KR102026235B1

KR102026235B1 - 미세조류로부터 클로로필 a를 분리 및 정제하는 방법

Info

Publication number: KR102026235B1
Application number: KR1020180038511A
Authority: KR
Inventors: 최태오; 최진영
Original assignee: 주식회사 클로랜드
Priority date: 2018-04-03
Filing date: 2018-04-03
Publication date: 2019-09-27

Abstract

본 발명은 미세조류로부터 고순도 클로로필 a를 분리 및 정제하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 에탄올 및 헥산을 이용하여 미세조류로부터 클로로필 a를 추출한 후, 세파덱스 레진이 충진된 컬럼을 이용하여 1차 정제하고, 순차적으로 C18 레진이 충진된 컬럼을 이용하여 2차 정제하는 방법을 통하여 단시간 내에 순도 90% 이상의 클로로필 a를 정제할 수 있는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 분리 및 정제방법으로 정제된 클로로필 a는 항산화용 화장품 또는 항산화용 건강기능식품의 소재로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

미세조류로부터 클로로필 a를 분리 및 정제하는 방법{Method for isolating and purifying chlorophyll a from microalgae}

본 발명은 미세조류로부터 클로로필 a를 분리 및 정제하는 방법에 관한 것이다.

미세조류는 당질, 지질, 단백질, 색소, 비타민, 스테로이드 및 기타 의약성분 등의 유용성분과 수소, 탄화수소, 생화학 연료 등의 다양한 물질들을 생산한다. 또한, 광합성 효율이 높고 성장속도가 빠르며 지질 생산성이 높다. 미세조류는 광합성을 통해 생태계의 1차 생산자 역할을 함으로써, 해양 생물 양식에서 잠재적인 식품 소재로 이용될 수 있다. 또한, 대체에너지원, 식품, 건강보조식품, 수산 양식용 사료, 의약 원료물질, 생화학 물질 등 미세조류의 응용분야가 넓어지고 있다. 따라서, 미세조류의 분리 및 물질 탐색, 대량 생산 기술 등이 지속적으로 개발된다면 생리활성물질의 산업적 생산도 이루어질 수 있을 것이다.

해양 단세포 미세조류인 난노클로롭시스는 진안점조강(Eustigmatophyceae)의 일종으로 직경이 2-4㎛ 정도인 식물 플랑크톤이다. 난노클로롭시스 속 미세조류는 단세포 녹조류로 양식용 사료로 이용되며, 최적영양조건이 충족될 경우, 지질함량이 다른 미세조류에 비해 매우 높은 특성이 있다. 또한, 광합성 미세조류로서 배양이 용이하고 스테롤(sterol) 또는 EPA(eicosapentaenoic acid)의 지질 함량이 높아 고부가가치 기능성 식품으로서 이용가치가 높다.

난노클로롭시스 속 미세조류 중 하나인 난노클로롭시스 오세아니카(Nannochloropsis oceanica)는 직경이 1-3 ㎛인 원형의 단세포 해양 미세 녹조류로서 클로렐라(chlorella)와 유사하지만, 클로로필의 조성에 차이가 있으며, 클로로필 a가 다량 함유되어 있다. 클로로필 a는 세포재생, 항암, 미백, 주름개선 등에 효과가 있는 것으로 알려졌으나, 고순도로 분리 및 정제하는데 어려움이 있어 클로로필 a의 활용에 제약을 받고 있다.

현재까지 난노클로롭시스 속 미세조류에 대한 연구는 산업적 생산을 위한 대량 배양에 초점이 맞춰져 있었으며, 난노클로롭시스로부터 생리 활성 물질을 효과적으로 생산하는 가공 기술에 대한 연구는 미흡한 실정이다. 따라서 난노클로롭시스로부터 새로운 생리 활성 물질을 추출하여 제품의 부가가치를 높일 수 있는 기술의 개발이 더욱 필요하다고 할 수 있다.

