KR102008064B1 - 애멸구의 핵수용체 E75 유전자에 특이적인 dsRNA를 이용한 애멸구 매개 바이러스 방제용 조성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

본원은 애멸구 핵수용체 E75의 발현을 억제하는 dsRNA 및 이를 포함하는 애멸구 방제용 조성물 및 방법을 개시한다. 본원에 따른 dsRNA 또는 조성물은 애멸구 핵수용체 E75 단백질의 발현을 저해함으로서 이에 의해 매개되는 벼줄무늬잎마름병 바이러스 등의 증식을 효과적으로 억제할 수 있다.

Description

애멸구의 핵수용체 E75 유전자에 특이적인 dsRNA를 이용한 애멸구 매개 바이러스 방제용 조성물 및 방법{Composition and method of controlling virus mediated by small brown planthopper using dsRNA targeting nuclear receptor E75 gene of small brown planthopper}

본 발명은 애멸구의 핵수용체 E75 유전자에 특이적인 dsRNA를 이용한 애멸구 매개 바이러스 방제용 조성물 및 방제 방법에 관한 것이다.

국내에서 벼의 주요 해충 가운데 하나인 애멸구는 1980년대부터 이에 의해 영향을 받는 일반계 품종이 확대 재배되면서 남부지방을 중심으로 많은 피해를 주고 있다.

애멸구에 의한 피해는 흡즙에 의한 직접적인 피해보다는 이들이 매개하는 벼줄무늬잎마름병 바이러스(Rice stripe virus; RSV) 및 벼검은줄오갈병 바이러스 (Rice black-streaked dwarf virus; RBSDV)에 의한 피해가 더욱 크며, 이들 바이러스의 발병 빈도 및 피해가 매년 증가하고 있는 실정이다. 최근 기후변화에 의한 이상고온 현상으로 애멸구의 월동 생존율이 증가하고 있을 뿐만 아니라 성충 애멸구가 중국에서부터 대량으로 날라오는 것으로 보고되고 있다. 날라온 성충은 2009년 전라북도에서 최초로 발견되어 해마다 날라오는 애멸구의 양이 급격히 증가하는 것으로 보고되고 있으며, 중국의 밀 수확기인 5월 중순에서 6월 상순에 남서풍의 기류 발달로 인해 애멸구의 대발생이 우려되므로 각별한 방제대책이 필요하다.

현재 애멸구가 매개하는 바이러스의 방제는 진단 키트를 이용한 병 발생 예찰을 통한 예방적 차원이 주를 이루고 있으며, 바이러스 자체에 대한 방제약은 아직 없으며, 바이러스를 옮기는 애멸구에 대한 직접적 방제는 Imidacloprid 입제 등을 이용한 화학적 방제에 전적으로 의존하고 있는 실정으로, 최근 들어 RNA 간섭(RNAi)를 이용한 방제 방법이 개발되고 있다.

미국등록특허 제9,528,123호는 곤충방제용 dsRNA에 관한 것으로, CHD3 gene 등을 표적으로 하는 방제를 위한 dsRNA가 개시되어 있다.

미국특허출원 공개번호 제2014/0143906호는 식물의 해충에 대한 저항성을 향상시키는 방법에 관한 것으로, 트립신 전구 유전자 등 해충유래의 표적 유전자에 대한 dsRNA가 개시되어 있다.

대한민국 등록특허 제1013092호는 벼 줄무늬잎마름병 저항성 형질전환 벼 및 이의 제조방법에 관한 것으로, RSV-CP-SW 유전자를 표적으로 하는 dsRNA가 개시되어 있다.

그러나 애멸구의 핵수용체 E75 유전자에 특이적인 dsRNA는 개시되어 있지 않다.

본 발명은 애멸구의 핵수용체(Nuclear Receptor) E75 유전자에 특이적인 dsRNA를 이용하여 유도된 RNA 간섭을 통하여 애멸구 매개 바이러스의 증식을 억제함으로써, 애멸구 매개 바이러스를 효과적으로 방제할 수 있는 방제용 조성물 및 방제 방법을 제공한다.

본원에 따르면 본원에 규명된 애멸구의 E75 유전자의 발현을 억제하여, 애멸구 매개 바이러스의 증식을 억제할 수 있다.

이에 한 양태에서 본원은 본원에서 규명된 서열번호 1의 서열로 표시되는 애멸구 E75 단백질을 코딩하는 유전자, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 상기 유전자를 포함하는 벡터, 및 상기 벡터를 포함하는 세포를 개시한다.

다른 한 양태에서 본원은 상보적으로 결합된 두 가닥의 RNA를 포함하는 이중가닥 RNA로, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5로 표시되는 서열을 갖으며, 상기 dsRNA는 애멸구 핵수용체 E75 유전자의 단백질로의 발현을 억제하여, 상기 애멸구에 의해 매개되는 바이러스 방제능을 갖는, 이중가닥 RNA를 제공한다.

일 구현예에서 dsRNA의 두 가닥은 완전히 상보적으로, 또는 한 가닥의 서열이 결정되면, 다른 가닥의 서열은 상보성에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

또는 부분적으로 상보적일 수 있으며, 세포내 도입되어 RNAi 기작을 유발시키기에 충분한 정도의 상보성으로, 당업자라면, 본원의 기재, RNAi의 기작 및 본원에 따른 표적 서열을 고려하여 적절한 상보성을 결정할 수 있을 것이다.

본원에 따른 dsRNA는 서열번호 1로 표시되는 애멸구 핵수용체 E75 유전자를 표적으로 한다.

또 다른 양태에서 본원은 본원에 따른 이중 가닥 RNA를 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터, 또는 상기 벡터로 형질전환된 식물을 제공한다. 상기 식물은 애멸구가 서식하는 식물 즉 기주(寄主)이면 제한되지 않으나, 예를 들면 벼, 보리, 밀, 조, 옥수수 및 수수를 포함하는 식량작물, 바랭이, 뚝새풀, 포아풀 및 줄풀을 포함하는 화본과 식물을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.

다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 이중 가닥 RNA 또는 본원의 벡터를 포함하는 애멸구 매개 바이러스 방제용 조성물을 제공한다.

본원에 따른 일 구현예에서 애멸구 매개 바이러스는 벼줄무늬잎마름병 바이러스(Rice stripe virus, RSV) 및 벼검은줄오갈병 바이러스(Rice black-streaked dwarf virus, RBSDV)를 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.

다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 dsRNA; 상기 dsRNA를 발현하는 벡터; 또는 상기 dsRNA 또는 상기 벡터를 포함하는 조성물을, 애멸구, 애멸구의 유충 또는 애멸구의 알; 상기 애멸구 기주의 전부 또는 일부 또는 상기 기주의 종자; 또는 상기 애멸구 매개 바이러스의 방제가 필요한 식물 또는 기주의 서식지와 접촉시키는 단계를 포함하는, 애멸구 매개 바이러스 방제 방법을 제공한다.

