KR101974405B1 - Cosmetic composition comprising hydrolyzate of colostrum whey protein for skin regeneration - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 초유 유청 단백질 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 피부 재생용 화장료 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to a cosmetic composition for skin regeneration comprising a colloidal whey protein hydrolyzate as an active ingredient.
우유는 건강에 유익한 효과를 나타내는 기능성 식품이며(Gill, H.S., et al., 2000), 기능성 식품과 건강음료의 첨가제로서의 가치가 있는 것으로 알려져 있다. 우유에는 수분, 단백질, 지방, 탄수화물, 무기질, 비타민, 효소 등이 포함되어 있다. 지방은 가장 중요한 성분이며 이것을 제외한 것을 탈지유라고 한다. 탈지유에 산 또는 응유효소를 첨가하면 응고물이 생기는데 이것을 응유(curd)라 하며 우유의 주단백질인 카세인(casein)이 주성분이다. 응유를 제외한 수용액을 유청(whey)이라 하고 전체 단백질의 20%를 포함한다. Milk is a functional food with beneficial effects on health (Gill, H. S., et al., 2000) and is known to be of value as an additive in functional foods and health beverages. Milk contains water, protein, fat, carbohydrates, minerals, vitamins, and enzymes. Fat is the most important ingredient and the exception is skim milk. The addition of acid or cough enzyme to skim milk results in clotting, which is called curd and is the main protein of milk, casein. The aqueous solution, excluding the curd, is called whey and contains 20% of the total protein.
유청에는 유당, 무기질, 각종 유청 단백질 등이 포함되어 있다. 유청에 포함된 유청 단백질은 β-락토글로불린(β-lactoglobulin), α-락타알부민(α-lactalbumin), BSA(bovine serum albumin), 락토페린(lactoferrin), 면역글로불린(immunoglobulin), 효소(enzyme), GMP(glycomacropeptide) 등이 있으며, 면역글로불린은 특히 초유에 다량 함유되어 있다. 유청은 다양한 필수아미노산을 함유하고 있으며, 면역 증진 효과가 있다고도 보고된 바 있다(Marshall, K., 2004). Whey contains lactose, minerals, and whey proteins. Whey proteins contained in whey are β-lactoglobulin, α-lactalbumin, bovine serum albumin (BSA), lactoferrin, immunoglobulin, enzyme, GMP (glycomacropeptide), etc., and immunoglobulin is especially contained in colostrum. Whey contains a variety of essential amino acids and has been reported to have immunomodulatory effects (Marshall, K., 2004).
초유(colostum)는 분만 후 3일 동안 분비되는 유즙을 의미하는 것으로, 분비 시간에 따라 성분의 차이가 크기 때문에 성분 함량의 폭이 크다. 특히나, 일반우유와 비교하였을 때, 초유에는 카세인(일반우유 2.3% vs 초유 3~5%), 유청 단백질(일반우유 0.65% vs 초유 1~11%) 등의 성분이 더 많이 함유되어 있다. Colostum refers to juice that is secreted for 3 days after delivery. The amount of the component is large due to the large difference in the components depending on the secretion time. Especially when compared to normal milk, colostrum contains more components such as casein (2.3% of normal milk vs 3-5% of colostrum) and whey protein (0.65% of normal milk vs 1-11% of colostrum).
우유 단백질의 가수분해물에 대한 생리활성 기능연구는 많이 진행되어 왔는데 지금까지 가장 잘 알려진 것은 면역조절 펩티드로서 β-카세인(β-casein, f1-28) 유래 CPP(casein phosphopeptide)이다. CPP는 마우스 비장과 토끼 Peyer's patch 세포에서 세포분열물질 촉진제(mitogen)로서의 활성을 나타내고 IgA 생산을 활성화한다고 보고된 바 있다(Hata, I., et al., 1998). 또한 β-카세인 유래의 β-카소케모타이드-1(β-casochemotide-1)이라는 펩티드가 단핵구(monocyte)와 대식세포(macrophage)에서의 주화성을 높인다고 보고되기도 하였다(Kitazawa, H., et al., 2007).Studies on the physiological activity of hydrolysates of milk protein have been carried out. The most well-known is the casein phosphopeptide (CPP) derived from β-casein (f1-28) as an immunomodulating peptide. CPPs have been reported to act as mitogens and activate IgA production in mouse spleen and rabbit Peyer's patch cells (Hata, I., et al., 1998). It has also been reported that a peptide called β-casochemotide-1 derived from β-casein increases the chemotaxis in monocytes and macrophages (Kitazawa, H., et al ., 2007).
피부(skin)는 인체 표면 전체를 덮고 있는 가장 큰 장기로서, 체액의 유실을 막아주고, 외부로부터 유해물질과 미생물의 유입을 막고, 물리적 자극, 방사선과 자외선 등으로부터 우리 몸을 보호하는 기능을 수행하고 있다. 피부에는 모낭, 털, 땀샘, 피지선 등 여러 부속기관을 보유하고 있어 보호막 기능 외에도 다양한 기능을 수행하고 있는 중요한 복합 기관이다(김천호, et al., 2002). The skin is the largest organ covering the entire surface of the human body. It prevents the loss of body fluids, prevents the entry of harmful substances and microorganisms from the outside, protects the body from physical stimulation, radiation and ultraviolet rays have. The skin is an important complex organ with various functions besides the protective membrane function, such as hair follicles, hair, sweat glands and sebaceous glands (Kim Cheon-ho, et al., 2002).
피부는 크게 표피층(epidermis), 진피층(dermis) 및 피하조직(subcutaneous tissue, hypodermis)으로 나뉜다. 표피층은 피부 외부의 얇은 층으로서, 새로 분화하는 세포들로 구성되어 있으며, 이들은 외부 환경으로부터 피부를 보호하는 세포들을 계속 새로운 세포로 교체해 준다. 제일 하단부로부터 기저층(stratum basalis, basal cell layer), 유극층(stratum spinosum, spinous cell layer), 과립층(stratum granulosum, granular cell layer), 각질층(stratum corneum)으로 계층화 되어 있어 피부 표면에는 최종 분화된 죽은 세포가 여러 겹으로 쌓여 보호막 기능을 수행하게 된다. The skin is divided into epidermis, dermis and subcutaneous tissue (hypodermis). The epidermis is a thin layer outside the skin, consisting of newly differentiating cells, which replace cells protecting the skin from the external environment with new cells. The stratum basalis layer, stratum spinosum, spinous cell layer, stratum granulosum, granular cell layer and stratum corneum are stratified from the bottom to form the deadly dead dead skin layer. Cells are stacked in layers to perform the protective function.
각질형성세포(keratinocyte)는 표피의 주요 구성세포로서 분열 후 위쪽으로 이동하면서 분화가 일어나기 시작하는데, 이러한 표피의 각질화 과정에서 여러 구조 단백질들이 시기에 맞춰 프로그램화되어 있어서 발현된다. 즉, 각질형성세포의 분화는 정교하게 조절 받는 유전자 발현 변화의 결과로서 세포주기의 정기 및 현저한 세포모양의 변화를 수반하며 최종 분화 과정을 거치고 증식(proliferation) 및 분화(differentiation)를 통해 피부 장벽을 만드는 역할을 담당한다(Oh, J.S., et al., 2015). 분화와 관련되어 발현이 증가하는 유전자로는 트랜스글루타미나아제(transglutaminase) 1 및 3, 인보루크린(involucrin), 코르니핀(cornifin, small proline rich proteins, SPRR1), 로리크린(loricrine), 필라그린(filaggrin) 등이 있으며, 각질형성세포의 분화가 시작되면 세포막의 안쪽에서 인보루크린, 코르니핀, 로리크린 등의 구조단백질을 트랜스글루타미나아제가 결합시켜 각질층이 피부 장벽 기능을 수행하는데 있어 가장 중요한 역할을 하는 물에 녹지 않은 단단한 구조물인 각질세포막(cornified cell envelope, CE)을 형성하게 된다(Kwon, Y.B., et al., 2007; Nam, J.J., 2012). The keratinocyte is a major constituent of the epidermis and starts to differentiate as it moves upward after cleavage. During the keratinization process of these epidermis, various structural proteins are programmed to be expressed in time. In other words, the differentiation of keratinocytes is a consequence of precisely regulated gene expression changes, which are accompanied by regular and remarkable cell shape changes in the cell cycle, through final differentiation, proliferation and differentiation, (Oh, JS, et al., 2015). The genes whose expression is increased in association with differentiation include
진피층은 표피의 아래에 있는 층으로 혈관, 신경 등의 다양한 구조물들을 지지해 주는 기질을 공급하는 층으로 콜라겐, 탄성 섬유 및 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)들로 이루어져 있다. 진피층은 크게 상층부의 섬유아세포(fibroblast)가 풍부하고 미세 혈관이 분포하는 유두층(papillary layer)과 두꺼운 콜라겐 섬유가 풍부한 세망 결합 조직(reticular connective tissue)으로 구성되어 있다. The dermis is a layer below the epidermis that serves as a substrate for supporting various structures such as blood vessels and nerves. It consists of collagen, elastic fibers and extracellular matrix (ECM). The dermis is composed of a papillary layer rich in fibroblasts in the upper part and a microvessel, and a reticular connective tissue rich in thick collagen fibers.
