KR102015448B1 - 검팽나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 조성물 - Google Patents
검팽나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 검팽나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 조성물 등에 관한 것으로서, 본 발명의 조성물은 IκBα, IKKα/β, AKT, p85, 또는 Src의 인산화를 억제하여 NF-κB 활성을 억제하고, 염증성 사이토카인인 COX-2, iNOS, 및 TNF-α의 발현을 억제하고, 염증성 인자인 NO의 생성을 억제하여 염증의 억제 또는 개선시키는 효과가 있는바, 본 발명의 조성물은 의약용, 의약부외용, 기능성 바이오 소재용, 및 기능성 식품소재용 등 다양한 방면으로 이용이 가능할 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 검팽나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 조성물 등에 관한 것이다.
염증 반응(inflammation)은 조직(세포)의 손상이나 외부감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발물질)에 감염되었을 때, 각종 염증 매개인자 및 면역세포가 관련되어 효소의 활성화, 염증매개물질 분비, 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종, 발열, 통증 등의 외적 증상을 나타낸다. 정상인 경우의 염증반응은 외부감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하여 생명체 기능 회복 작용을 하지만, 항원이 제거되지 않거나 내부물질이 원인이 되어 염증반응이 과도하거나 지속적으로 일어나는 경우 에는 오히려 점막손상을 촉진하고, 일부에서는 류마티스 관절염, 골다공증, 패혈증, 혈관 질환, 암 등을 유도한 다. 즉, 염증 반응은 상처, 미생물 감염 등에 대항하는 숙주의 방어기제에 따른 병리학적인 기작 중 가장 중요한 반응이지만, 지속적이고 과도한 염증반응은 조직을 손상시킨다.
대식세포(macrophage)는 이러한 염증 반응을 조절하는 가장 대표적인 면역세포로서, 유해한 환경에서 숙주의 방어기작에 중요한 역할을 하며, 자가면역질환과 같은 다양한 질병의 진행과정에 관여한다. 지질다당류와 같은 염증 자극인자들은 대식세포를 활성화시킬 수 있으며, 활성화된 대식세포는 종양괴사인자-알파 (tumor necrosis factor-α, TNF-α), 인터루킨-6 (interleukin-6, IL-6) 및 IL-1β와 같은 다양한 염증성 매개체를 생성하고, 유도형 NO생성효소 (inducible nitric oxide synthase, iNOS)와 고리형 산소화효소2 (cyclooxygenase-2, COX-2)를 합성하여 일산화 질소(nitric oxide, NO) 및 PGE 2 (prostaglandin E 2 )를 생성한다.
한편, Lipopolysaccharide(LPS)는 그람 음성균의 외막 구성성분이며 염증성 인자로 알려져 있있으며, 골수에서 생산되는 대식세포(macrophage)는 미량의 LPS에 의해 활성화되고 다양한 사이토카인(cytokine), 과산화 수소(hydrogen peroxide, H2O2), 및 일산화 질소 등의 각종 세포독성물질을 분비하여 면역기구로서 기능한다.
NO는 free radical 중의 하나로서, 매우 불안정한 분자이며, 산소나 과산화물(superoxide)에 의하여 NO2, N2O3, N2O4, nitrite(NO2 -) 및 nitrate(NO3 -)와 같은 안정한 nitrogen oxide로 바꾸어진다. NO는 L-arginine으로부터 NO합성효소(nitric oxide synthase, NOS)에 의해 만들어지며, NOS는 항상성 유지에 필요한 NO를 생성하는 endothelial NOS (eNOS) 및 neuronal NOS (nNOS)와 염증성 인자 등에 의해 유도되는 inducible NOS (유도형 NO생성효소, iNOS)로 분류할 수 있다. 특히, LPS와 같은 자극에 의해 유도된 iNOS인 경우 오랜 기간 동안 다량의 NO를 생성하게 되고, 생성된 NO는 guanyl cyclase의 활성과 동시에 세포독성을 나타내게 된다. 또한, 체내 염증반응에서 과량의 NO 및 PGE2 등의 염증인자가 iNOS 및 고리형 산소화효소2에 의해 형성되는데, 일반적으로 NO의 형성은 박테리아를 죽이거나 종양을 제거시키는 중요한 역할을 하지만 병리학적인 원인에 의한 과도한 NO의 형성은 염증을 유발시키게 되며, 조직의 손상, 유전자 변이 및 신경 손상 등을 유발한다. 염증 반응이 일어나면 대식세포의 고리형 산소화효소2에 의해 PGE2 가 생성되는데 이것은 통증과 발열에 주로 관여하는 염증 인자이다. 따라서, 염증 반응에서 생성되는 NO 및 COX-2 등의 염증성 인자 생성 억제를 확인함으로써 항염증 효과를 확인할 수 있다.
최근 질병을 예방 또는 치료할 수 있는 기능은 식품이나 식물체도 가지고 있다는 것이 보고되고 있고, 보다 건강하고 오래 살고자 하는 인류의 필요에 따라, 세계적으로 다양한 자원으로부터 다양한 생리기능을 가진 물질을 탐색하는 연구가 활발히 진행되고 있으며, 그 중에서도 특히 식물자원에 포함된 화합물에 많은 관심이 집중되고 있다.