본원에 따른 방법에 의해 방제가 가능한 애멸구 매개 바이러스는 벼줄무늬잎마름병 바이러스(Rice stripe virus, RSV) 및 벼검은줄오갈병 바이러스(Rice black-streaked dwarf virus, RBSDV)를 포함하며, 본원의 dsRNA는 상기 애멸구의 E75 유전자의 단백질로의 발현을 억제하여, 상기 애멸구가 매개하는 바이러스의 증식을 억제하여, 결국 상기 바이러스에 의한 병해로부터 식물을 구제할 수 있다.

본원은 애멸구 핵수용체 E75 유전자 서열에 상보적인 서열을 포함하는 dsRNA를 사용하여, 애멸구 등의 해충 체내에서 상기 핵수용체 E75 단백질 발현을 저해하여 애멸구 매개 바이러스의 증식을 억제함으로써 애멸구 등의 해충에 의해 매개되는 애멸구 매개 바이러스를 방제하는 뛰어난 효과가 있다. 또한, 본원의 dsRNA는 벼 등의 식물 또는 서식지에 처리하여 식물을 통하여 애멸구가 섭식하게 함으로써 애멸구 매개 바이러스를 방제하여, 바이러스로 인한 기주의 병해를 예방할 수 있다.

도 1은 본원의 일 구현예에 따른, 애멸구에서 발현되는 핵수용체 E75 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA 구조로서, 애멸구의 핵수용체 E75 유전자로부터 전사된 상보성 DNA(complementary DNA, cDNA)의 구조 및 본원의 dsRNA가 디자인된 부위를 나타낸 것이다. 본원에서 애멸구 핵수용체 E75 유전자는 서열번호 1로 표시되고, 상기 부위 1은 서열번호 1의 2914에서 2939번까지의 5'-TATAGTACAAACAAGCCGTGCCGTG-3', 부위 2는 서열번호 1의 2960에서 2988번까지의 5'-AATCAAAGACTACAAATCGGACTTC-3', 그리고 부위 3은 서열번호 1의 3151에서 3176번까지의 5'-TGTAAATGCACTGTTATTCTCCTTC-3'이다.
도 2는 핵수용체 E75 서열의 계통수(phylogenetic tree)를 나타낸 것이다. 다양한 곤충으로부터 추론된 아미노산 서열을 인접 결합 방법(neighborjoining method)으로 조사하였다. 각 노드의 숫자는 1000 복제의 부트트랩 퍼센트를 명시한 것이다. 본원에 사용된 뉴클레오타이드 서열 등록번호(accession number)는 하기와 같다: Apis mellifera E75 (GeneBank Accession No. NM_001080110), Bemisia tabaci E75 (GeneBank Accession No. XM_019052056), Blattella germanica E75 (GeneBank Accession No. AM710420), Bombyx mori E75 (GeneBank Accession No. NM_001043577), Choristoneura fumiferana E75(GeneBank Accession No. U63930), Cimex lectularius E75 (GeneBank Accession No. XM_014384895), Drosophila melanogaster E75A (GeneBank Accession No. X51548), Drosophila melanogaster E75B (GeneBank Accession No.×51549), Galleria mellonella E75 (GeneBank Accession No.U02620), Leptinotarsa decemlineata E75 (GeneBank Accession No. KP340511), Monochamus alternatus E75(GeneBank Accession No. KX428481), Manduca sexta E75C (GeneBank Accession No. AY602190), Oncopeltus fasciatus E75A (GeneBank Accession No. EF490808), Tribolium castaneum E75 (GeneBank Accession No. AB894400), Aedes aegypti E78 (GeneBank Accession No. CAO79100), Apis mellifera E78 (GeneBank Accession No. XP_396527), Drosophila melanogaster E78 (GeneBank Accession No.AAF69494), Aedes aegypti EcR (GeneBank Accession No.AAA87394), Bombyx mori EcR (GeneBank Accession No.AAA87341), Drosophila melanogaster EcR (GeneBank Accession No. AAA28498).이러한 결과는 본원의 dsRNA가 유래한 애멸구의 E75 유전자 염기서열이 기존에 알려지지 않은 새로운 것임을 나타내었으며, 이 유전자 염기서열을 GenBank에 등록하였다 (GeneBank Accession No. KY883671).
도 3은 RSV-보독(viruliferous) 및 비보독 애멸구(L. striatellus)의 E75의 전사 레벨을 나타낸 것이다. RSV-보독 및 비보독 애멸구의 10개의 4령 유충에서 총 RNA를 추출하였고, E75의 상대적 전사 레벨은 qPCR로 분석하였다. 모든 분석은 3 반복으로 수행하였고 에러바(± 표준편차를 나타냄) 위의 서로 다른 문자는 Scheffe's post hoc tests에서 유의하게 서로 다르다는 것을 나타낸다(P < 0.05).
애멸구의 E75 유전자는 비보독 애멸구에 비해 RSV-보독 애멸구에서 약 2.2배 많이 전사되는 것으로 나타났으며, 이러한 결과는 애멸구 체내에서 E75 유전자의 발현을 감소시킬 경우 RSV의 증식을 억제할 수 있음을 시사하는 것이다.
도 4는 애멸구의 핵수용체 E75 단백질 유전자에 특이적인 dsRNA를 합성하고 아가로스젤(agarose gel)전기영동을 통하여 확인한 결과이다.
도 5는 애멸구의 핵수용체 E75 단백질 유전자에 특이적인 dsRNA를 섭식한 애멸구에서 E75 단백질 유전자의 발현이 농도 의존적으로 감소한 것을 확인한 결과이다. 이러한 결과는 본원에서 제작한 E75 유전자에 특이적인 dsRNA를 이용하여 애멸구 체내에서 E75 유전자의 전사를 효과적으로 감소시킬 수 있음을 나타내는 것이다.
도 6은 애멸구의 핵수용체 E75 단백질 유전자에 특이적인 dsRNA를 섭식한 애멸구에서 벼줄무늬잎마름병 바이러스의 증식이 농도 의존적으로 감소한 것을 확인한 결과이다. 이러한 결과는 본원에서 제작한 E75 유전자에 특이적인 dsRNA를 이용하여 애멸구의 E75 유전자의 전사를 감소시킴으로써, 애멸구 체내에서 벼줄무늬잎마름병 바이러스의 증식을 효과적으로 억제할 수 있음을 나타내는 것이다.

본원은 애멸구의 핵수용체 E75 단백질 유전자 서열을 규명하고, 이에 특이적인 dsRNA를 이용하여 상기 유전자의 발현을 억제하는 경우, 애멸구에 의해 매개되어 벼 등과 같은 식물에 피해를 유발하는 바이러스의 증식을 억제할 수 있다는 발견에 근거한 것이다.

