KR101979916B1

KR101979916B1 - 밀 껍질 추출물을 포함하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101979916B1
Application number: KR1020170071835A
Authority: KR
Inventors: 박세연; 신유정
Original assignee: 동덕여자대학교 산학협력단
Priority date: 2017-06-08
Filing date: 2017-06-08
Publication date: 2019-05-17
Also published as: KR20180134232A

Abstract

본 발명은 밀 껍질 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물로서, 주름 개선 및/또는 피부 미백 기능을 갖는 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

Description

밀 껍질 추출물을 포함하는 화장료 조성물{Cosmetic composition comprising wheat-chaff extract}

본 발명은 밀 껍질의 추출물을 포함하는 화장료 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

웰빙 소비 트렌드에 힘입어 식물을 이용한 천연물에 대한 관심이 날로 증가하는 추세이지만 식량 작물을 이용하여 곡물을 제외한 부산물을 이용한 천연기능성 물질 개발 및 활용은 전무한 실정이다. 국내외에서는 작물을 수확하고 남은 부산물들을 사료로써 활용하는 방안으로 연구가 일부 진행되고 있으나, 국내에서는 벼 부산물을 이용한 연구에 국한되어 있다.

밀의 부산물(wheat straw)을 이용한 사료로써의 가치 연구도 일부 보고되어 있으나, 성분분석 등 이론적 기초연구에 머무르고 있으며, 바이오 연료로의 활용에 대한 연구가 진행되고 있으나 타 바이오 연료 작물에 비해서 바이오리파이너리 과정 및 경제성 문제로 주춤하고 있다. 그 밖에 상업적으로도 활용할 수 있는 방법들 또한 다수 보고되고 있는데 합성섬유나 페인트 등에 사용되는 폴리우레탄으로의 전환 (라트비아)이나 종이의 원료가 되는 lactic acid로의 전환 (덴마크) 등의 연구 보고 또는 차 또는 식기 세정제로서 사용한 연구 개발이 있다. 다만 밀을 수확한 후 얻어지는 부산물로부터 식품 또는 화장품 기능성 원료로의 개발 및 활용연구는 거의 전무한 실정이다.

종래 개발된 항노화 성분의 경우 TGF-β 등과 같은 성장인자의 mimic 펩타이드가 주를 이루고 있다. 다만, 항노화 성분의 주요 투여 대상인 고령자의 경우 MMP의 활성이 비정상적으로 높으며 세포의 기능이 쇠퇴하여 콜라겐 합성을 촉진시키는 메카니즘에 제대로 대응을 하지 못하므로, 콜라겐 생성 촉진 기능을 하는 물질은 고령자에게 적용하는 데 한계가 있다.

MMP 저해제의 경우 화장품 소재뿐 아니라 의약품의 개발 측면에서도 연구가 많이 되어 왔으나 현재까지 특별한 효능을 가진 MMP저해제에 대한 개발 성과가 미미하다. 화장품 소재의 경우 Pentapharm사의 Pepha-TIMP가 이러한 개념으로 사용이 되고 있지만 이는 21.7kDa의 고분자인 재조합 TIMP-2(Tissue Inhibitor of Matrix metalloproteinase-2)로서 인체내에 존재하는 MMP-2의 저해제이며 이러한 고분자는 침투가 되지도 않을 뿐 아니라 고가이며 활성도 뛰어나지 않기 때문에 사용상 문제가 많다.

약물 성분으로 사용되고 있는 레티노익산(Retinoic acid)의 뛰어난 MMP-1저해 능력은 이미 여러 문헌을 통해 발표된 바 있으며 항산화 효과뿐 아니라 강력한 MMP-1의 저해 능력을 가지고 있기 때문에 항주름용으로 사용되고 있는 처방의약품이다. 화장품용 소재로는 의약품인 레티노익산의 사용이 불가능하기 때문에 이의 유도체인 레티놀이나 다른 종류의 레티노이드가 사용이 되고 있지만 이러한 유도체의 MMP-1 저해 능력은 레티노익산에 비해 거의 미비한 수준이며 (1/20) 특히 레티노이드의 불안정성 및 자극성으로 인해 주로 자외선을 받지 않는 나이트 크림 등 사용이 제한적으로 이루어지고 있다.

따라서 신개념의 소재로서 레티노이드보다 강력한 MMP 저해효과 물질, 그리고 항산화 기능과 복합기능을 가지는 콜라겐합성 촉진물질이면서 인체에 대한 자극성이 없는 소재의 개발이 필요한 실정이다.