한편, 검팽나무(Celtis choseniana)는 쐐기풀목 느릅나무과 쌍떡잎식물로서 낙엽활엽 교목에 속한다. 주로 경상북도 ㅇ충청남도 ㅇ경기도 ㅇ황해도 등지에 분포하며, 산기슭에서 높이 25m까지 자란다. 검팽나무는 건축재, 가구재, 정자목, 신탄재 등으로 이용되고, 열매는 식용으로 이용되고 있으며, 최근 검팽나무 추출물이 전립선 질환에 치료 효과에 대해 있음에 대해 개시된 바 있다(한국특허공보 제10-1688018호). 그러나 검팽나무 추출물에 전립선암 세포주에서 안드로겐 수용체 및 전립성 특이 항원의 발현을 억제하는 것에 효과 있음을 개시하고 있을 뿐이고 검팽나무 추출물이 염증반응을 억제하여 염증성 질환의 예방 또는 치료 용도로 사용할 수 있다는 점에 대해서는 아직까지 전혀 알려진 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위한 것으로서 검팽나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물과 염증 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 검팽나무(Celtis choseniana) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 검팽나무 추출물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 질환 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 검팽나무 추출물의 염증성 질환 치료 용도를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 염증성 질환은 알레르기성 질환, 염증성 장질환, 죽상동맥경화, 염증성 콜라겐 혈관 질환, 사구체신염, 염증성 피부 질환, 유육종증, 망막염, 위염, 간염, 장염, 복막염, 관절염, 편도선염, 인후염, 기관지염, 폐렴, 췌장염, 패혈증, 및 신장염으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 추출물은 물, C1내지 C4의 저급 알코올, 다가 알코올, 탄화수소계 용매 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 용매로 추출한 것일 수 있으며, 바람직하게는 메탄올을 용매로 추출한 것일 수 있고 더욱 바람직하게는 99% 메탄올 용매를 이용하여 추출한 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 검팽나무 추출물은 일산화 질소 (nitric oxide, NO) 생성을 억제하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 검팽나무 추출물은 COX-2(cyclooxygenase-2), iNOS, 또는 TNF-α의 발현을 억제하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 검팽나무 추출물은 IκBα, IKKα/β, AKT, p85, 또는 Src의 인산화를 억제하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 검팽나무 추출물은 NF-κB 활성을 억제하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 검팽나무 추출물을 유효성분으로 포함하는, 염증 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 검팽나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 IκBα, IKKα/β, AKT, p85, 또는 Src의 인산화를 억제하여 NF-κB 활성을 억제하고, 염증성 사이토카인인 COX-2, iNOS, 및 TNF-α의 발현을 억제하고, 염증성 인자인 NO의 생성을 억제하여 염증의 억제 또는 개선시키는 효과가 있다. 또한, 검팽나무 추출물이 복막염 및 위염 동물모델에서 대식세포의 증식 및 염증부위의 감소에 탁월한 효과 있음을 확인하였는바, 이에 본 발명은 검팽나무 추출물의 염증성 및/또는 자가면역성 질환의 예방, 개선, 또는 치료의 새로운 용도를 제시하고, 본 발명의 제공에 따라 검팽나무 추출물이 의약용, 의약부외용, 기능성 바이오 소재용, 및 기능성 식품소재용 등 다양한 방면으로 이용이 가능할 것으로 기대된다.
도 1은 검팽나무 추출물의 처리에 따른 세포 생존율을 나타낸 도면이다.
도 2는 LPS로 자극을 준 RAW264.7 세포에서 검팽나무 추출물의 처리에 따른 NO 생성량 감소를 나타낸 도면이다.
도 3은 LPS로 자극을 준 복강 내 대식세포에서 검팽나무 추출물의 처리에 따른 NO 생성량 감소를 나타낸 도면이다.
도 4는 검팽나무 추출물 내에 존재하는 항염증 활성 성분의 비율을 확인한 도면이다.
도 5a는 LPS로 자극을 준 RAW264.7 세포에서 검팽나무 추출물의 처리에 따라 iNOS, COX-2, 및 TNF-α의 mRNA 수준이 감소함을 확인한 도면이다.
도 5b는 LPS로 자극을 준 RAW264.7 세포에서 검팽나무 추출물의 처리에 따라 iNOS 및 COX-2 단백질 수준이 감소함을 확인한 도면이다.
도 6은 LPS로 자극을 준 RAW264.7 세포에서 검팽나무 추출물의 처리에 따라 NF-κB 관련 단백질인 p50의 핵 내 이동이 감소됨을 확인한 도면이다.
도 7a는 LPS로 자극을 준 RAW264.7 세포에서 검팽나무 추출물의 처리에 따라 NF-κB 관련 신호 전달 단백질인 Src, p85, AKT, IKKα/β, IκBα의 인산화가 감소됨을 확인한 도면이다.
도 7b는 LPS로 자극을 준 RAW264.7 세포에서 검팽나무 추출물의 처리 직후(2, 3, 및 5분 후)에 NF-κB 관련 신호 전달 단백질인 Src 및 p85의 인산화가 감소됨을 확인한 도면이다.
도 8은 Src 단백질 과발현 돌연변이 HEK 293 세포에 검팽나무 추출물의 처리에 따라 Src 및 AKT의 인산화가 감소됨을 확인한 도면이다.
도 9는 LPS로 자극을 준 RAW264.7 세포에서 검팽나무 추출물의 처리에 따라 인산화된 Src과 결합하는 p85가 감소함을 확인한 도면이다.
도 10은 검팽나무 추출물이 대식세포의 염증신호 전달 체계에서 Src 단백질을 표적으로 하여 염증 억제에 미치는 단계적 반응을 도식화한 도면이다.
도 11은 복막염 동물 모델에서 검팽나무 추출물이 복막 내 백혈구의 수를 감소시킴을 확인한 도면이다.
도 12는 급성 위염 동물 모델에서 검팽나무 추출물이 염증의 정도를 완화시킴을 확인한 도면이다.
도 2는 LPS로 자극을 준 RAW264.7 세포에서 검팽나무 추출물의 처리에 따른 NO 생성량 감소를 나타낸 도면이다.
도 3은 LPS로 자극을 준 복강 내 대식세포에서 검팽나무 추출물의 처리에 따른 NO 생성량 감소를 나타낸 도면이다.
도 4는 검팽나무 추출물 내에 존재하는 항염증 활성 성분의 비율을 확인한 도면이다.
도 5a는 LPS로 자극을 준 RAW264.7 세포에서 검팽나무 추출물의 처리에 따라 iNOS, COX-2, 및 TNF-α의 mRNA 수준이 감소함을 확인한 도면이다.
도 5b는 LPS로 자극을 준 RAW264.7 세포에서 검팽나무 추출물의 처리에 따라 iNOS 및 COX-2 단백질 수준이 감소함을 확인한 도면이다.
도 6은 LPS로 자극을 준 RAW264.7 세포에서 검팽나무 추출물의 처리에 따라 NF-κB 관련 단백질인 p50의 핵 내 이동이 감소됨을 확인한 도면이다.
도 7a는 LPS로 자극을 준 RAW264.7 세포에서 검팽나무 추출물의 처리에 따라 NF-κB 관련 신호 전달 단백질인 Src, p85, AKT, IKKα/β, IκBα의 인산화가 감소됨을 확인한 도면이다.
