KR101993938B1 - IFNα2로부터의 SAR 인자를 갖는 발현 시스템 - Google Patents

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Abstract

인간 인터페론 α2 유전자의 SAR3 영역으로부터의 짧은 인간 게놈 뉴클레오티드 서열은 약물 선택 부재하에서 증진된 발현 안정성을 가능하게 하고 재조합 단백질을 생산하기 위한 세포의 안정한 풀 또는 안정한 클론의 생성을 가능하게 한다. 안정한 클론이 생성될 수 있음에도, 안정한 풀을 생성하는 능력은 안정한 클론을 생성하는 부담을 감소시킨다.

Description

IFNα2로부터의 SAR 인자를 갖는 발현 시스템{EXPRESSION SYSTEM WITH SAR ELEMENT FROM IFNα2}
본 출원은 2011년 4월 13일에 출원된 미국 가특허출원 USSN 61/474,879의 우선권을 주장하고, 그 전체 내용은 본원에 참고로 인용된다.
본 발명은 단백질 발현을 증진시키기 위한 폴리뉴클레오티드 및 이 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 시스템에 관한 것이다.
포유 동물 세포에서 높은 수준의 안정한 재조합 단백질(r-단백질) 생산은 저렴한 비용의 바이오치료제 제작을 위해 중요하다. S/MARs(스캐폴드(Scaffold)/매트릭스 부착 영역)는 70 %로 AT가 풍부한 서열이고, 이것은 염색질 기능에서 많은 중요한 역할을 한다고 생각된다. 이것의 구조적 기능외에, S/MARs는 유전자 발현의 시공간적 조직화에서 중요한 역할을 한다(문헌[Alvarez 2000; Liu 1997]). 따라서, 발현 벡터 내 S/MAR 서열의 포함은 발현 수준의 증가 및 트랜스진(transgene)의 침묵(silencing) 방지를 도울 수 있다(문헌[Phi-Van 1990; Jenke 2004; Zahn-Zabal 2001; Kim 2004]). MAR 인자는 숙주 게놈 내로 또는 에피소말(episomal) 벡터의 일부로 통합 후에 작동하는 것으로 나타나있다(문헌[Halweg 2005; Girod 2005]).
UCOE(밀리포어 제품) 또는 MAR(셀렉시스 제품)과 같은 게놈 인자가 이용 가능하고, 안정한 세포계를 생성하는데 사용되는 발현 벡터에서 시스(cis)형 또는 트랜스(trans)형으로 제공될 때 발현 수준 및 안정성을 증진시키는 것으로 입증되었다. 클론 세포계의 생산성 및 안정성을 증진시키기 위해 발현 벡터 내로 혼입될 수 있는 인간 게놈 내 많은 S/MARs가 있다(문헌[Girod 2007]). 그러나, 이 서열의 전부가 유리한 효과를 보여주지 않고(문헌[Sass 2005]), 이 서열은 빈번히 매우 커서(1.5 내지 4 kb) 그 자체로 발현 벡터에 혼입하는 것은 현실적이지 않다. 계속 효율적이면서 짧은(<1 kb) S/MAR 서열을 동정할 필요성이 있지만, 이것을 달성하는 유일한 방식은 시행착오 접근을 통한 것이다.
인간 인터페론 α2 유전자의 SAR3 영역으로부터의 짧은 인간 게놈 뉴클레오티드 서열은 약물 선택 부재하에서 증진된 발현 안정성을 가능하게 하고 재조합 단백질을 생산하기 위한 세포의 안정한 풀 또는 안정한 클론의 생성을 가능하게 한다. 안정한 클론이 생성될 수 있음에도, 안정한 풀을 생성하는 능력은 안정한 클론을 생성하는 부담을 감소시킨다.
따라서, 본 발명의 하나의 측면에서, 755개 이하의 뉴클레오티드를 포함하고 서열 1에 개시된 뉴클레오티드 서열로부터의 적어도 500개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
본 발명의 다른 측면에서, 목적 단백질을 코딩하기 위한 유전자; 발현 시스템의 작동을 위한 뉴클레오티드 서열; 및 유전자의 발현을 증진시키기 위한 발현 시스템에서 시스형으로 혼입되는 빌현 인핸서(enhancer)를 포함하고, 발현 인핸서가 755개 이하의 뉴클레오티드를 포함하고 서열 1에 개시된 뉴클레오티드 서열로부터의 적어도 500개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 인간 인터페론 알파2 상류 스캐폴드 관련 영역 3(SAR3)으로부터의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 숙주 세포에서 재조합 단백질을 생산하기 위한 발현 시스템이 제공된다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명의 발현 시스템을 포함하는 숙주 세포가 제공된다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명의 발현 시스템으로 숙주 세포를 형질 감염시키는 것; 유전자를 발현시키기 적합한 조건하에서 숙주 세포를 증식시켜 목적 단백질을 생산하는 것; 및 목적 단백질을 회수하는 것을 포함하는 재조합 단백질 생산 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 측면에서, 재조합 단백질을 생산하기 위한 발현 시스템에서 시스형의 발현 인핸서로서의 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 용도가 제공된다.