한편, 크로마토그래피는 크기, 전하, 흡착성 또는 생물학적 친화성(affinity)의 차이에 근거를 두고 미세한 입자를 충진시킨 컬럼을 통하여 유체를 균일하게 침투 통과시키는 과정에서 유체내 어떤 성분이 선택적으로 지연되어 결과적으로 물질이 분리되는 것을 말한다. 생물공정에서 많이 사용되는 것으로 크기의 차이에 근거를 두고 분리하는 겔(gel) 크로마토그래피, 이온교환수지의 흡착성을 기준으로 하는 이온교환(ion exchange) 크로마토그래피, 분자 사이의 친화성에 근거를 둔 친화성 크로마토그래피가 있다. 이외에도 용질분자와 지지체(matrix) 위의 작용기 사이의 소수성 상호작용에 기초한 소수성 상호반응(hydrophobic interaction) 크로마토그래피, 그리고 크로마토그래피의 일반 원리에 기초한 종이 크로마토그래피, 얇은 막 크로마토그래피, 기체 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피 등 여러 가지가 있다.

본 발명과 관련된 선행기술로 한국등록특허 제1233115호에 콩으로부터 클로로필을 다량 수득하는 방법이 개시되어 있지만, 본 발명의 미세조류로부터 클로로필 a를 분리 및 정제하는 방법에 대해서는 개시된 바 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로, 본 발명은 에탄올 및 헥산을 이용하여 미세조류로부터 클로로필 a가 포함된 추출물을 획득하고, 세파덱스(sephadex) 레진이 충진된 컬럼 및 C18 레진이 충진된 컬럼을 이용하여 상기 추출물로부터 클로로필 a를 분리 및 정제하는 방법을 제공하고, 상기 방법으로 분리 및 정제된 클로로필 a의 순도가 90% 이상인 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은

1) 수분이 제거된 미세조류 고형분에 에탄올을 혼합한 후 8~16시간 동안 반응시키는 단계;

2) 상기 단계 1)의 반응물을 원심분리하여 상층액을 회수하는 단계;

3) 상기 단계 2)의 상층액에 헥산 및 물을 혼합한 후 액체-액체 추출(liquid-liquid extraction)하여 헥산층을 회수하고 농축하는 단계;

4) 상기 단계 3)의 농축물을 세파덱스(sephadex) 레진(resin)이 충진된 컬럼으로 1차 정제 후, 농축하는 단계; 및

5) 상기 단계 4)의 농축된 1차 정제물을 C18 레진이 충진된 컬럼으로 2차 정제 후, 감압 농축하는 단계;를 포함하는 클로로필 a의 분리 및 정제 방법을 제공한다.

본 발명은 미세조류로부터 클로로필 a를 분리 및 정제하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 제조방법으로 제조된 클로로필 a는 90% 이상의 순도로 분리 및 정제되는 효과가 있다.

도 1은 에탄올 또는 에탄올 및 헥산을 이용하여 추출한 클로로필 a의 HPLC 결과를 확인한 것이다.
도 2는 레진에 따른 클로로필 a의 정제 후 변화를 HPLC를 통해 확인한 것이다.
도 3은 세파덱스가 충진된 컬럼을 이용한 클로로필 a 정제시 머무름 부피에 따른 클로로필 a의 함량을 확인한 것이다.
도 4는 클로로필 a의 로딩 양에 따른 정제 결과를 HPLC를 이용하여 확인한 것이다.
도 5는 세파덱스가 충진된 컬럼 정제시 이동상에 따른 클로로필 a의 정제 결과를 HPLC를 이용하여 확인한 것이다.
도 6은 컬럼 정제 순서에 따른 클로로필 a의 정제 후 순도를 HPLC를 이용하여 확인한 것이다.

본 발명은

3) 상기 단계 2)의 상층액에 헥산(hexane) 및 물을 혼합한 후 액체-액체 추출(liquid-liquid extraction)하여 헥산층을 회수하고 농축하는 단계;

5) 상기 단계 4)의 농축된 1차 정제물을 C18 레진이 충진된 컬럼으로 2차 정제 후, 감압 농축하는 단계;를 포함하는 클로로필 a의 분리 및 정제 방법에 관한 것이다.