이에 한 양태에서 본원은 폴리리보뉴클레오타이드 두 가닥이 상보적 결합을 하고 있으며, 상기 두 가닥 중 하나의 가닥은 서열번호 2로 표시되고, 다른 가닥은 상기 서열번호 2에 상보적인 서열을 갖는, 애멸구의 핵수용체 E75 유전자의 단백질로의 발현을 억제하여, 애멸구에 의해 매개되는 바이러스의 증식을 억제할 수 있는, 이중가닥(double strancded, ds) RNA에 관한 것이다.

본원에 따른 dsRNA는 세포내에서 RNA 간섭(RNAi)에 의해 작용한다. RNA 간섭은 곤충과 식물을 포함한 진핵생물에서 폭넓게 존재하는 전사 후 유전자 발현 조절 기작이다 (Merkling, S.H., van Rij, R.P., 2013. Beyond RNAi: antiviral defense strategies in Drosophila and mosquito. J. Insect Physiol. 59, 159-170). 세포에 도입된 dsRNA는 RNAse III 효소인 Dicer에 의해 처리되어, siRNA (small interference RNA)의 형태로 miRNP라 불리는 리보뉴클레오복합체를 형성하여 표적 부위에 상보적 결합을 통해 표적 유전자를 절단하거나, 단백질 합성을 억제한다. 이로 인해 세포에 도입된 dsRNA에 유도된 RNA 간섭은 표적 유전자의 발현 억제를 통하여 매개충의 생리를 교란함으로써 매개충의 치사를 유도하거나 또는 매개충 내에서 식물바이러스의 증식을 직접적으로 감소시키는 방식으로 작용하며, 본원에서는 특히 매개충 내에서 식물바이러스의 증식을 직접적으로 감소시킨다.

본원에 따른 dsRNA의 표적 유전자는 애멸구 핵수용체 E75이다.

곤충의 핵수용체 단백질 E75은 탈피호르몬 신호 전달(ecdysone signaling)을 포함한 다양한 생리작용에서 매우 중요한 역할을 하는 전사 인자(transcription factor)이다 (de Rosny, E., de Groot, A., Jullian-Binard, C., Gaillard, J., Borel, F., Pebay-Peyroula, E., Fontecilla-Camps, J.C., Jouve, H.M., 2006. Drosophila nuclear receptor E75 is a thiolate hemoprotein. Biochemistry 45, 9727-9734). 탈피호르몬 신호 전달은 난소 발달과 여포(follicle) 성숙 과정을 조절하는 것으로 알려져 있다 (Gancz, D., Lengil, T., Gilboa, L., 2011. Coordinated regulation of niche and stem cell precursors by hormonal signaling. PLoS Biol. 9, e1001202). 초파리에서는 E75 단백질이 난황형성(vitellogenesis) 초기에 여포의 생존을 포함한 다양한 생리 과정에 관여하는 것으로 보고되고 있다 (Morris, L.X., Spradling, A.C., 2012. Steroid signaling within Drosophila ovarian epithelial cells sex-specifically modulates early germ cell development and meiotic entry. PLoS One 7, e46109).

본원에서는 애멸구에 특이적인 핵수용체 E75를 규명하였으며, 이는 서열번호 1로 표시되며 유전자 분석결과 기존에 보고된 상동유전자와 66~91%의 상동성을 보이는, 기존에 알려지지 않은 새로운 서열의 유전자인 것으로 나타났다.

또한 기존에 핵수용체 E75 유전자의 발현 조절을 통한 바이러스 증식을 억제할 수 있다는 것에 대해서는 알려진 바 없고, 본원에서 처음으로 규명하였다.

이에 일 구현예에서 본원에서는 RNA 간섭 현상을 이용하여 E75 유전자의 발현을 유도하며, 애멸구 E75 유전자인 서열번호 1의 2847 내지 3296번째 부위에서 세 개의 siRNA 결합 부위를 규명하였다.

구체적으로 본원에 따른 RNA 간섭 현상이 유도될 수 있는 siRNA 결합 부위는 서열번호 1의 2914에서 2939번까지의 5'-TATAGTACAAACAAGCCGTGCCGTG-3', 서열번호 1의 2960에서 2988번까지의 5'-AATCAAAGACTACAAATCGGACTTC-3', 서열번호 1의 3151에서 3176번까지의 5'-TGTAAATGCACTGTTATTCTCCTTC-3'를 표적으로 할 수 있다.

이러한 siRNA 결합부위는 dsRNA의 형태로 제작되어 RNA 간섭현상 유도에 사용될 수 있다.

이런 관점에서 본원에 따른 dsRNA는 상기 세 개 부위를 모두 포함하는 서열번호 1의 2847 내지 3296번째에 해당하는 서열번호 2로 표시되는 dsRNA 또는 상기 서열번호 1의 2847 내지 3296번째 부위에서 규명된 세 개의 siRNA 표적 각 부위에 상응하는 서열의 dsRNA가 사용될 수 있다.

따라서 본원에 따른 dsRNA는 두 개의 가닥이 상보적으로 결합된 서열번호 2의 서열, 또는 상기 세 개의 각 부위에 해당하는 서열번호 3: 5'-uauaguacaa acaagccgugccgug-3'; 서열번호 4: 5'-aaucaaagacuacaaaucggacuuc-3'; 및 서열번호 5 5'-uguaaaugcacuguuauucuccuuc-3' 의 서열을 가질 수 있다.

본원에 사용된 dsRNA 또는 "이중가닥 RNA" 는 센스 및 안티센스가 결합된 것으로, 실질적으로 상보적인(하기 정의된 바와 같음) 2개의 핵산 가닥을 포함하는 이중체 구조를 갖는 리보핵산 분자의 복합체를 지칭한다. 이러한 이중가닥 RNA는 세포내로 도입시 단일가닥으로 분리되어, siRNA의 형태로 표적 전사 RNA에 결합하여, 이로부터 단백질이 합성되는 것을 방해한다. 따라서, 이중가닥을 형성할 수 있을 정도의 상보성을 가지는 한, 센스 및 안티센스 두 가닥이 완전히 상보적일 필요는 없고, 이런 의미에서 한 가닥의 서열만으로도, 다른 가닥의 서열은 적절하게 결정될 수 있을 것이다.

본원에 사용된 용어 "상보적"은, 두 가닥의 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가 특정 조건 하에 혼성화하여 이중체(duplex) 구조를 형성할 수 있는 능력을 지칭한다. 본원에서는 dsRNA가 세포에 도입되어 본원에 따른 목적을 달성하는 한 다양한 상보성이 사용될 수 있다. 예를 들면, 두 가닥이 완전히 상보적이거나, 또는 실질적으로 상보적일 수 있다. 일 구현예에선, 최대 4개, 3개 또는 2개 또는 1개의 미스매치된 염기 쌍을 포함할 수 있다.