본 발명은 콜라겐 생합성 촉진, 항산화 및 미백 효과가 우수한 기능을 갖는, 밀 껍질 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 밀 껍질 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명자들은 종래 폐 자원으로 분류되는 밀 껍질을 추출하여 화장료 조성물로 사용하는 경우 콜라겐 합성, 항산화 및 미백 효과 등 기능성이 우수함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 밀 껍질 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 또는 조성물에 관한 것으로서, 콜라겐 생합성 촉진, 항산화 활성 및 미백 활성이 뛰어나다.

본 발명의 화장료 조성물은 콜라겐 생합성 촉진용, 항노화용, 항산화용 또는 미백용 화장료 조성물일 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물은 콜라겐 생합성 촉진, 항노화, 항산화 특성 또는 미백 활성이 뛰어나 기능성 화장품으로의 적용이 용이하다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 밀의 부산물 즉, 밀 껍질 추출물을 유효성분으로 포함하며, 밀은 청정한 환경에서 생육을 할 수 있으므로 무공해 청정 식물이라는 점에서, 추가의 비용을 들이지 않고도 기능성 천연 유기농 화장품의 원료 공급원으로 사용할 수 있다는 장점이 있다.

이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일 예는 밀 껍질 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명의 화장료 조성물은 콜라겐 생합성 촉진용, 항노화용, 항산화용 또는 미백용 화장료 조성물일 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물은 콜라겐 생합성 촉진, 항노화, 항산화 특성 또는 미백 활성이 뛰어나 기능성 화장품으로의 적용이 용이하다.

본 발명의 화장료 조성물은 콜라겐 생합성 촉진, 콜라겐 분해 억제, 및 이에 따른 피부 주름 개선활성이 있어, 이들 용도로 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 화장료 조성물은 콜라겐 분해효소 또는 MMP(matrix metalloproteinase)에 대한 저해 활성이 우수하며, 이에 MMP 활성을 저해하여 주름 개선 또는 피부 노화 방지 활성이 있다.

진피 세포 외 조직 중 콜라겐 단백질들은 피부에 강도와 장력을 부여하며 이로 인해 외부의 자극이나 힘으로부터 피부를 보호하는 역할을 하며 진피층의 90%를 차지하고 있어 콜라겐의 감소는 피부 노화와 주름형성에 밀접한 관련이 있다. 콜라겐의 분해는 노화가 진행되면서 분해되기도 하고 자외선 같은 자극에 노출되게 되면 콜라겐 분해효소의 생합성이 증가하면서 콜라겐 합성이 감소되어 주름이 형성된다. 콜라겐 분해효소는 아연-의존적인 세포 내 단백분해 효소로 진피의 세포 외 구조의 성분들을 분해시키거나 재구조화 시킬 수 있는 물질로서 그 중 MMP-1은 진피의 콜라겐에 작용하여 분절시킨다. 따라서 MMP 효소의 합성 양과 활성도의 조절이 주름에 중요한 요인으로 작용하며, 상기 화장료 조성물은 MMP 활성을 저해하여 주름 개선 또는 피부 노화 방지 활성이 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 항산화 활성이 우수하여, 항산화 용도로 사용될 수 있다. 구체적으로, 밀 껍질 추출물을 처리하여 DCFDA를 이용한 세포 내 활성산소 농도 변화를 측정한 결과, 종래 강력한 항산화제로 알려진 글루타치온과 유사하거나 더욱 우수한 수준으로 항산화 효과를 내며, 특히 이러한 효과는 밀 종자 추출물 대비 밀 껍질 추출물에서 현저히 우수함을 확인하였다.

예를 들어 아래 수학식 1으로 산출된 글루타치온 10mM의 산화율 100%를 기준으로 상기 밀 껍질 추출물 10μg/ml의 상대 산화율(%)이 30 내지 135%, 바람직하게는 50 내지 120%, 더욱 바람직하게는 60 내지 120% 또는 85 내지 120%일 수 있다.

예를 들어 상기 상대 산화율은 아래 수학식 2의 식으로 산출될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 미백 활성이 우수하여, 미백 용도로 사용될 수 있다. 구체적으로, 밀 껍질 추출물을 처리한 흑색종 세포의 흡광도를 측정하여 미백 효과를 확인한 결과, 우수한 수준으로 미백 효과를 낸다는 점을 확인하였다. 예를 들어 멜라노마 세포의 멜라닌 생합성을 저해하는 활성이 있을 수 있으며, 구체적으로 티로시나제 저해 활성을 가질 수 있다.

밀(wheat)은 외떡잎식물 벼목 화본과의 한해살이풀로서, 가을에 파종하고 이른 여름 (6월 초)에 수확하는 재배특성상 제초제 및 기타 농약의 사용 없이도 재배가 가능하다.