진피층의 섬유아세포(dermal fibroblast)는 콜라겐 섬유, 세망 섬유 및 탄력 섬유를 이루는 기본 물질들을 생합성하여 주위의 기질로 방출하며 프로테오글리칸(proteoglycan)을 비롯한 각종 무형질 성분을 생성하여 세포외 기질 구성 성분의 많은 부분은 만들어내는 근원지이다(Kim, S.W., 2008). The dermal fibroblast of the dermal layer biosynthes the basic materials constituting the collagen fiber, the reticulated fiber and the elastic fiber and releases it to the surrounding substrate and produces various intact constituents including the proteoglycan, (Kim, SW, 2008).
피하조직은 진피와 근육, 골격 사이에 있는 부분으로 지방조직(adipose tissue)과 결합조직으로 구성되어 있고, 혈관과 림프관 및 신경말단부를 포함한다. 피하조직 내의 지방 조직은 외부의 압력으로부터 보호해주며, 마찰력에 대한 패딩 효과를 제공하여 뼈와 근육과 같은 심부구조 위에서 피부의 이동을 쉽게 한다. 또한, 지방 조직이 많아서 열을 생산하고 생산한 열을 보유할 뿐만 아니라 충격을 흡수함으로써 신체를 보호하며 여분의 영양소를 축적한다. Subcutaneous tissue is composed of adipose tissue and connective tissue between the dermis, muscle, and skeleton, and includes blood vessels, lymphatic vessels and nerve endings. The adipose tissue in the subcutaneous tissues protects against external pressure and provides a padding effect on the frictional force, which facilitates the movement of the skin on deep structures such as bones and muscles. In addition, there are many fat tissues that produce heat and produce heat, as well as absorb shocks to protect the body and accumulate extra nutrients.
피부는 우리 몸에서 가장 손상이 많이 일어나는 조직으로, 피부 손상이 발생한 경우에는 손상 부위의 빠른 치유와 피부 재생으로 자연치유가 가능하나, 손상 부위의 정도에 따라 재생 능력이나 속도가 차이가 난다. 빠른 피부 재생을 위해서는 외부 환경에서 유입될 수 있는 이물질이나 병원균에 의한 손상 발생 부위의 감염을 방지하고 각질형성세포의 분화, 증식 및 이주를 활성화시키는 것이 필요하다. 또한, 진피층의 섬유아세포는 피브로넥틴(fibronectin)과 같은 접착 단백질 발현을 증가시켜 손상된 피부조직들을 재건시킴으로써 피부 재생 및 상처 치유에 중요한 역할을 하고 있다. Skin is the most damaged tissue in our body. In case of skin damage, natural healing is possible by rapid healing and skin regeneration of damaged area, but there is a difference in regeneration ability and speed depending on the degree of damage. For rapid skin regeneration, it is necessary to prevent the infection of foreign matter or pathogenic microorganisms that may enter from the external environment, and to activate differentiation, proliferation and migration of keratinocytes. In addition, dermal fibroblasts play an important role in skin regeneration and wound healing by rebuilding damaged skin tissues by increasing expression of adhesive proteins such as fibronectin.
이에, 본 발명자는 초유 유청 단백질의 피부 재생 효과를 연구하는 과정에서, 초유 유청 단백질 가수분해물이 진피 섬유아세포 증식을 촉진시키고, 피부 재생에 중요하게 작용하는 접착 단백질인 피브로넥틴 분비 및 각질형성세포 분화 관련 인자인 인보루크린, 코르니핀, 로리크린의 발현을 증가시키는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.Accordingly, the present inventors have found that, in the process of studying the skin regeneration effect of colostrum-containing whey protein, the colloidal whey protein hydrolyzate promotes dermal fibroblast proliferation, and is associated with fibrotectin secretion and keratinocyte differentiation The present invention can be completed by confirming that the expression of phosphorylcholine, cornifin, and loricrin, which are factors, is increased.
종래 선행기술로서 한국공개특허 제2014-0020951호는 유청 단백질 가수분해물의 피부 보습, 콜라겐 합성 촉진 효과가 기재되어 있으나, 본 발명의 초유 유청 단백질 가수분해물 및 이의 각질형성세포 및 섬유아세포의 증식 촉진을 통한 피부 재생 효과는 기재 및 언급되어 있지 않다. 또한, 한국공개특허 제2014-0069569호는 초유 유청의 섬유아세포 증식 및 콜라겐 합성 촉진 효과가 기재되어 있으나, 본 발명의 초유 유청 단백질 가수분해물의 각질형성세포 분화 촉진 효과는 기재되어 있지 않다. 일본등록특허 제05719228호는 탈지유 유청의 섬유아세포 분화 및 주름, 피부 탄성 개선 효과가 기재되어 있고, 한국등록특허 제1110862호는 발효유 유청의 필라그린 합성 촉진을 통한 피부 보습 효과가 기재되어 있으나, 본 발명의 초유 유청 단백질 가수분해물의 피부 재생 효과는 기재되어 있지 않다. Korean Patent Laid-Open Publication No. 2014-0020951 discloses the effect of promoting skin moisturization and collagen synthesis of whey protein hydrolysates, but the present invention provides a method for promoting the proliferation of the colloidal whey protein hydrolyzate of the present invention and keratinocytes and fibroblasts thereof The effect of skin regeneration through is not described and mentioned. Korean Patent Laid-Open Publication No. 2014-0069569 discloses the effect of colloidal whey on promoting fibroblast proliferation and collagen synthesis, but does not describe the effect of the colloidal whey protein hydrolyzate of the present invention on promoting keratinocyte differentiation. Japanese Patent No. 05719228 discloses fibroblast differentiation, wrinkle and skin elasticity improving effect of skim milk wort, Korean Patent No. 1110862 discloses skin moisturizing effect by promoting pilagreen synthesis of fermented milk whey, The skin regeneration effect of the colloidal whey protein hydrolyzate of the invention is not described.
본 발명의 목적은 초유 유청 단백질 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 피부 재생용 화장료 조성물을 제공하는 데 있다. It is an object of the present invention to provide a cosmetic composition for skin regeneration comprising a colloidal whey protein hydrolyzate as an active ingredient.
본 발명은 알칼리 단백분해효소를 처리하여 가수분해율이 40~50%인 초유 유청 단백질 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 각질형성세포 분화를 촉진하는 피부 재생용 화장료 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to a cosmetic composition for skin regeneration, which promotes keratinocyte differentiation comprising an alcoholic whey protein hydrolyzate having an hydrolysis rate of 40 to 50% as an active ingredient by treating with an alkaline protease.