도 7b는 LPS로 자극을 준 RAW264.7 세포에서 검팽나무 추출물의 처리 직후(2, 3, 및 5분 후)에 NF-κB 관련 신호 전달 단백질인 Src 및 p85의 인산화가 감소됨을 확인한 도면이다.
도 8은 Src 단백질 과발현 돌연변이 HEK 293 세포에 검팽나무 추출물의 처리에 따라 Src 및 AKT의 인산화가 감소됨을 확인한 도면이다.
도 9는 LPS로 자극을 준 RAW264.7 세포에서 검팽나무 추출물의 처리에 따라 인산화된 Src과 결합하는 p85가 감소함을 확인한 도면이다.
도 10은 검팽나무 추출물이 대식세포의 염증신호 전달 체계에서 Src 단백질을 표적으로 하여 염증 억제에 미치는 단계적 반응을 도식화한 도면이다.
도 11은 복막염 동물 모델에서 검팽나무 추출물이 복막 내 백혈구의 수를 감소시킴을 확인한 도면이다.
도 12는 급성 위염 동물 모델에서 검팽나무 추출물이 염증의 정도를 완화시킴을 확인한 도면이다.
본 발명자들은 식물자원유래의 생리활성이 우수한 기능성 물질을 탐색하던 중 기존에 연구가 전무한 검팽나무 추출물의 항염증 효과를 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 검팽나무(Celtis choseniana) 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 염증성 질환의 예방 또는 치료는 검팽나무 추출물의 세포 독성이 나타나지 않는 선에서 예방 또는 치료를 의미하는 것으로서, 본 발명의 일 실시예에서는 검팽나무 추출물의 세포독성을 알아보고자 MTT assay를 수행하엿다. 구체적으로, 쥐의 대식세포 세포주인 RAW264.7 세포와 쥐의 복강에서 분리한 대식세포에 검팽나무 추출물을 0, 12.5, 25, 50, 또는 100 ㎍/㎖ 처리하고 24시간 동안 배양하여 세포 생존율을 확인한 결과, 아무것도 첨가하지 않은 음성 대조군과 NO억제제인 L-NAME 0.5 또는 1 μM를 처리한 양성 대조군과 비교하여 검팽나무 추출물의 처리에 따라 세포 생존률에 유의한 차이가 없음을 확인하였는바, 본 발명의 검팽나무 추출물이 세포독성이 없으며, 이는 검팽나무 추출물이 항염증용 조성물로 개체에 적용되는 경우 그 부작용이 없거나 미미함을 의미한다(실시예 2 참조).
또한, 본 발명의 일 실시예에서, 본 발명자들은 RAW264.7 세포와 쥐의 복강에서 분리한 대식세포에 검팽나무 추출물을 0, 12.5, 25, 50, 또는 100 ㎍/㎖ 처리하고 강한 면역반응을 야기하는 LPS(Lipopolysaccharides)를 처리한 후, 상기 세포의 배양 상등액에 존재하는 염증성 인자인 일산화 질소(nitric oxide, NO)의 농도를 확인한 결과, LPS 자극만 주고 아무것도 처리하지 않은 음성 대조군과 비교하여 검팽나무 추출물을 처리한 세포에서 일산화 질소의 생성이 감소하고, 검팽나무 추출물 처리에 따른 일산화 질소 생성 감소는 검팽나무 추출물의 농도에 의존적임을 확인하였다(실시예 3 및 4 참조).
또한, 본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 검팽나무 추출물이 포함하는 항염증 활성 성분의 비율을 확인한 결과, 검팽나무 추출물이 항염증 활성의 표준물질인 퀘르세틴(Quercetin), 루테올린(Luteolin), 및 켐페롤(Kaempferol)을 포함하고 있으며 각각 0.034%, 0.25%, 0.092%의 비율로 함유 하고 있음을 확인하였다(실시예 5 참조)
또한, 본 발명의 일 실시예에서, 본 발명자들은 검팽나무 추출물의 처리가 염증관련 사이토카인의 발현에 미치는 영향을 확인하고자, RAW264.7 세포에 검팽나무 추출물을 0, 50, 또는 100 ㎍/㎖ 처리하고 LPS 자극을 준 후, RAW264.7 세포의 mRNA를 수득하여 염증 관련 사이토카인인 iNOS, COX-2, 및 TNF-α의 발현 수준을 확인한 결과, 검팽나무 추출물 처리에 의해 iNOS, COX-2, 및 TNF-α의 mRNA 발현 수준이 감소됨을 확인할 수 있었으며, 특히, iNOS 및 COX-2의 mRNA 발현 수준이 현저하게 감소됨을 확인하였다(실시예 6 참조).
또한, 본 발명의 일 실시예에서, 본 발명자들은 검팽나무 추출물의 염증반응의 신호 전달에 있어 그 작용을 보다 구체적으로 확인하고자, RAW264.7 세포에 검팽나무 추출물을 0, 50, 또는 100 ㎍/㎖ 처리하고 LPS 자극을 준 후 인산화된 IκBα, IKKα/β, AKT, p85, 및 Src의 양을 확인한 결과, 검팽나무 추출물 처리에 의해 IκBα, IKKα/β, AKT, p85, 및 Src의 인산화가 감소되어 그 활성이 억제되고, 궁극적으로 NF-κB의 활성을 억제함을 확인할 수 있었다(실시예 8 참조).
보다 구체적으로 검팽나무 추출물이 염증 신호 전달 체계에서 타겟으로 하는 단백질을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에서, Src 단백질 과발현 세포주를 구축하고 검팽나무 추출물을 처리하여 p-AKT, AKT, p-Src, Src의 발현 수준을 확인한 결과, Src 단백질이 검팽나무 추출물의 표적 단백질임을 확인하였다(실시예 9 참조).
또한, 본 발명자들은 in vivo 에서 검팽나무 추출물의 염증 치료 효과를 확인하기 위하여 복막염 동물 모델과 급성 위염 동물 모델에서 검팽나무 추출물을 처리한 결과, 복막염 ICR mice에 검팽나무 추출물을 처리한 경우 복막 내 백혈구 숫자가 감소됨을 확인하였고, 급성 위염 mice에 검팽나무 추출물을 처리한 경우 음성 대조군과 비교하여 염증의 발생 정도가 현저하게 감소됨을 확인하였다(실시예 10 참조).
