KR102017948B1

KR102017948B1 - 콜라겐 및 실크 피브로인을 포함하는 세포 캡슐화용 복합 하이드로겔 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR102017948B1
Application number: KR1020170142691A
Authority: KR
Inventors: 김해원; 이정환; 올모스 부이트라고 제니퍼; 캠벨 놀스 조나단
Original assignee: 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단
Priority date: 2017-10-30
Filing date: 2017-10-30
Publication date: 2019-09-03
Also published as: KR20190048133A; EP3476409A1

Abstract

본 발명은 α-나선 구조를 갖는 콜라겐 및 β-시트 구조를 갖는 실크 피브로인을 혼합하여 겔화하는 단계를 포함하는, 콜라겐 및 실크 피브로인을 포함하는 세포 캡슐화용 복합 하이드로겔의 제조방법 및 이에 따라 제조한 세포 캡슐화용 복합 하이드로겔에 관한 것이다. 본 발명의 복합 하이드로겔은 대부분의 조직에 적합한 0.05 kPa ~ 40 kPa의 강성을 나타내며, 세포 캡슐화를 가능하게 하고, 세포 접착 및 증식을 돕고, 세포 견인력에 의해 수축을 억제하며, 체외 배양 및 생체 내 조직 공학에 장기간 유익한 효과를 나타낼 수 있다.

Description

콜라겐 및 실크 피브로인을 포함하는 세포 캡슐화용 복합 하이드로겔 및 이의 제조방법{Composite hydrogel for cell encapsulation comprising collagen and silk fibroin, and manufacturing method thereof}

본 발명은 복합 하이드로겔 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 뛰어난 물리적, 기계적 및 생물학적 특성을 지닌 콜라겐 및 실크 피브로인으로 구성된 복합 하이드로겔 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

조직 공학은 손상되고 병이 있는 조직을 치료하기 위한 임상적으로 효과적인 대용품을 개발하는 것을 목표로 하는 다분야의, 중개과학이다. 줄기 세포의 자연적 틈새와 일치하는 적절한 점탄력 특성을 갖는 생체 적합 물질의 설계는 손상된 조직을 재생하는 주요 전략 중 하나이다.

조직은 다른 구성 및 구조의 세포외 기질(ECM), 및 줄기 세포에 증식하고 계보 세포로 적절히 분화하도록 지시할 수 있는 기계적 성질(예를 들면, 강성)을 갖는다. 예를 들어, 연조직(예: 뇌)은 약 0.1-1kPa의 강성을 갖고, 근육과 같은 약간 뻣뻣한 조직의 세포는 5-10 kPa를 선호하고, 콜라겐 뼈 매트릭스의 강성은 25 kPa 이상이다. 세포는 ECM 접착 단백질(라미닌, 콜라겐, 및 피브로넥틴)에서 유발된 외부 기계적 힘을 감지할 수 있는데, 감지된 외부 기계적 힘은 접착 복합체, 주로 세포막에 위치한 인테그린(integrins)을 통해 세포 골격 액틴 필라멘트에 물리적으로 연결된다. 세포 골격은 핵막에서 단백질을 통해 핵과 물리적으로 결합되기 때문에 ECM 신호는 핵 분자쪽으로 세포 골격 네트워크를 통해 물리적으로 전달되어, 생체 신호로 번역되어, 궁극적으로는 증식, 이동 및/또는 분화를 포함한 세포 반응을 상향/하향 조절할 수 있다.

하이드로겔은 자연 조직과 유사한 방법으로 세포에 물리 화학적 신호를 제공하는 데 최적이라고 여겨진다. 하이드로겔은 공유 결합, 수소 결합, 반데르 발스 결합 또는 물리적 결합 등과 같은 응집력에 의해 가교된 친수성 고분자로서, 수용액상에서 다량의 물을 내부에 함유하여 팽윤할 수 있는 3차원 고분자 네트워크 구조를 갖는 물질이다. 세포가 함유된 하이드로겔이 주사할 수 있다면 의학적 응용 가능성이 있어 최소 침습 수술에 적합하다. 폴리(에틸렌 옥시드)(PEO), 폴리(비닐 알코올)(PVA), 폴리(아크릴산)(PAA)과 같은 각종 합성 물질, 및 아가로오스, 알기네이트, 키토산, 콜라겐, 피브린, 젤라틴 및 히알루론산(HA)과 같은 천연 유래의 물질이 하이드로겔을 형성하는 데 사용되어 왔다. 중합체 사슬이 화학 약품(예, 가교제) 또는 물리적 자극(예, pH 및/또는 온도)에 의해 유발됨으로써 화학적 또는 물리적으로 가교되어 그물구조를 이룰 때 겔화가 일어난다. 일반적으로, 천연 유래 중합체는, 고분자 성질이 세포외 매트릭스에 더욱 가까이 정렬되어 있고 분해 생성물이 비독성이기 때문에, 조직 공학 및 이식가능한 의학 장치용 세포 및 생활성 분자의 담체로 유용한 경향이 있지만, 그 겔화는 조절가능성이 적다

현재 전형적인 두 가지 중요한 생물학적 단백질인 실크와 콜라겐이 하이드로겔의 재료로 사용되고 있다. 콜라겐은 피부, 뼈, 힘줄, 인대, 근육 및 혈관과 같은 많은 조직의 ECM에서 가장 풍부한 단백질 성분이다. 실제로, 농도를 변화시킴으로써 다양한 강성 값을 갖는 콜라겐 하이드로겔을 생산하려는 많은 시도가 있어왔다. 콜라겐 하이드로겔의 전단 계수(G')는 농도 의존적으로 나타났으나(0.4 mg/ml에서 2.2 Pa, 1 mg/ml에서 7 Pa, 1.5 mg/ml에서 14 Pa, 2 mg/ml에서 15-17 Pa, 그리고 4 mg/ml에서 120 Pa), 수득한 겔은 화학적 가교 없이는 매우 낮은 강성 수준(대부분 1 kPa 미만)을 갖는다. 또한, 콜라겐 겔은 가교 결합되면 세포 캡슐화 및 전달에 응용될 수 없는 한계가 있다.

반면에, 지난 20년간 주목을 받아온 실크 피브로인 단백질은 좋은 생체 적합성과 높은 기계적 특성으로 인해 유망한 천연 중합체로 간주되고 있다. 실크 피브로인 하이드로겔의 유변학적 측정 결과 넓은 kPa 범위에서(1 %에서 4.8 kPa, 2 %에서 7.4 kPa, 3 %에서 22.4 kPa, 4 %에서 33.1 kPa, 그리고 5.2 %에서 70 kPa) 콜라겐 하이드로겔에서 얻은 것보다 훨씬 높은 G’값을 나타냈다. 그러나 4 % 미만의 실크 농도는 취급하기가 어렵고 강성이 너무 높아서 신경과 같은 많은 연조직에 최적으로 적용할 수 없다. 또한 가장 널리 알려진 실크 피브로인 Bombyx mori는 RGD 서열이 결핍되어있어 잠재적인 세포 부착과 성장을 제한하는 문제점이 있다.

본 발명자들은 상기 문제점을 인식하고 뛰어난 물리적, 기계적 및 생물학적 특성을 지닌, 콜라겐 및 실크 피브로인으로 구성된 복합 하이드로겔을 연구한 바, α-나선 구조의 콜라겐과 β-시트 구조의 실크 피브로인을 혼합할 경우, 겔화 과정이 가속되고 콜라겐과 실크 피브로인 단백질 간에 분자 상호 작용에 의한 네트워크가 형성되어, 조정가능한 강성을 갖는 복합 하이드로겔을 제조할 수 있고, 이를 세포 캡슐화에 사용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

KR

10-2015-091421

A

본 발명은 세포 전달 및 표적 조직 공학을 위한 최적의 하이드로겔 및 이의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명은 뛰어난 물리적, 기계적 및 생물학적 특성을 지닌, 비화학적이며 세포친화적인 방법을 사용하는 콜라겐 및 실크 피브로인으로 구성된 복합 하이드로겔 및 이의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명은 조절 가능한 강성을 갖는 하이드로겔 매트릭스는 표적 조직의 세포에 적절한 생물리학적/화학적 신호를 제공할 수 있다.

