KR101334846B1 - 벼줄무늬잎마름병 바이러스 유래 ｎｓ3유전자의 신규 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 핵산서열로 이루어진 유전자를 보유하는 벡터를 포함하는 외래 유전자 발현 증대용 조성물 및 서열번호 1의 핵산서열로 이루어지는 유전자를 식물체내에서 발현시키고자 하는 외래 유전자와 함께 식물체내에 도입시킴으로써 식물체내에서의 외래 유전자의 발현을 증대시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따라 서열번호1로 기재되는 핵산서열로 이루어진 유전자를 식물체 내에서 발현시키면 그 식물체에 동시에 도입된 다른 유용한 유전자의 발현을 증대시켜 유용유전자의 발현에 의한 단백질의 발현량, 발현기간 및 안정성이 증대된다.

Description

벼줄무늬잎마름병 바이러스 유래 ＮＳ3유전자의 신규 용도 {Novel Use of NS3 Gene from Rice Stripe Virus}

본 발명은 식물체 내에 도입된 유용유전자의 발현을 증진시켜 유전자 산물인 단백질의 발현량 및 발현기간을 증대시키고 안정화시키는데 필요한 유전자를 탐색하는 과정에서 발견된 유전자침묵(Gene silencing)을 억제한다고 알려진 벼줄무늬잎마름병 바이러스 유래 NS3유전자의 신규 기능에 관한 것이다.

대부분의 진핵생물은 상동성에 의존한 RNA 파괴시스템을 유전자침묵현상(post-transcriptional gene silencing, PTGS)이라 하며, 동물에서는 RNA 간섭(RNA interference), 진균에서는 quelling이라고 하지만 기존원리는 동일하다. 어떤 식물 바이러스는 유전자침묵현상을 차단하는 단백질을 암호하는 것으로 알려져 있는데, poty 바이러스의 HC-Pro(helper component-proteinase) 단백질은 유전자침묵현상이 유지되는 것을 방해하고, 오이모자이크바이러스의 2b 단백질은 새로 생겨나는 잎에 PTGS가 일어나는 것을 차단한다. 또한 감자바이러스 X의 p25 단백질은 유전자침묵현상이 식물체 전체로 퍼지는 것을 차단하는 것으로 알려져 있으며(The Plant Journal (2002), 29(5), 555~567), 벼줄무늬잎마름병 바이러스 유래 NS3유전자 또한 유전자침묵(Gene silencing)을 억제한다고 알려져 있다.

생명공학은 현재에도 급속히 발전하고 있고 그 범위도 넓어져 가고 있다. 특히 식물 또는 동물들에게서 인간에게 유용한 특성을 발휘할 수 있도록 외래유전자를 도입하여 형질전환식물 또는 형질전환동물을 제조하는 기술분야에 관한 연구가 활발하며, 그중에서도 동물에 비하여 식물을 대상으로 한 유전자조작은 더욱 실용화단계에 와있다. 이처럼, 외래유전자를 도입하여 신기능의 GM작물을 개발함에 있어서 외래유전자 도입에 따른 효과를 가시적으로 얻기 위해서는 도입유전자의 발현량을 일정 이상 증대시켜야 할 뿐만 아니라, 도입유전자의 발현을 안정적으로 유지시켜야 한다. 그러나 상기한 유전자 침묵(gene silencing)과 같은 문제가 발생하여 유용한 도입유전자의 안정적인 발현을 안정적으로 증대시키기 곤란하다는 문제가 빈번하게 발생하였다.

본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위하여 식물체에 도입된 다른 유용한 유전자의 발현량, 발현기간을 혁신적으로 증대시키고 발현단백질의 안정화를 도모할 수 있는 벼줄무늬잎마름병 바이러스 유래 NS3유전자의 신규기능을 개발하고 응용가능성을 확인하여 생명공학분야에 응용될 수 있도록 제공하고자 한다.

