KR102041117B1 - 신규한 살모넬라 티피뮤리움 박테리오파지 stp-2 및 이의 살모넬라 티피뮤리움 균 증식 억제 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 살모넬라 티피뮤리움 균을 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 자연으로부터 분리한 시포비리대 박테리오파지 STP-2(수탁번호 KCTC 12853BP), 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용한 살모넬라 티피뮤리움 균에 의해 유발되는 질환을 예방 및 치료하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 살모넬라 티피뮤리움 균에 감염하여 살모넬라 티피뮤리움 균을 사멸시킬 수 있는 자연으로부터 분리한 박테리오파지 및 이를 유효성분으로 포함한 조성물을 이용한 살모넬라 티피뮤리움 균에 의해서 유발되는 질환을 예방 및 치료하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 살모넬라 티피뮤리움 균을 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 자연으로부터 분리한 시포비리대 박테리오파지 STP-2(수탁번호 KCTC 12853BP), 및 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용한 살모넬라 티피뮤리움 균에 의해 유발되는 질환의 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
살모넬라 균은 장내세균과에 속하는 그람음성 간균으로, 분류학상 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)와 살모넬라 본고리(Salmonella bongori)의 2 가지 종(species)으로 크게 구분되고, 5개 그룹(group) 및 6개 아종(subspecies)으로 세분화 된다. 각 그룹 및 아종에 따라, Group I에 속하는 살모넬라 균은 S. enterica subsp. enterica이고 Group II에 속하는 살모넬라 균은 S. enterica subsp. salamae이다. Group III의 경우 IIIa와 IIIb로 세분되고 이에 속하는 살모넬라 균은 각각 S. enterica subsp. arizona와 S. enterica subsp. diarizona이다. 그리고 Group IV와 Group V에 속하는 살모넬라 균은 각각 S. enterica subsp. houtenae, S. enterica subsp. bongori이다. 또한 살모넬라 균은 생화학적 분류 외에 균체항원과 편모항원의 조합에 의해 다양한 혈청형으로 구분되며, 현재까지 58 종류의 균체항원과 114 종류의 편모항원이 확인된 가운데, 각 항원의 조합을 통해 총 2,659 종류의 혈청형이 있는 것으로 알려져 있다. 살모넬라 균은 사람을 포함한 포유류, 조류 그리고 파충류까지 넓은 숙주 범위를 갖고 있으며, 일반적으로 사람, 가축, 애완동물 및 야생동물에 감염하는 병원체로 알려져 있다. 식중독을 일으키는 살모넬라의 주요 혈청형은 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella Typhimurium), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis) 등이다. 1984년 이후 유럽 및 미국에서 살모넬라 균에 의한 식중독의 발생 빈도가 증가하기 시작하였고, 1988년 이후로 전 세계적으로 살모넬라 균에 의한 식중독 발병 사례가 급증함으로써 살모넬라 균에 대한 관심이 크게 고조되었다.
한편, 살모넬라 티피뮤리움 균은 돼지 등 가축에 있어 소화기성 질병을 일으키기도 한다. 살모넬라 티피뮤리움 균에 의해 유발되는 질환의 예방이나 치료 목적으로 다양한 항생제들이 사용되어 왔으나 최근 이들 항생제들에 대한 내성균의 발생이 증가함에 따라 항생제 외의 다른 방안의 확보가 시급한 실정이다. 특히 다제내성 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella Typhimurium DT104)이 출현하게 됨으로써 축산물을 통한 사람으로의 전파 우려 및 적절한 치료제 부재로 인해 사회적인 문제로 대두되고 있다.
최근 세균성 감염질환의 대처 방안으로 박테리오파지(Bacteriophage)의 활용이 크게 주목을 받고 있다. 특히 항생제 내성균에 대한 우수한 항균력 때문에 더욱 큰 관심을 받고 있다. 박테리오파지는 세균에 감염하는 아주 작은 미생물로서 보통 파지(Phage)라고 줄여서 부르기도 한다. 박테리오파지는 세균에 감염(Infection)한 후에 세균의 세포 내부에서 증식을 하고, 증식 후 자손 박테리오파지들이 세균 밖으로 나올 때 숙주인 세균의 세포벽을 파괴하는 방식으로 세균을 사멸시키는 능력을 갖고 있다. 박테리오파지의 세균 감염 방식은 매우 특이성이 높아서 특정 세균에 감염할 수 있는 박테리오파지의 종류는 일부로 한정된다. 즉, 특정 박테리오파지는 특정 범주의 세균에만 감염할 수 있고 이로 인하여 특정 박테리오파지는 특정 세균에 대해서만 항균효과를 제공할 수 있다. 이러한 박테리오파지의 세균 특이성으로 인하여 박테리오파지는 대상으로 하는 세균에 대해서만 항균효과를 제공하고 환경이나 동물 내의 상재균들에는 영향을 초래하지 않는다. 통상적으로 세균 처치에 널리 활용되던 기존의 항생제들은 여러 종류의 세균들에 대하여 동시에 영향을 끼쳤다. 이로 인하여 환경오염이나 동물의 정상 세균총 교란 등의 문제를 초래하였다. 이와는 달리 박테리오파지는 특정 세균에 대해서만 작동하므로 박테리오파지 사용에 의해서 체내 정상균총 교란 등이 발생하지 않는다. 따라서 박테리오파지 사용이 항생제 사용에 비교하여 매우 안전하다고 할 수 있고, 그 만큼 사용에 의한 부작용 초래 가능성이 상대적으로 크게 낮다.
박테리오파지는 1915년 영국의 세균학자 Twort가 포도상구균(Micrococcus) 집락이 어떤 것에 의해 투명하게 녹는 현상에 대한 연구를 수행하면서 발견되었다. 또한, 1917년에는 프랑스의 세균학자 d'Herelle이 이질환자 변의 여과액 중에 적리균(Shigella dysenteriae)을 녹이는 작용을 가진 것이 있다는 것을 발견하고 이에 대한 연구를 통해 독립적으로 박테리오파지를 발견하였으며, 세균을 잡아먹는다는 뜻에서 박테리오파지라고 명명하였다. 이후 이질균, 장티푸스균, 콜레라균 등 여러 병원성 세균에 대한 박테리오파지가 계속적으로 발견되었다.
세균을 사멸시킬 수 있는 특별한 능력으로 인하여 박테리오파지는 발견 이후부터 세균 감염에 대응하는 효과적 방안으로 기대를 모았으며 관련하여 많은 연구들이 있었다. 그러나 Fleming에 의해 페니실린이 발견된 이후, 항생제의 보급이 일반화되면서 박테리오파지에 대한 연구는 일부 동유럽 국가들 및 구소련에 한정되어서만 명맥이 유지되었다. 그런데 2000년 이후에 항생제 내성균의 발생 증가로 인하여 기존 항생제의 한계성이 나타나고, 기존 항생제의 대체 물질로의 개발 가능성이 부각되면서 다시 박테리오파지가 항-세균제로 주목을 받고 있다.