본 발명의 제1양태는 α-나선 구조를 갖는 콜라겐 및 β-시트 구조를 갖는 실크 피브로인을 혼합하여 겔화하는 단계를 포함하는, 콜라겐 및 실크 피브로인을 포함하는 세포 캡슐화용 복합 하이드로겔의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 제2양태는 α-나선 구조의 콜라겐 및 β-시트 구조의 실크 피브로인을 포함하고, α-나선 구조의 콜라겐과 β-시트 구조의 콜라겐 간에 수소결합에 의한 상호침투 네트워크가 형성되고, 0.05 kPa 내지 40 kPa의 범위 내에서 조정가능한 강성을 갖는, 콜라겐 및 실크 피브로인을 포함하는 세포 캡슐화용 복합 하이드로겔을 제공한다.

이하, 본 발명을 자세히 설명한다.

하이드로젤은 가교 고분자의 네트워크에 의해 결정되는 탄성 성분과 그 조성에 고함량의 물이 포함된 점성 성분으로 점탄성 물질로 작용한다. 하이드로겔은 양호한 생체 적합성을 만족시키고, 세포 캡슐화를 허용하고, 세포 성장 및 기능을 추가로 도울 수 있어야 한다. 또한, 다른 구성 및 구조의 세포외 기질(ECM), 및 줄기 세포에 증식하고 계보 세포로 적절히 분화하도록 지시할 수 있도록 조정가능한 광범한 범위의 강성을 가질 수 있어야 한다. 종래 콜라겐 겔은 화학적 가교 없이는 매우 낮은 강성 수준을 가지며, 가교 결합되면 세포 캡슐화 및 전달에 응용될 수 없는 한계가 있고, 실크 피브로인 겔은 4 % 미만의 실크 농도는 취급하기가 어렵고 강성이 너무 높아서 신경과 같은 많은 연조직에 최적으로 적용할 수 없다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 뛰어난 물리적, 기계적 및 생물학적 특성을 지닌, 콜라겐 및 실크 피브로인으로 구성된 복합 하이드로겔을 연구한 바, α-나선 구조의 콜라겐 0.5 ~ 4 mg/ml과 β-시트 구조의 실크 피브로인 0.35 ~ 2.45 (% w/v)를 혼합할 경우, 겔화 과정이 가속되고 콜라겐과 실크 피브로인 단백질 간에 분자 상호 작용에 의한 네트워크가 형성되어, 0.05 kPa 내지 40 kPa의 범위 내에서 조정가능한 강성을 갖는 복합 하이드로겔을 제조할 수 있고, 이를 세포 캡슐화에 사용할 수 있음을 확인하였다. 본 발명은 이에 기초한 것이다.

본 발명의 제조방법은 α-나선 구조의 콜라겐과 β-시트 구조의 실크 피브로인을 혼합하여 겔화를 가속하고 α-나선 구조의 콜라겐과 β-시트 구조의 실크 피브로인 간에 분자 상호 작용에 의한 상호침투 네트워크를 형성하는 것을 특징으로 한다.

이를 위해 본 발명의 복합 하이드로겔의 제조방법은 콜라겐을 중화처리하여 α-나선 구조의 콜라겐으로 자기조립하는 단계를 포함한다. 콜라겐은 세 가닥의 폴리펩티드 사슬이 왼쪽으로 감겨지는 좌선회 나선을 감아가면서 꼬아진 삼중나선 구조를 갖는다. 삼중나선 구조의 콜라겐은 β-시트 구조의 실크 피브로인과 혼합되어 겔화되거나 분자 상호 작용에 의한 네트워크를 형성할 수 없다. 따라서, 본 발명에서는, 삼중나선 구조의 콜라겐을 NaOH 등으로 pH를 갖도록 중화처리하여 α-나선 구조로 자기조립한다.

또한, 본 발명의 제조방법은 실크 피브로인을 초음파처리하여 β-시트 구조의 실크 피브로인으로 자기조립하는 단계를 포함한다.

상기 실크 피브로인은 세리신이 제거된 것일 수 있다.

서로 다른 구조인 α-나선 구조의 섬유형 콜라겐과 β-시트 구조의 실크 피브로인을 혼합하면 상호침투 네트워크가 형성되어 겔화가 진행된다.

초음파 처리 후, 실크 피브로인은 랜덤 코일에서 β-시트로 신속한 구조 변화를 진행한다(X. Wang et al., Biomaterials. 29 (2008)). 본 발명의 실시예에서, 초음파 처리하지 않으면 실크 피브로인은 1638 cm^-1(1620 cm^-1에서 피크 없음)에서만 피크를 나타냈으나, 20% 진폭에서 10 초 이상의 초음파 처리 결과 β-시트 구조의 강한 피크가 나타남을 확인하였다. 따라서, 초음파 처리 시간은 20% 진폭에서 10 초 이상인 것이 바람직하며, 10 초 내지 60초인 것이 더욱 바람직하다.

초음파 처리는 당 분야에 공지되어 있다. 상기 응용을 위해, "초음파 처리" 및 "음파 처리"라는 용어는 상호교환가능하게 사용되며 동일한 의미를 갖는다. 초음파 처리는 실크 피브로인에 초음파를 적용하는 당 분야에 공지된 임의의 방식으로 수행될 수 있다. 초음파 처리는 실크 피브로인을 음파 처리에 한 번 노출시키는 것을 포함하거나, 다수의 별도 노출을 수반할 수 있다.

본 발명은 α-나선 구조의 콜라겐의 농도가 0.5 ~ 4 mg/ml이고, 실크 피브로인의 농도가 0.35 ~ 2.45 (% w/v)인 범위 내에서 겔화가 안정적으로 진행되는 것을 확인하였다.

콜라겐은 실크 피브로인의 겔화를 촉진하며 이러한 효과는 특히 실크 농도가 낮은 경우 두드러질 수 있다. 본 발명의 실시예에서, 0.3-0.5 %의 실크 농도는 콜라겐과 혼합되지 않으면 초음파로 겔을 형성하지 못하고, 실크와 콜라겐의 혼합은 겔화 과정을 상당히 가속시킴을 확인하였다. 이는 실크와 콜라겐 단백질간에 분자 상호 작용이 있을 수 있음을 시사한다.

α-나선형 콜라겐과 β-시트 실크 피브로인 간에는 두 단백질의 아미노산 잔기의 수소결합에 의한 상호침투 네트워크(interpenetrating network; IPN)가 형성될 수 있다. 상호침투 네트워크란 공유결합 형태가 아닌, 분자 단위에서 부분적으로 엇갈려서 생긴 둘 이상의 네트워크를 의미한다. 실크 및 콜라겐 모두는 상호 침투 네트워크를 형성할 수 있다. 둘 다 얽히고 공유 결합이 관여하지 않지만 화학 결합이 끊어진 때 두 상이 분리될 수 있으므로 IPN 중합체는 향상된 물리적 및 기계적 특성을 용이하게 보일 수 있다.

본 발명의 제조방법은 콜라겐 농도 및 실크 피브로인 농도의 조정에 의해 0.05 kPa 내지 40 kPa의 범위 내에서 강성을 조정하는 것을 특징으로 한다. 따라서, 본 발명의 복합 하이드로겔은 대부분의 연질 및 경질조직에 적합한 다양한 강성 값을 만족하는 0.05 kPa ~ 40 kPa 범위의 강성을 가질 수 있다.