밀 소수는(spikelet)은 이삭(spike)의 수축(rachis)에 직접 달리며, 성숙된 종자는 일반적으로 겉껍질 (chaff)이라고 하는 바깥껍질 (lemma)과 안껍질(palea)로 싸여있다. 본 발명의 밀 껍질은 겉 껍질 및 안 껍질로 이루어진 군에서 선택된 1 이상일 수 있으며, 바람직하게는 겉 껍질을 사용할 수 있다. 겉 껍질은 수확 후 탈곡 시 쉽게 분리되며 오염되지 않게 수거될 수 있어서 이를 활용한 천연 기능성 물질 개발에 장점이 있다.

구체적으로 밀 껍질을 제거한 밀 종자 부분의 추출물의 경우 품종에 상관 없이 활성 산소를 낮추는 효과가 있으며, 이러한 효과는 밀 껍질을 제거한 밀의 종자 추출물의 활성 산소 저해 효과대비 현저하게 우수하다.

본 발명에 적용 가능한 밀은 조품, 조경, 올그루, 금강 및 우리로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 품종일 수 있으나 특별히 품종이 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 있어서 밀 껍질 추출물은 밀 껍질의 조추출물 또는 밀 껍질의 특정 용매 가용 추출물 또는 분획물을 포함하며, 용액, 농축물 또는 분말상태일 수 있다. 본 발명의 일예에서, 상기 밀 추출물은 밀 껍질을 물, 탄소수 1 내지 4의 직쇄 또는 분지형 알코올, 유기 용매 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 용매로 추출하여 얻어진 조추출물, 또는 상기 조추출물에 물, 탄소수 1 내지 4의 직쇄 또는 분지형 알코올, 유기 용매 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 용매를 가하여 얻어진 용매 가용 추출물일 수 있다. 또한 상기 유기 용매는 디클로로메탄, 디에틸에터, 클로로포름 및 에틸 아세테이트로 이루어진 군에서 선택된 1 이상인 것, 바람직하게는 디클로로메탄 및/또는 에틸아세테이트일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

밀 껍질 추출물은 통상의 추출 방법을 사용하여 제조될 수 있으며, 예컨대, 냉침 추출, 열수 추출, 초음파 추출, 환류 추출 또는 냉각 추출, 바람직하게는 환류 냉각 추출일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 추출 단계는 1 이상 반복하여 수행될 수 있으며, 2차 이상으로 추출된 추출물 및 각 추출 후 얻어진 여과액을 혼합하여 추출하여 추출효율을 높일 수 있다.

또한 추출 단계에서 얻어진 추출물을 약 2 내지 10배, 바람직하게는 약 3 내지 7배의 부피의 물로 현탁시킨 후 물, 탄소수 1 내지 4의 직쇄 또는 분지형 알코올, 유기 용매 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 용매를 가하여 용매 가용층을 추출한 후 감압 농축하여 용매 가용 추출물을 제조하는 방법을 추가로 포함하여 불필요한 단백질, 다당류 및 지방산 등의 불순물을 정제할 수 있다.

상기 추출물을 여과 또는 농축하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 농축 단계에 의해 제조되는 농축물은 화장품 또는 의약품 원료로 사용하기에 적합하도록 잔존하는 용매의 함량을 조절하기 위하여 농축물 총량의 약 10 내지 30배, 바람직하게는 15 내지 25배, 보다 바람직하게는 약 20 중량배의 물로 1 내지 5회, 바람직하게는 2 내지 3회 공비 농축하고 재차 동량의 물을 가하여 균질하게 현탁시킨 후 살균 및/또는 동결건조시킴으로써 분말상태의 밀 껍질 추출물로서 제조될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에서 밀 껍질 추출물은 조성물 전체의 고형분 중량을 기준으로 0.0001 내지 80중량%, 바람직하게는 0.001 내지 30중량%로 포함될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 유효성분 이외에, 통상의 제품화 또는 제제화에 사용 가능한 모든 종류의 성분, 예컨대 계면활성제, 유화제, 비누산, 용매, 결합제, 희석제, 활택제, 안정제, 항료, 물, 저급알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 착색제, 보존제, 항생제, 항산화제, 소포제, 항균제, 효소, 식물 또는 미네랄오일, 지방, 형광물질, 살진균제, 굴수성 유발물질, 보습제, 방향제, 방향제 담체, 보존제, 단백질, 실리콘, 용해화제, 당 유도체, 일광차단제, 비타민, 식물 추출물 및 왁스로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 약리학적으로 허용가능한 부형제를 함유할 수 있으며, 그 종류와 함량은 최종 산물의 용도 및 사용 목적에 따라 적절하게 조절할 수 있다.