단리된 폴리뉴클레오티드는 755개 이하의 뉴클레오티드를 포함하고 서열 1에 개시된 뉴클레오티드 서열로부터의 적어도 500개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게는, 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열 1에 개시된 뉴클레오티드 서열로부터의 적어도 550, 600, 650, 700 또는 750개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 단리된 폴리뉴클레오티드는 발현 시스템으로 형질 감염된 숙주 세포에서 r-단백질 발현을 증진하기 위한 발현 시스템에서 시스형으로 혼입될 수 있다. 유리하게는, 발현 증진은 약물 선택의 부재하에서 조차도 실현된다.
발현 시스템은 목적 단백질을 코딩하기 위한 유전자를 포함한다. 일부 특정 목적 단백질은 예를 들면, 모노클론 항체(예컨대, 트라스투주맙), 에리트로포이에틴, 인터페론, 혈관내피성장인자, 줄기세포성장인자, 성장 호르몬, 인슐린 유사 성장인자 결합 단백질, 조절 단백질(예컨대, 큐메이트(cumate) 조작체, 테트라사이클린 억제인자, 스테로이드 호르몬 수용체, 막횡단 수용체) 등을 포함한다. 목적 단백질의 아미노산 서열 및 이러한 단백질을 코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다.
발현 시스템은 임의의 적합한 벡터, 예를 들면, 플라스미드 벡터, 에피소말(episomal) 벡터(예컨대, oriP/EBV 벡터), 바이러스성 벡터(예컨대, 백만(Bacman)) 및 코스미드 벡터를 포함할 수 있다. 발현 시스템에서 이용되는 벡터의 유형은 다른 요인들 중에서도 목적 숙주 세포에 따라 달라질 것이고, 이것은 당업계의 숙련자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 벡터는 발현 시스템의 작동을 위한 각종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 뉴클레오티드 서열은 그중에서도 예를 들면, 프로모터(promoter), 복제 기점(예컨대, 복제의 세균 기점(pMB1ori), 복제의 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스 기점(oriP)), 리더(leader)(예컨대, 아데노바이러스 3부분 리더(TPL)), 스플라이스 도너(splice donor)(SD), 다른 인핸서(예컨대, 아네도바이러스 주요 후발 프로모터 인핸서(Enh MLP))를 가능한 포함하는 인트론, 스플라이스 어셉터(acceptor)(SA), 선택 가능한 마커(예컨대, 항생 물질 내성 유전자), 제한효소 컨센서스(consensus) 부위(바람직하게는 다중 제한효소 컨센서스 부위, 예컨대 EcoRV, Cla1, Sfol)를 갖는 클로닝 부위(바람직하게는 다중 클로닝 부위), 및 폴리아데닐화 신호(예컨대, 토끼 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호(pA))를 포함한다. 발현 시스템은 바람직하게는 플라스미드 벡터를 포함한다.
프로모터는 발현 시스템에서 각종 단백질-코딩 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절하는데 유용하다. 강하거나 약한 프로모터가 사용될 수 있다. 일부 프로모터는 예를 들면, 거대세포바이러스(CMV) 프로모터, 원숭이 바이러스 40 프로모터(SV40p), 연장 인자 1 알파-HTLV(EF1α-HTLV) 하이브리드 프로모터 및 라우스(Rous) 육종 바이러스(RSV) 프로모터를 포함한다. 선택 가능한 마커는 양성으로 형질 감염된 세포의 선택을 할 수 있게 한다. 통상의 선택 가능한 마커는 예를 들면, 진핵세포에 대한 퓨로마이신 및 하이그로마이신 B, 및 원핵세포에 대한 암피실린 및 카나마이신과 같은 항생 물질 내성 유전자를 포함한다.
본 발명의 발현 시스템은 임의의 적합한 방법에 의해 숙주 세포로 형질 감염될 수 있다. 이러한 방법은 일반적으로 당업계에 알려져 있다(문헌[Kim 2010]). 숙주 세포는 바람직하게는 진핵 세포, 더 바람직하게는 포유 동물 세포, 예를 들면 인간 배아 신장 293(HEK293) 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 아기 햄스터 신장(BHK21) 세포, PerC6 세포 또는 COS7 세포이다. 인간 배아 신장 293(HEK293) 및 중국 햄스터 난소(CHO) 세포가 특히 바람직하다.
