KR102035463B1

KR102035463B1 - 암 줄기세포의 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR102035463B1
Application number: KR1020180018716A
Authority: KR
Inventors: 강석구; 이지현; 김용철; 조경래
Original assignee: 연세대학교 산학협력단; 광주과학기술원
Priority date: 2018-02-14
Filing date: 2018-02-14
Publication date: 2019-11-26
Also published as: KR20190098593A; WO2019160312A1

Abstract

본 발명은 암 세포 중에서도 특히 암 줄기세포의 침윤성 및 전이성을 억제하여 암 줄기세포를 치료할 수 있는 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

암 줄기세포의 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical composition for treating cancer stem cells}

암은 전세계적으로 가장 보편적인 사망원인 중의 하나이다. 약 천만 건의 새로운 케이스가 매년 발생하며, 전체 사망원인의 약 12%를 차지하여 세 번째로 많은 사망의 원인이 되고 있다. 여러 가지 종류의 암 중에서 특히 뇌암은 연령에 관계없이 발생되며, 소아에서 발생 빈도가 다른 암에 비하여 높은 특징이 있다. 뇌암은 뇌조직과 뇌를 싸고 있는 뇌막에서 발생되는 일차성 뇌종양과 두개골이나 신체의 다른 부위에서 발생된 암으로부터 전이된 이차성 뇌종양으로 구별되는데, 증세로는 운동 마비, 지각 마비, 언어 장애, 시력 장애, 평형 장애 등과 같은 국소 증상과 두개내압항진 증상을 들 수 있다. 상기 뇌암은 조직특이적으로 1 내지 2종의 암이 발병되는 다른 조직에서 발병되는 암과는 달리 다형성아교모세포종, 악성신경교종, 임파선종, 배아세포종, 전이성 종양 등의 다양한 종류의 암을 포함하는데, 이 중에서도 신경교종(glioma), 특히 교모세포종(glioblastoma)은 가장 악성이고 공격적이어서 예후가 매우 좋지 않으며, 진단 후 평균 생존 기간이 약 1년을 넘지 못하는 매우 치명적인 질환이다. 상기 교모세포종이 발병된 환자에서는 뇌세포와 종양세포 간의 경계가 분명하지 않기 때문에, 암 조직을 외과적으로 완전히 제거하는 것은 거의 불가능한 것으로 알려져 있다.

이에, 상기 교모세포종을 치료하는 방법을 개발하기 위하여, 다양한 연구가 수행되고 있지만, 교모세포종은 다양한 유전적 돌연변이를 포함하기 때문에, 상기 병용 치료 방법이 사용되고 있는 현재에도 교모세포종 환자의 평균 생존율이 현저히 낮아, 새로운 치료제의 개발이 요구되고 있다. 이러한 필요성에 따라 새로운 교모세포종 치료제를 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 국제특허공개 제2012-061120호에는 정제된 교모세포종 GBM6-AD 줄기세포를 이용하여 교모세포종을 치료하는 방법이 개시되어 있고, 국제특허공개 제2012-104822호에는 마시텐탄을 투여하여 교모세포종을 치료하는 방법이 개시되어 있다.

한편, 암 조직에도 일반 장기처럼 암 조직을 유지하고 재생하는 암 줄기세포(cancer stem cells or tumor initiating cells)가 존재하며, 이것이 암의 최초 시작에 관여할 것으로 추측되고 있을 뿐 아니라, 암 치료 후 줄어든 암세포를 재생하는 데 관여함으로써 암의 재발이나 전이 및 항암치료 내성 유발에 깊은 영향을 미친다고 보고된 바 있다(BB Zhou et al. Nature Reviews Drug Discovery, 8:806-823(2009)). 따라서 암을 근본적으로 진단 및 치료하기 위해서는, 암 조직의 극히 일부만 차지하면서도 암의 발병과 유지, 재발에 핵심 구실을 하는 암 줄기세포에 초점을 맞추어야 하며, 암 줄기세포에 대한 더 많은 이해는 조기 진단 및 치료에 크게 도움이 될 것이다.

본 발명의 일 목적은 암 세포 중에서도 암 줄기세포의 침윤성 또는 전이성을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 약학 조성물에 관한 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

이하, 본원에 기재된 다양한 구현예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구현예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구현예" 또는 "구현예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구현예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구현예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구현예에서" 또는 "구현예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구현예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구현예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.