본 발명의 복합 하이드로겔의 기계적 및 생물학적 특성은 개별 단백질의 결합된 장점을 나타내기 위해 조정할 수 있다. 특히, 전단 저장 탄성률을 등조성(isocompositional) 선을 따라 0.05 kPa ~ 40 kPa의 범위로 조정할 수 있다. 따라서, 본 발명의 복합 하이드로겔은 약 0.1-1 kPa의 강성을 갖는 연조직(예: 뇌)의 세포, 약 5-10 kPa의 강성을 갖는 근육 조직의 세포, 25 kPa 이상의 강성을 갖는 콜라겐 뼈의 강성 모두에 적합할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 복합 하이드로겔은 연조직(예: 뇌)의 세포에 적용하기 위해, 0.1-1 kPa의 강성을 갖도록 조정된 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 복합 하이드로겔은 근육 조직의 세포에 적용하기 위해, 5-10 kPa의 강성을 갖도록 조정된 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 복합 하이드로겔은 콜라겐 뼈에 적용하기 위해, 25 kPa 이상의 강성을 갖도록 조정된 것일 수 있다.

구체적으로, 본 발명은 콜라겐을 중화처리하여 α-나선 구조의 콜라겐으로 자기조립하는 단계; 실크 피브로인을 초음파처리하여 β-시트 구조의 실크 피브로인으로 자기조립하는 단계; 및 상기 α-나선 구조의 콜라겐 0.5 ~ 4 mg/ml과 상기 β-시트 구조의 실크 피브로인 0.35 ~ 2.45 (% w/v)를 혼합하여 겔화하고, 분자 상호 작용에 의한 상호침투 네트워크를 형성하는 단계를 포함하고, 콜라겐 농도 및 실크 피브로인 농도의 조정에 의해 0.05 kPa 내지 40 kPa의 범위 내에서 강성을 조정하는, 콜라겐 및 실크 피브로인을 포함하는 세포 캡슐화용 복합 하이드로겔의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 복합 하이드로겔은 순수 콜라겐 또는 실크 하이드로겔에서 거의 볼 수 없었던 굽힘, 비틀림, 스트레칭 및 압축을 포함하는 다양한 응력 모드 하에서 우수한 탄성 거동을 나타냈다.

본 발명의 복합 하이드로겔은 세포 캡슐화를 가능하게하고, 세포의 접착 및 증식을 돕고, 세포 견인력에 의해 수축을 억제하며, 체외 배양 및 생체 내 조직 공학에 오랫동안 유익할 수 있다.

본 발명의 복합 하이드로겔의 콜라겐 성분은 세포 부착 부위를 제공하여 세포 부착 모티프가 결여된 실크 겔과 관련하여 세포 정착 및 확산을 촉진할 수 있다. 본 발명의 실시예에서, 본 발명의 복합 하이드로겔 상에서 배양된 세포(hMSC)는 신속하게 정착하고 확산하고, 활발하게 증식하고, 하이드로겔 수축을 보이지 않으며, 순수한 실크(세포 접착 모티프의 결핍) 및 순수한 콜라겐(실질적인 세포 매개된 수축) 모두의 일반적인 한계를 극복함을 확인하였다.

본 발명이 복합 하이드로젤은 장기간의 3D 배양 기간 동안 생존력과 성장을 유지하면서 세포를 캡슐화할 수 있다. 본 발명의 실시예에서, 세포가 복합 하이드로겔 내에 안전하게 캡슐화될 수 있고, 장기간의 3D 배양 하에서 높은 생존성을 보임을 확인하였다. 이러한, 실크-콜라겐 하이드로겔의 특성, 즉 가속화된 겔화, 개선된 물리적/기계적 특성, 및 유리한 세포 반응은 2 개의 상이한 단백질 영역에 배치된 개체의 시너지 작용에 기인한 것이다.

본 발명의 복합 하이드로겔은 삽입된 α-나선형 콜라겐 원섬유와 β-시트 형성 실크 구조는 적용된 응력에 대한 개별 약점을 보완할 수 있다. 즉, α-나선형 원섬유는 단단한 β-시트 단위에 높은 유연성을 제공하고 β-시트는 α-나선형 원섬유를 강화하여 수율과 수분 손실에 저항하게 한다.

본 발명의 복합 하이드로겔은 표적 조직에 대해 조정 가능한 넓은 강성 스펙트럼을 갖는 탄성 세포 캡슐화용 겔로서 유용하다.

본 발명의 복합 하이드로겔은 대부분의 조직에 적합한 0.05 kPa ~ 40 kPa의 강성을 나타내며 콜라겐 또는 실크의 개별 하이드로겔과 차별화된 급속 겔화 및 탄성 거동 특성을 나타낼 수 있다.

본 발명의 복합 하이드로겔은 세포 캡슐화를 가능하게 하고, 세포 접착 및 증식을 돕고, 세포 견인력에 의해 수축을 억제하며, 체외 배양 및 생체 내 조직 공학에 장기간 유익한 효과를 나타낼 수 있다.

도 1은 실크-콜라겐 복합 하이드로겔의 전형적인 겔화 과정을 나타내는 모식도 및 준비된 하이드로겔의 조성 지도이다(몇 가지 대표적인 등조성선 1:2.5, 1:3.5, 1:5, 1:7 및 1:10)를 나타내는 모식도이다.
도 2는 하이드로겔의 겔화 시간 분석 결과이다: (a) 순수 콜라겐 겔의 농도 및 온도 의존 겔화 시간; (b) 순수 실크 겔의 초음파 처리 노출 시간 및 농도 의존 겔화 시간; (c) 대표적인 등조성선(1:7)을 따라 제조된 콜라겐-실크 복합 겔의 겔화 시간; (d) 겔화 시간은 다른 성분(콜라겐 또는 실크)의 고정 조성물에서 한 성분 (실크 또는 콜라겐)의 조성 변화에 따라 변하고, 실크는 파란색 선을 따라 빨간색 선과 콜라겐에 따라 변하고; (e) 콜라겐-실크 복합 겔 대 콜라겐 또는 실크 개별 겔의 겔화 시간의 비교.
도 3은 1:7 등조성선을 따른 콜라겐-실크 하이드로겔의 전단 계수 (G') 플롯으로, 전단계수는 넓은 범위(0.017 kPa ~ 6.81 kPa)를 커버한다.
도 4는 콜라겐-실크 복합 하이드로겔의 기계적 거동을 나타낸다: (a) 직사각 형태의 하이드로겔(콜라겐 3.5mg/ml, 실크 2 % 및 CS-F를 대표적인 그룹으로 함)은 변형 후에 상이한 응력 조건을 수동으로 받았고, CS-F는 무결성과 수분 함량을 유지하고 지속적인 굽힘 및 장력을 유지하였고, (b) 추출 후 중공 관상 형태의 하이드로겔은 구부러지고 뒤틀리고 늘어져 거동에 명확한 차이를 보인다.
도 5는 콜라겐-실크 복합 하이드로겔의 기계적 거동을 나타낸다: (a) 원통형 하이드로 겔에 가해지는 작은 하중. 콜라겐 하이드로겔의 상당한 수분 손실은 모양을 유지할 수 없는 반면, 순수한 실크와 콜라겐-실크 하이드로겔에서는 잘 보존되어 수분 함량을 유지하고 모양을 회복하고; (b) 연속적인 힘이 가해지면, 실크 하이드로겔은 완전성을 잃는 반면, 복합 하이드로겔은 탁월한 신축성을 나타낸다.
도 6은 (a, b) 4 시간에 다른 하이드로겔 상에서 접착 세포의 정량 결과 및 세포 형태에 관한 것이고. (c, d) 처음 3 시간 동안 다른 시간 간격에서 세포 형태 및 세포 표면적의 변화에 관한 것이다.(p<0.05).
도 7은 (a) 세포 성장 형태, 및 (b) 상이한 하이드로겔에서 3 일 동안 배양 중에 정량화된 세포 수. (c) 콜라겐 하이드로겔에서 관찰되었지만 실크 기반 하이드로겔에서는 관찰되지 않은 세포 견인력의 결과로서의 수축을 나타낸 것이다. 하이드로겔 직경 = 10 mm.
도 8은 최대 14 일 동안 배양한 세포가 포함된 하이드로겔울 라이브/데드 세포 키트로 염색하고 형광 현미경으로 시각화한 것으로, 대부분의 세포는 모든 복합 하이드로겔에서 살아있다.