형질 감염된 숙주 세포는 목적 단백질을 코딩하기 위한 폴리뉴클레오티드의 발현을 가능하게 하기 적합한 조건하에서 증식된다. 이러한 조건은 일반적으로 알려진 숙주 세포, 예를 들면, HEK 및 CHO 세포와 같은 포유 동물 세포에 대해 잘 알려져 있다. 세포의 증식은 전형적으로 배양 배지에서 이뤄지고 또한 배양된 세포로부터 목적 단백질을 회수하는 것은 알려진 방법에 의해 손쉽게 이뤄질 수 있다(문헌[Hauser 1997]).
유리하게는, 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드는, 발현 시스템에서 시스형으로 혼입될 때 숙주 세포에서 안정한 발현을 증진시킬 수 있고, 약물 선택의 부재하에서 증진된 발현 안정성을 가능하게 하고, 비록 에피소말 발현 시스템(예컨대, oriP/EBNA1 시스템)으로 생성된 풀이 선택이 없어 안정하지 않을지라도 약물 선택의 부재하에서 발현 안정성을 증진시키기 위해 에피소말 발현 시스템(예컨대, oriP/EBNA1 시스템)과 조합될 수 있고, 안정한 클론의 생성 부담없이 r-단백질을 생산하기 위한 안정한 풀의 생성을 가능하게 한다.
본 발명의 추가적인 특징은 하기 상세한 설명의 전개로 기술되거나 명백해질 것이다.
본 발명을 더 명확하게 이해할 수 있게 하기 위해, 이제 이것의 실시태양을 첨부된 도면을 참고하여, 실시예로 상세하게 기술할 것이다.
도 1a는 상류 스캐폴드 관련 영역 3(SAR3)을 포함하는, 각종 스캐폴드 관련 영역의 위치를 보여주는 인간 인터페론 α2 유전자의 선행기술(문헌[Strissel 1998]의 도 1a)에서 가져온 제한 효소 지도를 묘사한다. 두 개의 EcoRI 부위가 "E"로 명시되고 동그라미 쳐져 있다. SAR3 영역에서 스트리쎌(Strissel)에 의해 확인된 0.7 kb SAR은 "j, R=70"으로 명시되고 또한 동그라미 쳐져 있다.
도 1b는 인간 인터페론 α2 유전자의 SAR3 영역을 보여주고, 본 발명의 SAR(SAR-BRI)가 이 지도에 위치되어 있는 곳을 보여주는 선행기술(문헌[Strissel 1998]의 도 1c)에서 가져온 제한 효소 지도를 묘사한다.
도 1c는 이 영역 내 제한 부위에 관한 SAR-BRI의 위치를 보여주는 SAR IFNa의 3483 bp 상류 영역의 지도를 묘사한다.
도 2는 EcoRV 및 Sfol 제한 부위의 위치를 보여주는 본 발명의 SAR의 제한 지도를 묘사한다.
도 3a는 SAR-BRI를 함유하는 pTT54-EPO 플라스미드의 벡터 지도를 묘사한다.
도 3b는 SAR-BRI를 함유하지 않는 pTT55-EPO 플라스미드의 벡터 지도를 묘사한다.
도 3c는 pTT54-EPO 및 pTT55-EPO로 형질 감염된 CHO-DG44 풀의 웨스턴 블롯(western blot), 및 형질감염 후(왼쪽) 20일 및 형질감염 후(오른쪽) 60일의 EPO 발현을 묘사한다.
도 3d는 새로 해동된 pTT54-EPO 클론(+S/MAR 인자)의 대조군(Ctrl) 배치(왼쪽 레인(lane))와 비교한 선택없이 50일 동안 유지된 pTT54-EPO 클론(+S/MAR 인자)(오른쪽 레인)의 웨스턴 블롯을 묘사한다.
도 3e는 pTT54-EPO(위쪽) 및 pTT55-EPO(아래쪽)로 형질 감염된 세포의 세포 배양물로부터의 상등액의 닷블롯(dotblot)을 묘사하고, 여기서 상등액에서 EPO의 존재는 항-EPO 항체를 사용하여 검출된다.
도 4a는 SAR-BRI를 함유하는 pTT54-TZMHc 플라스미드의 벡터 지도를 묘사한다.