본 발명 내 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당 업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

본 발명에서 "암줄기세포"는 줄기세포 특유의 능력인 자가재생이나 분화능력을 가지고 있는 포괄적인 의미의 암세포를 의미한다. 종양 내 존재하는 것으로 알려져 있으며 정상 줄기세포의 유전적인 정보의 비정상적인 전이로 인해 발생하는 것으로 생각되고 있다. 암줄기세포는 그들이 생존하기 위한 미세환경, 니쉬(niche)의 존재로 인해 유지, 증식되며 주변에 존재하는 정상 세포, 면역관련 세포 또는 분화된 암세포가 이들 특성 유지와 증식에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 상기 암 줄기세포는 정상적인 종양의 생장 조건(상기 "정상적인 종양의 생장 조건"이란 세포 성장에 필요한 영양분(포도당)이 충분하고 종양미세환경의 생장 여건이 풍족하여 세포 스트레스가 없는 상태를 지칭한다.)에서 일반적인 암세포와 상이하게 느린 속도로 증식하거나 휴지기(dormant state) 상태를 유지하여 항암제에 대한 저항성을 가지고 있을 수 있으며, 예를 들어, PGC-1α 등의 전사조절인자의 발현이 정상적인 종양세포와 달리 통제되어 주요 대사조절물질의 기능이 일반 암세포와 비교하여 상이할 수 있다. 이러한 상이한 대사조절 능력과 이에 기전적으로 연계된 세포신호전달계의 조절을 통해 영양 결핍 상태에서 세포 사멸(apoptosis)에 대한 저항성을 획득하고 침윤 및/또는 전이능이 있는 세포를 포괄적으로 지칭한다. 그러나 일반적인 암 세포로 분화할 수 있는 세포라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 "종양구(tumorsphere)"는 암 조직을 구성하는 세포 중 줄기세포(stem cells)와 유사한 특성을 가지는 일부의 세포가 3차원 배양 조건에서 형성하는 세포응집체를 의미하며, 그 직경 사이즈는 특별히 제한하지 않으나 예를 들면 10 내지 500 ㎛일 수 있다.

본 발명에서 상기 종양구는 Wnt 신호 전달 경로에서 베타 카테닌(beta-catenin)의 안정성을 조절하는 데에 중요한 역할을 하는 AXIN2 단백질 또는 mRNA의 발현 수준이 정상 조직보다 낮거나 발현되지 않는 것이 바람직하며, 예를 들면 대장암을 제외한 모든 종류의 암의 줄기세포일 수 있고, 바람직하게는 뇌암, 유방암, 자궁경부암, 폐암, 교모세포종, 구강암, 뇌하수체선종, 신경교종, 뇌종양, 상인두암, 후두암, 흉선종, 중피종, 위암, 식도암, 대장암, 직장암, 간암, 췌장암, 췌내분비종양, 담낭암, 음경암, 요관암, 신세포암, 전립선암, 방광암, 비호지킨성림프종, 골수이형성증후군, 다발성골수종, 형질세포성종양, 백혈병, 소아암, 피부암, 기관지암, 결장암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암의 줄기세포 또는 종양구일 수 있으며, 보다 바람직하게는 뇌암 줄기세포 또는 뇌암 종양구일 수 있다.

본 발명에서, “P2X7 수용체(P2X7R)”는 P2X 패밀리에 속하는 비선택적인 양이온 채널이고, 호모 3량체로서 기능을 발휘한다. 세포 외의 ATP에 의해 개구되어 양이온이 세포 내로 유입된다. 반복 자극 시 등에는 세포 내 시그널을 항진시키고, 파넥신 등의 헤미채널을 개재하여 막 형상으로 소공(小孔)을 형성한다(문헌 [Baroja-Mazo A et al., Biochim Biophys Acta. 2013. 1828. 79-93]). 이는 ATP 등의 소경 분자의 세포 외로의 방출을 유발함과 더불어, 세포의 더한층의 활성화를 유도한다. P2X7 수용체의 활성화는 염증성 사이토카인, 특히 인터류킨 1β 및 인터류킨 18의 성숙과 방출을 야기하여, 염증이나 면역 반응, 동통(疼痛) 등에 관여한다(문헌 [ MacKenzie A et al., Immunity. 2001. 15. 825-835]).

본 발명에서 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 암 줄기세포의 성장, 증식, 침윤성 또는 전이성을 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 "치료" 및 "개선"은 본 발명의 조성물의 투여로 암 줄기세포의 성장, 증식, 침윤성 또는 전이성을 억제하여 암 질환을 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 있어서, "약학 조성물"은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 약학 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약제적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.

한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 비강 내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다.

본 발명에서, "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여 시간, 투여 경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.