상기 초유 유청 단백질 가수분해물은 초유 유청 단백질을 pH 8~10, 50~60℃에서 알칼리 단백분해효소를 처리하여 가수분해 시킨 후, 80~100℃에서 10~40분간 처리하여 효소를 불활성화 시켜 얻을 수 있다. The colloidal whey protein hydrolyzate is obtained by hydrolyzing the coliform whey protein at pH 8 to 10 at 50 to 60 ° C with an alkaline protease and then treating the mixture at 80 to 100 ° C for 10 to 40 minutes to inactivate the enzyme .
상기 초유 유청 단백질 가수분해물은 진피 섬유아세포의 세포외기질 분비를 촉진시킬 수 있다. The colloidal whey protein hydrolyzate can promote the extracellular matrix secretion of dermal fibroblasts.
상기 세포외기질은 피브로넥틴(fibronectin)일 수 있다. The extracellular matrix may be fibronectin.
상기 초유 유청 단백질 가수분해물은 각질형성세포의 분화를 촉진시킬 수 있다. The colloidal whey protein hydrolyzate can promote the differentiation of keratinocytes.
또한, 본 발명은 상기 화장료 조성물을 함유하는 피부 재생용 화장료에 관한 것이다. The present invention also relates to a cosmetic for skin regeneration containing the cosmetic composition.
상기 화장료는 로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트리젠트, 크림, 파운데이션, 에센스, 팩, 비누, 클렌징폼 및 바디클린저로 이루어지 군에서 선택되는 하나 이상의 제형으로 이루어질 수 있다. The cosmetic may comprise one or more formulations selected from the group consisting of lotions, skin softeners, skin toners, astringents, creams, foundations, essences, packs, soaps, cleansing foams and body cleansers.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 초유 유청 단백질 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 피부 재생용 화장료 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to a cosmetic composition for skin regeneration comprising a colloidal whey protein hydrolyzate as an active ingredient.
상기 초유는 분만 후 3일 동안 분비되는 유즙을 의미하는 것으로, 일반 우유에 비해 카세인(casein), 유청 단백질 등이 많이 함유되어 있다. The colostrum refers to milk that is secreted for 3 days after delivery, and contains much casein and whey protein as compared with general milk.
상기 초유는 소, 염소, 양, 인간 등의 포유류로부터 얻을 수 있다. 바람직하게는 소이다. The colostrum can be obtained from mammals such as cattle, goats, sheep, and humans. Preferably, it is cow.
상기 유청(whey)은 우유에서 지방 및 카세인이 제거된 것을 의미하며, 이러한 유청을 투석을 이용하여 단백질만을 농축한 것을 유청 단백질이라 한다. The whey refers to the removal of fat and casein from milk, and whey protein is referred to as whey proteins by concentrating only the proteins using dialysis.
상기 유청 단백질 가수분해물은 유청 단백질을 가수분해시켜 얻을 수 있다. The whey protein hydrolyzate can be obtained by hydrolyzing whey protein.
본 발명의 초유 유청 단백질 가수분해물은 가수분해율이 40~50% 일 수 있다. The colloidal whey protein hydrolyzate of the present invention may have a hydrolysis rate of 40 to 50%.
상기 초유 유청 단백질 가수분해물은 초유 유청 단백질을 가수분해 시키는 것으로, 산, 알칼리 또는 효소 처리를 통해 얻을 수 있다. 바람직하게는 효소 처리이고, 가장 바람직하게는 알칼리 단백분해효소(alkaline protease)를 처리하여 얻을 수 있다. The colostral whey protein hydrolyzate hydrolyzes the colostrum whey protein and can be obtained by acid, alkali or enzyme treatment. Preferably an enzyme treatment, and most preferably an alkaline protease.
상기 알칼리 단백분해효소는 초유 유청 단백질 중량을 기준으로 초유 유청 단백질 및 알칼리 단백분해효소가 50~200:1 중량비율로 혼합할 수 있다. 바람직하게는 100~150:1 중량비율이고, 가장 바람직하게는 100:1 중량비율이다. The alkaline protease can be mixed with the colostrum whey protein and the alkaline protease in a weight ratio of 50 to 200: 1 based on the colostrum whey protein weight. Preferably 100 to 150: 1 by weight, and most preferably 100: 1 by weight.
상기 초유 유청 단백질 가수분해물은 초유 유청 단백질을 pH 8~10, 50~60℃에서 알칼리 단백분해효소를 처리하여 가수분해시킨 후, 80~100℃에서 10~40분간 처리하여 효소를 불활성화 시켜 얻을 수 있다. The colloidal whey protein hydrolyzate is obtained by hydrolyzing the coliform whey protein at pH 8 to 10 at 50 to 60 ° C with an alkaline protease and then treating the mixture at 80 to 100 ° C for 10 to 40 minutes to inactivate the enzyme .
상기 알칼리 단백분해효소는 5분 이상 처리할 수 있다. 바람직하게는 5~60분이고, 더 바람직하게는 5~10분이다. 알칼리 단백분해효소를 5분 미만 처리한 경우에는 초유 유청 단백질의 가수분해율이 40% 미만이 될 수 있어, 바람직하지 못하며, 10분 이상 처리하더라도 초유 유청 단백질의 가수분해율이 10분간 처리한 것과 큰 차이가 없어, 제조 공정상 바람직하지 못할 수 있다. The alkaline protease can be treated for 5 minutes or more. Preferably 5 to 60 minutes, and more preferably 5 to 10 minutes. When the alkaline protease is treated for less than 5 minutes, the hydrolysis rate of the coliform whey protein may be less than 40%, which is not preferable. Even if the treatment is performed for 10 minutes or longer, So that it may be undesirable in the manufacturing process.
상기 초유 유청 단백질 가수분해물은 피부 재생 효과를 가지며, 가수분해율이 40% 미만이거나 50% 초과일 경우에는 피부 재생 효과가 낮아 바람직하지 못하다. The colloidal whey protein hydrolyzate has a skin regeneration effect, and when the hydrolysis rate is less than 40% or more than 50%, the effect of regenerating the skin is undesirably low.
상기 피부 재생 효과는 진피 섬유아세포 증식, 진피 섬유아세포의 세포외기질 발현 증가 및 분비 촉진, 각질형성세포의 분화 촉진 등 일 수 있다. The skin regeneration effect may be dermal fibroblast proliferation, increase of extracellular matrix expression and promotion of secretion of dermal fibroblast, promotion of differentiation of keratinocyte, and the like.
상기 세포외기질은 콜라겐(collagen), 엘라스틴(elastin), 히알루론산(hyaluronic acid), 피브로넥틴(fibronectin) 등일 수 있으며, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 피브로넥틴이다. The extracellular matrix may be, but is not limited to, collagen, elastin, hyaluronic acid, fibronectin, and the like. It is preferably fibronectin.
상기 초유 유청 단백질 가수분해물은 각질형성세포의 분화를 촉진시킬 수 있다. The colloidal whey protein hydrolyzate can promote the differentiation of keratinocytes.
상기 각질형성세포는 피부 표피의 주요 구성세포로서 각질형성세포의 증식 및 분화를 통해 피부 장벽을 만드는 역할을 담당하는 것으로, 각질형성세포 분화시 인보루크린(involucrin), 코르니핀(cornifin), 로리크린(loricrine) 등의 발현이 증가한다. The keratinocyte is a main constituent cell of the skin epidermis and plays a role of making a skin barrier through proliferation and differentiation of keratinocytes. In the keratinocyte differentiation, involucrin, cornifin, The expression of loricrine and the like is increased.
상기 초유 유청 단백질 가수분해물의 각질형성세포의 분화 촉진은 인보루크린, 코리니핀 및 로리크린의 단백질 또는 유전자의 발현을 증가시키는 것일 수 있다. Promoting the differentiation of keratinocytes of the colostral whey protein hydrolyzate may be to increase the expression of proteins or genes of involucrin, corinipine, and lorikreen.
상기 초유 유청 단백질 가수분해물은 총 화장료 조성물에 0.001~50중량%, 바람직하게는 0.001~30중량%가 함유될 수 있다. The colloidal whey protein hydrolyzate may be contained in the total cosmetic composition in an amount of 0.001 to 50% by weight, preferably 0.001 to 30% by weight.