도 4b는 SAR-BRI를 함유하지 않는 pTT55-TZMHc 플라스미드의 벡터 지도를 묘사한다.
도 4c는 SAR-BRI를 함유하지 않는 pTT52-TZMLc 플라스미드의 벡터 지도를 묘사한다.
도 4d는 형질감염 후(왼쪽) 6일 및 형질감염 후(오른쪽) 25일에 허셉틴™(Herceptin)을 발현시킨 pTT54-TZMHc+pTT52-TZMLc 및 pTT55-TZMHc+pTT52-TZMLc로 형질 감염된 CHO-DG44 풀의 웨스턴 블롯 비교를 묘사한다.
도 5a는 SAR-BRI를 함유하는 pTT44-EG2Fc 플라스미드의 벡터 지도를 묘사한다.
도 5b는 선택없이 41일에 걸쳐 CHO-DG44-EG2Fc(클론 1A7)에 대한 유지 스케줄을 묘사한다.
도 5c는 도 5b에서와 같이 유지되고 이어서 새로운 배양 플라스크 내로 4일차(배치 1)에 이전되고 다른 8일 동안 배양된 CHO 세포의 생존성 및 세포 밀도를 보여주는 그래프를 묘사한다.
도 5d는 도 5b에서와 같이 유지되고 이어서 새로운 배양 플라스크 내로 36일차(배치 2)에 이전되고 다른 8일 동안 배양된 CHO 세포의 생존성 및 세포 밀도를 보여주는 그래프를 묘사한다.
도 5e는 4일 및 8일 후의 배치 1 및 배치 2 배양에서 EG2Fc 역가를 결정하기 위한 쿠마시(Coomassie) 염색을 이용한 SDS-PAGE를 묘사한다.
바람직한 실시태양의 묘사
실시예 1: SAR - BRI 의 합성
본 발명의 SAR의 예는 서열 1에 개시되어 있고, 이것은 인간 인터페론 α2 상류 스캐폴드 관련 영역3(SAR3) 서열(gi|1791229|gb|U82705.1|HSU82705)의 bp 수 1000-1750에 상응하는 751개의 뉴클레오티드 서열이다. 73.4 %로 AT가 풍부한(38.9 % A, 34.5 % T, 12.2 % C, 14.4 % G) 서열 1을 잠재적 발현 격리물로 확인하였고, 진아트(Geneart)와 일반적으로 알려진 방법을 사용하여 이것을 합성하기로 계약하였다. 이 서열은 내인성의 EcoRI 및 EcoRV 제한 부위를 파괴시켜 생성되었던 두 개의 염기 변이(각각 C1639→G 및 G1695→T)를 보유한다. 또한, 이 서열을 도 2에 나타난 바와 같이, 클로닝의 목적을 위해 각각 5' 및 3' 말단에 EcoRV 및 Sfol 제한 부위로 플랭킹(flanking)하였다.
이전에, IFN-α2의 SAR3 영역으로부터의 0.7 kb "강한" SAR 인자를 확인하였다(문헌[Strissel 1998]). 도 1a에 나타난 바와 같이, 이 0.7 kb SAR(j, R=70)은 두 개의 EcoRI 부위(동그라미 친 E) 사이에 위치된다. 그에 반해, 본 발명의 SAR(SAR-BRI)은 도 1b에 나타난 바와 같이 두 번째 EcoRI 부위의 상류에 위치하고 첫 번째 EcoRI 부위 바로 뒤에서 끝난다. 3483 bp SAR IFNα 서열의 bps 1000-1750을 포괄하는 SAR3에서 SAR-BRI의 위치는 도 1c에 추가로 묘사된다. 본 발명의 SAR(SAR-BRI)는 스트리쎌에 의해 확인된 0.7 kb SAR(j, R=70)에 상응하지 않는다는 것은 도 1로부터 명확하다.
추가로, 문헌[Strissel 1998]에 개시된 SARs의 강도는, 하기 스트리쎌 참고문헌에 명시되어 있는 바와 같이, 펠렛(핵) 분획과 상등액 사이의 DNA 단편의 재분배에 기초한다.
"펠렛 분획에서의 분배에 대한 각각의 개별적인 DNA 단편의 상대적 강도(R)를 펠렛 더하기 상등액의 세기의 합으로 나눈 펠렛의 밴드 세기로 측정하였다(R = IP/IP + IS). R값을 이미 공개된 SAR 및 비-SAR DNA 단편에 대해 결정하였고, 이 모두를 동일한 사우던 블롯(Southern blot)으로 동시에 혼성화하여 결합 친화성에 대한 표준을 설정하였다(문헌[Strissel et al. 1996]의 표 1 참조). 강한 SAR DNA 단편에 대해 설정된 R값은 펠렛 분획 내에서 70 %(R> 70) 풍부를 나타내고, 예를 들면 B1 5*　SAR.."