본원에 따른 dsRNA는 다양한 형태로 사용될 수 있다. 예를 들면 dsRNA가 각각 합성되어, 이중체를 형성할 수 있다. 또는 이중체는 한 분자로 합성되어 이중체를 형성할 수도 있다. 예를 들면 2개의 가닥은 한 가닥의 3'-말단과 다른 가닥의 5'-말단이 공유결합으로 연결, 예를 들면 링커에 의해 연결될 수 있다.

또한 본원에 따른 dsRNA는 이를 코딩하는 DNA로 합성되고, 이는 적절한 발현 벡터에 클로닝되거나 또는 인비트로에서 RNA로 발현되어 사용될 수 있다. 예를 들면 본원에 따른 dsRNA는 센스 및 안티센스 방향을 동시에 발현하는 바이너리 형질전환용 벡터에 클로닝되어 사용될 수 있다.

또한, 본원의 dsRNA는 다수의 뉴클레오티드에서의 실질적인 변형 및 당해 분야에 공지된 모든 다양한 유형의 화학적 변형을 포함할 수 있다.

본 발명의 dsRNA 당업계에 널리 확립된 방법, 예를 들어 문헌 [참고: "Current protocols in nucleic acid chemistry", Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA]에 기재된 방법에 의해 합성 및/또는 변형될 수 있다. 화학적 변형에는 2' 변형, 올리고뉴클레오티드의 당 또는 염기의 다른 부위에서의 변형, 올리고뉴클레오티드 쇄 내로의 비-천연 염기의 도입, 리간드 또는 화학적 부분에 대한 공유적 부착, 및 뉴클레오티드간 포스페이트 연쇄를 대체 연쇄, 예를 들어 티오포스페이트로 대체시키는 것이 포함될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 변형 한 가지 이상을 이용할 수 있다.

본원의 dsRNA는 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예를 들어 자동화 DNA 합성기를 사용하여 합성할 수 있다.

본원에 따른 dsRNA는 식물체에 다양한 방법으로 도입될 수 있으며, 예를 들면 하기를 참조할 수 있다: Kanakala, S., Ghanim, M., 2016. RNA interference in insect vectors for plant viruses. Viruses 8, E329.

본원에 따른 dsRNA는 본 이론으로 한정하는 것은 아니지만, 식물체의 세포에 도입되면, 세포에 존재하는 RNAi 기작(Merkling, S.H., van Rij, R.P., 2013. Beyond RNAi: antiviral defense strategies in Drosophila and mosquito. J. Insect Physiol. 59, 159-170)이 작동하여, 핵산절단효소인 Dicer에 의해 siRNA (small interference RNA)로 생성되어 탈피호르몬 신호전달을 포함한 다양한 생리작용에서 주요 역할을 하는 전사인자인 핵수용체 E75 mRNA의 해당 부위에 결합하여 이의 단백질로의 발현을 억제한다. 이러한 발현 억제를 통하여 매개충인 애멸구의 생리를 교란함으로써 매개충의 치사를 유도하거나, 유충의 정상적인 탈피를 방해하여 유충의 정상적인 발달을 저해함으로써 애멸구 매개 바이러스의 증식을 억제할 수 있다. 또한 애멸구 알의 부화율에도 영향을 미치며, 알에 처리한 경우, 부화한 유충의 발달에도 영향을 미쳐, 방제에 효과적으로 사용될 수 있다.

이에 본원에 따른 dsRNA는 매개충인 애멸구 내에서 식물바이러스의 증식을 직접적으로 저해할 수 있다. 따라서 애멸구가 매개하는 다양한 병원균 바이러스가 본원에 따른 dsRNA에 의해 효과적으로 방제될 수 있다.

이러한 바이러스는 벼줄무늬잎마름병 바이러스(Rice stripe virus, RSV) 및 벼검은줄오갈병 바이러스(Rice black-streaked dwarf virus, RBSDV)를 포함한다.

일 구현예에서는 애멸구 매개 바이러스의 방제에 사용된다. 바이러스성 병해인 벼줄무늬잎마름병은 벼 이삭이 아예 나오지 않거나 잎이 말라 죽는 병으로 '벼 에이즈'로 불리우며, 주로 애멸구가 병원균을 옮겨 생기는데 성충이 보독충이면 유충도 바이러스를 가지고 태어난다.

다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 dsRNA를 포함하는 형질전환 식물체 또는 그 종자에 관한 것이다. 본원에 따른 dsRNA를 발현하는 형질전환 식물체는 애멸구 매개 바이러스, 예를 들면 벼 줄무늬잎마름병 바이러스의 감염과 증식을 효과적으로 차단함으로써 바이러스에 대해 저항성을 부여한다.

이러한 형질전환 식물체의 제조를 위해, 본원에 따른 dsRNA는 센스 및 안티센스 방향을 동시에 발현하는 바이너리 형질전환용 벡터(Daisuke Miki와 Ko Shimamoto, Plant Cell Physiol. 45(4): 490-495, 2004) 등에 게이트웨이 시스템(Gateway system; Invitrogen, USA) 방법으로 클로닝되어 사용될 수 있다. 이러한 벡터에는 다양한 프로모터, 예를 들면, 과발현을 위한 프로모터, 상시발현을 위한 프로모터, 스트레스 조건에서 발현되는 유도성 프로모터, 목적유전자를 식물생육 기간 중 일정 시기에 발현되도록 하는 프로모터, 식물조직의 특정 부분에만 발현하게 하는 프로모터 또는 목적유전자의 발현을 높이기 위해 인핸서가 결합된 하이브리드 프로모터룰 포함할 수 있다.

이러한 본원에 따른 dsRNA를 포함하는 벡터를 이용하여 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)에 형질전환되어, 형질전환 식물체의 제조에 사용될 수 있다. 이러한 아그로박테리움은 병원성이 제거된 Ti 또는 Ri 플라스미드를 가지고 포함하며 옥토핀형 계통 또는 숙신아모핀형(succinamopine-type) 계통 등이 사용될 수 있다. 이어 본원에 따른 dsRNA가 도입된 아그로박테리움을 벼 체세포 캘러스와 공동 배양하여 벼 체세포에 목적 유전자를 도입한 후 벼 체세포 캘러스로부터 목적 유전자를 센스와 안티센스 방향으로 동시에 발현시켜 dsRNA를 형성하여, 이를 발현하는 형질전환 벼를 제조할 수 있다. 상기 목적유전자가 도입된 식물체를 효과적으로 스크리닝 하기 위한 마커유전자로는 NPTⅡ(neomycin phosphotransferase), HPT(hygromycin phosphotransferase), CAT(chloramphenicol acetyltransferase) 및 젠타마이신(gentamicin) 등의 항생제 내성 유전자; bar 유전자 등의 제초제 저항성 유전자; 및 GUS, GFP(green fluorescent protein) 및 LUX(luciferase) 등이 사용될 수 있다.

