KR102023827B1

KR102023827B1 - 안구 건조증 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 짧은 합성 펩티드의 용도

Info

Publication number: KR102023827B1
Application number: KR1020177026074A
Authority: KR
Inventors: 청 추안 호; 요우 핑 차오
Original assignee: 맥케이 메모리얼 호스피탈
Priority date: 2015-02-25
Filing date: 2015-02-25
Publication date: 2019-09-23
Also published as: JP6503085B2; AU2015384099B2; NZ734845A; KR20170126468A; JP2018508514A; US20180339010A1; EP3262060A1; AU2015384099A1; US10307456B2; EP3262060B1; CA2977562A1; CN107428805A; EP3262060A4; CA2977562C; ES2772772T3; CN107428805B; SG11201706819RA; WO2016134498A1

Abstract

본 발명은 안구 질환, 특히 안구 건조증의 치료 및/또는 예방을 위한 합성 펩티드 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 합성 펩티드를 함유하는 조성물을 그러한 치료가 필요한 대상에게 투여함으로써 안 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법을 개시한다.

Description

안구 건조증 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 짧은 합성 펩티드의 용도{USE OF SHORT SYNTHETIC PEPTIDE FOR THE TREATMENT AND/OR PROPHYLAXIS OF DRY EYE DISEASE}

본 발명은 짧은 합성 펩티드의 발견 및 안질환의 치료 및/또는 예방을 위한 그의 용도에 관한 것이다.

안구 건조증 (DED)은 각막 표면 손상으로 인한 눈물 막(tear film)의 이상을 특징으로 하는 다양한 상태의 일반적인 용어이다. 안구 건조증은 눈에 모래가 낀 듯한 느낌, 타는 듯함, 염증(irritation) 또는 낮 동안 악화되는 이물감과 같은 증상이 특징이다. DED로 고통받는 환자는 경미한 것에서부터 심각한 증상을 호소하고, 심각한 증상을 가진 자들은 보이는 환자는 지속적이고 불쾌한 눈의 염증을 경험할 수 있고, 안구 표면 상피 질환 및 시력을 위협하는 무균 또는 미생물 각막 궤양을 일으킬 수 있다. 현재 DED 치료를 위한 유일한 FDA 승인 처방약은 코르티코스테로이드(corticosteroids)와 레스타시스(Restasis)(0.05 % 시클로스포린)이다. 그러나 어느 약물도 손상된 각막 조직을 치료할 수 없다; 또한 두 약물 모두 DED 증상이나 손상된 각막 조직의 치유에 상당한 개선을 가져 오는 데 약 4-6 개월이 걸린다.

따라서, DED를 치료 및/또는 예방하는 개선된 약물 및/또는 방법의 관련 분야에 대한 필요성이 존재한다.

일반적으로, 본 발명은 안질환, 특히 안구 건조증(DED)을 치료하기 위한 신규한 화합물 및/또는 방법의 개발에 관해 개시한다.

따라서, 본 개시의 제 1 양태는 DED를 치료할 수 있는 짧은 합성 펩티드를 제공하는 것을 목적으로 한다. 7 개의 연속적인 아미노산 잔기로 구성된 상기 짧은 합성 펩티드는 DLYRX₁X₂S (서열 번호 1)로 제시되고, 여기서, X₁ 및 X₂는 독립적으로 임의의 아미노산 잔기이다.

다른 구현예에 따르면, X₁ 및 X₂는 각각 발린 및 아르기닌이고, 합성 펩티드는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는다.

일부 구현예에 따르면, X₁ 및 X₂는 각각 류신 및 아르기닌이고, 합성 펩티드는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는다.

다른 구현예에 따르면, X₁ 및 X₂는 각각 글루타민 및 아르기닌이고, 합성 펩티드는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는다.

또 다른 구현예에 따르면, X₁ 및 X₂는 각각 글루타민 및 라이신이고, 합성 펩티드는 서열 번호 5의 아미노산 서열을 갖는다.

또 다른 구현예에 따르면, 서열번호 1의 합성 펩티드는 적어도 하나의 D-형태 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 예에서, 서열번호 1의 합성 펩티드는 2 개의 D-형태 아미노산 잔기를 갖는다.

본 개시의 제 2 양태는 안구 건조증 (DED)을 앓고 있는 대상을 치료하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 상기 방법은 DED와 관련된 증상을 개선시키기 위한 유효량의 합성 펩티드를 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 7 개의 연속적인 아미노산 잔기로 구성된 상기 합성 펩티드는 DLYRX₁X₂S (서열 번호 1)로 제시되고, 여기서, X₁ 및 X₂는 독립적으로 임의의 아미노산 잔기이다.

선택적 구현예에 따르면, 상기 방법은 DED 치료를 위한 항염증제(anti-inflammatory agent), 칼시 뉴린 억제제(calcineurin inhibitor), 항생제(antibiotic), 니코틴성 아세틸 콜린 수용체 작용제(nicotinic acetylcholine receptor agonist) 및 항-림프관 형성 제제(anti-lymphangiogenic agent)로 구성된 군에서 선택된 약제의 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

일부 예에서, 항염증제는 사이클로스포린(cyclosporine)일 수 있다. 칼시 뉴린 억제제는 보클로스포린(voclosporin) 일 수 있다. 항생제는 아미카신(amikacin), 젠타마이신, 카나마이신, 네오마이신, 네틸마이신(netilmicin), 스트렙토마이신, 토브라마이신(tobramycin), 테이코플라닌(teicoplanin), 반코마이신, 아지트로마이신(azithromycin), 클라리스로마이신(clarithromycin), 디리스로마이신(dirithromycin), 에리스로마이신(erythromycin), 로시스로마이신(roxithromycin), 트로렌도마이신(troleandomycin), 아목시실린(amoxicillin), 암피실린(ampicillin), 아즐로실린(azlocillin), 카베니실린(carbenicillin), 클로자실린(cloxacillin), 디클로자실린(dicloxacillin), 플루클로자실린(flucloxacillin), 메즐로실린(mezlocillin), 나프실린(nafcillin), 페니실린(penicillin), 피페라실린(piperacillin), 티카르실린(ticarcillin), 바시트라신(bacitracin), 콜리스틴(colistin), 폴리믹신 B(polymyxin B), 시프로플록사신(ciprofloxacin), 에녹사신(enoxacin), 가티플록사신(gatifloxacin), 레보플록사신(levofloxacin), 로메플록사신(lomefloxacin), 목시플록사신(moxifloxacin), 노르플록사신(norfloxacin), 오플록사신(ofloxacin), 트로바플록사신(trovafloxacin), 마페나이드(mafenide), 설파아세트아미드(sulfacetamide), 설파메티졸(sulfamethizole), 설파살라진(sulfasalazine), 설피솔사졸(sulfisoxazole), 트리메쏘프림(trimethoprim), 코트리목사졸(cotrimoxazole), 데메클로사이클린(demeclocycline), 독시사이클린(doxycycline), 미노사이클린(minocycline), 옥시테트라사이클린(oxytetracycline) 및 테트라사이클린(tetracycline) 으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 니코틴성 아세틸콜린 수용체 작용제는 필로카핀(pilocarpine), 아트로핀(atropine), 니코틴(nicotine), 에피바티딘(epibatidine), 로브린(lobeline) 또는 이미다클로프리드(imidacloprid) 중 어느 하나일 수 있다. 항-림프관 형성제는 혈관 내피 성장 인자 C (VEGF-C) 항체, VEGF-D 항체 또는 VEGF-3 항체 일 수 있다.