그러므로, 스트리쎌은 0.7 kb SAR 자체의 생체 내(in vivo) 활성 기능을 제공하지 못하고, 문헌[Strissel 1998]에서 확인된 SAR의 생채 내 강도가 알려지지 않았다는 의미이다.
실시예 2: 에리트로포이에틴( EPO ) 발현 플라스미드
실시예 1에서 합성된 SAR-BRI 서열을 퓨로마이신 내성 카세트와 복제의 원핵 기점(pMB1) 사이에 놓인 EcoRV 제한 부위에서의 pTT55-EPO 벡터(도 3b)에 삽입하여 pTT54-EPO 플라스미드를 수득하였다(도 3b). pTT55-EPO 플라스미드는 CMV5 프로모터의 조절하에서 코돈-최적화된 인간 에리트로포이에틴 cDNA(진아트)를 코딩한다(문헌[Durocher 2002; Massie 1998]).
pTT55-EPO 및 pTT54-EPO 플라스미드를 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 내로 형질 감염시켰고 이 세포를 퓨로마이신 선택하에서 배양하여 안정한 CHO-DG44 EPO 풀을 형성하였다. EPO를 발현시키는 CHO-DG44 풀을 생성하기 위해, CHO CD-DG44 배지(인비트로젠(Invitrogen))에서 증식된 세포를 1:5(w:w)의 DNA:PEI 비율에서의 수퍼코일 플라스미드 DNA 1 μg/ml를 사용하여 PEImax(폴리사이언스(Polysciences))로 형질 감염시켰다. 이어서 퓨로마이신을 10 μg/ml의 농도로 형질 감염 후 24시간(hpt)에 첨가하였다. 배양 배지를 60일 이상 동안 퓨로마이신을 함유하는 새 배지로 정기적으로 교체하였다.
형질 감염 후 20 및 60일 후에, pTT54-EPO 및 pTT55-EPO 벡터로 생성된 풀간의 EPO 발현을 비교하였다(도 3c). 이렇게 하기 위해, 세포를 신선한 배지에 0.2x106 세포/ml의 밀도로 새로운 플라스크에 이전시켰고 배양을 5-6일 동안 유지하였다. 이어서 배양 배지의 샘플을 항-EPO 항체를 사용하는 웨스턴 블롯으로 분석하였다(도 3c). 이것의 광범위하고 불균일한 글리코실화에 의해, EPO는 SDS-PAGE 상에서 다중 밴드(도말 표본)로서 이동하였다.
본 발명의 SAR-BRI를 함유하는 pTT54-EPO로 형질 감염된 CHO 세포가 더 긴 기간에 걸쳐 높은 수준으로 r-단백질을 발현시킬 수 있다는 것이 도 3c로부터 명백하다. pTT54-EPO 플라스미드 및 pTT55-EPO 플라스미드 모두 형질 감염 후 20일에 양호한 발현(왼쪽 블롯)을 제공하는 반면, SAR-BRI을 갖는 pTT54-EPO만이 형질 감염 후 60일에 유의한 r-단백질 발현(오른쪽 블롯)을 제공하였다. 이것은, 본 발명의 SAR의 사용이 안정한 클론을 생성할 필요성없이 r-단백질을 생산하기 위한 안정한 풀의 생성을 가능하게 한다는 것을 설명한다.
추가로, 선택없이 50일 동안 유지된 EPO 클론(+S/MAR 인자)을 대조군(Ctrl)으로 EPO 클론(+S/MAR 인자)의 새롭게 해동된 배치와 병행하여 비교하였다. 웨스턴 블롯(도 3d)은 클론이 매우 안정하다는 것을 나타내는 유사한 생산성(140 mg/L)을 모두 보여준다.
게다가, pTT54-EPO 및 pTT55-EPO 벡터로 얻어진 풀로부터의 세포를 선택의 부재하에서 반-고체 배지(문헌[Caron 2009])에 낮은 세포 밀도로 평판 배양하였다. 콜로니가 4-10 세포에 도달되었을 때, 이것을 무작위로 골랐고 96-웰 플레이트(well plate) 내로 이전시켰다. 배양 일주일 후에, 각 웰로부터의 상등액의 분취액을 니트로셀룰로스 막에 떨어뜨렸고 EPO의 존재는 항-EPO 항체를 사용하여 검출하였다. 양성 클론의 수는 SAR-BRI를 함유하는 pTT54-EPO로 형질 감염된 세포의 경우에 더 높다는 것이 도 3e로부터 명확하다(위쪽 닷블롯). 또한, SAR-BRI로 얻어진 클론의 대부분은 SAR이 없는 것보다 더 많은 EPO를 발현시킨다. 모든 막에 침착된 EPO의 동일한 양을 포함하는 EPO 표준은 각각의 닷블롯 상에 격자 위치 H12에 보여진다. SAR-BRI를 함유하지 않는 pTT55에서 더 긴 노출을 필요로 하였다.