이하, 본 발명의 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실크 피브로인 정제 용액의 제조

실크 피브로인의 추출을 문헌[D.N. Rockwood et al., Nat. Protoc. 6 (2011) 16121631]에 보고된 이전의 프로토콜에 따라 수행하였다. 간략하게, Bombyx mori (한국 Uljinsilk)의 실크 고치 5g을 1 ~ 1.5cm 조각으로 절단한 다음 2 리터의 0.02M 탄산나트륨(Na2CO3, Sigma, 57795) 수용액에서 30 분 동안 끓여서 세리신을 제거하였다. 그 후 탈지면 고치를 초순수로 20 분간 두 번 씻어 실크 피브로인의 세리신을 완전히 씻어내었다.

생성된 피브로인을 칭량하고, 60 ℃에서 4 시간 동안 20 % w/v의 최종 농도로 9.3M 브롬화 리튬(LiBr, 대전, 5108-1410)에 용해시켰다. 점성 용액을 3.5 K MWCO 투석막(ThermoFisher, 88244)에서 초순수에 대하여 적어도 48 시간 동안 투석하여 모든 염을 제거하였다.

피브로인 용액을 4 ℃에서 20 분 동안 10.000g에서 2 번 원심 분리하여 용해되지 않은 섬유 및 다른 불순물을 제거하고 최종 사용을 위해 4㎕로 저장하였다. 이어서, 121 ℃에서 15 분 동안 고압 증기(오토 클레이브)를 사용하여 피브로인을 멸균시켰다. 실크 피브로인의 최종 농도는 약 6.5-7 % w/v로 측정되었다. 멸균된 물로 희석하여 원하는 농도를 얻었다.

쥐 꼬리 유래 콜라겐 I 형 및 콜라겐 하이드로겔의 제조

콜라겐 용액(타입 I, 쥐 꼬리로부터 고농축의 약 9-10 mg/ml, Corning, 354249)을 사용하였다. 콜라겐 하이드로겔의 제조를 위해, DMEM 20X (Gibco, 12800-017), 아세트산 0.02 N 및 NaOH 1 N을 다른 곳에서 보고된 절차에 따라 사용하였다.

실시예: 콜라겐-실크 혼합 하이드로겔의 제조

하기 표 1에 기재된 대로 일련의 상이한 콜라겐-실크 하이드로겔의 조성물을 제조하였다.

한 시리즈에서 콜라겐:실크 비는 1:7로 고정되었고(도 1에 도시된 등조성선 중 하나); 두 단백질의 농도는 1:7의 비율을 유지하면서 점진적으로 변하고, 고정된 조성에서 강성이 점진적으로 변화하였다. 하이드로겔은 'CS-A'에서 'CS-H'로 코드화하였다. 다른 시리즈에서는 콜라겐 농도가 3.5mg/ml로 고정되었고, 실크 농도는 0.175 %, 0.35 %, 1.05 %, 1.75 % 및 2.45 %로 변화하여, 다른 콜라겐/실크 비(콜라겐:실크 = 2:1, 1:1, 1:3, 1:5 및 1:7이고, 각각 'CS 2:1'에서 'CS 1:7'로 코드화)를 얻었다.

'CS 1:1'을 제조하는 전형적인 예에서, 0.02 N 아세트산 및 50 μl의 DMEM 20X로 0.5 ml 콜라겐을 제조하였고, 0.1 M NaOH로 중화시킨 다음 얼음에 두었다. 이와 별도로 실크 피브로인 용액 1ml를 초음파 장비(한국 공정 과학 기술 연구소, KSS-750DT)에 넣고 20 % 진폭에서 10 초 동안 초음파 처리하여 β-시트를 형성시켰다. 직후, 초음파 세척된 실크 용액 0.5ml를 콜라겐 용액에 첨가하고 균일하게 혼합하였다. 이 과정에서 버블 형성을 피하기 위해 특별히 주의를 기울였다. 혼합된 용액을 PDMS(polydimethylsiloxane) 몰드에 분주하고, 완전한 겔화를 위해 가습 분위기에서 37 ℃에서 배양하여 하이드로겔 샘플을 제조하였다.

실험예 1: 겔화 테스트

히드로겔의 겔화 시간을 바이얼-틸팅(vial-tilting) 방법에 의해 실온에서 측정하였다. 각 하이드로겔 용액(CS-A~H, 표 1 참조) 1 ml를 새로 준비하고(3번 반복), 혼합하고 신속하게 2 ml 유리 바이알에 옮겨서 뒤집을 때 겔화시간을 측정했다.

겔화 가능성을 관찰하기 위한 콜라겐 및 실크 하이드로겔의 다른 조성.

구분	중화	초음파	겔화	관찰결과
콜라겐	×		×	액체 형태. 투명으로부터 백색으로 색 전이
실크		×	×	액체 형태. 투명으로부터 백색으로 색 전이
콜라겐	○		○	불안정하고 약한 하이드로겔
실크		×	○	불안정하고 약한 하이드로겔
콜라겐	×		×	실크 및 상 분리의 실크 침전, 불안정
실크		○	×	실크 및 상 분리의 실크 침전, 불안정
콜라겐	○		○	안정한 하이드로겔
실크		○	○	안정한 하이드로겔

순수한 콜라겐 하이드로겔(1, 2.5 및 3.5mg/ml)의 겔화 시간을 다른 온도(4 ℃ 및 37 ℃)에서 측정하였다. 또한, 순수한 실크 피브로인 하이드로겔의 겔화 시간을 다양한 농도(1.75 %, 2 % 및 2.45 %) 및 상이한 초음파 처리 시간(5s, 10s 및 15s)에서 시험하였다.

콜라겐 및 실크에 어떠한 처리도 하지 않은 경우(콜라겐의 경우 pH 7.0로 중화하고, 실크의 경우 초음파 처리), 혼합된 용액은 겔이 될 수 없지만 실크 피브로인 단백질을 침전시킬 수 있는 콜라겐의 산성 pH로 인해 투명에서 백색으로의 색 변화만을 나타냈다. 콜라겐이 중화되고 실크는 초음파 처리되지 않았을 때 매우 불안정하고 약한 젤이 생성되었다. 반면에, 실크가 초음파 처리되었지만 콜라겐이 중화되지 않은 경우, 혼합된 용액의 낮은 pH는 겔화없이 실크를 응고시켰다. 콜라겐 중화 및 실크 초음파 처리가 모두 적용되었을 때에만, 혼합된 용액은 겔이 되었다.

그 다음, 넓은 조성 범위에서 겔화 시간을 측정하였다. 도 1에서 볼 수 있듯이, 본 발명자들은 등조성선에 초점을 맞췄다(콜라겐과 실크 농도 모두는 고정된 실크/콜라겐 비율, 즉 실크:콜라겐 = 1:10, 1:7, 1:5, 1,3.5, 및 1:2.5을 따라 규칙적으로 변한다). 첫째, 겔화를 일으키는 콜라겐 농도는 0.5 ~ 4 mg/ml의 범위에서 제한적으로 관찰되었다. 마찬가지로 실크 농도의 한계는 0.35 ~ 2.45 %로 확립되었다.