모든 실시 양태에서, 대상은 인간이다.

따라서, 본 발명의 제 3 양태는 DED의 치료 및/또는 예방용 의약의 제조에서 합성 펩티드의 용도에 관한 것이다. 7 개의 연속적인 아미노산 잔기로 구성된 상기 합성 펩티드는 DLYRX₁X₂S (서열 번호 1) 로 제시되고, 여기서, X₁ 및 X₂는독립적으로 임의의 아미노산 잔기이다.

본 발명의 하나 이상의 실시예의 세부 사항은 이하의 수반되는 기재에서 설명된다. 본 발명의 다른 특징 및 이점은 상세한 설명 및 청구 범위로부터 명백해질 것이다.

특허 또는 출원 파일에는 컬러로 실행된 하나 이상의 도면이 포함된다. 컬러 도면이 있는 이 특허 또는 특허 출원 간행물의 사본은 요청 및 필요한 수수료의 지불에 따라 사무소에 의해 제공될 것이다. 본 설명은 첨부 도면을 고려하여 다음의 상세한 설명으로부터 더 잘 이해 될 것이다:
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른, 건조 스트레스-마우스(desiccating stressed-mice) 상에서의 본 합성 펩티드의 예방 효과를 나타내는 플루오레세인(fluorescein) 염색된 각막 조직의 사진이다;
도 1b는 도 1a의 정량 분석을 나타내는 막대 그래프이다;
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 건조 스트레스-마우스의 눈물 생산 능력에 대한 본 합성 펩티드의 효과를 예시한다;
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른, 건조 스트레스-마우스에 대한 본 발명의 합성 펩티드의 치료 효과를 나타내는 플루오레세인 염색된 각막 조직 사진이다;
도 3b는 도 3a의 정량 분석을 나타내는 막대 그래프이다;
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따른, H & E 염색에 의한 각막 절편의 조직학적 검사를 나타낸 사진이다;
도 4b는 도 4a의 정량 분석을 나타내는 막대 그래프이다;
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따른, PAS- 염색된 결막 상피의 사진으로, 이 때 고블렛(goblet) 세포(분홍색, PAS 염색에 양성)는 화살표로 나타내었다;
도 5b는 도 5a의 정량 분석을 나타내는 막대 그래프이다.

첨부된 도면과 관련하여 아래에서 제공되는 상세한 설명은 본 실시예에 대한 설명으로 의도되며 본 실시예가 구성되거나 이용될 수 있는 유일한 형태를 나타내는 것으로 의도되지 않는다. 상기 설명은 예시의 기능 및 예시를 구성하고 조작하기 위한 일련의 단계를 제시한다. 그러나, 동일한 또는 동등한 기능 및 순서는 상이한 예에 의해 달성될 수 있다.

1. 정의

편의상, 본 명세서의 문맥에서 사용되는 특정 용어를 여기에 모았다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.

본원에 사용된 용어 "펩티드"는 아미노산 잔기의 중합체를 나타낸다. 본원에 사용된 용어 "합성 펩티드"는 자연적 발생 단백질 분자 전체를 포함하지 않는 펩티드를 의미한다. 펩티드는 화학적 합성, 재조합 유전자 기술 또는 전체 항원의 단편화 등과 같은 기술을 사용하여 인간의 개입(intervention)에 의해 생산될 수 있다는 점에서 "합성(synthetic)"이다. 본원에 걸쳐, 펩티드 내의 특정 아미노산 잔기의 위치는 펩티드의 N 말단으로부터 시작하여 번호가 매겨진다.

본원에서 확인된 합성 펩티드 서열에 대한 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성"은, 서열 정렬 후, 특정 펩티드 서열에서 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의되고, 필요한 경우, 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위한 갭을 도입하고, 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않는다. 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당업계의 기술 범위 내에 있는 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 대해 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬 측정을 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 본원의 목적을 위해, 2개의 아미노산 서열 간의 서열 비교는 NCBI(Nation Center for Biotechnology Information)에 의해 온라인으로 제공된 컴퓨터 프로그램 Blastp (단백질 - 단백질 BLAST)에 의해 수행되었다. 주어진 아미노산 서열 A와 주어진 아미노산 서열 B의 퍼센트 아미노산 서열 동일성(대안적으로, 주어진 아미노산 서열 B에 대해 특정 % 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열 A로 표시 될 수 있음)은 다음 공식에 따라 계산된다:

여기서 X는 A 및 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 BLAST에 의해 동일한 일치점으로 스코어된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 어느 쪽이든 더 짧은, A 또는 B 중 아미노산 잔기의 총 수이다.

본원에 사용된 용어 "치료"는 안구 건조증과 관련된 증상을 지연, 억제 또는 개선시키는 것과 같은 바람직한 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 의미한다. 그 효과는 질환 및/또는 그 질병에 기인하는 부작용에 대한 부분적 또는 완전한 치료의 관점에서 치료적이고, 질병 또는 그 상태를 완전히 또는 부분적으로 예방하는 관점에서 예방적일 수 있다. 본원에서 사용된 "치료"는 포유류, 특히 인간에서 질병의 예방 (예 : 예방을 위한(prophylactic)), 치유 또는 완화 치료를 포함하고; 다음을 포함한다 : (1) 질병에 걸리기 쉬울(pre-disposed) 수 있지만 그것이 아직 진단되지 않은 개인에게서 일어나는 질병 또는 상태의 예방 (예 : prophylactic), 치유 또는 완화 치료; (2) 질병을 억제하는 것 (예를 들면, 그것의 발달을 억제시킴); 또는 (3) 질병을 완화 (예를 들어, 질병과 관련된 증상을 감소시킴).

용어 "투여된", "투여하는" 또는 "투여"는, 제한 없이, 본 발명의 약제 (예를 들어, 화합물 또는 조성물)을 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 동맥 내, 두개 내 또는 피하로 투여하는 것을 포함하는 전달 방식을 나타내기 위해 여기서 상호 교환적으로 사용된다.