이 결과는 본 발명의 SAR의 사용이 높은 수준으로 r-단백질을 생산하기 위한 안정한 클론의 생성을 가능하게 한다는 것을 설명한다.
실시예 3: 허셉틴™ 발현 플라스미드
허셉틴™은 모노클론 항체 트라스투주맙에 대한 상표명이다. 코돈-최적화된 허셉틴™ 중쇄 cDNA(진아트)를 pTT54 또는 pTT55 벡터 내로 클로닝하여 pTT54-TZMHc 플라스미드(도 4a) 및 pTT55-TZMHc 플라스미드(도 4b)를 수득하였다. 허셉틴™ 경쇄를 pTT52 벡터 내로 클로닝하여 pTT52-TZMLc 플라스미드(도 4c)를 수득하였다. pTT52 벡터는, 퓨로마이신 내성 유전자를 글루타민 신타제 유전자(hGS)로 대체하였다는 것 외에는 pTT55 벡터와 동일하다. pTT54-TZMHc 플라스미드는 SAR-BRI 서열을 함유하나, pTT55-TZMHc 및 pTT52-TZMLc는 그렇지 않다.
허셉틴™을 발현시키는 안정한 CHO-DG44 풀을 생성하기 위해, 두 벡터를 1:1(w:w) 비(pTT54-TZMHc + pTT52-TZMLc 또는 pTT55-TZMHc + pTT52-TZMLc)로 공동 형질 감염시켰다는 것 외에는 실시예 2의 EPO에 대해 기술된대로 세포를 형질 감염시켰다. 선택을 EPO에 대해 한 바와 같이 행하였다. 생성된 풀에 의한 허셉틴™의 발현을 항-hFc 항체를 사용하는 리듀싱(reducing) 또는 비-리듀싱 조건하의 웨스턴 블롯에 의해 형질 감염 후 6일 또는 25일에 비교하였다(도 4d). SDS-PAGE에서의 부분적으로 분해된 항체 시편의 존재는 배양 동안 이황화 결합 감소때문일 수 있고 이미 기술되어 왔다(문헌[Trexler-Schmidt 2010]).
본 발명의 SAR-BRI를 함유하는 pTT54-TZMHc로 형질 감염된 CHO 세포가 더 긴 기간에 걸쳐 높은 수준으로 r-단백질을 발현시킬 수 있다는 것이 도 4d로부터 분명하다. pTT54-TZMHc 플라스미드 및 pTT55-TZMHc 플라스미드 모두 형질 감염 후 6일에 양호한 발현(왼쪽 블롯)을 제공하는 반면, SAR-BRI을 갖는 pTT54-TZMHc 만이 형질 감염 후 25일에 유의한 r-단백질 발현(오른쪽 블롯)을 제공하였다. 이것은, 본 발명의 SAR의 사용이 안정한 클론을 생성할 필요성없이 r-단백질을 생산하기 위한 안정한 풀의 생성을 가능하게 한다는 것을 추가로 설명한다. SAR-BRI 서열로 생성된 EPO 풀(실시예 2, 도 3e)이 더 높은 빈도의 고-발현 EPO 클론을 제공하기 때문에, 더 높은 빈도의 고-발현 허셉틴™ 클론 또한 SAR-BRI 인자의 존재하에서 관찰될 것이 예상된다.
실시예 4: EG2 cHCAb 발현 플라스미드
키메라 중쇄 항체 EG2(문헌[Zhang 2009])을 pTT44 벡터 내로 클로닝하여 pT44-EG2Fc 플라스미드를 수득하였다(도 5a). pT44 벡터는 토끼 베타-글로빈 대신 소 성장 호르몬에서의 것인 퓨로마이신 폴리아데닐화 신호 외에는 pTT54 벡터와 일치한다.