본 발명의 조성물은 단독으로, 혹은 종전의 항암제를 혼합하여 사용할 수 있고, 혹은 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 기타 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 (A)로 표시되는 화합물 또는 그의 염을 포함하는, 암 줄기세포의 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, R₁은

,

, 또는

로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 상기 화합물 또는 그의 염은 N-(1-아다만틸메틸)-2-클로로-5-[3-(3-히드록시프로필아미노)프로필]벤즈아미드, 2-(아다만탄-1-일)-N-(2-클로로퀴놀린-5-일)아세트아미드, 또는 2-(아다만탄-1-일)-N-(2-(4-(히드록시메틸)페닐)퀴놀린-5-일)아세트아미드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 화합물 또는 그의 염은 P2X7 수용체에 대한 길항작용을 나타내는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 암 줄기세포는 뇌암, 유방암, 자궁경부암, 폐암, 교모세포종, 구강암, 뇌하수체선종, 신경교종, 뇌종양, 상인두암, 후두암, 흉선종, 중피종, 위암, 식도암, 대장암, 직장암, 간암, 췌장암, 췌내분비종양, 담낭암, 음경암, 요관암, 신세포암, 전립선암, 방광암, 비호지킨성림프종, 골수이형성증후군, 다발성골수종, 형질세포성종양, 백혈병, 소아암, 피부암, 기관지암, 결장암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 (A)로 표시되는 화합물 또는 그의 염을 포함하는, 암 줄기세포의 침윤성 또는 전이성 억제용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, R₁은

,

, 또는

본 발명에서 제공하는 약학적 조성물은 암 세포 중에서도 특히 암 줄기세포의 크기가 성장하는 것을 억제하고 상기 암 줄기세포로부터 다른 암 줄기세포의 형성능 또한 억제하며, 암 줄기세포가 이웃하여 존재하는 부위로 침윤하는 성질을 가장 효과적으로 억제함으로써 전이암의 발생 가능성을 현저히 낮출 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 화합물인 AZD9056, LDD 2598 또는 LDD 2955의 화학식을 나타낸 도면이다.
도 2는 교모세포종 종양구 세포인 GSC11 및 TS15-88 세포와 세포주 U87에 P2X7R 저해제인 AZD9056, LDD 2598 또는 LDD 2955(50μM)를 각각 처리한 후 상기 종양구 세포의 침윤 면적 변화를 그래프로 나타낸 이미지 및 그래프이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

화학물 수득 과정

본 발명에 따른 화합물의 일반적인 합성 절차는 반응식 1에 기재되어 있다.

[반응식 1]

a) POCl₃, 1,2-DCE, 환류, 80℃, 12h; b) SnCl₂, EtOH, 아르곤가스, 80℃, 4h; c) R₂-CO-Cl, DIPEA, DCM, 15분; d) i) R₄-B(OH)₂, 2M Na₂CO₃, Pd(PPh₃)₄, 1,4-디옥산, 환류, 80℃, 3h; ii) SnCl₂, EtOH, 아르곤가스, 4h; iii) CH₃I, DMF, 1h; iv) THF 중의 1.0 M LAH, THF, 9h

문헌[S.H. Kwak, M. Kim, S.D. Lee, H. You, Y.C. Kim, H. Ko, Solid-Phase Synthesis of QuinolinoneLibrary. ACS Comb. Sci. 17 (2015) 60-69 및 R.A. Schumacher, A. Tehim, W. Xie, Preparation of pyrrolo[3,2-b]pyridine compounds as 5-HT6 receptor modulators for treatment of CNS disorders. PCT Int. Appl. 2010, WO 2010024980 A1.]에 보고된 절차에 따라 개시 물질, 5-니트로퀴놀린-2(1H)-온(9a) 및 메틸 5-니트로-2-옥소-1,2-디하이드로퀴놀린-3-카르복실레이트(9b)를 제조하였다.

반응식 1에는 퀴놀리논 구조로부터의 퀴놀린 유도체에 대한 합성을 나타내었다. 9a 및 9b의 퀴놀리논 아미드기는 POCl₃와의 반응에 의해 클로로퀴놀린 부분으로 전환하였다(14a 및 14b). 그 후, 14a 및 14b의 5-니트로기가 SnCl₂로 아민으로 환원되어 화합물 15a 또는 15b를 수득하고, 적절한 산염화물기와 아실화 반응하여 16a-e를 생성하였다. R₄ 위치에 다양한 기를 도입하기 위해, 적절한 붕소산 유도체를 Suzuki-Miyaura 교차 결합 조건 하에서 16c와 반응하여 17a-g 및 17i를 수득하였다. 화합물 17h는 SnCl₂를 사용하여 17g의 환원으로부터 얻어지고, 17i는 CH₃I를 사용한 메틸화에 의해 상응하는 에스터 유사체 17j로 추가로 전환된 후, 이어서 LAH로 환원시켜 17k를 수득하였다.