본원에 사용된 용어 "유효량"은 질환의 치료와 관련하여 바람직한 결과를 달성하기 위해 필요한 투여 용량 및 투여 기간에서 유효한 양을 의미한다. 예를 들어, 안구 건조증 질환의 치료에서, 안구 건조증 임의의 증상을 감소, 예방, 지연 또는 억제 또는 저지하는 약제 (즉, 화합물, 합성 펩티드, 또는 치료용 펩티드를 코딩하는 핵산)가 효과적일 것이다. 유효량의 약제는 질환 또는 상태를 치유(cure)하는데 요구되지는 않지만, 질환 또는 상태의 발병이 지연, 장애 또는 예방되거나 또는 질병 또는 증상이 완화되도록 질환 또는 상태에 대한 치료를 제공할 것이다. 상기 유효량은 지정된 기간에 걸쳐 1 회, 2 회 또는 그 이상으로 투여될 수 있는 적합한 형태로 1 회, 2 회 또는 그 이상의 투여 용량으로 나누어질 수 있다.

용어 "포유류"는 인간; 영장류; 동물원, 스포츠 또는 애완 동물뿐만 아니라 토끼, 돼지, 양 및 소와 같은 가축; 마우스 및 랫트와 같은 설치류를 포함하는 포유 동물류의 모든 구성원을 의미한다. "비인간 포유 동물"이란 용어는 인간을 제외한 포유 동물의 모든 구성원을 의미한다.

용어 "대상" 또는 "환자"는 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용되고, 본 발명의 합성 펩티드 및/또는 방법에 의해 치료 가능한 인간 종을 포함하는 동물을 의미하는 것으로 의도된다. 상기 용어 "대상" 또는 "환자"는 성별이 특별히 명시되지 않는 한 남성과 여성의 성별을 모두 지칭하는 것으로 의도된다. 따라서, "대상" 또는 "환자"라는 용어는 본 개시 내용의 치료 방법으로부터 이익을 얻을 수 있는 임의의 포유 동물을 포함한다. "대상" 또는 "환자"의 예로는 비제한적으로 인간, 랫트, 마우스, 기니아 피그, 원숭이, 돼지, 염소, 소, 말, 개, 고양이, 새 및 가금(fowl)이 포함된다. 예시적인 실시 예에서, 환자는 인간이다.

본원에서 사용된 용어 "약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제"는 안과 투여(ophthalmic administration)를 위해 약학적으로 허용가능한, 적합한 비히클(vehicle), 약제 또는 화합물을 의미한다. 본원에서 사용된 용어 "안과 조성물"은 눈에 적용하도록 의도되는 조성물, 또는 콘택트 렌즈와 같은 눈에 접촉되도록 놓여지는 장치를 처리하기 위해 의도되는 조성물을 의미한다.

본원에서 사용된 "안구 건조증(건성 안질환, DED)"이란 용어는, 다음 중 어느 하나, 눈물 생성 감소, 과도한 눈물 증발, 보통 눈물 층에서 발견되는 점액 또는 지질 생성에서의 이상 중 어느 하나에서 기인한 각막의 불투명도 및 결막의 지속 건조에 의해 특징되어지는 임의의 질환(disorder)을 의미하는 것을 의도한다. DED의 원인에는 비제한적으로 항공기 및 작업장과 같은 건조한 환경에의 노출, 비타민 A 결핍, 쉐그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 류마티스 관절염 및 기타 류마티즘 질환, 화학적 또는 열 화상, 아테놀롤(atenolol), 클로르페니라민(chlorpheniramine), 하이드로클로로티아지드(hydrochlorothiazide), 이소트레티노인(isotretinoin), 케토로락(ketorolac), 케토티펜(ketotifen), 레보카바스틴(levocabastin), 레보플록사신(levofloxacin), 옥시부티닌(oxybutynin) 및 톨테로딘(tolterodine) 등의 약물이 포함된다.

본 발명의 넓은 범위를 설명하는 수치 범위 및 파라미터가 근사치 임에도 불구하고, 특정 실시 예에 기재된 수치 값은 가능한 한 정확하게 보고된다. 그러나 모든 수치는 본질적으로 각각의 시험 측정에서 발견된 표준 편차로부터 필연적으로 발생하는 특정 오차를 포함한다. 또한, 본원에 사용 된 용어 "약"은 일반적으로 주어진 값 또는 범위의 10%, 5%, 1% 또는 0.5% 이내를 의미한다. 대안적으로, 용어 "약"은 당업자가 고려할 때 평균의 허용 가능한 표준 오차 이내를 의미한다. 작동/작용(operating/working) 실시예의 경우를 제외하고, 또는 달리 명시하지 않는 한, 재료의 양, 시간의 지속 시간, 온도, 작동 조건, 양의 비율 및 여기서 개시된 것과 같은 모든 수치 범위, 양, 값 및 퍼센트는 용어 "약"에 의해 모든 예시에서 변경되어 시해될 수 있어야 한다. 따라서, 달리 지시되지 않는 한, 본 개시 및 첨부된 청구 범위에 기재된 수치 파라미터는 원하는 바에 따라 변할 수 있는 근사치이다. 최소한 각 수치 파라미터는 적어도 보고된 유효 자릿수의 수와 일반적인 반올림 기술을 적용하여 해석되어야 한다.

단수 형태, "및", 그리고 "상기"는 문맥상 명확하게 다르게 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함하는 것으로 본원에서 사용된다.

2. 바람직한 구체예의 상세한 설명

본 발명은 적어도 부분적으로 안구 건조증 (DED)과 같은 안구 질환의 진행으로부터 환자를 치료 및/또는 예방할 수 있는 짧은 합성 펩티드의 발견에 기초한다. 따라서, 본 발명은 DED의 치료 및/또는 예방을 위해 새로이 확인된 합성 펩티드를 포함하는 방법 및 조성물을 제공한다.

2.1 본 합성 펩티드

본 발명의 짧은 합성 펩티드는 DLYRX₁X₂S (서열 번호 1)으로 기재되는 7 개의 연속적인 아미노산 잔기로 구성되고, 여기서, X₁ 및 X₂는 독립적으로 임의의 아미노산 잔기이다.

일 실시 양태에서, X₁은 류신이고, X₂는 임의의 아미노산 잔기이다.

또 다른 실시 양태에서, X₁ 및 X₂는 각각 발린 및 아르기닌이다.

또 다른 실시 양태에서, X₁ 및 X₂는 각각 글루타민 및 라이신이다.

임의의 실시 양태에 따라, 서열번호 1의 합성 펩티드는 적어도 하나의 D-형태 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 서열번호 1의 합성 펩티드는 2 개의 D-형태 아미노산 잔기를 갖는다.

본 합성 펩티드는 당업계의 임의의 표준 펩티드 합성 프로토콜에 따라 합성될 수 있다. 일 구현 예에서, 본 합성 펩티드는 제조사의 프로토콜에 따라, 고상 펩티드 합성기 (ABI433A 펩티드 합성기, Applied Biosystems Inc., Life Technologies Corp., Foster City, CA, USA)를 사용하여 합성하였다. 본 발명의 상기 합성 펩티드는 7-mer (X₁, X₂) (서열 번호 1), 7-mer (서열 번호 2), 7-mer (V → L) (서열 번호 3), 7-mer (V → Q) (서열 번호 4) 및 7-mer (VR → QK) (서열 번호 5)이며, 하기 표 1에 상세하게 기재되어있다.

