JP2008074797A - 魚類滑走細菌症ワクチン - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 テナキバクラム マリティマムの不活化菌体又はその成分を有効成分とする魚類滑走細菌症ワクチンとする。
【選択図】 図1
Description
特に稚魚期に於いて、滑走細菌症による被害が多く、その症状は、稚魚では***部や尾鰭に糜爛や壊死あるいは崩壊が起こり、幼魚や成魚では頭部、躯幹、鰭、鰓等に発赤や出血ときには潰瘍が見られる(非特許文献3)。閉鎖系である養殖領域に於ける滑走細菌症は、個体が高密度に存在していることから、それらの感染の影響は大きく、海産養殖産業において深刻な問題となっている。
しかしながら、これら抗菌性薬剤等の使用は、多剤耐性菌の増加や、薬剤の魚体への残留による食品衛生上の問題および環境中への拡散による公衆衛生上の問題を孕んでいる。さらに経口投与は餌を喰わない重症魚には効果が無いことや、ニフルスチレン酸ナトリウムは、現在ヒラメの稚魚にしか使用できないこと等の問題もある。
以上より、マダイ、カンパチ等の海産魚類の滑走細菌症予防に有効であって、且つ環境汚染等の問題が生じない新規製剤の開発が望まれている。
請求項2に係る発明は、浸漬ワクチンである請求項1記載の魚類滑走細菌症ワクチンに関する。
請求項3に係る発明は、テナキバクラム マリティマムの菌株が、R2、SM3322c、OM3510、MC9210からなる群より選択される何れか1つである請求項1又は2に記載の魚類滑走細菌症ワクチンに関する。
請求項4に係る発明は、マダイの滑走細菌症に適応される請求項1乃至3何れか記載の魚類滑走細菌症ワクチンに関する。
請求項5に係る発明は、テナキバクラム マリティマムの不活化菌体又はその成分を含有する魚類滑走細菌症ワクチン組成物に関する。
請求項6に係る発明は、浸漬用のワクチン組成物である請求項5記載の魚類滑走細菌症ワクチン組成物に関する。
請求項7に係る発明は、テナキバクラム マリティマムの菌株が、R2、SM3322c、OM3510、MC9210からなる群より選択される何れか1つである請求項5又は6に記載の魚類滑走細菌症ワクチン組成物に関する。
請求項8に係る発明は、マダイの滑走細菌症に適応される請求項5乃至7何れか記載の魚類滑走細菌症ワクチン組成物に関する。
請求項9に係る発明は、テナキバクラム マリティマムの不活化菌体又はその成分の有効量を浸漬法によって投与することを特徴とする魚類滑走細菌症の予防法に関する。
請求項10に係る発明は、沖出しの1〜2週間前に、テナキバクラム マリティマムの不活化菌体又はその成分を懸濁した溶液に20分以上浸漬する請求項9に記載の魚類滑走細菌症の予防法に関する。
通常、細菌を培養した場合、誘導期、対数増殖期、定常期、死滅期及び生残期に分けられるが、本発明のワクチンでは、対数増殖期のものを用いるのが望ましい。
得られた不活化菌体又はその成分は、濾過、蒸発脱水法、濃縮、凍結乾燥等により濃縮して用いるのが好ましい。
当該ワクチン組成物の形態としては、注射用組成物、経口投与組成物、魚類浸漬用組成物、飼料組成物等が挙げられるが、魚類浸漬用組成物とするのが望ましい。
液状の担体としては、リン酸緩衝液が挙げられる。固体状の担体としては、タルク、シュークロースなどの賦形剤が挙げられる。飼料組成物とするには、通常の魚類の飼料に本菌の不活化菌体又はその成分を混合すればよい。又、これらのワクチン組成物にはアジュバントを添加して抗原性を高めてもよい。
魚類ワクチンの接種法として代表的なものに、経口法、注射法及び浸漬法が知られているが、経口法は、胃の消化酵素等によりワクチンの免疫原性が低下してしまうことから高い有効性・持続性を得ることは困難である等の欠点が、また注射法は、稚魚への適用が困難であること、多大な労力が必要であること、魚に与えるストレスが大きいこと、作業者への誤注射の危険性があること等の欠点がある。特に注射法は、稚魚への適用が困難なので、滑走細菌症のような稚魚期に甚大な被害をもたらす疾病に用いることができない。
一方、浸漬法は(経口法に比べ)有効性が高く大量の魚を同時に処理することができ、注射法のように多大な労力が必要である等といった欠点もない。また稚魚への適用も可能である。但し、魚体に取り込まれるワクチンが少量である為、高い有効性が認められるのは、ビブリオ病など一部の疾病に対するワクチンに限られている。
投与方法は、上記したとおり「浸漬法」によるのが好ましいが、浸漬に用いるワクチン溶液としては、本発明のワクチン又はワクチン組成物を1μg/mL〜100mg/mLの濃度で、海水に懸濁したもの等が望ましい。
ワクチンの浸漬(投与)時間としては、10分以上行うのが好ましいが、20分以上行うのがより好ましい。この理由は、10分を下回る時間、浸漬したとしても十分なワクチン効果を発揮することができないからである。