EG2Fc를 발현시키는 CHO-DG44 클론을 생성하기 위해, 플라스미드를 PvuI 효소를 이용한 소화에 의해 선형화하는 것 외에는 실시예 2의 EPO에 대해 기술된대로 세포를 형질 감염하였다. 형질 감염 후에, 세포를 8일 동안 퓨로마이신 10 μg/ml의 존재하에서 선택하였다. 이어서, 퓨로마이신 내성 세포를 이전에 기술된대로(문헌[Caron 2009]) 퓨로마이신 선택없이 반고체 배지에서 250 세포/ml의 밀도로 평판 배양하였다. EG2Fc의 존재를 반고체 배지에서 형광-표지된 항-IgG 항체의 포함으로 모니터링하였고 높은 수준의 cHCAb를 발현시키는 클론을 형광 현미경으로 확인하였고 셀셀렉터™(CellCelector) 클론 픽커(picker)를 사용하여 96 웰-플레이트에 이전시켰다(문헌[Caron 2009]).
도 5b에 묘사된 바와 같이, 하나의 클론(1A7)을 높은 생산성에 대해 선택하였고, 추가로 확장하여 마스터 세포 은행(MCB)를 만들었다. MCB로부터의 하나의 바이알의 해동 후에, 퓨로마이신 선택없이 현탁액에서 이 클론의 조방 배양 후에 생산성을 평가하였다. 이렇게 하기 위해, 세포를 해동 후 4일차(배치 1) 및 36일차(배치 2)에 새로운 플라스크로 이전시켰고 8일 동안 배양하였다. 도 5c 및 5d는 배치 1(도 5c) 및 배치 2(도 5d) 모두에 대해 새로운 배양이 생존성 및 총 세포 밀도면에서 여전히 매우 유사하였다는 것을 설명한다.
4일 및 8일 후의 배치 1 및 배치 2 배양에서의 EG2Fc 역가를 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색으로 비교하였다(도 5e). 정제된 EG2Fc 대조군(도 5e에서 레인 2) 100 mg/L를 비교 목적을 위해 병행하여 넣었다. 선택 압력없이 세포를 배양한 지 4일 후에(레인 3 및 4), r-단백질 발현이 분명하였고, 8일 후에(레인 5 및 6), r-단백질 발현 수준은 매우 높았다는 것이 도 5e로부터 분명하다. 세포를 선택의 부재하에서 이른(4일차) 또는 늦은(36일차) 계대에서 취하였든지 간에 생산성이 매우 유사하기 때문에, 이것은 본 발명의 SAR의 사용이 약물 선택 압력의 부재하에서 조차도 클론에서의 발현 안정성을 강하게 만든다는 것을 입증한다.
실시예 5: 엡스타인-바( EBV ) 에피솜에서의 SAR - BRI
EBV의 에피솜은 선택 압력의 부재하에서 세대 당 1-4 %의 비율로 손실되는 것이 잘 알려져 있다(문헌[Lindner 2007]). EBV 에피솜의 보존을 증진시키기 위한, oriP 플라스미드에 S/MAR 인자를 조합시키는 시도는 지금까지 실패해 왔다(문헌[Giannakopoulos 2009]).
oriP-함유 pTT22-GFP 벡터로 형질 감염된 HEK293-EBNA1 세포의 풀은 선택 압력을 배양에서 72일 후에 제거할 때 GFP 발현을 상실한다. 그러나, 예비의 미공개된 연구에서, pTT22-GFP 벡터에 인간 베타-글로빈 및/또는 베타-인터페론으로부터의 하나 또는 두 개의 S/MAR 서열의 포함은, GFP-양성 세포의 상당히 더 높은 퍼센트가 125일(선택없이 53일) 후에 관찰될 수 있으므로 선택 압력의 제거시 에피솜 안정성을 증진시킨다. 유사하게, 에피소말 벡터 내 SAR-BRI의 포함 또한 선택 압력의 제거시 에피솜 안정성을 증진시킬 것이 예상된다.
Figure 112013099571492-pct00001
참고 문헌: 각각 이것의 전체 내용은 이것의 참고로 인용된다.