본 발명에 따른 암 줄기세포 치료용 화합물

모든 시약 및 용매는 Sigma-Aldrich 및 TCI에서 구입하여 추가 정제없이 사용하였다. ¹H NMR 스펙트럼은 400MHz에서 JEOL JNM-ECX 400P 분광기로 측정하였고, ¹³C NMR 스펙트럼은 125MHz에서 FT-NMR 분광계(한국 기초 과학 연구소, 광주)를 사용하여 기록하였다. 스펙트럼을 CDCl₃, DMSO-d₆ 또는 MeOH-d₄로 취했다. 별도로 명시되지 않는 한, 화학적 이동은 내부 테트라메틸실란으로부터 δ 단위 다운필드 또는 CDCl₃(7.26ppm), DMSO(2.50ppm), MeOH(3.31ppm)로부터 백만분율(ppm)로 기록되고, 커플링 상수(J)는 헤르츠(Hz)로 기록된다. 데이터는 화학적 이동, 다중도(s, 단일선; d, 이중선; t, 삼중선; m, 다중선), 커플링 상수 및 적분값도 기록된다. 질량 분광 분석은 전기분무로 수행하고, 고해상도 질량 스펙트럼(m/z)은 FAB 및 ESI로 기록하였다.

분석 HPLC에 의해 모든 최종 화합물의 순도를 측정하였다. 순도 측정은 선형 경사 용매계(linear gradient solvent systems)에서 Agilent ZORBAX Extend C18 분석 컬럼(250×4.6mm, 5mm, 80Å)을 사용하여 Agilent 1100 시리즈 HPLC 시스템에서 수행하였다(용매계는 10분 동안 1mL min^-1의 유속에서 H₂O:CH₃CN=80:20인 것이다). 254nm에서 피크가 검출되었다.

LDD 2598 : 2-(아다만탄-1-일)-N-(2-클로로퀴놀린-5-일)아세트아미드

반응식 1에 나타내는 바와 같이, 화합물 15a(50.0 mg, 0.28 mmol)와 1-아다만탄 아세틸클로라이드(0.06 mL, 0.33 mmol)의 아실화 반응을 진행하기 위해, 실온에서 15분 동안 DCM에서 교반하였다. 반응 혼합물을 포화된 NaHCO₃ 수용액과 에틸아세테이트 사이에 분배하였다. 유기층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 진공 하에 증발시켰다. 생성된 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 LDD 2598(16c)(37.0 mg)를 수득하였다(수득율: 37%). ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.14 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.91 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.83 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.73 (1H, t, J = 8.0 Hz), 7.43 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.28 (1H, s), 2.24 (2H, s), 2.02 (2H, s), 1.79-1.63 (13H, m). ¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃) δ 144.35, 129.42, 128.21, 126.61, 122.68, 118.47, 118.28, 117.84, 110.00, 48.48, 38.83, 32.72, 30.59, 29.48, 26.94, 25.76, 24.65. MS(ESI)m /z: 352.98 ([M-H]^-). HRMS (ESI): calcd for C₂₁H₂₃ClN₂O [M+H]⁺ 355.1572, found. 355.2721. 순도 95%

LDD 2955: 2 -( 아다만탄 -1-일)-N-(2-(4-( 히드록시메틸 )페닐)퀴놀린-5-일)아세트아미드

화합물 17j(반응식 1 참고)를 증류된 THF에 용해시키고 THF 중 1.0M LAH (1.2 당량)를 0℃에서 서서히 첨가하였다. 반응 혼합물을 9시간 동안 교반한 후에, 남아있는 LAH를 염화암모늄으로 조심스럽게 퀀칭시켰다. 반응 혼합물을 농축시킨 후, 이를 에틸아세테이트와 염화암모늄 사이에 분배하였다. 유기층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고 진공하에 증발시켰다. 얻어진 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 LDD 2955(17k)를 수득하였다(수득율: 15%). ¹H NMR (400MHz, CDCl₃) δ 8.25 (1H, d, J = 8.0 Hz), 8.18 (2H, d, J = 8.0 Hz), 8.04 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.92 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.86 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.72 (1H, t, J = 8.0 Hz), 7.53 (2H, d, J = 8.0 Hz), 7.37 (1H, s), 6.79 (1H, d, J = 8.0 Hz), 4.80 (2H, s), 2.28 (2H, s), 2.04 (2H, s), 1.80-1.65 (13H, m). MS(ESI)m /z: 427.17 ([M+H]). ¹³C NMR (125 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 145.01, 144.98, 134.54, 133.75, 132.74, 132.59, 132.04, 131.95, 129.38, 129.25, 127.50, 127.28, 125.90, 63.43, 63.11, 42.73, 36.97, 33.27, 28.63. HRMS(ESI): calcd for C₂₈H₃₀N₂O₂ [M+H]⁺ 427.2380, found. 427.2354. 순도 98%