尚、後述する実施例に於いて、15分間浸漬した試験区よりも30分間浸漬した試験区の方が、高いワクチン効果が得られることが実証されている(図3参照)。
投与方法は、上記したとおり「浸漬法」によるのが好ましく、海水に本発明のワクチン又はワクチン組成物を1μg/mL〜100mg/mLの濃度で懸濁したものが好ましく使用される。
浸漬(投与)回数は1回でもよいが、2回以上行うのがワクチン効果をより強固に発揮するためには好ましい。後述する実施例に於いても、1回投与の試験区よりも2回投与の試験区で、より高いワクチン効果(有効率が高い傾向)が認められている(図6参照)。
より高いワクチン効果(有効率が高い効果)を得る為には、ワクチンの浸漬時間は20分以上行うのがより好ましいが、この場合、ワクチンの浸漬(投与)は沖出しする少なくとも1週間前(好ましくは1〜2週間)に行うのが、好ましい(図1及び2参照)。
マダイ由来14株、ヒラメ由来1株およびトラフグ由来1株で不活化ワクチンを作製し、その有効性をマダイにおいて検討した。
近畿大学水産研究所白浜実験場で2003年に生産されたマダイ(平均全長5.4cm,平均体重3.1g)を450尾使用した。
マダイ由来12株(強毒株6株,弱毒株6株),ヒラメ由来1株(弱毒株),トラフグ由来1株(強毒株)を70%海水改変サイトファーガ寒天培地で25℃、48時間培養した後、1.5%ホルマリンPBSで4℃,24時間不活化した菌体を供試ワクチンとした。
200L容ポリカーボネイト水槽15基に30尾ずつ収容した。14基をワクチン投与区、1基を対照区に設定した。ワクチン投与は浸漬法によって行い、浸漬濃度は湿菌重量で20μg/mL、浸漬時間は30分とした。
70%海水改変サイトファーガ寒天培地で25℃、約24時間培養したテナキバクラム マリティマム(Tenacibaculum maritimum)R2株を、濾過海水で100μg/mLに懸濁し、供試魚を30分間浸漬した。人為感染の翌日から10日後まで約12時間ごとに死亡魚を取り上げ、有効率を〔数1〕における式において算出した。
R2株を100mg/mLの濃度に懸濁した菌液をBCG接種用管針で供試魚体表に接種し、人為感染の翌日から14日後まで約12時間ごとに死亡魚を取り上げた。
結果を下記の〔表1〕に示す。
・ 強毒株群では生残率20〜90%、有効率17.2〜89.7%であった。
・ また、弱毒株群では生残率0〜72.4%,有効率0〜71.5%であった。
・ 対照区の生残率は3.3%であった。
・ 強毒株群では、SM2202sを除き、40%以上の有効率が認められた。
・ 特に、SM3322c区およびOM3510区では有効率75%以上であった。
・ 弱毒株群ではMC9210区で71.5%の有効率が得られたものの、それ以外の試験区では0〜34.5%であった。
以上より、テナキバクラム マリティマムの中でも、R2株、SM3322c株、OM3510株、MC9210株の不活化菌体またはその成分を用いるのが望ましいことが示された。
実験 II : ワクチン浸漬時間および浸漬後経過日数の長短による比較
実験 III: ワクチン2回投与の検討
「材料と方法」
(1)供試魚 : マダイ稚魚400尾(平均全長8.8cm,平均体重14.6g)
(2)供試ワクチン : Tenacibaculum maritimum R2株を、70%海水サイトファーガ寒天培地で、25℃、48時間培養し、1.5%ホルマリンPBSで4℃,48時間の条件で不活化した。このようにして得られたワクチンを、以下「FKC」(Formalin killed cells)と称す。尚、FKCは本発明にかかるワクチンである。
(3)飼育水槽 : 200L容パンライト水槽
(4)収容尾数 : 50尾ずつ
(5)ワクチン(FKC)投与 : 20mg/mLのFKC懸濁海水に浸漬させることにより行った。FKC投与は、15分間浸漬、30分間浸漬の2通りで実施した。
(6)平均水温 : 20.7℃
(7)人為感染 : 人為感染は、Tenacibaculum maritimum R2を1.1×108CFU/mLに懸濁した海水に20分間浸漬することにより行った。
尚、有効率は〔数1〕における式において算出した。表2に各試験区を示す。
1)図1は、本発明にかかる滑走細菌症ワクチンを「15分間浸漬させた場合」におけるマダイの生存率(%)の推移を示したグラフであるが、FKC投与から人為感染までの日数が1週間のもの(前記表2における第2段目)が、3日のもの(同第1段目)及び2週間(同第3段目)のものと比して、格段に高い生存率(%)が示された。
2)図2は、本発明にかかる滑走細菌症ワクチンを「30分間浸漬させた場合」におけるマダイの生存率(%)の推移を示したグラフであるが、FKC投与から人為感染迄の日数が1週間、2週間のものが、3日のものと比して、格段に高い生存率(%)が示された。
3)以上より、本発明のワクチンを30分浸漬させた場合の方が、15分間浸漬させた場合と比して、高いワクチン効果(生存率%)を発揮することが示された。