본 발명의 세파덱스는 3차원 망목구조를 지닌 겔 여과를 위한 충전용 덱스트란의 상품명(Pharmacia Fine Chemical 사)이다. 세파덱스에 따로 LH 타입의 것이 있는데, 덱스트란이 알킬화된 유도체로서 친유성인 특성과 친수적인 성질을 아울러 지니고 있다. 따라서 세파덱스 LH는 여러 가지 유기용매, 물 및 그들의 혼합물 등 많은 용매계로 팽윤시켜 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에서, 상기 미세조류는 클로로필 a를 함유하고 있는 것이면 어느 것이든 사용 가능하고, 바람직하게는 난노클로롭시스 가디타나(N. gaditana), 난노클로롭시스 그라뉼라타(N. granulata), 난노클로롭시스 림네티카(N. limnetica), 난노클로롭시스 오세아니카(N. oceanica), 난노클로롭시스 오큘라타(N. oculata) 또는 난노클로롭시스 살리나(N. salina)로 구성된 난노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) 미세조류를 사용하는 것이며, 더욱 바람직하게는 난노클로롭시스 오세아니카(N. oceanica)를 사용하여 클로로필 a를 추출하는 것이지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 단계 1)의 미세조류 고형분과 에탄올의 혼합은 미세조류 고형분 1 중량부 당 3~7 중량부의 에탄올을 혼합하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 미세조류 고형분 1 중량부 당 5 중량부의 에탄올을 혼합하는 것이지만, 이에 제한되지 않는다.

상기 단계 3)의 상층액, 헥산 및 물 혼합은 상층액 1 부피부 당 0.5~2 부피부의 헥산 및 0.5~2 부피부의 물을 혼합하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 상층액 1 부피부 당 1 부피부의 헥산 및 1 부피부의 물을 혼합하는 것이지만, 이에 한정하지 않는다.

상기 단계 4)의 세파덱스 레진이 충진된 컬럼을 이용한 1차 정제에서, 이동상은 아세톤이고, 상기 단계 5)의 C18 레진이 충진된 컬럼을 이용한 2차 정제에서, 이동상은 메탄올이어야 클로로필 a의 파괴없이 클로로필 a를 분리 및 정제할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 구현 예에서, 클로로필 a의 분리 및 정제방법은

1) 수분이 제거된 난노클로롭시스 고형분 1 중량부에 대하여 3~7 중량부의 에탄올을 혼합한 후 8~16시간 동안 반응시키는 단계;

2) 상기 단계 1)의 반응물을 3200~4000rpm으로 5~15분 동안 원심분리하여 상층액을 회수하는 단계;

3) 상기 단계 2)의 상층액에 헥산 및 물을 1:0.5~2:0.5~2의 부피비로 혼합한 후 액체-액체 추출(liquid-liquid extraction)하여 헥산층을 회수하고 농축하는 단계;

4) 상기 단계 3)의 농축물을 세파덱스(sephadex) LH 레진(resin)이 충진된 컬럼에, 이동상으로 아세톤을 이용하여 1차 정제 후, 농축하는 단계; 및

5) 상기 단계 4)의 농축된 1차 정제물을 C18 레진이 충진된 컬럼에, 이동상으로 메탄올을 이용하여 2차 정제 후, 감압 농축하는 단계;를 포함할 수 있으며,

보다 바람직하게는

1) 수분이 제거된 난노클로롭시스 고형분 1 중량부에 대하여 5 중량부의 에탄올을 혼합한 후 12시간 동안 반응시키는 단계;

2) 상기 단계 1)의 반응물을 3700rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상층액을 회수하는 단계;

3) 상기 단계 2)의 상층액에 헥산 및 물을 1:1:1의 부피비로 혼합한 후 액체-액체 추출(liquid-liquid extraction)하여 헥산층을 회수하고 농축하는 단계;

4) 상기 단계 3)의 농축물을 세파덱스(sephadex) LH-20 레진(resin)이 충진된 컬럼에, 이동상으로 아세톤을 이용하여 1차 정제 후, 농축하는 단계; 및