실시예

교모세포종 환자로부터 종양구의 분리

이하의 실험은 교모세포종 종양구 세포인 TS15-88 및 GSC11 세포와 세포주 U87을 사용하여 수행하였다. 연세 의료원 세브란스 병원 임상시험심사위원회(4-2012-0212)에서 승인된 프로토콜에 따라 교모세포종 조직으로부터 유래된 환자 유래 TS15-88 종양구를 획득하였다. 교모세포종 시료로부터 종양구 분리를 위하여, 종래에 알려진 인간 뇌로부터 종양구를 분리하는 방법을 수행하였다(Sulman E, Aldape K, Colman H (2008) Brain tumorstem cells. CurrProbl Cancer 32: 124-142; Kong BH, Park NR, Shim JK, Kim BK, Shin HJ, Lee JH, HuhYM, Lee SJ, Kim SH, Kim EH, Park EK, Chang JH, Kim DS, Kim SH, Hong YK, Kang SG, Lang FF (2013) Isolation of glioma cancer stem cells in relation to histological grades in glioma specimens. Childs Nerv Syst 29: 217-229; Singh SK, Clarke ID, Terasaki M, Bonn VE, Hawkins C, Squire J, Dirks PB (2003) Identification of a cancer stem cell in human brain tumors.Cancer Res 63: 5821-5828). 헬싱키 선언(Declaration of Helsinki)에 따라 사전 동의를 받았고, 신경 병리학자는 WHO 분류에 따라 외래적 시료를 진단하였다. 기계적 해리 방법을 사용하여 종양 제거하는 2시간 안에 세포 분리 절차를 수행하였다. 구체적으로는, 외과적 시료를 분쇄한 후 둘베코 변형 이글 배지/햄 F-12 50/50 혼합 배지(DMEM/F-12; Corning Incorporated, NY, USA)에서 메스(scalpel)로 해리한 뒤 100㎛ 나일론 메쉬 세포 스트레이너(cell strainers)(BD Falcon, Franklin Lakes, NJ, USA)를 통과시켰다. 세포 부유물을 DMEM/F-12에서 2차례 세척하고 1×B27 보충제(Invitrogen, San Diego, CA, USA), 염기성 섬유 아세포 생장 인자(basic fibroblast growth factor, bFGF; Sigma, St. Louis, MO, USA) 20 ng/ml, 표피 성장 인자(epidermal growth factor, EGF; Sigma) 20 ng/ml, 및 50 U/ml 페니실린/50 mg/ml 스트렙토마이신(Gibco, Grand Island, NY, USA)을 포함하는 완전 배지(DMEM/F-12)에서 배양하였다. 환자 유래 GSC11 종양구는 랑 의사(Department of Neurosurgery, The University of Texas, MD Anderson Cancer Center, TX, USA)로부터 제공받았다.

종양구 특성(Tumorsphere characterization)

상기와 같이 얻어진 종양구를 종전에 알려진 방법에 따라 종양구 완전 배지에서 성장시킨 뒤(Singh SK, Clarke ID, Terasaki M, Bonn VE, Hawkins C, Squire J, Dirks PB (2003) Identification of a cancer stem cell in humanbrain tumors.Cancer Res 63: 5821-5828), 종양구 표면 마커 발현을 분석하였다. 구체적으로 종양구에서 CD133, 네스틴, 무사시 및 포도플라닌을 확인하기 위하여 면역 세포 화학을 사용하였다. 1% 소혈청 알부민(Amresco, Solon, OH, USA)을 사용하여 세포를 1시간 동안 블록시킨 후 1차 항체(토끼 항-CD133 1:250, ab19898, Abcam (Cambridge, UK), 토끼 항-네스틴 (1:250, ab5968, Abcam), 토끼 항-무사시 (1:250, ab52865, Abcam), 및 토끼 항-포도플라닌 (1:250,ab10274, Abcam))를 사용하여 상온에서 2시간 동안 배양시켰다. CD133 및 네스틴에 대한 1차 항체는 Cy3-컨쥬게이트된 염소 항-토끼 IgG Alexa Fluor 555 (1:2000, Invitrogen)를 사용하여 검출하고, 무사시 및 포도플라닌은 Alexa Fluor 488 (1:2000, Invitrogen)를 사용하여 검출하였다. 세포를 고정시킨 뒤 4,6-디아미디노-2-페닐인돌(4,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI; Vectashield H-1200; Vector Laboratories, Burlingame,CA, USA)을 사용하여 핵을 대비 염색시켰다. 또한, 종양구가 신경교 섬유질 산성 단백질(glial fibrillary acidic protein, GFAP), 수초 염기성 단백질(myelin basic protein, MBP), NeuN 및 β-튜블린(TUBB3)으로 분화될 수 있는지 확인하였다. 마우스 항-GFAP(1:200, Dako, Carpinteria, CA, USA), 마우스 항-MBP (1:200, Chemicon, Temecula, CA, USA), 마우스 항-NeuN (1:100, Chemicon), 및 마우스 항-Tuj1 (1:200, Chemicon)을 이용하여 종양구 세포를 상온에서 밤새 배양하였다. GFAP에 대한 1차 항체는 Cy3-컨쥬게이트된 염소 항-토끼 IgG Alexa Fluor 555 (1:200)를 사용하여 검출하였고, MBP, NeuN 및 Tuj1에 대한 1차 항체는 염소 항-마우스 Alexa Fluor 546 (1:200, Invitrogen)를 사용하여 탐지하였다. 세포를 고정시킨 뒤 DAPI를 이용하여 핵을 대비 염색시켰다. 종양구 세포를 챔버 슬라이드(Lab-Tek II; Nalge NuncInternational, Rochester, NY, USA)에 접종한 뒤 면역 세포 화학 염색을 수행하기 전 1일 동안 10% 소 태아 혈청 (Lonza, Basel, Switzerland) 및 1×B27 보충제를 포함하는 DMEM/F-12 배지에서 신경 분화시켰다.