さらに、15分浸漬の場合および30分間浸漬の場合の双方において、ワクチン浸漬後の沖出し迄の日数は、1週間程度(厳密には4日以上であることが本発明者らによって確認されている)、若しくはそれ以上(〜2週間)空けることが、より高いワクチン効果(有効率が高い効果)を得る為には好ましいことが示された。
「材料と方法」
(1)供試魚 : マダイ稚魚240尾(平均全長4.9cm,平均体重1.6g)
(2)供試ワクチン(FKC) :
Tenacibaculum maritimum R2株を、70%海水サイトファーガ寒天培地で、25℃、48時間培養し、1.5%ホルマリンPBSで4℃,48時間の条件で不活化した。尚、FKCは本発明にかかるワクチンである。
(3)飼育水槽 : 500L容パンライト水槽
(4)収容尾数 : 60尾ずつ
(5)ワクチン(FKC)投与 :
20mg/mLのFKC懸濁海水に30分間浸漬させることにより行った。
FKC投与(浸漬)は、2回投与(人為感染2週間前および1週間前の2回)、人為感染2週間前の1回投与、人為感染1週間前の1回投与の3通りで実施した(表3参照)。
(6)平均水温 : 20.0℃
(7)人為感染 : Tenacibaculum maritimum R2株を、懸濁海水に30尾ずつ20分間浸漬することにより行った。
(8)浸漬濃度 :
前記人為感染(7)において、Tenacibaculum maritimum R2株の浸漬濃度として、(1)1.6×107CFU/mLの場合と、(2)2.4×107CFU/mLの場合の2通りで実施した(表4参照)。
1)図4は、Tenacibaculum maritimum R2株を、1.6×107CFU/mLの濃度で浸漬させた場合におけるマダイの生存率(%)の推移を示したグラフであるが、人為感染2週間前から1週間置きにFKCを2回投与したもの(前記表3における第1段目)について最も高い生存率(%)が認められ(80,0%)、次いで、人為感染1週間前にFKCを1回投与したもの(同第2段目)についても高い生存率(%)が認められた(65,0%)。
2)図5は、Tenacibaculum maritimum R2株を、2.4×107CFU/mLの濃度で浸漬させた場合におけるマダイの生存率(%)の推移を示したグラフであるが、人為感染2週間前から1週間置きにFKCを2回投与したものについて最も高い生存率(%)が認められ(74.1%)、次いで、人為感染1週間前および2週間前にFKCを1回投与したもの(前記表3における第2及び3段目)についても高い生存率(%)が認められた(ともに59.3%)。
3)以上より、本発明のワクチンを2回浸漬した方が、1回のみの浸漬と比して、高いワクチン効果(生存率%)を発揮することが示された(図6参照)。
・ 実験II、実験IIIともにFKCの効果が認められた。
・ 実験IIでは15分浸漬区よりも30分浸漬区で有効率が高い傾向が認められた。
・ FKCを投与してから3日後に攻撃した区では生残率が低かった。
・ 実験IIIでは1回投与区よりも2回投与区で有効率が高い傾向が認められた。
マダイの滑走細菌症の防除に浸漬ワクチンが有効である。
浸漬時間は30分以上行うのが好ましい。
ワクチンを投与してから少なくとも4日以上経てから沖出しすることが有効である。
ワクチンの充分な防御効果を得るためには沖出し前に水槽内で2回以上免疫することが望ましい。
Claims (10)
- テナキバクラム マリティマムの不活化菌体又はその成分を有効成分とする魚類滑走細菌症ワクチン。
- 浸漬ワクチンである請求項1記載の魚類滑走細菌症ワクチン。
- テナキバクラム マリティマムの菌株が、R2、SM3322c、OM3510、MC9210からなる群より選択される何れか1つである請求項1又は2に記載の魚類滑走細菌症ワクチン。
- マダイの滑走細菌症に適応される請求項1乃至3何れか記載の魚類滑走細菌症ワクチン。
- テナキバクラム マリティマムの不活化菌体又はその成分を含有する魚類滑走細菌症ワクチン組成物。
- 浸漬用のワクチン組成物である請求項5記載の魚類滑走細菌症ワクチン組成物。
- テナキバクラム マリティマムの菌株が、R2、SM3322c、OM3510、MC9210からなる群より選択される何れか1つである請求項5又は6に記載の魚類滑走細菌症ワクチン組成物。
- マダイの滑走細菌症に適応される請求項5乃至7何れか記載の魚類滑走細菌症ワクチン組成物。
- テナキバクラム マリティマムの不活化菌体又はその成分の有効量を浸漬法によって投与することを特徴とする魚類滑走細菌症の予防法。
- 沖出しの1〜2週間前に、テナキバクラム マリティマムの不活化菌体又はその成分を懸濁した溶液に20分以上浸漬する請求項9に記載の魚類滑走細菌症の予防法。
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