앞에서 설명했듯이 박테리오파지는 세균에 대한 특이성이 매우 높다. 이러한 박테리오파지의 세균에 대한 높은 특이성으로 인하여 박테리오파지는 동일 종(Species)에 속하는 세균들이라 할지라도 그 일부 주(Strain)에 대해서만 항균효과를 발휘하는 경우가 많다. 또한 대상 세균 주에 따라 발휘되는 박테리오파지의 항균력 세기 자체도 다를 수 있다. 이러한 이유로 특정 종류의 세균에 대하여 효과적 제어법을 확보하려면 다양한 종류의 유용 박테리오파지들의 확보가 필요하다. 살모넬라 티피뮤리움 균에 대응하여 효과적인 박테리오파지 활용법을 개발하기 위해서도 당연히 살모넬라 티피뮤리움 균에 대하여 항균효과를 제공할 수 있는 여러 종류의 다양한 박테리오파지들의 확보가 필요하고, 더 나아가 확보한 다양한 유용 박테리오파지들 중에서 항균력의 세기나 항균범위 측면에서 비교우위에 있는 박테리오파지의 선발 활용도 필요하다.
이에, 본 발명자들은 살모넬라 티피뮤리움 균을 사멸시킬 수 있는 자연으로부터 분리된 박테리오파지를 이용하여 살모넬라 티피뮤리움 균에 의해 유발되는 질환을 예방 및 치료하는 데에 활용될 수 있는 조성물을 개발하고, 또 이 조성물을 이용하여 살모넬라 티피뮤리움 균에 의해 유발되는 질환을 예방 및 치료하는 방법을 개발하고자 노력한 끝에, 이에 적합한 박테리오파지를 자연으로부터 분리하고, 이 분리된 박테리오파지를 타 박테리오파지와 구별하여 특정 지을 수 있도록 유전체(Genome)의 서열 정보를 확보한 후에 상기 박테리오파지를 유효성분으로 한 조성물을 개발한 다음에 이 조성물이 살모넬라 티피뮤리움 균에 의해 유발되는 질환을 예방 및 치료하는 목적으로 효과적으로 활용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 살모넬라 티피뮤리움 균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 자연으로부터 분리한 시포비리대(Siphoviridae) 박테리오파지 STP-2(수탁번호 KCTC 12853BP)를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 살모넬라 티피뮤리움 균에 감염하여 살모넬라 티피뮤리움 균을 사멸시킬 수 있는 분리 박테리오파지 STP-2(수탁번호 KCTC 12853BP)를 유효성분으로 포함하는 살모넬라 티피뮤리움 균에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하는 목적으로 활용 가능한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 살모넬라 티피뮤리움 균에 감염하여 살모넬라 티피뮤리움 균을 사멸시킬 수 있는 분리 박테리오파지 STP-2(수탁번호 KCTC 12853BP)를 유효성분으로 포함하는 살모넬라 티피뮤리움 균에 의해 유발되는 질환을 예방 및 치료하는 목적으로 활용 가능한 조성물을 이용한 살모넬라 티피뮤리움 균에 의해 유발되는 질환을 예방 및 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물들을 이용한 살모넬라 티피뮤리움 균에 의해 유발되는 질환을 예방 및 치료하는 목적으로 사용되는 소독제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물들을 이용한 살모넬라 티피뮤리움 균에 의해 유발되는 질환의 예방 및 치료하는 목적으로 사용되는 음수첨가제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물들을 이용한 살모넬라 티피뮤리움 균에 의해 유발되는 질환의 예방 및 치료를 통한 사양 효과 제공 목적의 사료첨가제를 제공하는 것이다.
본 발명은 살모넬라 티피뮤리움 균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 자연으로부터 분리한 시포비리대 박테리오파지 STP-2(수탁번호 KCTC 12853BP), 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용한 살모넬라 티피뮤리움 균에 의해 유발되는 질환을 예방 및 치료하는 방법을 제공한다.
박테리오파지 STP-2는 본 발명자들에 의해 분리된 후에 2015년 6월 23일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁되었다(수탁번호 KCTC 12853BP).
또한, 본 발명은 살모넬라 티피뮤리움 균에 의해 유발되는 질환을 예방 및 치료하는 데에 활용될 수 있는 박테리오파지 STP-2를 유효성분으로 포함하는 소독제, 음수첨가제 및 사료첨가제를 제공한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 박테리오파지 STP-2는 살모넬라 티피뮤리움 균을 효과적으로 사멸시키므로 살모넬라 티피뮤리움 균에 의해 유발되는 질환의 예방(감염 방지)이나 치료(감염 처치)에 효과를 나타낸다. 따라서 본 발명의 조성물은 살모넬라 티피뮤리움 균에 의해 유발되는 질환에 대한 예방 및 치료 목적으로 활용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 “방지” 또는 “예방”이라는 용어는 (i) 살모넬라 티피뮤리움 균의 감염 방지; 및 (ii) 살모넬라 티피뮤리움 균 감염에 의한 질병으로의 발전을 억제하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 “처치” 또는 “치료”라는 용어는 (i) 살모넬라 티피뮤리움 균에 의해 유발된 질환의 억제; 및 (ii) 살모넬라 티피뮤리움 균에 의해 유발된 질환의 병적상태를 경감시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서의 “분리”, “분리한” 또는 “분리된”은 자연 상태로부터 여러 실험 기법을 활용하여 박테리오파지를 분리하는 것과 타 박테리오파지와 구별하여 본 발명의 박테리오파지를 특정 지을 수 있는 특징을 확보하는 일을 지칭하며, 이에 더하여 생물공학기술로 본 발명의 박테리오파지를 산업적으로 활용할 수 있게끔 증식시키는 것도 포함한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물에는 박테리오파지 STP-2가 유효성분으로 포함된다. 이때 포함되는 박테리오파지 STP-2는 1× 101 pfu/㎖ 내지 1× 1030 pfu/㎖ 또는 1× 101 pfu/g 내지 1× 1030 pfu/g로 포함되며, 바람직하게는 1× 104 pfu/㎖ 내지 1× 1015 pfu/㎖ 또는 1× 104 pfu/g 내지 1× 1015 pfu/g로 포함된다.
본 발명의 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수도 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수도 있다.
본 발명의 조성물은 활용 방식에 따라, 이에 국한되지 않지만 소독제, 음수첨가제 및 사료첨가제로 구현될 수 있다. 이러한 활용 목적에서의 효율성을 높이기 위하여 다른 세균종에 대하여 항균활성을 제공할 수 있는 박테리오파지들이 본 발명의 조성물에 추가될 수 있다. 또한, 살모넬라 티피뮤리움 균에 대하여 항균활성을 갖는 다른 종류의 박테리오파지들도 추가될 수 있다. 살모넬라 티피뮤리움 균에 대하여 항균활성을 갖는 박테리오파지라 하더라도 항균력의 세기나 항균범위 측면에서 서로 간에 차이가 있으므로 이들의 적절한 조합은 그 효과를 극대화 할 수 있다.