본 발명에서 "검팽나무(Celtis choseniana)"는 쐐기풀목 느릅나무과에 속하는 낙엽활엽 교목으로 열매는 가을에 채취하여 생식하며, 목재는 단단하여 건축재, 가구재, 운동구, 도마, 절구 등으로 많이 이용되며, 검팽나무 추출물의 약리작용과 면역학적 상관관계, 생리학적 연구는 전무하다.
본 발명에서 "염증성 질환"이란 염증을 주병변으로 하는 질병으로, 염증성 질환의 비제한적인 예로는 알레르기성 질환, 염증성 장 질환, 죽상동맥경화, 염증성 콜라겐 혈관 질환, 사구체신염, 염증성 피부 질환, 유육종증, 망막염, 위염, 간염, 장염, 복막염, 관절염, 편도선염, 인후염, 기관지염, 폐렴, 췌장염, 패혈증, 및 신장염 등이 있으며, 바람직하게는 위염 및 복막염일 수 있고, 더욱 바람직하게는 급성 위염 및 복막염일 수 있다.
본 발명의 상기 검팽나무 추출물 획득에 있어서, 추출 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 비제한적인 예로는, 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2 종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 검팽나무 추출물 획득에 이용되는 추출 용매의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 추출 용매의 비제한적인 예로는 물; 메탄올, 에탄올, 프로필알코올, 부틸알코올 등의 C1내지 C4의 저급 알코올; 글리세린, 부틸렌글라이콜, 프로필렌글라이콜 등의 다가 알코올; 및 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 아세톤, 벤젠, 헥산, 디에틸에테르, 디클로로메탄 등의 탄화수소계 용매; 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게 메탄올을 단독으로 사용하거나 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 99.9% 메탄올을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 검팽나무 추출물은 추출 및/또는 분획 과정을 수행한 이후, 감압 여과 과정을 수행하거나 추가로 농축 및/또는 동결건조를 수행하여 농축하거나 용매를 제거할 수 있으며, 상기 수득한 검팽나무 추출물은 사용 시까지 급속 냉동 냉장고에 보관할 수 있다.
대식세포(macrophage)는 이러한 염증 반응을 조절하는 가장 대표적인 면역세포로서, 유해한 환경에서 숙주의 방어기작에 중요한 역할을 하며, 자가면역질환과 같은 다양한 질병의 진행과정에 관여한다. 지질다당류(LPS)와 같은 염증 자극 인자들은 대식세포를 활성화시킬 수 있으며, 활성화된 대식세포는 종양괴사인자-알파 (tumor necrosis factor-α, TNF-α), 인터루킨-6 (interleukin-6, IL-6) 및 IL-1β와 같은 다양한 염증성 매개체를 생성하고, 유도형 NO생성효소 (inducible nitric oxide synthase, iNOS)와 고리형 산소화효소2 (cyclooxygenase-2, COX-2)를 합성하여 일산화 질소(nitric oxide, NO) 및 PGE 2 (prostaglandin E 2 )를 생성한다.
한편, nuclear factor κB (NF-κB)는 어디에나 존재하고 복합체 현상의 조절을 담당하는 것에 특화된 단백질이다. 어떤 조건에서 신체의 세포신호를 통제하는 중심적 역할을 하며, 특히 다른 기능 중에서도 NF-κB는 염증의 진행을 통제하는데 중요한 역할을 하는 상기 TNF-α 등의 염증 사이토카인 (pro-inflammatory cytokines), 케모카인 (chemokines), 및 COX-2 등의 유발 효소 (inducible enzymes)를 통제하는 것으로 알려져 있다. 따라서 NFκB는 많은 염증 질환을 치료하는 약에 있어서 중요하면서도 매우 눈에 띄는 치료 타겟을 대표한다고 할 수 있어 선택적으로 이러한 경로를 방해하는 화합물에 광범위하게 주의가 집중되고 있으며, 최근 NF-κB 경로를 억제하는 천연 물질에 관한 연구가 활발하게 일어나고 있으나, 검팽나무 추출물을 이용한 연구는 전무하다.
본 발명자들은 검팽나무 추출물이 LPS로 자극한 대식세포에서 고리형 산소화효소, 유도형 NO생성효소, 및 종양괴사인자-알파의 발현과 NO 생성을 감소시킴을 확인하고, 검팽나무 추출물이 LPS로 자극한 대식세포에서 NF-κB을 활성화 시키는 IκBα, IKKα/β, AKT, p85, 및 Src의 활성화를 억제함을 확인하여, 본 발명의 검팽나무 추출물이 염증 억제 및/또는 개선에 효과적임을 확인하고, 검팽나무 추출물을 포함하는 조성물을 염증성 질환의 예방 또는 치료 용도에 이용하였다.
본 발명에서 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 염증성 질환의 발생, 확산 또는 재발을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, 본 발명에서 "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
따라서, 본 발명은 검팽나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 염증성 질환의 치료 방법을 제공할 수 있으며, 상기 염증성 질환은 알레르기성 질환, 염증성 장 질환, 죽상동맥경화, 염증성 콜라겐 혈관 질환, 사구체신염, 염증성 피부 질환, 유육종증, 망막염, 위염, 간염, 장염, 복막염, 관절염, 편도선염, 인후염, 기관지염, 폐렴, 췌장염, 패혈증, 및 신장염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환일 수 있으며, 바람직하게는 위염 또는 복막염일 수 있고, 더욱 바람직하게는 급성 위염 또는 복막염일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "개체"는 쥐, 가축, 생쥐, 인간 등 포유류일 수 있으며, 구체적으로 염증 치료가 필요한 반려견, 경주마, 인간 등일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다.
본 발명에 따른 검팽나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 제형을 가질 수 있다. 상기 검팽나무 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 약학적 조성물은 1일 0.0001 내지 100㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 10㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
아울러, 본 발명은 검팽나무 추출물을 유효성분으로 포함하는, 염증 억제 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다. 또한, 검팽나무 추출물은 염증 개선을 목적으로 식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 검팽나무 추출물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 검팽나무 추출물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 0.01-0.20g, 바람직하게는 약 0.04-0.10g 이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01-0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 실험 준비 및 방법
1-1. 세포배양(Cell culture)
쥐의 대식세포주인 RAW264.7 세포를 ATCC에서 구입하여 10% FBS(fetal bovine serum) RPMI 배지[100 U/㎖ 페니실린(penicillin), 100㎍/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin)]에 배양하였고 배양조건은 5% CO2, 37℃로 유지되는 배양기에서 배양하였다.