상기 화장료 조성물은 본 발명의 초유 유청 단백질 가수분해물 이외에 본 발명이 목적으로 하는 피부 재생 효과를 상승시켜 줄 수 있는 다른 성분을 함유할 수 있다. In addition to the colloidal whey protein hydrolyzate of the present invention, the cosmetic composition may contain other components that can enhance the skin regeneration effect of the present invention.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 화장 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제, 예컨대 친수성 또는 친유성 겔화제, 친수성 또는 친유성 활성제, 보존제, 항산화제, 용매, 방향제, 충전제, 차단제, 안료, 흡취제 또는 염료를 함유할 수 있다. The cosmetic composition according to the present invention can be used as an adjuvant commonly used in cosmetics such as hydrophilic or lipophilic gelling agents, hydrophilic or lipophilic active agents, preservatives, antioxidants, solvents, fragrances, fillers, ≪ / RTI >
상기 보조제의 양은 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 양이며, 예컨대 화장료 조성물 총 중량에 대해 0.001~70중량%, 바람직하게는 0.001~50중량%이다. 다만, 어떠한 경우라도 보조제 및 그 비율은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 바람직한 성질에 악영향을 미치지 않도록 선택될 수 있다. The amount of the adjuvant is an amount ordinarily used in the art, for example, 0.001 to 70% by weight, preferably 0.001 to 50% by weight based on the total weight of the cosmetic composition. However, in any case, the adjuvants and their proportions may be chosen so as not to adversely affect the desired properties of the cosmetic composition according to the invention.
또한, 본 발명은 상기 화장료 조성물을 함유하는 피부 재생용 화장료에 관한 것이다. The present invention also relates to a cosmetic for skin regeneration containing the cosmetic composition.
상기 화장료는 로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트리젠트, 크림, 파운데이션, 에센스, 팩, 비누, 클렌징폼 및 바디클린저로 이루어지 군에서 선택되는 하나 이상의 제형으로 이루어질 수 있다. The cosmetic may comprise one or more formulations selected from the group consisting of lotions, skin softeners, skin toners, astringents, creams, foundations, essences, packs, soaps, cleansing foams and body cleansers.
본 발명은 초유 유청 단백질 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 피부 재생용 화장료 조성물에 관한 것으로, 초유 유청 단백질 가수분해물이 진피 섬유아세포의 증식을 촉진시키고, 피부 재생에 중요하게 작용하는 접착 단백질인 피브로넥틴 분비 및 각질형성세포 분화와 관련된 인자인 인보루크린, 코르니핀 및 로리크린의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다. 또한, 이러한 활성이 초유 유청 단백질 및 우유 유청 단백질 가수분해물과 비교하여 초유 유청 단백질 가수분해물이 현저히 우수함을 확인하였다. The present invention relates to a cosmetic composition for skin regeneration comprising a colloidal whey protein hydrolyzate as an active ingredient, wherein the colloidal whey protein hydrolyzate promotes the proliferation of the dermal fibroblast, and the fibronectin secretion And keratinocytes, which are factors associated with keratinocyte differentiation. In addition, it was confirmed that this activity was significantly superior to the colostral whey protein hydrolyzate as compared to the colostral whey protein and milk whey protein hydrolyzate.
이에 따라, 본 발명의 초유 유청 단백질 가수분해물을 이용하여 우수한 피부 재생 효과가 있는 화장품 조성물을 개발할 수 있을 것으로 기대된다. Accordingly, it is expected that a cosmetic composition having excellent skin regeneration effect can be developed using the colloidal whey protein hydrolyzate of the present invention.
도 1은 초유 유청 단백질의 가수분해 처리 시간에 따른 가수분해 정도를 보여주고 있는 것으로, (A)는 처리 시간에 따른 가수분해 정도를 전기영동으로 확인한 결과를, (B)는 10분간 가수분해한 초유 유청 단백질 가수분해물을 RP-HPLC로 분석한 결과를 보여주고 있다.
도 2는 초유 유청 단백질 가수분해물의 진피 섬유아세포 증식 촉진 효과를 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 3은 초유 유청 단백질 가수분해물의 진피 섬유아세포에서의 피브로넥틴 분비 촉진 효과를 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 4는 초유 유청 단백질 가수분해물의 각질형성세포 분화 관련 인자인 인보루크린 및 로리크린 단백질의 발현 유도 효과를 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 5는 초유 유청 단백질 가수분해물의 각질형성세포 분화 관련 인자인 (A)인보루크린, (B) 코르니핀 및 (C) 로리크린의 mRNA 발현 유도 효과를 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 6은 초유 유청 단백질 가수분해물의 진피 섬유아세포에서의 콜라겐 분비 촉진 효과를 확인한 결과를 보여주고 있다. FIG. 1 shows the degree of hydrolysis according to the hydrolysis treatment time of the colostrum whey protein. FIG. 1 (A) shows the results of hydrolysis by electrophoresis according to the treatment time, and (B) The results of analysis of colostral whey protein hydrolyzate by RP-HPLC are shown.
FIG. 2 shows the results of confirming the promoting effect of the colloidal whey protein hydrolyzate on dermal fibroblast proliferation.
FIG. 3 shows the results of confirming the effect of the colloidal whey protein hydrolyzate on the secretion of fibronectin in dermal fibroblasts.
FIG. 4 shows the results of confirming the induction effects of involucrin and loroclin protein, which are factors related to keratinocyte differentiation of colostral whey protein hydrolysates.
FIG. 5 shows the results of examining the effect of inducing mRNA expression of (A) Involucrin, (B) cornifine and (C) roricrin, which are keratinocyte differentiation factors of colostrum whey protein hydrolysates.
FIG. 6 shows the results of confirming the collagen secretion promoting effect of the colloidal whey protein hydrolyzate in the dermal fibroblast.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in detail. However, the present invention is not limited to the embodiments described herein but may be embodied in other forms. Rather, the intention is to provide an exhaustive, complete, and complete disclosure of the principles of the invention to those skilled in the art.
<비교예 1. 초유 유청 단백질 제조>≪ Comparative Example 1: Preparation of colostral whey protein >
홀스타인 젖소로부터 송아지 분만 후 72시간 이내에 위생적으로 착유한 초유 100㎏을 원심 분리하여 지방을 제거하였다. 지방을 제거한 초유에 pH가 4.6이 되도록 산을 처리하여 카세인(casein)을 침전시켜 초유 유청을 수득하였다. 수득한 초유 유청은 투석막을 이용하여 무기물, 비타민, 유당 등 기타 성분을 제거하여 초유 유청 단백질만을 분리하였다. Within 72 hours after calf delivery, 100 kg of hygienically milked colostrum was centrifuged to remove fat from a Holstein cow. Acid was treated to remove the fat from the colostrum to a pH of 4.6 to precipitate casein to obtain colostrum whey. The obtained colloidal whey was separated from colostrum whey protein by removing other ingredients such as minerals, vitamins and lactose using a dialysis membrane.
<실시예 1. 초유 유청 단백질 가수분해물의 제조>≪ Example 1: Preparation of colostral whey protein hydrolyzate >
초유 유청 단백질 가수분해물을 제조하기 위해 상기 비교예 1에서 분리한 초유 유청 단백질을 이용하였다. The colloidal whey protein isolated in Comparative Example 1 was used to produce a colostrum whey protein hydrolyzate.