본 발명의 박테리오파지 STP-2를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용한 살모넬라 티피뮤리움 균에 의해 유발되는 질환을 예방 및 치료하는 방법은 기존의 항생제 등에 기반을 둔 방식에 비하여 살모넬라 티피뮤리움 균에 대한 특이성이 매우 높다는 장점을 제공할 수 있다. 이는 다른 유용한 상재균에는 영향을 주지 않으면서도 살모넬라 티피뮤리움 균에 의해 유발되는 질환을 예방 및 치료하는 목적으로 사용할 수 있음을 의미하며, 이의 사용에 따른 부작용이 매우 적다는 것을 의미한다. 통상적으로 항생제 등을 사용하면 일반 상재균들도 피해를 함께 입게 되어 결과적으로 동물의 면역력 저하 등을 초래시켜 사용에 따른 다양한 부작용이 나타난다. 한편, 박테리오파지는 항균활성을 발휘할 수 있는 세균종이 같다 하더라도 항균효과 발휘에 있어 항균력의 세기나 항균범위[살모넬라 티피뮤리움 균종에 속하는 여러 세균 주(Strain)의 측면에서 개별 세균 주에 대하여 박테리오파지의 항균활성이 발휘되는 범위. 통상적으로 박테리오파지는 같은 세균 종(Species)에 속하는 일부 세균 주(Strain)에 대하여 항균활성을 발휘할 수 있음. 즉, 같은 세균 종에 속한다 하더라도 개별 세균 주에 따라 박테리오파지에 대한 감수성에서 차이가 있을 수 있음] 측면에서 차이가 있으므로 본 발명은 살모넬라 티피뮤리움 균에 대한 항균력을 갖는 타 박테리오파지에 비교하여 차별적 항균효과를 제공할 수 있다. 이는 산업현장 활용 시에 그 효과에 있어 큰 차이를 제공한다.
도 1은 박테리오파지 STP-2의 전자현미경 사진이다.
도 2는 박테리오파지 STP-2의 살모넬라 티피뮤리움 균에 대한 사멸능을 보여주는 실험 결과이다. 평판배지의 가운데 선을 기준으로 왼쪽은 박테리오파지 STP-2가 포함되지 않은 완충액(Buffer)만을 점적한 것이고, 오른쪽은 박테리오파지 STP-2가 포함된 액을 점적한 것이다. 오른쪽에서 관찰되는 투명한 부분은 시험대상 세균이 박테리오파지 STP-2의 작용에 의하여 용균되어 결과적으로 형성된 용균반이다.
도 2는 박테리오파지 STP-2의 살모넬라 티피뮤리움 균에 대한 사멸능을 보여주는 실험 결과이다. 평판배지의 가운데 선을 기준으로 왼쪽은 박테리오파지 STP-2가 포함되지 않은 완충액(Buffer)만을 점적한 것이고, 오른쪽은 박테리오파지 STP-2가 포함된 액을 점적한 것이다. 오른쪽에서 관찰되는 투명한 부분은 시험대상 세균이 박테리오파지 STP-2의 작용에 의하여 용균되어 결과적으로 형성된 용균반이다.
이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1: 살모넬라
티피뮤리움
균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지의 분리
살모넬라 티피뮤리움 균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지의 분리에는 자연 환경으로부터 확보된 시료들을 이용하였다. 한편, 박테리오파지 분리에 사용된 살모넬라 티피뮤리움 균은 미국 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 분양받아 사용하였다(ATCC14028).
박테리오파지 분리 과정을 상세히 설명하면, 살모넬라 티피뮤리움 균을 1/1,000 비율로 접종한 TSB(Tryptic Soy Broth) 배지(카제인 다이제스트, 17 g/L; 소이빈 다이제스트, 3 g/L; 덱스트로스, 2.5 g/L; NaCl, 5 g/L; 디포타슘 포스페이트, 2.5 g/L)에 수집된 시료를 함께 첨가한 다음 37℃에서 3-4시간동안 진탕배양 하였다. 배양 후, 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액에 살모넬라 티피뮤리움 균을 1/1,000 비율로 접종한 다음 37℃에서 3-4시간 동안 또 다시 진탕배양 하였다. 박테리오파지가 시료에 포함되어 있었을 경우에는 박테리오파지의 수(Titer)가 충분히 증가될 수 있도록 이러한 과정을 총 5회 반복 실시하였다. 5회 반복 실시 후에 배양액을 8,000 rpm에서 20분간 원심분리 하였다. 원심분리 후, 회수된 상등액에 대하여 0.45 μm의 필터를 이용하여 여과를 실시해 주었다. 이렇게 하여 얻어진 여과액을 사용한 통상의 점적 실험(Spot assay)을 통하여 살모넬라 티피뮤리움 균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지가 있는지를 조사하였다.
상기 점적 실험은 다음과 같이 실시되었다. TSB 배지에 살모넬라 티피뮤리움 균을 1/1,000 비율로 접종한 다음 37℃에서 한밤동안 진탕배양 하였다. 이렇게 하여 준비된 살모넬라 티피뮤리움 균의 배양액 3 ml(OD600이 1.5)을 TSA(Tryptic Soy Agar) 평판배지(카제인 다이제스트, 15 g/L; 소이빈 다이제스트, 5 g/L; NaCl, 5 g/L; 아가, 15 g/L)에 도말(Spreading)하였다. 도말한 평판배지를 클린벤치(Clean bench)에서 약 30분 정도 방치하여 도말액이 건조되게 하였다. 건조 후 앞에서 준비한 여과액 10 μl를 살모넬라 티피뮤리움 균이 도말된 평판배지 위에 점적하였다. 이를 30분 정도 방치하여 건조시켰다. 건조 후 점적한 평판배지를 37℃에서 하루 동안 정치 배양한 다음 여과액이 떨어진 위치에 투명환(Clear zone)이 생성되는가를 조사하였다. 투명환이 생성되는 여과액의 경우가 살모넬라 티피뮤리움 균을 사멸 시킬 수 있는 박테리오파지가 포함되어 있다고 판단할 수 있다. 이러한 조사를 통하여 살모넬라 티피뮤리움 균에 대한 사멸능을 가진 박테리오파지를 포함한 여과액을 확보할 수 있었다.
살모넬라 티피뮤리움 균에 대한 사멸능을 가진 박테리오파지의 존재가 확인된 여과액을 이용하여 순수 박테리오파지의 분리를 실시하였다. 순수 박테리오파지의 분리에는 통상의 용균반 분석(Plaque assay)을 이용하였다. 이를 자세히 설명하면, 용균반 분석에서 형성된 용균반 하나를 멸균된 팁을 이용하여 회수한 다음에 이를 살모넬라 티피뮤리움 균의 배양액에 첨가해 주어 4-5시간 동안 37℃에서 함께 배양하였다. 배양 후 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 얻어진 상등액에 50분의 1의 부피로 살모넬라 티피뮤리움 균의 배양액을 첨가해 준 다음에 다시 37℃에서 4-5시간 동안 배양해 주었다. 박테리오파지의 수를 증가시키기 위하여 이러한 과정을 최소 5회 이상 실시한 다음에 최종적으로 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 얻어진 상등액을 사용하여 다시 용균반 분석을 실시하였다. 통상 순수 박테리오파지의 분리가 상기 과정의 1회만으로는 달성되지 않기 때문에 이때 형성된 용균반을 이용하여 앞 단계를 전체적으로 다시 반복하였다. 이와 같은 과정을 최소 5회 이상 반복 실시하여 순수한 박테리오파지를 포함한 용액을 확보하였다. 통상적으로 순수 박테리오파지의 분리는 형성된 용균반의 크기 및 모양이 모두 유사하게 될 때까지 반복 수행하였다. 그리고 최종적으로는 전자현미경 분석을 통하여 박테리오파지의 순수 분리 여부를 확인하였다. 전자현미경 분석에서 순수 분리가 확인될 때까지 앞에 설명한 과정을 반복하였다. 전자현미경 분석은 통상의 방법에 따라 실시하였다. 이를 간단히 설명하면 다음과 같다. 순수한 박테리오파지를 포함한 용액을 구리 격자(Copper grid)에 묻히고 2% 우라닐 아세테이트(Uranyl acetate)로 역염색법(Negative staining)과 건조를 수행한 후에 투과전자현미경을 통하여 그 형태를 관찰하였다. 순수 분리한 박테리오파지의 전자현미경 사진이 도 1에 제시되어 있다. 형태적 특징으로 판단할 때, 신규 확보된 박테리오파지는 시포비리대(Siphoviridae) 박테리오파지에 속함을 확인할 수 있었다.