X₁, X₂는 각각 임의의 아미노산이다

이 기술 분야의 당업자는, 폴리펩티드 서열에서 폴리펩티드 형태(polypeptide conformation)의 변화 상에서 영향을 예측하는 방법 (예 : 컴퓨터 시뮬레이션 프로그램)에 의해 합성 펩티드를 변형시킬 수 있으며, 따라서 합성 펩티드가 원하는 기능 또는 형태를 유지하는지 여부를 결정하기 위해 변형된 합성 펩티드를 제시하고 시험함으로써 본원에 개시된 정보에 기초하여 본 합성 펩티드(예를 들어, 7-mer)를 "설계(design)" 또는 "변형" 할 수 있다. 본 발명의 합성 펩티드 (예를 들어, 7-mer)는 그의 생리 활성과 무관한 펩티드의 특징을 변경하기 위해 특이적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 특정 아미노산은 본 연구에서 펩티드의 생리학적 활성 (즉, DED를 치료할 수 있는 능력)에 영향을 주지 않은 채, 변경 및/또는 삭제될 수 있다. 일부 실시 양태에 따르면, 7-mer의 제 5 및 6 아미노산 잔기 (각각 발린 및 아르기닌)는 DED를 치료 및/또는 예방하는 능력에 영향을 주지 않으면서 임의의 아미노산 잔기로 치환될 수 있다. 따라서, 본 발명은 보존적 아미노산 치환을 갖는 펩티드를 포함하여, 서열 번호 2의 바람직한 합성 펩티드 (즉, 7-mer)의 기능적으로 동등한 유도체를 포함한다.

다른 실시 양태에 따르면, 서열 번호 2의 N 및 C 말단에 각각 위치한 아스파테이트 (D) 및 세린 (S) 잔기가 결실되고, 7-mer-ΔD(LYRVRS, 서열 번호 6) 및 7-mer-ΔS(DLYRVR, 서열 번호 7)로 각각 지정된 결과물 펩티드는 DED에 대해 어떠한 생물학적 기능도 갖고 있지 않다. 따라서, 서열 번호 2의 N- 및 C- 말단에 각각 위치한 아스파테이트 (D) 및 세린 (S) 잔기는 본 합성 펩티드가 DED를 치료하는 능력에 필요하며, 이들 2 개의 잔기는 보존적 아미노산 잔기에 의해서만 치환될 수 있다.

대안적으로, 본 합성 펩티드는 재조합 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 펩티드를 코딩하는 핵산을 발현 벡터에 클로닝할 수 있으며, 여기에서 상기 핵산은 숙주 세포에서 본 펩티드를 발현하는데 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된다. 그런 다음 상기 벡터를 적당한 숙주 세포에 도입하여 펩티드를 발현시킬 수 있다. 상기 발현된 재조합 폴리펩티드는 암모늄 설페이트 침전 및 분별 컬럼 크로마토그래피와 같은 방법에 의해 숙주 세포로부터 정제될 수 있다. 이와 같이 제조된 펩티드는 하기 실시예에 기재된 방법에 따라 그의 활성을 시험할 수 있다.

상기 언급된 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드는 당업계에 공지된 중합체, 생분해성 미립자(microparticle) 또는 마이크로 캡슐 전달 장치의 사용에 의해 전달될 수 있다. 숙주에서 핵산의 섭취를 달성하는 또 다른 방법은 표준 방법으로 제조된 리포솜을 사용하는 것이다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 이들 전달 비히클에 단독으로 혼입되거나 조직-특이적 항체와 함께 혼입될 수 있다. 대안으로, 정전기적 또는 공유 결합력에 의해 폴리-L-라이신에 부착된 플라스미드 또는 다른 벡터로 구성된 분자 접합체(molecular conjugate)를 제조할 수 있다. 대안적으로, 조직 특이적인 표적화는 당업계에 공지된 조직-특이적인 전사 조절 요소의 사용에 의해 달성될 수 있다. 근육 내, 피내 또는 피하 부위로의 "네이키드 DNA"(즉, 전달 비히클 없이)의 전달은 in vivo 발현을 달성하는 또 다른 수단이다.

2.2 DED의 치료 및/또는 예방용 조성물

본 합성 펩티드는 DED를 앓고 있는 대상을 치료하거나 대상이 DED가 생기는 것을 예방하는데 적합하다.

따라서, 본 발명의 또 추가적 양태는 DED를 치료하기 위한 본 합성 펩티드를 포함하는 의약을 제공하는 것이다. 상기 의약은 적절한 양의 본 합성 펩티드를, 동결 건조 제제 또는 수용액과 같은 안과 투여에 적합한 조성물 내로 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 제조된다. 특정 실시 양태에서, 상기 합성 펩티드는 그의 서열 번호 2 내지 5, 또는 이들의 조합의 군으로부터 선택된다.

조성물에 존재하는 펩티드의 양은 사용된 펩티드에 의존할 것이다. 상기 펩티드는 전형적으로 0.001 중량 % 내지 약 10 중량 %, 예컨대 0.001, 0.005, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2., 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.9, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 및 10.0 중량%; 특히 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.9, 3.1, 3.2 , 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9 및 5.0 중량 %와 같은 약 0.01 중량 % 내지 약 5 중량%의 양으로 존재할 것이다.

합성 펩티드와 함께 사용하기 위한 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 관련 분야에 잘 알려져 있으며, 비제한적으로, 인산염, 시트르산 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스 코르빈산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예 : 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드, 벤젠에토늄클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3- 펜탄올; 및 m- 크레졸); 저 분자량 (약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역 글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류 및 포도당, 만노오스 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)과 같은 킬레이트제; 수크로오즈, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 슈거; 쇼듐과 같은 염-형성 반대 이온(salt-forming counter-ions); 금속 착물(metal complexes)(예, Zn- 단백질 복합체); 및/또는 폴리소르베이트 (예 : TWEEN®), 폴록사머 (예 : PLURONICS®) 또는 폴리에틸렌글리콜 (PEG)과 같은 비-이온성 계면 활성제(non-ionic surfactants)를 포함한다.

특정 실시 양태에서, 본 발명에 의해 제공되는 조성물은 국소 적용용으로 제제되고 투여될 것이다. 국소 제제는 일반적으로 성질상 수성이며, 생리적으로 허용가능한 pH로 완충되고 일반적으로 다중 분배(multi-dispensing)를 위해 보존된다. 따라서, 특정 구현예에서, 상기 조성물은 약학적으로 유효한 양의 본 합성 펩티드 (즉, 7-mer, 7-mer (V→L), 7-mer (V→Q) 또는 7 (VR→QK)) 및 상기 펩티드용 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하며, 이때, 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 국소적 안과 투여에 적합한 비히클이다. 당업자에게 잘 알려진 바와 같이, 다양한 유형의 비히클이 이용될 수 있다. 상기 비히클은 일반적으로 본질적으로 수성이다. 수성 용액은 일반적으로 제제의 용이성뿐만 아니라, 환자가 감염된 눈에서 1 내지 2 방울의 용액을 주입함으로써 그러한 조성물을 쉽게 투여할 수 있는 능력에 기초하여 바람직하다. 그러나, 본 발명에 의해 제공된 합성 펩티드는 또한 현탁액, 점성 또는 반-점성 겔 또는 다른 유형의 고체 또는 반고체 조성물과 같은 다른 유형의 조성물에 쉽게 혼입될 수 있다. 물에 비교적 불용성인 펩티드에는 현탁액이 바람직할 수 있다. 본 발명의 안과 조성물은 또한 완충제, 보존제, 공-용매 및 점도 형성제와 같은 다양한 다른 성분을 포함할 수 있다.