본원에 따른 dsRNA가 도입되어 사용 가능한 형질전환 식물은 애멸구의 기주 식물이라면, 특별히 제한하지 않으며, 예를 들면 벼, 보리, 밀, 조, 옥수수 및 수수 등의 식량작물을 비롯하여 바랭이, 뚝새풀, 포아풀, 줄풀 등의 화본과 식물을 포함할 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.

다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 dsRNA 또는 이를 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터를 포함하는, 애멸구 매개 바이러스 방제용 조성물에 관한 것이다.

본원의 조성물은 상기 dsRNA를 유효성분으로 포함하지만, 그 외 통상의 살충제용 조성물에 포함되는 부형제, 첨가제를 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 가소제, 착색제, 증백제, 계면활성제, 분산제, 유화제, 유동화제 등을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.

본원의 조성물은 통상의 살충제, 또는 농약 제형으로 제제화될 수 있다. 예를 들면, 본원의 조성물은 유제, 액제, 수화제, 수용제, 분제, 입제, 훈증제, 도포제등으로 제형화될 수 있다. 구체적으로, 상기 dsRNA를 적정 방법으로 포함시켜 농약 제제로 제제화한다. 이들 조성물 제형은 문헌 ["Catalogue of pesticide formulation types and international coding system", Technical Monograph No. 2, 6th Ed. May 2008, CropLife International]에 정의되어 있다. 조성물은 문헌 [Mollet and Grubemann, Formulation technology, Wiley VCH, Weinheim, 2001; 또는 Knowles, New developments in crop protection product formulation, Agrow Reports DS243, T&F Informa, London, 2005]에 기재된 바와 같은 공지된 방식으로 제조될 수 있다.

구체적으로, 본원의 조성물에 계면활성제, 증량제, 붕해제, 영양제 등을 혼합하고 분쇄하여 수화제로 사용하거나 용해시켜 액제로 제제화할 수 있다. 계면활성제로는 폴리카르복실레이트(polycarboxylate), 소듐 리그노설포네이트(sodium lignosulfonate), 칼슘 리그노설포네이트 소듐 다이알킬 설포석시네이트(sodium dialkyl sulfosuccinate), 소듐 알킬 설포네이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 소듐 트리폴리포스페이트(sodium tripolyphosphate), 소듐 알킬 아릴 설포네이트(sodium alkyl aryl sulfonate), 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르(polyoxyethylene alkyl phenyl ether), 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 포스포릭 에스테르(polyoxyethylene aryl phosphoric ester), 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르(polyoxyethylene alkyl aryl ether), 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머(polyoxyethylene alkyl aryl polymer), 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머 스페셜, 폴리옥시알킬온 알킬 페닐 에테르(polyoxyalkylone alkyl phenyl ether), 폴리옥시에틸렌 노닐 페닐 에테르(polyoxyethylene nonyl phenyl ether), 소듐 설포네이트 나프탈렌 포름알데히드(sodium sulfonate naphthalene formaldehyde), 트리톤 100 및 트윈 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용할 수 있다. 계면활성제의 예는 문헌 [McCutcheon's, Vol.1:Emulsifiers & Detergents, McCutcheon's Directories, Glen Rock, USA, 2008 (International Ed. or North American Ed.)]에 열거되어 있다. 붕해제로는 벤토나이트, 탈크, 카올린, 칼슘카보네이트 등을 사용할 수 있고, 증량제로는 황토, 규조토, 덱스트린, 포도당, 전분 중 하나 또는 둘 이상을 사용할 수 있다.

본원의 조성물은 유효량의 dsRNA를 포함할 수 있다. 상기 용어 "유효량"은 재배 식물 상에서 바이러스 방제하는데 충분하거나, 처리된 식물에 실질적인 손상을 초래하지 않는 조성물 또는 화합물의 양을 의미한다. 이러한 양은 넓은 범위 내에서 달라질 수 있고, 다양한 인자, 처리된 재배 식물의 구체적 종류 및 상태, 서식 장소, 또는 기후 조건 등 에 따라 좌우된다. 제제화할 경우 사용 시기는 해충 발생시 상시적으로 사용할 수 있다.

이에 다른 양태에서 본원은 본원에 따른 dsRNA; 상기 dsRNA를 발현하는 벡터; 또는 상기 dsRNA 또는 상기 벡터를 포함하는 조성물을, 애멸구, 애멸구의 유충 또는 애멸구의 알; 상기 애멸구 매개 바이러스 방제가 필요한 기주의 전부 또는 일부 또는 상기 기주의 종자; 또는 애멸구 또는 상기 애멸구 방제가 필요한 기주의 서식지와 접촉시키는 단계를 포함하는, 애멸구 매개 바이러스 방제 방법에 관한 것이다.

본원에 따른 dsRNA 또는 조성물이 사용되는 애멸구는 벼줄무늬잎마름병 바이러스 등과 같은 병을 일으키는 바이러스를 보독한 애멸구 또는 보독 가능한 애멸구, 또는 상기 해충의 알 또는 유충을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니며, 본원에 따른 dsRNA 또는 조성물이 적용될 수 있는 식물은 식물 전체 또는 그 부분으로 예를 들면 뿌리, 줄기, 잎, 및 종자는 물론 식물체의 세포 또는 조직에 적용될 수 있다.

또한 본원에 따른 dsRNA 또는 조성물이 적용될 수 있는 식물은 성장하는 작물 및 수확된 작물 둘 다를 포함하는 것이다.

또한 본원에 따른 dsRNA 또는 조성물이 적용될 수 있는 식물의 종류는 애멸구 기주 식물로 예를 들면 벼, 보리, 밀, 호밀, 기장, 조, 옥수수, 귀리 및 수수 등의 식량작물을 비롯하여 피, 바랭이, 강아지풀, 잔디, 이탈리안 라이그라스, 겨풀, 쇄출, 둑새풀, 조개풀, 넓은잎개수염, 알방동사니, 방동사니대가리, 강피 및 좀바랭이 등의 화본과 식물을 포함할 수 있다.

또한 본원에 따른 dsRNA 또는 조성물은 상기 식물 및/또는 애멸구가 서식하는 서식지에 적용될 수 있다.

본원의 방법은 해충 또는 그 유충 또는 그 알 자체, 또는 해충의 서식지; 또는 식물의 전부 또는 일부 또는 그 종자, 식물 또는 해충 또는 그 유충이 서식하는 서식지 예를 들면 토양 또는 물에, 당업계에 공지된 임의의 적용 방법에 의해 본원의 조성물과 접촉시킬 수 있다. 이 경우에, "접촉"은 직접적 접촉(dsRNA/조성물을 해충 또는 식물 - 전형적으로 식물의 잎, 줄기 또는 뿌리에 직접적으로 적용함) 및 간접적 접촉(dsRNA/조성물을 해충 또는 식물의 생육지에 적용함) 둘 다를 포함한다.