상기 비교예 1의 초유 유청 단백질 5g에 알칼리 단백분해효소(alkaline protease)(FoodPro® Alkaline Protease, Danisco, France)를 초유 유청 단백질 중량을 기준으로 효소와 기질이 1:100이 되도록 첨가하고, pH 8.5, 53℃ 조건에서 10, 20, 30, 40, 50분 동안 가수분해를 실시하였다. 가수분해 완료 후 90℃에서 30분간 처리하여 알칼리 단백분해효소를 불활성화시킨 후, 원심 분리하여 상층액을 분리하고, 분리한 상층액을 동결건조하여 분말 형태의 초유 유청 단백질 가수분해물을 확보하였다. To 5 g of the coliform whey protein of Comparative Example 1 was added an alkaline protease (FoodPro Alkaline Protease, Danisco, France) was added in an amount of 1: 100 based on the weight of coliform whey protein, and hydrolysis was carried out at pH 8.5 and 53 ° C for 10, 20, 30, 40 and 50 minutes . After completion of the hydrolysis, the mixture was treated at 90 ° C for 30 minutes to inactivate the alkaline protease. The supernatant was separated by centrifugation, and the separated supernatant was lyophilized to obtain a powdery colostral whey protein hydrolyzate.
상기에서 확보한 초유 유청 단백질 가수분해물의 가수분해 정도를 확인하기 위해 전기영동 및 RP-HPLC(Waters 2487 Dural Dector, 600 Controller, 2410 Refractive index Detector, Milford, MA, USA)를 수행하고, 그 결과를 도 1에 나타내었다. (Waters 2487 Dural Dector, 600 Controller, 2410 Refractive index Detector, Milford, Mass., USA) was performed to confirm the degree of hydrolysis of the colloidal whey protein hydrolyzate obtained above. 1.
RP-HPLC는 용매 A(solvent A, 0.1% TFA[trifluoroacetic acid] in H2O)로 평형화시킨 C18 컬럼(4.6×250㎜, Vydac, Hesperia, CA. U.S.A)을 사용하였고 용매 B(solvent B, 0.1% TFA in acetonitrile)로 40분 동안 평형농도차(linear gradient)로 용출시켰다. RP-HPLC 시스템 작동은 실온에서 1㎖/min 유속으로, 흡광도는 214㎚로 작동시켰다. 초유 유청 단백질 가수분해물 주입량은 10㎕로서, 상기 가수분해물의 농도는 0.5㎎/㎖이었다. 이때, 대조군으로 상기 비교예 1의 초유 유청 단백질을 이용하였으며, 모든 시료는 필터(0.22㎛ Acrodisc Syringe Filters, Gelman Laboratory, Ann Arbor, MI, USA)로 C18 컬럼에 주입하기 전에 여과 후 사용하였다. RP-HPLC was performed on a C18 column (4.6 × 250 mm, Vydac, Hesperia, CA. USA) equilibrated with solvent A (solvent A, 0.1% TFA [trifluoroacetic acid] in H 2 O) 0.1% TFA in acetonitrile) for 40 min in a linear gradient. The operation of the RP-HPLC system was operated at a flow rate of 1 ml / min at room temperature and an absorbance of 214 nm. The amount of colloidal whey protein hydrolyzate injected was 10 μl, and the concentration of the hydrolyzate was 0.5 mg / ml. As a control, the colloidal whey protein of Comparative Example 1 was used. All the samples were used after filtration before being injected into a C18 column with a filter (0.22 μm Acrodisc Syringe Filters, Gelman Laboratory, Ann Arbor, MI, USA).
도 1에서 보여주듯이, 전기영동 결과의 경우(A), 초유 유청 단백질의 가수분해 처리 시간에 따른 가수분해 정도는 큰 차이가 나타나지 않는 것으로 확인되었으며, 가수분해 된 경우, 분자량이 14.4kDa 이하의 가수분해물과 6.5kDa 이하의 저분자 펩티드가 다양하게 생성되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 10분간 가수분해 처리한 초유 유청 단백질의 가수분해 정도를 RP-HPLC로 분석한 결과(B)를 통해서도 확인할 수 있었다. 즉, 대조군으로 이용한 초유 유청 단백질 피크에 비해 초유 유청 단백질 가수분해물의 피크가 앞쪽에 나타나는 것을 통해, 초유 유청 단백질이 가수분해되어 다양한 크기의 가수분해물이 생성되었음을 알 수 있었다. As shown in Fig. 1, in the case of the electrophoresis result (A), it was confirmed that the degree of hydrolysis according to the hydrolysis treatment time of the coliform whey protein did not show a great difference, and in case of hydrolysis, It was confirmed that the degradation products and low molecular weight peptides of 6.5 kDa or less were produced in various forms. This result was confirmed by the analysis of the hydrolysis degree of the colostral whey protein hydrolyzed for 10 minutes by RP-HPLC (B). In other words, the peaks of the colloidal whey protein hydrolyzate appeared in front of the colloidal whey protein peaks used as the control group, indicating that the colloidal whey proteins were hydrolyzed to produce hydrolysates of various sizes.
또한, 알칼리 단백분해효소에 의한 가수분해율을 TNBS(trinitrobenznsulfonic acid)를 이용해 가수분해물의 α-아미노기(amino group)를 정량 분석하여 확인하였다. In addition, the hydrolysis rate of the alkaline protease was confirmed by quantitative analysis of the α-amino group of the hydrolyzate using trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS).
구체적인 TNBS 방법은 상기 초유 유청 단백질 가수분해물 250㎕를 뜨거운 1% SDS(sodium dodecyl sulphate) 1.25㎖에 분산시켜 75℃의 수조에서 15분간 열처리한 다음 5㎖의 1% SDS를 첨가하여 혼합하였다. 혼합한 시료액 중 250㎕를 0.2125M 인산 완충용액(phosphate buffer)(pH 8.2) 2㎖ 및 0.1% TNBS 2㎖과 혼합한 다음, 50℃의 암소에서 60분간 반응시키고 0.1N HCl 4㎖을 첨가하여 반응을 정지시킨 후 340㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 초유 유청 단백질 가수분해물의 정량을 위해 L-류신(leucine)을 1% SDS 용액에 농도별(㎍/㎖)별로 용해하고 상기 방법과 동일하게 수행하여 흡광도를 측정하여 표준 곡선을 그리고, 하기 식 1에 따라 가수분해율을 분석하였다. Specifically, 250 μl of the colloidal whey protein hydrolyzate was dispersed in 1.25 ml of hot 1% SDS (sodium dodecyl sulphate), heat-treated in a water bath at 75 ° C. for 15 minutes, and then mixed with 5 ml of 1% SDS. 250 μl of the mixed sample solution was mixed with 2 ml of 0.2125 M phosphate buffer (pH 8.2) and 2 ml of 0.1% TNBS, reacted in a dark place at 50 ° C. for 60 minutes, 4 ml of 0.1 N HCl was added After stopping the reaction, absorbance was measured at 340 nm. At this time, for the determination of colostral whey protein hydrolyzate, L-leucine was dissolved in 1% SDS solution per concentration (쨉 g / ml), and the absorbance was measured in the same manner as described above, The hydrolysis rate was analyzed according to
[식 1][Formula 1]
가수분해율(Degree of hydrolysis, DH)(%) = (h/hhot)×100 Degree of hydrolysis (DH) (%) = (h / h hot ) x 100
h : 가수분해되는 동안 생성된 α-아미노기의 농도 (milliequivalent(meqv)/g 단백질)h: the concentration of the [alpha] -amino group produced during the hydrolysis (milliequivalent (meqv) / g protein)
hhot :유청 단백질의 경우 hhot는 8.8 meqv/gh hot: for whey proteins h hot is 8.8 meqv / g
상기 방법에 따라, 10분 이상 가수분해 처리한 초유 유청 단백질 가수분해물의 가수분해율이 약 40~50% 정도임을 확인하였다. According to the above method, it was confirmed that the hydrolysis rate of the colloidal whey protein hydrolyzate hydrolyzed for 10 minutes or more was about 40 to 50%.
이에 따라, 본 발명의 초유 유청 단백질 가수분해물은 알칼리 단백분해효소를 10분 동안 처리한 것을 이용하였다. Accordingly, the colloidal whey protein hydrolyzate of the present invention was obtained by treating the alkaline protease for 10 minutes.