또한, 상기 화장료 조성물은 적용되는 형태에 통상적으로 포함되는 용매를 포함하는 것일 수 있으며, 예컨대, 에탄올, 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 1,2,4-부탄트리올, 솔비톨에스테르, 1,2,6-헥산트리올, 벤질알코올, 이소프로판올, 부탄디올, 디에틸렌글리콜 모노에틸에테르, 디메틸이소소르비드, N-메틸-2-피롤리돈, 프로필렌카보네이트, 글리세레스-26, 메틸글루세스-20, 이소세틸미리스테이트, 이소세틸옥타노에이트, 옥틸도데실미리스테이트, 옥틸도데칸올, 이소스테아릴이소스테아레이트, 세틸옥타노에이트 및 네오펜틸글리콜디카프레이트 등 중에서 선택된 1 종 이상을 포함할 수 있다.　 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자라면 제품의 특성에 따라 용매의 종류 및 사용량을 알맞게 선택하여 적용할 수 있다.

또한, 상기 화장료 조성물은 경피 투여시의 경피 투과를 강화하기 위한 다양한 물질을 포함할 수 있다.　예를 들어, 라우로켑람 유도체 및 올레인산, 모노올레이트 유도체의 에스테르 유도체, 아다팔렌, 트리티노인, 레틴알데하이드, 타자로틴, 살리실산, 아질라익산, 글라이콜산, 에톡시다이글라이콜, 트윈80, 레시틴 올가노겔 등을 포함할 수 있다.　또한, 본 발명의 화장료 조성물은 부가적인 기능을 부여하기 위해, 본 발명의 콜라겐 생합성 촉진, 항산화 또는 미백 효과를 해치지 않는 범위 내에서 공계면활성제, 계면활성제, 비듬 방지제, 각질 연화제, 혈행 촉진제, 세포 활성제, 청량제, 보습제, 항산화제, pH 조절제, 정제수 등의 보조 성분들을 첨가할 수 있으며, 적용되는 형태에 따라서 적절한 향료, 색소, 방부제, 부형제 등의 첨가제를 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 주름개선용 화장료 조성물일 수 있다.

예를 들어 콜라겐 생합성 촉진 또는 콜라겐 분해 저해 활성이 있을 수 있으며, 구체적으로 프로콜라겐, 베타 액틴 및/또는 colla1 유전자의 발현을 증가시켜 콜라겐 생합성을 촉진시키거나, MMP 합성이 저해되어 콜라겐 분해가 저해될 수 있다.

또한, 상기 주름 개선 용도는 항산화 효과 개선에 의한 것일 수 있으며, 예를 들어 아래 수학식 1으로 산출된 글루타치온의 산화율 100%를 기준으로 상기 밀 껍질 추출물의 상대 산화율(%)이 30 내지 135%, 바람직하게는 50 내지 120%, 더욱 바람직하게는 60 내지 120%일 수 있다.

[수학식 1]

[수학식 2]

본 발명의 또 다른 일 예로서, 밀 껍질 추출물을 유효성분으로 포함하는 콜라겐 생합성 촉진제 또는 콜라겐 분해효소 억제제를 제공한다.

예를 들어, 상기 콜라겐 생합성 촉진제는 프로콜라겐, 베타 액틴 및/또는 colla1의 발현 증진제일 수 있으며, 상기 콜라겐 분해 효소 억제제는 예를 들어 MMP(matrix metalloproteinase), 바람직하게는 MMP-3 저해제일 수 있다.

또한 본 발명의 또 다른 일 예로서, 본 발명의 조성물은 밀 껍질 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 예로서, 본 발명의 조성물은 밀 껍질 추출물을 유효성분으로 포함하는 멜라노마 세포의 멜라닌 생합성 저해제 또는 티로시나제 저해제를 제공한다..

본 발명의 또 다른 일 예로서 밀 껍질 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

상기 화장료 조성물에 관한 사항은 이의 제조방법에 동일하게 적용될 수 있다.

예를 들어 상기 제조방법은 밀로부터 밀 껍질을 분리하는 단계; 및 상기 밀 껍질을 물, 탄소수 1 내지 4의 직쇄 또는 분지형 알코올, 유기 용매 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 용매로 추출하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 밀로부터 밀 껍질을 분리하는 단계는 수확된 밀로부터 밀 종자를 제거하고 밀 껍질만을 분리하는 것을 의미하며, 밀 껍질을 세척하는 단계, 절단하는 단계 또는 여과하는 단계를 추가로 포함하여 처리될 수 있으며, 잘게 절단하거나 이를 분말화하여 사용하거나, 분말을 냉동 건조시킨 후 사용할 수 있다.

상기 밀 껍질을 용매로 추출하는 단계에서는 통상적으로 사용되는 모든 추출 방법을 사용할 수 있으며, 예컨대, 냉침 추출, 열수 추출, 초음파 추출, 환류 추출 또는 냉각 추출, 바람직하게는 환류 추출일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 추출 단계는 1 이상 반복하여 수행될 수 있으며, 2차 이상으로 추출된 추출물 및 각 추출 후 얻어진 여과액을 혼합하여 추출하여 추출효율을 높일 수 있다.