이런 방식으로 확인된 순수 박테리오파지를 포함한 용액은 다음의 정제 과정을 거쳤다. 순수 박테리오파지를 포함한 용액에 용액 전체 부피의 50분의 1의 부피로 살모넬라 티피뮤리움 균의 배양액을 첨가해 준 다음에 다시 4-5시간 동안 배양하였다. 배양 후 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 충분한 수의 박테리오파지가 포함된 액을 얻기 위해 이러한 과정을 총 5회 반복하였다. 최종 원심분리로 얻어진 상등액을 0.45 μm의 필터를 이용하여 여과한 다음에 통상의 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene Glycol; PEG) 침전 과정을 실시하였다. 구체적으로, 여과액 100 ml에 10% PEG 8000/0.5 M NaCl이 되게 PEG와 NaCl을 첨가한 다음에 4℃에서 2-3시간 동안 정치한 후, 8,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 박테리오파지 침전물을 얻었다. 이렇게 얻어진 박테리오파지 침전물을 완충액(Buffer; 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgSO4, 0.1% Gelatin, pH 8.0) 5 ml로 부유시켰다. 이를 박테리오파지 부유액 또는 박테리오파지 액이라 지칭한다.
상기 과정을 통하여 정제된 순수 박테리오파지를 확보할 수 있었고, 이 박테리오파지를 박테리오파지 STP-2로 명명한 뒤, 2015년 6월 23일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다(수탁번호 KCTC 12853BP).
실시예
2: 박테리오파지
STP
-2의 유전체 분리 및 유전체 서열 분석
박테리오파지 STP-2의 유전체를 다음과 같이 분리하였다. 유전체 분리에는 실시예 1에서와 같은 방법으로 얻어진 박테리오파지 부유액을 이용하였다. 먼저 부유액에 포함되어 있을 수 있는 살모넬라 티피뮤리움 균의 DNA와 RNA를 제거하기 위해, 박테리오파지 부유액 10 ml에 DNase I과 RNase A를 각각 200 U씩 첨가한 다음에 37℃에서 30분간 방치하였다. 30분 방치 후에 DNase I과 RNase A의 활성을 제거하기 위해, 0.5 M 에틸렌디아민테트라아세트산(Ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA) 500 μl를 첨가한 다음에 다시 10분간 정치시켰다. 그리고 이를 추가로 10분간 65℃에 정치시킨 다음에 박테리오파지 외벽을 와해시키기 위해 proteinase K(20 ㎎/ml) 100 μl를 첨가한 후에 37℃에서 20분간 반응시켰다. 그 후 10% 도데실 황산 나트륨염(Sodium dodecyl sulfate; SDS) 500 μl를 첨가한 다음에 다시 65℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 반응 후, 이 반응액에 25:24:1의 구성비를 갖는 페놀(Phenol) : 클로로포름(Chloroform) : 이소아밀알코올(Isoamylalcohol)의 혼합액 10 ml을 첨가해 준 후 잘 섞어 주었다. 그리고는 이것을 13,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 층이 분리되게 한 다음에 분리된 층들 중에서 위층을 취하여 여기에 1.5 부피비의 아이소프로필 알코올(Isopropyl alcohol)을 첨가한 다음에 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 유전체를 침전시켰다. 침전물을 회수한 후 침전물에 70% 에탄올(Ethanol)을 첨가한 다음에 다시 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 침전물의 세척을 실시하였다. 세척된 침전물을 회수하고 진공 건조 시킨 다음에 이를 100 μl의 물에 녹였다. 상기 과정을 반복하여 박테리오파지 STP-2의 유전체를 다량 확보하였다.
이렇게 얻어진 유전체는 서울대학교 농생명과학공동기기원(National Instrumentation Center for Environmental Management)에서 Pac-bio 기기를 이용하여 차세대염기서열 분석(Next generation sequencing analysis)을 수행한 다음 박테리오파지 STP-2의 유전체 서열 정보를 확보하였다. 최종적으로 분석된 박테리오파지 STP-2 유전체는 59,043 bp의 크기를 가지며, 전체 유전체 서열은 서열번호 1로 제시되어 있다.
확보된 박테리오파지 STP-2의 유전체 서열 정보를 기반으로 Web상의 BLAST를 이용하여 기존에 알려진 박테리오파지 유전체 서열과의 상동성(Similarity)을 조사해 보았다. BLAST 조사 결과, 박테리오파지 STP-2의 유전체 서열은 살모넬라 박테리오파지 iEPS5의 서열(Genbank Accession No. KC677662.1)과 비교적 높은 상동성을 가지고 있는 것으로 확인되었다(identity: 99%). 그러나 박테리오파지 STP-2는 환형의 유전체를 가짐에 반하여 살모넬라 박테리오파지 iEPS5는 선형의 유전체를 가지고, 박테리오파지 STP-2 유전체 상의 개방형해독틀(Open Reading Frame, ORF)의 개수는 102개임에 반하여, 살모넬라 박테리오파지 iEPS5는 73개의 개방형해독틀을 가지고 있어 두 박테리오파지는 분명한 유전적 차이를 갖고 있다고 판단할 수 있었다. 이러한 두 박테리오파지 간의 유전적 특성 차이는 두 박테리오파지 간에 다양하게 표출되는 여러 특성의 외형적 및 기능적 차이가 있음을 나타낸다 할 수 있다. 더 나아가 이러한 두 박테리오파지 간의 차이는 두 박테리오파지의 산업적 활용 시의 차이가 있음도 나타낸다.
이러한 사실에 근거하여 박테리오파지 STP-2는 기존 보고된 박테리오파지들과는 다른 신규한 박테리오파지라 결론지을 수 있었다. 이러한 사실과 함께 통상적으로 박테리오파지의 종류가 다르면 제공할 수 있는 항균력의 세기 및 항균범위가 다르다는 사실로부터 박테리오파지 STP-2는 기존에 보고된 다른 박테리오파지들과는 다른 항균효과를 제공해 줄 수 있다고 판단할 수 있었다.
실시예
3: 박테리오파지
STP
-2의 살모넬라
티피뮤리움
균에 대한
사멸능
조사
분리된 박테리오파지 STP-2의 살모넬라 티피뮤리움 균에 대한 사멸능을 조사하였다. 사멸능 조사는 실시예 1에서 제시한 점적 실험을 통하여 투명환 생성 여부를 조사하는 방식으로 수행하였다. 사멸능 조사에 사용되어진 살모넬라 티피뮤리움 균주들은 미국 ATCC로부터 분양을 받거나 본 발명자들에 의해 분리되어 살모넬라 티피뮤리움 균으로 동정된 것들로 총 10주였다. 박테리오파지 STP-2는 실험에 대상이 된 살모넬라 티피뮤리움 10주 중에 ATCC14028 균주를 포함하여 총 9주에 대하여 사멸능을 갖고 있었다. 대표적 실험 결과가 도 2에 제시되어 있다. 한편, 박테리오파지 STP-2의 보데텔라 브론치셉티카(Bordetella bronchiseptica), 엔테로코쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코쿠스 패슘(Enterococcus faecium), 스트렙토코쿠스 미티스(Streptococcus mitis), 스트렙토코쿠스 우베리스(Streptococcus uberis) 및 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa)에 대한 사멸능 조사도 실시하였는데, 결과로 박테리오파지 STP-2는 이들 균종들에 대해서는 사멸능을 갖고 있지 않았다.