<비교예 2. 우유 유청 단백질 가수분해물의 제조>≪ Comparative Example 2: Preparation of milk whey protein hydrolyzate >
본 발명의 초유 유청 단백질 가수분해물과의 차이를 확인하기 위해 일반 우유 유청 단백질 가수분해물을 제조하였다. 제조 방법은 상기 비교예 1 및 실시예 1과 동일한 방법을 이용하여, 비교예 2의 우유 유청 단백질 가수분해물을 제조하였다. The whey protein hydrolyzate of general milk was prepared to confirm the difference from the colostral whey protein hydrolyzate of the present invention. The milk whey protein hydrolyzate of Comparative Example 2 was prepared using the same method as that of Comparative Example 1 and Example 1 described above.
<실시예 2. 진피 섬유아세포 증식 촉진 효과 확인><Example 2> Confirmation of promotion effect of dermal fibroblast proliferation>
본 발명의 초유 유청 단백질 가수분해물의 피부 재생 효과를 확인하기 위해 진피 섬유아세포의 증식 촉진 여부를 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 어세이를 이용해 확인하였다. 실험에 사용한 인간 진피 섬유아세포(human dermal fibroblast, HDF)는 포경수술 환자로부터 조직 공여에 대한 동의를 받은 후 음경표피를 얻고 이를 잘게 잘라 세포배양 접시에 부착시킨 후 조직으로부터 세포가 빠져 나와 자라도록 하는 일차배양(primary culture)을 통해 획득하였다. In order to confirm the skin regeneration effect of the colloidal whey protein hydrolyzate of the present invention, the promotion of the proliferation of the dermal fibroblast was examined by using an assay of 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5- diphenyltetrazolium bromide Respectively. The human dermal fibroblast (HDF) used in the experiment was obtained from a circumcised patient and after receiving consent for tissue donation, the penis skin was obtained, minced and attached to a cell culture dish, Were obtained by primary culture.
상기에서 획득한 일차 배양한 섬유아세포는 5% FBS(fetal bovine serum), 100U/㎖의 페니실린, 100㎍/㎖의 스트렙토마이신, 0.25㎍/㎖의 훈기존(fungizone)이 포함되어 있는 DMEM 배지를 이용하여 배양하였고, 100㎜ 플레이트에 배양한 세포를 24웰 플레이트에 웰 당 2×104개 세포가 되도록 분주하여 18시간 동안 배양하였다. FBS가 포함되지 않은 DMEM 배지로 교체 후 상기 실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2의 시료를 처리하고, 24시간 동안 배양하였다. 이때, 아무것도 처리하지 않은 섬유아세포를 대조군으로 이용하였다. 24시간 후에 세포에 100㎍/㎖의 농도로 MTT 용액을 처리하고 37℃에서 4시간 반응시킨 후 배양액을 제거하고 형성된 포마잔(formazan) 침전물을 DMSO(dimethyl sulfoxide) 200㎕로 녹이고 100㎕를 취해 570㎚에서 흡광도를 측정한 후, 대조군의 세포 증식을 100%로 기준으로 하여 각 처리군의 세포 증식율을 계산하고, 결과를 도 2에 나타내었다. The primary cultured fibroblasts obtained above were cultured in DMEM medium containing 5% FBS (fetal bovine serum), 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin and 0.25 μg / ml fungizone , And cells cultured on a 100 mm plate were seeded in a 24 well plate at 2 x 10 < 4 > cells / well And cells were cultured for 18 hours. After replacing DMEM medium not containing FBS, the samples of Example 1, Comparative Example 1 and Comparative Example 2 were treated and cultured for 24 hours. At this time, fibroblasts that were not treated with any were used as a control group. After 24 hours, the cells were treated with MTT solution at a concentration of 100 μg / ml and reacted at 37 ° C. for 4 hours. The culture solution was removed and the formed formazan precipitate was dissolved in 200 μl of DMSO (dimethyl sulfoxide) After measuring the absorbance at 570 nm, the cell proliferation rate of each treatment group was calculated based on the cell proliferation of the control group as 100%, and the results are shown in FIG.
도 2에서 보여주듯이, 비교예 1의 초유 유청 단백질 및 비교예 2의 우유 유청 단백질 가수분해물을 처리한 경우는 대조군의 세포 증식율과 비슷한 반면에, 실시예 1의 초유 유청 단백질 가수분해물을 처리한 경우는 비교예 1 및 비교에 2에 비해 진피 섬유아세포의 증식율이 현저히 증가하는 것을 확인하였다. As shown in FIG. 2, the treatment of the coliform whey protein of Comparative Example 1 and the milk whey protein hydrolyzate of Comparative Example 2 was similar to that of the control group, whereas the treatment of the colostral whey protein hydrolyzate of Example 1 Showed that the proliferation rate of the dermal fibroblasts was significantly increased as compared with those of Comparative Examples 1 and 2.
본 명세서에는 보여주지 않았으나, 가수분해율이 40% 미만 또는 60% 정도인 초유 유청 단백질 가수분해물의 경우에는 진피 섬유아세포의 증식율이 대조군과 유사한 것을 확인하였다. Although not shown in the present specification, it was confirmed that the proliferation rate of the dermal fibroblast was similar to that of the control in the case of the colloidal whey protein hydrolyzate having a hydrolysis rate of less than 40% or 60%.
이를 통해, 본 발명의 초유 유청 단백질 가수분해물이 진피 섬유아세포 증식 촉진을 통한 피부 재생 효과가 있음을 알 수 있었다. Thus, it was found that the colloidal whey protein hydrolyzate of the present invention had a skin regeneration effect through promotion of dermal fibroblast proliferation.
<< 실시예Example 3. 3. 피브로넥틴Fibronectin 분비 촉진 효과 확인> Confirmation of secretion promoting effect>
피부 손상시 진피층의 섬유아세포는 세포외기질의 발현을 증가시켜 피부 재생을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 이 중, 피브로넥틴과 같은 접착 단백질의 발현 증가를 통해 손상된 피부 조직들을 재건시켜 피부 재생시킨다. 따라서, 본 발명의 초유 유청 단백질 가수분해물의 피부 재생 효과를 확인하기 위해 진피 섬유아세포에서의 피브로넥틴 분비 정도를 분석하였다. Fibroblasts in the dermal layer are known to promote the regeneration of the skin by increasing the expression of the extracellular matrix during skin damage. Among them, the increased expression of adhesive proteins such as fibronectin, rebuilds damaged skin tissues and regenerates the skin. Therefore, in order to confirm the skin regeneration effect of the colloidal whey protein hydrolyzate of the present invention, the degree of secretion of fibronectin in the dermal fibroblast was analyzed.
상기 실시예 2와 동일한 방법으로 배양한 섬유아세포를 24웰 플레이트에 웰 당 2×104개 세포가 되도록 분주하여 18시간 동안 배양하였다. FBS가 포함되지 않은 DMEM 배지로 교체 후, 실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2의 시료를 처리하고, 48시간 동안 배양하였다. 48시간 후에 세포 배양액 100㎕를 취해 분비된 피브로넥틴의 양을 Fibronectin EIA(Takara, Japan) 키트를 이용하여 분석하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 이때, 대조군으로 아무것도 처리하지 않은 세포 배양액을, 양성 대조군으로는 섬유아세포에서 세포외기질 합성을 유도하는 것으로 잘 알려진 TGF-β를 처리한 세포 배양액을 이용하였다. The fibroblast cultured in the same manner as in Example 2 was applied to a 24-well plate at a density of 2 x 10 < 4 > cells And cells were cultured for 18 hours. After replacing with DMEM medium not containing FBS, the samples of Example 1, Comparative Example 1 and Comparative Example 2 were treated and cultured for 48 hours. After 48 hours, 100 μl of the cell culture was taken and the amount of fibronectin secreted was analyzed using a Fibronectin EIA (Takara, Japan) kit. The results are shown in FIG. At this time, as a positive control, a cell culture medium treated with TGF-β, which is known to induce extracellular matrix synthesis in fibroblasts, was used as a control.