세포 생존율 분석

MTS 생존율 어쎄이 (Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 화합물 AZD9056 (C₂₄H₃₅ClN₂O₂, N-(1-아다만틸메틸)-2-클로로-5-[3-(3-히드록시프로필아미노)프로필]벤즈아미드), LDD 2598, 및 LDD 2955가 교모세포종 종양구의 생존에 미치는 영향을 분석하였다. 96-웰 플레이트에 교모세포종 종양구 세포를 웰당 1×10⁴ 세포로 접종한 뒤 37℃에서 24시간 동안 배양하고, 화합물 AZD9056, LDD 2598 및 LDD 2955를 포함하는 조성물을 3일 동안 처리하였다. MTS 시약 (20 ㎕/well)을 첨가한 뒤 세포를 37℃에서 24시간 동안 배양하고, 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 실험은 3회 반복하여 그 결과는 대조군 대비 살아있는 세포의 퍼센티지로 표현하였다.

구 형성능 분석

1×B27 보충제(Invitrogen, San Diego, CA, USA), 염기성 섬유아세포 생장 인자(bFGF) 20 ng/ml, 표피 성장 인자(EGF) 20 ng/ml, 및 50 U/ml 페니실린/50 mg/ml 스트렙토마이신을 포함하는 DMEM/F-12 배지에서 종양구 세포를 배양하였다. 아큐타제(accutase)(Gibco)를 사용하여 상기 교모세포종(glioblastoma) GBM 종양구 세포를 해리시킨 뒤 10개의 단일 세포를 96-웰 플레이트에 접종하고 AZD9056, LDD 2598(500 nM) 또는 LDD 2955(500 nM)를 각각 처리하며 3주 동안 배양하였다. 구(sphere)가 형성된 웰의 수를 측정하고, 대조군 대비 처리 그룹에서 구가 형성된 웰의 비율을 계산하여 퍼센티지로 나타내었다. 위상차 현미경(inverted phase-contrast microscope)(Optinity KI 400; Seongnam, Korea)으로 세포 배양물을 관찰하여 GBM 종양구의 형상 및 사이즈를 결정하였다. 세포 사진은 ToupView 이미지 분석 소프트웨어 (ToupTek Photonics, Zhejiang, China)를 사용하여 디지털 카메라 (Industrial Digital Microscope Camera; Huaguang,Zhejiang, China)로 촬영하였다.

침윤성 분석

3D 침윤 분석을 사용하여 종양구 세포의 침윤성을 분석하다. 96-웰 플레이트의 각각의 웰을 마트리겔, Ⅰ형 콜라겐(Corning) 및 종양구 완전 배지로 구성된 혼합 마트리겔 매트릭스로 채웠다. 겔화 전에 상기 매트릭스에 단일 스페로이드를 접종하였다. 30분 경과 후 겔화된 매트릭스가 건조되는 것을 방지하기 위하여 종양구 완전 배지를 웰당 50 ㎕의 양으로 보충하였다. 위상차 현미경(phase-contrast microscope)을 사용하여 이미지를 촬영하였다