1-2. 검팽나무 추출물의 준비
검팽나무 추출물은 한국 식물 추출물은행에서 구입하여 진행하였다(분양번호 001-010). 하기 실시예 2 내지 8의 세포실험에서는 DMSO100 ㎎/㎖에 녹여 사용하였고, 하기 실시예 9에서 수행한 동물 실험에서는 0.5% CMC(Carboxymethyl cellulose)에 녹여 사용하였다.
1-3. Nitrite(NO)의 측정
NO의 생성은 나이트라이트(Nitrite) 측정을 통해 간접적으로 확인하였다. 세포에 시료를 투여하고 16시간 후에 배지(100㎕)를 걷어서 A, B의 Griess reagent(A:1% sulfanilamide와 B:0.1% naphtylenediamine를 포함한5%(v/v) phosphoric acid)를 섞은 시약(50㎕+50㎕=100㎕)과 반응시킨 후 570㎚에서 흡광도를 측정하였다. 나이트라이트 기준물질로 소듐 나이트라이트를 사용하여 RAW264.7 세포 및 복강 내 대식세포의 나이트라이트 분비를 측정하였다.
1-4. mRNA의 준비
세포내 mRNA는 cDNA로 합성하여, PCR을 통해 그 발현 양상을 비교하였다. 12 well plate에 (2 X 106 cells/㎖)로 18시간 동안 세포를 배양하고, 전배양된 세포를 검팽나무 추출물 (0, 50, 또는 100 ㎍/㎖)으로 30분 동안 처리한 다음, LPS(Lipopolysaccharide) (1 ㎍/㎖)와 함께 6시간 동안 더 배양하였다. 6시간 후 세포 배양액을 모두 걷어 내고, TRI-Zol을 이용하여 상기 세포를 분해하고, BCP를 이용하여 중화시켰다. 중화시킨 액체에 iso-propanol을 이용하여 mRNA를 침강시켰다. 이어서 원심분리기를 이용하여 침강된 mRNA만을 모아 실험에 이용하였다.
1-5. 웨스턴 블랏팅(Western blotting)
대식세포에서 PGE2, NO의 생성 단백질인 COX-2 및 iNOS를 하기와 같이 측정하였다.
RAW264.7 세포에 각각의 시료를 처리하고 일정시간 후 수거하여, PBS(PBS, 시그마 케미칼컴퍼티, 미국)로 2회 세척하였다. 그 다음 PBS를 완전히 제거한 후 세포 용해 및 염색 시약인 RIPA 버퍼 200㎕를 각각의 접시에 넣고 스크래퍼를 이용하여 긁었다. 그 다음 BCA assay로 단백질을 정량한 후 10% SDS-PAGE를 이용하여 전기영동을 수행하였다. 전기영동한 SDS-PAGE젤의 단백질을 PVDF막으로 이동시킨 후, 단백질 이동이 완료된 PVDF막을 상온에서 TBS-T(in 100mM NaCl, 10mM Tris, 0.1%(v/v) Tween-20, pH 7.4 (PBST)containing 3% BSA)로 블록킹하였다. 그 다음 TBS-T를 사용하여 10분간 3회 세척한 후, 3% BSA를 녹인 TBS-T에 1차 항체를 1시간 처리하고, TBS-T로 충분히 세척하였다. 그리고 2차 항체를 1 시간 동안 처리하고 PBS-T로 10분씩 3회 세척하였다. 그 다음 ECL detection system(애머샴,영국)을 사용하여 특정 단백질의 양 및 위치를 확인하였다. 단백질 양의 보정은 PVDF막을 재활용(stripping)하여 액틴 단백질의 양을 확인함으로써 동량임을 확인하였다. 각각의 항체는 Cell signaling 및 Santacruz 에서 구입하였다.
실시예 2. 검팽나무 추출물의 세포독성 효과
RAW264.7 세포 (1×106 cells/㎖) 및 복강내 대식세포 (1×106 cells/㎖)를 18시간 동안 전배양시킨 후, 전배양된 세포를 검팽나무 추출물 (0, 12.5, 25, 50, 또는 100 ㎍/㎖)과 비교 NO억제제인 L-NAME (0.5 또는 1 μM)을 처리하고 24시간 동안 배양 하였다. 그 다음 세포 독성 효과를 일반적인 MTT assay로 측정하였다. 구체적으로, 배양 종료 3시간 전에 10㎕의 MTT 용액(인산염 완충액 중 10 ㎎/㎖, pH 7.4)을 가하고 분석 종료까지 세포를 계속 배양하였다. 15% SDS(sodiumdodecyl sulphate)를 각 웰에 가하고 포마잔(formazan)을 녹여 배양을 중지시킨 후, Spectramax 250 마이크로플레이트 리더를 사용하여 570㎚ (OD570)에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 생존율은 아무런 시료를 첨가하지 않은 대조군(control)에 대한 백분율로 표시하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 검팽나무 추출물을 처리한 실험군에서 음성 대조군과 L-NAME을 처리한 양성 대조군에서의 세포 생존율과 유사한 세포 생존율을 확인 하였으며, 이는 검팽나무 추출물이 세포독성이 없음을 의미한다.
실시예 3. RAW264.7 세포 내에서 NO의 생성 측정
3-1. 세포배양
쥐의 대식세포 세포주인 RAW264.7 세포를 100 U/mℓ 페니실린, 100㎍/mℓ스트렙토마이신과 10% FBS로 보충된 RPMI1640 배지 내에서 유지시켰다. 세포는 37ㅀC, 5% CO2 습한 공기에서 배양하였다.