도 3에서 보여주듯이, 실시예 1의 초유 유청 단백질 가수분해물을 처리한 경우에 비교예 1의 초유 유청 단백질 및 비교예 2의 우유 유청 단백질 가수분해물을 처리한 경우보다 진피 섬유아세포의 피브로넥틴 분비량이 증가한 것을 확인하였다. As shown in FIG. 3, when the colostral whey protein hydrolyzate of Example 1 was treated, the amount of fibronectin secreted by the dermal fibroblast was increased compared to the case of the whey protein of Comparative Example 1 and the whey protein hydrolyzate of Comparative Example 2 Respectively.
이를 통해, 본 발명의 초유 유청 단백질 가수분해물이 피부 재생에 중요한 역할을 하는 세포외 기질의 발현 및 분비를 촉진시킴으로써 피부 재생을 유도한다는 것을 알 수 있었다. Thus, it was found that the colloidal whey protein hydrolyzate of the present invention promotes skin regeneration by promoting the expression and secretion of extracellular matrix, which plays an important role in skin regeneration.
<실시예 4. 각질형성세포 분화 관련 인자의 발현 유도 확인>Example 4 Confirmation of induction of expression of keratinocyte differentiation factor [
표피층에서는 각질형성세포의 분화, 증식 및 이주의 활성화를 통해 피부의 빠른 재생을 유도한다. 이에, 본 발명의 초유 유청 단백질 가수분해물의 각질형성세포의 분화 촉진에 미치는 영향을 확인하기 위해 각질형성세포 분화 관련 유전자의 발현 증가 여부를 확인하였다. In the epidermal layer, it induces rapid regeneration of skin through differentiation, proliferation and activation of keratinocyte. Thus, in order to confirm the effect of the colloidal whey protein hydrolyzate of the present invention on the promotion of differentiation of keratinocytes, the expression of keratinocyte differentiation-related gene was increased.
실시예 4-1. 각질형성세포 분화 관련 인자의 단백질 발현 확인Example 4-1. Identification of protein expression of keratinocyte differentiation factor
실험에 사용한 인간 각질형성세포(human epidermal keratinocytes)는 포경수술 환자로부터 조직 공여에 대한 동의를 받은 후 음경 표피를 얻고, 디스페이즈(dispase)를 이용하여 표피와 진피로 분리한 후, 표피를 트립신(trypsin)에 처리하여 단일세포로 만들어 100U/㎖의 페니실린 및 100㎍/㎖의 스트렙토마이신이 포함되어 있는 KGM(keatinocyte growth medium) 배지를 넣어 획득하였다. Human epidermal keratinocytes were obtained from circumcised patients after obtaining consent for tissue donation. The epidermis was separated into epidermis and dermis using dispase, and the epidermis was treated with trypsin trypsin) to obtain single cells, and KGM (keatinocyte growth medium) medium containing 100 U / ml of penicillin and 100 μg / ml of streptomycin was added.
실험을 위해 상기 각질형성세포를 100㎜ 플레이트에 플레이트 당 1×105개 세포가 되도록 분주하여 24시간 동안 배양하였다. KBM(keatinocyte basal medium) 배지로 교체 후, 상기 실시예 1 및 비교예 1의 시료를 1%[w/v]가 되도록 처리하고, 5일(120시간) 동안 배양하였다. 이때, 아무것도 처리하지 않은 세포를 대조군으로 이용하였다. 5일 후에 세포를 모은 후, 모은 세포를 용해(lysis)시켜 단백질을 확보하였다. 확보한 세포 단백질 동량을 이용하여 웨스턴 블롯(western blot)을 수행하였다. 이때, 각질형성세포 분화 관련 인자인 인보루크린 및 로리크린의 단백질 발현을 확인하기 위해 각각의 인자에 대한 항체를 처리하였고, 로딩(loading) 대조군으로 액틴(actin)에 대한 항체를 처리하여 발현 정도를 분석하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. For the experiment, the keratinocytes were plated on a 100 mm plate at a density of 1x10 < 5 > cells And cells were cultured for 24 hours. After replacing with KBM medium (keatinocyte basal medium), the samples of Example 1 and Comparative Example 1 were treated to 1% [w / v] and cultured for 5 days (120 hours). At this time, cells that were not treated with any were used as a control group. After 5 days, the cells were collected and the collected cells were lysed to obtain proteins. Western blotting was performed using the same amount of the cell protein. At this time, antibodies to each factor were treated to examine protein expression of invlorucrin and loricrin, keratinocyte differentiation factors, and the antibody to actin was treated as a loading control, And the results are shown in FIG.
도 4에서 알 수 있듯이, 비교예 1의 초유 유청 단백질을 처리한 경우 보다 실시예 1의 초유 유청 단백질 가수분해물을 처리한 경우, 인보루크린 및 로리크린의 단백질 발현이 증가한 것을 확인하였다. As can be seen from FIG. 4, protein expression of Involucrin and loricrin was increased when the colloidal whey protein hydrolyzate of Example 1 was treated, compared to the case of the colostral whey protein of Comparative Example 1.
실시예 4-2. 각질형성세포 분화 관련 인자의 mRNA 발현 확인Example 4-2. Identification of mRNA expression of keratinocyte differentiation factor
상기 실시예 4-1과 동일한 방법으로 각질형성세포에 실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2의 시료를 처리하였고, 양성 대조군으로 칼슘 이온(Ca2 +)을 처리하여 각각의 시료 처리 세포를 확보하였다. 이때, 아무것도 처리하지 않은 세포를 대조군으로 이용하였다. In keratinocytes in the same manner as Example 4-1, Example 1, Comparative Example 1 and Comparative Example 2 were prepared for the measurement of, for each of the samples treated cells were treated with calcium ions (Ca + 2) as a positive control Respectively. At this time, cells that were not treated with any were used as a control group.
확보한 세포로부터 mRNA를 추출한 후, 표 1의 프라이머와 SYBR Green PCR Master Mix를 이용하여 실시간 RT-PCR(real-time reverse transcription-polymerase chain reaction)을 수행하여, 인보루크린, 코르니핀 및 로리크린의 mRNA 발현 정도를 분석하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 이때, GAPDH를 정량 대조군으로 이용하였다. Real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) was performed using the primers shown in Table 1 and SYBR Green PCR Master Mix, And the results are shown in FIG. 5. At this time, GAPDH was used as a quantitative control group.
도 5에서 보여주듯이, 인보루크린(A), 크로니핀(B) 및 로리크린(C)의 mRNA 발현율이 실시예 1의 초유 유청 단백질 가수분해물을 처리한 경우에 현저히 증가된 것을 확인하였고, 양성 대조군 보다도 mRNA 발현율이 더 높은 것을 확인하였다. As shown in FIG. 5, it was confirmed that mRNA expression rates of Involucrin (A), Chronipin (B) and Lorycin (C) were significantly increased when the colloidal whey protein hydrolyzate of Example 1 was treated, MRNA expression rate was higher than that of the control group.
상기 실시예 4-1 및 실시예 4-2의 결과를 통해, 본 발명의 초유 유청 단백질 가수분해물이 피부 재생에 관련된 각질형성세포의 분화를 유도함으로써 피부 재생 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있었다.The results of Examples 4-1 and 4-2 show that the colloidal whey protein hydrolyzate of the present invention induces differentiation of keratinocytes associated with skin regeneration, thereby exhibiting a skin regeneration effect.
<< 실시예Example 5. 콜라겐 합성 촉진 효과 확인> 5. Confirmation of promoting collagen synthesis>
본 발명의 초유 유청 단백질 가수분해물의 진피 섬유아세포에서의 콜라겐 합성 촉진 효과를 확인하였다. The collagen synthesis promoting effect of the colloidal whey protein hydrolyzate of the present invention in the dermal fibroblast was confirmed.