5) 상기 단계 4)의 농축된 1차 정제물을 C18 레진이 충진된 컬럼에, 이동상으로 메탄올을 이용하여 2차 정제 후, 감압 농축하는 단계;를 포함하여 클로로필 a를 분리 및 정제할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현 예에서, 본 발명의 분리 및 정제방법을 통해 90% 이상의 순도를 갖는 클로로필 a를 분리 및 정제할 수 있으며, 더 바람직하게는 92% 이상의 순도를 갖는 클로로필 a를 분리 및 정제할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 분리 및 정제방법으로 분리 및 정제된 클로로필 a를 유효성분으로 함유하는 항산화용 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 일 구현에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 항산화용 화장료 조성물은 피부외용 연고, 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 젤, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드 크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저로 이루어지는 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이들 각 제형으로 이루어진 화장료 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판-부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형은 형광물질, 살진균제, 굴수성 유발물질, 보습체, 방향제, 방향제 담체, 단백질, 용해화제, 당 유도체, 일광차단제, 비타민, 식물 추출물 등을 포함하는 부형제를 추가로 함유할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 분리 및 정제방법으로 분리 및 정제된 클로로필 a를 유효성분으로 함유하는 항산화용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 건강기능식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 양은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 건강기능식품 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강을 목적으로 하는 장기간의 섭취인 경우, 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있다.

상기 건강기능식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다.

상기 건강기능식품 조성물 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다. 이러한 상기 첨가되는 성분의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강기능식품 조성물 100 중량부에 대하여, 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.

실시예 1. 미세조류로부터 클로로필 a의 추출

에탄올 및 헥산을 이용하여 미세조류인 난노클로롭시스 오세아니카로부터 클로로필 a를 추출하였다. 보다 상세하게는, 난노클로롭시스 오세아니카(N. oceanica)를 대량으로 배양하여 농축한 후, 연속식 원심분리기를 이용하여 수분을 완전히 제거한 후 고형분을 회수하였다. 회수된 고형분 1 중량부 당 5 중량부의 95%(v/v) 에탄올을 첨가한 후 12시간 동안 반응시켰으며, 12시간 후 3700rpm으로 10분 동안 원심분리하여 클로로필 a가 포함되어 있는 상등액을 회수하고, 회수된 상등액에 헥산 및 물을 1:1:1 부피비로 혼합하여 액체-액체 추출하였다. 클로로필 a는 헥산에 용해되어 있으므로, 액체-액체 추출물의 헥산층을 회수한 후 농축하여 시료로 이용하였다.

상기 에탄올을 이용한 클로로필 a 추출물, 에탄올 및 헥산을 이용한 클로로필 a 추출물을 하기 조건(표 1)의 HPLC를 이용하여 분석한 결과, 에탄올 및 헥산을 이용하여 클로로필 a를 추출한 경우, 에탄올만 이용하여 클로로필 a를 추출한 경우에 비해 클로로필 a(머무름 시간: 약 17.88분) 이전에 존재하는 다량의 불순물들이 일부 제거되는 것을 확인하였다(도 1).

시료 주입량	10㎕
컬럼	C18, 4.6×250mm, 5㎛
이동상	메탄올
오븐 온도	40℃
유속	1ml/분
검출파장	210&436nm

이하, 본 발명의 HPLC는 표 1의 조건으로 수행하였다.

실시예 2. 클로로필 a 분리 및 정제조건 비교

상기 실시예 1에서 에탄올 및 헥산을 이용하여 추출한 클로로필 a의 분리 및 정제를 위해, 본 발명은 각 단계별 정제조건을 레진, 로딩 양, 이동상, 정제 순서별로 비교하였으며, 최종적으로 에탄올 및 헥산을 이용하여 추출된 클로로필 a를 세파덱스 LH-20 컬럼을 이용하여 1차 정제한 후, C18 컬럼을 이용하여 2차 정제하였다.

1) 레진에 따른 클로로필 a의 정제

클로로필 a를 정제할 수 있는 최적의 레진을 선택하기 위해 실시예 1의 클로로필 a 농축액을 다양한 레진을 이용하여 컬럼 정제한 후 메탄올에 용해한 표준품(Wako Pure Co. Ltd., LOT no. DSE4908, Japan) 클로로필 a와 비교하였다.

각각의 레진 100ml에 실시예 1의 시료 100mg을 로딩하였다. 레진의 이동상은 레진의 특성에 맞춰 선정하였다. 실리카겔 및 알루미나 레진은 실시예 1의 시료를 헥산에 용해하여 로딩하였고, 띠퍼짐 현상을 방지하기 위해 이동상으로 헥산과 아세트산에틸(ethyl acetate, EA)의 비율을 2:8 부피비에서 4:6 부피비까지 이동상의 구배(gradient)를 가하여 컬럼 정제를 진행한 후 표 1의 조건과 동일한 HPLC를 통하여 정제결과를 확인하였다. HP와 C18 레진은 이동상으로 메탄올을 이용하였으며, 초기 100ml의 90%(v/v) 메탄올을 흘려준 뒤 100% 메탄올로 이동상을 변경하여 클로로필 a를 정제한 후, 표 1의 조건과 동일한 HPLC를 통하여 정제결과를 확인하였다. 세파덱스 LH-20은 이동상으로 아세톤을 사용하여 정제한 후 표 1의 조건과 동일한 HPLC를 통하여 정제결과를 확인하였다.