콜라겐 겔화 측정을 농도, 온도 및 이온 강도에 의존하여 진행하였다(도 1). 도 2a와 같이 농도(1, 2.5 및 3.5 mg/ml) 및 온도(실온 및 37 ℃)에 대한 콜라겐 겔화 시간을 플로팅했다. 1 mg/ml의 콜라겐에 대해, 실온(약 12 분)에서의 겔화 시간은 37 ℃(약 7.5 분)에서 감소했다. 또한, 콜라겐의 농도가 증가함에 따라 겔화 시간이 감소하였다; 각각 2.5 및 3.5 mg/ml에서 7.5 및 3.5 분.

유사하게, 순수한 실크의 겔화를 초음파 처리 시간과 실크 농도를 변경하여 조사하였다(도 2b). 겔화 시간은 초음파 처리 시간이 증가함에 따라 크게 감소하였다(예를 들어, 초음파 시간이 5 초에서 15 초로 증가함에 따라 겔화 시간이 27 분에서 7 분으로 변경됨). 또한 실크 농도를 1.75에서 2.45%로 증가시킨 결과 겔화 시간이 단축되었다.

이러한 순수한 콜라겐 및 실크 용액에 대한 겔화 정보에 기초하여, 콜라겐-실크 혼합물의 겔화 시간을 조사하였다. 도 2c는 등조성선(CS 1:7)을 따르는 겔화 시간 변화를 나타낸다. 콜라겐과 실크(‘CS-A’에서 ‘CS-D’까지)의 상대적으로 낮은 농도에서, 실크 및 콜라겐 모두의 농도 효과를 반영하여 농도 증가에 따라 겔화 시간은 거의 선형적으로 감소했는데(9.4 분에서 6.26 분까지). 이는 순수한 콜라겐 또는 실크 겔에서 유사하게 관찰되었다. 훨씬 더 높은 농도에서('CS-E'에서 'CS-H'로) 겔화 시간의 감소는 약 2 분까지 포화되는 것으로 나타났다.

다른 실험에서, 도 2d에 제공된 대로, 두 가지 중 어느 하나(콜라겐 또는 실크)의 고정된 농도에서 다른 성분의 농도를 변화시키면서 겔화 시간을 측정하였다. 0.75 %의 고정된 실크 농도에서, 콜라겐 농도의 증가는 겔화 시간을 점차적으로 감소시켰다. 반면, 1 mg/ml의 고정된 콜라겐 농도에서 실크 농도가 1 %를 초과하면 겔화가 급격히 감소했다.

겔화 속도 및 각 성분의 역할을 더 잘 이해하기 위해, 상이한 콜라겐/실크 비(CS 1:3 및 CS 1:5)를 연구하여 도 2e에 비교하였다. 순수한 실크(백색 막대) 또는 콜라겐(검은 색 막대)과 비교할 때, 이들의 혼합(해시 막대)은 모든 조성에서 실질적으로 겔화 시간의 감소를 나타냈다. 실크 겔화 촉진에 대한 콜라겐의 효과는 특히 실크 농도가 낮은 경우(모든 비율에서 0.7 % 미만) 두드러졌다. 실제로 CS 1:7에서 0.7 % 실크의 겔화에는 약 2 시간이 걸렸는데, 1mg/ml 콜라겐을 혼합한 경우 6.5 분으로 급격히 감소하였고, CS 1:3에서 2.5mg/ml 콜라겐을 혼합한 경우 4.5 분으로 감소하였다. 또한, 0.3-0.5 %의 실크 농도는 콜라겐과 혼합되지 않으면 초음파로 겔을 형성하지 못한다. CS 1:3에서는, 1 mg/ml 콜라겐을 혼합할 경우 약 7 분 내에 성공적으로 겔화가 유도되었다. 즉, 전반적으로 실크와 콜라겐의 혼합은 겔화 과정을 상당히 가속시켰으며, 이는 실크와 콜라겐 단백질간에 분자 상호 작용이 있을 수 있음을 시사한다.

실험예 2: 푸리에 변환 적외선(FT-IR)에 의한 하이드로겔 분석

감쇠된 총 반사율 FT-IR(ATR-FTIR) 분광학을 사용하여 복합 하이드로겔의 화학 결합 상태를 검출하였다. Gladi ATR 다이아몬드 크리스탈 액세서리를 사용하여 2000-400 cm^-1의 범위에서 FT-IR 분광계(Varian 640-IR, 호주)에서 4 cm^-1의 분해능으로 느린 스캐닝 스펙트럼(100 스캔/스펙트럼)(PIKE Technologies, USA)을 수집하였다.

분석에 사용된 샘플은 다음과 같이 제조하였다: 200㎕ 부피의 각 하이드로겔을 96 웰 플레이트에 넣고 겔화시켰다. 그 후 시료를 탈 이온수로 세척하여 과량의 염과 배지를 완전히 제거한 다음 -80 ℃에서 냉동하고 분석하기 전에 동결 건조하였다. 분석된 시료의 조성을 상기 표 1에 나타내었다.

FT-IR 분석을 통해 콜라겐과 실크 사이의 가능한 상호 작용의 결과인 화학 결합 구조의 변화를 조사하였다. 선험적 시험으로, 다른 초음파 처리 시간을 적용하여 β-시트 구조 형성의 시작을 확인함으로써 2 % 순수한 실크를 관찰하였다.

실크 피브로인에서 전형적으로 3 개의 아미드 띠(1700-1600 cm^-1에서 아미드 I, 1600-1500 cm^-1에서 아미드 II, 1350-1200 cm^-1에서 아미드 III)가 관찰되었다. 특히, C=O 신축에 기인하는 아미드 I 영역은 구조 변화를 시사한다. 실크 피브로인의 경우, 결정 형태인 β-시트 구조는 일반적으로 1620 cm^-1에서 확인되는 반면, 무작위 코일 및 α-나선 구조는 일반적으로 1640-1660 cm^-1에서 발견된다.

초음파 처리하지 않으면 실크 피브로인은 1638 cm^-1(1620 cm^-1에서 피크 없음)에서만 피크를 나타내어 비결정 구조를 시사한다. 추가로 5 초 동안 초음파 처리했을 때 1620 cm^-1에서 β-시트 특성 피크가 없이 약간의 변화가 있었다. 그러나, 10 초 이상의 초음파 처리 결과 β-시트 구조의 강한 피크가 나타났다. 1510 cm^-1에서 1515 cm^-1 로의 피크 이동이 아미드 II 영역에 나타나는데, 이는 β-시트의 2 차 N-H 벤딩과 C-N 스트레칭에 해당하는 것으로 알려져있다. 상기 피크 이동은 초음파 처리된 모든 시료에서 관찰되었는데, 이는 티로신 측쇄의 C-C 고리 신축 진동에 기인하며, 아미드 Ⅱ 영역에서의 이러한 현상은 베타-시트 구조의 입체 구조를 더 많이 채택하는 것으로 알려져있다.

다음으로, FT-IR 분석을 상이한 조성을 갖는 콜라겐-실크 복합 하이드로겔에 대해 수행하였다. 초음파처리된 순수 실크와 비교했을 때, 콜라겐-실크 복합체는 모두 1620 cm^-1(아미드 I 영역) 부근에서 유사한 피크 이동을 보였으며, 피크 강도는 아마도 다른 콜라겐/실크 함량에 기인하는 조성에 따라 달랐다. 이러한 결과는 실크의 β-시트 형성이 콜라겐의 존재에 의해 방해받지 않았다는 것을 나타낸다. 또한, 면밀한 시험 결과, 아미드 Ⅱ 영역의 피크는 콜라겐/실크 조성, 1510, 1515이나 1523 cm^-1에서 발생하는 상이한 세기 및 피크에 따라 가변적이었으며, 이는 두 성분 간의 분자 상호작용에 기인하여 실크의 β-시트에서 입체 구조 변화가 있을 수 있음을 반영한다.