추출물을 여과 또는 농축하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 농축 단계에 의해 제조되는 농축물은 의약품 원료로 사용하기에 적합하도록 잔존하는 용매의 함량을 조절하기 위하여 농축물 총량의 약 10 내지 30배, 바람직하게는 15 내지 25배, 보다 바람직하게는 약 20 중량배의 물로 1 내지 5회, 바람직하게는 2 내지 3회 공비 농축하고 재차 동량의 물을 가하여 균질하게 현탁시킨 후 살균 및/또는 동결건조시킴으로써 분말상태의 밀껍질 추출물로서 제조될 수 있다.

본 발명은 밀 껍질 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물로서, 콜라겐 생합성 촉진, 항산화 활성 및/또는 미백 활성이 우수하여 기능성 화장품으로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1a는 HS68 세포에서의 밀 껍질 추출물 세포독성 실험을 나타낸 결과이다.
도 1b는 Hacat 세포에서의 밀 껍질 추출물 세포독성 실험을 나타낸 결과이다.
도 2는 품종 별 밀 껍질 추출물 처리에 따른 프로콜라겐 1의 합성 결과를 베타 액틴 양으로 보정하여 나타낸 것이다.
도 3은 품종 및 농도 별 밀 껍질 추출물 처리에 따른 항산화 효과를 나타낸 결과이다.
도 4는 품종 별 밀 껍질 추출물 처리에 따른 미백 효과를 나타낸 결과이다.
도 5a는 품종 별 밀 껍질 추출물 처리에 따른 세포 산화율을 측정한 결과이다.
도 5b는 품종 별 밀 종자 추출물 처리에 따른 세포 산화율을 측정한 결과이다.
도 6는 쥐의 흑색종 세포에 품종 별 밀 껍질 추출물 처리한 시료 및 이의 흡광도 측정 결과이다.

하기 예시적인 실시예를 들어 본 발명을 더욱 자세히 설명할 것이나, 본 발명의 보호범위가 하기 실시예로 한정되는 의도는 아니다.

실시예 1. 밀 껍질 추출물 제조

조품, 조경, 올그루, 금강의 껍질 각각의 10g, 20g, 및 40g에 80% 에탄올 물 혼합 용매 1L에 가하여 환류냉각 추출하였다. 3시간 동안 추출한 뒤 감압 여과하고 회전진공농축기로 용매를 제거시킨 다음 4℃에 보관하면서 실험에 사용하였다.

실시예 2. 밀 종자 및 녹체 추출물 제조

조품, 조경, 올그루, 금강의 종자 각각의 10g, 20g, 및 40g와, 금강의 녹체 10g 및 20g에 80% 에탄올 물 혼합 용매 1L에 가하여 환류냉각 추출하였다. 3시간 동안 추출한 뒤 감압 여과하고 회전진공농축기로 용매를 제거시킨 다음 4℃에 보관하면서 실험에 사용하였다.

실시예 3. 안전성 평가

실시예 1에서 제조한 밀 껍질 추출물 시료의 안정성을 평가하기 위하여 세포 독성 실험을 실시하였다. HaCaT (Human keratinocyte, KCB, Korea) 및 H s-68 (Human skin fibroblast, ATCC, USA)를1.5*104cells/well의 농도로 96 웰 플레이트에 분주하여 37℃의 온도 및 5% CO2의 조건에서 24시간 배양하였다. 시료를 희석한 10% FBS가 포함된 DMEM 배지200μl를 배양배지와 교체한 후 24시간 동안 추가 배양하였다. 이후 MTT 키트(CellTiter 96, Promega)를 각 well에 20μl씩 가해준 후, 3시간 후에 마이크로플레이트 판독기(Microplate reader, Bioteck)을 이용하여 이용하여 490nm에서 흡광도를 측정, 아래의 수학식 1으로 세포 생존률(%)으로 환산하였다.

[수학식 1]

세포 생존률(%)=S_S/S_C×100

(S_S:시료를 처리한 군의 흡광도, S_C:시료를 처리하지 않은 군의 흡광도)

상기 결과를 도 1a 및 도 1b에 나타내었으며, MTT 분석 결과, 모든 시료에서 20ppm까지 세포 생존률의 감소가 보이지 않으므로 밀 껍질 추출물이 유효 농도 이내에서 안전한 원료임을 확인하였다.