이상의 결과로 박테리오파지 STP-2는 살모넬라 티피뮤리움 균에 대하여 우수한 사멸능을 가지며, 다수의 살모넬라 티피뮤리움 균주들에 대하여 항균 효과를 발휘할 수 있음을 확인할 수 있었다. 이는 박테리오파지 STP-2가 살모넬라 티피뮤리움 균에 의해 유발되는 질환에 대한 예방 및 치료 목적의 조성물의 유효성분으로 활용 가능함을 의미한다.
실시예
4: 박테리오파지
STP
-2의 살모넬라
티피뮤리움
균 감염 예방에 대한 실험예
9 ml의 TSB 배지를 담은 하나의 튜브에 1× 108 pfu/ml 수준의 박테리오파지 STP-2 액 100 μl를 넣어주고, 다른 하나의 9 ml의 TSB 배지를 담은 튜브에는 동량의 TSB 배지만을 추가로 첨가하였다. 그 다음에 각 튜브에 600 nm에서 흡광도가 약 0.5 정도가 되도록 살모넬라 티피뮤리움 균의 배양액을 넣어 주었다. 살모넬라 티피뮤리움 균을 첨가한 후 튜브들을 37℃의 배양기에 옮겨 진탕배양하면서 살모넬라 티피뮤리움 균의 성장 상태를 관찰하였다. 표 1에 제시된 바와 같이, 박테리오파지 STP-2 액을 첨가해 준 튜브에서는 살모넬라 티피뮤리움 균의 성장 억제가 관찰된 반면에 박테리오파지 액을 첨가하지 않은 튜브에서는 살모넬라 티피뮤리움 균의 성장 억제가 관찰되지 않았다.
구분 | OD600 흡광도 값 | ||
배양 0분 | 배양후 60분 | 배양후 120분 | |
박테리오파지 액 미첨가 | 0.5 | 0.9 | 1.6 |
박테리오파지 액 첨가 | 0.5 | 0.2 | 0.1 |
이 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 STP-2가 살모넬라 티피뮤리움 균의 성장을 저해할 뿐만 아니라 살모넬라 티피뮤리움 균의 사멸까지 시키는 능력이 있음을 확인할 수 있었고, 이로부터 박테리오파지 STP-2가 살모넬라 티피뮤리움 균에 의해 유발되는 질환을 예방하는 목적의 조성물의 유효성분으로 활용될 수 있다고 결론지을 수 있었다.
실시예
5: 박테리오파지
STP
-2를 이용한 살모넬라
티피뮤리움
균에 의해 유발되는
질환에 대한 예방 동물시험
이유자돈을 이용하여 박테리오파지 STP-2의 살모넬라 티피뮤리움 균에 의해 유발되는 질환에 대한 예방 효과를 조사하였다. 생후 25일령의 이유자돈 20마리를 총 2 그룹(그룹 당 10마리)으로 나눈 후 실험사육돈방(1.1m × 1.0m)에 분리 사육하면서 14일간 시험을 실시하였다. 보온시설 하에 주위환경을 통제하였고 돈방의 온도와 습도는 일정하게 유지시켰으며 돈방 바닥의 청소를 매일 실시하였다. 시험 개시일로부터 시험 종료일까지 시험군(박테리오파지 포함 사료 투여군)의 돼지들에게는 1× 108 pfu/g의 박테리오파지 STP-2를 포함하고 있는 사료를 통상적인 사료 급이 방식에 따라 급이하였다. 반면에 대조군(박테리오파지 미포함 사료 투여군)의 돼지들에게는 시험 개시일로부터 시험 종료일까지 박테리오파지 STP-2가 포함되지 않은 동일 조성의 사료를 동일한 방식으로 급이하였다. 시험개시일로부터 7일째가 되는 날부터 2일간에 걸쳐 실험군(박테리오파지 포함 사료 투여군) 및 대조군(박테리오파지 미포함 사료 투여군)의 돼지들 모두에게 1× 108 cfu/g 수준으로 살모넬라 티피뮤리움 균을 급이하는 사료에 추가 포함시켜 하루 2회씩 급이하여 살모넬라 티피뮤리움 균 감염을 유도하였다. 살모넬라 티피뮤리움 균을 포함하고 있는 사료 급이 시행일(시험개시일로부터 7일째가 되는 날)부터 매일 모든 시험동물들을 대상으로 분변에서의 살모넬라 티피뮤리움 균 검출 정도를 조사하였고 돼지들의 설사 발생 정도도 조사하였다.
분변에서의 살모넬라 티피뮤리움 균 검출 조사는 다음과 같이 수행하였다. 분변 시료를 살모넬라 티피뮤리움 선택배지(RAMBACHⓡ agar, Merck)에 도말한 후에 37℃에서 18-24시간 동안 배양한 다음에 형성된 콜로니(Colony) 중에 살모넬라 티피뮤리움 균으로 추정되는 콜로니를 선별하였다. 이렇게 선별된 콜로니들을 각각 시료로 하여 살모넬라 티피뮤리움 균 특이 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)을 수행하여 최종적으로 해당 콜로니가 살모넬라 티피뮤리움 균인지를 확인하였다.
설사 발생 정도 조사는 설사지수를 측정하는 방식으로 실시하였다. 설사지수 측정은 통상 사용되는 Fecal Consistency(FC) score(정상: 0, 연변: 1, 묽은 설사: 2, 심한 설사: 3)를 측정하는 방식으로 실시하였다.
그 결과는 표 2 및 표 3과 같았다.
구분 | 평판배지 접시 당 검출된 살모넬라 티피뮤리움 균의 콜로니 수 | |||||||
D7 | D8 | D9 | D10 | D11 | D12 | D13 | D14 | |
대조군(박테리오파지 미포함 사료 투여) | 24 | 21 | 18 | 17 | 16 | 17 | 14 | 14 |
시험군(박테리오파지 포함 사료 투여) | 12 | 8 | 7 | 3 | 1 | 0 | 0 | 0 |
구분 | D7 | D8 | D9 | D10 | D11 | D12 | D13 | D14 |
대조군(박테리오파지 미포함 사료 투여) | 1.6 | 1.8 | 2.0 | 1.6 | 1.4 | 1.5 | 1.2 | 1.2 |
시험군(박테리오파지 포함 사료 투여) | 0.6 | 0.4 | 0.2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
이 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 STP-2가 살모넬라 티피뮤리움 균에 의해 유발되는 질환의 예방에 매우 효과적이라는 것을 확인할 수 있었다.