실크와 콜라겐 간의 유사한 분자 상호 작용은 겔화 과정을 촉진시키고, 결과적으로 다음에 설명되는 바와 같이, 물리적 및 기계적 특성에 영향을 미친다.

실험예 3: 하이드로겔의 동력학적 기계 분석

하이드로겔의 동력학적 기계 분석을 수행하였다. 콜라겐-실크 하이드로겔의 점탄성 특성을 진동식 전단 유동계를 사용하여 조사하였다. 1:7로 고정된 콜라겐/실크 비를 갖는 시리즈 I(CS-A 내지 CS-H, 표 1) 및 가변 농도를 분석하였다. 시험을 위해, 각각의 하이드로겔 용액 1 ml를 직경 25 mm 및 높이 1.5 mm의 주형에 주조한 후 겔화시켰다. 하이드로겔 용액은 PDMS의 얇은 층으로 덮여 표면을 평탄하게 만들었다. 모든 측정은 25mm 평행판 형상을 갖는 선행 레오 메트릭 팽창 시스템(ARES LS2, TA 기기)을 사용하여 수행되었다.

선형 점탄성 범위(linear viscoelastic range, LVE)를 결정하기 위해 변형률 스윕 테스트를 주파수 1 rad/s에서 0.01 ~ 100 %의 변형률 범위에서 수행하였다. 그 후, 샘플을 LVE 범위 내에 있는 5 % 변형 하에서 0.1-100 rad/s의 스위핑 주파수 범위에서 테스트하였다. 하이드로겔의 전단 탄성률(저장 G '및 손실 G ")를 기록하고 손실 각도(tanθ = G"/G')도 계산하였다.

측정 결과, 열로 손실된 에너지로부터 저장된 에너지 및 점성 부분을 측정하는 탄성 성분을 나타내는 G'(저장 탄성율) 및 G"(손실률)이 각각 얻어졌다. 먼저, 하이드로겔의 G' 및 G"값을 진동수의 함수로 기록하고, 그 다음 하이드로겔의 평균 G' 값의 변화를 도 3에 그래프로 표시하였다.

실크 및 콜라겐 농도가 증가함에 따라 G' 값은 광범한 범위의 강성 수준, 즉 0.017 kPa(0.35 % 실크 + 0.5 mg/ml 콜라겐)에서 6.81 kPa(2.45 % 실크 + 3.5 mg/ml 콜라겐)에 걸쳐 거의 지수 함수적으로 증가했다. 특히, 매우 부드러운 하이드로겔의 G값은 'CS-A'의 경우 0.017 kPa, 'CS-B'의 경우 0.079 kPa 및 'CS-D'의 경우 0.385 kPa 이며, 모두 신경과 같은 매우 부드러운 조직에 대한 응용과 관련이 있다고 고려되었다.

또한, 중간 연질 하이드로겔(CS-C, CS-E 및 CS-F)의 G' 값은 0.278 kPa, 1.19 kPa, 1.53 kPa이었으며, 근육과 같은 중간 연조직에 대한 응용에 적합한 것으로 고려되었다. 반면에, 5.16 kPa(CS-G) 및 6.8 kPa(CS-H)의 G' 값을 기록하는 상대적으로 딱딱한 하이드로겔은 연골과 뼈와 같은 경질 조직에 유용할 것이다. 따라서, 본 발명의 콜라겐-실크 하이드로겔은 연질-경질 조직에 적절한 매트릭스 강성을 나타냄을 알 수 있다.

대부분의 복합 하이드로겔(CS-A’ 제외)의 저장 탄성률 G' 는 손실 계수(G")보다 유의하게 높았으며, 손실 계수(tanδ = G"/G')는 0.1보다 훨씬 낮았다(표 3). 이는 합성 하이드로겔이 점성 액체보다 탄성 고체처럼 거동함을 시사한다.

탄성 계수(E")는 비례성(푸아송 비율 = 0.5)을 가정하여 추정된 것이다.

실험적인 전단 계수 값과 함께, E' 값은 다음 공식에 의해 추정되었다:

E = 2·G (1 + υ),

여기서 υ는 푸아송 비로서 하이드로겔에서 단순화를 위해 0.5로 가정된다.

상기 표 3에 요약된 바와 같이, 추정된 E' 값은 0.05 kPa ~ 20.4 kPa 범위이며, 다른 곳에서 보고된 다른 하이드로겔의 강성 값과 직접 비교하여 콜라겐-실크 하이드로겔의 대략적인 적용 가능성을 제공한다. 강성이 등조성선을 따라 조정될 수 있다는 사실은 다양한 세포 반응에 대한 강성을 나타내는 매트릭스 플랫폼으로서 본 발명의 콜라겐-실크 복합 하이드로겔이 적용 가능함을 뒷받침한다.

통계적 분석

달리 언급되지 않는 한, 실험은 3 번 반복하여 수행하였다. 재현성을 확인하기 위해 모든 다른 실험을 적어도 두 번 수행하였다. 데이터는 평균 ± 1 표준 편차로 표시된다. 통계 분석은 두 가지 방법으로 분산 분석을 실시한 후 Bonferroni 사후 교정하였다(p <0.05).

실험예 4: 하이드로겔의 기계적 반응

점탄성 특성과 함께, 다른 응력 모드 하에서 하이드로겔의 기계적 반응을 수동으로 압축, 굽힘, 비틀림 또는 신장 모드의 응력을 적용하고 하이드로겔의 성형 거동을 관찰함으로써 조사하였다. 이를 위해 다양한 모양(얇은 직사각형, 관형 및 원통형)의 하이드로겔 시료를 제조하고 수동으로 다른 응력 모드(인장, 전단/비틀림 또는 압축)를 적용했다. 콜라겐-실크 복합체(대표 군으로서 CS 1:7, 'CS-F')를 순수한 실크 또는 콜라겐과 비교하였다.

먼저, 얇은 사각 형태의 하이드로겔을 시험하였다(도 4a). CS-F를 대조 복합 하이드로겔 그룹으로 선택하였고 순수 콜라겐(3.5mg/ml)과 순수 실크(2 %)를 대조 하이드로겔 그룹으로 선택하였다. 하이드로겔의 무결성, 굽힘 능력, 탄성 및 물 짜내기(water sqeezing-out)를 평평한 직사각형 모양을 사용하여 관찰하였다. 3 ml의 용액을 PDMS 몰드(3 cm x 3 cm x 0.3 mm)에 붓고 6 시간 동안 배양하여 완전히 겔화시켰다. 실크 하이드로겔은 성형되지 않은 상태에서 형상을 보존하지만, 크림성으로 인해 일체성을 유지하지 못하고 주걱으로 잡을 때 쉽게 부러졌다. 반대로, 콜라겐 및 콜라겐-실크 하이드로겔은 성형되지 않을 때 쉽게 구부러져서 탄성 거동을 특징으로 한다. 그렇더라도 콜라겐 하이드로겔은 지속적으로 수분을 잃고 시간이 지남에 따라 형태와 기계적 무결성이 변했으나, 콜라겐-실크 하이드로겔에서는 이러한 현상이 미미한 것으로 나타났다.

다음으로, 중공 관형의 하이드로겔을 제조하고 시험하였다(도 4b). 실크 하이드로겔은 다소 딱딱한 거동을 나타내었으며 구부리거나 꼬여지면 쉽게 부러졌다. 또한 중공 코어를 통해 주입된 염료 용액이 막혀 채널 내부로 쉽게 흐르지 않았다. 반면에 콜라겐 하이드로젤은 비틀림, 굽힘, 긴장 등의 높은 응력에 저항하는 것처럼 보였으나 모양의 변화는 소성 항복과 많은 수분 손실을 동반했다. 대조적으로, 복합 하이드로겔은 적용된 응력에 대해 훨씬 높은 탄성을 보였으며, 수분 손실없이 쎈 구부러짐, 뒤틀림 또는 당김 응력에 저항하여 모양을 잘 유지했다.