또한 본원의 방법은 보호하고자 하는 식물, 식물 번식 재료, 예컨대 종자, 토양, 표면, 물질 또는 공간을 유효량의 본원 조성물로 처리함으로써 이용된다. 또한 본원 방법은 해충에 의한 식물, 식물 번식 재료, 예컨대 종자, 토양, 표면, 물질 또는 공간의 감염 전 및 감염 후에 둘 다 수행될 수 있다.

본원 방법은 해충의 발생이 예상되는 장소에 예방적으로 적용될 수 있다.

또다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 dsRNA 또는 이를 포함하는 조성물을 애멸구 또는 그 유충 또는 그 알에 처리하는 단계를 포함하는, 상기 해충에서 핵수용체 E75 단백질 발현을 억제하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법에 사용되는 dsRNA, 처리 방법은 앞서 언급한 바를 참조할 수 있다.

또다른 양태에서 본원은 또한 애멸구에서 E75 단백질의 발현을 억제하여, 이에 의해 매개되는 바이러스의 증식을 억제하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법에 사용되는 dsRNA, 처리 방법은 앞서 언급한 바를 참조할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실험재료 및 방법

곤충 배양 비보독(non-viruliferous) L. 스트리아텔러스(L. striatellus)를 해충이 없는 논(벼: Oriza sativa)에서 수집하여 28℃, 80% 상대습도, 및 16:8 (light:dark) 광주기에서 곤충사육식(insectary)에서 비보독 벼에서 키웠다. RSV-보균 L. 스트리아텔러스를 얻기 위하여, 성장 챔버내 5-6 cm 크기의 RSV-감염 벼에서 5일간 80% 상대습도, 및 16:8 (light:dark) 광주기 조건 하에 비보독 L. 스트리아텔러스의 두 번째 인스타 유충(insta nymph)를 키웠다.

다수 서열 배열 및 계통(phylogenetic) 분석 서로 다른 핵 수용체 E75 서열을 National Center for Biotechnology Information (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html)에서 검색하여 CLUSTAL W 프로그램 (Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K., 2016. MEGA7: molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets. Mol. Biol. Evol. 33, 18701874.)을 사용하여 추론된 아미노산 레벨로 배열하였다. LsE75의 분자 계통(phylogeny)은 MEGA7 software(Jones, D.T., Taylor, W.R., Thornton, J.M., 1992. The rapid generation of mutation data matrices from protein sequences. Comput. Appl. Biosci. 8, 275-282)에 삽입된 neighborjoining method under the Jones-Taylor-Thornton (JTT) 기질-기초 모델을 사용하여 추론하였다.

dsRNA 합성 후보 siRNA 사이트를 예측하기 위하여 BLOCK-iT™ RNAi Designer(https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress)에 LsE78의 뉴클레오타이드 서열을 적용시켰고, 최소 세 개의 추정 siRNA 부위를 예측하기 위하여 표적 유전자에 대한 dsRNA를 설계하였다. QuantiTect Reverse Transcription Kit (QIAGEN, Germany)를 제조자의 매뉴얼이 따라 사용하여 L. 스트리아텔러스의 총 RNA로부터 표적 유전자의 단일 가닥 cDNA를 합성하였고, 5-엔드에 T7 프로모터 서열 (5′- TAATACGACTCACTATAG-3′)을 포함하는 프라이머 세트를 포함하는 표적 유전자를 증폭시켰다. 증폭된 생성물을 템플레이트로 사용하여, Genolution Phamaceuticals (Korea)에서 표적 유전자에 대한 dsRNA를 생산하였다.

L. 스트리아텔러스로의 dsRNA의 전달 종래 문헌(An et al, 2017. Silencing of rice stripe virus in Laodelphax striatellus using virusderived double-stranded RNAs. J. Asia Pac. Entomol. 20, 695698)에 따라 조립 피딩(feeding) 챔버를 사용하여 벼-매개 피딩 RNAi 방법으로 dsRNA를 L. 스트리아텔러스에 인제스트(ingest)시켰다. 공기 공급을 위한 구멍이 튜브 위에 있는 15ml 코니컬 튜브(Fisher Scientific, USA)를 모아 피딩 챔버를 만들고, L. 스트리아텔러스가 튜브에서 새어나가는 것을 방지하기 위하여 10㎕ tip을 구멍 안에 두었다. dsRNA 용액을 홀딩하기 위한 저장소를 만들기 위하여 피딩 챔버 구성요소인 튜브 캡 및 15ml 튜브 사이에 갭을 봉인하기 위한 Parafilm M film (Bemis, USA)을 두었다. 300마이크로리터의 각 dsRNA 용액(50, 250, and 500 ng/μl in 10% sucrose solution)을 저장소 위쪽으로 분배하여 3 벼잎을 dsRNA용액 위에 두었다. L. 스트리아텔러스의 15 4^th 인스타 유충을 3 dsRNA-투과 벼잎 위에 감염시켰다. 피딩 챔버에서 L. 스트리아텔러스에 감염된 dsRNA-처리 잎을, 28℃, 80% 상대습도, 및 16:8(명:암) 광주기 조건하에 생장 챔버에 두었다.

총 RNA 추출 및 정량적 PCR ( qPCR ) dsRNA-처리 벼잎에서 키운 RSV-감염 L. 스트리아텔러스의 4번째 인스타 유충을 처리 48시간 후에 수집하여, 이들의 총 RNA를 QIAzol Lysis Reagent (QIAGEN, Germany)를 제조자의 매뉴얼에 따라 사용하여 추출하였다. QuantiTect Reverse Transcription Kit (QIAGEN, Germany)를 사용하여 oligo-d(T) 프라이머로 상보적 DNA를 합성하였다. EvaGreen qPCR Master Mix (Applied Biological Materials, Canada) 및 CFX96™ Real-Time System (BIO-RAD, USA)를 제조자의 매뉴얼에 따라 사용하여 정량적 CPR을 수행하였다. qPCR에 사용된 싸이클 프로파일은 하기와 같다: 95℃에서 10분간 효소 활성화를 위한 예열단계, 그 후 95℃에서 15s, 55℃에서 15s 및 72℃에서 30s의 40 싸이클. ARF(ADP ribosylation factor)를 참조 유전자로 사용하였다. 상대적 전사 레벨은 2ΔCt method (Pfaffl, M.W., 2001. A new mathematical model for relative quantification in real-time RTPCR. Nucleic Acids Res. 29, e45)를 사용하여 계산하였다. qPCR에 사용된 프라이머는 하기 표 1에 기재되어 있다.