3-2. RAW264.7 세포 내에서 검팽나무 추출물의 일산화질소(NO) 생성 억제 효과
RAW264.7 세포 (1×106 cells/㎖)를 18시간 동안 전배양시킨 후, 전배양된 세포를 메탄올 추출물 (0, 12.5, 25, 50, 또는 100 ㎍/㎖)과 비교 NO 억제제인 L-NAME (0.5, 또는 1μM)으로 30분 동안 처리한 다음, LPS (1 ㎍/㎖), Poly(I:C) (200 ㎍/㎖), Pam3 (10 ㎍/㎖)와 함께 24시간 동안 더 배양하였다. 상기 세포 배양액의 상등액을 모으고, 상등액 내 일산화질소(NO)의 농도를 Griess 시약으로 측정하였다. NO 생성억제 효과는 NO의 농도로 표시하여 비교하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 검팽나무 추출물은 LPS, Poly(I:C), Pam3 처리에 의해 증가된 NO 생성을 억제하였고, 50 ㎍/㎖를 처리한 경우 아무 처리도 하지 않은 대조군과 비교하여 약 50% 정도의 NO 생성량이 감소되었으며, 농도 의존적으로 계속하여 NO 함량이 감소하여, 100 ㎍ /㎖를 처리한 경우 90% 이상 NO 생성을 억제함을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 복강내 대식세포 내에서 NO의 생성 측정
4-1 세포배양
쥐의 복강에 TG(Thioglycolate)를 주사하고, 4일 뒤 복강내로 PBS 5㎖를 주입하여 쥐의 복강내에 존재하는 대식세포를 분리하여 100 U/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신과 10% FBS로 보충된 RPMI1640 배지에서 37ㅀC, 5% CO2 습한 공기 조건 하에서 배양하였다.
4-2. 복강내 대식세포 내에서 검팽나무 추출물의 일산화질소(NO) 생성 억제 효과
복강내 대식세포 (1×106 cells/㎖) 를 18시간 동안 전배양시킨 후, 전배양된 세포를 검팽나무 추출물 (0, 12.5, 25, 50, 또는 100 ㎍/㎖)과 비교 NO억제제인 L-NAME(N(G)-nitro-L-arginine methyl ester) (0.5, 또는 1μM)으로 30분 동안 처리한 다음, LPS (1 ㎍/㎖)와 함께 24시간 동안 더 배양하였다. 상기 세포 배양액의 상등액을 모으고, 상등액 내 일산화질소(NO)의 농도를 Griess 시약으로 측정하였다. NO 생성 억제 효과는 NO의 농도로 표시하여 비교하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 검팽나무 추출물은 LPS 처리에 의해 증가된 NO 생성을 억제하였고, 50 ㎍/㎖를 처리한 경우 아무 처리도 하지 않은 대조군과 비교하여 약 15% 정도의 NO 생성량이 감소되었으며, 농도 의존적으로 계속하여 NO 함량이 감소하여, 100 ug/㎖를 처리한 경우 65% 이상 감소한 것을 확인하였다.
실시예 5. 검팽나무 추출물의 항염증 활성 성분의 비율 확인
검팽나무 추출물 내에 존재하는 항염증 활성 성분의 비율을 액체 크로마토 그래피를 이용하여 확인하였다. 검팽나무 추출물 100 ㎎/㎖을 DMSO로 희석하여, 최종 50 ㎎/㎖로 만들었다. 대표적인 항염증 활성 표준 물질 퀘르세틴(Quercetin), 루테올린(Luteolin), 및 켐페롤(Kaempferol)을 각각 0, 5, 10, 20, 50 ppm으로 희석하여 액체 크로마토 그래피로 측정하고, 표준 곡선을 그려 정량화 하였다. 표준물질의 양(ppm, ㎎/l) / 시료의 농도 (㎎/㎖) X 100 (%)의 식을 이용하여 함량을 계산하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 검팽나무 추출물에는 퀘르세틴, 루테올린, 및 켐페롤이 각각 0.034%, 0.25%, 0.092%가 존재하는 것으로 확인하였다.
실시예 6. 검팽나무 추출물의 염증 관련 사이토카인의 발현 역제 효과 확인
6-1. 검팽나무 추출물의 염증관련 사이토카인 mRNA 발현 억제 효과
RAW264.7 세포내 mRNA를 cDNA로 합성하여, PCR을 통해 그 발현 양상을 비교하였다. 구체적으로, RAW264.7 세포를 12 well plate에 (2 X 106 cells/㎖)로 18시간 동안 전배양하고, 전배양된 세포를 검팽나무 추출물 (0, 50, 또는 100 ㎍/㎖)으로 30분 동안 처리한 다음, LPS (1 ㎍/㎖)와 함께 6시간 동안 더 배양하였다. 6시간 후 세포 배양액을 모두 걷어 내고, TRI-Zol을 이용하여 세포를 용해하고, BCP를 이용하여 중화하였다. 중화된 액체에 iso-propanol을 첨가하여 mRNA를 침강시키고, 원심분리기를 이용하여 침강된 mRNA만을 수득하였다. 상기 수득된 mRNA는 역전사 효소를 이용하여 cDNA로 합성하고, PCR을 통해 염증관련 사이토카인인 iNOS, COX-2, 및 TNF-α의 발현 수준을 확인하였다. 이때 사용한 표적단백질의 정방향 및 역방향 프라이머의 구체적인 염기서열을 하기 표 1에 나타내었다.
대조군 유전자로는 GAPDH을 사용하였다. PCR amplication은 Hipi PCR kit (Elpis biotech)을 사용하여 각 실험군 cDNA와 표적 단백질들의 정방향 및 역방향 프라이머, 대조군 GAPDH 프라이머를 dNTP 250 μM, Tris-HCL(pH 8.3) 10 mM, KCl 50 mM, NgCl2 1.5 mM를 포함한 Hipi PCR kit 20 ㎕에서 시행하였다. PCR은 95℃에서 45초간 denaturing, 55℃에서 45초간 annealing 그리고 72℃에서 1분간 extension 하는 조건으로 시행하며, 총 30 cycles을 수행하였다. PCR로 증폭된 DNA는 1.5 % agarose gel에서 전기영동 하였고 분획된 DNA band의 강도(intensity)를 측정하였다.
그 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이, 검팽나무 추출물 처리에 의해 iNOS, COX-2, 및 TNF-α의 mRNA 발현 수준이 감소됨을 확인할 수 있었으며, 특히, iNOS 및 COX-2의 mRNA 발현 수준이 현저하게 감소됨을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, 검팽나무 추출물에 의한 일산화질소(NO)의 생성 억제가 사이토카인의 전사 수준에서도 조절됨을 확인하였다.