본원에 기술된 임의의 조성물과 관련하여, pH를 약 6 내지 약 8, 바람직하게는 약 7로 유지하기 위해 유효량의 완충액을 포함하는 것이 바람직하다. 사용된 완충액은 당업자에게 공지된 것, 제한하고자 하는 것은 아니지만, 일부 예는 아세테이트, 아스코르베이트, 보레이트, 바이카보네이트, 카보네이트, 시트레이트 및 포스페이트 완충액이다. 바람직하게는, 상기 완충제는 보레이트를 포함한다. 본 발명의 목적에 필요한 완충액의 유효량은 과도한 실험 없이 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 상기 완충제가 보레이트를 포함하는 경우, 상기 보레이트 완충액의 농도는 약 0.6 % 인 것이 바람직하다.

본 발명과 관련하여 본원에 기술된 임의의 조성물에서, 그것은 토니시티 제제(tonicity agent)를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 토니시티 제제는 안과용 조성물에 사용되어 용해된 물질의 농도를 원하는 등장성 범위로 조정하는데 사용된다. 상기 토니시티 제제는 안과 분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 제한하려는 의도는 아니나, 일부 예는 글리세린, 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨 및 다른 전해질을 포함한다. 바람직하게는, 토니시티 제제는 염화나트륨이다.

안과 제제(Ophthalmic formulations)는 전형적으로 다회 투여형(multidose form)으로 포장된다. 따라서 보존제는 사용 중 미생물 오염을 방지하는 것이 요구된다. 또한 개별적인 환경에 따라 일회용 조성물에 보존제를 사용하는 이유가 있을 수 있다. "보존제"라는 용어는 안과 분야에서 일반적으로 이해되는 의미를 가진다. 보존제는 다회 투여용 안과 제제에서 세균 오염을 방지하기 위해 사용되며, 제한하려는 것은 아니지만 예를 들면, 염화 벤잘코늄(benzalkonium chloride), 티메로살(thimerosal), 클로로부탄올, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 페닐에틸 알콜, 에데테이트 디소듐(edetate disodium), 소르브산, 폴리쿼터늄 -1, 안정화된 옥시클로로 복합체(Purite®로도 공지), 페닐메르큐릭 아세테이트(phenylmercuric acetate), 클로로부탄올, 벤질 알코올 또는 당업자에게 공지된 다른 제제를 포함할 수 있다. 이러한 보존제는 전형적으로 조성물의 총 중량 (중량 %)을 기준으로 0.001 내지 1.0 중량 %의 수준으로 사용된다.

특정 상황 하에서, 계면 활성제 또는 다른 적절한 공용매(co-solvent)가 본원에 기술된 본 발명에 의해 제공된 임의의 조성물에 사용될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "계면 활성제" 및 "공용매"라는 용어는 당업계에서 일반적으로 이해되는 의미를 가진다. 계면 활성제는 조성물의 치료학적 활성제 또는 다른 불용성 성분을 가용화시키는 것을 돕기 위해 사용되며, 다른 목적을 또한 제공할 수 있다. 상기 화합물의 예시적이고 비-제한적인 예는 폴리에톡실화 피마자유(castor oils), 폴리 솔베이트 20, 60 및 80; Pluronic® F-68, F-84 및 P-103 (BASF Corp., Parsippany N.J., USA); 사이클로덱스트린; 또는 당업자에게 공지된 다른 제제를 포함한다. 음이온성, 양이온성, 산, 염기 양쪽 작용성(amphoteric), 양성 이온성(zwitterionic) 및 비이온성 계면 활성제가 모두 본 발명에서 사용될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 폴리소르베이트, 폴록사머, 알콜 에톡실레이트, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 블록 공중합체, 지방산 아미드, 알킬페놀 에톡실레이트 또는 포스포리피드와 같은 비이온성 계면 활성제를, 계면 활성제를 사용하는 것이 바람직한 상황에서 사용하는 것이 좋다. 이러한 계면 활성제 또는 공용매는 전형적으로 0.01 내지 2 중량 %의 수준으로 사용된다.

간단한 수성 용액의 점도보다 큰 점도는 활성 성분의 안 흡수(ocular absorption)를 증가시키고, 제형의 분배에서의 가변성(variability)을 감소시키고, 제형의 현탁액 또는 에멀젼의 성분의 물리적 분리를 감소시키고 및/또는 그외에도 안과 제제를 개선시키는데 바람직할 수 있다. 그러한 점도 형성 제제는 예를 들어, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸 셀룰로오스, 히드록시에틸 셀룰로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스 또는 당업자에게 공지된 다른 제제를 포함한다. 이러한 제제는 전형적으로 0.01 내지 2 중량 %의 수준으로 사용된다.

본원에 기재된 본 발명의 임의의 조성물에 사용될 수 있는 또 다른 유형의 화합물은 킬레이트제(chelating agent)이다. 용어 킬레이트제는 화학 분야의 당업자가 이해하는 바와 같이, 금속을 착화시킬(complexing) 수 있는 화합물을 지칭한다. 킬레이트제는 보존제 효과를 향상시키기 위해 안과용 조성물에 사용된다. 제한하고자 하는 것은 아니지만, 본 발명의 목적을 위한 일부 유용한 킬레이트제는 에데테이트 디소듐, 에데테이트 칼슘 디소듐, 에데테이트 소듐, 에데테이트 트리소듐 및 에데테이트 디포타슘과 같은 에데테이트 염(edetate salts)이다.

특정 실시 양태에서, 본 합성 펩티드는 점안약(eye drops), 연고제, 크림 등과 같은 안과용으로 적합한 국소 조성물의 형태로 투여된다.

본 발명의 조성물은 눈에 국소 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 본 합성 펩티드 약 1 ㎍/kg 내지 약 50 mg/kg (예를 들어, 0.1 ~ 20 mg/kg)이 환자에게 투여된다. 전형적인 일일 또는 주간 투여 용량은 약 1㎍/kg 내지 약 20mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 임의의 상기 기술한 국소 투여 목적에 사용되는 투여 용량은 일반적으로 하루에 1 내지 수회, 예를 들어 4, 6, 8 또는 그 이상으로 투여되는, 체중 1kg 당 약 0.01 내지 약 100mg 일 것이다.