상기와 같은 과제의 해결을 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 핵산서열로 이루어진 유전자를 보유하는 벡터를 포함하는 외래 유전자 발현 증대용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 서열번호 1의 핵산서열로 이루어지는 유전자를 식물체내에서 발현시키고자 하는 외래 유전자와 함께 식물체내에 도입시킴으로써 식물체내에서의 외래 유전자의 발현을 증대시키는 방법을 제공한다.

본 발명에 따라 서열번호1로 기재되는 핵산서열로 이루어진 유전자를 식물체 내에서 발현시키면 그 식물체에 동시에 도입된 다른 유용한 유전자의 발현을 증대시켜 유용유전자의 발현에 의한 단백질의 발현량, 발현기간 및 안정성이 증대된다. 이는 향후 농업분야에서의 유용유전자 개발에 의한 품종육성에 활용될 수 있는 매우 유용한 응용기술(방법)로 사용될 수 있다.

도 1은 NS3 유전자를 발현시키는 식물형질전환용 벡터 지도이다.
도 2는 담배잎 조직에서의 GFP 발현증대 효과를 나타낸다. 좌측부터 시계방향으로 GFP유전자만 존재하는 대조군; 오이모자이크 바이러스 유래 2b유전자를 사용한 비교군; 및 본 발명의 NS3유전자를 사용한 실험군이다.
도 3은 담배잎 조직에서 GFP 및 NS3, 2b 유전자의 mRNA 발현량을 분석한 결과이다.

본 발명은 서열번호 1의 핵산서열로 이루어진 유전자를 보유하는 벡터를 포함하는 외래 유전자 발현 증대용 조성물을 제공한다.

본 발명의 발명자들은 외래유전자를 도입한 형질전환식물에 있어서 벼줄무늬잎마름병 바이러스 유래 NS3유전자를 발현시키면, 유전자 침묵현상이 억제될 뿐만 아니라, 도입유전자의 발현량, 기간이 혁신적으로 증대되므로써, 단백질 발현의 불안정성의 문제가 해결되어 유용한 유전자를 대량으로 안정적으로 생산할 수 있다는 것을 발견하여 본 발명에 이르게 되었다.

본 명세서에서 사용된 ‘외래 유전자’란 벼줄무늬잎마름병 바이러스 유래 NS3 유전자와 함께 도입되는 식물체에 형질도입시키고자 하는 목적 유전자를 의미하며, ‘외래 유전자 발현 증대’란, 상기 외래 유전자의 유전자 복제, 이를 통한 단백질 발현의 증가를 유도하는 것을 의미한다.

본 발명의 상기 벼줄무늬잎마름병 바이러스 유래 NS3유전자는 636bp의 서열번호 1로 기재되는 핵산서열로, 211 아미노산을 갖는 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함한다.

서열번호 1의 핵산서열을 갖는 유전자 외에도, 상기 서열들의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 본다. 변이체는 핵산서열은 변화되지만, 서열번호 1의 핵산서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기서열로 이루어진 유전자이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 벼줄무늬잎마름병 바이러스 유래 NS3유전자는 서열번호 1의 핵산서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따른 서열번호 1의 핵산서열로 이루어진 벼줄무늬잎마름병 바이러스 유래 NS3유전자를 보유하는 벡터는 pGreen0229 벡터이며, 이는 도 1에 기재되어 있다. 그러나, 본 발명의 벡터는 도 1에 기재된 벡터에 한정되지 않고, 식물의 형질전환에 유용한 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 식물 발현 벡터의 바람직한 예는 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명에 있어서 “벡터(vector)”는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 보유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 “발현 벡터”는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 의해 적절히 선택 가능하다.

본 발명의 일실시예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다.