실시예
6: 박테리오파지
STP
-2를 이용한 살모넬라
티피뮤리움
균에 의해 유발되는 질환에 대한
치료예
박테리오파지 STP-2의 살모넬라 티피뮤리움 균에 의해 유발되는 질환에 대한 치료 효과를 조사해 보았다. 2일령 병아리 40마리를 한 그룹으로 하여 총 두 그룹으로 나눈 후에 분리 사육하면서 14일간 시험을 실시하였다. 시험 개시일로부터 5일째 되는 날부터 3일간 1× 107 cfu/g 수준으로 살모넬라 티피뮤리움 균을 포함하고 있는 사료를 통상적인 사료 급이 방식으로 급이하였다. 3일간의 살모넬라 티피뮤리움 균을 포함하고 있는 사료 급이 시행 다음날(시험 개시일로부터 8일째가 되는 날)부터 시험군(박테리오파지 포함 사료 투여군)의 병아리들에게는 1× 108 pfu/g의 박테리오파지 STP-2를 포함하고 있는 사료를 통상적인 사료 급이 방식에 따라 급이하였다. 반면에 대조군(박테리오파지 미포함 사료 투여군)의 병아리들에게는 박테리오파지 STP-2가 포함되지 않은 동일 조성의 사료를 동일한 방식으로 급이하였다. 시험 개시일로부터 8일째가 되는 날부터는 시험동물들을 대상으로 분변에서의 살모넬라 티피뮤리움 균수를 측정하였다. 본 실시예의 살모넬라 티피뮤리움 균수 측정에서는 타 오염 세균에 의한 간섭을 막기 위해 살모넬라 티피뮤리움 균 선택배지(RAMBACHⓡ agar, Merck)를 사용하였다. 시료를 선택배지에 도말한 후에 37℃에서 18-24시간 동안 배양하였다. 배양한 선택배지로부터 살모넬라 티피뮤리움 균으로 추정되는 콜로니를 선별하여 순수분리한 후에 중합효소연쇄반응을 통해 살모넬라 티피뮤리움 균인가를 확인하는 방식(중합효소연쇄반응을 통해 살모넬라 티피뮤리움 균으로 확인된 콜로니 수가 102 cfu/ml 수준 이상일 경우: 2, 중합효소연쇄반응을 통해 살모넬라 티피뮤리움 균으로 확인된 콜로니 수가 101~102 cfu/ml 수준인 경우: 1, 중합효소연쇄반응을 통해 살모넬라 티피뮤리움 균으로 확인된 콜로니 수가 100~101 cfu/ml 수준인 경우: 0)으로 실시하였다. 참고로, 살모넬라 티피뮤리움 균을 포함하고 있는 사료 투여 종료 다음 날(시험 개시일로부터 8일째)부터 분변에서 살모넬라 티피뮤리움 균이 두 그룹 모두에서 확인되어, 강제 감염이 잘 유도되었음을 확인할 수 있었다. 살모넬라 티피뮤리움 균수 특정 결과 결과표는 표 4와 같았다.
날짜 | D8 | D9 | D10 | D11 | D12 | D13 | D14 |
대조군(박테리오파지 미포함 사료 투여) | 1.2 | 1.2 | 1.0 | 1.1 | 1.0 | 1.1 | 1.0 |
실험군(박테리오파지 포함 사료 투여) | 0.3 | 0.2 | 0.2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
이 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 STP-2가 살모넬라 티피뮤리움 균에 의해 유발되는 질환의 치료에도 매우 효과적이라는 것을 확인할 수 있었다.
실시예
7: 사료첨가제 및 사료의 제조
박테리오파지 STP-2 액을 이용하여 사료첨가제 1 g당 1× 108 pfu의 박테리오파지 STP-2가 포함되도록 사료첨가제를 제조하였다. 사료첨가제의 제조 방법은 박테리오파지 액에 말토덱스트린을 첨가(50%, w/v)한 다음에 동결 건조시켜 제조하였다. 최종적으로 고운 가루형태로 분쇄하였다. 상기 제조과정 중의 건조 과정에는 감압 건조, 가온 건조, 상온 건조도 대체 가능하다. 대조 실험을 위해, 박테리오파지가 포함되지 않은 사료첨가제도 박테리오파지 액 대신에 박테리오파지 액의 제조 시에 사용한 완충액(Buffer; 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgSO4, 0.1% Gelatin, pH 8.0)을 사용하는 방식으로 제조하였다.
이렇게 제조된 2종의 사료첨가제 각각을 중량비로 1,000배의 양계용 사료와 혼합하여 최종 2종의 사료를 제조하였다.
실시예
8:
음수첨가제
및 소독제의 제조
음수첨가제나 소독제는 그 활용에서만 차이가 나고 제형은 동일하므로 같은 방식으로 제조하였다. 박테리오파지 STP-2 액을 이용하여 음수첨가제(또는 소독제) 1 ml당 1× 109 pfu의 박테리오파지 STP-2가 포함되도록 음수첨가제(또는 소독제)를 제조하였다. 음수첨가제(또는 소독제)의 제조 방법은 박테리오파지 액 제조 시에 사용하는 완충액 1 ml당 1× 109 pfu의 박테리오파지 STP-2가 포함되도록 상기 박테리오파지 STP-2 액을 첨가하여 잘 혼합해 주는 방식으로 제조하였다. 대조 실험을 위해, 박테리오파지가 포함되지 않은 음수첨가제(또는 소독제)로는 박테리오파지 액의 제조 시에 사용한 완충액 자체를 그대로 사용하였다.
이렇게 제조된 2종의 음수첨가제(또는 소독제)는 부피비로 1,000배의 물로 희석하여 최종적인 음수 또는 소독제로 사용하였다.
실시예
9: 닭 사육에서의 사양 효과 확인
실시예 7 및 실시예 8에서 제조한 사료, 음수 및 소독제를 이용하여 닭 사육 시의 사양 결과 개선 여부에 대하여 조사해 보았다. 특히 본 조사는 폐사율 관점에서 실시되었다. 총 120 마리의 2일령 병아리를 한 군당 40 마리씩으로 총 3개 그룹(사료로 급이한 그룹-A; 음수로 공급한 그룹-B; 소독 처리한 그룹-C)으로 나누어 4주간 시험을 실시하였다. 각 그룹은 다시 20마리로 구성되는 소그룹으로 나누어지며 각 소그룹은 박테리오파지 STP-2가 적용된 소그룹(소그룹-①) 박테리오파지가 적용되지 않은 소그룹(소그룹-②)으로 나누었다. 본 시험에 대상이 된 병아리들은 각 시험 소그룹 별로 분리되어 사육되었다. 각 소그룹은 다음의 표 5와 같이 구분되고 지칭되었다.
적용 | 소그룹 구분 및 표시 | |
박테리오파지 STP-2 적용 | 박테리오파지가 적용되지 않음 | |
사료로 급이한 그룹 | A-① | A-② |
음수로 공급한 그룹 | B-① | B-② |
소독 처리한 그룹 | C-① | C-② |
사료 급이의 경우에는 실시예 7에서 제조한 사료를 표 5의 구분에 따라 통상적인 사료 급이 방식을 따라 급이 하였으며, 음수 급이의 경우에는 실시예 8에서 제조한 음수를 표 5의 구분에 따라 통상적인 음수 급이 방식에 따라 급이하였으며, 소독 처리의 경우에는 일주일에 3회씩 기존 소독과 번갈아 가면서 실시하였다. 본 발명의 소독제를 분무하는 날은 통상의 소독제를 이용한 소독은 실시하지 않았다. 시험 결과가 표 6에 제시되어 있다.