특정 실시 양태에서, 본 발명에 의해 제공되는 상기 조성물은 둘 또는 그 이상의 합성 펩티드를 포함하며, 이 때, 이들 중 적어도 하나는 7-mer 또는 이의 유도체 (7-mer (V→L), 7-mer (V→Q) 또는 7-mer (VR→QK)이고, DED를 치료 또는 예방할 수 있는 능력을 가진다. 이 실시 양태에서, 합성 펩티드는 이들의 개별, 동시 또는 연속 사용을 위해 제형화될 수 있다.

본 발명에 의해 제공되는 조성물은 또한 키트의 형태 일 수 있다. 본 발명에서, "키트"는 본 발명에 의해 제공된 합성 펩티드(들) 및/또는 팩킹된 조성물을 형성하는 부가적인 치료 화합물을 함유하는 생성물로서 이해되어, 그 수송, 저장 및 동시 또는 연속 투여가 허용된다. 따라서, 본 발명의 키트는, 본 발명의 합성 펩티드를 함유하고 단일 투여량 또는 다중 투여량으로 제조될 수 있는 하나 이상의 현탁액, 주사기 등을 함유할 수 있다. 상기 키트는 추가로 식염수, 링거액, 덱스트로스 및 염화나트륨과 같은 수성 매질; 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필에틸렌 글리콜과 같은 수용성 매질; 그리고 필요하다면 수불용성(insoluble) 비히클과 같은 합성 펩티드를 가용화하기에 적합한 비히클을 함유할 수 있다. 키트에 존재할 수 있는 또 다른 성분은 본 발명의 조성물을 결정된 한계 내에서 유지시키는 것을 허용하는 패키지이다. 이러한 패키지를 제조하기에 적합한 재료는 유리, 플라스틱 (폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트 등), 병, 바이알, 종이, 봉지(sachets)등을 포함한다.

본 발명의 키트는, 키트에 존재하는 상이한 제제를 동시에, 연속적으로 또는 개별 투여하기 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 키트는 상이한 성분의 동시, 연속 또는 개별 투여를 위한 지침을 추가로 포함할 수 있다. 상기 지침은 인쇄된 물질의 형태 또는 전자 저장 매체 (자기 디스크, 테이프 등), 광학 매체(CD-ROM, DVD) 등과 같이, 대상에 판독될 수 있도록 지침을 저장할 수 있는 전자 지원 형태일 수 있다. 상기 매체는 추가적으로 또는 대안적으로 상기 지침을 제공하는 인터넷 웹페이지를 포함할 수 있다.

2.3 DED의 치료 및/또는 예방 방법

상기 설명한 바와 같이, 본 발명에서 기술된 발견은 DED의 예방 및/또는 치료에 유용하다.

따라서, 본 발명은 DED의 예방 및/또는 치료 방법에 관한 것으로, DED의 예방 및/또는 치료 방법에 관한 것으로, 이를 필요로 하는 대상에게, DLYRX₁X₂S (서열 번호 1)로 제시되는, 7 개의 연속적인 아미노산 잔기로 이루어진 합성 펩티드, 여기서, X₁ 및 X₂는 독립적으로 임의의 아미노산 잔기이다; 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물 또는 의약을 국소 투여하는 것을 포함한다.

특정 실시 양태에서, 상기 합성 펩티드는 조성물의 형태이고, 이 때, 상기 조성물은 하나 이상의 합성 펩티드를 포함한다. 특정 실시 양태에서, 상기 합성 펩티드는 그의 서열이 서열번호 2 내지 5, 또는 이들의 조합의 군으로부터 선택된다.

선택적으로, 본 방법은 DED 치료를 위해 항염증제, 칼시뉴린 억제제, 항생제, 니코틴성 아세틸콜린 수용체 작용제 및 항-림프관 형성제제로 이루어진 군으로부터 선택된 약제의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

일부 예에서, 상기 항염증제는 사이클로스포린(cyclosporine)일 수 있다. 상기 칼시 뉴린 억제제는 보클로스포린(voclosporin) 일 수 있다. 상기 항생제는 아미카신(amikacin), 젠타마이신, 카나마이신, 네오마이신, 네틸마이신(netilmicin), 스트렙토마이신, 토브라마이신(tobramycin), 테이코플라닌(teicoplanin), 반코마이신, 아지트로마이신(azithromycin), 클라리스로마이신(clarithromycin), 디리스로마이신(dirithromycin), 에리스로마이신(erythromycin), 로시스로마이신(roxithromycin), 트로렌도마이신(troleandomycin), 아목시실린(amoxicillin), 암피실린(ampicillin), 아즐로실린(azlocillin), 카베니실린(carbenicillin), 클로자실린(cloxacillin), 디클로자실린(dicloxacillin), 플루클로자실린(flucloxacillin), 메즐로실린(mezlocillin), 나프실린(nafcillin), 페니실린(penicillin), 피페라실린(piperacillin), 티카르실린(ticarcillin), 바시트라신(bacitracin), 콜리스틴(colistin), 폴리믹신 B(polymyxin B), 시프로플록사신(ciprofloxacin), 에녹사신(enoxacin), 가티플록사신(gatifloxacin), 레보플록사신(levofloxacin), 로메플록사신(lomefloxacin), 목시플록사신(moxifloxacin), 노르플록사신(norfloxacin), 오플록사신(ofloxacin), 트로바플록사신(trovafloxacin), 마페나이드(mafenide), 설파아세트아미드(sulfacetamide), 설파메티졸(sulfamethizole), 설파살라진(sulfasalazine), 설피솔사졸(sulfisoxazole), 트리메쏘프림(trimethoprim), 코트리목사졸(cotrimoxazole), 데메클로사이클린(demeclocycline), 독시사이클린(doxycycline), 미노사이클린(minocycline), 옥시테트라사이클린(oxytetracycline) 및 테트라사이클린(tetracycline) 으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 니코틴성 아세틸콜린 수용체 작용제는 필로카핀(pilocarpine), 아트로핀(atropine), 니코틴(nicotine), 에피바티딘(epibatidine), 로브린(lobeline) 또는 이미다클로프리드(imidacloprid) 중 어느 하나일 수 있다. 상기 항-림프관 형성 제제는 혈관 내피 성장 인자 C (VEGF-C) 항체, VEGF-D 항체 또는 VEGF-3 항체 일 수 있다.

모든 실시 양태에서, 치료에 적합한 대상은 인간이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것이 아니고 설명을 목적으로 제공된다.

실시예

재료 및 방법

재료

CMC(Carboxymethylcellulose sodium), PAS(period acid Schiff) 시약 및 덱사메타손(dexamethasone)은 모두 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구매하였다. 균형잡힌 염 용액에서 CMC (1% w/v)를 7-mer 비히클로 사용하였다. 모든 펩티드는 GenScript(Piscataway, NJ, USA)에 의해 합성되었으며, 여기서, NH₂ 말단에서의 아세틸화(acetylation)와 COOH 말단에서의 아미드화(amidation)에 의해 변형되어 안정성을 향상시킨 이후 이어서 질량 분광법 (> 95% 순도)을 사용하여 특성화하였다.