본 발명은 또한 서열번호 1의 핵산서열로 이루어지는 유전자를 식물체내에서 발현시키고자 하는 외래 유전자와 함께 식물체내에 도입시킴으로써 식물체내에서의 외래 유전자의 발현을 증대시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 서열번호 1의 핵산서열로 이루어지는 벼줄무늬잎마름병바이러스 유래 NS3유전자는 이 유전자로 형질전환된 아그로박테리움 형질전환체의 형태로 식물체내에 도입될 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 아그로박테리움 형질전환체는, 서열번호 1의 핵산서열로 이루어진 유전자를 보유하는 벡터로 아그로박테리움 속 미생물을 형질전환시키는 방법으로 얻어질 수 있다. 이후 이를 대상 식물의 조직에 감염시켜, 형질전환된 식물을 수득할 수 있고, 이러한 형질전환된 식물 내에서 함께 도입된 외래 유전자의 발현이 증대된다.

그러나 아그로박테리움 형질전환체를 이용하는 방법 외에도, 벼줄무늬잎마름병 바이러스 유래 NS3유전자는 발현시키고자 하는 외래 유전자와 함께 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70) 등의 방법을 이용하여 도입될 수 있으며, 이는 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> RSV NS3 유전자 클로닝을 위한 프라이머 및 RT - PCR 방법

RSV로부터 NS3유전자 클로닝하기 위해 바이러스를 10% SDS로 처리한후 phenol용액으로 단백질을 제거하고 바이러스 RNA를 분리하였다. 분리한 바이러스 RNA를 주형으로 primer인 5＇-TTT ACT ATA CAA TAC ACT TCC GAC-3＇, 5＇-CTA GAG TCC ACT AGA CAG CCA GTG -3＇를 사용해 RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)을 실시하였다. Reverse transcription은 45℃ 30분, 94℃ 15분 수행하였고, PCR은 94℃ 30초, 50℃ 30초, 72℃ 1분을 30회 반복하였다. 합성된 NS3유전자는 염기서열측정기(ABI 3100)를 사용하여 핵산서열을 결정하였고, 이를 서열번호 1에 나타내었다.

< 실시예 2> 클로닝된 NS3 유전자를 식물형질전환운반체에 삽입

클로닝된 NS3유전자를 CaMV 35S 프로모터와 터미네이터 사이 SpeI과 EcoRI site에 삽입하여 pGreen0229-NS3를 제작하였다. 제작한 벡터 지도를 도 1에 나타내었다.

< 실시예 3> NS3 유전자에 의한 형광발현단백질 발현증대 검정

형광발현유전자(GFP, 외래유전자)를 보유하며 pGreen0229-NS3를 함유한 아그로박테리움 형질전환체 AGL-1을 50 ug mL-1 카나마이신(kanamycin), 50 ug mL-1 암피실린(ampicillin), 5 ug mL-1 테트라사이클린(tetracycline), 0.02 mM 아세토시린곤(acetosyringone)이 포함된 LB 브로스로 29 ℃ 에서 진탕배양기(shaking incubator)로 배양한 후, 배양액을 원심분리 (5000 gx 5 min)하여 아그로박테리움을 침전시킨 후 펠렛을 10 mM MgCl2, 0.1 mM 아세토시린곤 용액에 재현탁 한 후 농도를 조정하고 (OD600 = 0.2) 얼음에 2 시간 동안 방치하여 아그로박테리움을 준비하였다.

유전자 기능을 확인하기 위한 Agro-infiltration 은 파종 후 3∼4 주 지난 담배의 잎 뒷면에 1 mL 시린지(syringe)를 사용해 기공을 통해 아그로박테리움을 주입하는 방법으로 수행하였다(Voinnet et al. 2003). 비교예로 기존에 개발한 2b유전자 (한국등록특허 제10-0679715호)를 사용하였다. 결과를 도 2에 나타내었다. 좌측부터 시계방향으로 GFP유전자만 존재하는 대조군; 오이모자이크 바이러스 유래 2b유전자를 사용한 비교군; 및 본 발명의 NS3유전자를 사용한 실험군이다.

도 2를 참조하면, NS3 유전자의 발현 유도 효과는 15일까지 GFP 발현량을 볼 때 2b 유전자를 사용한 비교예의 경우보다 강한 것을 확인할 수 있다. 비록 9일까지는 NS3와 2b의 발현강도가 유사한 것처럼 나타나도 12일부터는 NS3가 보다 안정적인 발현증대를 유도하는 것으로 확인되었다. 그러나 GFP만 도입된 대조군은 6일부터 급격하게 GFP 발현량이 감소함을 확인할 수 있었다.