상기 실시예 2의 진피 섬유아세포를 100㎜ 플레이트에 플레이트 당 1×105개 세포가 되도록 분주하여 24시간 동안 배양하였다. KBM(keatinocyte basal medium) 배지로 교체 후, 상기 실시예 1 및 비교예 1의 시료를 1%[w/v]가 되도록 처리하고, 5일(120시간) 동안 배양하였다. 이때, 아무것도 처리하지 않은 세포를 대조군으로 이용하였다. 5일 후에 세포 배양액에 포함되어 있는 프로콜라겐의 함량을 프로콜라겐 분석 ELISA 키트 및 제조사로부터 제공받은 실험 방법을 바탕으로 분석하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.The dermal fibroblast of Example 2 was coated on a 100 mm plate at a density of 1 x 10 5 And cells were cultured for 24 hours. After replacing with KBM medium (keatinocyte basal medium), the samples of Example 1 and Comparative Example 1 were treated to 1% [w / v] and cultured for 5 days (120 hours). At this time, cells that were not treated with any were used as a control group. After 5 days, the content of procollagen contained in the cell culture was analyzed based on the procollagen analysis ELISA kit and the experimental method provided by the manufacturer, and the results are shown in FIG.
도 6에서 보여주듯이, 비교예 1의 초유 유청 단백질을 처리한 경우에 비해, 실시예 1의 초유 유청 단백질 가수분해물을 처리한 경우에 프로콜라겐의 분비량이 낮은 것을 확인하였다. As shown in FIG. 6, when the colloidal whey protein hydrolyzate of Example 1 was treated, the amount of procollagen secretion was lower than that of the colostral whey protein of Comparative Example 1.
이를 통해, 본 발명의 초유 유청 단백질 가수분해물이 진피 섬유아세포의 콜라겐 합성에는 영향을 주지 않음을 알 수 있었다. Thus, it was found that the colloidal whey protein hydrolyzate of the present invention did not affect the collagen synthesis of the dermal fibroblast.
<제조예 1. 화장료 제조>≪ Preparation Example 1: Preparation of cosmetic preparation >
제조예 1-1. 크림 제조Production Example 1-1. Cream manufacturing
본 발명의 초유 유청 단백질 가수분해물 5g에 시토스테롤 4g, 폴리글리세릴 2-올레이트 3g, 세라마이드 0.7g, 세테아레스-4 2g, 콜레스테롤 3g, 디세틸포스페이트 0.4g, 농글리세린 5.0g, 선플라우어오일 22g, 카르복시비닐폴리머 0.5g, 트리에탄올아민 0.5g, 방부제 및 향료 미량 및 정제수를 총 무게가 100g이 되도록 혼합하였고, 통상의 크림 제조 방법에 따라 영양 크림을 제조하였다. To 5 g of the colloidal whey protein hydrolyzate of the present invention were added 4 g of sitosterol, 3 g of polyglyceryl 2-olate, 0.7 g of ceramide, 2 g of cetearate-4, 3 g of cholesterol, 0.4 g of dicetyl phosphate, 5.0 g of concentrated glycerin, 0.5 g of carboxyvinyl polymer, 0.5 g of triethanolamine, a small amount of preservative and perfume, and purified water were mixed to a total weight of 100 g, and a nutritional cream was prepared according to a conventional cream preparation method.
제조예 1-2. 화장수 제조Production Example 1-2. Lotion manufacturing
95% 에탄올 8g에 폴리피롤리돈 0.05g, 올레일알콜 0.1g, 폴리옥시에틸렌모노올레이트 0.2g, 향료 0.2g, 파라옥시안식향산메틸에스테르 0.1g, 소량의 산화방지제, 소량의 색소를 혼합 용해하였다. 본 발명의 초유 유청 단백질 가수분해물 0.05g, 글리세린 5g을 정제수 85.33g에 용해한 것에 상기 혼합액을 첨가한 후 교반하여 혼합 생약의 추출물을 함유하는 화장수를 제조하였다.0.05 g of polypyrrolidone, 0.1 g of oleyl alcohol, 0.2 g of polyoxyethylene monooleate, 0.2 g of perfume, 0.1 g of p-hydroxybenzoic acid methyl ester, a small amount of antioxidant and a small amount of dye were mixed and dissolved in 8 g of 95% ethanol. 0.05 g of the colloidal whey protein hydrolyzate of the present invention and 5 g of glycerin were dissolved in 85.33 g of purified water. The mixture was added to the mixture and stirred to prepare a lotion containing the extract of the mixed herbal medicine.
제제예 1-3. 유액 제조Formulation Example 1-3. Emulsion manufacturing
세틸알코올 1.2g, 스쿠알란 10g, 바세린 2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.2g, 글리세린모노에스테아레이드 1g, 폴리옥시에틸렌(20몰부가)모노올레이트 1g 및 향료 0.1g을 70℃에서 가열혼합용해하고, 본 발명의 초유 유청 단백질 가수분해물 0.5g, 디프로필렌글리콜 5g, 폴리에틸렌글리콜-1500 2g, 트리에탄올아민 0.2g, 정제수 76.2g을 75℃로 가열해서 용해시켰다. 양자를 혼합하여 유화시킨 후 냉각하여 수중유(O/W)형의 유액을 제조하였다.1.2 g of cetyl alcohol, 10 g of squalane, 2 g of vaseline, 0.2 g of p-hydroxybenzoic acid ethyl ester, 1 g of glycerin monoestearate, 1 g of polyoxyethylene (20 mols of addition) monooleate and 0.1 g of perfume were heated and mixed at 70 캜 , 0.5 g of the colloidal whey protein hydrolyzate of the present invention, 5 g of dipropylene glycol, 2 g of polyethylene glycol-1,500, 0.2 g of triethanolamine and 76.2 g of purified water were dissolved by heating at 75 ° C. The mixture was emulsified by mixing them and then cooled to prepare oil-in-water (O / W) type emulsion.
제제예Formulation example 1-4. 미용액 제조 1-4. Serum preparation
95% 에틸알콜 5g에 폴리옥시에틸렌솔비탄모노올레이트 1.2g, 키툴로오즈 0.3g, 히야론산나트륨 0.2g, 비타민 E-아세테이트 0.2g, 감초산 나트륨 0.2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.1g, 본 발명의 초유 유청 단백질 가수분해물 1g 및 적량의 색소를 혼합하여 미용액을 제조하였다.To 5 g of 95% ethyl alcohol, 1.2 g of polyoxyethylene sorbitan monooleate, 0.3 g of quitrose, 0.2 g of sodium hyaluronate, 0.2 g of vitamin E-acetate, 0.2 g of sodium permanganate, 0.1 g of paraoxybenzoic acid ethyl ester, 1 g of the colloidal whey protein hydrolyzate of the present invention and an appropriate amount of pigment were mixed to prepare a serum.
Claims (6)
상기 초유 유청 단백질 가수분해물은 초유 유청 단백질을 pH 8~10, 50~60℃에서 알칼리 단백분해효소(alkaline protease)를 처리하여 가수분해 시킨 후, 80~100℃에서 10~40분간 처리하여 효소를 불활성화 시켜 얻는 것을 특징으로 하는 피부 재생용 화장료 조성물. The method according to claim 1,
The colloidal whey protein hydrolyzate is prepared by hydrolyzing the coliform whey protein by treating alkaline protease at pH 8 to 10 at 50 to 60 ° C and treating the enzyme at 80 to 100 ° C for 10 to 40 minutes. Wherein the composition is obtained by inactivation.
상기 초유 유청 단백질 가수분해물은 진피 섬유아세포의 피브로넥틴(fibronectin) 분비를 촉진하는 것을 특징으로 하는 피부 재생용 화장료 조성물. The method according to claim 1,
Wherein the colloidal whey protein hydrolyzate promotes the secretion of fibronectin from dermal fibroblasts.
상기 화장료는 로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트리젠트, 크림, 파운데이션, 에센스, 팩, 비누, 클렌징폼 및 바디클린저로 이루어지 군에서 선택되는 하나 이상의 제형으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 피부 재생용 화장료.6. The method of claim 5,
Wherein the cosmetic material comprises one or more formulations selected from the group consisting of lotions, skin softeners, skin toners, astringents, creams, foundations, essences, packs, soaps, cleansing foams and body cleansers.
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