이미다조[1,5-a]아제핀-3-일) 카바모일)페닐 아세테이트(E-A).
제1항에 따른 화학식 A를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 치료학적으로 유효한 양으로 포함하는 통증의 예방 또는 치료용 약학조성물.
제3항에 있어서,
상기 통증이 통각수용기성 통증, 침해성 통증, 심인성 통증, 염증성 통증, 병적 통증, 신경병성 통증, 암 통증, 수술후 통증, 삼차 신경통, 특발성 통증, 당뇨 신경병성 통증 및 편두통으로부터 선택되는 하나 이상인 통증의 예방 또는 치료용 약학조성물.
제1항에 따른 화학식 A를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 치료학적으로 유효한 양으로 포함하는 염증의 예방 또는 치료용 약학조성물.
제3항에 있어서,
상기 약학조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, pH 조절제, 안정화제, 보존제, 감미제 및 착향제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 추가로 포함하는 통증의 예방 또는 치료용 약학조성물.
제3항에 있어서,
상기 약학조성물은 점안제, 주사제, 과립제, 정제, 환제, 캡슐제, 겔, 시럽, 현탁제, 유제, 점적제 및 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형인 것을 특징으로 하는 통증의 예방 또는 치료용 약학조성물.
제3항에 있어서,
상기 화합물이 라세미체, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체, 거울상 이성질체의 혼합물 또는 부분입체 이성질체의 혼합물 형태인 통증의 예방 또는 치료용 약학조성물.
1) 하기 화학식 (2)로 나타나는 화합물을 용매에 용해시켜 혼합물을 제조하는 단계;
2) 상기 혼합물에 하기 화학식 (1)로 나타나는 화합물을 첨가하여 혼합하여 커플링 반응을 진행하는 단계;
3) 상기 혼합물에 염기를 추가로 첨가하는 단계; 및
4) 상기 커플링 반응에 사용되는 커플링제를 추가로 첨가하는 단계를 포함하는 하기 화학식 (3)으로 나타나는 화합물 (3)의 제조방법:
[화학식 (1)]

[화학식 (2)]

[화학식 (3)]
제9항에 있어서,
상기 용매는 DCM, CH₃CN 및 CHCl₃로 이루어진 군으로부터 선택되는 제조방법.
제9항에 있어서,
상기 염기는 DIPEA 및 TEA로 이루어진 군으로부터 선택되는 제조방법.
제9항에 있어서,
상기 커플링제는 DCC, HATU 및 EDCI로 이루어진 군으로부터 선택되는 제조방법.
1) 하기 화학식 (3)으로 나타나는 화합물 (3)을 산촉매 존재하에서 아세트산무수물과 반응시키는 것을 포함하는 하기 화학식 (4)로 나타나는 화합물 (4)의 제조방법:
[화학식 (3)]

[화학식 (4)]