웨스턴 블럿 분석

10% 글라이신-SDS-PAGE를 이용하여 세포 용해물을 분리하였다. 단백질을 니트로셀룰로오스 막에 이동시킨 후 CD133, Sox2 (Merck Millipore, Billerica, MA, USA), 네스틴 (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA), PDPN, β-카테닌, 스네일 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), N-카데린, (R&D Systems), Zeb1, β-액틴 (Sigma-Aldrich), 트위스트, Oct3/4, 및 GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)에 대한 항체를 이용하여 상기 단백질을 탐지하였다. 밴드 검출을 위하여, 홀스래디쉬 페록시다제-컨쥬게이트된 염소 항-토끼 및 -마우스 IgG (Santa Cruz Biotechnology)를 2차 항체로 부착시킨 뒤 Western Lightning Plus-증강 화학발광 시약 (PerkinElmer, Waltham, MA, USA)을 사용하여 발전시켰다. ImageQuant LAS 4000 mini (GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, UK)으로 이미지를 촬영하였다.

통계적 분석

데이터는 통계±표준 편차로 나타내었고, 3D 침윤 모델 분석에서는 통계±표준 오차로 나타내었다. 각 군간에 비교를 위하여 Kruskal-Wallis 테스트 및 Mann-Whitney U 테스트를 사용하였다. 3D 침윤 분석에서 GBM 종양구의 침윤성에 있어 각 그룹 간의 차이는 선형 혼합 모델을 사용하여 분석하였다. P 값이 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의성이 있는 것으로 평가하였다. 사후 검증(post hoc tests) 시 Bonferroni 교정을 수행하였다. 모든 통계적 분석 및 그래프는 SPSS 버젼 18.0KO 소프트웨어 (SPSS Korea, Seoul, Korea)를 사용하여 수행하였다.

AZD9056 , LDD 2598 또는 LDD 2955 투여 시 세포 생존율 억제 효과

교모세포종 종양구 세포인 GSC11 및 TS15-88 세포, 세포주 U87 및 세포주 U251 각각에 500 nM의 화합물 AZD9056, LDD 2598, 또는 LDD 2955를 개별적으로 3일 동안 처리한 뒤 MTT 어쎄이에 의하여 각각 교모세포종 종양구 세포인 GSC11 및 TS15-88 세포, 세포주 U87 및 세포주 U251의 생존율의 변화를 분석하였다. 아무 처리를 하지 않은 대조군(Control)에 비하여 상기 세포주 U87에 AZD9056, LDD 2598 또는 LDD 2955를 단독으로 처리한 경우 세포 생존율이 감소한 것을 확인할 수 있었다.

AZD9056 , LDD 2598 또는 LDD 2955 투여 시 GBM 종양구의 줄기세포능 (stemness) 억제 효과

본 발명에서, 암 줄기세포로서 교모세포종 종양구 세포인 GSC11 및 TS15-88 세포를 사용하고, 비교 대상으로서 암세포의 세포주 U87을 사용하였다. 교모세포종 종양구 세포인 GSC11 및 TS15-88 세포와 세포주 U87에 50μM의 화합물 AZD9056, LDD 2598 또는 LDD 2955를 처리한 후 종양구 세포로부터의 종양구 형성능을 분석하였다. 100% 종양구 형성능 저해되었음을 확인할 수 있었다.

AZD9056 , LDD 2598 또는 LDD 2955 투여 시 GBM 종양구의 침윤성(invasiveness) 억제 효과

3D 침윤 어쎄이를 통하여, Ⅰ형 콜라겐 매트릭스에 GFP-GBM 종양구를 이식한 뒤 50μM의 화합물 AZD9056, LDD 2598 또는 LDD 2955를 처리한 후 72시간 경과 시점에서 종양구 세포의 형상을 위상차 현미경으로 촬영해 그 결과를 도 2의 a에 나타내었다. 또한, 교모세포종 종양구 세포인 GSC11 및 TS15-88 세포와 세포주 U87에서의 침윤 면적을 측정하여 그 결과를 도 2의 b에 그래프로 나타내었다.

도 2 및 하기 표 1에 나타나는 바와 같이, 환자유래 교모세포종 종양구인 GSC11 및 TS15-88이 일반 세포주인 U87구에 비해 상대적으로 침윤 저해의 효과가 높았음을 확인할 수 있었다. 종양구 세포인 GSC11에 본 발명의 화합물 LDD 2598을 처리한 경우에 9.98%로 감소한 것으로 보아, 가장 침윤 저해 효과가 높았음을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명에 따른 P2X7R 길항 화합물인 AZD9056, LDD 2598 및 LDD 2955를 각각 처리한 경우 특이적으로 암 줄기세포의 침윤성이 현저하게 감소한 것을 볼 수 있다.