[표 1]

실시예 1: 애멸구 핵수용체 E75 단백질 유전자의 염기서열

애멸구가 발현하는 핵수용체 E75 단백질을 코드하는 유전자의 전령RNA 구조는 도 1에 요약하였다. 농촌진흥청 국립식량과학원 남부작물부로부터 분양받은 벼줄무늬잎마름병 바이러스를 보독한 애멸구와 비보독 애멸구에서 추출한 각각의 total RNA로부터 poly-T oligo-attached magnetic beads를 이용하여 mRNA를 정제한 다음 divalent cation을 통해 더 작은 조각의 단편으로 절단하였다. 절단된 RNA 단편을 템플레이트로 reverse transcriptase와 random primers를 이용하여 first strand cDNA를 합성한 후, 다시 second strand cDNA를 합성하였다. 이렇게 제작된 cDNA 단편들을 PCR로 증폭시켜 cDNA library를 제작하고 클러스터를 형성한 후 Illumina system을 이용하여 paired-end sequencing을 수행하였다. Illumina RNA-sequencing을 통해 얻은 raw data는 NGS QC toolkit v2.3 (National Institute of Plant Genome Research, India) 프로그램을 이용하여 low quality sequence와 adopter sequence를 제거한 뒤, Trinity software (Broad Institute and the Hebrew University of Jerusalem)를 이용하여 de novo assembly를 통해 EST library를 제작하였다. 벼줄무늬잎마름병 바이러스 보독 애멸구와 비보독 애멸구의 RNA에 대한 454-pyrosequencing 결과를 통합하여 assembly한 각각의 isotig는 BLASTX를 사용하여 초파리의 단백질과 비교함으로써 애멸구의 핵수용체 E75 단백질 유전자의 상보적 DNA 염기서열을 확인하였다.

애멸구가 발현하는 핵수용체 E75 단백질을 코드하는 유전자의 염기서열은 서열번호 1과 같다. 핵수용체 E75 단백질 유전자는 5'-말단과 3'-말단의 비해석부위(untranslated region)을 포함하여 전체적으로 5,296개의 염기서열로 이루어져 있고, 그 중 핵수용체 E75 단백질을 코드하는 오픈리딩프레임(open reading frame)은 2,454개의 염기서열로 이루어져 있다(도 1). 이렇게 확인된 애멸구의 핵수용체 E75 단백질 유전자는 기 보고된 상동유전자(X51548.1, XM022342225.1)와 66~91% 정도의 상동성을 보였으나, 서열이 다른 신규한 유전자이다.

실시예 2. 애멸구 핵수용체 E75 단백질 유전자에 특이적인 dsRNA 제작

Thermofisher사에서 제공하는 BLOCK-It RNAi Designer software(https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress)를 이용하여 target gene에 대한 후보 siRNA 부위를 검색하고, 3개 이상의 후보 siRNA 부위를 포함한 구간을 dsRNA의 제작을 위한 대상 부위(target site)로 선정하였다. 이렇게 선정된 dsRNA의 대상 부위는 애멸구의 핵수용체 E75 단백질 유전자의 cDNA 중 2,847번째 염기서열부터 3,296번째 염기서열(서열번호 2)에 해당하는 부위이다(도 1).

애멸구의 total RNA를 주형(template)으로 QuantiTect Reverse Transcription Kit (QIAGEN, Germany)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 핵수용체 E75 단백질 유전자의 단일가닥 cDNA (Single-strand cDNA)를 합성하였다. 이렇게 합성된 애멸구의 핵수용체 E75 단백질 유전자의 단일가닥 cDNA를 주형으로 5'-말단에 T7 프로모터 염기서열이 포함된 포워드 프라이머 (forward primer; T7-LsE75-F, 5'-TAATACGACTCACTATAGTTGCACTCGCTCAAAACTA-3')와 리버스 프라이머 (reverse primer; T7-LsE75-R, 5'-TAATACGACTCACTATAGCAAGGTGGTGAAGCTGGAG-3')를 이용하여 dsRNA 대상 부위를 유전자 증폭 반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)에 의해 다량 합성하고, (주)Genolution에 의뢰하여 대상 유전자에 특이적인 dsRNA를 제작하였다(도 4).

실시예 3. 애멸구 핵수용체 E75 단백질 유전자에 특이적인 dsRNA 처리에 의한 E75 단백질 유전자의 발현 조절

애멸구 체내로의 성공적인 dsRNA 전달을 위하여 벼의 뿌리를 통하여 dsRNA solution을 흡수시킨 뒤 애멸구가 벼의 이파리를 흡즙하게 하는 간접 feeding 방법을 이용하였다. 10%의 설탕물(sucrose solution)에 현탁된 300 ul의 dsRNA를 50, 250 및 500 ng/ul의 농도로 각각 벼에 처리하고, 15마리의 애멸구 4령 약충을 dsRNA가 처리된 각각의 벼에 접종하였다. 대조구로는 동일 농도의 녹색형광단백질 (green fluorescent protein, GFP) 유전자에 특이적인 dsRNA를 처리한 벼를 시용하였다. 이렇게 처리한 벼를 28℃, 80% 상대습도 및 16:8(명:암)의 광주기로 설정한 생육상(growth chamber)에 넣었다. dsRNA 처리 48시간 후에 각각의 벼에서 애멸구를 수거하여 Trizol reagent (Invitrogen, USA)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 total RNA를 추출하고, 추출한 애멸구의 total RNA로부터 QuantiTect Reverse Transcription Kit (QIAGEN, Germany)를 사용하여 단일가닥 상보적 DNA를 합성하였다. 이렇게 합성한 단일가닥 상보적 DNA를 주형으로 하여 EvaGreen qPCR Mastermix (Applied Biological Materials Inc, Canada)와 CFX96TMReal-TimeSystem(BIO-RAD,USA)를 사용하여 정량 유전자 증폭 반응(quantitative Polymerase Chain Reaction, qPCR)을 수행하였다. 각 유전자의 상대적인 발현 수준을 확인하기 위한 reference 유전자로는 애멸구의 ADP ribosylation factor 유전자를 사용하였으며, 핵수용체 E75 단백질 유전자의 qPCR을 위해서는 포워드 프라이머 (forward primer; qLsE75-Fw, 5'-CACTCAACGCTGGCCAAGTC-3')와 리버스 프라이머 (reverse primer; qLsE75-Re, 5'-CAGCCGGGTACGACTGGTAG-3')를, ADP ribosylation factor유전자의 qPCR을 위해서는 포워드 프라이머 (forward primer; qARF-Fw, 5'-TTGGACAGTATCAAGACCCATC-3')와 리버스 프라이머 (reverse primer; qARF-Re, 5'-GCAGCAATGTCATCAATAAGC-3')를 이용하였다.

도 5의 좌측 패널(dsGFP)에 나타난 바와 같이 녹색형광단백질 유전자에 특이적인 dsRNA를 처리한 벼를 흡즙한 애멸구에서는 핵수용체 E75 단백질 유전자의 발현에 변화가 없는 반면, 핵수용체 E75 단백질 유전자에 특이적인 dsRNA를 처리한 벼를 흡즙한 애멸구에서는 처리한 dsRNA의 농도가 증가할수록 E75 단백질 유전자의 발현이 감소하는 경향을 보였다(도 5, dsLsE75).