그룹 | 폐사율(%) |
A-① | 0 |
A-② | 45 |
B-① | 5 |
B-② | 45 |
C-① | 5 |
C-② | 45 |
이상의 결과로 본 발명에 따라 제조된 사료 및 음수의 급이와 본 발명에 따른 소독 처리가 닭 사육에서의 폐사율 감소에 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 이로부터 본 발명의 조성물의 적용이 닭의 사양 결과 개선에 효과적이라는 결론을 내릴 수 있었다.
이상의 결과로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
[수탁번호]
기탁기관명: KCTC
수탁번호: KCTC 12853BP
수탁일자: 20150623
SEQUENCE LISTING
<110> iNtRON Biotechnology, Co. Ltd.
<120> Novel Salmonella Typhimurium bacteriophage STP-2 and its use for
preventing proliferation of Salmonella Typhimurium
<130> KP090567
<160> 1
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 59043
<212> DNA
<213> Bacteriophage STP-2
<400> 1
atcaaggtcg cgctggtgga tcatcttgtt aacgatggac aggtcggtca cgtcctcgat 60
cagcttcggc gttctcggca ggttttgagt ctgaatacgg cggccagccc aacggttcgt 120
gcggcttgcc ccggcgaatt gcagcgagaa gcggaatcgt ccatcttcgc cagccgcgtc 180
aatcatggtc tgatattttg acagggagtt tttcgcgcta ttcaggcgca tccgcagcac 240
gcggatcgca tccgggtcaa cgccgttttc atcggcttcg cgaatgacct tgttgacggt 300
gtcactgcga aggtcgctga acggatagcc gcgctctttg agccacggtg ttaactgcgc 360
cgggaattgg ggttgttcag gccagtgatg tcggccattt cttcgataat ctgcggtttg 420
cgcgcctctg cgagcgccag cgccgagtac gcgaattcgc ggtcaatcat cacgcctgta 480
tcgttgatga actgatccag cgcgtacatg tcccattcgg catccagaac cgggtaccgc 540
atcaggcggg ctttaatcgc cagttcggtt tcaacgtccc gcacgttata tttgcagaag 600
tgccaccagt cttccgggtc ggtcgcttca ttgcgccact caaacgggtt tttcttcgtg 660
acgcgctgcg gcttgctgaa caggtcgatc aggcgcttgc cttccgggtc tttcagtttc 720
tcttccggca agccgatctg cgtgccgacg gccagaaggt cgcccgcaaa gccgagcatg 780
tacgccagcg ccatcgtaca gcgccacgat ttatacggcg tcttgatgcc gagcacccgg 840
cgggtcatta cgcgttcgaa ctgcgcgtta aaggcccact tctcgacggc cggtcttcca 900
gcgcttcacg cagttcgccg ggcaacttct tccctcggtg aaggtcgata tgctgcaccg 960
ctccgccatt gatagaccat gcgcccatca gaattttagt cgattcgtcg ttcgaatatc 1020
ggtcgaatcc gttcgtttta aggttcaccc ggcttcggga ttcatagtcc agattaatgc 1080
aatcggtcac gttaacgctc ctgtatgaaa aaagcccgca cgcggcgggc cttgtattac 1140
cgcccgaggg cgtacattac acttcgtctt cccaatcttc gtcttcatcc cacgcgtcgg 1200
acgtgtccac acgaccttca ccgaacggct cgtcgtcttt gcgtttcaga acggaaatca 1260
ggttggcgtt aacgcgtttg ccgaatttgt tttcctgcga ccacggacgg atgacaaccg 1320
acacccaaca accaccgtag atctcttcca gaatttcgga agaggtagtc aactcttcgc 1380
gctcgatgtt atacacatcc gggcgtttgc tttcgcgtgc ggagataacc cacatccctt 1440
cgcattccgg tttatccgga aaatcggtat caccgtcttt gatgaacaac atggacgggg 1500
cgactttcag cgcgcctgtc ttgtggttct tcttggtgac ttcgatctgc tcacggatga 1560
ttttctcgat ctcgccgtgg ctgtctttcg gcatcaaaag cgtcagcgag tatttcggct 1620
cgccgccgtc ttcaccgccg tacggcttat cgaggtgcgg gtaagaagca cgtacgttag 1680
aaatcttgat gtgaccagat ttgtacagca cgccattctt gacttttttc gcagggacta 1740
atttctcggc catcttaata tcctcggttt actgttttac gggtttactt tctacggttt 1800
tacgggttta cacttcgtca tcatcttcgt cgtcccacgc cccggaatac ttgccgtcca 1860
gtggtggccg cttatcggtc agcggtgcca gtgtcggctt gccttccggc ttgtagacga 1920
tccccgcgat gatgttcggc gcgccagccc gggacacgcc caattcatcc ctaagcactt 1980
cttccatctg cgccggggta cgcagtttgc gttcgatgta cttgtcctcg tcaatatcga 2040
ggaaccggaa cagcgcgatc gcatctttct cattggcgaa tttacggttt gtccgcgact 2100
ccaccagctt ttgacccggt accttctcgc cgttcattgc gcggcgttcc agttcgaagt 2160
caaggcgcga gaaccagttt tcgaccacct tgcggtatgg caggatcttc gccatctgct 2220
cggttgtcag gtttccgaac tgcgcccgcc ggaacttata ttcctgcgcc agcgcatcac 2280
gcaatactga catttcttcc tccccgaatt cagcttcaag gaattccacg tccccgccca 2340
ctgcgcattc catcatgtac gctatcgctg cgcagttatg cgctgcccgg caaaagcgac 2400
accctttcag ggatgcgcgg cgcggcgcgg taaggctcca tgccgctgca attcgctccc 2460
gggcatactc cgcgaactct aacaattcgt caatcgtgat ttcccacgta tcgaaatggt 2520
cgagcctcgg ctgcgcgatc cggatgacaa tacggtcaaa ctcgtattca tctgcgaaag 2580
cgcggtacgc accgtacgcg taaagtagcg cctgcgggtt cccttccgcg aaaacctgaa 2640
cgccagtccc gtatttcagg tcggtcacga tcaaggttcg gtcgcggatg atgatattat 2700
ccgccgttcc gccctgagcg acaaactcga tcgggtcttc gtcaggttca tccgggttcg 2760
ctcgcggcat caggtcggta aaccagaccc ggatttccgt gaacatttca ccctcttcaa 2820
atcggcacca gtccacgtac tcctgaaccg agtcgagcat tgaccgcgta atcgggatgt 2880
catggctgac accgccttcc gtgatcgtct cgactgtacc gattaaatgg gttggccgga 2940
catccgttcg cagccattgt tcggcgattc cgtgggccac cgtgccttcc gccgcctcgt 3000
agatggtttc gtcatgctca aaaagcccgg ctatcaggct tccagaacat gcgatccaac 3060
gcgctgacgc agaaggcgcg aagattgagt ggccgccacc gccgaattcc cgcatgatgc 3120
ggactaacag tgacttacta ctcattcgga tacgccttta tcgcattgag gaatcggtgt 3180
tcgccgactc gctcaatcgt cgctaccaat gccctagcgc ctgccccgct gtaattattg 3240
cggcctgcgt taaagcgagt cttcgccacg tcgtcccacc agacgtcgca cactcgatag 3300
cccgatgcag catgggttac gagcagcggc gcttctagtt tcgaaacagg tgaagtaact 3360
ctgaacagca catcgcgatc accgatttga aaacgaaact ccgcccaagt gcgcgcgaga 3420
actgcgccgc cggatgttgc tacgttggtg aaagtaatgc tggtcacaat tgcctctccg 3480