실험 동물

C57BL/6 마우스 (7-8 주령, 각각 약 18 ~ 25g의 체중)가 본 연구에서 사용되었다. 모든 마우스는 Mackay Memorial Hospital Review Board (Taiwan, R.O. C.)에 의해 승인된 절차에 따라 동물 시설에서 유지되었다. 모든 동물 실험 절차는 안과 및 시력 연구(Ophthalmic and Vision Research)에서 동물 사용에 대한 ARVO Statement에 따라 수행되었다.

안구 건조증 동물 모델(Dry Eye Animal Model)

Barabino 등(IVOS (2005) 46 (8), 2766-2771)에 의해 이전에 기술된 절차에 따라 제어된 환경 챔버 (CEC)에 마우스를 두어 건성안(Dry eyes)을 유도하였다. CEC에 배치된 마우스는 상대 습도 (RH) <25%, 온도 20~22℃ 및 기류 15L/분, 하루 12 시간 노출시켰다. 대조군 마우스는 동일한 기간 동안 정상 환경 (RH> 50%, 기류 없음, 21-23℃의 온도)에서 유지되었다.

각막 형광 염색( Corneal fluorescein staining )

졸레틸(zoletil)(6 mg/kg)과 자일라진(xylazine)(3 mg/kg)의 혼합물을 복강 내 주사하여 동물을 마취시켰다. 각막 상피 손상은 국소 플루오레세인 (Fluor-I-Strip, Ayerst Laboratories, Philadelphia, PA)으로 염색하여 결정하였다. 각막 형광 염색은 코발트 청색광 하 슬릿-램프 생체 현미경(slit-lamp biomicroscope)을 사용하여 검사하고 디지털 카메라로 촬영했다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 나타내었다. 표준화된 5 점 척도 (0 도트, 0 등급; 1-5 도트, 1 등급; 6-15 도트, 2 등급; 16-30 도트, 3 등급; 30 도트, 4 등급)로, 각 눈의 1mm 중앙 각막 영역에서 플루오레세인 염색 도트의 수를 등급화했다. 한 영역의 컨플루언트 염색이 있으면, 1 포인트가 추가되었고, 2 이상의 컨플루언스 영역에 대해서는 2 포인트가 추가되었다 (Li J 외, Mole Visions 2012, 18, 317).

눈물 생산량 측정(Measurement of Tear Production)

눈물 생산은 페놀 레드-함침된 면사(Zone-Quick; Oasis, Glendora, CA)로 측정하였다. 마우스에서의 이 테스트의 타당성은 이전에 Dursun 등(IVOS (2002) 43, 632-638)에 의해 기술된 절차에 따라 수행되었다. 실을 jeweler 겸자로 잡고 60초 동안 측면 안각(lateral canthus)에 두었다. 눈물 생산은 눈물에 젖은 실의 밀리미터로 표현되고 빨갛게 변했다.

각막 상피 조직 병리학(Corneal epithelial histopathology )

각막 상피조직 손상은 이전에 기술된 바와 같이 평가되었다(Pflugfelder 등., 2005, Am J Pathol 166, 61-71). 요약하면, 2명의 독립적 마스크를 쓴 관찰자에 의해 20 대물렌즈를 사용하여, 3 개의 분리된 조직 섹션으로부터 분리되는 정점 세포(detaching apical cells) 수를 완전한 현미경 시야(full microscope field-of vision)에서 계산하였다. 3 마리의 마우스를 각 치료법에서 평가하였다.

고블렛 세포의 PAS(Period Acid Schiff ) 염색

동물을 안락사시킨 후, 눈을 외과적으로 절제하고, 10% 포르말린에 고정시키고, 파라핀 포매하고, 5-μm 절편으로 절단하였다. 상(superior) 및 하(inferior) 결막(conjunctiva)에서, 고블렛 세포 검출에 적합한 PAS (Sigma-Aldrich) 시약으로 상기 절편을 염색한 후, 상기 PAS-염색된 절편을 검사하고 디지털 카메라가 장착된 현미경으로 촬영하였다.

통계

결과는 평균의 평균 ± 표준 오차(SEM)로 표현되었다. 1-way ANOVA를 통계적 비교를 위해 사용하였다. P <0.05는 유의한 것으로 간주되었다.

실시예 1 : 본 합성 펩티드는 건조-스트레스 유발 안구 건조증을 예방함

"재료 및 방법" 섹션에 설명된 절차에 따라, 제어된 환경 챔버(CEC)를 사용하여 마우스에서 건조한 안구를 만들었다. 마우스를 CEC에 넣은 첫 날에 치료가 시작되었고, 본 합성 펩티드 (즉, 7-mer, 100μM), 펩티드 비히클 (1% CMC) 또는 7-mer 유래 펩티드 (즉, 7-mer-ΔD, 7-mer-ΔS, 7-mer (V→L) 및 7-mer (VR→QK), 100μM)를 14일 동안 매일 3번씩 국소 투여하였다. 상기 펩티드 7-mer-ΔD (LYRVRS, 서열 번호 6) 및 7-mer-ΔS (DLYRVR, 서열 번호 7)은 각각 5'- 말단(D; Aspartic acid ) 및 7-mer의 3'- 말단 (S, Serine)으로부터 결실된 하나의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드를 나타내었고, 음성 대조군 펩티드로 사용하였다. 또한, 7-mer (V→L) 및 7-mer (VR→QK)를 생성하는 7-mer에서의 단일 및 이중 아미노산 치환의 효과 또한 안구 건조증 치료에 사용되었다.

플루오레세인 염색은 각막 상피의 완전성 변화를 평가하기 위해 사용되었으며, 결과는 도 1a 및 1b에 나타내었다. 도 1a는 1% CMC 비히클, 7-mer 및 그 유도체로 각각 처리된 건조한 눈에서 얻은 사진이다. 도 1b는 도 1a의 정량 분석을 나타낸다.

도 1a에서 명백한 바와 같이, 1% CMC 비히클 처리로 각막 상피 세포에 현저한 플루오레세인 염색이 생성되지 않았고, 이는 상기 비히클 처리가 건조-스트레스 유발 각막 상피 손상을 예방하지 못함을 가리킨다. 반대로, 7-mer (3.8 ± 0.31 vs 1.3 ± 0.21)로 처리한 마우스에서 플루오레세인 염색에서 현저한 감소가 관찰되었고, 이는 7-mer 처리한 마우스에서 각막 상피 조직이 상대적으로 손상되지 않았음을 의미하고, 7-mer 합성 펩티드는 마우스를 DED 발병으로부터 보호 및/또는 방지할 수 있음을 의미한다. 유사한 보호 효과가 7-mer 유래 펩티드, 즉 7-mer (V→L) 및 7-mer (VR→QK)로 처리된 마우스에서도 관찰되었고; 반면에 7-mer (ΔD)와 7-mer (ΔS)는 그러한 효과가 없었다.