실시예 4. 프로콜라겐 합성 효과 평가

4.1 프로콜라겐 및 베타 액틴 발현량 분석

인간 피부 섬유아세포인 HS58을 1*10⁶cells/well의 농도로 6 웰 플레이트에 분주한 뒤, 세포의 수가 70 내지 80%로 증가할 때까지 37℃의 온도 및 5% CO₂의 조건에서 24시간 배양하였다. PBS로 세포 세척 후 UV 조사기(BoTeck, Korea)로 UV-A 및 UV-B를 60초 동안 조사하였다. 실시예 1에서 제조된 20μg/ml 시료를 무혈청 배지를 배양배지와 교체한 후 24시간 동안 추가 배양한다. 배지 제거 후 PBS로 세포를 세척하여 뒤 SDS sample buffer (120mM Tris-HCl(pH 6.8), 20% Glycerol, 4% SDS, 28.8mM 2-mercaptoethanol, 0.01% bromophenol blue)를 100μl씩 가하여 세포를 터트린 뒤 수거하여 105℃의 온도에서 10분간 끓여 단백질을 변성시켰다. 변성시킨 샘플 20μl을 10% SDS-PAGE 전기영동을 걸어 나이트로셀룰로스막(nitrocellulose membrane)에 단백질을 이동(transfer)시킨 후 TBST 버퍼에 용해시킨 5% 스킴밀크에서 30분 동안 배양한 뒤, 베타 액틴(Santa cruze Biotechnology, CA) 과 프로콜라겐1(Santa cruze Biotechnology, CA) 항체를 5% 스킴밀크 TBST 배지에 1:500으로 희석해 4에서 하룻밤 동안 쉐이킹하며 배양시켰다. TBST로 10분씩 3번 세척한 후 HRP-conjigated 된 2차 항체를 5% 스킴밀크 TBST 버퍼에 1:2000으로 희석한 용액에 2시간 동안 배양하였다. TBST로 10분씩 3번 멤브레인을 세척한 뒤 Novex ECL Chemiluminescent Substrate Reagent Kit 시약(Invitrogen, USA)을 뿌려 암실에서 3분간 반응시킨 후, 감광 필름에 현상시켰다.

프로콜라겐1의 양을 베타 액틴 양으로 보정하여 베타 액틴과 프로콜라겐1의 현상 결과를 image J로 분석한 그래프를 도 2에 나타내었다. 모든 품종의 밀 껌질 추출물에서 유의적으로 프로콜라겐 1이 합성되어 프로콜라겐 생합성이 촉진된 것을 확인하였으며, 특히 조경, 올그루 및 금강 품종에서 프로콜라겐 생합성 촉진 효과가 더욱 우수함을 확인하였다.

4.2 COL1A1 발현량 분석

콜라겐 유전자로 알려진 col1a1 유전자의 발현량을 측정하였다.

구체적으로, 인간 피부 섬유아세포인 Hs68 (human skin fibroblast)를 2.2 x 10⁶ cells 농도로 100 파이 cell culture dish에 분주한 후 70~80% 정도 자랄 때까지 37℃, 5% CO2의 조건에서 72 시간 배양하였다. 각 dish에 Phosphate buffer saline(PBS) 10ml를 가해 세포를 세척한 후 UV 조사기(BoTeck, Korea)로 UV-A와 UV-B를 60초간 쪼여주었다. 이후 시료를 희석한 무혈청 배지를 배양배지와 교체한 후 24시간 동안 추가배양 하였다.

24시간 후 배지를 제거하고 RNA extraction kit 인 hybrid-RTM(GeneAll Biotechnology, Korea)를 이용하여 RNA를 분리한 후, iScript TM cDNA Synthesis Kit(BIO-RAD, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA에 Col1a1, GAPDH의 primer 각각 1μL (0.5 μg/μL), DEPC-Water와 함께 iQTM SYBER® Green Supermix (BIO-RAD, USA)를 섞어준 뒤 CFX96TM Real-Time System(BIO-RAD, USA)를 이용하여 RT-PCR 을 3회 반복 실시하였다. Col1a1 의 mRNA 발현량을 GAPDH의 mRNA 발현량으로 보정하여 정량 PCR을 수행하고 그 결과를 도 4에 나타내었다.

실시예 5. 콜라겐 분해 억제활성 평가 ( MMP활성 )

인간 피부 섬유아세포인 Hs68 (human skin fibroblast)를 1*10⁶cells/well의 농도로 6 well plate에 분주한 후 70~80% 정도 자랄 때까지 37℃, 5% CO2의 조건에서 24 시간 동안 배양하고, 각 well plate에 Phosphate buffer saline(PBS) 1㎖씩을 넣어 세포 세척 한 후, 실시예 1에서 제조된 시료로서, 조품, 조경, 올그루, 금강 및 우리 품종의 밀 껍질 추출물 20μg/ml 시료를 희석한 무혈청배지를 배양배지와 교체한 후 48시간(MMP-3)동안 추가 배양하였다. 상기 배지를 제거 후 RNA extraction kit을 이용하여 RNA 를 분리한 후, cDNA를 합성하고 mRNA 발현량을 측정하기 위하여 합성된 cDNA로 RT-PCR을 실시하였다. 사용한 GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), MMP-3의 프라이머 서열을 아래 표에 나타내었다.