표 1의 침윤값(invasiveness(%))은 식 1에 의해 결정하였다.

[식 1]

침윤 면적 평균값	대조군	LDD 2598	LDD 2955
GSC11(상기 식 1에 의한 비율)	654.6	65.3	334.9
GSC11의 대조군 기준 백분율 환산값	100	9.98	51.15
TS15-88(상기 식 1에 의한 비율)	454.1	68.8	174.8
TS15-88의 대조군 기준 백분율 환산값	100	15.14	38.50
U87(상기 식 1에 의한 비율)	4000.3	4226.831	3523.40
U87의 대조군 기준 백분율 환산값	100	105.67	88.08

본 발명에 따른 화합물 AZD9056, LDD 2598 및 LDD 2955를 처리한 경우, 일반 암세포주 U87 및 U251에서는 세포 생존율을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 한편, 본 발명에 따른 화합물 AZD9056, LDD 2598 및 LDD 2955는 일반 암세포에 비해 암 줄기세포에서 현저한 침윤성 또는 전이성 억제 효과를 확인할 수 있었다(도 2 참고).

P2X7R에 길항 작용을 하고 암 줄기세포의 치료에 탁월한 효과를 나타내는 물질인 AZD9056, LDD 2598 및 LDD 2955를 발견하였다. 본 발명에 따르면, 화합물 AZD9056, LDD 2598 및 화합물 LDD 2955는 암 줄기세포의 침윤성 및 전이성을 억제하여 암 줄기세포를 치료할 수 있는 결과적으로 최적화된 화합물임을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

N-(1-아다만틸메틸)-2-클로로-5-[3-(3-히드록시프로필아미노)프로필]벤즈아미드, 2-(아다만탄-1-일)-N-(2-클로로퀴놀린-5-일)아세트아미드, 및 2-(아다만탄-1-일)-N-(2-(4-(히드록시메틸)페닐)퀴놀린-5-일)아세트아미드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물 또는 그의 염을 포함하는, 암 성장 억제용 약학 조성물.
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 N-(1-아다만틸메틸)-2-클로로-5-[3-(3-히드록시프로필아미노)프로필]벤즈아미드, 2-(아다만탄-1-일)-N-(2-클로로퀴놀린-5-일)아세트아미드, 및 2-(아다만탄-1-일)-N-(2-(4-(히드록시메틸)페닐)퀴놀린-5-일)아세트아미드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물 또는 그의 염은 P2X7 수용체에 대한 길항작용을 나타내는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물..
제1항에 있어서,
상기 암은 뇌암, 유방암, 자궁경부암, 폐암, 교모세포종, 구강암, 뇌하수체선종, 신경교종, 뇌종양, 상인두암, 후두암, 흉선종, 중피종, 위암, 식도암, 대장암, 직장암, 간암, 췌장암, 췌내분비종양, 담낭암, 음경암, 요관암, 신세포암, 전립선암, 방광암, 비호지킨성림프종, 골수이형성증후군, 다발성골수종, 형질세포성종양, 백혈병, 소아암, 피부암, 기관지암, 결장암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
N-(1-아다만틸메틸)-2-클로로-5-[3-(3-히드록시프로필아미노)프로필]벤즈아미드, 2-(아다만탄-1-일)-N-(2-클로로퀴놀린-5-일)아세트아미드, 및 2-(아다만탄-1-일)-N-(2-(4-(히드록시메틸)페닐)퀴놀린-5-일)아세트아미드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물 또는 그의 염을 포함하는, 암 전이성 억제용 약학 조성물.
삭제
삭제
제6항에 있어서,
상기 N-(1-아다만틸메틸)-2-클로로-5-[3-(3-히드록시프로필아미노)프로필]벤즈아미드, 2-(아다만탄-1-일)-N-(2-클로로퀴놀린-5-일)아세트아미드, 및 2-(아다만탄-1-일)-N-(2-(4-(히드록시메틸)페닐)퀴놀린-5-일)아세트아미드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물 또는 그의 염은 P2X7 수용체에 대한 길항작용을 나타내는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
제6항에 있어서,
상기 암은 뇌암, 유방암, 자궁경부암, 폐암, 교모세포종, 구강암, 뇌하수체선종, 신경교종, 뇌종양, 상인두암, 후두암, 흉선종, 중피종, 위암, 식도암, 대장암, 직장암, 간암, 췌장암, 췌내분비종양, 담낭암, 음경암, 요관암, 신세포암, 전립선암, 방광암, 비호지킨성림프종, 골수이형성증후군, 다발성골수종, 형질세포성종양, 백혈병, 소아암, 피부암, 기관지암, 결장암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.