ttggtgtgaa aaacggcccc cgaagggagc cgatgcgggg cgaaagatta aacgtcgtct 3540
tcttcgccgt taccgccttc atctttttca gccagtttgg cttcacacat ttcgacgatt 3600
tcgtcgaagt gttcttcctt cgcttccgcg actttggcga ggccgaagtg tgcggtgatt 3660
ttcttggctt ccggcgcgcc gaacgcgtct ttaaccgcaa cgacagccgc gactacttcg 3720
tctttggtgt gtttaggctt gaccgcttta gtttcggttt tacctgcacc gcctttcgcg 3780
ccgcccttag caccgccttt ggtggtagtg gtggtttttt cagtggtttc gctaccagcg 3840
tcagcggaag tgttcaccgc gccgcctttc agtgctgcca gaacgccttc cagcagggtg 3900
ttagtttttt gttgttcagc cagcagttgt tcgaagatac cagacataat tttctactcc 3960
gttaagtgtt taaaaggtcg tgtcgtgttg acgggatgaa gtatggccca aacgccgaat 4020
aactgtcaaa cacttttttc gaaatttttt gattaggtac ctcaaagcct tgtattccgg 4080
acgtaagatg gttgcggtac ccgactaaat ggccagcttg acagatttac gggccggata 4140
tactatccgc aaatctataa cacgcacaca tgcgagggct tgggctatgc gatttccgaa 4200
atgggcttta aatgatgacc ggatgaaggt caaattccta atgacacaag cggcgttaga 4260
gatcgacccg aatgccagaa tggcggactt agcgaaggct gcgaaggtaa gctactcgac 4320
tcttttatgg gcgacgcaaa ataacgtatc gagcgccgtg gccgaaaaag tttgcagcgc 4380
ggtaccgctg accgggatcc gccccactgg ctgactaacc cttcttggat caaaactgac 4440
agcgaaacag gggaaatcct tgaatgaatt actggcaaga gtacggcgaa acgctttggg 4500
gaatgggtac accatcgtac ctatctacgc cccggacgcc gataagaagg gcgcgggtaa 4560
acgccccatc ggtaaggatt gggaacgaac cattaacgat aaggagcaga tccagcgttg 4620
ggcggaacgc ttcaccaaaa acggtattgg catcctgacc aaatacaccc cggccgtgga 4680
catcgacgtg tacgatgaag acgccgtggc gcatatgtcg gattgggtgc tggagaatgt 4740
tggccgcgcg ccttgtcgta tcggccggag ccaaagaaac ttttcctgtt cagatcggaa 4800
tcgccattct cgaaagtgaa gtccggcgtg tgggaagacg acttcggcca gcgccatgcg 4860
gttgaaatcc tcgccgacgg ccagcagttc gtcgcgtacg gtatccaccc ggacaccaac 4920
cgcgattatt actggctcga cgacgaaacc ccgctgaaca atgcggccga cttcgacctt 4980
gaagagatca gcctcgatac cgcgcgggaa attgctgcgg agtttgaccg ctacgccaaa 5040
gaacaaggct ggacgatggt caagcgcccg atgaacgggt acgaagccat cggaacggcg 5100
gacgaagagg attgggcggc aacggcgggt atccggaaat gggacggcac gtacgaagac 5160
cttcgcgatc tcgtcatgaa gtacccgaat ccggaagatt atgagaacta catcaaggtt 5220
ctggccgcgt tgcaaatctc ctgccgggat caggacgaag ccaagtcgat tgctcgcgaa 5280
tgggccatgc aggcgcacaa ctttgatgat ggtgatttcg agtacaaatg ggataagggc 5340
tttgcgcata acgcatcacg ccttgtaacc ctcggatcga tcatcaccga agtccgtgaa 5400
atcgagaaag ccgagcagga agagaaggcc atcgagtacc gcgaggcttt cgccgagtgt 5460
accgaagcaa atgactggaa tgcgtgggcc gaatccttca aaaaagcgca gattttcggc 5520
cttacccgcc ggacgatcgt gaaaatcgcc gcagaagcat actacaggat caacaactta 5580
cgtcttactg ccgccgataa aaaggacatt ttgggcttcg attatgggtc aaaagagact 5640
ccacaatggc tgaaaaagtt cgttttttcg gaagaaaatg actgtttgat cgataaatca 5700
tccggttctt acatttctaa gggcgctttt gacttcgcat acgcaaaact ctgcaaattc 5760
gaggatgaag tgttcaagcc aaccgtgttc gcgtccgtta cgcgtccgat cccgatcgtt 5820
tgcgacgcca tgtactaccc ggcgatgcac ggtgatatgg aagaatcgct ttggaagccg 5880
aaggaggggt tttaggcccg gaattcttca ttgacgagtc cggcaagacg tggctcaact 5940
ctttcgaccc tgattccatt ccggagccag ccgccgagct ttcgccgtac gataaaaagg 6000
cggtggagat catcaaggac ttcttcgtcg tacttttccc gaatgacaag gaacgccgat 6060
acgttatgga ctggatggct tggattatcc agcacccgac aaaacgcatc aactactcgt 6120
tactgattcg cggcgcgcac ggttccggta aatcgacgtt gggcgtgctc atgtcggcca 6180
tgttaggccg taaaaacgtg ggctacgtgt caaacaccgt gatgaatggc cgtttcagcg 6240
attgggcgga aggcgacatc ctgaaaatcg tggaagaggt gtacgacaaa ggcgaccgat 6300
acagcgctat cgagcggcag aaagagtaca tcaccaacga ccgttttcag gtggagccga 6360
aaggccgcaa gccgaaggtt gtcgtgaata ccagcagcaa aatgatgttc accaaccact 6420
ttaacgcgtt gccacttgat gaaaaccagc gtcgttatct ggtggtgtcc acgcaggcgg 6480
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tcctcgaaac ggaagacgtt gaaatgccga aaacgtcacg cctcaaaaat atgcttatgg 6840
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tcaagatcta acatccagta accgcgcttt aaataaacgt attcccccgc cggattggtt 9960
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gcattcatcg cgatgatctc cgcttcgatt tcagcgcggg taaagtcgga aaggttgagg 10080
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ccaaaggcgc tggcaccatc tggctgacca agtccgcgac atcggaaagc tggtggccgg 20160
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gca 59043
Claims (5)
- 삭제
- 살모넬라 티피뮤리움 균을 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 가지며 자연으로부터 분리된 시포비리대 박테리오파지 STP-2(수탁번호 12853BP)를 유효성분으로 포함하는, 살모넬라 티피뮤리움 균에 의해 유발되는 질환 예방용 및 치료용 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 조성물은 사료첨가제, 음수첨가제, 또는 소독제 제조 용도로 사용되는 것을 특징으로 하는, 살모넬라 티피뮤리움 균에 의해 유발되는 질환 예방용 및 치료용 조성물.
- 제2항 또는 제3항에 의한 박테리오파지 STP-2(수탁번호 12853BP)를 유효성분으로 포함하는 사료첨가제, 음수첨가제 또는 소독제 형태의 조성물을 사람을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 살모넬라 티피뮤리움 균에 의해 유발되는 질환을 예방 및 치료하는 방법.
- 삭제
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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