코어에서 직경 2mm의 맨드릴(mandrel)이 있는 1ml 주사기에서 하이드로겔을 제조하였다. 하이드로겔의 압축력에 대한 내성을 원통형(직경 10mm x 높이 15mm)을 사용하여 관찰하였다.

콜라겐 하이드로겔의 경우, 성형되지 않은 상태에서 많은 수분 손실로 인해 초기 모양까지도 보존할 수 없었다(도 5a). 일단 물이 충분하게 압착되면, 콜라겐 하이드로겔은 하나의 반복 압축에 의해 형상을 크게 변화시키지 않으며, 물로 짜낸 압출 콜라겐 겔에서 보고된 바로는 탄력적이지 않고 오히려 강성이었다.

반면에, 실크 하이드로겔은 수분 손실없이 작은 반복 하중(cyclic load)에 대해 저항하였다. 또한, 복합 하이드로겔은 적재/하적 사이클 중에 탄성 변형이 작은 것으로 나타났다. 실크와 복합 하이드로겔 모두 작은 반복 하중 하에서 유사하게 행동하는 것으로 보이지만 높은 압축 하중 하에서는 명확한 차이를 보였다(도 5b). 증가하는 응력에 대한 지속적인 압축은 실크 하이드로겔의 실패로 이어진다.

그러나, 복합 하이드로겔은 우수한 탄성 특성을 반영하여 높은 응력에 견딜 수 있다. 관찰된 것처럼 콜라겐-실크 하이드로겔은 흥미로운 기계적 거동을 보여준다. 즉, 긴장, 굽힘, 비틀림/뒤틀림, 압축 등의 다양한 응력 모드에서 모양을 동적으로 변화시키고 소성 파괴(plastic failure)에 저항하도록 매우 탄력성이 있다. 이는 수분과 수율을 잃기 쉬운 순수한 콜라겐과, 탄성이지 않으나 단단하고 성형하기 어려운 순수한 실크에서와 분명히 다른 것이다. 즉, 본 발명의 복합 하이드로겔은 개별 하이드로겔에 비해, 많은 탄성 조직에 적용가능하다는 점에서 개별 하이드로겔에 비해 장점을 갖는다.

실험예 5: 하이드로겔의 세포 반응

1 시간, 2 시간 및 3 시간에 세포 고정과 확산 거동을 조사하였다. 각 배양 시간에 각 시료를 4 % 파라 포름알데히드로 20 분간 고정시킨 후 0.1 % Triton X-100으로 7 분간 처리하였다. PBS로 세척한 후, 샘플을 용액(PBS 중 3 % 소 혈청 알부민)으로 30 분 동안 차단시켰다.

다음으로, F-액틴 필라멘트 및 핵을 각각 Alexa Fluor 546-접합 팔로이딘(Invitrogen, A22283) 및 DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)(Invitrogen, D1306)로 염색하였다. iRIS^TM 디지털 셀 이미지 시스템(Logos Biosystems사 제조)과 공 촛점 레이저 스캐닝 현미경(Zeiss LSM 700)을 사용하여 세포 이미지를 수득하였다. 세포 확산 면적 및 고정된 세포 수는 각 그룹에 대해 무작위로 선택된 10 개의 프레임으로부터 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 계산하였다.

골수에서 얻은 인간 중간엽 줄기 세포(hMSC; MSC-003, Rooster Bio, US)를 시험관내 연구에 사용했다. 세포를 제조사의 지침에 따라 High Performance Media Kit(RoosterBio, KT-001)로 스케일링하였다. 세포 배양을 위한 하이드로겔 샘플을 PDMS 몰드를 사용하여 디스크 모양(직경 10mm x 높이 200μm)으로 준비했다.

CS-C, CS-F, CS-H, 순수 콜라겐 3.5 mg/ml, 순수 실크 2 %를 사용하였다. 세포를 접종하기 전에 80 μl의 배지 방울을 각 하이드로겔에 첨가하고 1 시간 동안 배양한 다음 제거했다. 1 x 10⁴(60 μl)의 세포를 각 하이드로겔에 뿌리고 부착시켰다.

인간 간엽 줄기 세포(hMSC)를 하이드로겔 위에 배양하고 고정 및 확산 거동을 최대 4 시간 동안 모니터링하였다(도 6). 다른 강성도(CS-C, CS-F, 및 CS-H)를 갖는 등조성선 CS 1:7에서 대표적인 복합 하이드로겔을 사용하였고, 순수 콜라겐과 순수 실크 하이드로겔을 비교하였다. 4 시간 후, hMSC는 세포 부착에 거의 포화를 보였다.

계산된 부착 세포 수는 순수한 실크(콜라겐의 82 %)보다 순수한 콜라겐과 콜라겐-실크 복합체(콜라겐의 92-99 %)에서 약간 더 높았다(도 6a). 그러나 형광 세포 형태를 면밀히 살펴보면 순수한 실크 상의 세포는 제한된 확산으로 둥글었지만 콜라겐과 콜라겐-실크 복합체 상의 세포는 활발히 확산되어 있음을 알 수 있다(도 6b). 복합 하이드로겔 군 사이의 초기 세포 부착 수준 및 형태에는 유의한 차이가 없었다.

초기 시점(1, 2, 3 시간)에서는 세포 고정과 확산 거동이 유의하게 달랐다 (도 6c, d). 순수한 콜라겐 하이드로겔 상의 hMSC는 1 시간 만큼 빨리 세포 골격 확장과 함께 고도로 신장되었지만, 순수한 실크 하이드로겔 상의 세포는 최대 3 시간까지 거의 세포 골격 과정 없이 대부분 라운드형이었다.

반면에, 콜라겐-실크 복합 하이드로겔 상의 세포는 초기에는 라운드형이었지만 시간에 따라 신속하게 발달되어 광범위한 세포 골격 과정을 보였다. 세포 확산을 정량화하였다. 순수한 콜라겐 상의 세포는 모든 시점에서 가장 넓은 확산 영역을 보였고, 순수한 실크 상의 세포는 가장 낮은 확산 영역을 보였다. 콜라겐-실크 복합 하이드로겔은 또한 순수한 실크 하이드로겔보다 유의하게 높은 수준으로 실질적인 세포 확산을 허용했다. B. mori의 실크는 아미노산 구조에서 RGD 서열과 같은 세포 접착 리간드가 부족하여 초기 세포 활동이 제한적이라는 사실이 알려져있다. 따라서, 실크 하이드로겔에 배합된 콜라겐은 hMSC 접착을 촉진시키고 접착 리간드를 통해 퍼질 수 있다.

hMSC를 단단히 부착시키고 확산시킨 후, 시간에 따라 분열시켜 증식시키고, 3 일까지 배양하는 동안 형광 현미경으로 조사하였다(도 7a). 순수한 콜라겐 하이드로겔 상의 세포는 1 일째에 매우 신장되어 콜라겐 섬유소를 따라 세포 골격 과정이 진행된다.

장기간의 배양(2-3 일)에서 세포가 활발히 증식하여 표면을 거의 완전히 덮었다. 순수한 실크 하이드로겔에서, 1-2 일째, 대부분의 세포는 여전히 라운드형이었고 일부는 다각형 모양으로 퍼졌고, 3 일째에는 콜라겐 하이드로겔에서 관찰된 것과 유사하게 융합에 이르기까지 고도로 확산되어 증식했다. 3 일째에, hMSC는 세포 성장과 확산을 유의하게 조력할 수 있는 접착성 단백질을 포함하는 ECM 분자를 분비할 수 있다.