< 실시예 4> NS3 에 의한 GFP 단백질 정량적 생산증대 분석

담배에 GFP, GFP+2b 및 GFP+NS3 유전자를 각각 infilteration한 경우 시간이 경과함에 따라 GFP 발현정도를 파악하였다. 결과를 도 3 및 표 1에 나타내었다.

[표 1]

GFP만 도입된 경우에는 총단백질 1ug당 최대 28ng이 생산되었으나, NS3유전자가 동시 infiltration된 경우에는 약 3배 증가된 76ng이 축적되었다. 그러나 2b유전자는 2배인 54ng을 생산하여, 안정적인 대량생산에는 NS3유전자가 2b 보다 강력하였다. 이는 도 2에서 표현형으로 관찰된 결과와 유사하였다. 이는 도입유전자를 식물체가 발현억제하는 기능을 NS3가 강력히 억제함으로서 발현이 증대되는 것으로 추정되며, 이는 새로운 suppressor를 발견하였다는 것을 보여준다.

또한 도 3을 참조하면, GFP만 도입된 비교예의 경우에는 담배 형질전환체에 내재적으로 발현하던 GFP mRNA가 영향을 받아 유전자침묵이 되었으나, 2b 또는 NS3 유전자가 함께 도입된 경우에는 GFP mRNA가 안정적으로 발현되고 유전자침묵도 발생하지 않는 것을 보여주었다.

그러나 3일까지는 GFP 단독의 경우보다 2b 또는 NS3 유전자가 함께 도입된 경우 mRNA 발현량이 증대하였으나, 6일 이후에는 본 발명의 GFP+NS3 또는 비교예인 GFP+2b 의 경우, mRNA양이 급격히 감소함에도 불구하고, GFP 단백질의 안정적 발현은 지속적으로 유지되는 것을 볼 수 있었다. 따라서 이와 같이 6일 이후에 mRNA양이 감소함에도 불구하고 GFP의 안정적 발현이 지속되었다는 것은 단백질의 발현증대가 반드시 유전자 침묵과 관련된 효과가 아니라는 것을 의미하며, 처리후 9일 이후까지 단백질 발현이 안정하게 증대하는 것은 "유전자침묵"만으로는 설명하기 불가능하다. 즉, NS3 및 2b 유전자는 유전자 침묵 억제 효과외에 유전자 발현증대 및 발현된 단백질의 안정성 증대라는 별도의 추가기능이 있으며, 본원발명은 종래 2b 유전자보다 더욱 향상된 효과를 보이는 NS3 유전자에 관한 것으로, 이와 같이, "유전자 침묵 억제" 현상만으로는 설명될 수 없는, NS3 유전자의 추가의 새로운 기능 및 이를 이용한 외래 유전자의 안정적 발현 증대 방법에 관한 것이다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (3)

1. 벼줄무늬잎마름병 바이러스(rice stripe virus, RSV) 유래 서열번호 1의 핵산서열로 이루어진 NS3 유전자를 보유하는 벡터를 포함하는 외래 유전자 발현 증대 및 발현된 단백질의 안정성 증대용 조성물.
   
2. 벼줄무늬잎마름병 바이러스(RSV) 유래 서열번호 1의 핵산서열로 이루어지는 NS3 유전자를 식물체내에서 발현시키고자 하는 외래 유전자와 함께 식물체내에 도입시킴으로써 식물체내에서의 외래 유전자의 발현 증대 및 발현된 단백질의 안정성을 증대시키는 방법.
   
3. 제2항에 있어서,
   상기 NS3 유전자는 이 유전자로 형질전환된 아그로박테리움 형질전환체의 형태로 식물체내에 도입되는 것인 식물체내에서의 외래 유전자의 발현 증대 및 발현된 단백질의 안정성을 증대시키는 방법.

Images