서열번호	명칭	서열
1	GAPDH 정방향 프라이머	5'-CAA AAG GGT CAT CAT CTC TG-3'
2	GAPDH 역방향 프라이머	5'-CCT GCT TCA CCA CCT TCT TG-3'
3	MMP-3 정방향 프라이머	5’-GGT TCC GCC TGT CTC AAG AT-3’
4	MMP-3 역방향 프라이머	5’-GGT TCT GGA GGG ACA CCT TC-3'

상기 프라이머를 각각 1μL (0.5μg/μL)씩 가하고 합성된 cDNA에 DEPC-Water와 함께 PCR-premix tube에 첨가하여 정량 PCR을 수행하였다. real-time PCR system (Mx3000P, Stratagene, Tokyo, Japan) using SYBR PreMix ExTaq (Takara Bio, Shiga, Japan)

그 결과를 도 4에 나타내었으며, 모든 품종의 밀 껍질 추출물에서 유의적으로 MMP3 합성이 저해되는 것을 확인하였다.

실시예 6. 항산화 효과 평가

실시예 1 및 2에서 제조된 밀 껍질 추출물 시료의 항산화 효과를 평가하기 위하여 DCFDA 어세이를 실시하였다. Hacat 세포를 1.5*10⁵cells/well 농도로 96 웰 플레이트에 분주한 뒤 37℃의 온도 및 5% CO₂의 조건에서 24시간 동안 배양하였다. PBS로 세포 세척 후 10% FBS 포함된 DMEM 배지에 실시예 1에서 제조된 10μg/ml 또는 20μg/ml 시료를 배양배지와 교체한 후 24시간 동안 추가 배양하였다. 배지 제거 후 PBS로 세포를 세척하고 DCFDA를 PBS 배지에 20μM로 희석하여 45분간 배양하였다. PBS로 세포를 세척해준 뒤, H2O2를 500uM로 PBS에 희석한 배지에 시약을 100μl씩 가해 30분 동안 추가배양 하였다. 이후 마이크로플레이트 판독기(Microplate reader, Tecan)을 이용하여 이용하여 Excitation: 485/20, Emission: 528/20 조건에서 형광을 측정하였다. 측정된 값은 아래의 수학식 1로 계산된 산화율(%)으로 환산하고, 음성 대조군인 글루타치온 10mM의 산화율을 100%로 하는 경우의 밀 추출물 10μg/ml의 상대 산화율(%)를 아래 수학식 2로 산출하였다.

[수학식 1]

[수학식 2]

상기 세포 산화율 측정한 결과로서 밀 껍질 시료에 대한 결과를 도 5a 및 표 2에, 밀 종자 시료에 대한 결과를 도 5b 및 표 3에 나타내었으며, 모든 품종의 시료에서 음성 대조군인 글루타치온과 비슷하거나 더욱 우수한 수준으로 항산화 효과가 있을 뿐 아니라 밀의 종자 부분 대비 밀 껍질 부분에 항산화 효과가 현저히 우수함을 확인하였다. 구체적으로 밀의 종자 추출물의 경우, 40μg/mL까지의 농도에서도 항산화 효과를 대조군의 80% 수준 이하로 낮추지 못한 반면, 밀 껍질의 경우 20μg/mL의 농도에서 활성 산소를 대조군의 60% 또는 80% 수준 이하까지 낮춘 것을 확인하였다. 이는 종자 부분과 밀 껍질 부분의 활성이 차이가 있음을 의미하고, 밀 껍질 부분의 유효성의 차이를 보여준다고 할 수 있다.

시료	농도	산화율(%)	글루타치온 대비 상대 산화율(%)
대조군	-	100
글루타치온	10mM	66.97	100
조품 껍질	10μg/ml	70.42	91.49
조품 껍질	20μg/ml	53.85	69.97
조경 껍질	10μg/ml	69.61	90.43
조경 껍질	20μg/ml	66.05	85.82
올그루 껍질	10μg/ml	75.17	97.66
올그루 껍질	20μg/ml	73.16	95.05
금강 껍질	10μg/ml	88.40	114.85
금강 껍질	20μg/ml	77.78	101.06