DED에 대한 7-mer 및 그 유도체의 보호 효과는 또한 시험 동물에 의해 생성된 눈물을 측정함으로써 평가되었고, 결과는 도 2에 나타내었다.

14 일 동안 CEC에서 수용한 후, 1% CMC 비히클 처리 마우스에 의해 생성된 눈물 부피는 CEC에 수용되지 않았거나 또는 임의의 치료를 받은 정상적인 건강한 마우스와 비교하여 유의하게 감소하였다 (P <0.05). 대조적으로, 7-mer, 7-mer (V→L) 또는 7-mer (VR→QK) 처리는 비히클 대조군 (5.1±0.21, 5.0±0.16 및 4.9±0.15 vs 3.7±0.25; 도 2)과 비교하여, 건조-스트레스를 받는 마우스의 눈물 생성 능력을 회복시켰다; 반면에 7-mer (ΔD) 또는 7-mer (ΔS) 펩티드 어느 것도 그러한 효과를 가지지 않았다.

이 실시예로부터의 결과는 7-mer 합성 펩티드가 동물이 건조-스트레스 유발된 DED를 발병시키는 것을 방지할 수 있음을 확인했다.

실시예 2 : 본 합성 펩티드는 건조-스트레스 유발 안구 건조증에 치료 효능을 발휘함

건조 안구는 "재료 및 방법" 섹션에 설명된 절차에 따라 14일 동안 CEC에 시험 동물을 수용하여 만들었다. 플루오레세인 염색에 의한 DED의 징후가 확인된 후 (도 3a, 상부 패널, 14일), CEC에서 동물을 제거하고 정상 환경 (15일)에 놓은 다음, 1% CMC, 1% 덱사메타손(Dex), 7-mer(100μM) 또는 7-mer (ΔS)(100μM)가 포함된 점안제를 7일 동안 투여하여 치료를 시작하였다(도 3a, 하부 패널; 21일; 및 도 3b).

도 3b에 도시된 정량 결과는 0.1% 덱사메타손 및 대조군 펩티드 7-mer (ΔS)가 DED에 대한 치료효과가 없음을 나타내었으며; 대조적으로, 본 개시의 7-mer 합성 펩티드는 1% CMC (1.5±0.18 vs 3.6±0.26;도 3b)로 처리된 대조군 마우스와 비교하여, 각막의 플루오레세인 염색 스코어를 현저하게 감소시킬 수 있다.

1% CMC 비히클, 0.1% Dex 및 대조군 펩티드 7-mer (ΔS)로 처리한 마우스에서 채취한 H&E 염색된 각막 조직 절편에서, 분리된 표면 정점 세포(superficial apical cells)가 확인된(도 4a) 반면, 정상 건강한 마우스 및 7-mer 처리된 마우스에서 채취한 각막 조직상에서 분리된 세포는 발견되지 않았다. 본 발명의 7-mer 합성 펩티드는 1% CMC 또는 7-mer (ΔS) (2.1±0.37 vs 14±1.06 및 13.8±1.03; 도 4b)로 처리한 대조군 마우스와 비교하여 분리된 표면 정점 세포를 유의하게 감소시킬 수 있다.

고블렛(Goblet) 세포는, 수분이 많은 환경에서 각막을 유지하는 데 도움이 되는 눈물층의 구성 요소 중 하나인 점액 분비를 담당하는 상피 세포의 주요 세포 유형이다. PAS-염색된 각막 절편은 1% CMC 또는 7-mer (ΔS)로 처리한 건조-스트레스 마우스뿐만 아니라, 건조 조건에서 14일 동안 수용했던 마우스의 고블렛 세포의 수를 현저히 감소시켰음을 보여주었다(도 5a, 하부 패널); 반면에 7-mer 합성 펩티드로 처리된 건조-스트레스 마우스에서 고블렛 세포의 수는 정상적인 건강한 마우스의 그것과 상대적으로 동일하였다(도 5a, 상부 패널). 본원의 상기 7-mer 합성 펩티드는 1% CMC (12.7±1.28 vs. 7.5±0.96, 도 5b)로 처리된 마우스의 것과 비교하여, 고블렛 세포의 성장을 현저하게 유도할 수 있다.

종합하면, 전술한 결과는 안구 건조증의 치료 및/또는 예방에 대한 본 개시의 짧은 합성 펩티드의 신규한 기능을 확인한다.

상기 실시예의 설명은 단지 예시로서 주어지며 당업자에 의해 다양한 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 상기 명세서, 실시예 및 데이터는 본 발명의 예시적인 실시예의 구조 및 사용에 대한 완전한 설명을 제공한다. 본 발명의 다양한 실시예가 특정의 어떤 정도로, 또는 하나 이상의 개별적인 실시예를 참조하여 상술되었지만, 당업자는 본 발명의 정신 또는 범위를 벗어나지 않고 개시된 실시예들에 다수의 변경을 가할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> TSAO Yeou-Ping HO Tsung-Chuan <120> USE OF SHORT SYNTHETIC PEPTIDE FOR THE TREATMENT AND/OR PROPHYLAXIS OF DRY EYE DISEASE <130> P2861-PCT <160> 7 <170> BiSSAP 1.3 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> VARIANT <222> 5..6 <223> Xaa can be any amino acid <400> 1 Asp Leu Tyr Arg Xaa Xaa Ser 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 2 Asp Leu Tyr Arg Val Arg Ser 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 3 Asp Leu Tyr Arg Leu Arg Ser 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 4 Asp Leu Tyr Arg Gln Arg Ser 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 5 Asp Leu Tyr Arg Gln Lys Ser 1 5 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 6 Leu Tyr Arg Val Arg Ser 1 5 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 7 Asp Leu Tyr Arg Val Arg 1 5

Claims

DLYRX₁X₂S(서열 번호 1)으로 기재되는 7 개의 연속적인 아미노산 잔기로 이루어진 합성 펩티드로서,
이 때, X₁ 및 X₂는 각각 발린 및 아르기닌(서열번호 2), 류신 및 아르기닌(서열번호 3), 글루타민 및 아르기닌(서열번호 4) 또는 글루타민 및 라이신(서열번호 5)인 합성 펩티드.
제 1항에 있어서, 적어도 1 개의 D-형태 아미노산 잔기가 서열 번호 1의 아미노산 서열에 존재하는 합성 펩티드.
제 2항에 있어서, 적어도 2 개의 D-형태 아미노산 잔기가 서열 번호 1의 아미노산 서열에 존재하는 합성 펩티드.
제 1항에 따른 합성 펩티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 안구 건조증(dry eye disease, DED)을 치료하기 위한 의약.
제 4항에 있어서, 적어도 1개의 D-형태 아미노산 잔기가 서열 번호 1의 아미노산 서열에 존재하는 안구 건조증(dry eye disease, DED)을 치료하기 위한 의약.
제 5항에 있어서, 적어도 2개의 D-형태 아미노산 잔기가 서열 번호 1의 아미노산 서열에 존재하는 안구 건조증(dry eye disease, DED)을 치료하기 위한 의약.
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