그 결과, 세파덱스 LH-20 레진을 이용하였을 경우 5~15분 사이에 존재하는 대부분의 불순물이 제거되는 것을 확인하였고, C18 레진의 경우 세파덱스 LH-20에 비해 불순물 제거효과는 감소하였지만, 클로로필 a의 파괴율은 낮은 것을 확인하였다(도 2a). HP 또는 알루미나(Al₂O₃)를 사용하였을 경우 클로로필 a가 대부분 파괴되었고, 실리카겔(silica gel)을 이용하였을 경우 전혀 다른 새로운 물질로 변환되었다(도 2b). 따라서 본 발명에서는 클로로필 a의 변화나 파괴율이 낮은 세파덱스 LH-20 컬럼 및 C18 컬럼을 사용하여 정제하였다.

세파덱스 LH-20 컬럼 이용시 머무름 부피에 따른 클로로필 a 함량을 확인한 결과 초기에는 분자량이 큰 고형분이 먼저 흘러나오고, 클로로필 a는 후반부에 흘러나오는 것을 확인할 수 있었다(도 3). 따라서 상기 실시예 1에서 추출한 클로로필 a 농축물을 컬럼에 로딩한 후 녹색액이 나오기 시작하면, 초기 80ml은 버리고 이후 40ml만 분취하여 농축하였다.

2) 로딩 양에 따른 클로로필 a의 정제

실시예 1에서 추출한 클로로필 a 농축액의 로딩 양을 결정하기 위해 다양한 양의 클로로필 a를 120ml의 세파덱스 LH-20이 충진된 컬럼에 로딩해본 결과(이동상: 아세톤), 0.3g 이하의 양으로 로딩하였을 경우 클로로필 a의 순도는 약 70%였고, 6g을 로딩하였을 경우 약 40%의 순도를 나타내는 것을 확인하였다(도 4). 따라서 이후 실험에서는 0.3g의 클로로필 a 농축액을 세파덱스 LH-20 컬럼에 로딩하였다.

3) 이동상에 따른 클로로필 a의 정제

세파덱스 LH-20 컬럼 정제시 이동상에 따른 클로로필 a의 순도를 비교해 본 결과, 아세톤을 이동상으로 사용하였을 경우 클로로필 a의 파괴없이 클로로필 a(머무름 시간: 약 17.88분) 앞쪽에 존재하는 불순물들이 대부분 제거되었고, 클로로필 a 뒤쪽에 존재하는 몇몇 불순물들이 관찰되었다. 하지만, 아세토니트릴(acetonitrile), 아세트산에틸(ethyl acetate), 에탄올(ethyl alcohol) 또는 디클로로메탄(dichloromethane)을 이동상으로 이용하여 정제하였을 경우 불순물 제거 효과가 아세톤을 이용하였을 경우에 비해 감소하는 것을 확인하였다(도 5).

4) 정제 순서에 따른 클로로필 a의 정제

정제 순서 외의 모든 조건이 동일한 상태에서, 세파덱스 LH-20 컬럼 정제 후 C18 컬럼 정제를 진행하는 조건과 C18 컬럼 정제한 후 세파덱스 LH-20 컬럼 정제하는 조건을 비교하였다. 그 결과, 세파덱스 LH-20 컬럼 정제 후 C18 컬럼 정제를 진행하였을 경우(도 6), 세파덱스 LH-20 컬럼 정제 후에도 클로로필 a 이후에 존재하던 물질이 제거되었으며, 순도는 90~95%로 나타났다. C18 컬럼 정제한 후 세파덱스 LH-20 컬럼을 이용하여 정제하는 경우, 클로로필 a(머무름 시간: 약 17.88분) 전·후로 불순물 피크가 형성되는 것을 확인하였으며, 순도는 80~85%로 나타났다.