Figure 112013099571492-pct00002
Figure 112013099571492-pct00003
Figure 112013099571492-pct00004
Figure 112013099571492-pct00005
Figure 112013099571492-pct00006
이 체계에 내재하는 다른 이점은 당업계의 숙련자에게 명백하다. 실시태양은 설명적으로 본원에 기술되고 청구된 본 발명의 범위를 제한하는 것을 의미하지 않는다. 앞서 말한 실시태양의 변형은 보통의 기술자에게 분명할 것이고 발명자에 의해 하기 청구항에 의해 포괄될 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> National Research Council of Canada Durocher, Yves <120> EXPRESSION SYSTEM WITH SAR ELEMENT FROM IFNalpha2 <130> 12273-1 <150> 61/474,879 <151> 2011-04-13 <150> PCT/CA2012/000254 <151> 2012-03-20 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 751 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 aatcagagaa acaaaaatgt tagaaaattc ttgcaggtga ttttcaatat tgttttattt 60 tgtgcaaaaa ataattaacc ttttagaagg tcccagagta ttagaagccc aaactctgga 120 atattctcaa ttttagttga gcttttcagt tattataata ttgtatagct actcatataa 180 ttagtaatac aaaagattct gagtcttatt tgtaaataaa gttcaaaata agtcatatgt 240 tatatgttat aggtaatcat gttagatata aaccactatt gaaaaagata taaaaacaaa 300 ataactttat tttttgttat catatatata gtccattatg ttcacattta gaatgatgtt 360 aacaattgtt ttgacatttt taaaatgaaa aactcatata tctagttcat gaaattgtta 420 ataaactaga aaatatatgg acataaaaat gacattagcc aagatatgat aatgaggcaa 480 tggtggcagg gtacacaagg cataaaagcc attatttccc acccaaaatg ttatgtcaca 540 tttgtgcctt actcagctat aatttatgta aaaatctgat ttgtgaatta agataacttt 600 ttaaaagatt gtacaaaggt atatctacat ttttgaattg aactagagat gggaattatc 660 atgtcgtatt aaccactaca ttaaaaacac ttaagtatat ctagggcata aaaataaaaa 720 tcgatgtaat ggcacttaag atatgtatta a 751

Claims (18)

  1. 서열 1에 개시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  2. 목적 단백질을 코딩하기 위한 유전자; 발현 시스템의 작동을 위한 뉴클레오티드 서열; 및 유전자의 발현을 증진시키기 위한 발현 시스템에서 시스(cis)형으로 혼입되는 발현 인핸서(enhancer)를 포함하고, 발현 인핸서가 제1항에서 정의된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 숙주 세포에서 재조합 단백질을 생산하기 위한 발현 시스템.
  3. 제2항에 있어서, 상기 유전자 및 상기 발현 인핸서를 함유하는 플라스미드 벡터를 포함하는 발현 시스템.
  4. 제2항에 있어서, 상기 유전자 및 상기 발현 인핸서를 함유하는 에피소말(episomal) 벡터를 포함하는 발현 시스템.
  5. 제2항에 있어서, 상기 유전자가 모노클론 항체, 에리트로포이에틴, 인터페론, 혈관내피성장인자, 줄기세포성장인자, 성장 호르몬, 또는 인슐린 유사 성장인자 결합 단백질을 코딩하는 것인, 발현 시스템.
  6. 제2항에 있어서, 상기 발현 시스템의 작동을 위한 뉴클레오티드 서열이 프로모터(promoter), 복제 기점, 리더(leader), 스플라이스 도너(splice donor), 인트론, 스플라이스 어셉터(acceptor), 선택 가능한 마커, 클로닝 부위, 제한 효소 컨센서스(consensus) 부위 및 폴리아데닐화 신호 중 하나 이상을 포함하는 것인, 발현 시스템.
  7. 제2항에서 정의된 발현 시스템을 포함하는 숙주 세포.
  8. 제7항에 있어서, 포유 동물 세포인 숙주 세포.
  9. 제7항에 있어서, 인간 배아 신장 293(HEK293) 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 아기 햄스터 신장(BHK21) 세포, PerC6 세포 또는 COS7 세포를 포함하는 숙주 세포.
  10. 제7항에 있어서, 인간 배아 신장 293(HEK293) 세포 또는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 포함하는 숙주 세포.
  11. 제2항에서 정의된 발현 시스템으로 숙주 세포를 형질 감염시키는 것; 유전자를 발현시키기 적합한 조건하에서 숙주 세포를 증식시켜 목적 단백질을 생산하는 것; 및 목적 단백질을 회수하는 것을 포함하는 재조합 단백질의 생산 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 숙주 세포가 포유 동물 세포를 포함하는 것인, 재조합 단백질의 생산 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 숙주 세포가 인간 배아 신장 293(HEK293) 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 아기 햄스터 신장(BHK21) 세포, PerC6 세포 또는 COS7 세포를 포함하는 것인, 재조합 단백질의 생산 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 숙주 세포가 인간 배아 신장 293(HEK293) 세포 또는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 포함하는 것인, 재조합 단백질의 생산 방법.
  15. 제1항에 있어서, 재조합 단백질을 생산하기 위한 발현 시스템에서 시스형의 발현 인핸서로서 사용되는 폴리뉴클레오티드.
  16. 삭제
  17. 삭제
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