콜라겐-실크 복합체 하이드로겔 상에서, 1일째처럼 초기에 세포는 순수한 콜라겐 하이드로겔 상에서와 유사하게 활발히 퍼지지만, 그 형상은 기본 매트릭스 미세 구조를 반영하는 다각형(순수한 콜라겐에서의 연장된 형태와는 다른)이었다. 즉, 콜라겐-실크 네트워크는 콜라겐성 섬유 형태를 가지지 않지만, 콜라겐 분자가 공간적으로 분포되어 초기 세포 확산 및 증식을 조력하는 일반적인 무작위 다공성 형태(도 S4에서 언급된 순수한 실크 네트워크와 유사)를 나타낸다.

2 ~ 3 일의 장기간의 배양으로, 복합 하이드로겔 상의 세포는 그룹에 따라 다르게 행동한다. 즉, CS-F 및 CS-H 상에서는 확산을 지속하고 활발하게 증식하여 거의 표면을 완전하게 덮어, 순수한 콜라겐 하이드로겔 상의 세포와 유사하였지만, CS-C 상의 세포는 2 일에서 3 일까지 증식 잠재력이 줄어드는 것으로 보였다.

1 일부터 3 일까지의 배양 동안 측정된 세포 수는 그룹간에 유의한 차이를 나타냈다; CS-F와 CS-H는 시간에 따라 세포의 활발한 증식을 가능하게했지만 CS-F는 그렇지 않았다(도 7b). 상대적으로 높은 강성으로 인하여 조밀하게 네트워크화된 하이드로겔(CS-F 및 CS-H)은 hMSC가 2 일에서 3 일까지 다각형 모양을 갖는 모든 방향의 확산 및 활발한 성장을 유지하게 하지만, 느슨하게 네트워크화된 하이드로겔(CS-C) 상에서의 세포의 세포 골격 과정은 그 연질 특성으로 인해, 2 일째 다각형 모양을 유지하고, 오히려 더욱 신장된 형태로 변경된 후 네트워크 구조를 재구성할 수 있다. 3일 째에 히드로겔의 약 90 %가 수축되었고, 세포 수는 1 일째의 수의 3 배로 증가하였다(도 7c). 실제로, 이 현상은 콜라겐겔을 포함하는 세포 배양에서 일반적으로 관찰되어 왔으며 많은 생의학적 용도를 위해 중요한 관심사로 간주되어 왔다. 콜라겐 섬유에 작용하는 세포의 견인력은 세포 집단이 증가하는 동안 일반적일 수 있으며, 이는 겔의 유의한 수축을 가져온다.

순수한 콜라겐과는 달리, 순수한 실크 하이드로겔은 3일까지 배양 중에 그러한 수축을 나타내지 않았다. 또한, 모든 콜라겐-실크 하이드로겔 그룹은 수축없이 초기 형태를 보존했다. 3 일째 순수 콜라겐과 복합 하이드로겔의 세포 증식 수준이 비슷하다면, 세포 작용력은 비슷할 수 있다. 따라서, 복합 하이드로겔의 겔 수축에 대한 더 높은 저항성은 복합 네트워크의 향상된 기계적 특성에 기인하는 것으로 보인다. 즉, 본 발명의 복합 하이드로겔은 실크-콜라겐 네트워크의 보다 탄성적인 특성으로 인해 순수한 콜라겐보다 세포에 더 동력학적으로 반응하여 세포 견인력에 대한 항복(순수한 콜라겐 네트워크 상에 발생하는 현상)에 저항할 수 있다.

실험예 6: 하이드로겔 내의 세포 캡슐화

본 발명의 복합 하이드로겔이 세포 고정, 확산 및 증식을 포함하는 hMSC의 2D 배양을 위한 우수한 매트릭스 조건을 제공함을 확인한 후, 하이드로겔 제조 중에 이들을 캡슐화하여 3D 조건에서 세포를 배양하였다. 세포 캡슐화를 위해 문헌[X. Wang, J.A. et al., Biomaterials. 29 (2008) 10541064]과 같이 하이드로겔 1 ml에 100 μL의 총 5 x 10⁵ 세포를 첨가했다. 세포는 초음파 처리된 실크 용액과 혼합하기 전에 pH 7.0에서 중화시킨 후에 항상 콜라겐 용액에 첨가하였다. 세포가 포매된 하이드로겔(35 ㎕)을 PDMS 몰드에 넣고 2 시간 동안 배양하고, 배지를 첨가하고 다른 기간 동안 배양하였다.

캡슐화된 세포는 생존하고 성장할 수 있었지만, 높은 실크 농도로 인해 강성 수준이 매우 높아(63-441 kPa), 실크 하이드로겔을 뼈와 같은 경조직 공학에만 사용하도록 제한되었다. 그러나, 본 발명에서는 훨씬 낮은 농도의 실크(0.35 % - 2.45 %)가 콜라겐과 결합하여 세포 캡슐화 하이드로겔로 쉽게 제조되고, 그 결과 강성이 훨씬 부드러운 범위(0.017-6.81 kPa)에서 뇌 및 근육과 같은 연조직에 적합한 세포 캡슐화 하이드로겔을 생성할 수 있다.

등조성선(CS 1:7)에 있지만 실크-콜라겐 농도가 다른 세 가지 복합 하이드로겔(각각, CS-C, CS-F 및 CS-H)에 hMSC를 캡슐화한 다음, 성장 배지에서 14 일 동안 배양하는 동안 세포 생존성을 관찰하였다. 라이브/데드 세포 얼룩 이미지(도 8)에서 드러난 바와 같이, 대부분의 세포는 모든 복합체 하이드로겔에서 장기 배양 동안 살아있음을 확인하였다.

Claims

(a) 콜라겐을 중화처리하여 α-나선 구조의 콜라겐으로 자기조립하고, 실크 피브로인을 초음파처리하여 β-시트 구조의 실크 피브로인으로 자기조립하는 단계;
(b) 상기α-나선 구조의 콜라겐 0.5 ~ 4 mg/ml와 β-시트 구조의 실크 피브로인 0.35 ~ 2.45 %(w/v)를 혼합하여 겔화하고, 분자 상호 작용에 의한 상호침투 네트워크를 형성하는 단계를 포함하는,
콜라겐 및 실크 피브로인을 포함하는 세포 캡슐화용 복합 하이드로겔의 제조방법.
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제1항에 있어서,
콜라겐 농도 및 실크 피브로인 농도의 조정에 의해 0.05 kPa 내지 40 kPa의 범위 내에서 강성을 조정하는 것인, 제조방법.
제1항에 있어서, 중화처리 전의 콜라겐은 삼중나선 구조인 것인, 제조방법.
제1항에 있어서, 초음파 처리 시간은 20% 진폭에서 10초 내지 60초인 것인, 제조방법.
제1항에 있어서, 등조성선을 따라 콜라겐 농도 및 실크 피브로인 농도를 조정하여 강성을 조정하는 것인, 제조방법.
제1항에 있어서, 분자 상호 작용은 수소 결합인 것인, 제조방법.
중화처리되어 자기조립된 α-나선 구조의 콜라겐 0.5 ~ 4 mg/ml와 초음파처리되어 자기조립된 β-시트 구조의 실크 피브로인 0.35 ~ 2.45 %(w/v)를 혼합하여 겔화하고, α-나선 구조의 콜라겐과 β-시트 구조의 실크 피브로인 간에 수소결합에 의한 상호침투 네트워크가 형성되고, 0.05 kPa 내지 40 kPa의 범위 내에서 조정가능한 강성을 갖는, 콜라겐 및 실크 피브로인을 포함하는 세포 캡슐화용 복합 하이드로겔.