시료	농도	산화율(%)	글루타치온 대비 상대 산화율(%)
대조군	-	100
글루타치온	10mM	59.85	100
조품 종자	10 μg/ml	97.02	162.10
조품 종자	20 μg/ml	86.43	144.41
조품 종자	40 μg/ml	81.37	135.96
조경종자	10 μg/ml	123.47	206.29
조경 종자	20 μg/ml	113.74	190.04
조경 종자	40 μg/ml	114.77	191.77
올그루 종자	10 μg/ml	114.51	191.33
올그루 종자	20 μg/ml	113.16	189.08
올그루 종자	40 μg/ml	106.83	178.49
금강 종자	10 μg/ml	103.63	173.14
금강 종자	20 μg/ml	89.55	149.62
금강 종자	40 μg/ml	85.63	143.08
우리 종자	10 μg/ml	93.02	155.42
우리 종자	20 μg/ml	89.60	149.71
우리 종자	40 μg/ml	81.34	135.91

실시예 7. 미백 효과 평가

쥐의 흑색종 세포인 B16-F10 세포를 1*10⁶cells/well 농도로 96 웰 플레이트에 분주한 뒤, 세포의 수가 70~80% 정도 증가할 때까지 37℃의 온도 및 5% CO2의 조건에서 24시간 동안 배양하였다. PBS로 세포 세척 후, 10% FBS 포함된DMEM 배지에 실시예 1에서 제조된 20μg/ml 시료를 희석하여 배양배지와 교체한 후 3일간 추가 배양하였다. PBS로 세포를 세척한 이후 0.25% 트립신-EDTA 200μl를 가하고 3분간 배양기에서 배양하였다. 이후 PBS 1ml를 가해 세포를 탈착시켜 1.5ml e-tube에 옮긴 뒤 12000rpm, 4℃의 온도에서 3분간 세포 펠렛만을 남기고 상층액을 제거했다. 세포 용해 완충액(Lysis buffer) (25 mM Tris-HCl pH 7.6, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA,1% Triton X-100, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS ) 100μl를 가해준 뒤 4 ℃의 온도에서 30분간 배양하였다. 이후 4 ℃의 온도 및 13000rpm 에서 30분 원심분리하여 세포 펠렛과 상층액을 분리했다.

상층액은 BSA stnadard를 이용하여 595nm에서 단백질 정량하였다. 세포 펠렛은 60℃ 온도의 오븐에서 건조 후 20% DMSO, 2N NaOH 200μl를 넣고 잘 녹여준 뒤 405nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과를 도 6에 나타내었으며, 모든 품종의 밀 껍질 추출물에서 미백 효과가 우수함을 확인하였고, 특히 금강이 20ppm으로 처리했을 때 가장 뛰어난 미백 효과가 있음을 확인하였다.

<110> Dongduk Womens's University Industry-Academy Collaboration Foundation <120> Cosmetic composition comprising wheat-chaff extract <130> DPP20170751KR <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 1 caaaagggtc atcatctctg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 2 cctgcttcac caccttcttg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-3 forward primer <400> 3 ggttccgcct gtctcaagat 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-3 reverse primer <400> 4 ggttctggag ggacaccttc 20

Claims

밀 껍질 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물로서,
상기 화장료 조성물은 주름개선용 또는 피부 미백용인, 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 밀 껍질은 겉 껍질(chaff) 및 안 껍질(palea)로 이루어진 군에서 선택된 1 이상인, 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 밀 껍질 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 직쇄 또는 분지형 알코올, 유기 용매 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 용매로 추출된 추출물 또는 분획물로, 상기 유기용매는 디클로로메탄, 디에틸에테르, 클로로포름 및 에틸 아세테이트로 이루어진 군에서 선택된 1 이상인, 화장료 조성물.
제3항에 있어서, 상기 용매는 에탄올 수용액인, 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 항산화 활성을 가지며, 아래 수학식 1으로 산출된 글루타치온의 산화율 100%를 기준으로 상기 밀 껍질 추출물의 상대 산화율(%)이 30 내지 135%인, 화장료 조성물:
[수학식 1]
제1항에 있어서, 상기 밀 껍질 추출물은 조성물 전체 고형분 중량을 기준으로 0.0001 내지 80중량%로 포함되는, 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 밀 껍질 추출물은 조성물 전체 고형분 중량을 기준으로 0.001 내지 30중량%로 포함되는, 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 주름개선은 콜라겐 생합성 촉진 또는 콜라겐 분해효소 저해활성에 의한 것인, 조성물.
밀로부터 밀 껍질을 분리하는 단계; 및
상기 밀 껍질을 물, 탄소수 1 내지 4의 직쇄 또는 분지형 알코올, 유기 용매 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 용매로 추출하는 단계를 포함하며,
밀 껍질 추출물을 유효성분으로 포함하는, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 화장료 조성물의 제조방법.