6-2. 검팽나무 추출물의 염증관련 사이토카인 단백질 발현 억제 효과
RAW264.7 세포를 12 well plate에서 (2 X 106 cells/㎖)로 18시간 동안 배양하고, 배양된 세포를 검팽나무 추출물 (0, 50, 또는 100 ㎍/㎖)으로 30분 동안 처리한 다음, LPS (1 ㎍/㎖)와 함께 6시간 동안 더 배양하였다. 6시간 후 세포 배양액을 모두 걷어 내고, cold-PBS를 이용하여 세포를 세척하였다. PBS를 이용하여 세포들을 모아서 lysis buffer와 sonicator를 사용해 세포를 용해하여 웨스턴 블랏 표본을 얻었다. 그리고 각 표본의 단백질 농도를 BSA를 표준으로하여 측정하였다. 동량의 단백질을 사용하여 웨스턴 블랏법을 통해 iNOS와 COX-2의 발현 수준을 비교하였고, 대조군으로 β-actin을 사용하였다.
그 결과, 도 5b에 나타낸 바와 같이, 검팽나무 추출물은 iNOS 및 COX-2의 단백질 발현 수준을 농도 의족적으로 감소시키는 것을 확인하였다.
실시예 7. 검팽나무 추출물에 의한 전사인자의 핵 내 이동 확인
RAW264.7 세포를 페니실린 (100 IU/㎖) 및 스트렙토마이신 (100 ㎍/㎖)과 10%의 FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지를 이용해서 배양한 세포를 90%의 밀도로 100㎜의 dish에서 18시간 동안 전 배양시켰다. 이후 검팽나무 추출물 (100 ㎍/㎖)을 30분 동안 전-처리하고 LPS로 자극한 후, 시간의 흐름에 다른 단백질의 변화 양상을 확인하기 위해 각 15, 30, 60 분 후 ice-cold PBS로 세척하고 Homogenization buffer A [20 mM Tris-HCl pH8.0, 10 mM EGTA, 2 mM EDTA, 2 mM DTT, 1 mM PMSF, 25 ㎍/㎖ Aprotinin, 10 ㎍/㎖ Leupeptin] 300㎕를 이용하여 세포를 수집하였다. Sonicator를 사용하여 Output 4의 세기로 세포를 깬 후 8000 rpm으로 15분 동안 4℃에서 원심분리 하여 상층액 (Cytosol 분획)을 분리하였다. Pellet (Nuclear 분획)은 300 ㎕ Homogenization buffer B [1% TritonX-100 in Homogenization buffer A]로 부유시킨 후 sonicator를 사용하여 Output 4의 세기로 세포를 깬 후, 얻어진 분획을 웨스턴 블랏을 이용하여 전사인자의 핵 내 이동 수준을 평가하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 검팽나무 추출물을 처리하는 경우, LPS에 의한 NF-κB 관련 단백질인 p50의 핵 내 이동이 감소되는 것을 확인 하였다.
실시예 8. NF-κB 관련 신호 전달 단백질 Src, p85, AKT, IKKα/β, IκBα의 활성 변화 확인
RAW264.7 세포를 페니실린(100 IU/㎖) 및 스트렙토마이신(100 ㎍/㎖)과 10%의 FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지를 이용해서 배양한 세포를 7 X 106 cell/㎖ 농도로 60㎜의 dish에서 18시간 동안 전 배양시켰다. 검팽나무 추출물 (100 ㎍/㎖)을 30분 동안 전-처리하고 LPS로 자극하였다. LPS로 2, 3, 5, 15, 30분 간 각각 자극한 뒤 상기 세포를 모아서 lysis buffer와 sonicator를 사용해 세포를 용해하여 웨스턴 블랏 표본을 얻었다. 그리고 각 표본의 단백질 농도를 BSA를 표준으로하여 측정하였다. 이렇게 얻어진 값을 기준으로 단백질 농도가 되는 각 표본량을 가지고 웨스턴 블랏 방법을 사용해 표적 단백질 항체 및 신호전달 단백질 항체 (p-IκBα, IκBα, p-IKKα/β, IKKα/β, p-AKT, AKT, p-Src, Src, p-p85, p85, β-actin) 용액을 1차 항체로 사용하여 X-ray film으로 감광하였다.
그 결과, 도 7a에 나타낸 바와 같이, 검팽나무 추출물에 의해 IκBα, IKKα/β, AKT, p85 및 Src 의 인산화(활성)가 감소함을 확인하였다. 또한, 도 7b에 나타낸 바와 같이, LPS 처리 후 초기 시간대인 2, 3, 5분 후에 역시 Src와 p85의 인산화(활성)가 감소되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 9. 검팽나무 추출물의 표적 단백질 확인
9-1. 검팽나무 추출물의 표적단백질 확인
HEK 293 세포주를 Opti-MEM을 이용하여 12 well plate에 분주한 후 37℃ 5% CO2 세포배양기에서 전배양하였고, 배양 후 세포가 50% 밀도가 되었을 때 실험을 진행하였다. PEI (Polyethylenimine) 법을 이용하여 Src DNA를 형질주입(transfection)하여 Src 단백질 과발현 세포주를 구축였다. 보다 구체적으로, PEI법은 DNA 1 ㎍과 PEI 3 ㎍을 Opti-MEM에 각각 희석한 후 상온에서 20분 동안 배양하고, DNA 희석액과 PEI 희석액을 혼합하여 다시 상온에서 20분 배양하는 방법으로 진행하였다. 배양 후 혼합액을 세포가 분주된 12 well plate에 넣어준 후 6시간 후 세포 배양 배지를 10 % FBS, 1 % 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 DMEM로 교체하고, 24시간 배양 후 검팽나무 추출물을 농도별(50 또는 100 ㎍/㎖)로 처리한 후 다시 24시간 배양하였다. 배양 후 세포를 모아서 lysis buffer와 sonicator를 사용해 세포를 용해하여 웨스턴 블랏 표본을 얻었다. 그리고 각 표본의 단백질 농도를 BSA를 표준으로하여 측정하였다. 이렇게 얻어진 값을 기준으로 단백질 농도가 되는 각 표본량을 가지고 웨스턴 블랏 방법을 사용해 표적 단백질 항체 및 신호전달 단백질 항체 (p-AKT, AKT, p-Src, Src, β-actin) 용액을 1차 항체로 사용하여 X-ray film으로 감광하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, Src 단백질의 과발현에 의해 증가된 AKT와 Src의 인산화가 검팽나무 추출물 처리에 의해 감소됨을 확인하였다. 상기 결과는 Src 단백질이 검팽나무 추출물의 표적 단백질임을 의미한다.