실시예 4. 애멸구 핵수용체 E75 단백질 유전자에 특이적인 dsRNA 처리에 의한 벼줄무늬잎마름병 바이러스의 증식 억제

애멸구 핵수용체 E75 단백질 유전자에 특이적인 dsRNA가 애멸구 체내에서 벼줄무늬잎마름병 바이러스의 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 실시예 3에서 녹색형광단백질 유전자 또는 애멸구 핵수용체 E75 단백질 유전자에 특이적인 dsRNA를 섭식한 애멸구로부터 추출한 total RNA를 사용하여 합성한 단일가닥 상보적 DNA를 주형으로 하여 EvaGreen qPCR Mastermix (Applied Biological Materials Inc, Canada)와 CFX96TMReal-TimeSystem(BIO-RAD,USA)를 사용하여 정량 유전자 증폭 반응을 수행하였다. 벼줄무늬잎마름병 바이러스의 상대적인 증식율을 확인하기 위해서 벼줄무늬잎마름병 바이러스의 유전자 중 NS3 유전자를 사용하였으며, reference 유전자로는 실시예 3에서와 동일하게 애멸구의 ADP ribosylation factor 유전자를 사용하였다. 벼줄무늬잎마름병 바이러스의 NS3 유전자는 RNA 간섭 억제자(viral suppressor of RNAi)로 알려진 단백질을 코드하고 있으며, 이 NS3 단백질은 벼와 애멸구가 가지고 있는 항바이러스 방어기작에 대항함으로써 기주(host)의 체내에서 벼줄무늬잎마름병 바이러스가 증식하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (Hemmes, H., Kaaij, L., Lohuis, D., Prins, M., Goldbach, R., Schnettler, E., 2009. Binding of small interfering RNA molecules is crucial for RNA interference suppressor activity of rice hoja blanca virus NS3 in plants. Journal of General Virology 90, 1762-1766). NS3 유전자의 qPCR을 위해서는 포워드 프라이머 (forward primer; qNS3-Fw, 5'-GCAGAGCTCTACATTGTGCCA-3')와 리버스 프라이머 (reverse primer; qNS3-Re, 5'-AACGTGCACTAAGAGGTGGTTT-3')를 이용하였다.

도 6에 나타난 바와 같이 녹색형광단백질 유전자에 특이적인 dsRNA를 섭식한 애멸구에서는 벼줄무늬잎마름병 바이러스의 NS3 유전자 발현에 변화가 없는 반면(도 6, dsGFP), 핵수용체 E75 단백질 유전자에 특이적인 dsRNA를 섭식한 애멸구에서는 처리한 dsRNA의 농도가 증가할수록 NS3 유전자의 발현이 큰 폭으로 감소하는 경향을 보였다(도 6, dsLsE75). 핵수용체 E75 단백질 유전자에 특이적인 dsRNA를 섭식한 애멸구에서 벼줄무늬잎마름병 바이러스의 NS3 유전자 발현은 무처리구에 비해 38.9~55.5배 정도 감소하는 것으로 나타났다.

이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Composition and method of controlling virus mediated by small brown planthopper using dsRNA targeting nuclear receptor E75 gene of small brown planthopper <130> DP201709014P <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 5296 <212> DNA <213> Laodelphax striatellus <400> 1 ccgcctcaag ctctgactat ggccaggcaa cagcgttttg ttggcttggc ttcacacttc 60 tcgcttcagt cgactcttga acacggtccc agatagttct atgcgtctcc gtgcgttgtt 120 tccattcaaa aattacctag gcgtgaaaat ctactagggt agtgagtgat tgatttttat 180 ctgctccaaa gagaacactt ggatattcac tggtgacaac atttaattcc tagaggggaa 240 atcttctagt gtataggttt actccaccgt tgatatcaac actttgtgtg aaaaactgtg 300 ctcattcaaa ttttgtttgt aaaaactgta ggaacttgtg caattgcaac actgttttgg 360 ggaagttgtt ctcccagtgc tgttacgccc ctcaacccag ttgtagaatt gtgggctatg 420 ggatgtgttt cgacgccgaa taacaccgat aacgatacaa gtatggctcc cacttgtctt 480 accaactcgg cctccgccaa tgttgttatc agcgaggccc tcctaaaagt acaaaacgaa 540 aaggactcta tcatcgaatc ctgctattcg gacatagatg 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Claims (13)

1. 서열번호 2로 표시되는 서열을 갖는 이중가닥 RNA (dsRNA)로, 상기 이중가닥 RNA는 애멸구 핵수용체 E75 단백질 발현을 억제하여, 상기 애멸구에 의해 매개되는 바이러스 방제능을 갖는, 이중가닥 RNA.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 애멸구 핵수용체 E75 단백질를 코딩하는 DNA는 서열번호 1로 표시되는 것인, 이중가닥 RNA.
   
3. 제 2 항에 따른 이중가닥 RNA를 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터.
   
4. 제 3 항에 따른 벡터로 형질 전환된 식물.
   
5. 제 1 항에 따른 이중 가닥 RNA 또는 제 3 항에 따른 벡터를 포함하는 애멸구 매개 바이러스 방제용 조성물.
   
6. 제 5 항에 있어서,
   상기 바이러스는 벼줄무늬잎마름병 바이러스 또는 벼검은줄오갈병 바이러스를 포함하는 것인, 애멸구 매개 바이러스 방제용 조성물.
   
7. 서열번호 2의 서열을 갖는 dsRNA, 상기 dsRNA를 발현하는 벡터, 또는 상기 dsRNA 또는 상기 벡터를 포함하는 조성물을, 애멸구, 애멸구의 유충 또는 애멸구의 알; 상기 애멸구 기주의 전부 또는 일부 또는 상기 기주의 종자; 또는 상기 애멸구 매개 바이러스의 방제가 필요한 기주의 서식지와 접촉시키는 단계를 포함하는, 애멸구 매개 바이러스 방제 방법.
   
8. 제 7 항에 있어서,
   상기 애멸구 매개 바이러스는 벼줄무늬잎마름병 바이러스 또는 벼검은줄오갈병 바이러스를 포함하며,
   상기 dsRNA는 상기 애멸구의 E75 유전자의 단백질로의 발현을 억제하여, 상기 애멸구가 매개하는 상기 바이러스의 증식을 억제하는 것인, 애멸구 매개 바이러스 방제 방법.
   
9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
   상기 애멸구 E75 유전자는 서열번호 1의 서열로 표시되며, 상기 dsRNA는 상기 서열번호 1의 2847 내지 3296번째 서열에 결합하는 것인, 애멸구 매개 바이러스 방제 방법.
   
10. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
    상기 기주는 벼, 보리, 밀, 조, 옥수수 및 수수를 포함하는 식량 작물, 또는 바랭이, 뚝새풀, 포아풀, 및 줄풀을 포함하는 화본과 식물인, 애멸구 매개 바이러스 방제 방법.
    
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