세파덱스 LH-20 컬럼 정제 후 C18 컬럼 정제시 3분대에 나타나는 피크는 용매 피크로 감압농축시 용매가 제거되는 것을 확인하였다. 따라서 세파덱스 컬럼 정제 후 C18 컬럼 정제를 진행하면, 클로로필 a의 고순도 정제가 가능하다는 것을 알 수 있었다.

실시예 3. 고순도 클로로필 a의 분리 및 정제

상기 실시예 2의 결과를 토대로 본 발명의 고순도 클로로필 a의 분리 및 정제방법을 확립하였다.

정제용 유리관 컬럼에 120ml의 세파덱스 LH-20을 충진하고, 아세톤을 충분히 흘려주어 이물 또는 버블을 제거하였다. 이후 상기 실시예 1에서 에탄올 및 헥산을 이용하여 추출한 후 농축한 클로로필 a 농축액 0.3g을 상기 세파덱스 LH-20 컬럼에 로딩한 후 녹색액이 나오기 시작하면 초기 80ml은 버리고 이후 40ml만 분취하여 농축하였다. 총 컬럼정제에 소요된 시간은 약 30분이었다.

그 후 정제용 유리관 컬럼에 50g의 C18을 충진하고, 메탄올을 흘려 활성화 시켰다. 활성화 후 상기 세파덱스 LH-20 컬럼 정제 농축물을 로딩하고, 이동상으로 메탄올을 흘려주어 정제하였다. 상기 세파덱스 LH-20컬럼 정제 농축물에 클로로필 a 외의 불순물이 많이 존재할 경우 이동상으로 95%(v/v) 메탄올을 이용하여 컬럼 부피의 1배를 흘려준 후 100% 메탄올을 흘려주었다. 세파덱스 LH-20 컬럼 정제가 잘 된 경우는 이동상으로 100% 메탄올을 흘려준 뒤 정제물을 받아서 감압 농축하여 유기용매를 제거한 후 동결건조하여 순도 높은 클로로필 a를 획득하였다. C18 컬럼 정제에 소요된 시간은 약 15분이었다.

클로로필 a는 불안정한 물질이므로, 본 발명의 모든 공정은 차광이 이루어진 약 20℃의 서늘한 장소에서, 농축시간을 포함하여 1시간 30분 이내에 진행하여 클로로필 a의 파괴를 최소화하였다.

Claims

1) 수분이 제거된 난노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) 미세조류 고형분에 에탄올을 혼합한 후 8~16시간 동안 반응시키는 단계;
2) 상기 단계 1)의 반응물을 원심분리하여 상층액을 회수하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 상층액 1 부피부 당 0.5~2 부피부의 헥산 및 0.5~2 부피부의 물을 혼합한 후 액체-액체 추출(liquid-liquid extraction)하여 헥산층을 회수하고 농축하는 단계;
4) 상기 단계 3)의 농축물을 세파덱스(sephadex) 레진(resin)이 충진된 컬럼으로 1차 정제 후, 농축하는 단계; 및
5) 상기 단계 4)의 농축된 1차 정제물을 C18 레진이 충진된 컬럼으로 2차 정제 후, 감압 농축하는 단계;를 포함하는 순도 90% 이상의 클로로필 a의 분리 및 정제 방법.

삭제

제1항에 있어서, 상기 난노클로롭시스 속 미세조류는 난노클로롭시스 오세아니카(N. oceanica)인 것을 특징으로 하는 순도 90% 이상의 클로로필 a의 분리 및 정제 방법.

제1항에 있어서, 상기 단계 1)의 미세조류 고형분과 에탄올의 혼합은 미세조류 고형분 1 중량부 당 3~7 중량부의 에탄올을 혼합하는 것을 특징으로 하는 순도 90% 이상의 클로로필 a의 분리 및 정제 방법.

삭제

제1항에 있어서, 상기 단계 4)의 세파덱스 레진이 충진된 컬럼을 이용한 1차 정제에서, 이동상은 아세톤이고, 상기 단계 5)의 C18 레진이 충진된 컬럼을 이용한 2차 정제에서, 이동상은 메탄올인 것을 특징으로 하는 순도 90% 이상의 클로로필 a의 분리 및 정제 방법.

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