9-2. 면역 침강법을 이용한 검팽나무 추출물의 표적 단백질 확인
RAW264.7 세포를 페니실린(100 IU/㎖) 및 스트렙토마이신(100 ㎍/㎖)과 10%의 FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지를 이용해서 배양한 세포를 7 X 106 cell/㎖ 농도로 60㎜의 dish에서 18시간 동안 전 배양시켰다. 검팽나무 추출물 (100 ㎍/㎖)을 30분 동안 전-처리하고 LPS로 자극하였다. LPS로 3분 간 각각 자극한 뒤 세포를 모아서 lysis buffer와 sonicator를 사용해 세포를 용해하여 면역 침강 표본을 얻었다. 그리고 각 표본의 단백질 농도를 BSA를 표준으로하여 측정하였다. 이렇게 얻어진 값을 기준으로 단백질 농도가 되는 각 표본량을 가지고 면역 침강법을 이용하여 단백질을 분리하였다. 면역 침강법은 단백질간의 결합을 확인함으로써 두 단백질 사이의 상호작용에 대해 분석하는 방법으로써, 염증 신호 전달시 효소와 기질의 결합이 이루어지는 것을 확인하여 신호 전달 과정을 확인한다. 준비된 면역 침강 표본 1000 ㎍에 표적 단백질의 인산화 형태에 결합이 가능한 항체 (p-Src)을 5 ㎕ 넣고 4℃에서 18시간 동안 반응시켰다. 18시간 반응 후 항체와 결합이 가능한 N-protein-A sepharose를 40 ㎕ 넣고 4시간 반응시켰다. 반응 후 Wash buffer로 5회 세척하고, laemli buffer를 이용하여 웨스턴 블랏 표본을 준비하였다. 웨스턴 블랏 방법을 사용해 표적 단백질 항체 및 신호전달 단백질 항체 (p-Src, p-p85) 용액을 1차 항체로 사용하여 X-ray film으로 감광하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 검팽나무 추출물에 의해 인산화된 Src과 결합하는 p85가 감소함을 확인하였다. 상기 결과에 따라, 도 10에 나타낸 바와 같이, 검팽나무 추출물은 대식세포의 염증 신호 전달 체계에서 Src 단백질을 표적으로 하여 Src의 인산화를 억제함에 따라 궁극적으로 염증 반응을 억제하는 기능을 수행한다는 것을 알 수 있다.
실시예 10. 검팽나무 추출물의 동물 염증 모델 (복막염, 위염)에서 항염증 효과 확인
10-1. 복막염에 대한 검팽나무 추출물의 효과 확인
복막염 염증 모델에는 5주령의 ICR mice를 이용하였다. 검팽나무 추출물을 각 50, 200 ㎎/㎏, 대조 약물로 prednisolone 3 ㎎/㎏를 이용하여 경구 투여하였다. 약물 투여 1시간 후 LPS 250ng을 0.2㎖ PBS에 넣어 복강 내에 주입하였다. 6시간 후 쥐를 안락사 시키고, 복강 내에 있는 세포들을 PBS를 통하여 획득하였다. 복강 내에 존재하는 백혈구(leukocyte)를 터크 용액(Turk solution)으로 염색하고 염색된 백혈구를 계수하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, LPS에 의해 발생된 복막염을 검팽나무 추출물이 억제하여 염증 발생시 증가되는 복막 내 백혈구의 수를 감소시킴을 확인할 수 있었다.
10-2. 급성위염에 대한 검팽나무 추출물의 효과 확인
급성 위염 염증 모델에는 5주령의 ICR mice를 이용하였다. 검팽나무 추출물을 각 50 ㎎/㎏, 대조 약물로 Ranitidine 40 ㎎/㎏를 이용하여 경구 투여하였다. 약물은 12시간 간격으로 3회 투여하였고, 3회 약물 투여 1시간 이후 HCl/EtOH을 이용하여 급성 위염을 유발하고, 1시간 후 쥐를 안락사 시키고 장기를 적출 하여 염증 발생정도를 확인하였다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 급성 위염이 유도된 쥐에서 검팽나무 추출물 처리시 그 염증 발생이 Ranitidine을 처리한 양성 대조군 수준으로 감소되는 것을 확인할 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가지는 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> RESEARCH & BUSINESS FOUNDATION SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY
<120> An anti-inflamatory composition comprising extract of Celtis
choseniana as an active ingredient
<130> MP17-264
<160> 8
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> iNOS primer F
<400> 1
ggagccttta gacctcaaca ga 22
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> iNOS primer R
<400> 2
tgaacgagga gggtggtg 18
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF-alpha primer F
<400> 3
tgcctatgtc tcagcctctt c 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF-alpha primer R
<400> 4
gaggccattt gggaacttct 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> COX-2 primer F
<400> 5
gggagtctgg aacattgtga a 21
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> COX-2 primer R
<400> 6
gcacattgta agtaggtgga ctgt 24
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH primer F
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caatgaatac ggctacagca cc 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH primer R
<400> 8
ggagccttta gacctcaaca ga 22
Claims (9)
- 검팽나무(Celtis choseniana) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 복막염 또는 위염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 추출물은 메탄올을 용매로 추출한 것을 특징으로 하는, 복막염 또는 위염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 검팽나무 추출물은 일산화 질소 (nitric oxide, NO) 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 복막염 또는 위염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 검팽나무 추출물은 고리형 산소화효소2 (Cyclooxygenase-2, COX-2), 유도형 NO생성효소 (Inducible nitric oxide synthase, iNOS), 또는 종양괴사인자-알파 (Tumor necrosis factor- α, TNF-α)의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는, 복막염 또는 위염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 검팽나무 추출물은 IκBα, IKKα/β, AKT, p85, 또는 Src의 인산화를 억제하는 것을 특징으로 하는, 복막염 또는 위염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 제6항에 있어서,
상기 검팽나무 추출물은 IκBα, IKKα/β, AKT, p85, 또는 Src의 인산화를 억제함으로써 nuclear factor κB (NF-κB) 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 복막염 또는 위염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물. - 검팽나무(Celtis choseniana) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 복막염 또는 위염의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 삭제
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2017
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